Взаимодействие лецитина с комплексами ДНК

Кривцов, Алексей Олегович

Взаимодействие лецитина с комплексами ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Кривцов, Алексей Олегович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Казань МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Взаимодействие лецитина с комплексами ДНК»

Автореферат диссертации на тему "Взаимодействие лецитина с комплексами ДНК"

На правах рукописи

КРИВЦОВ АЛЕКСЕЙ ОЛЕГОВИЧ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛЕЦИТИНА С КОМПЛЕКСАМИ ДНК: ФАЗОВЫЕ РАВНОВЕСИЯ II МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

02.00.04 — Физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

5 ДЕК 2013 005541993

Казань - 2013

005541993

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент

Билапов Азат Вагизович

Официальные оппоненты: Соломонов Борис Николаевич

доктор химических наук, профессор, ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», заведующий кафедрой физической химии

Бакеева Роза Фаридовна доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет»,

профессор кафедры аналитической химии, сертификации и менеджмента качества.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учереждение высшего профессионального образования «Российский химико-техно- логический университет им. Д.И. Менделеева»

Защита состоится «17» декабря 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.03 на базе Казанского национального исследовательского технологического университета по адресу: 420015, Казань, ул. К.Маркса, 68 (зал заседаний Ученого совета, А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского национального исследовательского технологического университета

Автореферат разослан ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

А .Я. Третьякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Системы содержащие ДНК, многозарядные катионы и фосфолипиды имеют важное биологическое и биотехнологическое значение. В клеточных ядрах эукариотик наблюдаются сложные взаимодействия между ДНК, катионными белками и липидами, самоассоциирущимися друг с другом с образованием сложных структур. Эта самоорганизация все еще далека от детального понимания, в частности это касается и взаимодействия с липидами. Кроме того, выявление закономерностей взаимодействия цвиттерионных липидов и ДНК помогло бы усовершенствовать физико-химическую основу создания липоплексов для невиральной генной терапии. Липоплексы представляют собой невиральные векторы доставки генной информации в клетку, они содержат специальным образом упакованную и защищенную ДНК в капсуле липидной мембраны.

Интерес со стороны физиков, химиков и биологов к системам ПАВ-ДНК обусловлен еще и тем, что небольшая пертурбация состава системы, незначительное изменение температуры, давления или концентрации может оказаться достаточной, чтобы вызвать существенные структурные изменения. Современный уровень развития методов анализа, прежде всего спектроскопии, позволяет получать количественные данные о таких свойствах, как подвижность молекулярных ансамблей, упаковка ДНК, ее транспортировка через мембрану, самоассоциация в вирусах и т.д.

Цели н задачи работы. Целью настоящей работы являлось установление морфологии систем на основе лецитина и комплексов катионное ПАВ-ДНК и полиамин-ДНК, выявление механизма самоорганизации и закономерностей ДНК-липидньгх взаимодействий в этих системах, а также оптимизация рецептуры получения микродисперсий на основе лецитина и комплекса катионное ПАВ-ДНК.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи: 1) Синтез 1:1 (стехиометрическое отношение зарядов) комплексов ДНК с катионными ПАВ и полиаминами.

2) Установление изобарно-изотермических фазовых диаграмм и структуры фаз трехкомпонентных систем комплекс ДНК-лецитин-вода.

3) Оценка влияния различных факторов (строения молекулы протавоиона, соотношения между компонентами, молекулярной массы ДНК) на взаимодействие лецитина с комплексом ДНК.

4) Получение агрегативно-устойчивой ДНК-липидной дисперсии, пригодной для использования при in vivo исследованиях.

Научная новнзна и практическая значимость работы заключается в обнаружении новых закономерностей, имеющих важное значение, как для теоретических положений о фазовых переходах и процессах самоассоциации в ДНК-липидных системах, так и для практических способов их использования.

Впервые экспериментально получены фазовые диаграммы лиотропных систем дидодецилдиметиламмонийный комплекс ДНК (ДДА-ДНК)-лецитин-вода, сперминовый комплекс ДНК (Спм-ДНК)-лецитин-вода и спермидиновый комплекс ДНК (Спд-ДНК)-лецитин-вода; на основании анализа микроструктуры и физико-химических свойств фаз установлен механизм влияния структуры протавоиона ДНК на морфологию систем.

Оптимизирован способ диспергирования амфифильных комплексов ДНК. Впервые предложено использование этанольного раствора комплекса катионное ПАВ-ДНК в качестве «инжекторного» и раствора цвиттерионного фосфолипида в качестве «стабилизирующего» для получения липоплекса методом «solvent shifting»; подобраны составы растворов.

Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет». Исследование систем, включающих комплексы ДНК, проводилось автором в лаборатории кафедры Физическая химия университета г. Лунда (Швеция) под руководством профессора Ульфа Олссона в соавторстве с профессором Бъёрном Линдманом.

В университете города Лунд состоялось три стажировки, первая

стажировка проходила весной 2011 года и финансировалась из средств гранта

профессора Ульфа Олссона, вторая стажировка была оплачена из личных средств, а третья была осуществлена при поддержке системы грантов РТ «Алгарыш».

