Химический синтез модифицированных нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов и химико-ферментативный синтез некоторых генетических детерминантов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РГ8 ОД

« / МАП !СПО РЕСИУЫИлА ,

и / ¡¡»^ТхАетШ Г0С.УЛА1Ч:Т&2ШЫП уаЫЕРСИХШ " кк. Ив. Дк'ЗВйххиелгь!

АЗ. боодо'^лО а5щоЬпЬ

На праЕох рукоятей Сдабо^гЗД О&ЮЬоф

УДК 547.857.7'455.057:577.II3.6

ТЛКТАКИШЫ'ЛК ШШД ОТаРОВМ са^а^овзпсп доЬ£ос яясбпЬ-ОО

9

хмшк.л синтез вдазйщроешш дакйюзддоб-;.

НУКЛБ01Щ0В И СШГОНУХЛВОТадОВ и ЖШС^ЖвШАГИШк СИНТЕЗ НЕКОТОРОЙ Г£ШШСШ 'ДШРйЕййТ®

впроиоио^дазсс ^осд^аоодгог!, бл&зя£г>$ог>оь, оОп^па^сап^п^оЪпЬ ¿пдъзбь Хп^ообою

Специальность: 02.00.02 Органглесхая.

>; , ■ лжгд

•.ОЗзсооо,^: 02-00.02 -

автореферат диссертации на соискавке ученой степени доктора химических нзук-

Завоз* ддабгоЯ.зйа.го е^тфлб «• ео^оОСпЬ роб^з ¿ооо'^

М?.л;;сп - 1393

Ро.упа -вкдолнека на кафедре органической химии Тбилисского государственного университета км. Из. Дкавахюквшй и Институте бхооргтичеоксй хшкя РАН г.Моекш-

Офлшальше оппоненты:

Г. Доктор химических наук, профессор Н.Н.Суворов

2. Доктор химических наук, профессор Р.Д.Кацаравз

3. Доктор биологически наук, Академик АН Грузии

Т.Г.Верздзе

Зьг^та состоится '_£__" декабря 1993 г. в 14 часов иа сесодг-ник спегкализированного совета 02.00. Ji 2 - 1 ас прхоугаеяга учзнэЯ степени доктора химических наук при ТбЕлисокак государственно.».; университете им. Ив. Ьаикшхигъ пс адресу: S80OSO, Республика Грузия, Тбилиси пр.-КЛивчасадас 0. Т1У, II корпус, жик$ак, аудитория 8?

С диссертаций i-ouho ознакомиться в научной библиотеке, НУ

Abiорзферат (вестник) разослан " " октября IS93 г.

Учений секретарь яециалкзировзнного

Ciiüi'e, яавдкдат хим. нь/к, доцент ^^^^

Ii. Бзрдосанидзе

Актуальность крооде;.м■ Црасташшй шг^.с гёяодо-

ческюс ойойств НК обусловлен уст. дяэъеваи ■¿о^ыс природе.

Определенное значение овязывшл: хша с ^скуос.-. акадо-

нуклеозпдов и яукдеотпдоз, сшагезо^ аолг<здкрсьбШюй ¿НК, гуцей слунйть шдельы ир;: цзучехш.1 ск&о?» пр-^одшйс систем, дагуры » ууетшии ттд«шй ДЙС. «лацейшиа раздедои Ж з кас?оя:;<ои зрс&я является сдиго-•кдеотвдшй синтез - яшхческий е-штез ¿¡КК я, отчасти,- РНК и, в .стности, разраоокса зеднтных группировок моншероз. • В згой шзяс жил этапом е работе по дальнейисму уссЕер^онствоважю методов ягояуклеотидного схикеза нам цредегааллгтея упорядочен-.-; ,-годах подчас противоречивый характер дшашх, евздетельезг-с., ^я с дой стороны б пользу целесообразности и,. в ряде случаев, совер-;няой необходимости пог,шло традиционном задеты мономеров '¿о эк->аш:ногругле гетероциклического основания, углеводному и фосфат-» )чу остаткам дополнительного блокирования, т.в. -дспольнозашу? лаиюй защитной группы" таюю и дпя реакидонносиосаоно1.; аквд-истамкой фуякшш в нодозашш 4/6 нуклеиновых оенованг'1 н осгла-)вааие этих дшшых с ^есгауащга-ш такае некоторыми сос^-.^еал-д» ой отсутствии необходимости в таковой зшццте - с др/г<-,.';. Для злее уснешого решения задач синтеза слигояуклеотэдои ; дботз зпользовани дашзобутирилоксязтилековая- ШШ), дкфеа;:лкарба-жлътя-фРС) и п-шгрофенйлэт^ькая- (Ш'й) задайте группа. .

