Комплексы нуклеиновых кислот с противоположно заряженными амфифильными ионами и поликатионами в водных и органических средах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Направахрукописи

СЕРГЕЕВ ВЛАДИМИР ГЛЕБОВИЧ

КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПРОТИВОПОЛОЖНО ЗАРЯЖЕННЫМИ АМФИФИЛЬНЫМИ ИОНАМИ И ПОЛИКАТИОНАМИ В ВОДНЫХ И ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕД^

02 00 06 - высокомолекулярные соединения по химическим наукам

ДИССЕРТАЦИЯ

в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2004

Научный консультант: академик РАН

Кабанов Виктор Александрович

Официальные оппоненты: академик РАН

Хохлов Алексей Ремович

доктор химических наук, профессор Паписов Иван Михайлович

доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович

Ведущая организация: Институт химической физики

им.Н.Н.Семенова РАН

Защита состоится «9» июня 2004 г. в 15.00 на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119992 г.Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета им.М.В. Ломоносова.

Диссертация в виде научного доклада разослана 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н.

Долгова А. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последнее время большое внимание уделяется исследованию процессов, происходящих при контакте двух противоположно заряженных полиионов или полииона с противоположно заряженными амфифилъными ионами в водных средах. В результате наложения ван-дер-ваальсовых, гидрофобных, электростатических взаимодействий и водородных связей, устанавливающихся между компонентами, в этих системах образуются разнообразные комплексные структуры: в частности, интерполиэлектролитные и полиэлектролит-коллоидные комплексы (ИПЭК и ПКК соответственно). При этом во всех случаях взаимодействующие полиионы приобретают более компактные конформации по сравнению с исходными. Образование таких структур имеет много общего с процессами самоорганизации в биологических системах. Особый интерес представляет изучение явлений самоорганизации с участием дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая занимает особое положение в мире полиэлектролитов благодаря ее уникальной биологической роли носителя генетической информации на молекулярном уровне.

Изолированная молекула нативной ДНК представляет собой жесткую спираль, собранную из двух линейных полинуклеотидов, которые соединены друг с другом системой водородных связей («двойная спираль»). В водных растворах при умеренной ионной силе двухспиральный полианион ДНК имеет форму развернутого персистентного гауссова клубка. Однако в живой природе развернутые конформации ДНК не встречаются. В клетках ДНК всегда присутствует в составе конденсированных компактных структур, образованных ее комплексами с положительно заряженными белками. Кроме того, в последнее десятилетие компактные комплексы ДНК успешно используются в медицинских и биотехнологических целях для доставки в клетки чужеродного генетического материала (плазмид и антисмысловых полинуклеотидов) как in vitro , так и in vivo. Поэтому явления и механизмы компактизации ДНК под влиянием различных конденсирующих агентов небиологического происхождения, равно как и свойства образующихся комплексов, изученные в нашей работе, имеют первостепенное фундаментальное и прикладное значение, в частности: -для понимания общих закономерностей взаимодействия ДНК с положительно заряженными конденсирующими агентами и установления физико-химических факторов, вызывающих и контролирующих ее компактизацию;

-для раскрытия пока еще не ясных механизмов проникновения конденсированных молекул ДНК сквозь мембраны внутрь клеток (трансмембранный перенос).

В последние десятилетия проблеме конденсации (компактизации) ДНК было посвящено большое число теоретических и экспериментальных исследований, ( подробный обзор можно найти, например, в сборнике Self-Assembling Complexes for Gene Delivery, eds, A. V. Kabanov, Ph.L Feigner, L.W. Seymour, Wiley, Chichester, 1998, p.p. 27-50, 169-218). Большинство экспериментов выполнено с использованием физико-химических и физических методов, в которых информация о поведении отдельных макромолекул выводится либо из коллигативных свойств их растворов, либо из анализа структуры конечных продуктов конденсации. Однако недавно в работах К. Иошикава и сотр. была открыта иная, принципиально новая возможность (см. например, К. Yoshikawa et. al. Biochem.Biophys.Res.Commun.1994,188,1274-1423.). Она состоит в прямом наблюдении в поле флуоресцентного микроскопа отдельных изолированных макромолекул ДНК в режиме реального времени непосредственно в процессе их компактизации.

Наиболее эффективным нам представлялось применение методики прямого наблюдения в сочетании с другими физико-химическими и физическими методами исследования. Этот подход был использован в нашей работе. Цель работы:

-изучить динамику и условия компактизации отдельных изолированных молекул ДНК при их взаимодействии с различными положительно заряженными конденсирующими агентами, в частности: катионными амфифилами, дендримерами и гидрогелями путем прямого визуального наблюдения происходящих процессов с помощью флуоресцентного микроскопа в режиме реального времени;

-исследовать образование и поведение комплексов ДНК-катионный амфифил в средах различной полярности, в том числе в малополярных органических растворителях для установления роли электростатических и гидрофобных взаимодействий в процессах компактизации; -исследовать образование и поведение комплексов ДНК с катионными дендримерами (предельный случай разветвленных конденсирующих агентов);

-изучить особенности взаимодействия нативной и денатурированной (одноцепочечной) ДНК с катионным гидрогелем, который был использован в качестве макроскопического конденсирующего агента. .

В целом стратегия исследования была построена так, чтобы достичь максимальной степени сопряжения и взаимной дополняемости данных прямого визуального наблюдения и других физико-химических и физических измерений. Для решения поставленных задач в работе использован ряд современных физико-химических и физических методов, в том числе; скоростная седиментация, вискозиметрия, диффузия, УФ-,

КД- и ИК- спектроскопия, рентгенография, атомно-силовая микроскопия и сканирующая калориметрия. Научная новизна.

1. Впервые методом флуоресцентной микроскопии в режиме реального времени осуществлено прямое визуальное наблюдение компактизации отдельных изолированных молекул ДНК, которая происходит при их взаимодействии с катионными амфифилами, дендримерами и гидрогелями в водных растворах. Изучена динамика конформационного перехода клубок-глобула и показано, что он происходит по принципу «все или ничего» (фазовый переход первого рода). Показано также, что этот переход обратим и не приводит к разрушению цепей ДНК.

2. В результате изучения комплексообразования ДНК с катионными амфифилами в водно-спиртовых средах выявлена роль электростатического и гидрофобного взаимодействий в процессах комплексообразования и компактизации, установлена структура образующихся комплексов.

3. Впервые получены комплексы ДНК-катионный амфифил, растворимые в малополярных органических растворителях. Показано, что ДНК в таких комплексах сохраняет конформацию двойной спирали. Физико-химическое исследование этих систем позволило установить, что молекулы ДНК, удерживаемые в органическом растворителе разобщенными углеводородными радикалами амфифильных противоионов, свернуты в компактные частицы так же, как и в водной среде. Последнее означает, что конденсацию ДНК вызывает не только взаимное притяжение комплексно связанных лигандов. Иными словами впервые экспериментально показано, что тенденция к возникновению компактной структуры - внутреннее свойство самой двойной спирали.

4. С использованием органо-растворимых комплексов ДНК - катионный амфифил продемонстрирована возможность практически полного обратимого переноса молекул ДНК через поверхность раздела фаз: вода/малополярный органический растворитель. Направление переноса определяется концентрацией простой соли в водной фазе.

5. В результате систематического изучения взаимодействия пяти поколений катионных дендримеров с молекулами ДНК в водных растворах установлено, что дендримеры всех поколений конденсируют ДНК при зарядовом отношении Z=l. При этом дендримеры 4-го и 5-го поколений, добавленные в избытке, способны образовывать перезаряженные растворимые частицы комплекса, в которых молекулы ДНК сохраняют компактные конформации.

6. Впервые обнаружено кардинальное отличие в характере сорбции нативной и денатурированной ДНК катионным слабо сшитым гидрогелем. При этом в обоих случаях сохраняется возможность контролируемой

десорбции ДНК из гидрогеля с восстановлением исходной нативной структуры.

Практическая значимость.

Совокупность полученных в работе результатов имеет принципиальное значение для понимания физико-химических аспектов образования конденсированных структур в биологических системах и трансмембранного переноса конденсированных молекул ДНК в клетки.

Обратимый перевод ДНК в малополярные органические растворители открывает возможности для модификации ДНК с помощью реагентов, которые невозможно использовать в водной среде.

Обратимая сорбция ДНК катионными гидрогелями открывает возможность создания систем для контролируемого выделения нативных и одноцепочечных молекул ДНК в окружающую среду.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, составивших предмет диссертационной работы, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. Все экспериментальные данные получены при непосредственном участии автора. Автор непосредственно участвовал на всех этапах постановки задач, экспериментального выполнения и обсуждения работ, опубликованных в соавторстве. Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 печатные работы. Апробация работы. Результаты работы были доложены на Международной конференции « Образование и динамика самоорганизованных структур в растворах поверхностно-активных веществ и полимеров» (Нагоя, Япония, 1994), международной конференции «Наноструктуры и самоорганизация в полимерных системах» (Санкт-Петербург-Москва, 1995), Международном симпозиуме по коллоидной химии и химии полимеров «Формирование и динамика самоорганизующихся структур в растворах полимеров и поверхностно-активных веществ-последние достижения» (Нагоя, Япония, 1996), международной конференции «Фундаментальные проблемы науки о полимерах» (К 90-летию академика В.А.Каргина) (Москва 1997), Гордоновской конференции по ионным полимерам (Нью-Лондон, США, 1997), Европейской Гордоновской конференции по полимерам (Шантейн, Франция, 1997), 2 Международной конференции «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» (Сант-Петербург, 1998), втором Всероссийском Каргинском симпозиуме «Химия и физика полимеров в начале XXI века» (Черноголовка 2000), Международном симпозиуме по полиэлектролитам «Polyelectrolytes 2000» (Лес Диаблеретс, Швейцария, 2000), Международной конференции «Polyelectшlytes 2002» (Лунд, Швеция).

1.ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С ПРОТИВОПОЛОЖНО ЗАРЯЖЕННЫМИ АМФИФИЛАМИ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ.

Полимер-коллоидные комплексы (ПКК), образующиеся при взаимодействии гибкоцепных синтетических полиэлектролитов с противоположно заряженными ионными амфифилами в водных растворах, подробно и всесторонне изучены. Благодаря гидрофобному взаимодействию углеводородных радикалов, амфифильные ионы конденсируются на полиионе и нейтрализуют его заряды, а эквивалентные количества низкомолекулярных противоионов обоих знаков заряда освобождаются и выделяются в окружающий раствор. Поскольку все исследованные амфифилы - поверхностно активные вещества (ПАВ), в дальнейшем мы будем пользоваться также и этим более привычным для физико-химиков термином.

Следовало априори ожидать, что жесткоцепной полиэлектролит, каким является двуспиральная ДНК, подобно гибкоцепным должен связываться с противоположно заряженными амфифильными катионами. Однако к моменту постановки наших исследований информация о строении и свойствах ДНК-содержащих ПКК в литературе практически отсутствовала.

Используя традиционные физико-химические методы, мы изучили взаимодействие образцов ДНК умеренной молекулярной 'массы (400 и 2000 пар оснований) из молок лосося с катионными ПАВ: цетилтриметиламмоний бромидом (ЦТАБ), дистеарилдиметиламмоний хлоридом (ДСДАХ) и дистеарилдиметиламмоний бромидом (ДСДАБ) в водных средах. Параллельно мы наблюдали взаимодействие отдельных изолированных молекул гигантской ДНК фага Т4 (166000 пар оснований) с этими ПАВ с помощью флуоресцентной микроскопии (ФМ).

При смешении водных растворов ДНК с растворами ПАВ происходило фазовое разделение из-за образования нерастворимых комплексов ДНК-ПАВ. О степени завершенности реакции судили по величине остаточной концентрации ДНК в надосадочной жидкости после отделения нерастворимого комплекса путем центрифугирования (рис.1). Видно, что ДНК400 и ДНК2000 начинают связываться с катионами ДСДАХ уже при очень низких концентрациях ПАВ в растворе (кривая 1). При соотношениях ДСДАХ/ДНК, близких к 1.2, основная масса ДНК переходит в состав нерастворимого комплекса. Связывание менее гидрофобного ЦТАБ с обоими образцами ДНК начинается при существенно большей концентрации ПАВ в растворе. При этом так же, как и в случае ДСДАХ, практически полное осаждение комплексно-связанной ДНК наблюдается

Рис.1. Зависимость остаточной концентрации ДНК400 и ДНК^ (о) в надосадочной жидкости после отделения нерастворимого

комплекса ДНК-ПАВ от соотношения мольных

концентраций СПАВ И СДНК: 1-ДСДАХ, 2- ЦТАБ. Концентрация ДНК 20 мкг/мл, что соответствует концентрации нуклеотидных

звеньев 6х10-5 М. Т=20°С.