Личное участие автора заключается в определяющем вкладе проведенных им (лично или при непосредственном участии) исследований всеми использованными в работе методами. Автору принадлежит решающая роль в обобщении и интерпретации представленных результатов.

А втор выражает свою искреннюю признательность всем коллегам, внесшим тот или иной вклад в реализацию настоящей работы, и глубочайше благодарен своим учителям и соавторам: Л.В.Билалову, У.Олссону и Б.Линдману.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на IV международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике, проходившей в Москве в июле 2013 года, на Всероссийской молодежной конференции «Химия поверхности и нанотехнология», проходившей в Казани в октябре 2012 года, а также на научных сессиях КНИТУ в 2012 и 2013 годах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ, и 2 тезиса по докладам на конференциях всероссийского и международного уровня.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах, содержит 51 рисунок, 1 таблицу. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, библиографии, включающей 110 ссылок

Введение отражает актуальность выбранной темы диссертации, цели исследования и задачи, научную новизну и практическую значимость.

современные представления об основных закономерностях взаимодействия ДНК-ПАВ в разбавленных и концентрированных растворах. Четвертый подраздел посвящен практическому применению ДНК-липидных систем.

Во второй главе приведены физико-химические свойства объектов исследования, описаны методы приготовления образцов, а также обоснованы применяемые методы исследования и приведены методы расчетов некоторых параметров.

Третья глава посвящена обсуждению результатов исследования трехкомпонентных систем комплекс катионное ПАВ-ДНК:лецитин:вода

В четвертой главе обсуждаются закономерности, выявленные при изучении систем комплекс полиамин-ДНК:лецитин:вода.

Пятая глава фокусирует внимание на трактовке закономерностей, обнаруженных при оптимизации методики диспергирования додецилтриметиламмонийного комплекса ДНК (ДТА-ДНК).

На защиту выносятся следующие положения:

Структура гидратированных агрегатов ПАВ-ДНК. Влияние молекулярной массы и полидиспесрности ДНК на структуру агрегатов.

Фазовые равновесия и структуры фаз в трехкомпонентных системах ДДАДНК/лецитин/вода и ДТА-ДНК/лецитин/вода. Особенности взаимодействия лецитина с двух-це по печными амфифильными противоионами ДНК в сравнении с одно-цепочечными. Расчет теоретической фазовой диаграммы на основании простых геометрических моделей ЖК фаз.

Фазовые равновесия в системах Спм-ДНК/лецитин/вода и Спд-ДНК/лецитин/вода. Влияние строения многозарядного противоиона на солюбилизацию ДНК липидной мембраной.

Двух-стадийный способ диспергирования комплекса ДТА-ДНК в водной среде при помощи лецитина.

Объекты и методы исследования. Работа сфокусирована на определенном типе комплексов ДНК, (1:1) стехиометрических в терминах соотношения противоположных зарядов ДНК и противоиона, например,

фосфатная группа ДНК: аммонийная группа ДДА (ДТА) или фосфатная группа ДНК: аминогруппа Спм (Спд). Была использована относительно короткая двух-спиральная ДНК (В-форма, 700 пар-оснований), свойства разбавленных растворов которой в смесях с ПАВ хорошо известны, а также с длиной 2000 пар-оснований для оценки влияния молекулярной массы ДНК на структуру фаз.

Объектом исследования, хорошо моделирующим поведение нейтральных мембранных фосфолипидов, являлся цвитгерионный фосфолипид, 1,2-диацил-яп-З-фосфатидилхолин или, по-просту, лецитин. Исследование проводилось в водных растворах

В основном изучались водные растворы (для ЯМР в качестве растворителя использовали 020)

Применялся ряд комплементарных методов:

- поляризационная оптическая микроскопия, 2Н ЯМР спектроскопия, малоугловое рентгеновское рассеяние (МРР) - для изучения фазовых равновесий и структуры фаз;

- статическое (СРС) и динамическое (ДРС) рассеяние света, микроэлектрофорез, реометрия - для характеристики растворов комплексов ДНК;

- циркулярный дихроизм (ЦЦ), УФ-спектроскопия и некоторые другие - для оценки конформационного состояния ДНК.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ключевым хорошо известным явлением в поведении систем полиэлектролит — противоположно заряженное ПАВ является ассоциативное взаимодействие, приводящее к образованию комплекса полимер-ПАВ, при формировании которого неорганические противоионы уходят в объем раствора. При определенных концентрациях (рис. 1 а) комплекс можно легко отделить. Нейтральный комплекс виртуально не растворим в воде (рис. 1 б) и может

рассматриваться как отдельный компонент системы, назовем его комплексной солью.

Рисунок 1. Условные фазовые диаграммы: (а) полиэлектролит ассоциирует с противоположнозаряженным ПАВ образуя комплексную соль ПАВ-полиэлектролит, например ДЦА-ДНК. Ассоциация приводит к нейтрализации поверхносного заряда и при определенных соотношениях между компонентами (2-х фазная область) сопровождается агрегацией и макрофазным расслоением; (б) нейтральный (1:1 по соотношению зарядов) комплекс практически не растворим в воде в широкой области концентраций добавляемых солей (ионной силы раствора).

