Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие аминогруппу при С2'-атоме углеводного фрагмента, и получение олигонуклеотидопептидов на их основе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. Методы синтеза олигонуклеотидопептидов (Литературный обзор)

1.1. Номенклатура олигонуклеотидопептидов

1.2. Синтез олигонуклеотидопептидов в растворе

1.2.1. Синтез олигонуклеотидопептидов с фосфодиэфирной связью между фрагментами

1.2.2. Синтез олигонуклеотидопептидов с фосфамидной связью между фрагментами

1.2.3. Синтез олигонуклеотидопептидов с амидной связью между фрагментами

1.2.4. Синтез олигонуклеотидопептидов с тиоэфирной связью между фрагментами

1.2.4.1. Методы конъюгации

1.2.4.2. Методы введения малеимидной группы и остатка а-галогенкарбоновой кислоты в пептиды и олигонуклеотиды

1.2.5. Синтез олигонуклеотидопептидов с дисульфидной связью между фрагментами

1.2.6. Синтез олигонуклеотидов, содержащих сульфгидрильную группу

1.3. Твердофазный синтез олигонуклеотидопептидов 58 1.3.1. Последовательный синтез пептидного и олигонуклеотидного фрагментов конъюгатов на одном полимерном носителе

1.3.1.1. Полимерный носитель

1.3.1.2. Введение якорной группы

1.3.1.3. Защитные группы

1.3.1.4. Введение мостикового звена

1.3.1.5. Синтез олигонуклеотидного фрагмента

1.3.1.6. Отщепление олигонуклеотидопептидов от полимерного носителя и деблокирование функциональных групп

1.3.2. Последовательный синтез олигонуклеотидного и пептидного фрагментов конъюгатов на одном полимерном носителе

1.3.3. Синтез олигонукпеотидопептидов с использованием разветвленного полимерного носителя

1.3.4. Синтез олигонукпеотидопептидов методом фрагментной конденсации

2. Олигодезоксирибонукпеотиды, содержащие аминогруппу при С2'-атоме углеводного фрагмента, и получение олигонукпеотидопептидов на их основе

Обсуждение результатов)

2.1. Синтез Ы6-бензоил-9-(2-дезокси-5-0-диметокситритил-2-трифторацет-амидо-(3-о-арабинофуранозил)аденина и 1\16-бензоил-9-[2-дезокси--5-0-диметокситритил-2-(9-флуоренилметоксикарбонил)амино--(3-о-арабинофуранозил]аденина

2.2. Синтез 1 -(2-дезокси-5-0-диметокситритил-2-трифторацетамидо--р-о-рибофуранозил)урацила

2.3. Синтез М6-бензоил-9-{2-дезокси-5-0-диметокситритил-2-[1\1-(9-флуоренил-метоксикарбонил)-3-аминопропионил]амино-|3-о-арабинофуранозил}-аденина и 1 -{2-дезокси-5-0-диметокситритил-2-[1\1-(9-флуоренилметокси-карбонил)-3-аминопропионил]амино-(3-о-рибофуранозил}урацила

2.4. Синтез З'-амидофосфитов модифицированных нуклеозидов

2.5. Синтез модифицированных олигодезоксирибонукпеотидов

2.6. Изучение реакционной способности алифатической аминогруппы модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов

2.7. Изучение физико-химических и субстратных свойств олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки 9-(2-амино-2-дезокси-р-о-арабино-фуранозил)аденина

2.8. Синтез олигонукпеотидопептидов

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

Химический синтез модифицированных олигонуклеотидов представляет собой наиболее интересную и сложную область исследований в органической химии нуклеиновых кислот. В последние 10-15 лет это направление развивается достаточно быстрыми темпами, в первую очередь, благодаря автоматизации процесса получения олигонуклеотидов и их модифицированных производных. Последние могут использоваться как для решения разнообразных задач молекулярной биологии, так и в качестве потенциальных терапевтических препаратов при лечении различных вирусных и наследственных заболеваний.