при близком к эквимольному соотношении ЦТАБ/ДНК (кривая 2). Длина макромолекул ДНК в исследованном интервале не оказывает существенного влияния на взаимодействие ДНК с ПАВ.

Состав нерастворимых комплексов ПАВ-ДНК был определен методом элементного анализа. Соотношение [К]/[Р] в исходной ДНК равно 3.4 (К 12.7, Р 8.32 % вес). Экспериментально для комплексов ДНК-ЦТАБ и ДНК-ДСДАХ получено: N 9.81; Р 5,16 ,([ЭД/[Р]=4,2) и N 6,48; Р 3.10, ([К]/[Р]=4.6), соответственно. Из отношения [ЭД/[Р] в комплексах к [К]/[Р] в исходной ДНК вычислены молярные отношения ПАВ/ДНК в комплексах, приблизительно равные 1.3. Полученные значения в пределах ошибки измерений согласуются с данными дробного осаждения.

Для изучения особенностей взаимодействия молекул ДНК с катионными ПАВ был использован метод потенциометрии, позволяющий с помощью электрода, селективного по отношению к ионам ПАВ, измерять их концентрацию в растворе от 10-6 М до точки ККМ (ККМЦТАБ=0.9 мМ: ККМДСДАХ<0.009 ММ).

На рис.2 представлены изотермы связывания ЦТАБ с образцами ДНК из эритроцитов цыплят (7500 пар оснований) и ДНК Т4 (166000 пар оснований) в форме зависимостей степени связывания ПАВ (Р) от логарифма равновесной концентрации ПАВ в растворе; где

Са - концентрация фосфатных групп ДНК, С( - общая концентрация ЦТАБ в растворе и Сг - концентрация свободного ЦТАБ (не связанного с ДНК) в состоянии равновесия. Количество ПАВ, связанного с полианионами ДНК, вычисляли по разности между общей концентрацией ПАВ в растворе и равновесной концентрацией ПАВ, определяемой ион-селективным электродом.

Рис. 2. Изотермы связывания ЦТАБ молекулами ДНК из эритроцитов цыплят (ДНК7500) и ДНК Т4 в буферном растворе, 20°С. Исходные концентрации ДНК7500 1.4х10^(*), ДНК Т4 6х10-5осн. моль/л ( о).

Видно, что изотермы связывания ДНК7500 и ДНК Т4 имеют ярко выраженную S-образную форму и практически совпадают, несмотря на огромное различие в молекулярных массах исследованных образцов. Реакция, приводящая к образованию комплекса ПАВ-ДНК, по существу представляет собой реакцию ионного обмена:

В

пуриновое или пиримидиновое основание.

Амфифильные противоионы, конденсируясь на полиэлектролитной цепи, нейтрализуют ее заряд. При этом неполярные углеводородные фрагменты ПАВ притягиваются друг к другу за счет гидрофобных взаимодействий и образуют внутрикомплексные мицеллы. Роль нейтрализующих противоионов в данном случае выполняют фосфатные группы ДНК. Их локализация вблизи заряженной поверхности мицелл сопряжена со значительно меньшим энтропийным проигрышем, чем в случае

низкомолекулярных противоионов. Поэтому связывание ПАВ с ДНК происходит при концентрациях ПАВ значительно ниже их ККМ. Связывание носит кооперативный характер. Об этом явно свидетельствуют резкое возрастание степени связывания в узком интервале изменения lgCf и S-образность изотерм связывания, приведенных на рис.2. Однако полученные данные не дают ответа на вопрос о том, реализуется ли кооперативный переход на уровне отдельных

макромолекул или более крупных агрегатов, образующихся при фазовом разделении.

Метод ФМ позволяет визуализировать отдельные флуоресцентно-меченные 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (ДАФИ) молекулы ДНК Т4 в растворе и анализировать их распределение по размерам. Образцы для наблюдения в ФМ готовили следующим образом: в раствор ДНК Т4 в 0.5хТВЕ буфере (рН=8, 45мМ трис-основания, 45 мМ борной кислоты, 1мМ ЭДТА) добавляли антиоксидант 2-меркаптоэтанол (4% по объему),

и необходимое количество

ПАВ до нужной концентрации.

На рис 3 представлены флуоресцентные изображения отдельных молекул ДНК Т4 при различном содержании ПАВ в буферном растворе.

В отсутствие и при очень низких концентрациях ПАВ (10-9 М) молекулы ДНК находятся в конформациях развернутого клубка (рис.3 а). При увеличении концентрации ПАВ в растворе до 10-4 М молекулы ДНК переходят из развернутой в компактную конформацию, флуоресцентное изображение которой проявляется в виде отдельных глобул, и становятся

Рис.3. Типичные изображения одиночных молекул ДНК Т4 в 0.5хТВЕ буферном растворе, полученные методом ФМ при различных концентрациях ПАВ. Концентрация ДНК=6-10-7М, [ЦТАБ]=1.0 10"6 М, [ДСДАХ]=1.0 10"9 М (а); [ЦТАБ]=1.010"5 М, [ДСДАХ]= 1.010"7 М (б) и [ЦТАБ]=1.010"4 М, [ДСДАХ]=1.010"5М(в).

неподвижными в поле флуоресцентного микроскопа (рис.3 в). Последнее означает, что они утрачивают растворимость и прилипают к стеклу измерительной ячейки. В промежуточном интервале концентраций ПАВ клубки и глобулы сосуществуют (рис. 3 б).

На рис.4 представлены зависимости размеров L (расстояния между концами макромолекулы) молекул ДНК Т4 от концентрации добавленных ПАВ. Полученные значения L для единичных молекул ДНК были усреднены по 100 молекулам для каждой исследованной концентрации ПАВ. Значение L с максимумом около 3.3 мкм, наблюдаемое в отсутствие ионов ПАВ и при его концентрациях, не превышающих 9.410-6 М для ЦТАБ и 1.010-8 М для ДСДАБ, соответствует размерам свободных клубкоз ДНК. При увеличении содержания ПАВ в растворе до концентраций [ЦТАБ]> 2 010-5 М и [ДСДАБ]> 4 0 10-6 М значение L уменьшается до 0.8 мкм.

интервал сосуществования

клубков и глобул Т4 ДНК

1о81ЦТАБ: ^ 1О8[ДСДАБ]

а б

Рис. 4. Зависимости размера молекул ДНК Т4 от концентрации ЦТАБ (а) и ДСДАБ (б).

В промежуточном интервале концентраций ПАВ обнаружена бимодальность в распределении L, соответствующая сосуществованию молекул ДНК Т4 только в двух состояниях - клубка или «глобулы» (Слово глобула взято в кавычки, поскольку свернувшаяся молекула ДНК, по всей вероятности, имеет тороидальную форму). Отсутствие иных промежуточных конформаций указывает на то, что при образовании ПКК конформации ДНК меняются скачкообразно. Это значит, что связывание ПАВ носит кооперативный характер, а переход «глобула» в

отдельных изолированных молекулах ДНК происходит по принципу «все или ничего», т.е. представляет собой фазовый переход первого рода Замечательно, что область концентраций ЦТАБ, в которой визуально наблюдается сосуществование развернутых и компактных конформаций ДНК Т4, как раз соответствует концентрационному интервалу, в котором по данным ион-специфической потенциометрии ЦТАБ кооперативно связывается с ДНК (область, заштрихованная на рис.2).

Равновесие в реакции образования ПКК, описываемое приведенной выше схемой и изотермами рис.2, можно сместить влево путем уменьшения равновесной концентрации ПАВ или увеличения ионной силы раствора, что приводит к диссоциации комплекса. На уровне единичных компактизованных молекул ДНК это должно приводить к разворачиванию «глобул» и возвращению к исходным конформациям развернутых клубков. Действительно, при добавлении 0.5хТВЕ или при введении в ячейку ФМ, содержащую «глобулы» ДНК Т4 при [ЦТАБ]= 5.010-5 М, раствора полиакрилата натрия (ПА), который связывает ионы ПАВ сильнее, чем ДНК, мы наблюдали разворачивание «глобул» и переход молекул ДНК Т4 в раствор, где они принимали исходные конформации персистентных клубков (таблица. 1).

Таблица 1. Усредненные значения длины отдельных молекул Т4 ДНК, определенные методом ФМ.

Из таблицы 1 видно, что размер клубков ДНК Т4, освободившихся из компактных комплексов, совпадает с размером свободных молекул ДНК Т4 в контрольном растворе. Этот результат свидетельствует о том, что компактизация молекул ДНК катионными ПАВ не приводит к необратимым изменениям в структуре двойной спирали ДНК. В противном случае после разрушения комплекса ДНК-ПАВ путем переселения ЦТАБ на добавленный ПА мы не увидели бы в поле флуоресцентного микроскопа изображение развернутых молекулярных клубков, поскольку только малая бороздка двойной спирали способна специфически связывать флуоресцентный краситель. Денатурированная ДНК этой способностью не обладает.

Таким образом, в этой части работы нам удалось свести воедино данные по образованию ПКК ДНК-ПАВ, полученные методом потенциометрии для больших молекулярных ансамблей, и результаты наблюдения за поведением отдельных гигантских макромолекул ДНК непосредственно в процессе их связывания с катионами ПАВ.

2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С ПРОТИВОПОЛОЖНО ЗАРЯЖЕННЫМИ ПАВ В ВОДНО-СПИРТОВОЙ СРЕДЕ.

Гидрофобное взаимодействие неполярных фрагментов ПАВ играет решающую роль в стабилизации комплексов ДНК-ПАВ в водном растворе. Поэтому следовало ожидать, что добавление в систему органических веществ, ослабляющих или отменяющих гидрофобное взаимодействие, например, спиртов, будет влиять на положение равновесия в реакции комплексообразования. Это влияние действительно было установлено и изучено нами на примере поведения комплексов ДНК-катионные ПАВ в бинарном растворителе вода - 2-пропанол. Выбор 2-пропанола обусловлен тем, что его диэлектрическая постоянная существенно меньше, чем у воды, но при этом он неограниченно смешивается с водой. Следовательно, изменяя соотношение воды и спирта, мы могли в достаточно широких пределах варьировать полярность смешанного растворителя, сохраняя при этом его гомофазность.

Для оценки растворимости комплексов ДНК-ПАВ в водно-спиртовой среде образцы комплексов ДНК-ПАВ состава 1:1, полученные смешением водных растворов компонентов и отделенные от супернатанта, заливали определенным количеством 2-пропанола различной концентрации и подвергали интенсивному перемешиванию. Через 24 часа (время, достаточное для достижения равновесия) спектроскопически определяли количество ДНК, перешедшей в раствор. Соответствующие зависимости для комплексов ДНК-ЦТАБ и ДНК-ДСДАХ от состава смешанного растворителя представлены на рис.5.

Рис.5. Зависимость

относительной оптической плотности ДНК в супернатанте для

комплексов ДНК400-ЦТАБ (1) и ДНК400-ДСДАХ (2) от состава смешанного

растворителя вода 2-пропанол. Т=20°С.

Видно, что в случае комплекса ДНК-ЦТАБ ДНК обнаруживается в растворе уже при концентрациях 2-пропанола около 25 об.% (кривая 1). В отличие от этого добавление смешанного растворителя к комплексу ДНК-ДСДАХ не приводит к появлению ДНК в растворе во всем интервале соотношений вода - 2-пропанол (кривая 2). Оба исходных комплекса

% содержание спирта

соотношений вода - 2-пропанол (кривая 2). Оба исходных комплекса нерастворимы в воде. Свободная ДНК растворима в воде и в водных растворах 2-пропанола, если концентрация спирта не превышает 60 об. %. Поэтому появление ДНК в смешанном растворителе при концентрациях 2-пропанола, меньших 60%, могло быть только следствием растворения комплекса ДНК-ЦТАБ в результате частичной диссоциации ионных пар ДНК-ПАВ из-за нарушения гидрофобного взаимодействия между углеводородными радикалами амфифильных катионов. В отличие от этого комплекс ДНК-ДСДАХ не переходит в раствор. Он устойчив во всем интервале составов смешанного растворителя.