Оправдало, на каш взгляд, шмвко итог-:: ;г.::.оотрить вой. инке •> ¡иске на неооратикых шлоцроазвалышх д;^соразовак>1ях с-*-!д-лакгай->й фушеав«, явлдыцихся одной из щгачиа сих,а80ъшшд паразатшас, . эбочша: продуктов одигонуалео тарного сеттег-а, .ип;':::е, наоесрот.; гугцестьляе^х целенаправленно, к ютуцкх сл,уля'а источником уклеозидов й нуклеотидог, шда$пщцровйнивх по иолокелвио 4/6.

Не меньз опадыши ьоточшком «одафчнрованкнх. нуклеозадоь луга!т их прдаей едчтез реакшей кшеозгиировакяя гетеронаап-есклх-осяозааий цроизЬодокш мскоз, открывавяиЦ пуль к колучеяий азкоооразаых аналогов нуудеоздде? и нукдеогьдоэ, ойчадааих чеях. ыиродам диалазоясм озопех-в и гзредставляадих шгер^с а аз-ёсгва онологичеиш-акач^лшх соедянешй-, например )".ренлрба-пл с нт}'.оа:стерцальнои и аняиируояой адоишносг-ьк', нэтешзьадьаич етабо.У'тсв при ксследовалмл гариесоа ошолнтеза к

Цбсоьаекша пнгзрес щ>здотай11я»г ¡.¡сде^гаадыг н.уклесг;:ло:?, зат-аглвтуде также :тль-ьодагый или ^осфашй! остатш нуяйеогь-доэ -, ссю^'-ветстзепно, остоз

к, наконец, одно!! из кихчетх. проблем химии. приходных ct I» маяекул.чрцой ополох'ли и ностоедое врдоя остается, i го^о^дооь ЕШб, деиш&йжее усовераеасгьойанме методов оми адкд-'отааяою синтеза, синтез функцйонадьцо-зтдааах igparK« ДНК.

Цель работа замоталась в изучении возмозшостс защити ; №ф;каш;1 4/б-а»®д-лаг;та1.шой функши нуклеиновых основан ¿¡i первую очередь полокенкя 6 гуанина, нркчег.; -методы зсщлты оч tiavuKam ncnojtbjya апробированные ¿Oil, ЙРС н ШЩ ваилаш •защити грукп оляхчзцуклессидного синтеза, а кодафасаи;:» ос иесивяла едкфа-шческшви и . ^-замещешшш спиртами, содер«£ остаток красителя - ыцркераш для нерадисактлшюго мзчешш ь разработке методов получеши! маркеров исхода из рдбо- и зокарабоардоЕ (в дадьнвйием - (дезоксн)рибозидо1') зашцт аро»<ахическах аминов, Ендолана, видела; в иолучишц с их i ,м01чь» ciifrciio.tj (-юномеров) олигояуклеотидного синтеза с но: зеванием аосдедких в трыаширном варианте олигонукдеотидногс ■ «::ia;_ в усовариюнсмоваши тр» эфирного» варианта сеюентйс ¡.¡к. ода сдкхонугасотлдногс синтеза; в химическом шатезе рс лиг. генетических дефершяанзгав (ыдангоров, лднкер<5в, npaito синтезе некоторых структурнкх ?еиов ( iiODOvi тРНК и оиолог»:ческа-ак1йвных пептидов - опиатов дине и нео-эвдорфмнов). Научная новизна. Разработано новое направление в хкши Кро*зводаих (дезокси)руанозиьа, мо'илфедированного алкильньт грушшьа (для исследования взаимодействия шдафшмрованной с эздонуклеазаыц рестрикщи) и группами, содерыдами ссгато : аз окрасит едя - для керйдиоакзмвного мечения ДЕК. •

