Конструирование эндонуклеаз рестрикции с фоторегулируемой активностью тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

004660767

На правах рукописи

Ле Тхи Хиен

КОНСТРУИРОВАНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ С ФОТОРЕГУЛИРУЕМОЙ АКТИВНОСТЬЮ

02.00.10 - биоорганическая химия

1 5АПР20Ю

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

(Д^Г

МОСКВА-2010

004600767

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в Институте биохимии Университета имени Ю. Либиха (г. Гиссен, Германия) в группе профессора А. Пингоуда.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Орецкая Татьяна Семеновна

доктор химических наук Кубарева Елена Александровна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Михайлов Сергей Николаевич

доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится 27 апреля 2010 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 26 марта 2010 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Человеческий геном включает около 30000 различных генов. Нуклеотидные замены в геноме могут привести к различным болезням. Коррекция мутаций эффективно возвращает фенотип болезни в первоначальную форму. Одна из самых многообещающих стратегий исправления мутаций основана на гомологичной рекомбинации. Главная проблема при исправлении нарушений генома путем замены дефектного участка генов заключается в том, чтобы стимулировать рекомбинацию, так как ее эффективность очень низка. Известно, что гидролиз целевой нуклеотидной последовательности приводит к появлению концов ДНК, склонных к рекомбинации, последовательно увеличивая частоту гомологичной рекомбинации в десятки тысяч раз.

В «хирургии» генома в качестве молекулярных инструментов для расщепления ДНК вблизи дефектного гена находят применение различные ферменты, в том числе эндонуклеазы рестрикции (ЭР), нуклеазы, содержащие структурный модуль «цинковые пальцы», и эндонуклеазы генной конверсии. Специфическое расщепление ДНК в нужном участке является ключевым требованием этого метода. Для точечного гидролиза ДНК в геноме человека, содержащем приблизительно 3 миллиарда пар нуклеотидов, используют мегануклеазы - сиквенс-специфические эндонуклеазы с протяженным участком узнавания. Однако в процессе поиска целевого субстрата ферменты, направлено гидролизующие ДНК, могут проявлять неспецифическую активность. Поэтому актуальной задачей является регулирование их действия. Процесс нежелательного расщепления ДНК можно попытаться минимизировать, «включая» и «выключая» активность фермента в определенные моменты времени посредством внешних воздействий, таких как свет. Для управления активностью белков посредством света все большее применение находят «фотопереключатели» -производные азобензола (Banghart et al, 2004; Nakayama et al., 2004; Volgraf et al„ 2006; Harvey et al„ 2008). Цис-транс-тоиеркзацш азобензола протекает быстро под действием света с длиной волны более 300 нм и, следовательно, позволяет активировать/инактивировать белки in vivo. В настоящей работе в качестве объектов для разработки подходов к регулированию ферментативной активности использованы гомодимерные эндонуклеазы рестрикции 11-го типа SsoII (R.SsoII) и PvuII (R.PvuII).

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в модификации мутантных форм эндонуклеаз рестрикции SsoII и PvuII производными азобензола для конструирования ферментов с фоторегулируемой активностью. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.

1. На основании данных рентгеноструктурного анализа выбрать аминокислотные остатки в R.SsoII для их замены на цистеин для последующей модификации производными азобензола.

2. Получить мутантные формы R.SsoII, содержащие остаток (остатки) цистеина в выбранной позиции.

з

3. Синтезировать производные азобензола, подтвердить их структуру, исследовать их химические и оптические свойства.

4. Модифицировать мутантные формы Я.БзоП производными азобензола.

5. Исследовать гидролитическую активность набора мутантных форм Я.БбоП, модифицированных производными азобензола, при облучении светом определенной длины волны.

6. Сравнить эффективность и возможность применения метода «молекулярных ворот», разработанного для Я.БзоН, и метода «молекулярной пружины», предложенного для Я.РуиН, для фоторегулирования активности белков. Научная новизна. Предложены и разработаны два подхода к регулированию

активности эндонуклеаз рестрикции П-го типа при облучении светом определенной длины волны: метод «молекулярных ворот» на примере Я-БбоП и метод «молекулярной пружины», примененный для Я.Руи11.

Впервые продемонстрировано, что гидролитическая активность мутантных форм Я.БбоН регулируется светом, если одно из бензольных колец асимметричного производного азобензола присоединено к белку вблизи от «входа» в его ДНК-связывающий центр, «закрывая» или «открывая» его для взаимодействия с ДНК-субстратом в нужный момент времени. Начальная скорость гидролиза ДНК под действием света с длиной волны 365 и 470 нм различается в 2 раза, когда в каждой субъединице Я.ЗбоП к остатку СуБ, находящемуся внутри ДНК-связывающего «кармана» (С224), и к остатку Суз, локализованному на его внешней поверхности (С 174), присоединены производные азобензола, содержащие гидроксильную группу. Такой же эффект достигается при сближении хелатообразующих групп молекул азобензола, присоединенных к остатку СуБ 171, за счет формирования комплексного соединения в присутствии ионов никеля.

Идея второго подхода заключалась в использовании симметричного производного азобензола (4,4'-бисмалеимидазобензола) для соединения двух сближенных остатков цистеина Я.РуиН. Показано, что при специфическом облучении происходит изомеризация азобензола, который работает как «пружина», изменяя локальную конформацию белка и, как следствие, его активность. Установлено, что максимальный эффект - 16-кратное различие в начальной скорости гидролиза ДНК-субстрата при облучении светом с длиной волны 365 и 470 нм наблюдается, когда две субъединицы Руц11 соединены пептидным линкером, существенный для катализа остаток Туг94 заменен на РЬе, а две молекулы азобензола локализованы либо рядом с каталитическим центром фермента, либо в пептидном линкере в непосредственной близости от него.

Разработан новый метод синтеза разнообразных асимметричных производных азобензола, содержащих малеимидную группировку в одном из бензольных ядер для модификации цистеина белка, в другом - гидроксильную, амино-, одну или две карбоксильных группы, цистеин, а также олигонуклеотиды. Предложена новая, оригинальная методика выделения конъюгата белка с присоединенным к нему олигонуклеотидом.

Практическая значимость работы. Предложенные и развитые в данной работе методы фоторегулирования активности белков - «молекулярные ворота» для R.SsoII и «молекулярная пружина» для R.PvuII - можно применить не только для эндонуклеаз рестрикции, но и для других белков.

Регулирование ферментативной активности ЭР под действием света открывает новые перспективы для контроля за расщеплением ДНК и создания безопасных молекулярных инструментов для манипуляции генами. Так, модифицированная нуклеаза может быть доставлена в ядро клетки в малоактивном состоянии для последующей дистанционной активации внешним сигналом (УФ-светом) после связывания с ДНК в специфичном сайте. Неспецифическое расщепление ДНК можно уменьшить путем снижения нуклеазной активности после гидролиза целевого участка посредством облучения голубым светом.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российских и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на конференции «Ломоносов-2007» (Москва, Россия, апрель 2007 г.), конференции «Offspring-Meeting of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow» (Москва, Россия, февраль 2008 г.), IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.), конференции «Human Resources Development in the Study of Nucleic Acids» (Хания, Греция, июнь - июль 2008 г.), 34-ом конгрессе FEBS «Life's Molecular Interactions» (Прага, Чехия, июль 2009 г.), конференции «Nucleic Acids at the Chemistry-Biology Interface» (Манчестер, Великобритания, сентябрь 2009 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен методам регулирования активности белков под действием света), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 72 рисунками, 25 схемами, 23 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 135 цитированных работ.

Работа выполнена при поддержке программы РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых» (гранты 08-04-91974 ННИОМ_а и IRTG GRK 1384).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Эндонуклеазы рестрикции SsoII и PvuII

В настоящей работе в качестве объектов для конструирования фоторегулируемых ферментов использованы гомодимерная эндонуклеаза рестрикции SsoII (R.SsoII) и мутантная форма эндонуклеазы рестрикции PvuII (scPvuII), в которой С-конец одной

Плазмиды, несущие ген Я^юН или ген Я^оП без остатков Суь, были любезно предоставлены Карягиной А С. (НИИЭиМ РАМН) и Пингоуд В. (Институт биохимии Университета им. Ю. Либиха, Германия).

субъединицы соединен с N-концом другой субъединицы пептидным линкером Gly-Ser-Gly-Gly (Meramveliotaki et al., 2007). Основой для конструирования мутантных форм R.SsoII послужили результаты рентгеноструктурного анализа комплекса эндонуклеазы рестрикции Ecll8kl (R.Ecll8kI) с субстратом (Bochtler et al., 2006). R.Ecll8kI является изошизомером и ближайшим гомологом R.SsoII (ферменты отличаются одной аминокислотой - Val232 в R.EcllSkI соответствует Не в R.SsoII). R.SsoII входит в систему рестрикции-модификации 11-го типа бактерии Shigella sonnei 47 (Упорова и др., 1985). Фермент узнает в двутяжевой ДНК последовательность нуклеотидов 5'-|CCNGG-3V3r-GGNCCt-5' (N = А, Т, G или С) и гидролизует ДНК на границах этого участка в местах, указанных стрелками. R.PvuII входит в систему рестрикции-модификации 11-го типа бактерии Proteus vulgaris (Gingeras et al., 1981). R.PvuII дикого типа в растворе существует в форме гомодимера. Фермент узнает в двутяжевой ДНК последовательность нуклеотидов 54^AGlCTG-373'-GTC/TGAC-5' и гидролизует ДНК в середине этого участка, как указано стрелками.

2. Подходы к фоторегулированию активности эндонуклеаз рестрикции

Для конструирования фоторегулируемого белка требуется прежде всего селективно присоединить к нему светочувствительные соединения. Для модификации белка различными реагентами наиболее удобными являются тиольные группы остатков цистеина, которые могут быть введены в состав белка методом сайт-направленного мутагенеза. В качестве фотопереключателя чаще всего используются производные азобензола. 7/эанс-конфигурация азобензола переходит в г/нс-конфигурацию при облучении УФ-светом (365 нм), а обратный переход осуществляется при облучении голубым светом (470 нм) или при термической релаксации (схема 1). Цис-транс-изомеризация азобензола при специфическом облучении протекает быстро, эффективно и практически не зависит от окружающей среды.

365 нм ~

у-ч , 365 нм ■ 0 Г)

W N4>R' 470 нм или R^ Ц.,

термическая релаксация

транс-конфигурация ¡/¡/¿-конфигурация

Схема 1.

В работе предлагаются два подхода к регулированию активности эндонуклеаз рестрикции при специфическом облучении. Идея первого подхода основана на том, что большинство эндонуклеаз рестрикции в активном состоянии представляют собой гомодимеры. Многие из них при взаимодействии с субстратом подвергаются конформационным изменениям, что позволяет ДНК подойти к ДНК-связывающему центру фермента, который находится в интерфейсе между двумя субъединицами гомодимера. Модифицируя белок асимметричными производными азобензола вблизи

от ДНК-связывающего или каталитического центра, можно сделать его недоступным для подхода ДНК из-за стерических препятствий в случае более «вытянутой» трансконфигурации производных азобензола. При облучении УФ-светом транс-форма азобензола переходит в более компактную цис-форму, расстояние между концами двух молекул азобензола увеличивается, и субстрат может попасть в ДНК-связывающий центр белка. Такая тактика регулирования активности белка может быть названа методом фоторегулируемых «молекулярных ворот» (схема 2).