Основные усилия исследователей были направлены на решение, по крайней мере, двух ключевых задач. Первой из них можно считать разработку методов, использование которых позволяет трансформировать структуру нуклеиновых кислот с помощью направленных замен мономерных звеньев и их фрагментов различными аналогами либо за счет присоединения к олигонуклеотидам определенных химических группировок и соединений. В настоящее время данная задача практически уже решена. Широкое применение эффективных методов современного органического синтеза позволяет получать модифицированные олигонуклеотиды, имеющие подчас очень сложное строение.

Вторая задача имеет непосредственное отношение к изучению взаимосвязи между структурой модифицированных фрагментов нуклеиновых кислот и их свойствами. В данном случае целями исследований являются синтез олигонуклеотидных производных, обладающих набором определенных химических, физико-химических и биологических свойств, необходимых для успешного использования полученных соединений в молекулярно-биологических исследованиях, выявление взаимосвязи между этими свойствами и строением самих соединений и, наконец, решение обратной задачи: создание необходимых структур с заданными свойствами.

Вопрос о связи между строением вещества и его свойствами и функциями -основная проблема во многих областях науки. Однако в большинстве случаев установить четкие закономерности не удается. На таком общем фоне нуклеиновые кислоты представляют собой один из наиболее ярких примеров того, насколько тесно важнейшие биологические функции связаны со строением молекулы. Именно по этой причине существует абсолютно реальная основа для применения рациональных подходов к структурному моделированию и синтезу модифицированных фрагментов нуклеиновых кислот. При этом обязательным условием является перевод молекулярно-биологических или медицинских терминов на специфический язык органической химии, а именно язык структурных формул, в результате чего становится возможным создание химических соединений, с помощью которых можно в дальнейшем направленно влиять на те или иные процессы, протекающие в клетке.

Изложенные выше общие соображения должны играть ключевую роль при решении тех конкретных задач, которые ставят перед химиками молекулярные биологи или медики. Так, для использования фрагментов нуклеиновых кислот при изучении закономерностей нуклеиново-белкового узнавания или для успешного применения их в качестве высокоэффективных диагностических и терапевтических препаратов необходимым представляется синтез конъюгатов олигонуклеотидов с другими молекулами, обладающими рядом уникальных свойств. Иными словами, к фрагментам нуклеиновых кислот можно ковалентно присоединять различные реакционноспособные или репортерные группировки, интеркаляторы, биологически активные пептиды и ферменты. В этой связи актуальной задачей становится получение одно- или двутяжевых молекул ДНК, имеющих в своем составе группировки, реакционная способность которых отличалась бы от реакционной способности функциональных групп немодифицированных ДНК. Именно введение новых реакционных центров в состав олигонуклеотидной цепи позволяет успешно осуществлять синтез различных гибридных молекул.

Целями настоящего исследования являются разработка эффективных методов синтеза олигодезоксирибонукпеотидов, в которых алифатическая аминогруппа непосредственно либо с помощью линкера присоединена к С2'-атому углеводного фрагмента одного или нескольких нукпеотидных остатков, и изучение химических и физико-химических свойств полученных соединений. Важной частью настоящей работы также является получение олигонуклеотидопептидов на основе модифицированных таким образом олигодезоксирибонуклеотидов.

Основными этапами работы были синтез модифицированных мономерных компонентов такого строения, которое предопределяло возможность их использования в автоматическом синтезе олигонуклеотидов, подбор оптимальных условий для встраивания модифицированных звеньев в олигонукпеотидную цепь, и собственно твердофазный синтез олигонуклеотидопептидов. 8

В представленной работе предложены новые эффективные методы синтеза ранее неописанных олигодезоксирибонукпеотидов, содержащих остатки 9-(2-амино-2-дезокси-(3-о-арабинофуранозил)аденина, 9-[2-(3-аминопропионил)-амино-2-дезокси-(3-о-арабинофуранозил]аденина и 1 -[2-(3-аминопропионил)-амино-2-дезокси-|3-о-рибофуранозил]урацила соответственно. Особенностью настоящего подхода можно считать то, что алифатическая аминогруппа находится либо непосредственно при С2'-атоме углеводного фрагмента модифицированного нуклеозида, либо присоединена к нему с помощью линкера. Следует подчеркнуть, что модификация 2'-положения углеводного остатка представляется оптимальным вариантом, так как в этом случае возможное искажение структуры одно- и двутяжевых фрагментов ДНК будет относительно незначительным. Помимо этого, разработанная методика синтеза модифицированных олигонуклеотидов предусматривает возможность встраивания как одного, так и нескольких модифицированных мономерных звеньев в любое заранее определенное положение олигомерной цепи при сохранении в целом стандартного регламента автоматического олигонукпеотидного синтеза.