Рисунок 2. Фазовая диаграмма смеси полиэлектролита и ПАВ в воде при постоянном давлении и температуре может быть представлена в виде пирамиды. Смесь полиэлектролита и ПАВ в воде дает 4 возможных комбинации нейтральных ионных пар: полиэлектролит, ПАВ, комплексную соль и простую соль.

В общем случае фазовая диаграмма системы, состоящей из полиэлектролита, противоположно заряженного ПАВ и воды при постоянных давлении и температуре, представляет собой пирамиду (рис. 2). Фазовое

№ДНК

полиэлектролит

ДДАВг ДДАДНК

ПАВ комплексная

соль (комплекс)

ЫаВг

простая

соль

Вода

поведение системы, состоящей из комплексной соли, воды и какой-либо добавки при постоянных давлении и температуре, можно описывать с помощью треугольника Гиббса.

Итак, мы смешали эквимольные растворы ДНК и катионного ПАВ, дидодецилдиметиламмоний бромида (ДДАБ), отделили выделившийся в осадок нейтральный комплекс ДДА-ДНК от неорганических ионов. После очистки и сушки ДДА-ДНК смешали с лецитином и водой в необходимых пропорциях и после достижения равновесия в системе (после завершения многократного перемешивания образцы хранили 2 месяца при 7= 25 °С) преступили к анализу образцов. Сперва проводился визуальный анализ образцов с поляризационным тестированием, затем получали 2Н ЯМР спектры образцов, после чего ампулы вскрывались и определялась структура фаз с помощью МРР, а также текстура с помощью поляризационной микроскопии.

Структура гидратированного комплекса. Спектр МРР полностью гидратированного ДДА-ДНК в избытке воды (рис. 3) указывает на гексагональную структуру. Наблюдаются три пика с позиционным соотношением 1:чЗ:2, которое может быть индексировано как (Ыс) = ( 10), (11) и (20) гексагональной решетки с пиком первого порядка при q¡0 = 0.22 А"'. Двух-цепочечные ПАВ обычно образуют обратные цилиндрические мицеллы, как показано на рис. 3 б.

С ДНК и гидратирующей водой содержащейся в каналах с радиусом /?пол, для пика первого порядка мы можем записать

где фс - объемная фракция /-го компонента, Лдак - радиус сечения молекулы двух-спиральной ДНК. С Лднк= 10 А из уравнения

■дик

'пол.

(1)

пав = 130 А2, мы получаем рмии. = - 0.58 е/А, что является достаточно строгим доказательством правильности выбора обратной гексагональной структуры.

Совершенно иная ситуация наблюдается в случае одно-цепочечного амфифильного противоиона, додецилтриметиламмония (ДТА). ДТА образует агрегаты с более высокой кривизной поверхности, поэтому ничего удивительного, что комплексная соль ДТА-ДНК в гидратированном состоянии имеет нормальную тетрагональную структуру с четырьмя молекулами ДНК вокруг каждой цилиндрической мицеллы ПАВ (рис. 4).

Рисунок 4. МРР спектр гидратированного ДТА-ДНК (а) и схематическое представление его структуры (б). Относительное соотношение Брэгговских пиков 1 :\'2 соотносится с двумерной тетрагональной решеткой.

Влияние молекулярной массы и полидиспесрности ДНК на структуру агрегатов. Сравнение двух систем, 700 и 2000 пар-оснований, с различной полидисперсностью показало, что структурные характеристики жидкокристаллических (ЖК) фаз в обеих системах одинаковы. Однако измерения МРР гидратированных комплексов в отсутствии лецитина показали разницу в плотности упаковки ДНК в бинарной системе ДТА-ДНК:вода. Образцы с большей молекулярной массой (2000 пар-оснований) и более низкой полидисперсностью дают более плотную упаковку квадратично упорядоченных молекул ДНК в нормальной тетрагональной структуре.

Тройная фазовая диаграмма при 25°С для системы ДДА-ДНК:лецитин: вода приведена на рис. 5 а в сравнении с ранее изученной системой ДТАДНК:

гексагональной (рис. 3 б) и ламеллярной (рис. 7) фаз, мы рассчитали теоретическую фазовую диаграмму системы ДДА-ДНК/лецитин/вода (рис. 8).

Рис. 6. Рис. 7.

Рисунок 6. МРР пики от ламеллярной фазы (а), образца состава 33:33:34 (ДДА-ДНК/лецитин/вода, вес. %), и гексагональной фазы (б), образца состава 22:51:27 (ДЦА-ДНК/лецитин/вода, вес. %). Широкие размытые пики, расположенные между первым и вторым, и между вторым и третьим Брэпговскими пиками от ламеллярной структуры связаны с повторяющимся расстоянием ДНК-ДНК, ¿/днк, полученное на основании позиции пика, с/дНк = 2п/дднк коррелирует с ЯдНк расчитанным по уравнению ДцНк/(Уднк = Уат/(Уанк + Увол), где Адш - площадь сечения цилиндра ДНК, £/,од является толщиной водного слоя, КДНк - общий исключенный объем молекул ДНК, и - общий объем воды в образце.