Наблюдение с помощью флуоресцентного микроскопа за поведением отдельных молекул комплекса ДНК Т4-ЦТАБ, перешедших в смешанный растворитель при различных концентрациях 2-пропанола, дополнило данные, приведенные на рис.5. В этих экспериментах стехиометричный флуоресцентно меченый комплекс ДНК Т4-ПАВ, полученный смешением водных растворов компонентов и отделенный от супернатанта, заливали 1.5 мл водного раствора 2-пропанола различной концентрации. Через 24 часа растворы энергично перемешивали и исследовали методом ФМ. Оказалось, что в этом случае отдельные молекулы ДНК обнаруживаются в растворе (в количестве, недостаточном для спектрального определения) даже при концентрациях 2-пропанола, меньших 25%. При этом все они имеют компактные конформации (Ь=0.7±0.2 мкм). Это означает, что в таких условиях комплекс ДНК-ЦТАБ достаточно устойчив. При концентрации 2-пропанола 30% компактные частицы (Ь=0.8±0.6 мкм) сосуществуют с развернутыми клубками ^=3±0.8 мкм). В 40% водном растворе 2-пропанола ДНК обнаруживается только в форме развернутых молекулярных клубков. Надо полагать, что в этих условиях комплекс ДНК-ЦТАБ уже в значительной мере диссоциирован, и развернутые конформации ДНК устанавливаются благодаря внутримолекулярному электростатическому отталкиванию фосфатных групп. Вместе с тем при концентрациях спирта, превышающих 60%, в поле флуоресцентного микроскопа вновь выявляются только компактные «глобулы», которые через некоторое время фиксируются на поверхности предметного стекла и утрачивают подвижность. Появление таких «глобул» означает, что в исследуемой системе происходит восстановление недиссоциированного комплекса ДНК-ЦТАБ. Поскольку при высоких концентрациях 2-пропанола гидрофобное взаимодействие между цетильными радикалами явно нарушено, стабилизация комплекса ДНК-ЦТАБ в этих условиях, очевидно, обусловлена иным фактором. Скорее всего - это образование контактных ионных пар из-за уменьшения полярности среды. В смешанном растворителе вода - этанол комплекс ДНК-ЦТАБ испытывал аналогичные превращения с той разницей, что

диссоциация комплекса и сопутствующее ей разворачивание исходных «глобул» происходили при более высокой концентрации спирта (около 40%). В отличие от комплекса ДНК-ЦТАБ отдельные молекулы комплекса ДНК Т4-ДСДАХ, переходившие в раствор в результате диспергирования осадка комплекса при энергичном перемешивании, имели компакгные конформации, т.е. не диссоциировали во всем интервале составов смешанного растворителя. Следовательно в последнем случае нарушение гидрофобного взаимодействия, вызываемое присутствием 2-пропанола, само по себе недостаточно для диссоциации комплекса, образованного с участием амфифильных катионов, каждый из которых содержит пару громоздких стеарильных радикалов.

Рассмотрим теперь особенности самого процесса комплексообразования между ДНК и ПАВ в водно-спиртовых растворах,. Отметим, что образование нерастворимого комплекса ДНК-ДСДАХ при невысоких концентрациях 2-пропанола в водном растворе, как и в чистой воде, начинается уже при очень низких концентрациях ДСДАХ (порядка 10-6 моль/л). В частности уменьшение диэлектрической постоянной (с) от 81 для воды до 68 для 20% водного раствора не оказывает заметного влияния на характер взаимодействия ДСДАХ с ДНК: кривая осаждения комплекса практически совпадает с кривой 1 на рис. 1.

Поскольку ДНК не растворяется в смешанном растворителе при концентрациях 2-пропанола, превышающих 60%, для систематического исследования влияния 2-пропанола на комплексообразование между ДНК и ДСДАХ в качестве растворителя был выбран 40%-ный раствор 2-пропанола в воде =55). При такой концентрации спирт уже нарушает гидрофобные взаимодействия между алкильными радикалами ПАВ, но еще не осаждает молекулы ДНК из раствора.

В 40%-ном водном растворе 2-пропанола связывание ДНК в нерастворимый ПКК начинается только после достижения некоторой критической концентрации ДСДАХ (рис.6, кривая 1). Увеличение отношения [ДСДАХ]/[ДНК] в реакционной смеси до 0,8 - 0,9 еще не приводит к изменению содержания ДНК в растворе. Однако при соотношениях [ДСДАХ]/[ДНК], близких к эквимольному, практически вся ДНК переходит в нерастворимый комплекс. В случае ЦТАБ молекулы ДНК остаются в растворе вплоть до соотношения [ЦТАБ]/[ДНК] = 6. При дальнейшем увеличении концентрации ЦТАБ наблюдается уменьшение содержания ДНК в надосадочной жидкости. Однако полное осаждение ДНК происходит лишь при соотношении [ЦТАБ]/[ДНК], близком к 10. Таким образом, хотя в 40%-ном водном растворе 2-пропанола гидрофобное взаимодействие углеводородных радикалов ПАВ заметно ослаблено, различие кривых осаждения ДНК растворами ЦТАБ и ДСДАХ в водно-спиртовой среде указывает на то, что лиофобно-лиофильный

баланс катионов ПАВ на самом деле все же оказывает существенное влияние на их связывание с полианионами ДНК.

Рис.6. Зависимость оптической плотности ДНК400 в надосадочной жидкости в области поглощения ДНК (А. = 260 нм) после отделения нерастворимых комплексов от отношения [ДСДАХ]: [ДН^] (1) и [ЦТАБ]:[ДНК400] (2) в 40%-ном водном растворе 2-пропанола, [ДНК400Н ,5х 10"4 моль/л.

ДНК может существовать в растворе либо в составе растворимого комплекса с ПАВ, либо в свободном состоянии, если ее связывание с амфифильными катионами происходит лишь в области осаждения после достижения определенной пороговой концентрации ПАВ (по типу противоионной конденсации). На седиментограммах комплексов ДНК-ДСДАХ при всех соотношениях ДСДАХ:ДНК в интервале 0,2-0,8 наблюдалась только одна ступенька с коэффициентом седиментации S, соответствующим единственному типу частиц. С увеличением концентрации ДСДАХ происходит линейное возрастание S от 4 до 9 ед. Сведберга. Полученные значения заметно превышают величину S для исходной ДНК ^=4 ед. Сведберга) в том же растворителе. Этим наблюдаемая картина резко отличается от комплексообразования между полиэлектролитами и ПАВ в воде; в этом случае на седиментограммах проявляются две ступеньки: при заселении полиионов ионами ПАВ происходит диспропорционирование, и частицы комплекса постоянного состава, включающие мицеллярную фазу, сосуществуют с еще не заселенными полиионами. Таким образом, данные скоростной седиментации показывают, что в исследованном интервале соотношений ДСДАХ и ДНК образуются растворимые комплексы переменного состава.

Из совокупности приведенных данных следует, что состояние комплекса ДНК-ПАВ определяется равновесием:

Увеличение концентрации ПАВ приводит к смещению равновесия вправо и уменьшению эффективного заряда ДНК. Осаждение ПКК при высоких концентрациях ПАВ свидетельствует о том, что лиофильность частиц ПКК в водно-спиртовом растворе, т.е. их растворимость, обусловлена присутствием свободных заряженных звеньев ДНК подобно тому, как это имеет место в случае нестехиометричных водорастворимых ПКК. Вместе с тем из данных седиментационного анализа следует, что в отличие от водных растворов ПКК в водно-спиртовом растворе связанные ионы ПАВ не образуют внутрикомплексных доменов коллоидной фазы. В водно-спиртовой среде, где гидрофобное взаимодействие нарушено, они равномерно заполняют молекулы ДНК.

Такое равномерное заполнение должно приводить к постепенному снижению линейной плотности отрицательных зарядов и, соответственно, уменьшению размера макромолекулярных клубков. Методом флуоресцентной микроскопии нам удалось проследить за изменением размеров макромолекулярных клубков ДНК Т4 по мере их заполнения ионами ПАВ (рис.7). Полученные результаты показывают, что в отличие от водных растворов, где при комплексообразование ДНК-ПАВ наблюдался дискретный переход макромолекул из клубкообразного состояния в компактное, в водно-спиртовом растворе размеры макромолекул монотонно уменьшаются. Такое уменьшение размеров может происходить только при равномерном заселении молекул ДНК ионами ПАВ.

Рис.7.3ависимость усредненного размера молекул ДНК Т4 от концентрации ДСДАБ в 40%-ном водном растворе 2-пропанола по данным ФМ.

Спектры КД растворимых комплексов ДНК-ДСДАХ различного состава очень близки к спектру исходной ДНК: отношение интенсивностей отрицательной и положительной полос поглощения практически не изменяется. Это означает, что молекулы ДНК в комплексе ДНК-ПАВ в

водно-спиртовой среде сохраняют исходную В форму двойной спирали, характерную для водных растворов ДНК.

Из самого факта растворимости натриевой соли ДНК и нерастворимости ее ЦТА- и ДСДА-солей следует, что последние значительно менее диссоциированы в водно-спиртовой среде, чем натриевая соль. Повышенная стабильность ионных пар, образуемых ДНК и катионами ПАВ, вероятно, обусловлена локальным понижением диэлектрической проницаемости среды в зоне расположения алкильных радикалов ПАВ. С этим предположением согласуется тот факт, что осаждение ДНК при добавлении ДСДАХ происходит при существенно меньшем соотношении ДНК:ПАВ, чем при добавлении ЦТАБ (рис. 6).

Полученный результат принципиально отличается от ситуации в водном растворе, где полиионы ДНК неравномерно заселяются противоионами ПАВ, следуя принципу "все или ничего". В результате диспропорционирования сразу образуется мицеллярная фаза стехиометричного ПКК, которая, переходя в осадок, сосуществует с оставшейся в растворе свободной ДНК. При достижении стехиометрического отношения ДНК/ПАВ вся ДНК переходит в состав нерастворимого ПКК. Образование комплексов ДНК-ПАВ в водно-спиртовой среде происходит по иному механизму. В этом случае полиионы ДНК равномерно заселяются противоионами ПАВ и по мере добавления ПАВ постепенно замещают противоионы натрия, уменьшая тем самым локальную диэлектрическую постоянную среды вблизи полианионов. Последнее, как известно, способствует конденсации противоионов, в том числе №+, на полиионах ДНК и снижению лиофильности последних. В результате при достижении некоторого критического отношения ДНК/ПАВ образуется нерастворимый ПКК, в состав которого наряду с амфифильными катионами вовлекаются и противоионы №+, нейтрализующие фосфатные группы ДНК, еще не заселенные катионами ПАВ.

Состав нерастворимых комплексов ДНК-ПАВ, полученных смешением компонентов в 40%-ном водном растворе 2-пропанола, был определен методом элементного анализа. Для комплекса, осажденного из водно-спиртового раствора, получено: N 6,46; С 63,89; Н 10,90; Р 5,20 %. Из отношения Р к С вычислено [ДСДА+]/[ДНК]= 0,6. Это означает, что в отличие от комплекса, осажденного из воды, здесь около 40% фосфатных групп ДНК нейтрализовано противоионами натрия.

Таким образом, из совокупности приведенных данных следует, что в водно-спиртовом растворе при взаимодействии ДНК с катионными ПАВ в зависимости от мольного соотношения компонентов образуются комплексы переменного состава. При недостатке ПАВ эти комплексы растворимы и остаются в растворе вплоть до достижения определенной

критической концентрации ПАВ, которая зависит от его природы. В водно-спиртовой среде полианионы ДНК, входящие в состав растворимых комплексов, равномерно заселены катионами ПАВ, и молекулы ДНК сохраняют исходную конформацию В-формы.

3. СТРОЕНИЕ КОМПЛЕКСОВ ДНК-ПАВ, ПОЛУЧЕННЫХ В ВОДНЫХ И ВОДНО-СПИРТОВЫХ СРЕДАХ.

Комплексы ДНК-ПАВ, полученные из разных сред и характеризующиеся различным составом, по-видимому, должны отличаться структурой и морфологией. Для исследования структуры нерастворимых комплексов использовали методы калориметрии и рентгеновского анализа в больших и малых углах.