Хздшчесгаш цдеш, {используя • триэ^ирнь'й к аьгздитякй пол слптьзярсвшш олигонуяьеогвдк для различных колекулярно-Оио ;лмео1мх полей, такие как:

-ряд саиоколтязментаршх. декадезоксинуклеотвдсв, содераа мсдафдуфОвашшЁ сайт узнавания для эддонуклегз iisp 2 и На и i-oiopos гуаыш(ы) участка узнавания заленен(ы) на соствеа Uftic икалопъС^жшшровашше по исло'кешш 6; показано; чгс ^и^очапкь'б олкгомери - утрачивают спосоояоогь слулл-ь суост jfyi--,^; ■

- - дошталсга сллгоь/клеот^доя (

^.UO-'i-'i.hJ J'Ja Ba.i-.^Wia v.y. слнтиза .'JU OO'ti'uiO; 3ari-y3Kax);

3.

ряд (¿уцкщюналы!о-зна'|п1мцх' олтудезсжсйхгухл-зо-'.'йдов (регуля-х учачткозз, структурных гояогО; модоршзогши, усовериено-сехч.вдггнкц метод оллголуклоог*1Дгю.о синтеза путем ¿снолъ-ия ноюх способов дерйштизашш носителя - иреобрааовашш уин пеллюлозы дойссьиш раядодише фосдодаллрдада реатенг-ов. актнчцекое ниимонение. Синтезированные соединения могут цршлеиепие црй редеиш задач »«гая ПК, в мол-зкуяярцой <$®э~ и генной ш-мшерлк.

зр&оо'гаи истод получения перадаоактйвшк иаркороа ДЦК дууем икоты (дезоксм)гуанозйна сикгегировашшк доя'этой дели асдеепяш о хгелью испальзоьашл огмх маркеров для нерадьо-. чого ьвччняя Д11Х - задач:! первостепенной хаякоота при а^а-херьичяой структуры (оикышйровашш) последней. Метод полумаркеров, содержащих молекулу азокрасиелк, разраоотг-ч л ;1ругом варианте, о использованием (дезохсиЗрибозадв лших ароматических аминов, илдашша и индола,. Оба варианта ь ряде случаев служить адекватной заменой существук^м аюслько дорогостоящим импортным лреаарагаи для нс-радг.оак-:о яечехшя ДНК. хйзмошюсти метода не ограллчелк и могут 5атыватьоя в дальнейшем как £ плате усиления ана-еасиькости и (путем множественного маркирования), так и з пл&по уг-шя цвете путем увеличения дахаы цещ. хро:..о$ориой грунш ?еля.

петлчесн^е олигонуклеогадатисатн, ясдсоко крареднойг »ГОК,: 1ыш, сохраняют шнявй характер игжф-клеоьикоц сййзй и иен к хашчеекому гидролизу. И то же лремяг, будучч устой: ну 4 .сиазам, они обладают пуоташовяруспоа аютйяоатыз к •ашяыг ¿и'.терсс ддя лечения злокачественных яовооб^азозакий-'Цма разработанного яаш х^рухаюьгасштабйого синтеза

,<сх^'лзь0;игельа0'< очиотхш олкгахук^шотвддаисагов ксслед-х'ут сыть с'^л'Хезироеанк в препаративных объемах для медако-¡.чееша лсследо^шй. ' ■

ивззрешаихло в лр-оцессе работа раэл&чйне •^ухшшсааах.'но-«•з «ррагиелхы ДНК - шцриыер линкеры, адаптеры, пра®«ер«' -прдоелвизд г* рядз колекулярно-б:«м:ох-йчейЮ.ч исследош;ь.и. ¿одошкше иа».а1 с помоад» у^шс-'^иотитлкйас ае-юдог ::чйсяле садяхургке гены таких око зек та еда кашах и -к хцлюр!.;::: л нео-эвдои/ыя позесляют создать биотвхколс-

ютеску; схему аахтерхалького екнтеаа олэхлыческ.: важках ком-пензнток саезх органгамог, jsaafeRociyaasx из естественных пето»