Рисунок 7. Структурная модель ламеллярной фазы системы ДЦА-ДНК/лецитин/вода: с!*од. - толщина слоя, виочающего воду и ДНК; ¿/пав - толщина слоя, включающего молекулы ПАВ; с! - повторяющаяся дистанция между двойными слоями; с/днк -дистанция между молекулами ДНК; /пав - средняя длина молекул ПАВ (/ПАв - 0.5 (1); Аднк - площадь сечения цилиндра ДНК. Повторяющаяся дистанция между слоями может быть полученя на основании данных МРР (она соответствует размерности ламеллярной фазы с! = 2лЛ/дт, с индексами Миллера [Н\ — [1], [2], [3], и т.д.). Толщина двойного слоя ПАВ может быть оценена на основании данных МРР по наклону зависимости в координатах уравнения (I = йпав /^пав-

О 50 100 ИОРЮЛЬНМ Н0$Щ*ЛН1*

ЛеЦИТИН третрвгонвлънд* кубичесяй (йЗф

Рис. 8. Рис. 9

Рисунок 8. Модельная фазовая диаграмма системы ДДА-ДНК/лецитин/вода. Рисунок 9. Схематическая иллюстрация фазовых переходов ЖК структур, обнаруженных в системах ДЦА-ДНК и ДТА-ДНК. С увеличением кривизны межфазной поверхности при замене двух-цепочечного амфифильного противоиона на одно-цепочечный, комплекс переходит от обратной к нормальной (прямой) структуре.

обратная гекс»тональнм

Гидр»тироинный ДДА-ДНК

Уменьшение п»р«меп»% уляноихм ПАВ М

Гидретираввнный

л«меял*рняя

При этом для гексагональной фазы, помимо уравнения 2, мы должны учитывать основное требование геометрической модели

¿•ДНК _ ¿миц. /¿П

К V '

которое легко преобразуется в уравнение (детальный вывод дан в тексте диссертации)

, _ ЛднкФпАВ (•«■)

В случае ламеллярной фазы, модель которой представлена на рис. 7, учитывается что молекулы ДНК расположены внутри тонкого водного слоя, с толщиной

<*зод. = 2/пав ^• (6)

Расположение ЖК фаз на расчетной фазовой диаграмме (рис. 8) четко совпадает с их расположением на экспериментальной фазовой диаграмме (рис. 5 а).

Обобщая фазовое поведение двух систем ДЦА-ДНК и ДТА-ДНК, можно придти к заключению, что при увеличении гидрофобной части ПАВ путем замены одно-цепочечного ПАВ на двух-цепочечное, комплекс ПАВ-ДНК сперва адаптируется в ламеллярную фазу. Дальнейшее увеличение гидрофобной части ПАВ ведет к образованию обратных структур, таких как обратная гексагональная фаза (рис. 9).

Фазовые равновесия в системах СпмДНК/лецитин/вода и СпдДНК/лецитин/вода. Замена амфифильного противоиона на многозарядный противоион полиамина, спермин (Спм) или спермидин (Спд), кардинально изменяет фазовое поведение системы. Молекулы Спм или Спд не могут образовывать межфазные разделенные гидрофобные и гидрофильные слои, но ожидалось, что в смеси с ПАВ (лецитином) они смогут встраиваться в полярный слой, оказывая незначительное влияние на структуру слоев ПАВ и слегка изменяя кривизну поверхности. Однако, на основании проведенных исследований были построены фазовые диаграммы систем СпмДНК/лецитин/вода (рис. 5 в) и Спд-ДНК/лецитин/вода и сделан вывод о том, что ламеллярная фаза лецитина не солюбилизирует нейтральные комплексы ДНК со спермином (СпмДНК) или спермидином (Спд-ДНК). Другими словами, нейтрализация заряда ДНК и ее компактизация не являются достаточным условием для ее переноса через липидную мембрану. Очевидно, углеводородный радикал у амфифильного противоиона играет двойную роль: во-первых, он ответственен за многозарядность противоиона

(мицеллообразование), что обеспечивает прочную ассоциацию ДНК с противоионами (стабильность комплекса); во-вторых, встраиваясь в углеводородный слой липидного бислоя, по-всей видимости, он играет роль якоря, удерживающего противоион, а вместе с ним и ДНК внутри фосфолипидной мембраны.

Двух-стадийный способ диспергирования комплекса ДТА-ДНК в водной среде при помощи лецитина. Мы инжектировали 100 мкл. 1 %-ного по весу этанольного раствора ДТА-ДНК в 900 мкл. водного раствора лецитина и через определенные промежутки времени начиная с момента впрыска методом СРС измеряли средний размер частиц дисперсной фазы. Мольное соотношение ДТА/лецитин варьировали от 1.5 до 0.2. Кинетические кривые представлены на рис. 10.