транс-азобензол

ДНК-субстрат

центр Л.Ес11Ш

(Я^зоП)

г/мс-азобензол

365 <-

470

Схема 2.

Второй подход к регулированию активности белка назван методом «молекулярной пружины» (схема 3). Он заключается в использовании симметричных производных азобензола для соединения двух сближенных остатков цистеина белка. При изменении длины волны возбуждающего света происходит изомеризация азобензола, который работает как пружина, изменяя локальную конформацию белка, что может привести к изменению его активности.

Каталитический центр Я.РмШ

Д \ >

& V-,

ш

сЛ "*

X*

365 нм

470 нм

Л/' -М-

\у

.4 Ч

транс-аюоензол

и и с-азооензол

Схема 3.

7

3. Конструирование и характеристика мутантных форм К^воП

В структуре Я^оН дикого типа (\vtR.SsoII) имеется 2 остатка цистеина в позиции 33 и 60. Был получен вариант белка К^оЩСЗЗв/СбОЗ), не содержащий остатков цистеина - сЖ^боН (или 2С8), и проведен сайт-направленный мутагенез гена этого белка. Согласно анализу структуры комплекса К.Ес118к1 с субстратом гомодимер белка содержит внутренний и внешний «зажимы», которые окружают ДНК. В мономере cfR.SsoII были выбраны две аминокислоты 5171 и Я174, входящие в состав внешнего «зажима» и три аминокислоты Я198, 1220 и А224, локализованные во внутреннем «зажиме» (рис. 1). Было получено 5 мутантных форм с1К.8зо11, в которых один из перечисленных выше остатков заменен на Сув. Можно предположить, что чем больше молекул азобензола находится вблизи от «входа» в ДНК-связывающий центр белка, тем больше стерический эффект и тем больше влияние облучения на активность белка. Поэтому были получены еще 6 мутантных форм с1Я.8зоП с 2, 3 или 4 остатками цистеина в положениях 171, 174, 198, 220 и 224 или 198 в различных комбинациях.

Рис. 1. Структура гомодимера К.БэоП (на основе данных РСА для Я.Ес118Ы (ВосШег е? Ы, 2006). Указаны аминокислоты, замененные на цистеин: Г 8171, Я174, Я198,1220, А224.

4. Анализ реакционной способности остатков цистеина мутантных форм КвзоП

Для оценки реакционной способности остатков Су б мутантных форм Я.БзоИ использовали полиэтиленгликоль, содержащий группировки малеимида (РЕС-Ма1). Большая молекулярная масса РЕв-Ма! (5 кДа) позволяет фиксировать образование его конъюгата с мутантными формами К.БзоП методом гель-электрофореза по Лэммли. РЕС-Ма1 практически количественно взаимодействует с большинством мутантных форм Я.ЗбоП, что свидетельствует о высокой реакционной способности остатков Суэ в' этих белках при взаимодействии с остатком малеимида (рис. 2).

Внешний «зажим»

8171С

С335

С 608

к Л a1 2 3 4 5

SsgM.. Конъюгат 2CS SI " 1С R1~4C I220C A224C с PEG-Mal

" ДИМ-е-^Конъюгат 2CS S ПС R1 "4С I220C с PEG-Mal

60 ^рЦР«— Конъюгат 2CS S1 "1С RI "4С с PEG-Mal

50 m • ЩН-Конъюгат 2CS I220C с PEG-Mal " <-Немодифщнрованньш белок

Рис. 2. Анализ методом гель-электрофореза по Лэммли взаимодействия мутантных форм R.SsoII (5 мкМ), содержащих 1 (дорожка 5), 2 (дорожка 4), 3 (дорожка 5) или 4 (дорожка 2) остатка цистеина в мономере белка с PEG-Mal (5 кДа, 500 мкМ). Дорожка 1 - маркерные белки, молекулярная масса (кДа) указана слева. Гель окрашен раствором кумасси G250.

1

5. Гидролиз ДНК-субстрата мутантными формами R.SsoII

■ Ферментативную активность мутантных форм R.SsoII оценивали по способности

белка гидролизовать 873-звенный ДНК-субстрат, содержащий единственный участок узнавания этого фермента. Реакционную смесь анализировали методом гель-электрофореза с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия. Продуктами расщепления являются ДНК-дуплексы длиной 530 и 338 нуклеотидных пар (н.п.).

ir 100 1 wtR.SsoII

S g 2 cfR.SsoII(C33S/C60S) = 2CS

s- 80 . 3 2CS/S171C

KZ Щ 4 2CS/R174C

V 60 I 11 ! 5 2CS/R198C

=: j 1 г1 6 2CS/I220C

1 40 i H H 7 2CS/A224C

- p g il H II В в 8 2CS/S171C/R174C

2 20 I 1Ц1 y ■ 9 2CS/R174C/A224C

! и i] H | 11 10 2CS/R198C/A224C

- 0 ™ 1 1 : 11 2CS/R174C/R198C

-> 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 12 2CS/S171C/R174C/I220C

о 13 2CS/S171C/R174C/I220C/A224C

Рис. 3. Гистограмма, отражающая степень расщепления ДНК-субстрата мутантными формами Я.БзоП за 15 мин при 37°С. Концентрация ДНК-субстрата составляла 20 нМ. Концентрация фермента (20 - 300 нМ) была подобрана так, чтобы степень расщепления ДНК-субстрата находилась в пределах от 20% до 90%. Степень расщепления ДНК определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов. Ошибка измерения не превышала 8%.

Показано, что ферментативная активность мутантных форм R.SsoII зависит от положения и от количества введенных остатков цистеина. Чем ближе аминокислотный остаток (а.о.), заменяемый на Сув, расположен к ДНК-связывающему центру фермента

и чем большее число аминокислот заменено на цистеин, тем менее активна эта мутантная форма Я^оН (рис. 3).

6. Синтез производных азобензола

Для регулирования доступности ДНК-связывающего центра фермента при облучении светом определенной длины волны было предложено использовать несимметричные производные азобензола, содержащие в одном из бензольных колец малеимидную группировку для связывания с остатком цистеина белка, а в другом -различные заместители. В качестве заместителя выбраны функциональные группы, которые при определенном расположении друг относительно друга удерживаются в сближенном состоянии при образовании комплекса с ионом металла (рис. 4, а) или в результате формирования ДНК-дуплекса (рис. 4, в). При определенном расположении заместителя относительно аминокислоты из другой субъединицы белка принцип «молекулярных ворот» реализуется за счет образования водородных связей и/или кислотно-основных взаимодействий (рис. 4, б). Таким образом, заместитель на свободном конце производного азобензола может повлиять на функционирование белка.

дуплекс

0-6

Гомодимер белка

#•— Производное азобензола с присоединенньш олигонуклеоткдом О 6

Рис. 4. Схематическое изображение метода «молекулярных ворот». Обратимое блокирование активного центра белка с помощью производных азобензола: а -комплексообразование в присутствии иона металла, 6 - кислотно-основное взаимодействие производного азобензола со сближенной аминокислотой одной из субъединиц гомодимера белка, в - формирование ДНК-дуплекса.

Для получения производных азобензола был синтезирован 4,4'-бисмалеимидазобензол (1), к которому присоединяли различные тиосоединия (схема 4, табл. 1). Впервые были разработаны оригинальные методики для синтеза библиотеки новых производных азобензола, содержащих в одном из бензольных колец малеимидную группировку для связывания с остатком цистеина белка, а в другом -заместители, несущие различные функциональные группы: гидроксильнуто (2), одну или две карбоксильные группы (3) и (5), аминофункцию (4), а также группировки,

ю

способные образовывать комплексные соединения (6), или фрагмент ДНК (7) (табл. 1). Их структура была подтверждена методом УФ-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. о

о

Н5-Х: Н5^0Н

Н5^соон соон

Н5-Х

Ш,

НЭ

А

СООН

О И-О

5'-ТООАТСС.

о

соон

3' о

НХ^^О-Р-О б

Схема 4.

Таблица 1. Синтезированные производные азобензола.

Тип взаимодействия в молекуле белка Сокращенное название Номер Структура производных азобензола

Ковалентная связь ВМАВ 1 о 0

Водородная связь, кислотно-основные взаимодействия МАВОН 2 О О

МАВСООН 3 о ^•-оК-,,.. о

МАВ-Аш 4 0 0

МАВ-Бис 5 о

Образование комплекса с ионами металлов МАВ-СуБ 6 о О (? 5 Т СООН

ФормированиеДНК-дуплекса МАВ-о^о I 7 о ^-О-'^^.^^асстасст-У о

7. Модификация белка производными азобензола

Для модификации мутантных форм R.SsoII производными малеимидазобензола к раствору белка добавляли 10-кратный избыток раствора одного из соединений (1) - (7) при комнатной температуре. Молекулярная масса веществ (1) - (6) существенно меньше молекулярной массы R.SsoII. Поэтому присоединение любого из них практически не влияет на подвижность белка в геле в условиях анализа. Для оценки эффективности протекания реакции через 10 мин после начала инкубации мутантной формы R.SsoII с производным малеимидазобензола к аликвоте реакционной смеси добавляли избыток PEG-Mal (5 кДа). Образование конъюгата белок-PEG-Mal фиксировали методом электрофореза по Лэммли. Выход белка, модифицированного одним из соединений (1) - (6), был близок к 95%. Показано, что заместители практически не влияют на реакционную способность малеимидной группы. Таким образом, соединения (1) - (6) могут быть использованы для эффективной и селективной модификации белков.

В случае присоединения производного азобензола (7), содержащего олигонуклеотид, большая молекулярная масса MAB-oligo I (3 кДа) позволяет различить в геле зоны, соответствующие конъюгату и исходному белку (рис. 5, дорожки 3, 5, 7). Выход конъюгата достигает 50%. В контрольном эксперименте MAB-oligo I инкубировали cfR.SsoII, не содержащей остатков Cys. Образование конъюгата в этом случае не наблюдалось.

Мономер белка : MAB-oligo I 1:2 1:5 1:10

КДа 1 2 c-f-jry^prj^

б0|1и*

40 .

**—""—* .........<_ Конъюгат 2CS/S171С с MAB-oligo I

30j\, Немодифицированныйбелок

27 46 49 <- Выход конъюгата 2CS/S171С

с MAB-oligo I; %

Рис. 5. Анализ методом гель-электрофореза по Лэммли взаимодействия мутантной формы 2CS/S171С (5 мкМ) с MAB-oligo I. Дорожки 3, 5,7 - белок инкубировали с 2-, 5- и 10-кратным избытком MAB-oligo I (10, 25, 50 мкМ соответственно). Дорожки 4, 6, 8 - белок первоначально инкубировали с 2-, 5- и 10-кратным избытком MAB-oligo I, затем с PEG-Mal (5 кДа, 500 мкМ). Дорожка 2 - белок инкубировали с PEG-Mal. Дорожка / - маркерные белки, молекулярная масса (кДа) указана слева. Гель окрашен раствором кумасси G250.

8. Оптические свойства мутантных форм Н^зоИ, модифицированных производными азобензола

Для выяснения способности производных азобензола к цис-транс-изомеризации после их присоединения к белкам мутантные формы Я^оИ, модифицированные производными азобензола, облучали УФ- и голубым светом, затем регистрировали их спектры поглощения (рис. 6).