На термограммах комплексов ДНК-ДСДАХ, полученных из воды и 40% водного раствора 2-пропанола, присутствует один эндотермический пик вблизи температуры 40°С. Аналогичный пик наблюдали на термограммах везикул ДСДАХ в водных средах. Процесс, который связан с появлением этого пика, в литературе отнесен к переходу бислоя из твердого в жидкокристаллическое состояние. Можно ожидать, что молекулы ДСДАХ в полученных комплексах также образуют структуры, сходные со структурой везикулярного бислоя ДСДАХ.

. Рентгенограммы комплексов ДНК-ДСДАХ в больших углах характеризуются очень сильным (о.с.) рефлексом, отвечающим межплоскостному расстоянию 4.15 А, что указывает на гексагональную упаковку алифатических радикалов ПАВ. В малых углах для комплексов ДНК-ДСДАХ наблюдали два значительно отличающихся по интенсивности рефлекса. Основной сильный (с.) рефлекс соответствует межплоскостному расстоянию 38 А. Слабый рефлекс (сл.) соответствует примерно половине межплоскостного расстояния, что позволяет отнести этот рефлекс к дифракции второго порядка на тех же плоскостях.

Таблица 2. Физико-химические свойства нерастворимых комплексов ДНК-ДСДА, полученных в 40% водном растворе 2-пропанола и воде.

пкк [ДСДА]: ГДНК1 т °г ■»ПП > ^ ДНш,Дж/г «и

Из 40% 2-пропанола 0.6 38.3 27.6 4.15 (о с) 19 (сл) 38 (с)

Из воды 1.15 36.8 35.9 4.15 (о.с) 19 (сл) 38 (с)

Обычно такая картина характерна для ламелярной структуры. В данном случае надо полагать, что молекулы ДНК располагаются между плоскостями ламелей, образованных катионами ПАВ. На рентгенограмме одноосно ориентированной пленки комплекса наблюдается текстура с двумя экваториальными рефлексами большой и малой интенсивности, соответственно, d=38 А и d=19 А и меридиальным рефлексом с d=4.15 A. (см. табл.2). Последнее указывает на то, что алкильные радикалы ПАВ в ламелях ориентированы перпендикулярно оси молекул ДНК.

Температура плавления комплекса ДНК-ДСДАХ, содержащего наряду с катионным ПАВ около 40 мол.% противоионов №+, оказывается не ниже, а даже несколько выше, чем температура плавления комплекса, содержащего только катионы ПАВ. По нашему мнению, это означает, что фосфатные группы ДНК, нейтрализованные катионами №+, не нарушают упаковку алкильных радикалов в ламелях, а образуют собственные домены. Различия в удельных энтальпиях плавления (AHпл) изученных комплексов естественным образом объясняются меньшей объемной долей противоионов ПАВ в комплексе, полученном из водно-спиртового раствора.

Как уже было отмечено, молекулы ДНК, образующие нерастворимый комплекс с ПАВ в воде, сохраняют конформацию двойной спирали. А сохраняется ли двойная спираль ДНК в нерастворимом комплексе, осаждающемся из водно-спиртового раствора? Для оценки целостности двойной спирали мы использовали метод ИК-спектроскопии, так как известно, что при разрушении двойной спирали ДНК характеристические полосы в области 1700-1720 см-1, относящиеся к колебаниям водородных связей между азотистыми основаниями, сдвигаются в коротковолновую область на 20-30 см"1. Отсутствие таких изменений в комплексе ДНК-ДСДАХ, полученном из водно-спиртового раствора, свидетельствует о сохранении двуспиральной конформации ДНК.

Таким образом, из совокупности приведенных данных следует, что различные по составу комплексы ДНК-ДСДАХ, полученные из водной и водно-спиртовой среды, в конденсированной фазе имеют сходную ламеллярную структуру. Ламели образованы катионами ПАВ, нейтрализующими фосфатные группы ДНК. При этом полианионы ДНК, располагающиеся в слоях между ламелями, существуют в конформации двойной спирали.

Морфологию частиц комплексов ДНК-ДСДАХ, полученных в воде и водно-спиртовой среде, изучали методами атомно-силовой (АСМ) и сканирующей туннельной микроскопии (СТМ).

На рис.8 представлены типичные СТМ и АФМ изображения частицы комплекса ДНК-ПАВ, полученного в водном растворе, которая

осела на поверхность пирографита. Наблюдаемые конденсированные структуры имеют форму тороидов диаметром 0.1-0.2 мкм и содержат в среднем от 5 до 15 молекул ДНК. Эту сравнительно высокую степень агрегации можно объяснить гидрофобными взаимодействиями углеводородных радикалов ПАВ, включенных в состав комплекса.

Рис.8. СТМ и АСМ изображения комплексов ДНК^-ДСДАХ (А) (размер кадра:380х380 нм) и ДНК^-ЦТАБ (Б).

Углеводородные фрагменты молекул ПАВ, стремясь «оказаться в окружении себе подобных, притягиваются друг к другу. Тем самым они отгораживаются от молекул воды и превращают полиэлектролитный клубок в плотную компактную частицу.

Однако конденсация с образованием тороидальных структур может происходить также и на уровне отдельных макромолекул ДНК. Это мы показали, проведя АСМ исследования непосредственно в проточной жидкостной ячейке. Ячейку заполняли раствором ДНК Т4 в смешанном растворителе (40% водный раствор 2-пропанола). Затем в нее постепенно вводили раствор ДСДАХ в том же растворителе. Оказалось, что в этих условиях ДНК осаждалась на поверхность подложки как в виде плотных компактных глобулярных частиц, так и в виде тороидальных частиц диаметром 0.1-0.3 мкм, образованных только одной макромолекулой (рис.9а). Эти тороидальные образования можно считать зародышами торов, которые мы наблюдали на поверхности пирографита на воздухе (рис.8).

Конденсация отдельных макромолекул ДНК в водно-спиртовой среде может происходить и в отсутствие молекул ПАВ. Это было показано в следующей серии опытов. Раствор Т4 ДНК в 40% изопропаноле вводили в жидкостную ячейку. Затем концентрацию спирта в ячейке повышали до

А

Б

80%. В этих условиях происходит конденсация ионов №+ на полианионе ДНК, что приводит к нейтрализации его заряда и потере растворимости.

а ' б

Рис. 9. АСМ изображение комплекса ДНК Т4-ДСДАХ (а) и ДНК Т4 (б), полученных в растворе 2-пропанола. Размер кадра: а - 3.6x3.6 мкм; б - 2x2 мкм.

На рис. 96 представлена одна из типичных АСМ фотографий. Видно, что отдельная макромолекула гигантской ДНК зафиксирована на поверхности подложки на пути ее скручивания в отчетливо выраженную компактную тороидальную структуру. В этих экспериментах компактизацию ДНК нельзя объяснить специфическим взаимодействием нейтрализующих ее лигандов, поскольку таковые отсутствуют. Последние данные свидетельствуют о том, что склонность молекул ДНК к образованию компактных тороидальных структур на самом деле является внутренним свойством незаряженной двойной спирали.

4. КОМПЛЕКСЫ ДНК-ПАВ В МАЛОПОЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ.

К началу проведения наших исследований было установлено, что стехиометричные комплексы, образованные гибкоцепными полиионами и противоположно заряженными ПАВ, способны растворяться в органических растворителях с низкой диэлектрической постоянной. В разделах 1-2 показано, что при взаимодействии жесткоцепного полииона ДНК с катионными ПАВ в водной и водно-спиртовой средах образуются нерастворимые комплексы ДНК-ПАВ состава, близкого к стехиометрическому. Формирование подобных комплексов сопровождается гидрофобизацией и компактизацией макромолекул ДНК. Можно, ожидать, что эти комплексы также будут растворимы в малополярных органических растворителях.

Результаты исследования растворимости комплексов в малополярных органических растворителях с диэлектрической проницаемостью е=2.0-4.7 приведены в табл.3. Комплексы получали смешением разбавленных водных растворов нативных ДНК400, ДНЕ^м и ДНК7500 (10-20 мкг/мл) с водными растворами ДСДАХ и ЦТАБ (0.001 М), взятыми в эквимольных количествах по отношению к фосфатным группам ДНК. Полученные осадки комплексов отделяли от супернатанта центрифугированием, сушили над СаС12 в вакуумном эксикаторе до постоянного веса и помещали в органический растворитель. Из данных табл. 3 следует, что способность растворяться в малополярных органических средах - общее свойство исследованных комплексов ДНК-ПАВ. Необходимо отметить, что тщательное удаление воды и использование сухих растворителей является обязательным условием для растворимости комплексов, образованных высокомолекулярными фракциями ДНК (ДН^ и ДНК7500).

Таблица 3. Растворимость комплексов ДНК-ПАВ в малополярных органических растворителях.

Тип комплекса Хлороформ (Е=4.7) Гептан (е=4.0) Циклогексан (е=2.0)

ДНК400-ЦТАБ + + ■ +

ДНКгооо-ЦТАБ + + +

ДНК400-ДСДАХ + + +

ДНКзооо-ДСДАХ + + +

ДНК7500-ДСДАХ + + +

ДНК7500-ЦТАБ + + +

+ способность комплекса растворяться.

Систематическое исследование растворов комплексов ДНК-ПАВ в хлороформе проведено методами скоростной седиментации, вискозиметрии, диффузии, УФ- и КД- спектроскопии.

Флотационные профили комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе, соответствующие различной продолжительности центрифугирования, приведены на рис.10. Во всех случаях они содержат только одну ступеньку. Поскольку ДНК в отсутствие ПАВ в хлороформе не растворяется, из приведенных данных следует, что комплексы ДНК-ПАВ не диссоциируют на отдельные компоненты, т.е. представляют собой индивидуальные соединения. Аналогичные результаты получены также и для комплексов ДНК-ЦТАБ в хлороформе.

Известно, что при разрушении двойной спирали в УФ-спектрах растворов ДНК наблюдается гиперхромный эффект. По величине эффекта оценивают долю звеньев, входящих в состав двойной спирали.

Рис.10. Флотационные профили комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе, полученные на сканирующей центрифуге при различной продолжительности центрифугирования. а: ДНКгооо, время центрифугирования соответственно 2 (1), 13 (2) и 26 (3) мин, (0=40 ООО об/мин; б: ДНК400, время центрифугирования 4 (1), 12 (2), 17 (3) и 29 (4) мин, со=бО ООО об/мин, Т=20°С.

В нашем случае УФ-спектры растворов комплексов ДНК-ПАВ в хлороформе не отличались от УФ-спектра ее водного раствора. Все спектры имели максимум поглощения в области 260 нм. Коэффициент экстинкции комплексов ДНК-ПАВ в хлороформе был равен коэффициенту экстинкции исходной ДНК в воде и составлял 6500-6700 моль"1 см*1. Отсутствие гиперхромного эффекта при замене воды на органический растворитель свидетельствует о том, что ДНК, включенная в комплекс, сохраняет конформацию двойной спирали. Уф-спектроскопия, однако, не дает информации о форме двойной спирали, т.е. об ее тонкой структуре в комплексе. Представление об этой структуре можно получить с помощью КД-спектроскопии. Спектры КД представлены на рис.11. В отличие от водного раствора ДНК, в КД-спектрах комплексов ДНК-ПАВ в хлороформе проявляются черты, характерные для С- и А-форм двойной спирали. В частности, для комплекса ДНКгооо наблюдается длинноволновая положительная полоса с максимумом около 280 нм и молярным дихроизмом меньше 2 град*см2*дмоль-1, а также интенсивная коротковолновая отрицательная полоса с минимумом при 240 нм.

—_>

1

им

Рис.11. КД-спектры комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе для ДНК™ (1), ДНК400 ( 2) и для исходных ДНК в 0.5хТВЕ-буфере (3).

Точка инверсии (Де =0) лежит в области 270 нм. В спектре комплекса ДНК400 проявляются черты, характерные для спектра ДНК в А-форме. В нем присутствует интенсивная длинноволновая положительная полоса с максимумом около 270 нм и коротковолновая отрицательная полоса с минимумом при 240 нм. Точка инверсии лежит в области 255 нм. А- и С-формы ДНК отличаются от В-формы, характерной для водных растворов, большей закрученностью спирали. Объяснить структурные изменения, т.е. переход из В-формы в А или С-форму, которые типичны для сконденсированных молекул ДНК, можно единственным способом: предположив, что молекулы ДНК в комплексе с ПАВ в органическом растворителе находятся в достаточно компактном состоянии.