В работе продемонстрирована высокая реакционная способность алифатических аминогрупп в составе олигонуклеотидов в реакциях с электрофильными реагентами. Наличие подобного свойства позволило разработать общий метод получения олигонуклеотидопептидов - соединений, которые могут быть использованы в качестве потенциальных терапевтических агентов в антисмысловой биотехнологии. Основная суть данного подхода состоит в том, что реакцию образования амидной связи между заранее синтезированным ^-блокированным пептидом с активированной а-карбоксильной функцией и защищенным олигонуклеотидом, содержащим селективно деблокированную МН2-группу, осуществляют после завершения автоматического олигонуклеотидного синтеза, при этом фрагмент ДНК иммобилизован на нерастворимом полимерном носителе. Проведение конденсации на твердой фазе существенно облегчает процесс выделения целевых олигонуклеотидопептидов. Предложенный подход представляется достаточно гибким, так как позволяет присоединять пептидный фрагмент к любому заранее определенному положению олигонуклеотидной цепи.

Работа включает обзор литературы, посвященный методам синтеза олигонуклеотидопептидов.

128 ВЫВОДЫ

1. Впервые получены производные аденозина и уридина, содержащие алифатическую аминогруппу, присоединенную к С2'-атому углеводного фрагмента с помощью линкера: амидофосфиты М6-бензоил-9-{2-дезокси--5-0-диметокситритил-2-[Ы-(9-флуоренилметоксикарбонил)-3-аминопропионил]-амино-(3-0-арабинофуранозил}аденина и 1 -{2-дезокси-5-0-диметокситритил--2-[1М-(9-флуоренилметоксикарбонил)-3-аминопропионил]амино-р-о-рибо-фуранозил}урацила.

2. Предложен эффективный метод синтеза З'-амидофосфитных производных 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина - М6-бензоил-9-(2-дезокси-5-0-диметокси-тритил-2-трифторацетамидо-р-о-арабинофуранозил)аденина и Ы6-бензоил--9-[2-дезокси-5-0-диметокситритил-2-(9-флуоренилметоксикарбонил)амино--р-о-арабинофуранозил]аденина.

3. Впервые получены модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие остатки 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина, 2'-(3-амино-пропионил)амино-2'-дезоксиарабиноаденозина и 2'-(3-аминопропионил)амино--2'-дезоксиуридина.

4. Показана высокая реакционная способность алифатических аминогрупп модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов в реакциях с электро-фильными реагентами.

5. Обнаружено, что введение остатков 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина в одну из цепей ДНК-дуплекса приводит к некоторому понижению его температуры плавления. Наличие 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина в олигонуклеотидной цепи существенно затрудняет протекание ферментативного гидролиза под действием фосфодиэстеразы змеиного яда.

6. Предложен эффективный метод твердофазного синтеза олигонуклеотидо-пептидов, основанный на использовании олигодезоксирибонуклеотидов, в которых аминогруппа непосредственно либо с помощью линкера присоединена к С2'-атому углеводного фрагмента.

1. Богданов А.А. Формы химической связи между РНК, белками и их фрагментами. //Успехи совр. биологии. 1963. Т. 55. N 3. С. 321-338.

2. Юодка Б.А. Ковалентные комплексы нуклеотидов и нуклеиновых кислот с белками. Их распространение, структура, функции. // Биоорган, химия. 1980. Т. 6. N 10. С. 1445-1465.

3. Юодка Б.А. Ковалентные нуклеиново-белковые структуры и их химическое моделирование. Вильнюс: Мокслас, 1985. 176 с.

4. Shabarova Z.A. Synthetic nucleotide-peptides. // Progress in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol. // Eds. J.N. Davidson, W.E. Cohn. New York: Acad. Press, 1970. V. 10. P. 145-182.