Для спектров поглощения производных азобензола характерен пик с максимумом 340 нм. Анализ оптических свойств замещенных азобензолов и производных азобензола, присоединенных к остаткам цистеина белка, не выявил существенных различий. Следовательно, процесс г/ис-гаранс-изомеризации протекает одинаково для азобензольных производных в свободном виде и после их присоединения к белкам.

Длина волны, нм Длина волны, нм

а б

Рис. 6. Спектр поглощения конъюгата 2С5/3171С/Я174С с МАВСООН: а -транс—>цис-изомеризация при облучении УФ-светом с длиной волны 365 нм; б - цис—»транс-изомеризация при облучении голубым светом с длиной волны 470 нм.

9. Гидролиз ДНК-субстрата мутантными формами К-БвоН, модифицированными МАВОН, МАВСООН, МАВ-Аш и МАВ-вис при специфическом облучении

В ходе работы необходимо было выбрать такую модифицированную производным азобензола мутантную форму Я.ЗбоН, которая бы проявляла максимальную разницу в эффективности расщепления ДНК при облучении УФ- и голубым светом (фотоэффект).

Первоначально фермент облучали светом соответствующей длины волны («предоблучение»). Затем ЭР добавляли к ДНК-субстрату и продолжали облучение. После 1, 2, 3, 5, 7, 10 мин инкубации отбирали пробы по 10 мкл, анализировали их методом гель-электрофореза, определяли степень гидролиза ДНК и строили кинетические кривые, из которых определяли начальную скорость расщепления субстрата модифицированными мутантными формами Я^боП. Фотоэффект рассчитывали как отношение начальной скорости гидролиза ДНК-дуплекса

13

эндонуклеазой рестрикции при облучении УФ-светом (азобензол в цкс-конфигурации) к начальной скорости гидролиза субстрата этим же белком при облучении голубым светом (азобензол в транс-конфигурации). Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2. Сравнение ферментативной активности мутантных форм Я^оИ, модифицированных производными азобензола, при облучении УФ- и голубым светом.

Фермент Фотоэффект

1 ууг^ББОП 1,00 ±0,01

2 сЯ^оН 1,1 ±0,1

3 2С8/8171С-МАВОН 1,00 ±0,01

4 2С8/Я174С-М АВОН 1,10 ± 0,01

5 2С8/Я198С-МАВОН 1,2 ±0,1

6 2С8/1220С-МАВОН 1,3 ±0,2

7 2С8/А224С-МАВОН 1,4 ±0,2

8 2С8/Я174С/А224С-МАВОН 2,4 ± 0,4

9 2С8Л> 171С/Ш74С-М АВОН 1,3 ±0,2

10 2С8/8171С-МАВСООН 1,2 ± 0,1

11 2С8Л1174С-МАВСООН 1,1 ±0,1

12 2С8Ш98С-МАВСООН 1,00 ±0,01

13 2С8/А224С-МАВСООН 1,3 ±0,2

14 2СБ/174/224-СООН 1,1 ±0,1

15 2С8Л1174С-МАВ-8ис 0,8 ±0,1

16 2С8/171-МАВ-Аш 1,2 ± 0,1

17 2С8/174-М АВ-Ат 1,00 ±0,01

Наибольшая разница в скоростях гидролиза (в 2 раза) была получена для варианта 2СЭ/Я174С/А224С-МАВОН. В нем одна молекула МАВОН присоединена к остатку СуБ, который находится внутри ДНК-связывающего «кармана» (С224), а другая - к остатку Суэ, который находится на его внешней поверхности (С 174). Можно предположить возможность образования водородных связей между гидроксильными группами молекул азобензола в транс-конфигурации, что усиливает разницу в скоростях гидролиза ДНК ферментом при облучении УФ- и голубым светом (рис. 7). Остальные мутантные формы Я^оП, модифицированные МАВОН, МАВСООН, МАВ-Ат и МАВ-Бис, не проявляли значительного фотоэффекта при специфическом облучении. Соотношение скоростей близко к единице. Контрольные эксперименты показали, что ферментативная активность \vtR.SsoII и cfR.SsoИ при облучении УФ- и голубым светом сравнима (табл. 2).

0 1 2 3 4 5 Время, мин

а б

Рис. 7. а - Гидролиз ДНК-субстрата белком 2С5/Я174С/А224С-МАВОН при облучении голубым светом и УФ-светом. Концентрация субстрата - 20 нМ, фермента - 500 нМ. б -Схематическое изображение 2С8Ш74С/А224С-МАВОН

10. Гидролиз ДНК-субстрата мутантной формой Н-БвоИ, модифицированной олигонуклеотидсодержащим производным азобензола, при специфическом

облучении

Для создания существенного препятствия для «входа» ДНК в ДНК-связывающий центр фермента целесообразно использовать свойство комплементарных олигонуклеотидов формировать дуплекс. Такое взаимодействие обратимо и кооперативно и может реализоваться при сближении фрагментов ДНК, введенных в каждую из двух субъединиц гомодимерной ЭР с помощью производного азобензола (рис. 4, в).

Выбор структуры олигонуклеотида для присоединения к бисмалеимидазобензолу основывался на следующих требованиях. Во-первых, нуклеотидная последовательность должна быть самокомплементарной. Во-вторых, олигонуклеотид должен быть достаточным протяженным, чтобы дуплекс формировался при температуре, когда \vtR.SsoII эффективно гидролизуег ДНК (> 20°С). В-третьих, ДНК-дуплекс не должен быть слишком прочным, чтобы цис-транс-изомеризация азобензола оказывала влияние на его образование. В результате был выбран 8-звенный олигонуклеотид 5-ТСОАТССА-З' (оПёо I), образующий дуплекс с расчетной температурой плавления 24°С. Следовательно, гидролиз ДНК-субстрата должен протекать при температуре не выше, чем это значение. Показано, что скорость гидролиза субстрата 2С8/8171С-МАВ-о^о I при 24 ± 0,5°С при облучении УФ-светом в 1,7 раз больше, чем при облучении голубым светом.

11. Гидролиз ДНК-субстрата мутантной формой R.SsoII, содержащей хелатообразующую группировку, при облучении УФ- и голубым светом

В данной работе было синтезировано производное малеимидазобензола, содержащее остаток цистеина в одном из бензольных колец (MAB-Cys (6)), т.к. цистеин и его производные образуют комплексные соединения со многими ионами металлов (Lenz et al., 1964). После присоединения MAB-Cys к белку при трансконфигурации азобензола группировки для координирования иона металла могут сблизиться. Такого рода прочный «заслон» должен препятствовать входу субстрата в ДНК-связывающий центр. Анализ структуры R.SsoII показал, что наиболее предпочтительной мутантной формой для присоединения MAB-Cys является белок 2CS/S171 С.

Были определены кинетические параметры реакций гидролиза ДНК R.SsoII дикого типа и белка 2CS/S171 C-MAB-Cys. Рассчитывали начальные скорости гидролиза ферментами 20-звенного ДНК-дуплекса при различных его концентрациях. Из полученных данных определяли значения константы Михаэлиса (Км) и максимальную скорость (VMaKC) ферментативных реакций (табл. 3).

Таблица 3. Кинетические характеристики реакций гидролиза 20-звенного субстрата эндонуклеазами рестрикции.

Фермент Vmekc, нМ/мин Км, нМ

wtR.SsoII 100± 13 4,07 ±0,65

2CS/S171 C-MAB-Cys 77 ±5 17,03 ± 0,09

Показано, что значение Км реакции с участием 2CS/S171C-MAB-Cys в 4 раза больше, чем значение Км реакции с участием wtR.SsoII, в то время как значения максимальных скоростей гидролиза ДНК обоими ферментами различаются незначительно. То есть 20-звенный дуплекс имеет меньшее сродство к модифицированному белку 2CS/S171C-MAB-Cys по сравнению с ферментом дикого типа. Это соответствует ожиданиям, так как производные азобензола, находящиеся вблизи от входа субстрата в ДНК-связывающий центр, должны препятствовать взаимодействию фермента с ДНК.

Ранее было показано, что ионы Ni2+ и Со2+ образуют комплексы с цистеином и его производными, причем константа устойчивости таких комплексов выше в случае ионов Niz+ (Lenz et al., 1964). Вместе с тем, ионы Ni2+ оказывает больший ингибирующий эффект на функционирование ЭР (Haiford et al., 1995, Baldwin et al., 1999). Установлено, что wtR.SsoIi способна гидролизовать ДНК-субстрат, если в реакционной смеси наряду с 10 мМ MgCl2 содержится 1-10 мкМ CoS04 или 1 мкМ NiCl2. Скорость расщепления ДНК-субстрата wtR.SsoII при облучении в отсутствие и в присутствии ионов Со2+ или Ni2+ сравнима. Мутантная форма 2CS/R171C-MAB-Cys в отсутствие ионов металлов гидролизует ДНК-субстрат с одинаковой скоростью при

облучении как УФ-, так и голубым светом. В присутствии ионов никеля (концентрация 1 мкМ) начальная скорость расщепления ДНК модифицированным ферментом при облучении УФ-светом в два раза больше, чем при облучении голубым светом (рис. 8). Очевидно, что наблюдаемое изменение активности 2С8/Ш71С-МАВ-Су5 под действием возбуждающего света разной длины волны обусловлено только образованием комплекса с ионами металлов (рис. 9).

3 4 Время, мин

Рис. 8. Гидролиз ДНК-субстрата ферментом 2С8/К171С-МАВ-Суэ в присутствии ионов №2+ (концентрация 1 мкМ) при облучении голубым и УФ-светом. Кинетические кривые расщепления ДНК-субстрата.

XVI 2С8/5171С-МАВ-Суз

_И_,,_1_,

I

г-Л

□ Голубой свет а УФ-свет

п Со2+ Со:+

| I г П гП г-П

Рис. 9. Сравнение начальных скоростей расщепления 837-звенного ДНК-дуплекса ферментами: \vtR.SsolI (колонки 1-3) и 2С8/Б171С-М АВ-Суэ (колонки 4-7) в отсутствие и в присутствии ионов Со2+ или №2+ при облучении голубым и УФ-светом.

3 4 5 6 7

Фермент Фотоэффект

1 1,00 ±0,01

2 + 1 мкМ N¡02 1,00 ±0,02

3 + 1 мкМ Со304 1,1 ±0,1

4 2СБ/8171С-МАВ-Су б 1,1 ±0,1

5 2СБ/8171 С-МАВ-Су в + 1 мкМ№С12 2,2 ±0,2

6 2СБ/8171 С-МАВ-СуБ + 1 мкМ Со804 1,2 ±0,1

7 2С8/8171С-МАВ-Суэ + 10 мкМ Со804 1,6 ±0,1

12. Эидонуклеаза рестрикции Руи11 с фоторегулируемой активностью

Метод «молекулярной пружины» был разработан для Я.РуиП совместно с аспирантом Б. Ширлингом под руководством проф. А. Пингоуда (Германия), Было получено 28 мутантных форм всРуиП, содержащих одну или несколько пар сближенных остатков цистеина, которые могут быть соединены с помощью бисмалеимидазобензола (ВМАВ) (1). Подобраны пары а.о., локализованные в трех а-спиралях бсРуцП, две из которых находятся в ДНК-связывающем субдомене (У89/096, 11129/8133), а одна расположена в каталитическом субдомене (К147/Е151) фермента, пары а.о. в петлях и (3-листах рядом с активным центром (Т49/Ы62, Е66/(}96, 174/ЕПО) и пары а.о., в которых одна из аминокислот находится в линкере (1), соединяющем Ы- и С-субъединицы белка, а другая локализована рядом с каталитическим центром (1/061 и 1/14162) (рис. 10, а). Указанные аминокислоты были заменены на СуБ. Расстояние между двумя атомами серы остатков Суз в одной паре должно составлять 8 ± 3 А, что необходимо для их эффективного соединения ¡¿мс-бисмалеимидазобензолом (рис. 10, б).