Для установления конформационных характеристик растворенного в хлороформе комплекса ДНК-ДСДАХ мы изучили гидродинамическое поведение растворов. На рис.12 представлены концентрационные зависимости приведенной вязкости растворов комплексов ДНК400-ДСДАХ и ДНК7500-ДСДАХ в хлороформе, а также в смеси хлороформ-ацетон.

18

Рис.12. Концентрационные зависимости приведенной вязкости растворов, Т=20°С.

1 - ДНК400-ДСДАХ в хлороформе и в смеси хлороформ+ацетон (2:1)

2 - ДНК7500-ДСДАХ в хлороформе и

2

О

00 02 04 06 08 1 0 1.2

ОДш

в смеси хлороформ+ацетон (2:1)

3 - ДНК4а) в ТВЕ-буфере

4 - ДНК7500 в ТВЕ-буфере

В исследованной области концентраций зависимости имеют линейный характер. Путем экстраполяции были оценены значения

характеристической вязкости, а из наклона экспериментальных зависимостей рассчитаны постоянные Хаггинса. Значения характеристической вязкости комплексов в хлороформе и в смеси хлороформ-ацетон (2:1) практически совпадают. Это означает, что добавление ацетона в указанных пределах не влияет на гидродинамические размеры растворенных частиц. Постоянная Хаггинса к' в обоих растворителях близка к величине 0.7, характерной для растворов жестких сферических молекул в -растворителях. Коэффициенты диффузии комплексов в разбавленных растворах оценили из дисперсии диффузионной границы Для этого использовали

смешанный растворитель, в котором в отличие от хлороформа диффузионную границу можно было наблюдать с помощью рефрактометра. Величину

<02> рассчитывали из концентрационного профиля диффундирующего вещества в ячейке, содержащей раствор и чистый растворитель. Для этого использовали метод площади и максимальной ординаты в предположении гауссовой формы концентрационной границы диффундирующего вещества. Зависимости от времени для различных комплексов хорошо аппроксимировались прямыми, из наклона которых были рассчитаны средневесовые коэффициенты диффузии комплексов D. Полученные данные суммированы в табл.4.

Подставляя экспериментальные значения D и [т|] и известную величину гидродинамического инварианта Ао=(3.2±0.2)-1(Г10эрг/К(моль)л/3 в соотношение Мол ^АДТ)/ г|оУ'100/[т|], мы оценили молекулярную массу комплексов. Полученное таким образом значение для комплекса ДНК400-ДСДАХ в пределах погрешности эксперимента соответствовало величине молекулярной массы М*р, которую следовало ожидать Таблица 4. Гидродинамические и молекулярно-массовые характеристики

Образец Растворитель м. дл/г к" Оох107, см2/с М*рх 10^ Мо.хЮ"6

ДНК400- ДСДАХ хлороформ 0.55 0.66 0.36

ДНК4 оо" ДСДАХ хлороформ+ ацетсн (2:1) 0.55 0.66 3.7±0.1 0.3 ±0.02

ДНК7500-ДСДАХ хлороформ 0.55 0.66 6.0

ДНК7500- ДСДАХ хлороформ+ ацетон (2:1) 0.55 0.66 1.6±0.3 4±2

в предположении, что каждая растворенная частица комплекса содержит одну макромолекулу ДНК длиной в 300-500 пар оснований, комплекса ДНК7500-ДСДАХ оценена с существенно большей погрешностью из-за значительной полидисперсности исходной ДНК. Однако и эта экспериментально определенная величина в пределах ошибки соответствует рассчитанной в предположении, что индивидуальная частица комплекса в растворе содержит одну макромолекулу ДНК7500. Последний вывод подтверждается прямолинейностью концентрационных зависимостей коэффициентов поступательной диффузии частиц комплексов ДНК400-ДСДАХ и ДНК7500-ДСДАХ в растворе.

Важно отметить, что при существенно различающихся длинах макромолекул ДНК в двух исходных образцах, величины коэффициента поступательной диффузии и значения [т|] соответствующих комплексов практически не отличаются друг от друга. Независимость [т]] от молекулярной массы комплексов означает, что плотность мономерных звеньев в объеме растворенных частиц не зависит от длины цепи (молекулярной массы) ДНК, т.е. V~M, где ^эффективный гидродинамический объем. Такое, в частности, характерно для макромолекул, свернутых в плотные глобулы, для которых среднеквадратичный радиус инерции пропорционален корню кубическому из молекулярной массы, т.е. (<11^>),/2~Мш Однако этому условию могут удовлетворять и другие модели, например, цилиндр, образованный молекулярным стержнем, скрученным в спираль с плотно уложенными витками. В последнем случае эффективный объем, исключенный из процесса ламилярного течения, также, оставаясь пропорциональным М, т.е. длине молекулярного стержня, может быть существенно больше его собственного объема. Соответственно возрастет и величина [т|] при сохранении ее независимости от М. В самом деле, экспериментально измеренное значение [т|] (0.55 дл/г) на порядок превышает величину, ожидаемую для плотных сферических частиц. Учитывая, что коэффициент поступательной диффузии Б~М4/3, имеем Однк400 /Цщпс7500 = (Мдщс7500 / Мднк40о)Ш • Из данных табл.4 следует, что Бдщс«» /Цднк75оо=2.3, что удовлетворительно согласуется с рассчитанным значением (Мднк7500 /

Методом ФМ нам удалось наблюдать компактные частицы швшша ДНК Т4=ДЩАМ 8 м§р§ф§рме ш вщвт ш размер ((Ш(У цкм), «жрй Шшк к щшщ чаетвд, §1рзр§щшя щш тжмшттт м§зещщ ДНК Т4 § ДСЩАМ 8 §§дш8 ёреае:

Методом АСМ была определена форма отдельных частиц комплексов ДНК-ПАВ, оседающих из раствора в хлороформе на поверхность графита. Оказалось, что это - торозды, внешний диаметр

которых для молекул ДНК различной длины и различных ПАВ, меняется в пределах от 100 до 300 нм. Существенно, однако, что здесь один тор включает в среднем одну молекулу ДНК, в отличие от тороидальных агрегатов, образующихся в водной среде.

Компактизацию ДНК под влиянием ПАВ в неполярном органическом растворителе нельзя объяснить притяжением алифатических фрагментов ПАВ друг к другу, подобным их гидрофобному взаимодействию в водных средах, поскольку само растворение комплекса в органической фазе обусловлено «смешением» этих фрагментов с молекулами растворителя. Ее нельзя объяснить и взаимным притяжением диполей, состоящих из противоположно заряженных групп ДНК и ПАВ, которые в неполярной среде образуют контактные ионные пары В самом деле, ранее было показано (Вакееу КЖ й а]. Масгошо1еси1е8 1996, 29, 1320), что в отличие от комплексов ДНК, комплексы, образованные гибкоцепными полиионами и противоположно заряженными ПАВ, в хлороформе ведут себя, как отдельные макромолекулы в хорошем растворителе и существуют в виде развернутых молекулярных клубков.

Таким образом, компактная конформация отдельных макромолекул комплексов ДНК-ПАВ в неполярном растворителе, установленная нами с помощью прямого и косвенных физико-химических методов, скорее всего, обусловлена особенностями двухцепочечной структуры нативной ДНК как таковой, т.е. является внутренним свойством незаряженной двойной спирали. Полученный результат свидетельствует о плодотворности модельного представления ионизованной ДНК как внутренне напряженного эластичного стержня, стремящегося принять компактную форму и реализующего это стремление при нейтрализации отрицательных зарядов на его поверхности.

5. ПЕРЕНОС МОЛЕКУЛ ДНК ЧЕРЕЗ МЕЖФАЗНУЮ ГРАНИЦУ ВОДА-ХЛОРОФОРМ.

Известно, что комплексы, образованные гибкоцепными полиионами и противоположно заряженными ПАВ, в водных средах диссоциируют на исходные компоненты при добавлении определенных количеств низкомолекулярной соли. Представляло интерес убедиться, что последнее справедливо и для комплексов ДНК-ПАВ. Для этого стехиометричный комплекс ДНК-ПАВ, полученный смешением водных растворов компонентов и отделенный от супернатанта, заливали определенным количеством водного раствора №С1 различной концентрации. Через 24 ч (время, достаточное для установления равновесия)

спектрофотометрически определяли количество ДНК, перешедшей в водную фазу. Соответствующие зависимости представлены на рис.13.

Видно, что при концентрациях №0, превышающих 0.25 моль/л, ДНК начинает переходить в водно-солевой раствор; это происходит в результате диссоциации комплекса. Количество ДНК в растворе увеличивается с повышением концентрации №0. При концентрациях №0, превышающих 1.0 моль/л, комплексы полностью диссоциируют и практически вся ДНК переходит в раствор.

С (№С1), М

Рис.13. Зависимость доли ДНК400, перешедшей в раствор, от концентрации №0 в системах:

1-ДНК-ЦТАБ,

2-ДНК-ДСДАХ

Аналогичное влияние соли мы наблюдали методом ФМ и для комплексов, образованных отдельными молекулами ДНК Т4 и катионными ПАВ. Оказалось, что при концентрациях низкомолекулярного электролита, не превышающих 0.4 моль/л, молекулы ДНК еще сохраняют компактные конформации. Однако уже при [КаС1]~0.45 моль/л компактные глобулы сосуществуют с развернутыми клубками: промежуточные конформации не наблюдаются. При моль/л все

молекулы ДНК переходят в конформации развернутых клубков. Таким образом, данные прямого визуального наблюдения также свидетельствуют о том, что комплексы ДНК- ПАВ при достаточно высокой концентрации низкомолекулярной соли полностью диссоциируют на исходные компоненты. Вместе с тем данные, полученные методом ФМ, позволяют сделать и другой важный вывод: переход компактной конформации в клубкообразную при добавлении №0 для каждой молекулы ДНК происходит дискретно по принципу «все или ничего», т.е. диссоциация комплексов ДНК-ПАВ под влиянием низкомолекулярных солей носит отчетливо выраженный кооперативный характер.

Для исследования возможности переноса молекул ДНК через межфазную границу из воды в хлороформ была выполнена следующая серия экспериментов. Водный раствор ДНК400 моль/л)

смешивали с двойным объемом хлороформа и в образовавшуюся

двухфазную систему добавляли различные количества ПАВ. Полученную смесь интенсивно перемешивали, центрифугировали для ускорения макроскопического фазового разделения, а затем выдерживали в течение нескольких часов до полного расслаивания и установления равновесия. Затем спектрофотометрически определяли концентрацию ДНК400 в водной и органической фазах На рис.14 представлены зависимости равновесного относительного содержания ДНК400 в водном (кривые 1 и 2) и в органическом слоях (кривые 3 и 4) от заданного суммарного отношения ПАВ/ДНК в системе.

Рис.14. Зависимость

содержания ДИЗС^ в водной фазе (1,2) и в фазе хлорофорхма (3,4) в присутствии ДСДАХ (3,1) и ЦТАБ(4,2).

Видно, что убыль ДНК в воде соответствует ее накоплению в хлороформе. При 1,5 кратном избытке ПАВ практически вся ДНК оказывается в органической фазе.

Подобный перенос, однако, не происходит в системах, содержащих относительно высокомолекулярные ДНК^ и ДНК7500. В этом случае комплексы ДНК-ПАВ в виде макроскопических агрегатов группируются вблизи границы раздела фаз. Ранее было отмечено, что для растворения в органическом растворителе комплекса высокомолекулярной ДНК с ПАВ прежде необходимо тщательно высушить оба компонента. Поэтому отсутствие переноса в таких системах в условиях, когда водная и органическая фазы сосуществуют, представляется вполне естественным.

АСМ-изображения комплексов ДНКщсгДСДАХ, перешедших через межфазную границу из воды в хлороформ, приведены на рис.15. Наблюдаемые тороидальные структуры имеют внешний диаметр 100±30 нм.

Обратный перенос молекул ДНК400 из органической фазы в водную можно было вызвать добавлением в систему №0. Для этого слой органической фазы (1мл), содержащий различные количества растворенного комплекса отделяли от водного слоя и

смешивали с 0.5 мл 0.5 М или 1.5 М водного раствора №С1. Смесь интенсивно перемешивали, разделяли центрифугированием и определяли равновесную концентрацию ДНК в каждой из фаз. Полученные результаты приведены в табл. 5.