т 12 о

Время после смешения, часы

Рисунок 10. Средний диаметр частиц как функция от времени прошедшего после впрыска этанольного раствора ДТА-ДНК в везикулярный раствор лецитина. В квадратной карте соотнесены значки и весовое ' отношение ДТА-ДНК к лецитину.

Можно выделить три области на кинетических зависимостях. Начальный период, где размер частиц имеет минимальные значения и не изменяется или очень слабо растет со временем; период агрегации, где размеры агрегатов интенсивно растут в течение примерно 2-х часов от 1 до 11-14 мкм; заключительный период, где частицы достигают максимальных размеров и в дальнейшем средний диаметр либо перестает менятся, либо изменяетя очень медленно. Учитывая, что наблюдается увеличение продолжительности начального периода с увеличением содержания лецитина, можно полагать, что агрегативная устойчивость коллоидов ДТА-ДНК увеличивается с уменьшением

мольного соотношения ДТА/лецитин. При мольном соотношении ДТА/лецитин выше 1, начальный период очень короток (несколько секунд), в то время как при избытке лецитина этот период может длиться часами и сутками. Начальный период становится больше 24 часов (что уже приемлемо для липоплексов), начиная с весового соотношения ДТА/лецитин = 1/6.

Таким образом, мы оптимизировали метод получения коллоидных частиц ДНК встроенной в ламеллярные ассоциаты ДТА/лецитин и получили агрегаты размерами в переделах 1-го микрометра, агрегативно-устойчивые по-крайней мере в течение суток, что является хорошим условием для рецептуры приготовления липоплексов.

ВЫВОДЫ

Установлено, что:

1. гидратированный комплекс ДЦА-ДНК имеет 2-мерную гексагональную ЖК структуру, обратного типа, в то время как гидратированный комплекс ДТА-ДНК имеет тетрагональную ЖК структуру нормального типа.

2. образцы ДНК с большим молекулярным весом и более низкой полидисперсностью дают более плотную упаковку квадратично упорядоченных молекул ДНК в нормальной тетрагональной структуре гидратированного комплекса.

3. при увеличении гидрофобной части ПАВ путем замены одно-цепочечного ПАВ на двух-цепочечный, комплекс ПАВ-ДНК сперва адаптируется в ламеллярную фазу. Дальнейшее увеличение гидрофобной части ведет к образованию обратных структур, таких как обратная гексагональная фаза.

4. ламеллярная фаза лецитина не солюбшшзирует нейтральные комплексы ДНК со спермином или спермидином, т.е. углеводородный радикал у амфифильного противоиона играет двойную роль: во-первых, он ответственен за многозарядность противоиона (мицеллообразование), что обеспечивает прочную ассоциацию ДНК с противоионами (стабильность комплекса); во-

вторых, встраиваясь в углеводородный слой липидного бислоя, он играет роль якоря, удерживающего противоион, а вместе с ним и ДНК внутри фосфолипидной мембраны.

5. с увеличением соотношения лецитин/ДТА увеличивается устойчивость микродисперсий, полученных путем быстрого впрыскивания этанольного разбавленного раствора ДТА-ДНК в везикулярный водный раствор лецитина. Это позволяет получить агрегаты размерами в переделах 1-го микрометра, агрегативно-устойчивые в течение суток и более, что является хорошим условием для рецептуры приготовления липоплексов.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Krivtsov А.О., Bilalov A.V., Olsson U., Lindman В. / DNA with double-chained amphiphilic counterions and its interaction with lecithin // Langmuir - 2012 -V. 28-P. 13698-13704.

2. Кривцов A.O., Влияние природы многозарядного противоиона на солюбилизацию ДНК липидной мембраной/ А. О. Кривцов, А. В. Билалов, У. Олссон, Б. Линдман // Вестник Казанского технологического университета -2013-Т. 16,- №18.-С. 43-47.

3. Krivtsov А.О., Bilalov A.V., Olsson U., Lindman В. Dispersion of DTA-DNA in water using «solvent shiftinng» technique // Book of abstracts, V International conference on colloid chemistry and physicochemical mechanics, 2013, Moscow P. 447-448.

4. Кривцов A.O. ДНК с двухцепочечными амфифильными противоионами и их взаимодействия с лецитином. // Сборник материалов Всероссийской молодежной конференции «Химия поверхности и нанотехнология», 2012, Казань, С. 119.

Заказ ¿-¿УЗ_Тираж 100 экз.

Офсетная лаборатория Казанского национального исследовательского технологического университета 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Кривцов, Алексей Олегович, Казань

Федеральное государственное бюджетное образовательное учереждение высшего профессионального образования «КАЗАНСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

04201452881

Кривцов Алексей Олегович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛЕЦИТИНА С КОМПЛЕКСАМИ ДНК: ФАЗОВЫЕ РАВНОВЕСИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

02.00.04 - Физическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель -

доктор химических наук, Билалов А. В.