5. Соколова Н.И., Гурова Г.И., Шабарова 3.A., Прокофьев М.А. Нуклеотидопептиды. Синтез тимидилил-(3'->5')-аденозино-{Рм—^)-амидов. II Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1969. Т. 24. N 5. С. 104-105.

6. Смирнов В.Д., Бочарова Т.Н., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Новый способ модификации полимерного носителя для олигонуклеотидного синтеза. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1972. Т. 27. N 1. С. 3-10.

7. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. // Bioconjugate Chem. 1990. V. 1. N 3. P. 165-187.

8. Uhlmann E., Peyman A. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle. // Chem. Rev. 1990. V. 90. N 4. P. 543-584.

9. Beaucage S., Iyer P. The synthesis of specific ribonucleotides and unrelated phosphorylated biomolecules by the phosphoramidite method. // Tetrahedron. 1993. V. 49. N 46. P. 10441-10488.

10. Manoharan M. Designer antisense oligonucleotides: conjugation chemistry and functionality placement. // Antisense research and applications. // Eds. S.L. Crooke, B. Lebleu. Boca Raton: CRC Press, 1993. P. 303-349.

11. Стеценко Д.А., Арзуманов A.A., Коршун B.A., Гейт М.Дж. Пептид-олигонуклеотидные конъюгаты как антисмысловые агенты нового поколения. // Молекулярная биол. 2000. Т. 34. N 6. В печати.

12. Шредер Э., Любке К. Пептиды. Т. 1. М.: Мир, 1967. С. 386-388.

13. Wang J.С. DNAtopoisomerases. //Ann. Rev. Biochem. 1985. V. 54. P. 665-697.130

14. Schattenkerk С., Wreesman C.T.J., de Graaf M.J., van der Marel G.A., van Boom J.H. Synthesis of a naturally occurring nucleopeptide fragment via a phosphotriester approach. //Tetrahedron Lett. 1984. V. 25. N 45. P. 5197-5200.

15. Kuyl-Yeheskiely E., Tromp C.M., Lefeber A.W.M., van der Marel G.A., van Boom J.H. A convenient approach toward the preparation of nucleopeptides. //Tetrahedron. 1988. V. 44. N 20. P. 6515-6523.

16. Kuyl-Yeheskiely E., Dreef-Tromp C.M., Geluk A., van der Marel G.A., van Boom J.H. Synthesis of the nucleopeptide H-Phe-Tyr(pGC)-NH2 and H-Phe-Ser(pGC)-Ala-OH via a phosphotriester approach. // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. N 8. P. 2897-2905.

17. Hotoda H., Ueno Y., Sekine M., Hata T. Studies on the synthesis of nucleotidyl-peptide. I: a facile synthesis involving selective P-S bond cleavage. // Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. N 16. P. 2117-2120.

18. Ueno Y., Saito R., Hata T. Studies on the synthesis of nucleotidyl-peptides. II. The preparation of a nucleotidyl-peptide having a 5'-nucleotidyl-(P-0)-serine phosphodiesterbond. //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. N 19. P. 4451-4457.

19. Шабарова 3.A., Богданов A.A. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. М.: Химия, 1978. С. 381-382.

20. Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Ярмолюк С.Н., Алексеева И.В. Синтез олигонуклеотидил-(5'—^-пептидов, содержащих аргинин. // Биополимеры и клетка. 1988. Т. 4. N 4. С. 220-222.

21. Levina A.S., Metelev V.G., Cohen A.S., Zamecnik P.C. Conjugates of minor groove DNA binders with oligodeoxynucleotides: synthesis and properties. // Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 1996. V. 6. N 2. P. 75-85.

22. Зарытова В.Ф. Механизм реакций фосфорилирования, используемых в биоорганической химии. // Биоорганическая химия. Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ АН СССР, 1984. Т. 4. С. 85-90.

23. McMinn D.L., Matray T.J., Greenberg М.М. Efficient solution phase synthesis of oligonucleotide conjugates using protected biopolymers containing З'-terminal alkyl amines. //J. Org. Chem. 1997. V. 62. N 21. P. 7074-7075.