< ' - ■

1 * л* * '

\ »V * - ~

: « * V1"

•V к * ^ г 3 с _ . ,

>^<,гЧ -'Л5

Рис.15. Комплексы ДНК400-ДСДАХ, перешедшие в хлороформ из водной фазы и адсорбированные для АСМ-исследования на поверхности слюды.

Таблица 5. Перенос молекул ДНК400 из хлороформа в водный раствор №С1.

Исходная концентрация ДНК в хлороформе, моль/л 9хЮ"5 1.8хЮ"5 2.4хЮ"5 З.ОхЮ"5

Концентрация ДНК в 0.5 М ЫаС1, моль/л 3x10* 3x10* 3x10* З.ОхКГ6

Концентрация ДНК в 1.5 М ЫаС!, моль/л 7.5x10"5 1.5*10"5 1.9хЮ'5 2.6х10"5

Видно, что в изученных системах действительно происходит перенос ДНК из хлороформа в водно-солевой раствор. При этом равновесная концентрация перешедшей ДНК не зависит от исходной концентрации ее комплекса в хлороформе, но зависит от концентрации №С1. При концентрации №С1 в водной фазе 1.5 М достигается практически полный перенос.

Таким образом, нами установлено ранее неизвестное явление обратимого переноса относительно коротких молекул ДНК через поверхность раздела водной и органической фаз, контролируемого катионным ПАВ и простой солью. Учет полученных результатов может оказаться полезным при изучении механизмов трансмембранного транспорта молекул ДНК.

6. КОМПЛЕКСЫ ДНК С ДЕНДРИТНЫМИ ПОЛИКАТИОНАМИ.

Известно, что полианионы ДНК подобно другим полианионам способны кооперативно связываться с линейными поликатионами в водных растворах, образуя интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК). Включение ДНК в такие ИПЭК приводит к существенному изменению ее свойств, в том числе к компактизации, повышению стабильности против расщепления нуклеазами и увеличению трансформирующей активности по отношению к клеткам.

Мы изучили взаимодействие молекул ДНК с регулярно разветвленными дендритными поликатионами - продуктами протонирования полипропилениминовых дендримеров (ППИД) пяти поколений.

Строение ППИД представлено структурными формулами на рис. 16. Число х периферийных первичных аминогрупп в молекулах ППИД 1-ого (ППИД-1), 2-ого (ППИД-2), 3-его (ППИД-4), 4-ого (ППИД-4) и 5-ого (ППИД-5) поколений соответственно равно 4,8,16,32 и 64, а суммарное число внутренних третичных и первичных аминогрупп Х=2х-2. Как первичные, так и третичные аминогруппы ППИД могут быть протонированы; тогда молекула дендримера превращается в поликатион.

Дендритные поликатионы ППИД всех пяти поколений, взаимодействуя с полианионами в водных растворах, образуют ИПЭК. Ранее показано, что полностью протонированные ППИД вполне проницаемы для гибкоцепных полианионов так, что не только

Рис.16. Структуры мономерного звена полипропилениминового дендримера (А), дендримеров 1-ого (Б) и 5-ого (В) поколений.

периферийные первичные, но и внутренние третичные аминогруппы дендримеров оказываются доступны для заряженных групп полианиона и образуют с ними ионные пары (Kabanov V.A. et в1. Macromolecules 1999,

32,1904.).

Нашей задачей было выяснение особенностей взаимодействия поликатионов ППИД с жесткими полианионами нативной ДНК.

А

Б

В

При добавлении водных растворов ППИД к водным растворам ДНК при основомольных отношениях Z=[l 11 ШД]/[ДНК]<0.5 смеси оставались прозрачными. При Z>0.5 происходило постепенное нарастание мутности из-за образования нерастворимых ИПЭК. Их отделяли центрифугированием и спектрофотометрически определяли концентрацию ДНК, оставшейся в надосадочной жидкости. На рис. 17 приведены типичные зависимости остаточной относительной оптической плотности (А/А0) растворов ДНК после отделения нерастворимой фракции от состава исходной смеси Z.

Рис. 17. Зависимость относительной оптической плотности ДНК в надосадочной жидкости после отделения нерастворимых комплексов ДНК-ППИД, образующихся при смешении раствора ДШС400 (рН~7; 0.01 М №аС1) с растворами ППИД дендримеров (рН=3; 0.01 М №аС1), от состава смеси Z. ППИД-1 (1), ППИД-2 (2), ППИД-3 (3), ППИД-4 (4),ППИД-5(5).

Резкое уменьшение поглощения при Z>0.5 и практически полное отсутствие молекул ДНК в исследуемом растворе при Z=l показывает, что в исследованном интервале составов ДНК образует нерастворимые комплексы с дендримерами всех пяти поколений. В области 0.5^<1 происходит известное явление диспропорционирования; в этом интервале нерастворимые стехиометричные ИПЭК сосуществуют со свободными полиионами ДНК.

Единичные стадии кооперативной реакции комплексообразования ДНК с дендримерами представлены на следующей схеме:

чЫ

"о ни о=Р-О—

"о н' О=Р-О-

I _

о м

+ п

+ пКа*+ пСГ

+ + пСГ

РОС НАЦИОНАЛ ШЛЯ

библиотека С.пе«рвург 09 ТО» _

Существенно, что образование комплекса ДНК-дендример сопровождается выделением в окружающую среду ионов №+ и С1- в количестве, эквивалентном числу образовавшихся межцепных ионных пар (солевых связей). Поэтому при полном завершении реакции комплексообразования ИПЭК не должны содержать низкомолекулярных ионов. Из этого следует, что если в нерастворимом комплексе ДНК-дендример обнаружить и количественно измерить, например, содержание ионов С1-, то можно определить количество межцепных ионных пар, а следовательно, и долю фосфатных групп ДНК, не связавшихся с аммонийными группами дендримеров. В тщательно промытом и высушенном комплексе ДНК-ППИД-4, полученном при исходном /=1, было найдено Р 8,4±0,1 вес.%, С1 3,0±0,2 вес.%, что соответствует атомному отношению [Р]/[С1]=3. Это значит, что в отличие от гибкоцепных полианионов, в случае жесткого полианиона нативной ДНК, около 30% фосфатных групп, вовлеченных в состав нерастворимого ИПЭК, не участвуют в образовании межцепных солевых связей. Иными словами, около трети аминогрупп ППИД-4 (по всей вероятности тех, что расположены во внутреннем слое дендритного поликатиона) оказываются стерически недоступными для полианиона ДНК.

Из данных рис.17 следует, что существенное отличие в поведении ППИД различных поколений проявляется при />1. Видно, что в противоположность ППИД-1 и -2, добавление дендримеров более высоких поколений (ППИД-3, -4, и -5) приводит к увеличению содержания ДНК в надосадочной жидкости. Это, по-видимому, указывает на образование водорастворимых комплексов ДНК-ППИД, включающих избыточное количество положительно заряженных аминогрупп дендримеров, которые и обеспечивают растворение соответствующих частиц комплекса. Следует отметить, что образование водорастворимых комплексов ДНК с ППИД высоких поколений не зависит от порядка смешения реагентов, происходит только в присутствии 0.01 М №С1 и не происходит при смешении гибкоцепных полианионов (полиакрилат и

полистиролсульфонат) с этими же дендримерами в идентичных условиях.

На седиментограммах всех образцов, полученных смешением растворов ДНК и ППИД-3, ППИД-4 и ППИД-5 при соотношении г=2.5, наблюдается единственная граница, указывающая на существование в растворе только одного типа частиц. Соответствующий этой границе коэффициент седиментации 8 (69 ед. Сзедберга) больше чем в 5 раз превышает значение 8 свободной ДНК (13 ед.Сведберга). Наблюдаемое в присутствии дендримера повышение коэффициента седиментации не может быть объяснено только увеличением молекулярной массы комплекса, которое не превышает 10%. Результаты седиментационных

экспериментов показывают, что включение молекулы ДНК в состав ИПЭК при Z>1, по-видимому, приводит к ее компактизации.

Непосредственное свидетельство компактизации ДНК при ее взаимодействии с дендримерами получено нами методом ФМ. В зависимости от концентрации в растворе дендримеры всех пяти поколений вызывают переход молекул ДНК из развернутой конформации молекулярного клубка в компактную глобулярную конформацию табл. 6.

Таблица 6. Конформации комплексов ДНК-ППИД, наблюдаемые во флуоресцентный микроскоп, от концентрации дендримера в растворе.

дендример 1x10*, М 3x10*, М 5х10-*,М 1х10'3,М

ППИД-1 клубок клубок клубок глобула

ППИД-2 клубок клубок клубок глобула

ППИД-3 клубок глобула глобула в растворе

ППИД-4 клубок глобула глобула в растворе

ППИД-5 "клубок глобула глобула в растворе

На рис. 18 представлена зависимость размера молекул ДНК Т4 от концентрации добавленного ППИД-4.

Рис.18. Зависимость размера L ДНК Т4 от состава смеси Z=[ППИД-4]/[ДНК].

0.5 1 1.5

В интервале 0^<0.5 клубки, уменьшаясь в размерах, свободно перемещаются в объеме, участвуя в тепловом движении и сохраняя растворимость. Однако, когда состав реакционной смеси становиться равным Z=l, молекулы ДНК переходят из клубкообразной конформации в «глобулярную», и значение Ь становится равным 0.8 мкм. При этом «глобулы» утрачивают растворимость, прилипают к поверхности покровного стекла и становятся неподвижными в поле микроскопа. Увеличение содержания ППИД-4 в реакционной смеси сверх эквивалентного приводит к образованию набухших «глобул» ДНК, которые свободно перемещаются в растворе, т.е. сохраняют растворимость. Эти «глобулы» характеризуются размерами около 1 мкм.

Из сопоставления спектров кругового дихроизма растворимых комплексов и исходной ДНК мы определили конформацию ДНК в водорастворимом комплексе ДНК-ППИД-4. Молекулы исходной ДНК в растворе находятся в В-форме, которая характеризуется наличием положительной длинноволновой полосы с максимумом около 280 нм и отрицательной коротковолновой с минимумом около 250 нм, сравнимыми по интенсивности; точка пересечения (Де=0) лежит вблизи максимума поглощения 260 нм. Спектр же комплекса асимметричен и характеризуется наличием интенсивной коротковолновой полосы с минимумом при 240 нм и положительной длинноволновой полосы значительно меньшей интенсивности с максимумом около 280 нм. Точка инверсии (Де=0) лежит в области 270 нм. Такие спектры КД характерны для плотно упакованных нуклеиновых кислот, находящихся в фаговых корпускулах (Кагазеу, ЛУ., БоЬют Е.№., 1п1ТВю1.Масгото1. 1988, 10, 227). Это означает, что при образовании водорастворимого комплекса ДНК-ППИД-4, происходит переход из В-конформации в конформацию более закрученной двойной спирали, которая характерна для сильно компактизированных молекул ДНК.

Таким образом, ППИД всех 5-ти поколений, взаимодействуя с ДНК при основомольных отношениях 0.5<2=[ППИД]/[ДНК]<1, образуют водонерастворимые ИПЭК. Комплексообразование сопровождается компактизацией молекул ДНК. Однако при 2>1 дендримеры более высоких поколений (ППИД-3, -4 и -5), в отличие от ППИД-1 и -2, способны образовывать перезаряженные растворимые частицы комплекса, в которых молекулы ДНК сохраняют компактные конформации.

7.ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МОЛЕКУЛ ДНК СО СЛАБО СШИТЫМ КАТИОННЫМ ГИДРОГЕЛЕМ.

Известно, что гибкоцепные полиионы способны реагировать со слабо сшитыми противоположно заряженными гидрогелями. Во всех

случаях в качестве продуктов реакции образуются сшитые интерполиэлектролитные комплексы (#ИПЭК). Однако в зависимости от химической структуры полииона реакция распространяется либо на всю глубину исходного гидрогеля, либо останавливается в его поверхностном слое.

Взаимодействие ДНК с линейными поликатионами как конденсирующими агентами в водных растворах интенсивно исследуется в последние годы. Компактизация ДНК в таких системах также происходит в результате образования ИПЭК ДНК - поликатион.