С-субъединица N-субъедишща

N —-> Пептидный

линкер

Рис. 10. а - Пространственная структура scPvull. Отмечены а.о., которые заменяли на Cys для соединения с бисмалеимидазобензолом: T49C/N62C, E66C/Q96C, I74C*/E1 ЮС*, V89C/Q96C, R129C/S133C и К147С*/Е151С*. Аминокислоты, образующие пару, взаимодействующую с ВМАВ, обозначены шариками, окрашенными одинаковым цветом; 1 -пептидный линкер, соединяющий N- и С-субъединицы белка. Аминокислоты, находящиеся в С-субъединице белка, отмечены звездочкой. Аминокислотные остатки каталитического центра (D58, Е68, К70) выделены оранжевым цветом. Н83 и Y94, замененные на Ala и Phe, выделены зеленым и синим цветом, соответственно, б - Область scPvull, содержащая (3-листы (¡31, (32, (33) и каталитический центр. «Сшивка» С49 и С62 ^ие-бисмалеимидазобензолом.

Восемь из 28 мутантных ферментов содержали дополнительные аминокислотные замены в ДНК-связывающем центре (Н83А) и рядом с каталитическим центром (У94Р), что снижало их способность взаимодействовать с субстратом.

В качестве ДНК-субстрата использовали суперскрученную плазмиду рАТ, содержащую один участок узнавания Я.РуиП. Определяли начальную скорость ее перехода в линейную или открытую форму в результате гидролиза каждой из мутантных форм зсРуцП при специфическом облучении (рис. 11, а). Лучшего результата - 16-кратного различия в скоростях гидролиза ДНК при облучении УФ- и голубым светом - удалось добиться, когда существенный для катализа остаток Туг94 был заменен на РЬе, а две молекулы азобензола локализованы либо рядом с каталитическим центром фермента (5с(Т49С/ТЧ62С)2(У94Р)2-ВМАВ) (рис. 11,6), либо в пептидном линкере и в непосредственной близости от него.

2 5

Голубойсвет ГГ 3'г

а

открытая форма 1 Продукты линейная форма [ пиролиза суперскрупенная плазмлда

0,5

0.0

Голубойсвет УФ-свет

Фермент Фотоэффект

1 эсРуиП 1,0 ±0,1

2 5с(Т49СЛМ62С)2 1,0 ±0,1

3 5с(Т49СЛМ62С)2(У94Р)2 1,00 ±0,01

4 зс(Т49С/К62С)2-ВМАВ 7,0 ± 0,3

5 5с(Т49СЛМ62С)2(У94Р)-ВМАВ 15,9 ±2,3

6 5с(Т49С/К62С)2(У94Р)гВМАВ 15,5 ±2,4

Рис. 11. а - Анализ реакционной смеси методом гель-электрофореза после гидролиза суперскрученной плазмиды рАТ мутантной формой зс(Т49С/Ы62С)2(У94Р)2-ВМАВ при облучении голубым и УФ-светом. Концентрация субстрата - 4 нМ, фермента - 12 нМ. 6 -Сравнение начальных скоростей расщепления плазмиды рАТ мутантными ферментами БсРуиП при облучении голубым и УФ-светом. Условные обозначения: зс(Т49С/Ы62С)2 - бсРуцИ содержит остатки Суэ в положениях 49 и 62 в обеих Ы- и С-субъединицах; зс(Т49С/Ы62С)2(У94Р)2 - мутантный белок 5с(Т49С/Ы62С)2, у которого остаток Туг94 был заменен на РЬе в обеих И- и С-субъединицах; зс(Т49С/Ы62С)-ВМАВ - мутантный белок 8с(Т49С/№2С), два остатка Суэ которого соединены бисмалеимидазобензолом.

Ниже приведено краткое сравнение двух подходов к модулированию активности эндонуклеаз рестрикции посредством света.

Подход «Молекулярные ворота» «Молекулярная пружина»

ЭР Я.ЯБОП БСРуиН

Максимальный фотоэффект 2 раза Высокая степень подвижности фотопереключателя относительно белка —► «ослабленное» влияние изомеризации производного азобензола на белок 16 раз Значительное влияние производного азобензола как «механической пружины» на локальную конформацию фермента

Фотопереключатель Асимметричные производные азобензола, содержащие в одном из бензольных колец малеимидную группировку для связывания с остатком цистеина белка, а в другом -различные заместители (требуется синтезировать производные азобензола с различными заместителями) Симметричный «сшивающий» реагент, содержащий остаток азобензола (более простой синтез)

Выбор положений в белке для введения производных азобензола В непосредственной близости от входа субстрата в ДНК-связывающий или каталитический центр белка (более простой выбор мест модификации) - Во всех областях белка (а-спираль, р-лист, р-шпилька,...) недалеко от активного центра с учетом расстояния между двумя остатками цистеина для их успешного соединения бис-малеимидазобензолом (кропотливый поиск оптимальных мест модификации) - Соединение двух субъединиц пептидным линкером

Введение фотопереключателя в белок Один продукт присоединения Сложная смесь продуктов присоединения бисмалеимид-азобензола

Предполагаемый механизм Специфическое облучение —► изомеризация азобензола —► стерическое затруднение для входа субстрата в ДНК-связывающий центр —» изменение активности белка Специфическое облучение —► изомеризация азобензола («механическая пружина») —► изменение локальной конформации белка —► изменение активности белка

выводы

1. Разработан метод регулирования активности гомодимерной эндонуютеазы рестрикции П-го типа БбоИ, основанный на модификации белка производными азобензола, - метод «молекулярных ворот».

2. Для реализации метода «молекулярных ворот» предложены новые методики синтеза разнообразных асимметричных производных азобензола, содержащих малеимидную группировку в одном из бензольных ядер для модификации цистеина белка, в другом - гидроксильную, амино-, одну или две карбоксильные группы, остаток цистеина, а также олигонукпеотиды.

3. Получено 11 мутантных форм эндонуютеазы рестрикции БэоН, содержащих остаток (остатки) цистеина в выбранных позициях, проведена их модификация различными производными малеимидазобензола и протестирована способность белков с «фотопереключаемыми» молекулами гидролизовать ДНК при облучении светом с длиной волны 365 и 470 нм.

4. Впервые продемонстрировано двукратное изменение ферментативной активности эндонуклеазы рестрикции БбоН при альтернативном облучении в случае, когда два азобензольных «фотопереключателя» с гидроксильной или хелатообразующей группой селективно присоединены к мутантной форме белка в непосредственной близости от его ДНК-связывающего центра.

5. Найдены положения в структуре мутантных форм эндонуклеазы рестрикции РуцН, модификация которых симметричными производными азобензола приводит к 16-кратному различию в начальной скорости гидролиза ДНК-субстрата при изменении длины волны возбуждающего света.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Schierling В., Noel A.J., Wende W., Le Thi Hien, Volkov E., Kubareva E., Oretskaya Т., Kokkinidis M., Rompp A., Spengler В., Pingoud A. Controlling the enzymatic activity of a restriction enzyme by light. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2010, v. 107, N 4, p. 1361- 1366.

2. Jle Тхи Хиен, Ширлинг Б., Рязанова А.Ю., Зацепин Т.С., Волков Е.М., Кубарева Е.А., Орецкая Т.С., Величко Т.И., Пингоуд А. Новые производные азобензола для направленной модификации белков. // Биоорганическая химия, 2009, т. 35, N 5, с. 610-617.

3. Le Thi Hien, Oretskaya T.S., Zatsepin T.S. Metal ion chelate-assisted ligation (CHESS LIGA) for SNP detection on microarrays. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2009, v. 19, N 15, p. 4018-4021.

4. Schierling В., Noel A.J., Thi H.L., Wende W., Pingoud A. Development of a «photoswitchable» restriction endonuclease. // FEBS Journal, 2009, v. 276, Suppl. 1, p. 291.

5. Le Thi Hien, Oretskaya T.S., Zatsepin T.S. Metal ion chelate-assisted ligation (CHESS LIGA) for SNP detection on microarrays. // Abstract book of conference «Nucleic Acids at the Chemistry-Biology Interface», 2009, Manchester, England, p. 85.

6. Hien Le Thi, Zatsepin T.S., Oretskaya T.S. Chelate ligation of modified oligodeoxynucleotides on DNA template UV thermal melting study. // Abstract book of Offspring-Meeting of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow (DFG-RFBR-funded), 2008, Moscow, Russia, p. 33.

7. Schierling В., Noel A.J., Thi H.L., Wende W., Pingoud A. Development of a photoswitchable restriction enzyme. // Abstract book of Asia Link Workshop «Human Resources Development in the Study of Nucleic Acids», 2008, Chania, Greece, p. 33.

8. Орецкая T.C., Jle Тхи Хиен, Ян Фань, Федотова Е.А., Хомякова Е.А. Модифицированные олигонуклеотиды: химия и молекулярно-биологические исследования. // Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 2008, Новосибирск, Россия, с. 99.

9. Jle Т.Х., Зацепин Т.С. Синтез модифицированных олигонуклеотидов для «обратимого лигирования» на ДНК-матрицах. // Материалы международной научной конференции молодых ученых «Ломоносов-2007». Химия. Цикл наук о живом. Москва, Россия, с. 520.

Подписано в печать: 24.03.2010

Заказ № 3434 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Условные сокращения

Введение

Глава 1. Регулирование активности белков под действием света 9 (Обзор литературы)

1.1. Подходы к управлению активностью белков при облучении светом

1.1.1. Необратимая фотоактивация белков

1.1.2. Обратимое фоторегулирование белков

1.2. Методы введения остатка азобензола в состав пептидов и белков

1.2.1. Химическая модификация пептидов и белков

1.2.1.1. Синтез симметричных реакционноспособных производных азобензола

1.2.1.2. Синтез асимметричных реакционноспособных производных 22 азобензола

1.2.2. Введение азобензольного остатка в состав пептида в процессе пептидного 24 синтеза

1.2.3. Введение азобензольного остатка в состав белка в процессе трансляции 26 in vitro

1.2.4. Введение азобензольного остатка в состав белка в процессе трансляции 27 in vivo

1.3. Регулирование активности белков при облучении светом различной длины 28 волны

1.3.1. Фоторегулирование активности белков путем их модификации 29 производными азобензола

1.3.1.1. Метод «молекулярной пружины»

1.3.1.2. Влияние облучения на формирование р -шпильки в пептиде

1.3.1.3. Связывание ДНК с пептидом, содержащим мотив «цинковый палец»

1.3.1.4. Связывание активатора транскрипции САР с 3',5'-аденозин- 36 циклофосфатом

1.3.1.5. Эндонуклеаза рестрикции BamHI

1.3.1.6. Неспецифическое воздействие на различные области в структуре 37 белковой глобулы

1.3.2. Косвенное регулирование активности белков под действием света 38 различной длины волны

1.3.2.1. Фоторегулируемые ингибиторы

1.3.2.2. Фоторегулируемые субстраты ферментов

1.3.2.3. Расщепление РНК рибонуклеазой Н с использованием ДНК, 44 содержащей остаток азобензола

1.3.2.4. Взаимодействие антигена, содержащего азобензол, с антителом

1.3.3. Фоторегулирование активности белков путем их модификации 46 производными азобензола, содержащими лиганд для связывания с данным белком

1.3.3.1. Фоторегулирование калиевого канала

1.3.3.2. Фоторегулирование активности карбоангидразы

1.3.3.3. Фоторегулирование глутаматного рецептора

Человеческий геном включает около 30000 различных генов. Нуклеотидные замены в геноме могут привести к различным болезням. Коррекция мутаций эффективно возвращает фенотип болезни в первоначальную форму. Одна из самых многообещающих стратегий исправления мутаций основана на гомологичной рекомбинации. Главная проблема при исправлении нарушений генома путем замены дефектного участка генов заключается в том, чтобы стимулировать рекомбинацию, так как ее эффективность очень низка. Известно, что гидролиз целевой нуклеотидной последовательности приводит к появлению концов ДНК, склонных к рекомбинации, последовательно увеличивая частоту гомологичной рекомбинации в десятки тысяч раз.