Казань-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Ведение.................................................................................5

Глава 1. Литературный обзор......................................................9

1.1 Ионогенные и неионогенные ПАВ.........................................9

1.2 Форма агрегатов ПАВ.......................................................12

1.2.1 Средняя кривизна поверхности агрегатов...........................14

1.2.2 Параметр упаковки........................................................17

1.3 Агрегация в разбавленных растворах....................................18

1.3.1 Критическая концентрация мицеллообразования..................19

1.3.2 Число агрегации...........................................................20

1.3.3 Точка Крафта...............................................................20

1.4 Агрегация при высоких концентрациях.................................21

1.5 Фазовые диаграммы систем ПАВ/вода..................................24

1.5.1 Система ДТАБ/вода......................................................24

1.5.2 Система ДДАБ/вода......................................................25

1.5.3 Система лецитин/вода....................................................26

1.6 Фазовые равновесия в трехкомпонентных системах.................27

1.6.1 Система ДТАБ/лецитин/вода...........................................28

1.6.2 Система ДДАБ/лецитин/вода...........................................29

1.7 Молекула ДНК................................................................31

1.7.1 Растворимость ДНК в воде..............................................33

1.8 ДНК с различными веществами в растворе.............................36

1.8.1 Системы ПАВ-ДНК.......................................................41

1.8.2 Взаимодействие ДНК с липосомами..................................42

1.8.3 Компактизация ДНК катионными ПАВ..............................43

1.8.3.1 Влияние гидрофобности ПАВ на упаковку ДНК................43

1.8.3.2 Влияние природы ПАВ на упаковку ДНК........................43

1.8.4 Упаковка ДНК неамфифильными противоионами.................44

1.8.5 Взаимодействие ДНК-полимер.........................................46

1.9 Структура комплексной соли кат. ПАВ-ДНК...........................47

1.9.1 Фазовые равновесия в системах на основе кат. ПАВ-ДНК......49

1.10 Генная терапия...............................................................57

1.10.1 Липоплексы...............................................................69

1.10.2 Эндоцитоз..................................................................60

1.10.3 Требования, предъявляемые к липополексам......................62

Выводы по литературному обзору.............................................62

Глава 2. Эксперимент..............................................................64

2.1 Объекты исследования и исходные вещества...........................64

2.1.1 ДНК...........................................................................64

2.1.2 ДДА...........................................................................65

2.1.3 Лецитин.....................................................................65

2.1.4 Полиамины.................................................................66

2.1.5 Бромид натрия.............................................................66

2.1.6 Растворители...............................................................67

2.1.6.1 Вода........................................................................67

2.1.6.2 Этанол.....................................................................67

2.2 Основные препаративные операцииРЬ^Г:....

rniigaagBgBpg ..:..::....:.. а

2ZmПриготовление обЖЩШ№.. .v:......:..v. jh.........

2.Д Подход тройной фазовои диаграммы.. .. . ...,.... .v:^ .^ . .^ .............69

2..

2.4.1. 1Г Общие аспекты твердофазной ЯМР спектроскопии... лК70

2.4*1Использование твердофйзной ЯМР спектроскопии.3?.ñ^^JJll 2.4. í-.3f,, ^еблогическа^^

2-АА Салоугловое рассеяние рентгеновских лучей*МРР.,„.....-........74

2.4.3?- Динамическое рассеяние света.!.....................

2.4.4- ЗО Динамическое рассеяние света..Г.ГГТгд..Г..Г.:7ШШШЯ6

2.4.5 1 Реологические исследования.......ГП.........rs.i...........ja Д.. Г. 77

2.4.8 ЩркЙайнызди.^йэм., -..-'.Ж.......ЖШ

2.4.7 Оптическая микроскопия... ........../еЖ...................I... .1..78

2.5 Некоторые расчеты.:................¡Ж..*.!!........Ж...I?... ..178

2.5.1 Расчет объемных долей? компонентов,..... .4......................... 78

<ш» а

■<> •*-»<. 'Щмл

2.5.2 Расчет Сп дляагр^гатов ДТА-ДЩ|в растворе........¿•■■•Ш- •# • Ф

Г-, « Ef, » > lit ттттт/- * " }■ SIT* « I

Глава 3. ¿Влияние природы противоядна ДНК на взаимодействие с

jprr- где > • Л >" "J" ЯГГ »

лецитином в воде....................................fA...#., Jr.. h............. 82

J. 1 СиТтема ДДА-ДНК/лецитин/вода.......Г.. А .М Ж- ■ I ■ • JP •••••!•• С-82

3.1 rl Комплекс ДДА-ДНК....17.Ж........................................1.84

3$.2 Gfigrem Д^А-ДНК/лецитин/во'дЩ; длинной ДНК.Т.К...........1.88

* М ^ Ч t 4 ф % •WSSiSS®^ J® й ц |Г ^

3.1.3 Фазовая диаграмма системы ДДА-ДНЩлецитин/врда............88

3!'1 .ПШеш^АжК фаза.^Ч|д.........^........ГЖЕ..§..,89

ST & ^ ж* Tw & -я- / « ««Si „¿Is л- ¿4 J

„¿Is «

ЗЛфЛ Модель ламеллярной ЖК Шазы..........Г...А....93

3.1.4.2 , Особенности ламеллярно'й^ЖКфазы.Ж.М..'.Ш............J.97

3.1.5 Обратная гексагональнаяЙСК фазы. .'.T^?.. Mi.. Л ............7100

М Модель траттой гексавонадьнойЖ'фйьь!!:.?.:. v.^102

-г - " ' "'—« ■"ПГН ** * ж J0; щ ЯГ гГу.