24. McMinn D.L., Greenberg M.M. Convergent solution-phase synthesis of a nucleopeptide using a protected oligonucleotide. // Bioorg. and Med. Chem. Lett. 1999. V. 9. N4. P. 547-550.

25. Jensen O.N., Kulkarni S., Aldrich J.V., Barofsky D.F. Characterization of peptide-oligonucleotide heteroconjugates by mass spectrometry. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. N 19. P. 3866-3872.

26. Lukhtanov E.A., Kutyavin I.V., Gamper H.B., Meyer R.B. Oligodeoxyribonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole oligopeptides: preparation and hybridization properties. // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. N 4. P. 418-426.

27. Guibourdenche C., Seebach D. 1. Use of the Wolff rearrangement of diazo ketones from amino acids as a synthetic method for the formation of oligonucleo-peptides: a novel approach to chimeric biomolecules. // Helv. Chim. Acta. 1997. V. 80. N 1. P. 1-13.

28. Bruick R.K., Dawson P.E., Kent S.B.H., Usman N., Joyce G.F. Template-directed ligation of peptides to oligonucleotides. // Chemistry and Biology. 1996. V. 3. N 1. P. 49-56.

29. McMinn D.L., Greenberg M.M. Novel solid phase synthesis support for the preparation of oligonucleotides containing З'-aikyl amines.// Tetrahedron. 1996. V. 52. N 11. P. 3827-3840.

30. McMinn D.L., Greenberg M.M. Postsynthetic conjugation of protected oligonucleotides containing 3-alkylamines. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. N 14. P. 3289-3294.

31. Sinha N.D., Cook R.M. The preparation of functionalised synthetic oligonucleotides: III. Use of H-phosphonate derivatives of protected amino-hexanoland mercapto-propanol or -hexanol. // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. N 6. P. 2659-2669.

32. Arar K., Monsigny M., Mayer R. Synthesis of oligonucleotide-peptide conjugates containing a KDEL signal sequence. // Tetrahedron Lett. 1993. V. 34. N 50. P. 8087-8090.

33. Ede N.J., Treager G.W., Haralambidis J. Routine preparation of thiol oligonucleotides: application to the synthesis of oligonucleotide-peptide hybrids. // Bioconjugate Chem. 1994. V. 4. N 4. P. 373-378.

34. Soukchareun S., Haralambidis J., Treager G.W. Use of Na-Fmoc-cysteine(S-thio-butyl) derivatized oligodeoxynucleotides for the preparation of oligodeoxynucleotide-peptide hybrid molecules. // Bioconjugate Chem. 1998. V. 9. N 4. P. 466-475.

35. Tung C.-H., Rudolph M.J., Stein S. Preparation of oligonucleotide-peptide conjugates. // Bioconjugate Chem. 1991. V. 2. N 6. P. 464-465.

36. Zhu T., Wei Z., Tung C.-H., Dickerhof W.A., Breslauer K.J., Georgopoulos D.E., Leibowitz M.J., Stein S. Oligonucleotide-poly-L-ornithine conjugates: binding to complementary DNA and RNA. //Antisense Res. and Dev. 1993. V. 3. N 3. P. 265-275.

37. Bongartz J.-P., Aubertin A.-M., Milhaud P.G., Lebleu B. Improved biological activity of antisense oligonucleotides conjugated to a fusogenic peptide. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. N 22. P. 4681-4688.133

38. Harrison J.G., Balasubramanian S. Synthesis and hybridization analysis of a small library of oligonucleotide-peptide conjugates. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. N 13. P. 3136-3145.

39. Zanta M.A., Belguise-Valladier P., Behr J.-P. Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. N 1. P. 91-96.

40. Wei Z., Tung C.-H., Zhu T., Stein S. Synthesis of oligoarginine-oligonucleotide conjugates and oligoarginine-bridged oligonucleotide pairs. // Bioconjugate Chem. 1994. V. 5. N 5. P. 468-474.

41. Zhu T., Stein S. Preparation of vitamin B6-conjugated peptides at the amino terminus and of vitamin B6-peptide-oligonucleotide conjugates. // Bioconjugate Chem. 1994. V. 5. N 4. P. 312-315.