Двойная спираль нативной ДНК при рН>11 денатурируется, диссоциируя на составляющие ее одиночные полинуклеотидные цепи. Денатурация обратима: в нейтральной среде двойная спираль восстанавливается. Таким образом, переход от нейтральной среды к щелочной, дает возможность сравнить взаимодействие нативной двухцепочечной и денатурированной одноцепочечной ДНК с поликатионными конденсирующими агентами. Однако возможные различия могут быть однозначно приписаны особенностям вторичной структуры ДНК только в том случае, если сам конденсирующий агент не чувствителен к изменению рН в указанном интервале. Этому условию, как известно, удовлетворяют сильные катионные электролиты, к числу которых относится как линейный водорастворимый поли-К-диаллил-М-диметиламмоний хлорид (ПДАДМАХ), так и слабо сшитый не растворимый в воде, но сильно набухающий ПДАДМАХ (ШДАДМАХ). Последний можно рассматривать как макроскопический конденсирующий агент. Мы решили сравнить взаимодействие нативной двухцепочечной и денатурированной одноцепочечной ДНК с гидрогелем ШДАДМАХ.

Для этого в качестве точки отсчета необходима информация о взаимодействии обеих форм ДНК с линейным ПДАДМАХ при рН=7 и рН=12. Как и следовало ожидать, при титровании растворов нативной (рН=7) и денатурированной (рН=12) ДНК раствором линейного ПДАДМАХ в 0.01 М №С1 образуется осадок нейтрального ИПЭК.

Единичный акт этой кооперативной реакции представлен на схеме:

в

-Н»с , у СИ,-

Полное осаждение нативной ДНК из раствора происходит при эквимольном соотношении четвертичных аммонийных и фосфатных групп. В случае денатурированной одноцепочечной ДНК это достигается при несколько большем соотношении (около 1.4) . Избыточное количество положительных зарядов ПДАДМАХ, по всей вероятности, расходуется на нейтрализацию депротонированных гуаниновых и тиминовых оснований. Противоионы №+ и С1- остаются в растворе в количестве, эквивалентном числу образовавшихся интерполиэлектролитных ионных пар (солевых связей). Аналогичный процесс должен происходить и при взаимодействии ДНК с гидрогелем #ПДАДМАХ.

Для исследования взаимодействия нативной и денатурированной ДНК с ШДАДМАХ из блока #ПДАДМАХ (одна сшивка на 200 мономерных звеньев), равновесно набухшего в 0.01 М №С1 при рН 7 или рН 12 , вырезали образцы в форме кубиков с массой 0.3-0.5 г. В каждом эксперименте один такой кубик помещали в бюкс, содержащий 10 мл раствора ДНК (1.17 мг/мл) в 0.01 М №С1 при соответствующем значении рН. Таким образом, валовое молярное отношение четвертичных аммонийных групп геля к фосфатным группам ДНК в исследуемых системах изменялось в пределах от 0.6 до 1.0. Количество ДНК, сорбированной гидрогелем #ПДАДМАХ, определяли

спектрофотометрически по убыли ее концентрации в растворе, окружающем гель. Для проведения экспериментов в ФМ была сконструирована специальная ячейка, состоящая из пластинки оргстекла толщиной 2 мм, в которой были сделаны два сквозных отверстия по 5 мм, соединенные между собой каналом шириной 2 мм. Пластинку помещали на покровное стекло; один резервуар заполняли гелем, а другой -раствором ДНК и наблюдали их взаимодействие.

Сразу после погружения геля в раствор как нативной, так и денатурированной ДНК на поверхности образца появляется тонкая радужная пленка, свидетельствующая о сорбции ДНК на границе раздела, т.е. об образовании #ИПЭК из ДНК и фрагментов сетки ШДАДМАХ в поверхностном слое гидрогеля. Движущая сила образования #ИПЭК, как и в случае взаимодействия противоположно заряженных линейных полиионов, обусловлена увеличением энтропии низкомолекулярных противоионов. Однако в дальнейшем поведение исследуемых систем становится совершенно различным.

Для нативной ДНК процесс ка этом заканчивается: полианионы, исходно скрученные в двойную спираль, в глубину геля не проникают. В случае денатурированной одноцепочечной ДНК процесс образования ИПЭК фронтально распространяется внутрь геля. На срезах с образцов, извлеченных из раствора на промежуточных стадиях, видна мутная оболочка #ИПЭК, окружающая прозрачную еще не прореагировавшую

сердцевину. После окончания процесса исходный образец сильно набухшего #ПДАДМАХ полностью превращается в #ИПЭК, равновесная степень набухания которого по сравнению с исходной уменьшается не менее, чем в 50 раз, т.е. в результате сорбции денатурированной ДНК происходит коллапс катионного геля. Указанные различия количественно иллюстрируются данными рис.19, на котором приведены кинетические кривые убыли нативной и денатурированной ДНК из растворов, находящихся в контакте с гидрогелем #ПДАДМАХ.

Таким образом, нами было обнаружено кардинальное различие в характере сорбции нативной и денатурированной ДНК катионным гидрогелем. Это означает, что катионный гидрогель распознает вторичную структуруДНК.

».сутки

Рис.19. Зависимость концентрации ДНК от времени над гидрогелем #ПДАДМАХ: 1-рН 7; 2-рН 12; 0.01 МКаС1,20°С

Для того, чтобы понять наблюдаемые различия, следует обратиться к механизму переноса заряженных частиц в противоположно заряженных полиэлектролитных гидрогелях. Механизм, обеспечивающий неограниченное превращение гидрогеля в соответствующий #ИПЭК, включает две взаимозависимые интерполиэлектролитные реакции. Одна из них - адсорбция полианионов ДНК на поверхности геля, т.е. образование #ИПЭК в поверхностном слое. Эта реакция происходит очень быстро по мере поступательной диффузии полиионов из раствора. Ее удалось непосредственно наблюдать методом ФМ для ДНК Т4 (рис.20 а, б, в, г). Видно, как клубок гигантской ДНК приближается к поверхности геля (а, б). Достигнув поверхности, адсорбирующиеся на ней клубки образуют #ИПЭК и принимают компактные конформации (в, г). При полном покрытии геля слоем #ИПЭК (рис. 21 а) исчерпываются все поверхностные катионные вакансии, без которых присоединение следующих порций полианионов ДНК по реакции I уже невозможно.

(а) (б) (в) (г)

Рис.20. ФМ изображения молекулы ДНК Т4, сорбирующейся на поверхность гидрогеля. Интервал времени между изображениями 2 с.

Для нативной ДНК процесс сорбции на этом заканчивается: полианионы, исходно скрученные в двойную спираль, вглубь геля не проникают и остаются в растворе (рис.21 а), не изменяя своих размеров (рис. 21 б).

а б

Рис.21 Изображение молекул ДНК в растворе на границе #ИПЭК (а) и распределение их по размерам в растворе (б).

Для появления новой вакансии необходимо, чтобы фрагмент полианиона, уже образовавший #ИПЭК, переместился по крайней мере на один «шаг» вглубь гидрогеля. Такое перемещение может произойти только в результате кооперативной интерполиэлектролитной реакции ионного обмена с участием заряженных звеньев адсорбированного полианиона, фрагмента полиэлектролитной сетки и нейтрализующих противоионов СГ. Тогда на поверхности гидрогеля вновь образуется вакантный катионный фрагмент, способный связаться со следующим полианионом из раствора. Фактически скорость превращения исходного гидрогеля в #ИПЭК, т. е. скорость проникновения полианионов вглубь образца гидрогеля определяется скоростью интерполиэлектролитной реакции обмена на поверхности раздела #ИПЭК-гидрогель. Если эта реакция по какой-либо причине запрещена, то процесс образования #ИПЭК не распространяется

глубже поверхностного слоя. Очевидно, что этот запрет существует для компактной нативной ДНК и отсутствует для однотяжной полинуклеотидной цепи.

Представляло интерес выяснить сопровождается ли адсорбция или миграция ДНК внутрь гидрогеля #ПДАДМАХ необратимыми изменениями в структуре макромолекул или разрывами самих полинуклеотидных цепей по относительно легко гидролизуемым Р-0 связям. Для этого необходимо в мягких условиях разрушить #ИПЭК и извлечь ДНК из гидрогеля в водный раствор.

Согласно схеме 1, увеличение ионной силы раствора путем добавления в систему низкомолекулярных солей должно приводить к сдвигу равновесия справа налево, т.е. к диссоциации #ИПЭК на исходные компоненты. Используя в качестве объектов описанные выше нерастворимые зарядово-стехиометричные комплексы нативной и денатурированной ДНК с линейным ПДАДМАХ, мы оценили интервал концентрации низкомолекулярной соли, в котором происходит диссоциация ИПЭК. Для этого осадки ИПЭК, полученные смешением растворов ДНК и ПДАДМАХ в 0.01 М №С1 при рН=7 и рН=12 и отделенные от супернатанта центрифугированием, помещали в одинаковые объемы нейтральных растворов №С1 различной концентрации. Через 24 часа (время, достаточное для установления равновесия) спектрофотометрически (к = 260 нм) определяли количество ДНК, перешедшей в водную фазу (ПДАДМАХ не поглощает свет в указанной области спектра). Зависимости относительной оптической плотности ДНК в растворе от концентрации №С1 представлены на рис.22.

Видно, что обе формы ДНК остаются в составе нерастворимых ИПЭК лишь до достижения определенных критических значений концентрации №С1: 0.25 М для двуспиральной (рис.22, кривая 1) и 0.5 М для одноцепочечной (рис.22, кривая 2). При превышении указанных значений происходит экранирование межцепных ионных пар низкомолекулярными противоионами. В результате оба ИПЭК диссоциируют, и ДНК количественно переходит в раствор.

Различие в стабильности исследуемых ИПЭК по отношению к экранирующему действию низкомолекулярных противоионов, по-видимому, обусловлено более совершенной взаимной подстройкой ионных пар, образующих солевые связи между ПДАДМАХ и относительно гибкой по сравнению с двойной спиралью одноцепочечной ДНК.

Из данных рис. 22 также следует, что ИПЭК, образованные линейным ПДАДМАХ с обеими формами ДНК, заведомо полностью диссоциируют на исходные компоненты в 1 М №С1. Можно полагать, что эта концентрация соли достаточна и для полного экранирования ионных пар в исследуемых #ИПЭК.

Рис.22. Зависимость относительной оптической плотности ДНК, перешедшей в раствор из поликомплекса ДНК-линейный

ЦДАДМАХ, приготовленного при рН 7 (1) и рН 12 (2), от концентрации №С1 в растворе; 20°С. Ад-оптическая плотность раствора ДНК,

использованного для приготовления комплекса.

погружения #ИПЭК, содержащего денатурированную ДНК, в 1 М водный раствор №С1 при рН=12 компактный вначале образец покрывается прозрачным сильно набухшим слоем, отделенным четкой границей от внутреннего плотного матового ядра. Постепенно граница размывается, перемещаясь в направлении центра; объем образца увеличивается. В конечном счете #ИПЭК превращается в однородный прозрачный гидрогель, приобретая исходные размер и форму. Описанное превращение сопровождается количественным выделением ДНК в окружающий раствор (рис.23, кривая 1).

После доведения рН раствора до 7 выделившаяся ДНК ренатурируется, практически полностью восстанавливая конформацию двойной спирали. Об этом свидетельствует величина гиперхромного эффекта (33%), измеренного при 260 нм после повторного подщелачивания. Коэффициент седиментации извлеченной из #ИПЭК ренатурированной ДНК (6.12 ед. Сведберга), оказался близок к таковому для исходного образца ( 6.27 ед. Сведберга). Совсем иначе ведет себя тот же #ИПЭК после погружения в 1 М водный раствор №С1 при рН=7. Часть ДНК, как и в первом случае, выделяется в окружающий раствор и ренатурируется (рис.23, кривая 2). При этом ее коэффициент седиментации (5.5 ед.Сведберга) оказывается несколько ниже исходного.

Однако, около 80% ДНК застревает внутри гидрогеля и не извлекается даже при концентрации №С1 4 М. Указанное различие можно объяснить, приняв во внимание, что разрушение солевых связей между цепями ДНК и сеткой при рН 7 сопровождается двумя конкурирующими процессами: диффузией однотяжных цепей из гидрогеля в раствор и образованием двутяжной вторичной структуры за счет восстановления водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями.