В «хирургии» генома в качестве молекулярных инструментов для расщепления ДНК вблизи дефектного гена находят применение различные ферменты, в том числе эндонуклеазы рестрикции (ЭР), нуклеазы, содержащие структурный модуль «цинковые пальцы», и эндонуклеазы генной конверсии. Специфическое расщепление ДНК в нужном участке является ключевым требованием этого метода. Для точечного гидролиза ДНК в геноме человека, содержащем приблизительно 3 миллиарда пар нуклеотидов, используют мегануклеазы - сиквенс-специфические эндонуклеазы с протяженным участком узнавания. Однако в процессе поиска целевого субстрата ферменты, направлено гидролизующие ДНК, могут проявлять неспецифическую активность. Поэтому актуальной задачей является регулирование их действия. Процесс нежелательного расщепления ДНК можно попытаться минимизировать, «включая» и «выключая» активность фермента в определенные моменты времени посредством внешних воздействий, таких как свет.

Свет обладает неоспоримыми преимуществами перед другими источниками внешних воздействий. Свет может с высокой эффективностью мгновенно оказывать влияние только на целевой объект в клетке, вызывая минимальные разрушения клеточных органелл.

Цель работы заключалась в модификации мутантных форм эндонуклеаз рестрикции SsoII и PvuII производными азобензола для конструирования ферментов с фоторегулируемой активностью.

При конструировании фоторегулируемого белка требуется, прежде всего, селективно присоединить к нему светочувствительные соединения. Для управления активностью белков посредством света все большее применение находят 7 фотопереключатели» - производные азобензола [1-4]. Цис-транс-томерпзацт азобензола протекает быстро под действием света с длиной волны более 300 нм и, следовательно, позволяет активировать/инактивировать белки in vivo. На сегодняшний день сконструировано лишь небольшое количество модифицированных белков, функционирование которых можно изменять под действием света, и не существует общей стратегии, позволяющей эффективно регулировать активность различных классов белков. В настоящем исследовании в качестве объектов для разработки подходов к регулированию ферментативной активности использованы гомодимерные эндонуклеазы рестрикции Н-го типа SsoII (R.SsoII) и PvuII (R.PvuII).

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.

1. На основании данных рентгеноструктурного анализа выбрать аминокислотные остатки в R.SsoII для их замены на цистеин для последующей модификации производными азобензола.

2. Получить мутантные формы R.SsoII, содержащие остаток (остатки) цистеина в выбранной позиции.

3. Синтезировать производные азобензола, подтвердить их структуру, исследовать их химические и оптические свойства.

4. Модифицировать мутантные формы R.SsoII производными азобензола.

5. Исследовать гидролитическую активность набора мутантных форм R.SsoII, модифицированных производными азобензола, при облучении светом определенной длины волны.

6. Сравнить эффективность и возможность применения метода «молекулярных ворот», разработанного для R.SsoII, и метода «молекулярной пружины», предложенного для R.PvuII, для фоторегулирования активности белков.

В представленной работе предложены и разработаны два подхода к регулированию активности эндонуклеаз рестрикции П-го типа при облучении светом определенной длины волны: метод «молекулярных ворот» на примере R.SsoII и метод «молекулярной пружины», примененный для R.PvuII.

выводы

1. Разработан метод регулирования активности гомодимерной эндонуклеазы рестрикции П-го типа SsoII, основанный на модификации белка производными азобензола, — метод «молекулярных ворот».

2. Для реализации метода «молекулярных ворот» предложены новые методики синтеза разнообразных асимметричных производных азобензола, содержащих малеимидную группировку в одном из бензольных ядер для модификации цистеина белка, в другом - гидроксильную, амино-, одну или две карбоксильные группы, остаток цистеина, а также олигонуклеотиды.

3. Получено 11 мутантных форм эндонуклеазы рестрикции SsoII, содержащих остаток (остатки) цистеина в выбранных позициях, проведена их модификация различными производными малеимидазобензола и протестирована способность белков с «фотопереключаемыми» молекулами гидролизовать ДНК при облучении светом с длиной волны 365 и 470 нм.

4. Впервые продемонстрировано двукратное изменение ферментативной активности эндонуклеазы рестрикции SsoII при альтернативном облучении в случае, когда два азобензольных «фотопереключателя» с гидроксильной или хелатообразующей группой селективно присоединены к мутантной форме белка в непосредственной близости от его ДНК-связывающего центра.

5. Найдены положения в структуре мутантных форм эндонуклеазы рестрикции PvuII, модификация которых симметричными производными азобензола приводит к 16-кратному различию в начальной скорости гидролиза ДНК-субстрата при изменении длины волны возбуждающего света.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор выражает благодарность своим научным руководителям профессору Т.С. Орецкой и ведущему научному сотруднику Е.А.Кубаревой, а также профессору Университета имени Ю. Либиха (г. Гиссен, Германия) Альфреду Пингуду за руководство и помощь при выполнении работы.

Автор благодарит своих коллег по лаборатории за постоянную помощь и поддержку, а также Т.С. Зацепина, Е.М. Волкова за консультации по синтезу замещенных азобензолов, В.Н. Ташлицкого - за помощь в анализе полученных в работе соединений, Е.А. Романову, А.В. Судьину - за полезные советы при обсуждении диссертационной работы. Автор благодарен аспиранту Бенно Ширлингу за плодотворное сотрудничество во время совместной работы в Университете имени Ю. Либиха (г. Гиссен, Германия). Автор также благодарит членов своей семьи, родственников и друзей за помощь и поддержку.

Автор выражает благодарность правительству Социалистической Республики Вьетнам за предоставленную возможность обучения в аспирантуре Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

1.4. Заключение

Таким образом, рассмотрены 3 основные стратегии регулирования активности белков под действием света различной длины волны: 1) направленная модификация белков производными азобензола; 2) создание фоторегулируемых ингибиторов, субстратов ферментов и 3) направленная модификация белков производными азобензола, содержащими лиганд для связывания с данным белком. Каждая стратегия имеет свои достоинства и недостатки. Определяющим фактором для применения рассмотренных методов является цель регулирования активности белка, структура самого белка и его лиганда или ингибитора. При выборе того или иного подхода нужно учитывать не только конечный результат (разница в активности белка при специфическом облучении), но и совокупность факторов, приводящих к получаемому эффекту.

Стратегия создания фоторегулируемых ингибиторов или субстратов ферментов находит практическое применение, например, в области очистки ферментов для упрощения техники аффинной хроматографии белков. При аффинной сорбции ингибиторы фермента могут использоваться как лиганды, которые при облучении будут переходить из конфигурации с сильным сродством к целевому ферменту в конфигурацию со слабым сродством к нему. Эту процедуру можно рассматривать как новый подход к очистке фермента в мягких условиях. Кроме того, возможность регулировать взаимодействия биомолекул с поверхностью с помощью света позволяет конструировать новые обратимые биосенсоры, улучшенные медицинские имплантанты и др.

Направленная модификация белков производными азобензола, содержащими лиганд для связывания с данным белком, применяется в большинстве случаев для белков, образующих ионные каналы, и рецепторов с известными лигандами. Включение подходящей группы в качестве лиганда в состав «фотопереключателей» позволяет модифицировать разные типы ионных каналов и рецепторов, что дает возможность контролировать различные физиологические функции белков посредством света.

Для применения стратегии направленной модификации белков производными азобензола необходимо, чтобы структура фермента была известна. Для введения производных азобензола обычно выбираются положения в таких структурных элементах пептидов или белков, которые играют важную роль в белок-белковом и/или ДНК-белковом узнавании и связывании белка с лигандом.

На основании данных, представленных в обзоре литературы, можно сделать вывод, что для ферментов известно лишь ограниченное число примеров, когда модификация производными азобензола позволяла регулировать их активность при облучении. Поиск фотохромных соединений для регулирования активности ферментов является актуальной задачей. В данной работе в качестве основного подхода для введения «фотопереключателя» в эндонуклеазы рестрикции была выбрана химическая модификация остатков цистеина белков симметричными и несимметричными производными азобензола.

Глава 2. Конструирование эндонуклеаз рестрикции с фоторегулируемой активностью

Обсуждение результатов)

В клетке существует сложный механизм регулирования активности ДНК-связывающих белков, сопровождающийся перестройками ДНК-белковых комплексов и их разрушением. Во многих случаях возникает необходимость временного контроля активности белка. Так, в генетической инженерии широко используются эндонуклеазы рестрикции, нуклеазы, содержащие структурный модуль «цинковые пальцы», и эндонуклеазы генной конверсии. Несмотря на их высокую специфичность в процессе поиска целевого субстрата, ферменты, направлено гидролизующие ДНК, могут проявлять неспецифическую активность. Поэтому актуальной задачей является регулирование их действия. Процесс нежелательного расщепления ДНК можно попытаться минимизировать, «включая» и «выключая» активность фермента в определенные моменты времени посредством внешних воздействий, таких, например, как свет. Свет обладает неоспоримыми преимуществами перед другими источниками внешних воздействий. С высокой эффективностью свет может мгновенно оказывать влияние только на целевой объект в клетке с минимальным разрушением оставшихся частей клетки.

Цель данной работы заключалась в модификации мутантных форм эндонуклеаз рестрикции SsoII и PvuII производными азобензола для конструирования ферментов с фоторегулируемой активностью.

Для конструирования фоторегулируемого белка требуется прежде всего селективно присоединить к нему светочувствительные соединения. Для модификации белка различными реагентами наиболее удобными являются сульфгидрильные группы остатков цистеина, которые могут быть введены в состав белка методом сайт-направленного мутагенеза. Среди существующих светочувствительных соединений [16-20] наиболее широко используются производные азобензола. 7рд//с-конфигурация азобензола переходит в г/мс-конфигурацию при облучении УФ-светом (365 нм), а обратный переход осуществляется при облучении голубым светом (470 нм) или при термической релаксации (схема 2.1). Цис-транс-юомъртация азобензола при специфическом облучении протекает быстро, эффективно и практически не зависит от окружающей среды. Значительный интерес к производными азобензола вызван тем, что изомеризация этих соединений протекает быстро под действием света с длиной волны более 300 нм, а, следовательно, позволяет активировать/инактивировать белки in vivo.