42. Stein S., Zhu T. Preparation of vitamin B6-peptide and vitamin B6-peptide-oligonucleotide conjugates. // Methods Enzymol. 1997. V. 280. P. 51-58.

43. Reed M.W., Fraga D., Schwartz D.E., Scholler J., Hinrichsen R.D. Synthesis and evaluation of nuclear targeting peptide-antisense oligodeoxynucleotide conjugates. //Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. N 1. P. 101-108.

44. Arar K., Aubertin A.-M., Roche A.-C., Monsigny M., Mayer R. Synthesis and antiviral activity of peptide-oligonucleotide conjugates prepared by using A/a-(bromoacetyl)peptides. // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. N 5. P. 573-577.

45. Meunier L., Bourgerie S., Mayer R., Roche A.-C., Monsigny M. Optimized conditions to couple two water-soluble biomolecules through alkylamine thiolation and thioetherification. // Bioconjugate Chem. 1999. V. 10. N 2. P. 206-212.

46. Lin Y., Padmapriya A., Morden K.M., Jayasena S.D. Peptide conjugation to an in vitro-selected DNA ligand improves enzyme inhibition. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. N 24. P. 11044-11048.

47. Corey D.R. 4800-fold acceleration of hybridization by chemically modified oligonucleotides. //J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. N 36. P. 9373-9374.

48. Vives E., Lebleu B. Selective coupling of a highly basic peptide to an oligonucleotide. //Tetrahedron Lett. 1997. V. 38. N 7. P. 1183-1186.

49. Bonfils B., Thuong N.T. Solid phase synthesis of 5', 3'-bifunctional oligodeoxyribonucleotides bearing a masked thiol group at the 3'-end. //Tetrahedron Lett. 1991. V. 32. N 26. P. 3053-3056.

50. Haralambidis J., Duncan L., Treager G.W. The solid phase synthesis of oligonucleotides containing a 3-peptide moiety. // Tetrahedron Lett. 1987. V. 28. N43. P. 5199-5202.

51. Haralambidis J., Duncan L., Angus K., Treager G.W. The synthesis of polyamide-oligonucleotide conjugate molecules. // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. N 3. P. 493-499.

52. Soukchareun S., Treager G.W., Haralambidis J. Preparation and characterization of antisense oligonucleotide-peptide hybrids containing viral fusion peptides. // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. N 1. P. 43-53.

53. Lukhtanov E.A., Kutyavin I.V., Meyer R.B. Direct, solid phase assembly of dihydropyrroloindole peptides with conjugated oligonucleotides. // Bioconjugate Chem. 1996. V. 7. N 5. P. 564-567.

54. Truffert J.-C., Lorthioir O., Asseline U., Thuong N.T., Brack A. On-line solid phase synthesis of oligonucleotide-peptide hybrids using silica supports. // Tetrahedron Lett. 1994. V. 35. N 15. P. 2353-2356.

55. Truffert J.-C., Asseline U., Thuong N.T., Brack A. Synthesis, characterization and binding properties of peptide-oligonucleotide conjugates containing the SPKK peptide motif. // Protein and Peptide Lett. 1995. V. 2. N 3. P. 419-424.

56. Robles J., Beltran M., Marchan V., Perez Y., Travesset I., Pedroso E., Grandas A. Towards nucleopeptides containing any trifunctional amino acid. // Tetrahedron. 1999. V. 55. N 46. P. 13251-13264.

57. Robles J., Pedroso E., Grandas A. Stepwise solid-phase synthesis of nucleopeptide Phac-Ser(p5CATCAT)-Gly-Asp-OH from adenovirus-2 nucleoprotein. //Tetrahedron Lett. 1994. V. 35. N 25. P. 4449-4452.

58. Robles J., Pedroso E., Grandas A. Stepwise solid-phase synthesis of the nucleopeptide Phac-Phe-Val-Ser(p3ACT)-Gly-OH. // J. Org. Chem. 1994. V. 59. N 9. P. 2482-2486.

59. Robles J., Pedroso E., Grandas A. Solid-phase synthesis of a nucleopeptide from the linking site of adenovirus-2 nucleoprotein, -Ser(p5CATCAT)-Gly-Asp-. Convergent versus stepwise strategy. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. N 20. P. 4151-4161.