иикоз. °

Jiii4Ht;ii вклад автора. Автор западает согояуыкость яаучьнх ' результатов, которые совтаииш новое научное направление - »ал некоторая йкфйроднвх аналогов нукдеоаадов к ыуалботидоа, иода-фшированных по 4/б-аицц-лактаыног функш» различные: группам, в том числе остатками красителей, я та;с;се (дезокси)рибозидов некоторых азокрасителей для нерадиоактивного' меченая ДНК и ож гонуклеоткдоз, ырд^шшрошшшх ко гетероциклическому основанш Jiiic3b сахасш-йос&а'шому остову. В дасоерташопной раооте обобще рсзул>ти;у, яодучекные лично автором 2: аспирантами под его руке еодстеом и б соавторство.

Апробирование работы. Отдельные часта работы представлялись v. оосулдаыюь на различных научных келфереюдая: и рпшюзкуьах: tav Мек^акультегсксй конференции по естественным наукам ('Гбплпс! ШЮ, II Кнтериашональноы симпозиуме по химии йоодора, нацраз лендом ва вопросы биологии (Лодзь, 1Э86), Республиканской кон4>< рерш колодах хлипкок (Сухуми, 1887), Всемирном конгрессе fefcc (Будапешт, 1987), Закавказской конференции но жж и технолог) (Tûiuiiiûa, 1987), Зсесойзной конференции по выделению, очистке! анализу блоахтийшх соединений.(Сухуми, 1987), Международной к< \tcpeftшз по ^азихо-сааш: ДНК и молекулярному механизму фушщю-яированль гекока (Москва, 198'?), III и ¿У Республиканских науч! технических конференциях (Кутайся, IS87JI988), Интернационалы« спгаозцуме ;ю электродной структуре и свойствам кристаллов (За: pt-б,. 1988), Всесоюзной конференция по поверхносгно-актцвнн.: со< даяенпяш и красителям (Ереван, Канавар, 1983), ХУП Всесоюзной - îâ-Чфепешди по синтезу и реакционной способности органических ; соединений серьг (ТошшоЕ, 1989), НУ Меддеяеезсжом съезде но /чфеЯ л прикладаой химии (Ташкент, 1939), Всемирно« конгрессе ïccd/t; .in ыадормала университета Ньюфаундленда (Ньюфаундленд, !'«&&). II ¿оесоюзкоУ конференции по химии, биохшпи' и фарыако-хгвзик пр^пзЕэдяых' авдола (Тбилиси, ISSI) к др.

Ослогль^' результаты исследований отражены в Уб печатных рабе

Отмуктурь 11 объём 'доссертадо!, Работа изложена на 320 стр. ° pitiiitu^-.iw-cro текста, состоят ;:з вьедеякя (4 стр.) , двух раз; .'■iCé i: ■ s.с::, ileb^ir.: раздел' состоит*из mtz глаз (155 стр.), : ^.оу..;даытся колучии'лк« резуль^ы. лто^си раздел соду . л,.-. '•-•..чН'хчийз!¡у» Часть (47 KjGMt того, и ¿■utioï« 10;

¿4 таблицы, 22 рисунка и список цитируемой литерату\>:л, эключа-й 544 наименования (73 стр.).

ОСНОВНОЕ аДОЗШШ РАБОТЫ

1. СИНТЕЗ ЫОДйФУЩРОВАЖа НУЮ1Е03ИДСВ б-О-АЛКИЛ^ОБАМИМ ГУАНОЗИНА И 2<-Д1130КСИтаНШКНА

1.2. Алкилировзние иезаыещеннш/й алифатическими спиртам;!

В тесной связи с быстрым совершенствованием методов блкгонуклеогид-о синтеза в последние годы начали активно развиваться также методы теза модифицированных олигонуклеотадоз, охватывающие все болео шро» спектр соединений, В целом, характер модификаций синтетических а^а-ов ДН1С и РНК сводится к трем основным направлениям: синтез о ли гону к--тидов с разветвленной цепью, получение слигочукяботидоь с модифицировал ¡.«ннуклеотидной связей и, наконец, замена природных"куклеотядов олигонуклеотидах и функционально значимых фрагментах ДКК и РНК на их логи - нучлеотиды, модифицированные по гетероциклическому ссгавакик-о сахарному остатку, которая вызывает нарушение вторичной структуры

и влияет на ее способность служить в качество субетрша муклеаз и гих ферментов нуклеинового обмена.