3.2Влияние природы противоиона на солюбтлтзацию ДНК л........:.Ю6

3.2.1 Системы спермин-ДНК/во да и спермидин-Д 1Ж/вода............108

3.2.2 Системы спермин-ДНК/лецитин и спермидин-ДНК/лецитин.,108

3.2.3 Система спермин-ДНК/лецитин/вода..............................108

3.2.4 Система спермидин-ДНК/лецитин/вода.............................113

Глава 4. Диспергирование ДТА-ДНК в водной среде.....................114

4.1 Двух-стадийный способ диспергирования комплекса ДТА-ДНК в

водной среде при помощи лецитин.............................................114

Выводы.............................................................................120

Перечень условных сокращений............................................... 121

Список литературы............................................................122

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Системы, содержащие ДНК, многозарядные катионы и фосфолипиды имеют важное биологическое и биотехнологическое значение. В клеточных ядрах эукариотик наблюдаются ассоциативные взаимодействия между ДНК, катионными белками и липидами, самоассоциирущимися друг с другом с образованием сложных структур. Эта самоорганизация все еще не достаточно изучена, в частности, что касается и взаимодействия с липидами. Кроме того, выявление закономерностей взаимодействия цвиттерионных липидов и ДНК помогло бы усовершенствовать физико-химическую теорию создания липоплексов для невиральной генной терапии.

Интерес со стороны физиков, химиков и биологов к системам ДНК-ПАВ обусловлен еще и тем, что небольшое изменение состава системы, незначительное изменение температуры, давления или концентрации может оказаться достаточной, чтобы вызвать существенные структурные изменения. Современный уровень развития методов анализа, прежде всего спектроскопии, позволяет получать количественные данные о таких свойствах, как подвижность молекулярных ансамблей, упаковка ДНК, ее транспортировка через мембрану, самоассоциация в вирусах и т.д.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы являлось установление морфологии систем на основе лецитина и комплексов катионное ПАВ-ДНК и полиамин-ДНК, выявление механизма самоорганизации и закономерностей ДНК-липидных взаимодействий в этих системах, а также оптимизация рецептуры получения микродисперсий на основе лецитина и комплекса катионное ПАВ-ДНК.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1) Синтез 1:1 (стехиометрическое отношение зарядов) комплексов ДНК с катионными ПАВ и полиаминами.

3) Оценка влияния различных факторов (строения молекулы противоиона, соотношения между компонентами, молекулярной массы ДНК) на взаимодействие лецитина с комплексом ДНК.

Научная новизна и практическая значимость работы заключается в обнаружении новых закономерностей, имеющих важное значение, как для теоретических положений о фазовых переходах и процессах самоассоциации в ДНК-липидных системах, так и для практических способов их использования.

Впервые экспериментально получены фазовые диаграммы лиотропных систем дидодецилдиметиламмонийный комплекс ДНК (ДДА-ДНК)-лецитин-вода, сперминовый комплекс ДНК (Спм-ДНК)-лецитин-вода и спермидиновый комплекс ДНК (Спд-ДНК)-лецитин-вода; на основании анализа микроструктуры и физико-химических свойств фаз установлен механизм влияния структуры противоиона ДНК на морфологию систем.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах, содержит 51 рисунок, 1 таблицу. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, библиографии, включающей 110 ссылок

Первая глава (литературный обзор) включает четыре подраздела. В первом подразделе приведены основные положения о состоянии ПАВ в разбавленных и концентрированных растворах. Во втором подразделе обосновывается выбор полимера и излагаются некоторые особенности физико-химических свойств ДНК в растворе. В третьем подразделе изложены современные представления об основных закономерностях взаимодействия ДНК-ПАВ в разбавленных и концентрированных растворах. Четвертый подраздел посвящен практическому применению ДНК-липидных систем.

Третья глава посвящена обсуждению результатов исследования трехкомпонентных систем комплекс катионное ПАВ-ДНК/лецитин/вода.

В четвертой главе обсуждаются закономерности, выявленные при изучении систем комплекс полиамин-ДНК/лецитин/вода.

На защиту выносятся следующие положения:

Фазовые равновесия и структуры фаз в трехкомпонентной системе ДДАДНК/лецитин/вода. Сравнение с системой ДТАДНК/лецитин/вода. Особенности взаимодействия лецитина с двухцепочечными амфифильными противоионами ДНК в сравнении с одноцепочечными. Расчет теоретической фазовой диаграммы на основании простых геометрических моделей ЖК фаз.

Фазовые равновесия в системах СпмДНК/лецитин/вода и С пд ДНК/лецитин/во да. Влияние строения многозарядного противоиона на солюбилизацию ДНК липидной мембраной.

Двухстадийный способ диспергирования комплекса ДТА-ДНК в водной среде при помощи лецитина.