60. Robles J., Maseda M., Beltran M., Concernau M., Pedroso E., Grandas A. Synthesis and enzymatic stability of phosphodiester-linked peptide-oligonucleotide hybrids. // Bioconjugate Chem. 1997. V. 8. N 6. P. 785-788.

61. Beltran M., Pedroso E., Grandas A. A comparison of histidine protecting groups in the synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates. // Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. N 23. P. 4115-4118.

62. Robles J., Pedroso E., Grandas A. Peptide-oligonucleotide hybrids with N-acylphosphoramidate linkages. // J. Org. Chem. 1995. V. 60. N 15. P. 4856-4861.

63. Bergmann F., Bannwarth W. Solid phase synthesis of directly linked peptide-oligodeoxynucleotide hybrids using standard synthesis protocols. // Tetrahedron Lett. 1995. V. 36. N 11. P. 1839-1842.

64. Tetzlaff C.N., Schwope I., Bleczinski C.F., Steinberg J.A., Richert C. A convenient synthesis of 5'-amino-5'-deoxythymidine and preparation of peptide-DNA hybrids. //Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. N 24. P. 4215-4218.

65. Juby C.D., Richardson C.D., Brousseau R. Facile preparation of 3'oligonucleotide-peptide conjugates. // Tetrahedron Lett. 1991. V. 32. N 7. P. 879-882.

66. Basu S., Wickstrom E. Solid phase synthesis of a D-peptide-phosphorothioate oligodeoxynucleotide conjugate from two arms of a polyethylene glycol-polystyrene support. // Tetrahedron Lett. 1995. V. 36. N 28. P. 4943-4946.136

67. Chow T. Y.-K., Juby C., Brousseau R. Specific targeting of antisense oligonucleotides to neutrophils. // Antisense Res. and Dev. 1994. V. 4. N 2. P. 81-86.

68. Dreef-Tromp C.M., van den Elst H., van der Boogart J.E., van der Marel G.A., van Boom J.H. Solid-phase synthesis of an RNA nucleopeptide fragment from the nucleoprotein of poliovirus. // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. N 10. P. 2435-2439.

69. Robles J., Pedroso E., Grandas A. Solid phase synthesis of a model nucleopeptide with a phosphodiester bond between 5' end of a trinucleotide and a serine residue. //Tetrahedron Lett. 1991. V. 32. N 34. P. 4389-4392.

70. Grandas A., Robles J., Pedroso E. Phosphitylation of primary carboxamides. Synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates with acylphosphoramidate linkages. // Nucleosides and Nucleotides. 1995. V. 14. N 3-5. P. 825-828.

71. Peyrottes S., Mestre B., Burlina F., Gait M.J. The synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates by a fragment coupling approach. // Tetrahedron. 1998. V. 54. N41. P. 12513-12522.

72. Peyrottes S., Mestre B., Burlina F., Gait M.J. Studies towards the synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates. // Nucleosides and Nucleotides. 1999. V. 18. N 6, 7. P. 1443-1448.

73. Fujii M., Hasegava T., Koujima I. Preparation of DNA-peptide conjugate using oxime resin. // Nucleic Acids Symp. Ser. 1997. N 37. P. 71-72.137

74. Fujii M., Hasegava Т., Takase S., Koichiro I. Convenient method for the synthesis of DNA conjugate. // Nucleosides and Nucleotides. 1999. V. 18. N 6,7. P. 1487-1488.

75. Pieken W.A., Olsen D.B., Benseler F., Aurup H., Eckstein F. Kinetic characterization of ribonuclease-resistant 2'-modified hammerhead ribozymes. //Science. 1991. V. 253. N5017. P. 314-317.

76. Кузнецова Л.Г., Волков Е.М., Романова Е.А., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 2'-амино--2'-дезоксиуридиновые звенья. // Биоорган, химия. 1991. Т. 17. N 9. С. 1289-1291.

77. Кузнецова Л.Г., Романова Е.А., Волков Е.М., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С., Крынецкая Н.Ф., Шабарова З.А. Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие 2'-амино-2'-дезоксипиримидиновые нуклеозиды. // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. N4. С. 455-466.