Часто мишенью модификаций в ДНК и РЖ оказывается лабильнее основание уанин, высокач реакционная способность которого требует1 как известно, ¡••■о традиционного N-ацилировакия ик&оаминогрулпы таккэ блонировккГ -положения,.Б олигонуклеотидием синтезе для этой-цели пользуются личные ацильнке и алкильине группы. В настоящей работе гм стремились сти в остаток гуанина такую б-О-зацатцуи группу., которая на -только елняла €:-1 чисто защитную .'функцию, но к сохранялась после удален«; иа гонуялзетида всех остальных блокирующих групп. Действительно,^ если 'защитой 6-0-положения подразумевается его алкилироьакие, причем не ко гадролязущимися по механизму ^-элиминирования уЗ-вамся-^шгама лы-аши грушами, "а незамеченными'алкильнши группами, сако собой такая' цита может скорее рассматриваться как модификация основания, так как ови.ч полного деблокирования 'после полного деблокирования после заверил олигонуклеотидногс синтеза могут оказаться ьедостаточно яйсткими удаления введено?, в 6-0-г.олокение гуанина устойчивей к гидролипу ед-ьной группы» Таким сбросом, в составе синтезированного фрагмента ДНК чин оказывается аляилироватшм. Такого рода модификация ккторесии' ъзи, б-О&якилированннй гуанин в .составе нуклеиновых кйслот образует ком-^ ¿ентарную пару с гншщом и уряцилом взамен цитозана й язвяогся, цус&»!!а я канцерогенным фактором. Введение в ^-С-кояоже;п:& акелльнух '-^амес-злоЯ с реоличшЗ длиней углеводородной цепи позволяет' ырьгровадь'' •

.гость эх1&\уявюго гуанином п; остатка в сосотаге с:«,ге .кгувгаикис

.¡V* г,огг" . • гг.кяшл псах вгцг.т, адо пешккч спсйепх Д1:К кап

' ' • 6

полиэлектрелита; сферические затруднения будут препятствовать сбразова комплементарной пары оснований в дуп$гэксе и, соответственно, искажать форму двойной спирали ДШ.-

Для сведения СрС^-алкильних заместителей в б-О-пологкение гуанина ■Гуанезине и ого деэсксианвлоге ш воспользовались*реакцией яцилировани гуансзина фенклхлортиофоршатом с последующим гидролитическим отщеплем ем' 2-фснилтиокарботишной группы и замещением б-фенилтиогруппы на ал г ную путем кипячения 6-йенилтиогуаноэкна с алкоголяталш соответствутацта спиртов. Для защиты гидроксилов сахара мы воспользовались не диметия-трет-бутмлсилилькой группой, требующей для своего удаления дополнител; ной обработки тетрабутилелшеиийфторидоы, а лабильной триметилсилилык» группой, удаление которой осуществляется в очень мягких условиях (гид; лиз раябазленньш ала каком)непосредственно вслед за реакциями изобутир; розалия и фзнилткохарбошлировавдя (сз^ема 52). Тем сашм отпадает неос дтаэит*» хроматографическогс выделения промежуточных силиль^ых проияво;

Для получения -алигонуклеотидев с заданной последовательностью осно) кий, содержащих б-^О-алкштрованше гуаниноше остатки,:синтезировали ] постыэ защищенные 6-С~алкклгуано?ик-3!-фосфаты. С этой целью б-0-елки. гушюзпш Й-кзобутирилировали изомасляным ангидридом, 5'-тритилирова п, г.' -диметокситригалхлбридои и 31 -<£осфорилировали монофункциональным ] агентом - п-хлорфстл-^-цишэтилхдорфосфатом. Полуценный 5,-0-(п,п|-д1 топси5,ри'Л5л)7С»0»алгал-2"Н-изобутирилдезоксигуанозин-3'-(п-хлорфенкл' цианэтил )фосфат ¿1135 (универсальный м'о но мерный блок) использовали в 1 гокуклеотидном слнтесе (его триафирном варианте) в качестве как гидро сильного компонента (после 5'-деблокирования), так и фосфатного компо; та (по'ско 3'-деблокирования).