Личное участие автора заключается в определяющей роли проведенных (лично или при непосредственном участии) исследований всеми использованными в работе методами. Автору принадлежит решающая роль в обобщении и интерпретации представленных результатов.

Автор выражает свою искреннюю признательность всем коллегам, внесшим тот или иной вклад в реализацию настоящей работы, и глубочайше благодарен своим учителям и соавторам: А.В.Билалову, У.Олссону и Б.Линдману.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Ионогенные и неионогенные ПАВ

Поверхностно активные вещества (ПАВ) - химические соединения, которые, концентрируясь на поверхности раздела фаз, вызывают значительное снижение поверхностного натяжения (о). Основная их характеристика — поверхностная активность. То есть, это способность вещества снижать поверхностное натяжение на границе раздела фаз.

Физико-химические свойства ПАВ, выделяющие их на фоне других веществ, определяются не размерами молекул, а их амфифильностью.

Амфифильность - это свойство, которым обладают молекулы ПАВ из-за наличия в их структуре двух частей, по-разному относящихся к среде. Одна из частей молекулы растворима в среде (т.е. лиофильна), а вторая нерастворима и поэтому «боится» контакта с этой средой (т.е. лиофобна). Амфифильность можно перевести как «двуликость». Таким образом, физико-химические свойства ПАВ зависят от соотношения размеров двух частей молекулы [1].

Классификация ПАВ достаточно компактна и основана на химической природе головной группы амфифильной молекулы. Учитывая перспективу изучения взаимодействия ПАВ с полиэлектролитами, где важнейшим фактором является именно заряд головной группы ПАВ, уместно разделить амфифильные вещества на ионогенные и неоиногенные ПАВ.

Ионогенные ПАВ представлены огромным количеством веществ, молекулы которых способны к электролитической диссоциации и существуют в растворе в виде ионов. К ионогенным ПАВ относятся катионные, анионные, цвиттерионные амфифилы.

Анионные ПАВ имеют в составе головной группы фосфатные, карбоксилатные, сульфатные и сульфонатные группы [2]. Химические структуры основных классов анионных ПАВ представлены на рис. 1.1. Анионные ПАВ чаще других используются при изготовлении моющих средств и бытовых химикатов.

Алкилфосфаты Ал кил ПЭГфосфаты

Рисунок 1.1— Химические структуры некоторых представителей класса

анионных ПАВ

Катионные ПАВ в преобладающем большинстве представлены соединениями, где головная группа содержит атом азота, несущий положительный заряд в растворе, и наименее чувствительны к изменениям рН [3]. В общем виде химический состав этих ПАВ можно записать как (тСпН114"т)+ НаГ. На рис. 1.2 представлены структуры разновидностей этого класса ПАВ.

В природе встречаются такие амфифильные молекулы, которые в растворе не несут никакого электростатического заряда, однако в составе головной группы имеют две противоположно-заряженные близкорасположенные группировки [4]. Примером таких ПАВ являются фосфолипиды, содержащие карбоксилатную и четвертичную аммониевую группы сразу. Химические структуры ярких представителей цвиттероинных ПАВ представлены на рис. 1.3.

Соли первичных аминов

Соли жирных диаминов

Соли четвертичных алкиламинов

' нщ ^ ни

Соли четвертичных диалкиламинов

Эфирные соли четвертичных диалкиламинов

Рисунок 1.2 - Химические структуры аминосодержащих представителей

катионных ПАВ

Бетаины

- СН2СОО" Амидобетаины

^СН,СН,ОН

Инидазолины

N-—0

Оксиды аминов

Рисунок 1.3 — Химические структуры некоторых представителей класса

цвиттерионных ПАВ

Особняком от вышеперечисленных ПАВ стоят неионогенные амфифилы, чьи головные группы не содержат ионогенных радикалов, хотя и отличаются полярностью от углеводородных хвостов. Чаще всего химически головная группа представляет собой цепочку этиленгликолевых или гидроксильных юнитов. На рисунке 1.4 представлены структуры неионогенных ПАВ.

В результате различия в структурах этих амфифильных молекул существенно различаются и их химические свойства. Однако, при

взаимодействии с водой молекулы каждого из четырех видов ПАВ стремятся адсорбироваться на поверхности раздела фаз. Таким образом, реализуется амфифильная природа ПАВ: гидрофобная часть уходит в менее полярную фазу, а гидрофильная находится в воде. Альтернативным способом устранения контакта гидрофобных частей молекул ПАВ с водой является агрегация.

,соо

он

Жирные полиэтиленгликолиевые спирты

Жирные ароматические полиэтиленгликолиевые спирты

Жирные кислые полиэтиленгликолиевые спирты

Жирные амидные полиэтиленгликолиевые спирты

ОН

Жирные анино полиэтиленгликолиевые спирты

Алкилгликозиды

Рисунок 1.4 — Химические структуры некоторых представителей класса

неионогенных ПАВ

1.2 Форма агрегатов ПАВ

При смешивании ПАВ с водой в результате гидрофобного ассоциативного взаимодействия между амфифильными молекулами в широком концентрационном диапазоне происходит с