470 нм или термическая релаксация

365 нм r' г/ис-конфигурация мранс-конфигурация

Схема 2.1.

В работе предлагаются два подхода к регулированию активности эндонуклеаз рестрикции при специфическом облучении. Идея первого подхода основана на том, что большинство эндонуклеаз рестрикции в активном состоянии представляют собой гомодимеры. Многие из них при взаимодействии с субстратом подвергаются конформационным изменениям, что позволяет ДНК подойти к ДНК-связывающему центру фермента, который находится в интерфейсе между двумя субъединицами гомодимера [104, 105]. Модифицируя белок асимметричными производными азобензола вблизи от ДНК-связывающего или каталитического центра, можно сделать его недоступным для подхода ДНК из-за стерических препятствий в случае более «вытянутой» /и/юнс-конфигурации производных азобензола. Поскольку транс-форма более стабильна, чем цис-форма, в обычных условиях азобензол существует в основном в транс-форме. То есть модифицированный фермент не может связываться с ДНК-субстратом и, поэтому, неактивен. При облучении УФ-светом происходит переход трансформы азобензола в более компактную г/г/с-форму, расстояние между концами двух молекул азобензола увеличивается, и субстрат может попасть в ДНК-связывающий центр белка. Под действием голубого света г/г/с-конфигурация азобензола быстро переходит в /ярднс-конфигурацию. Следовательно, ДНК-связывающий центр белка «закрывается» вскоре после связывания и расщепления ДНК. Повторное «включение» фермента возможно путем облучения фермента УФ-свстом. Такая тактика регулирования активности белка может быть названа методом фоторегулируемых «молекулярных ворот». На схеме 2.2 в качестве примера изображены «молекулярные ворота», закрытые (а) и открытые (б) для входа субстрата в ДНК-связывающий центр при транс-цис-изомеризации асимметричного производного азобензола в белке.

Согласно этому подходу, только один из концов производного азобензола взаимодействует с остатком цистеина белка. Предполагается, что белок не оказывает влияния на изомеризацию азобензола. Однако заместитель на свободном конце производного азобензола может потенциально повлиять на функционирование белка, контактируя с пространственно сближенными группировками, что также может блокировать активный центр (рис. 2.1). В качестве лигандов в работе использованы различные функциональные группы, которые при определенном расположении друг относительно друга удерживаются в сближенном состоянии за счет комплексообразования в присутствии ионов металла (а), образования водородных связей и кислотно-основных взаимодействий (б) или формирования дуплекса иммобилизованными на белке олигонуклеотидами (в). транс- азобензол цис- азобензол Л

ДНК-связываю: центр R.EcllSkI (R.SsoII)

365 нм

470 нм

ДНК-субстрат

Фермент неактивен

Фермент активен

R - расстояние между концами двух молекул азобензола. а б

Схема 2.2.

Ион металла

Гомодимер белка Производное азобензола с присоединенным олнгонуклеотидом б в

Рис. 2.1. Схематическое изображение метода «молекулярных ворот». Обратимое блокирование активного центра белка с помощью производных азобензола: а -комплексообразование в присутствии иона металла, б - кислотно-основное взаимодействие производного азобензола со сближенной аминокислотой одного из мономеров гомодимера белка, в - формирование ДНК-дуплекса.

Второй подход заключается в использовании симметричных производных азобензола для соединения двух сближенных остатков цистеина белка. При изменении длины волны возбуждающего света происходит изомеризация азобензола и изменяется локальная конформация белка. Это конформационное изменение в свою очередь может привести к изменению его активности. Такая тактика регулирования активности белка может быть названа методом «молекулярной пружины» (схема 2.3).

Существуют следующие подходы для введения остатка азобензола в пептиды или белки: в результате химической модификации пептидов и белков [3, 42, 43], в процессе пептидного синтеза [37, 44, 60], в процессе трансляции in vitro [61, 62] и в процессе трансляции in vivo [48].

Сайт-направленная химическая модификация белка достигается путем взаимодействия соединения, содержащего функциональную группу, которая специфически реагирует с уникальным остатком аминокислоты. Обычно для специфической модификации выбирают остатки цистеина, так как, во-первых, для сульфгидрильной группы цистеина известны специфические реакции с малеимидом и галогенпроизводными (галоген находится у насыщенного атома углерода). Во-вторых, количество остатков цистеина в белке, как правило, невелико, поэтому, сначала можно заменить их на другие аминокислоты, например, аланин или серин методом сайт-направленного мутагенеза гена исходного белка. Затем в полученном мутантном белке, не содержащем остатков цистеина, заменяют одну или несколько аминокислот в заданном положении на цистеин (схема 2.4).

Катал нтич ескнй центр R.P vull

Фермент неактивен

Фермент активен

Схема 2.3.

Схема 2.4.

В данной работе в качестве основного подхода была выбрана химическая модификация остатков цистеина эндонуклеаз рестрикции симметричными и несимметричными производными азобензола.

Для конструирования ферментов с фоторегулируемой активностью с применением подхода «молекулярных ворот», предложено модифицировать эндонуклеазу рестрикции SsoII производными азобензола, которые содержат в одном бензольном кольце малеимидную группировку для присоединения к остатку цистеина белка, а в другом кольце различные заместители. Для того чтобы сравнить подходы «молекулярных ворот» и «молекулярной пружины» для конструирования ферментов с фоторегулируемой активностью, была выбрана и модифицирована симметричным «сшивающим» реагентом, содержащим азобензольный остаток, эндонуклеаза рестрикции PvuII.

2.1. Конструирование и характеристика мутантных форм эндонуклеазы рестрикции SsoII

Эндонуклеаза рестрикции SsoII входит в систему рестрикции-модификации П-го типа бактерии Shigella sonnei 47 [106]. Белок имеет в своем составе 305 аминокислотных остатков (а.о.), его молекулярная масса составляет 35,9 кДа. Это гомодимерный фермент, который узнаёт в двутяжевой ДНК последовательность нуклеотидов 5-J.CCNGG-373'-GGNCCT-5' (N = А, Т, G или С) и гидролизует ДНК на границах этого участка в местах, указанных стрелками. В связывании ДНК участвуют аминокислотные остатки R186, R187,

R188 (контакты с гетероциклическими основаниями) и R116, R117, R119 (контакты с углеводофосфатным остовом), в катализе гидролиза ДНК-субстрата - Е125, D160, К182, Е195 [107].

Ранее был получен штамм-суперпродуцент фермента и разработан способ выделения гомогенного препарата R.SsoII, пригодного для молекулярно-биологических исследований [108]. Фермент содержит на N-конце полипептидную последовательность MetArgGlySer(His)6GlySerSerGln. Наличие в ней блока из шести остатков гистидина позволяет выделять R.SsoII методом аффинной хроматографии. Степень очистки фермента составляла более 95%, концентрация белка более - 4 мкг/мкл, активность -более 300 ед./мкл. Молекулярная масса рекомбинантного белка, вычисленная по программе, предложенной на ExPASy Proteomics Server http://au.expasy.org/tools/pitool.html), равна 37,2 кДа.

2.1.1. Выбор положений аминокислот в эндонуклеазе рестрикции SsoII для модификации азобензольными производными

На первом этапе работы для создания фоторегулируемой R.SsoII необходимо было выбрать положения аминокислот, которые находятся недалеко от «входа» субстрата в ДНК-связывающий и каталитический центры фермента, и заменить эти аминокислоты на цистеин. При этом нужно учитывать, что остатки цистеина должны располагаться на поверхности белка (они должны быть доступны для модифицирующих реагентов) и находиться достаточно далеко от каталитического центра для того, чтобы присутствие и изомеризация хромофора непосредственно не влияли на функционирование фермента. Основой для конструирования мутантных форм R.SsoII послужили результаты рентгеноструктурного анализа комплекса эндонуклеазы рестрикции Ecll8kl (R.Ecll8kl) с субстратом [109] (рис. 2.2). R.Ecll8kI является изошизомером и ближайшим гомологом R.SsoII (ферменты отличаются одной аминокислотой — Val232 в R.Ecll8kI соответствует Не в R.SsoII).

В структуре R.SsoII дикого типа (wtR.SsoII) имеется 2 остатка цистеина в позиции 33 и 60. В качестве исходного фермента использовали мутантную форму R.SsoII(C33S/C60S), не содержащую остатков цистеина - cfR.SsoII (или 2CS), предоставленную доктором В. Пингоуд (Университет им. Ю. Либиха, Германия). Белок сfR.SsoII также эффективно гидролизует ДНК-субстраты, как и природный фермент.

Рис. 2.2. Структура комплекса гомодимера эндонуклеазы рестрикции Ecll 8kl с ДНК-субстратом (PDB-код 2FQZ) [109].

1 - Внутренние «зажимы»

2 - Внешние «зажимы»

S171C а

Рис. 2.3. Структура гомодимера фермента R. SsoII (на основе данных PC А для R.Ecll8kI [109]. а - Аминокислоты, замененные на цистеин (S171, R174, R198, 1220, А224). б - Аминокислоты, участвующие в связывании (контакт с гетероциклическими основаниями - R186, R187, R188; контакт с углеводофосфатным остовом - R116, R117, R119). в -Аминокислоты, участвующие в катализе (Е125, D160, К182, Е195).

R1S6.R187.R188 16.R117.R119

К182 б в

Мы предположили, что чем больше молекул азобензола находится вблизи от «входа» в ДНК-связывающий центр белка, тем больше стерический эффект и тем больше влияние облучения на активность белка. Поэтому были получены ещё 6 мутантных форм cfR.SsoII с 2, 3 или 4 остатками цистеина в положениях 171, 174, 198, 220 и 224 в различных комбинациях (табл. 2.1)

1. Banghart М., Borges К., Isacoff Е., Trauner D., Kramer R. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. //Nature Neuroscience. 2004. V. 7. P. 1381-1386.

2. Nakayama K., Endo M., Majima T. Photochemical regulation of the activity of an endonuclease BamHI using an azobenzene moiety incorporated site-selectively into the dimer interface. // Chem. Commun. 2004. V. 21. P. 2386-2387.

3. Volgraf M., Gorostiza P., Numano R., Kramer R., Isacoff E., Trauner D. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. //Nat. Chem. Biol. 2006. V. 2. P. 47-52.

4. Harvey J. H., Trauner D. Regulating enzymatic activity with a photoswitchable affinity label. // ChemBioChem. 2008. V. 9. P. 191-193.

5. Yemul S., Berger C., Estabrook A., Suarez S., Edelson R., Bayley H. Selective killing of T lymphocytes by phototoxic liposomes. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1987. V. 84. P. 246-250.

6. Chang C.Y., Fernandez Т., Panchal R., Bayley H. Caged catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 7661-7662.

7. Short III G.F., Lodder M., Laikhter A.L., Arslan Т., Hecht S.M. Caged HIV-1 protease: dimerization as independent of the ionization state of the active site aspartates. // J. Am. Chem. Soc. 1999. V.121. P. 478-479.

8. Arabaci G., Guo X.C., Beebe K.D., Coggeshall K.M., Pei D. a-Haloacetophenone derivatives as photoreversible covalent inhibitors of protein tyrosine phosphatases. // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121.5085-5086.