¡Индивидуально:« соединения 127-137 выделяли колоночной хроматограф на силик&геле (см. табл. 9); их строение доказано анализом Н-ЯМР- и спектров (см, табл. 10-12). Для рибозидов в области б м.д. имеются си з с идо дублота от аномеркого протона и другие сигналы рибозы в облает 4,85~3,7э »¡.д.. Для соединений дезоксиряда сигналы аноыерного протона ¿иде триплета располозсены'в области 5,40 м.д., а сигналы в области 3, 2,40 м.д. относятся к протонам Н-2", Сигналы протона Н-3 гетероцикла ароматических протчнов защитных групп расположены в области 8,25-7,15 м.д. В спектрах соединений 132-135 имеются сигналы в областях 4,5-4,С 1,90-0}9С м.д» соответствующие 6-0-алкильшм-.заместителям. Помимо Н, сшл-спкьс-ього рм^-х^-сния сигналы Н-2' и протонов ^-цианэтильпой и групп расщепляются также б результате взаимодействия . &с{сгл г НОЕ -УР,Я) 2~8 Гц, а Н-3' - с константой б Гц (см. тс И). Iйжки лм'.,.';.;-'уг!лсп10го фазового дейтероюаэтоования с примененном , дегЛнссп рсос'нги.^а позволяй® получить спектры ^Н-ЯМР высокого разреас V. одногий^о сг/мэстн сигнала протоков по всех о?ластчх спектра.

масс-спектрах "соединений I37A, IJ37E, .<Я37Л, ¿Г37Б, T37n?>-g,cg37Btf " 57Вд присутствуют.пики молекулярнда ионо'з (см. -гад'л.12). Диссоциация сулярных ионоэ даег'з общем аналогичные' масс-фрагме-лтиционкые картины, аентк с m/z 259 в соединениях риборяда и с пл /3 2CI в соединениях ссиряда отвечают конем углеводного остатка при распаде молчкулы по <

Схема 52

, Hförjf kWVV

i>*o x

PK 5 coci

«MV

HO-^.

ghx

ДО/Уа

(a)I27; я H, й?»ЙМе£ (4)128; R1 = Рг CO. К2 « H

MI29: ; B1 « R2 » Pr^GO

F?

МШ: B1

М1Ш- R =» H» IT « CHcOßO

«rr

ОЯ

*nrif

z k x

(rü)J3S: R1 » K2 - H? - !I' (e»I33; RX =. iV-Cö, E? » R? « В

. ■ Tri

VI

Ш .

;' ■• А: 7 * Z» II ;

"Bs 7»^Ph, Z-M80CCb

¿134: R1 «. R -CO, R2 *= (MeO^Tr, К?=НЬ; У » ОД, Z^ P^-sJO

Л135: Б1

pZ-CC, iP «

P(O) (ÖG£) (OPkCI)

d 135: Д1 » ?r -CO, -B2 = II, P(0)(0GS)(CPIk:O

. = (п-.is), с !:.• i<ci), c7;i-:-(>). c- .',{!■•) iVv/.'.); « ü;

- J ( . j ,L V 1Л> vi

о о о о о

и <

сг» . m

ó

5 «

- M

» Ф Ol 0)

to о с?>

а о

¿Î <5í

ё I S

щ в

ю ** ñ со со со

УЗ а» о>

со со Ü3 со

a s

о 1Л ir> со I а> из «л iß

1> 'со -со аз

40 .О СО СО

f» • со о со о о со со

« С- > Е» С» > (О (О СО СО О СО СО* СО СО СО

СУ о

с5 о <0 со

-ООО

«J О) О

<5» • <

ra D о

то со о

<7i со со со oí œ - ci о côcococooco-coco

in te 'P о о л ю

Û N О « N NN N ГЭ M

. - » V

HH^N-í^ñtíJií) s M M NN ci H H

1

■(«• V ^

чу xp • ^

s. ^ннс-ен^ё CV ю Ю о rj О r-tctûio<xi<^>cûcoco

л

•5

s.ö'.