78. Aurup Н., Tuschl Т., Benseler F., Ludwig J., Eckstein F. Oligonucleotide duplexes containing 2'-amino-2'-deoxycytidines: thermal stability and chemical reactivity. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. N 1. P. 20-24.

79. Yamana K., Mitsui Т., Nakano H. Synthesis and properties of oligonucleotide duplexes containing donor and acceptor fluorophores at 2'-positions. //Tetrahedron. 1999. V. 55. N 30. P. 9143-9150.

80. Alefelder S., Sigurdsson S.Th. Interstrand disulfide cross-linking of internal sugar residues in duplex RNA. // Bioorg. and Med. Chem. 2000. V. 8. N 1. P. 269-273.

81. Hwang J.-Т., Greenberg M.M. Synthesis of modified oligodeoxyribonucleotides on a solid-phase support via derivatization of a selectively revealed 2'-amino-2'-deoxy-uridine. //Organic Lett. 1999. V. 1. N 12. P. 2021-2024.138

82. Miller P.S., Bhan P., Kan L.-S. Syntheses and interactions of oligodeoxyribonucleotides containing 2'-amino-2'-deoxyuridine. // Nucleosides and Nucleotides. 1993. V. 12. N 8. P. 785-792.

83. Sato A., Imai R., Nakamizo N., Hirata T. Synthesis of 2,-amino-2'-deoxy--(3-D-arabinofuranosyl nucleosides. // Chem. Pharm. Bull. 1979. V. 27. N 3. P. 821-823.

84. Walcher G., Pfleiderer W. 93. Synthesis of 2'-amino-2'-deoxyarabinonucleoside phosphoramidite building blocks. // Helv. Chim. Acta. 1996. V. 79. N 4. P. 1067-1074.

85. Jones R.A. Preparation of protected deoxyribonucleotides. // Oligonucleotide synthesis: a practical approach. // Ed. M.J. Gait. Oxford, Washington DC: IRL Press, 1984. P. 23-34.

86. Markiewicz W.T. Tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl, a group for simultaneous protection of 3'- and 5'-hydroxy functions of nucleosides. // J. Chem. Res. Synop. 1979. P. 24, 25.

87. Sproat B.S., Lamond A.I. 2'-0-Methyloligoribonucleotides: synthesis and applications. // Oligonucleotides and analogues: a practical approach. // Ed. F. Eckstein. Oxford, New York, Tokyo: IRL Press, 1991. P. 49-86.

88. Гершкович A.A., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. Киев: Наукова думка, 1992. 360 с.

89. Verheyden J.P.H., Wagner D., Moffat J.G. Synthesis of some pyrimidine 2'-amino-2'-deoxynucleosides. //J. Org. Chem. 1971. V. 36. N 2. P. 250-254.

90. Nakai C., Konishi A., Komatsu Y., Inoue H., Ohtsuka E., Kanaya S. Sequence-specific cleavage of RNA by a hybrid ribonuclease H. // FEBS Lett. 1994. V. 339. N 1, 2. P. 67-72

91. Knorr R., Trzeciak A., Bannwarth W., Gillessen D. New coupling reagents in peptide chemistry. //Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. N 15. P. 1927-1930.

92. Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985. С. 211-230.

93. Fox J.J., Miller N.C. Nucleosides XVI. Further studies of anhydronucleosides. //J. Org. Chem. 1963. V. 28. N 4. P. 936-941.

94. McGee D.P.C., Vargeese C., Zhai Y., Kirschenheuter G.P., Settle A., Siedem C.R., Pieken W.A. Efficient synthesis of 2'-amino-2'-deoxypyrimidine 5'-triphosphates. // Nucleosides and Nucleotides. 1995. V. 14. N 6. P. 1329-1339.

95. Agrawal S., Christodoulou C., Gait M.J. Efficient methods for attaching non-radioactive labels to the 5'-ends of synthetic oligodeoxyribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. N 15. P. 6227-6245.

96. Bischoff R., Coull J.M., Regnier F.E. Introduction of 5'-terminal functional groups into synthetic oligonucleotides for selective immobilization. //Anal. Biochem. 1987. V. 164. N 2. P. 336-344.