9. Jones P.В., Porter N.A. 2-Aroylbenzoyl serine proteases: photoreversible inhibition or photoaffinity labeling. //J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 2753-2761.

10. Zou K., Cheley S., Givens R.S., Bayley H. Catalytic subunit of protein kinase A caged at the activating phosphothreonine. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 8220-8229.

11. Golan R., Zehavi U., Nairn M, Patchornik A., Smirnoff P. Inhibition of Escherichia coli p-galactosidase by 2-nitro-l-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)ethyl, a photoreversible thiol label. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1293. P. 238-242.

12. LoudwigS., Nicolel Y., Masson P., Fontecilla-Camps J.C., Bon S., Nachon F., Goeldner M. Photoreversible inhibition of cholinesterases: catalytic serine-labeled caged butyrylcholinesterase. // ChemBioChem. 2003. V. 4. P. 762-767.

13. Hiraoka Т., Hamachi I. Caged RNase: photoactivation of the enzyme from perfect off-state by site-specific incorporation of 2-nitrobenzyl moiety. I I Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. V. 13. P. 13-15.

14. Self C.H., Thompson S. Light activatable antibodies: models for remotely activatable proteins. //Nature Medicine. 1996. V. 2. P. 817-820.

15. Feringa B.L., Delden R.A., Koiimura N. Geertsema E.M. Chiroptical molecular switches. // Chem. Rev. 2000. V. 100. P. 1789-1816.

16. Fujimoto K, AmanoM., Horibe Y., InouyeM. Reversible photoregulation of helical structures in short peptides under indoor lighting/dark conditions. // Org. Lett. 2006. V. 8. P. 285-287.

17. ErdelyiM., Karl A., Gogol A. A new tool in peptide engineering: a photoswitchable stilbene-type P-Hairpin mimetic. // Chem. Eur. J. 2006. V. 12. P. 403^12.

18. Cordes Т., Weinrich D., Kempa S., Riesselmann K, Herre S., Hoppmann C., Riick-Braun K, Zinth. W. Hemithioindigo-based photoswitches as ultrafast light trigger in chromopeptides. // Chem. Phys. Lett. 2006. V. 42. P. 167-173.

19. Cordes Т., Eisner C., Herzog Т. Т., Hoppmann C., Schadendorf Т., Summerer W., Riick-Braun K, Zinth W. Ultrafast hemithioindigo-based peptide-switches. // Chemical Physics. 2009. V. 358. P. 103-110.

20. Schadendorf Т., Hoppmann C, Riick-Braun K. Synthesis of rigid photoswitchable hemithioindigo (o-amino acids. // Tetrahedron Lett. 2007. V 48. P. 9044-9047.

21. Natansohn A., Rochon P. Photoinduced motions in azo-containing polymers. // Chem. Rev. 2002. V. 102. P. 4139-4175.

22. Shibaev V., Bobrovsky A., Boiko N. Photoactive liquid crystalline polymer systems with light-controllable structure and optical properties. // Prog. Polym. Sci. 2003. V. 28. P. 729-836.

23. Harada A. Cyclodextrin-based molecular machines. // Acc. Chem. Res. 2001. V. 34. P. 456464.

24. Pieroni O., Fissi A., Angelini N., Lend F. Photoresponsive polypeptides. // Acc. Chem. Res. 2001. V. 34. P. 9-17.

25. Willner I., Rubin S. Control of the structure and functions of biomaterials by light. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996. V. 35. P. 367-385.

26. Willner I. Photoswitchable biomaterials: en route to optobioelectronic systems. // Acc. Chem. Res. 1997. V. 30. P. 347-356.

27. Kumar G.S., Neckers D.C. Photochemistry of azobenzene-containing polymers. // Chem. Rev. 1989. V. 89. P. 1915-1925.

28. Rau H. Studies in organic chemistry: photochromism, molecules and systems. // V. 40 (Eds.: Diirr H., Bonas-Laurent H.). Elsevier. Amsterdam. 1990. P. 165-192.

29. Rau H. Photoreactive organic thin films (Eds.: Sekkat Z., Knoll W.). Elsevier. New York. 2002, P. 3.

30. Fujino Т., Arzhantsev Y. S., Tahara T. Femtosecond time-resolved fluorescence study of photoisomerization of/rara-azobenzene. // J. Phys. Chem. A. 2001. V. 105. P. 8123-8129.

31. Nagele R, Hoche R., Zinth W., Wachtveitl J. Femtosecond photoisomerization of cis-azobenzene. // Chem. Phys. Lett. 1997. V. 272. P. 489^195.

32. Crecca C. R, Roitberg A. E. Theoretical study of the isomerization mechanisim of azobenzene and disubstituted azobenzene derivatives. // J. Phys. Chem. A. 2006. V. 110. P. 8188-8203.

33. Fuss W., Kosmidis C., Schmid W.E., Trushin S.A. The photochemical cis-trans isomerization of free stilbene molecules follows a hula-twist pathway. // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. V. 43. P. 4178-4182.

34. Tiago M.L., Ismail-Beigi S., Louie S.G. Photoisomerization of azobenzene from first principles constrained density-functional calculations. // J. Chem. Phys. 2005. V. 122. P. 094311-094318.

35. Cembran A., Bernardi F., Garavelli M., Gagliardi L., Orlandi G. On the mechanisim of the cis—trans isomerizationin the lowest electronic states of azobenzene: SO, SI, and Tl. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 3234-3243.

36. James D.A., Burns D.C., Woolley G.A. Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues. // Protein Engineering. 2001. V. 14. P. 983-991.

37. Srinivas O., Mitra N., Surolia A., and Jayaraman N. Photoswitchable multivalent sugar ligands: synthesis, isomerization, and lectin binding studies of azobenzene-glycopyranoside derivatives. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 2124-2125.

38. Renner C., Moroder L. Azobenzene as conformational switchin model peptides. // ChemBioChem. 2006. V. 7. P. 868-878.

39. Dong S., Leweneck M., Schrader Т.Е., Schreier W.J., Zinth W., Moroder L., Renner CA Photocontrolled р-hairpin peptide. // Chem. Eur. J. 2006. V. 12. P. 1114-1120.

40. Burns D.C., Flint D.G., Kumita J.R., Feldman H.J., Serrano L., Zhang Z., Smart O.S., Woolley G.A. Origins of helix-coil switching in a light-sensitive peptide. // Biochemistry. 2004. V. 43. P.15329-15338.

41. Kumita J.R., Smart O.S., Woolley. G.A. Photo-control of helix content in a short peptide. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 3803-3808.

42. Pozhidaeva N., Cormier M., Chaudhari A., Woolley G.A. Reversible photocontrol of peptide helix content: adjusting thermal stability of the cis state. // Bioconjugate Chem. 2004. V. 15. P. 1297-1303.

43. Liu D., Karanicolas J., Yu C., Zhang Z., Woolley G.A. Site-specific incorporation of photoisomerizable azobenzenegroups into ribonuclease S. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997. V. 7. P. 2677-2680.

44. Ueda Т., Murayama K., Yamamoto Т., Kimura S., Imanishi Y. Photoregulation of hydrolysis activity of semisynthetic mutant phospholipases A2 replaced by non-natural aromatic amino acids. //J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1994. V. 1. P. 225-230.

45. Muranaka N., Hohsaka Т., Sisido M. Photoswitching of peroxidase activity by position-specific incorporation of a photoisomerizable non-natural amino acid into horseradish peroxidase. // FEBS Lett. 2002. V. 510. P. 10-12.

46. Hohsaka Т., Kajihara D., Ashizuka Y, Murakami H., Sisido M. Efficient incorporation of nonnatural amino acids with large aromatic groups into streptavidin in vitro protein synthesizing systems. // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 34-40.

47. Base M., Groff D., Xie J., Brustad E., Schultz P. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. II J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 388-389.

48. Smyth D.G., Nagamatsu A., FrutonJ.S. Reactions of N-ethylmaleimide. // J. Am. Chem. Soc. 1960. V. 82. P. 4600—4604.

49. Brewer C.F., Riehmn J.P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethymaleimide and proteins. //Anal. Biochem. 1967. V. 18. P. 248-255.

50. Lee Y.C., Lee R.T. Carbohydrate-protein interactions: basis of glycobiology. // Acc. Chem. Res. 1995. V. 28. P. 321-327.

51. Zhang Z., Burns D.C., Kumita J.R., Smart O.S., Woolley G.A. A water-soluble azobenzene cross-linker for photocontrol of peptide confirmation. // Bioconjugate Chem. 2003. V. 14. P. 824-829.

52. Sadovski O., Beharry A.A., Zhang F., Woolley G.A. Spectral tuning of azobenzene photoswitches for biological applications. // Angew. Chem. Int. Ed. 2009. V. 48. P. 1484-1486.

53. Menta S.M., Vakihvala M. V. Sodium perborate as a reagent in organicchemistry. Preparation of azo-compounds. // J. Am. Chem. Soc. 1952. V. 74. P. 563-564.

54. CookA.H. The preparation of some c/s-azo-compounds. // J. Chem. Soc. 1938. P. 876-881.

55. Burns D.C., Zhang F., Woolley G.A. Synthesis of 3,3'-bis(sulfonato)-4,4'-bis(chloroacetamido)azobenzene and cysteine cross-linking for photo-control of protein conformation and activity. //Nature Protocols. 2007. V. 2. P. 251-258.

56. Loudwig S., Bayley H. Photoisomerization of an individual azobenzene molecule in water: an on-off switch triggered by light at a fixed wavelength. // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 12404-12405.

57. Goodman M., Kossoy A. Conformational aspects of polypeptide structure. XIX. Azoaromatic side-chain effects. //J. Am. Chem. Soc. 1966.V. 88. P. 5010-5015.

58. Hohsaka, Т., Ashizuka, Y., Murakami, H., and Sisido, M. Incorporation of nonnatural amino acids into streptavidin through in vifro frame-shift suppression. // J. Am.Chem. Soc. 1996 . V. 118. P. 9778-9779.

59. Hohsaka Т., Kawashima K., Sisido M. Photoswitching of N AD+-Mediated enzyme reaction through photoreversible antigen-antibody reaction. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 413414.

60. Flint D.G., Kumita J.R., Smart O.S., Woolley G.A. Using an azobenzene cross-linker to either increase or decrease peptide helix content upon trans-to-cis photoisomerization. // Chem. Biol. 2002. V. 9. P. 391-397.

61. Kusebauch U. Photocontrolled folding and unfolding of a collagen triple helix. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006. V. 45. P. 7015-7018.

62. Woolley G.A., Jaikaran A.S.I., Berezovski M., Calarco J.P., Krylov S.N., Smart O.S., Kumita J.R. Reversible photocontrol of DNA binding by a designed GCN4-bZlP protein. // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 6075-6084.

63. Zhang F., Sadovski O., Woolley G.A. Synthesis and characterization of a long, rigid photoswitchable cross-linker or promoting peptide and protein confirmational change. // ChemBioChem. 2008. V. 9. P. 2147-2154.

64. Jog P. V., Gin M.S. A light-gated synthetic ion channel. // Org. Lett. 2008. V. 10. P. 36933696.

65. Muramatsu S., Kinbara K., Taguchi H., Ishii N., Aida T. Semibiological molecular machine with an implemented «AND» logic gate for regulation of protein folding. // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 3764-3769.