ä s 8 8

r-î tí о> ю со о

СО о

ííj л

Í-» г*

со со

} W

<о ел л, о ф о> С^ С^ о о о о > со со со

1Г> iЛ ' >л

со со со со о

Л' Л О W

о со со

s s

со аэ

с*, 'fr- fr- , С-

J» О О О О О V

и

SI я

I м| SI H Si ¡§h

н v-^l С*it •—,{ <

-_) j—fj i-»! r-a ы1 -г., -,

сэ о

П Sí Ca

У,ЬО - V.lSu 7,c-ü - ?,I5:.í 7,30 - 7.7.S'J

ь.ьм

Ь.й'Л

7,2Тда 7,'Ü-I

0,11

в. CS

5,13

.',03

',93

6,'Jjï

С.Г-Гл'

(i,20 т

?.,G3t а, сода

2,8.',!,!

Ь, í>5;j;

З.К'КВ 3,21м 3,'<!2ÄK КВ 5,5to

3,2Г«;

5.5B it

4,l№

4,20л

4.I5AS

4,35дд

10 il 12 13

з,; о — — З.ьО 1 СО/.'.

4,52т 2 Р0м

3,30 — - 3,00 1 8Ù.<

I I 4,521 2,60:.!

3,Й 3,81

I

4,со -г,ex

3,0 0 I,S3o

4,52т C,?8¡;

4,5Ьт 1,85кь

4,Q.'.ÁT г.ЗСк

4,Vi; 1,85"-'.в

4,04 ДТ г, ЗОк

14 15

0,97т 1,2Ьд Gl!

1,53:.: 0.97т 1,2Ьд 6 H

1,43, Q,C-I? 1.25Д G H

1,5UK 0,97т 1,гсд s s

I, С, 97т В Ч

» цултмьг 2,71 - 3,04 и.д. српш (СИ3)»Ж.

чз lo.'.с\ , >м«м '.д.. (ci. Ji-i J

о: (,1 If j >!„•> •>-< IM (CO ( ; ¡o; jCO Uli ico 0'; t_ 5 It,; jr.i ¡oí ro ¡fj ¡

en je»;слUi.»wjvjo.'-'t. wj» i?o rote «

bi' ö' la.' & tu É5. ifi

'.n. in !ы Im (a im i-j. im sa i". la. 1ы

'• ' 'm (coto lt.; ¡;.' ¡m|w im к-з h m и ¡ro Ь-о ¡M ¡Aj !лз ¡¿o (¡o со '.m ¡c; (о ¡ro 'о ч ko !ro te (t (a (щ 1м lq lio • ícd to lo»

к гл о г.:

О 'J¡

id

СУ о

^ 1

)м "с! *

¡:\з о п

СТ> V:- -3 м 1—» м л J'- 1—1 Ci о ID œ 1 го v.* о я 1 с.

О V M r,1 го en п Ь' • ',1 » -Í с л э 1 <7' со <3

h t i ; о a i ¡ 1 ю 1 р Í о о •-Ч ^ о г Ï1 о ÍO) в: о

о> Ï4 ( t" îa О Ol С"' ..J M с:; I, а> s

X ГС' О с> -3 t-Ч t -ч b-¡ О 01 tn Ul 'г- о i J > т С;: Q о- го <•

f ». Ы M 1—1 Ô • 4S - s:

С* »—i CP го ОТ сл о — о о '0 > m X Го

о о о о о О О о О о о о о о ^ о о о о о о о о о о 'ri

■0 1)

О • " -о л О"» iN Г.З лз Pi со л* к-Ч со со й С) сл н> W OJ к

<о о - ' ^ о О о О'.. и) Cl Л.1 о о о 04 о f оо о 2 » >%¡ rt

-si г» ;9 к4- л. Г ГУ/ to С V Cxi СИ ся 07 у\ оЧ V-, чС

ч-Я п. с л ^ s О' о vi о о о •-> о о о о о о о к о

3 Й

!