Действительно, после

Рис.23. Зависимость относительного количества ДНК, выделившейся из

00 05 10 15 20 25 30 ^ сутки

гидрогелей ШДАДМАХ в окружающий раствор 1 М №С1, от времени, 20°С; Дт - количество ДНК, выделившейся в раствор к моменту ^ Дщ» - предельное количество ДНК, поглощенное гидрогелем при сорбции. 1-#ИПЭК ДНК-#ПДАДМАХ, приготовленный при рН 7; 2~#ИПЭК ДНК-ШДАДМАХ, приготовленный при рН=12 и помещенный в раствор при рН 7; 3- #ИПЭК ДНК-#ПДАДМАХ, приготовленный при рН 12 и помещенный в раствор при рН 12.

В ходе второго процесса в промежутке между уже ренатурировавшимися двухцепочечными участками могут возникать дефекты в виде петель, охватывающих фрагменты сетки ШДАДМАХ и таким образом запирающие молекулы ДНК внутри гидрогеля, как показано на рис. 24. Вероятно, именно этим, а не деструкцией объясняется понижение коэффициента седиментации фракции ДНК, перешедшей из гидрогеля в раствор.

Нативная ДНК, образующая при взаимодействии с ШДАДМАХ тонкий запирающий слой #ИПЭК на поверхности гидрогеля, полностью десорбируется при погружении образцов в 1 М водный раствор №С1 при рН=7 (рис.23, кривая 3). Процесс десорбции не сопровождается разрушением молекул ДНК, о чем свидетельствуют данные, полученные флуоресцентной микроскопией.

Таким образом нативную ДНК можно сорбировать на поверхности, а денатурированную иммобилизовать в объеме слабо сшитого катионного гидрогеля, а затем без разрушения выделить в окружающий раствор.

Рис.24. Схема возможного застревания ДНК в полиэлектролитном гидрогеле.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Основные результаты работы сформулированы выше в разделе «Научная новизна». В заключение подчеркнем, что ряд важных явлений, происходящих при взаимодействии ДНК с катионными конденсирующими агентами, удалось обнаружить и однозначно объяснить только благодаря сочетанию классических физико-химических методов исследования с прямой визуальной регистрацией поведения отдельных молекул ДНК в условиях эксперимента. Этот подход впервые широко использован в этой работе. Только таким путем оказалось возможным экспериментально показать:

-дискретность и обратимость конформационного перехода клубок-«глобула», происходящего как фазовый переход первого рода при взаимодействии ДНК с катионными ПАВ даже на уровне отдельных молекул ДНК;

-выявить и разделить роль электростатического и гидрофобного взаимодействий в процессах комплексообразования и компактизации ДНК в водно-спиртовых средах;

-установить факт растворимости и тенденцию к компактизации отдельных молекул ДНК, комплексно связанных с катионным ПАВ, в неполярной органической среде, определить, что в этих условиях молекулы ДНК сохраняют нативную конформацию, приобретая форму тороидов;

- продемонстрировать возможность использования катионных ПАВ для практически полного обратимого переноса молекул ДНК через поверхность раздела фаз вода/малополярный органический растворитель;

-показать, что катионные дендримеры, взаимодействуя с ДНК, способны образовывать положительно заряженные растворимые частицы комплекса, в которых отдельные молекулы ДНК, будучи компактизованными, сохраняют конформацию двойной спирали;

-установить, что катионный гидрогель способен распознавать вторичную структуру отдельных молекул ДНК.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa К. Discrete Coil-Globule Transition ofLarge DNA Induced by Cationic Surfactant. // J. Am. Chem. Soc, 1995, V.I 17, P. 2401-2408.

2. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa K. Discrete Coil-Globule Transition of Single Large DNA Molecules Induced by Cationic Surfactant.

//Abstracts of International Conference "Nanostructures and Self-Assemblies in Polymer Systems." St-Peterburg-Moscow.1995. P.2.

3. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa K. Transition of Large Double-Stranded DNA Chains between Random Coil and Compact Globule States Caused by Cooperative Binding of Cationic Surfactant.// Abstracts of 48th Annual Colloid Meeting of Japanese Chemical Society. Sapporo, Japan. 1995. p.294-295.

4. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa K. Bimodality of Single Double-StrandedDNA Chains between Random Coil and Compact Globule States as Is Induced by Cooperative Binding of Cationic Surfactant. // J. Am. Chem. Soc.,

1995, V.I 17, P. 9951-9956.

5. Пышкина OA, Сергеев В.Г., Зезин А.Б., Кабанов В.А Высокомолекулярную ДНК можно растворить в малополярных органических растворителях путем коплексообразования с катионными поверхностно-активными веществами. Доклады Академии Наук, 1996, т.348, № 4, с. 496-498.

6. Пышкина О.А., Сергеев В.Г., Лезов А.В., Мельников А.Б., Рюмцев Е И., Зезин А.Б.,Кабанов В.А. Компактная конформация комплекса ДНК-катионный ПАВ в хлороформе. Доклады Академии Наук, 1996, т.349, №6, с.772-775.

7. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa К. Visualization of DNA-Surfactant Interaction at the Single-Molecular Level. // Abstracts of International Symposium on Colloid and Polymer Science. Nagoya, Japan.

1996. p.70.

8. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Mel'nikova Yu.S., Yoshikawa K. Folding Transition of Long DNA Chains in the Presence of Distearyldimethylammonium Bromide and Unfolding Induced by Neutral Liposomes. // J. Chem. Soc, Faraday Trans., 1997, V. 93, P. 283-288.

9. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa K. Cooperation between Salt Induced Globule-Coil Transition in Single Duplex DNA Complexed with Cationic Surfactant and Sphere-Rod Transition of Surfactant Micelles. // Progr. Coll. Polym. Sci., 1997, V. 106, pp.209-214.

10. Kabanov V.A., Zezin A.B., Sergeyev V.G., Pyshkina O.A., Rjumtsev E.I., Lezov A.V.The Self-Assembly phenomena in DNA Cationic Surfactant SystemsV/Тезисы докладов Международной конференции «Фундаментальные проблемы науки о полимероах», Москва. 1997. ПЗ-4.

11. Пышкина О.А., Зинчентко А.А., Сергеев ВТ., Мельников А.Б., Лезов А.В., Рюмцев Е.И. Комплексы нуклеиновых кислот с катионными ПАВ в органической среде.//Тезисы докладов 2 Международной конференции «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии». Ст.-Петербург. 1998. с. 128.

12. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa K. Yisualization of DNA-Surfactant Interaction with Fluorescence Microscopy. // Recent Res. Devel. in Chemical Sciences, Transworld Research Network Publ., Trivandrum, India, 1997,v.l,pp.69-113.

13. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa K. Inorganic Salt Induced Decollapsing Transition of DNA Complexed with a Cationic Surfactant. // J.Chem.Phys., 1997,107,6917-6924.

14.Пышкина О.А., Андреева А.С., Сергеев В.Г., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Моделирование трансмембранного переноса ДНК.//Тезисы докладов международной конференции «Фундаментальные проблемы науки о полимерах». Москва. 1997, с.СЗ-69.

15. Сергеев В.Г., Пышкина О.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Комплексы ДНК-поверхностно-активное вещество, растворимые в малополярных органических жидкостях. Высокомолек. Соед., 1997, т. А39, №1, с. 17-21.

16. Sergeyev V.G., Pyshkina OA, Gallyamov M.O., Yaminsky I.V., Zezin А В., Kabanov V.A. DNA-surfactant complexes in organic media. Coll. & Polym Sci., 1997,

17. Галлямов М.О., Зинченко А.А., Пышкина О.А., Сергеев В.Г., Яминский И.В. Применение методов сканирующей зондовой микроскопии к исследованию конформационных свойств ДНК. Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 1998, № 2, с. 79-83.

18. Лезов А.В., Мельников А.Б., Пышкина О.А., Сергеев В.Г., Лысенко Е.А., Рюмцев Е.И., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Структура и молекулярные свойства комплексов полиэлектролит-ПАВ в слабополярных органических средах.// Тезисы докладов XVI Менделеевского сьезда по общей и прикладной химии. Ст.-Петербург.1998.Т.1.С.184.

19. Sergeyev, V. G; Mikhailenko, S. V; Pyshkina, О. A.; Yaminsky, I. V; Yoshikawa, K. How does alcohol dissolve the complex of DNA with a cationic surfactant? J. Am. Chem. Soc. 1999,121, 1780-1785.

20. Mikhailenko S.V., Sergeyev V.G., Pyshkina O.A., and K.Yoshikawa K, "Reentrant Confonnational Transitions of Giant DNAs Complexed with СТАВ in Low-Polar Media", Polyelectrolytes Yamada Sc. found 6 '99 (Proceedings of Yamada Conference), 1999, p. 89-92.

21. Андреева А.С., Галлямов М.О., Пышкина OA, Сергеев В.Г., Яминский И.В. Морфология комплексов ДНК-ПАВ, перешедших через границу раздела фаз вода-хлороформ, по данным гтсмпс-силозой микроскопии. Ж. Физ. Хим., 1999, т.73, с. 2062-2067.

22. Sergeyev V.G., Pyshkina O.A., Lezov AV., Mel'nikov A.B., Ryumtsev E.I., Zezin A.B., Kabanov V.A DNA complexed with oppositely charged amphiphile in low-polar organic solvents. Langmuir, 1999,15, p.4434-4440.

23. Mikhailenko, S. V.; Sergeyev, V. G.; Zinchenko, A. A.; Gallyamov, M. O.; Yaminsky, I. A.; Yoshikawa, K. "Interplay between folding/unfolding and helix/coil transitions in giant DNA". Biomacromolecules, 2000, v.l, No. 4, pp. 597-603.

24. Zinchenko A.A., Sergeyev V.G., Pysgkina O.A. DNA-surfactant complexes in a water/alcohol mixture. Prog.Colloid Polym.Sci., 2000,116, p.21-25.

25. Галлямов М.О., Пышкина О.А., Сергеев В.Г., Яминский И.В. Конденсация ДНК Т4 в водно-спиртовых средах. Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследовани., 2000, № 7,с. 88-91.

26. Kabanov V.A., Sergeyev V.G., Pyshkina O.A., Zinchenko A.A., Zezin A.B., Joosten J.G.H., Brackman J. Yoshikawa K. Interpolyelectrolyte complexes formed by DNA and Astramol polypropylene inline) dendrimers. Macromolecules, 2000,33,95-87-9593.

27. Сергеев В.Г., Новоскольцева О.А., Зинченко А.А., Пышкина О.А., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Вторичная структура определяет характер взаимодействия ДНК со слабосшитым катионным гидрогелем. Доклады Академии Наук, 2001, т.379, № 6, с.788-792.

28. Sergeyev V.G., Novoskoltseva O.A., Pyshkina ОЛ., Zinchenko A.A., Rogacheva V.B., Zezin A.B., Yoshikawa K., Kabanov V.A Secondary structure of DNA is recognized by slightly cross-linked cationic hydrogel. J.Am.Chem.Soc. 2002,124, p.l 1324-11333.

29. Zinchenko A.A., Sergeyev V.G., Murata S., Yoshikawa K. Controlling the intracham segregation on a single DNA molecules. J.Am.Chem.Soc. 2003,125,

p. 4414-4415.

30. Сергеев В.Г., Пышкина О.А., Зинченко А.А., Зезин СБ., Зезин А.Б., Кабанов В. А. Механизм взаимодействия ДНК с катионными поверхностно-активными веществами в водно-спиртовой среде и структура образующихся комплексов. Высокомолек. Соед., 2003, т. А45, №5, с. 814-822.

31. Сергеев В.Г., Локшин Н.А., Голубев В.Б., Зезин А.Б., Левон К., Кабанов В.А. Синтез электропроводящего интерполиэлектролитного комплекса полианилин-ДНК. Доклады Академии Наук, 2003, т.390, № 1, с.66-69.

32. Zinchenko A.A., Sergeyev V.G., Yamabe Y., Murata S., Yoshikawa K. DNA Compaction by Divalent Cations: Structural Specificity Revealed by the Potentiality ofDesigned Quaternary Diammonium Salts. ChemBioChem. 2004. V. 5, Is. 3, pp. 360-368.

ООП МГУ. Заказ 68-100-04

*-07 46