66. Gorostiza P., VolgrafM., Numano R., Szobota S., Trauner D., Isacojf E.Y. Mechanisims of photoswitch conjugation and light activation of an ionotropic glutamate receptor. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 10865-10870.

67. Szobota S. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. // Neuron. 2007. V. 54. P. 535-545.

68. Numano R. Nanosculpting reversed wavelength sensitivity into a photoswitchable iGluR. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 6814-6819.

69. Yamada M.D., Nakajima Y., Maeda II, Maruta S. Photocontrol of kinesin ATPasc activity using an azobenzene derivative. // J. Biochem. 2007. V. 142. P. 691-698.

70. Willner I., Rubin S., Riklin A. Photoregulation of papain activity through anchoring photochromic azo groups to the enzyme backbone. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 33213325.

71. Woolley G. A. Photocontrolling peptide a-helices. // Acc. Chem. Res. 2005. V. 38. P. 486493.

72. Chi L„ Sadovski O., Woolley G.A. A blue-green absorbing cross-linker for rapid photoswitching of peptide helix content. // Bioconjugate Chem. 2006. V. 17. P. 670-676.

73. Kumita J.R., Flint D.G., Woolley G.A., Smart O.S. Achieving photo-control of protein conformation and activity: producing a photo-controlled leucine zipper. // Faraday Discuss. 2002. V. 122. P. 89-103.

74. Guerrero L., Smart O.S., Weston C.J., Burns D.C., Woolley G. A., Allemann R.K. Photochemical regulation of DNA-binding specificity of MyoD. // Angew. Chem. Int. Ed. 2005. V. 44. P. 7778-7782.

75. Cochran A. G., Skelton N.J., Starovasnik MA. Tryptophan zippers: stable, monomeric (3-hairpins. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2001. V 98. P. 5578-5583.

76. Tachikawa К., Schroeder О., Frey G., Briggs S.P., Sera T. Regulation of the endogenous VEGF-A gene by exogenous designed regulatory proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 15225-15230.

77. Segal D.J., Goncealves J., Eberhardy S., Swan C.H., Torbett B.E., Li X., Barbas III C.F. Attenuation of HIV-1 replication in primary human cells with a designed zinc finger transcription factor . // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 14509-14519.

78. Sera T. Inhibition of virus DNA replication by artificial zinc-finger proteins. // J. Virol. 2005. V. 79. P. 2614-2619.

79. Patel S.D., Isalan M., Gavory G., Ladame S., Choo Y., Balasubramanian S. Inhibition of human telomerase activity by an engineered zinc finger protein that binds G-quadruplexes. // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 13452-13458.

80. Kim Y.G., Cha J., Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fokl cleavage domain. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 1156-1160.

81. Nomura W., Barbas III C.F. In vivo site-specific DNA methylation with a designed sequence-enabled DNA methylase. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 8676-8677.

82. Nomura A, Okamoto A. Photoresponsive tandem zinc finger peptid. // Chem. Commun. 2009. P. 1906-1908.

83. Newman M., Strzelecka Т., Dorner L.F., Schildkraut I., Aggarwal A.K. Structure of restriction endonuclease BamHI and its relationship to EcoRl. //Nature. 1994. V. 368. P. 660664.

84. Westmark P. R., Kelly J.P., Smith B.D. Photoregulation of enzyme activity photochromic, transition-state-analogue inhibitors of cysteine and serine proteases. I I J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 3416-3419.

85. Pearson D., Abell A.D. Photoswitch inhibitors of a-chymotrypsin increased substitution and peptidic character in peptidomimetic boronate esters. // Org. Biomol. Chem. 2006. V. 4. P. 3618-3625.

86. Pearson D., Alexander N., Abell A.D. Improved photocontrol of a-chymotiypsin activity: peptidomimetic trifluoromethylketonc photoswitch enzyme inhibitors. // Chem. Eur. J. 2008. V. 14. P. 7358-7365.

87. Pearson D., Downard A.J., Muscroft-Taylor A., Abell A.D. Reversible photoregulation of binding of a-chymotrypsin to a gold surface. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 1486214863.

88. Auernheimer J. , Dahmen C., Hersel U., Bausch A., Kessler H. Photoswitched cell adhesion on surfaces with RGD peptides. //J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 16107-16110.

89. Asanuma H., Tamaru D., Yamazawa A., Liu M., Komiyama M. Photoregulation of the transcription reaction of T7 RNA polymerase by tethering an azobenzene to the promoter. // ChemBioChem. 2002. V. 3. P. 786-789.

90. Zhao J., Zhou J., Liu M., Asanuma H., Komiyama M. Photoregulation of in vitro transcription/translation of GFP by tethering an azobenzene to T7 promoter. // Nucleic Acids Symposium Series. N. 48. P. 199-200.

91. Matsunaga D., Asanuma H., Komiyama M. Photoregulation of RNA digestion by RNase H with azobenzene-tethered DNA. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 11452-11453.

92. ParisotJ., Kurz K., HilbrigF., Freitag R. Use of azobenzene amino acids as photoresponsive conformational switches to regulate antibody-antigen interaction. // J. Sep. Sci. 2009. V. 32. P. 1613-1624.

93. MacKinnon R., Yellen G. Mutations affecting TEA blockade and ion permeation in voltage-activated K+ channels. // Science. 1990. V. 150. P. 276-279.

94. Blaustein R.O., Cole P.A., Williams C., Miller C. Tethered blockers as molecular «tape measures» for a voltage-gated K+ channel. // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 309-311.

95. Bartels E., Wassermann N.H., Erlanger B.F. Photochromic activators of the acetylcholine receptor.//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. P. 1820-1823.

96. Golovenko D., Manakova E., Tamulaitiene G., Grazulis S., Siksnys V. Structural mechanisms for the 5'-CCWGG sequence recognition by the N- and C-terminal domains of EcoRII. //Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 6613-6624.

97. Упорова T.M., Карташова ИМ., Скрипкин E.A., Jlonapeea E., Никольская НИ. Эндонуклеазы рестрикции из Shigella sonnei 47. П Вопросы медицинской химии. 1985. Т. 31.N2. С. 131-136.

98. Судъина А.Е. Эндонуклеазы рестрикции SsoII, PspGI и Mbol: изучение свойств и определение ДНК-связывающих мотивов. // М.: МГУ им. М.В. Ломоносова. 2004. Дис. . канд. хим. наук. 149 с.

99. Sheflyan G., Kubareva Е.А., Kuznetsova S.A., Karyagina A.S., Nikolskaya L.I., Gromova E.S.,Shabarova Z.A. Cross-linking for SsoII restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs. // FEBS Lett. 1996. V. 390. N3. P. 307-310.

100. Bochtler M., Szczepanowski R.H., Tamulaitis G., Grazulis S., Czapinska H., Manakova E., Siksnys V. Nucleotide flips determine the specificity of the Ecll8kl restriction endonuclease. // The EMBO Journal. 2006. V. 25. P. 2219-2229.

101. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. //Nature. 1970. V.227. P. 680-685.

102. Luo Y., WuJ., Li В., Langsetmo K, Gergely J., Tao T. Photocrosslinking of benzophenone-labeled single cysteine troponin I mutants to other thin filament proteins. // J. Mol. Biol. 2000. V. 296. P. 899-910.

103. Лифиц А.Л., Вейцман A.A., Дистанова Л.Я. II Методы получения химических реактивов и препаратов. / Под ред. Ластовского Р.П. М.: НИИТЭХИМ, 1970. Вып. 22. С. 118-122.

104. Лифиц A.JI., Вейцман А.А., Дистанова Л.Я. // Методы получения химических реактивов и препаратов. / Под ред. Ластовского Р.П. М.: НИИТЭХИМ, 1970. Вып. 22. С. 114-117.

105. Derek G.S., Blumenfeld О.О., Konigsberg W. Reactions of N-ethylmaleimide with peptides and amino acids. // Biochem. J. 1964. V. 91. P. 589.

106. Leal N.A., Sukeda M., Benner S.A. Dynamic assembly of primers on nucleic acid template. //Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 4702^1710.

107. Chaberek S., Martell A.E. Stability of metal chelates. Iminodiacetic and iminodipropionic acids. //J. Am. Chem. Soc. 1952. V. 74. P. 5052-505 6.

108. Lenz G.R., Martell A.E. Metal chelates of some sulfur-containing amino acids. // Biochemistry. 1964. V. 3. P. 745-750.

109. Perrin D. D. Organic complexing reagents: structure, behavior, and application to inorganic analysis. New York, Interscience Publishers. 1964. P. 100.

110. Shinkai S., Nakamura S., Nakashima M., Manabe O., Iwamoto M. Photoregulated ion-binding to azobenzen-linked ethylenediamines and iminodiacetic acids. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1985. V. 58. P. 2340-2347.

111. Davies G., Kustin K., PasternackR. F. Reactions of L-cysteine with cobalt (II) and nickel (II). //Trans. Faraday Soc. 1968. V. 64. P. 1006-1013.

112. Vipond В., Baldwin G. S., Halford S. E. Divalent metal ions at the active sites of the EcoRV and EcoRI restriction endonucleases. // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 697-704.

113. Baldwin G.S., Sessions R.B., Erskine S.G., Halford S.E. DNA cleavage by the EcoRV restriction endonuclease: roles of divalent metal ions in specificity and catalysis. // J. Mol. Biol. 1999. V. 288. P. 87-103.

114. Pingoud A., Fwcreiter M., Pingoud V., Wende W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. // Cell. Mol. Life Sci. 2005. V. 62. P. 685-707.

115. KrezelA., Lesniak W., Jezowska-Bojczuk M„ Mlynarz P., Brasun J., Kozlowski H., Bal. W. Coordination of heavy metals by dithiothreitol, a commonly used thiol group protectant. // J. Inorg. Biochem. 2001. V. 84. P. 77-88.

116. Dias A. R., Piedade E. M., Simoes J. A. M., Simoni J. A., Teixeira C., Diogo H. P. Enthalpies of formation of c/s-azobenzene and trans-azobenzene. // J. Chem. Thermodynamics. 1992. V. 24. P. 439-447.

117. Gingeras T.R., Greenough L., Schildkraut I., Roberts R.J. Two new restriction endonucleases from Proteus Vulgaris. //Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 4525—4536.

118. Athanasiadis A., Vlassi M., Kotsifaki D., Tucker P.A., Wilson K.S., Kokkinidis M. Crystal structure of PvuII endonuclease reveals extensive structural homologies to EcoRV. // Nat. Struct. Biol. 1994. V. l.P. 469^75.

119. Simoncsits A., Tjornhammar M.L., Rasko Т., Kiss A., Pongor S. Covalent joining of the subunits of a homodimeric type II restriction endonuclease: single-chain PvuII endonuclease. // J. Mol. Biol. 2001. V. 309. P. 89-97.

120. Woolley G.A., Lee E.S., Zhang F. sGAL: a computational method for finding surface exposed sites in proteins suitable for Cys-mediated cross-linking. // Bioinformatics. 2006. V. 22. P. 3101-3102.

121. Nastri H.G., Evans P.D., Walker I.H., Riggs P.D. Catalytic and DNA binding properties of PvuII restriction endonuclease mutants. Hi. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 25761-25767.

122. Kirsch R.D., Joly E. An improved PCR-mutagenesis strategy for two-site mutagenesis or sequence swapping between related genes. //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1848-1850.1. P. 395—406.