о о о о

со да сз со

г

I I

ООО ci Ci oí

о л со

ю >л

McvictfcvMMCitoo

V"» Ы M Kl M HI H W M

СЧ О M n

о cî

О О 0* M

'x> со «5"

Ю О и IO

C\î cv

Cl OJ N H Ci ымсмс^ыюою n И n Я Й w ci n n n о n n

CO W CM "41 W M M СО (M H Ю si' Ю

»»««»■a* «h^ *

COCOCOCOCOCOCONCOCOCOCOCO

i»Oiso<»i-«OC>MM03it-jC0 cococo^cocococococowmm

юсоосо'оооэа со со со со со со ■ м -

fí о-

мчэс^осчюос-ю

'i I

(ОСООЮЮЮМ С

finniOCOCO'í-J M. H И И И W f-4 I-

-о

N 1 1 1 1 i со OJ со О <о 00 D

«я ta (О <f> tf> «0 Ю ir

• и .

й _

■ '.О со M M M ■sf со со о LO LD с

и '-0 1С 1Л LO ю D- «5 С"- с- СО с

о| I о ; ,-í J а

1 ю) ю s lo

. . ? j i -г? 1 co , i со

н и H H| ! w

-Ы-к! -ОI -Г5

«

• M-Ac

'' '' ! .'-:, ;.-t¡¡ 'J-Ac.+K II-AO, +2fl tí-At, -Ко U-Zkc l.i-R-'iEHi'g btBO В, B+-H ' bt2H S, S+H

1 ! 2 3 5 ü 7 в 9 10 II Х2

M1M) №2(2) 372(1) ¿43(4) 243(6) 241(3) 250(3)

агз jjfíJ; ■(•M ai 41S<f) ьзои) 55SÍ3) •MüU) Ш13) 5I«'(2) - - - — - 272(1) 242(6) 243(7) . 244 (2) 300(4) 3C1(6) зоН'П ZÜX(4) гога) 259(23) ;ьо(5) S-ÜC ^4(1) В - Ыхи ií«U), В - lieOCO - )1й£ 217(1) t¡ £('•>) eim'i

ákilf: CCö(I) '-■OI! 4) bü2C'¿) 457(4) •i5P(2) 303 (Я 301(lû) гогцо) 201(10} 20? (3.1 в-й4 г»*и>. ' a - teoso vaw, 270(3), Z«(4) В - ЦбГ>:ОЧЧ 2X7(1) . 213(4!

«3(3) 4M (5) 4M(?.) 430(3) 435(г) 407(2) 403(5) 47tí(I5) 274(2) 234(2) ,235(3) 259Í?) I- t *

'.'/ЛТС йЗзис; 4SX(3) «б es ; f 4Ь0(5) 476(IS) 333 ,»Jb'.4) 273 а ^ ■W7(s) 259(4} ге;;(4)

673(10) W3{3) jsXB(7) - 432(3) ¿7b(ei - 343(8) 31Ь(4) ¡,; - läKü.. - Ms 477 _ I! - liNH¿ - A 3S3 i"'

¡617(7) ! 58S(2) 530 ill 479(30) 323(2) 443(г; 416(2) 5X7(50) 459(3) •ISO(SC) U - 'OR»- ÜMH¿ - z'9 347(25)

. ^с-спг,:тр, п/х 1о%жкаг*ла&* етчеисатоосп», ;.)*' (пдооеесвв«)

-------- "í J. 6 . -6 s 10 II 12

! '/.¡'.s. Ù-1 í í GIV(I) tly(X) .j78(ZCi) -v' 474(14) 444(10) 259(7) --

I • u'-i V '*) 445(10) 260(19)

j 7;b(5;

¿г:- iíV/C-t) ■IM (i-) 323U&) - - 421(9) 336!;) 276(7) 201(11) i! -.IÍNKg - R - fl<- 2?3

277Ü2) 202(23) i: - lili 1¡2 " R - l» 321

te £01(2) - - 561(1) <20(41/ ззь(i) 471(4) 4'И(4) 201(3) « - lf.NI¡2 - R- Ac 202

j^-IGÍ'j) ) 445(B) 202(3)

* Cúe,j'¡¡<\4 i J jj .ч;;.: нспольэоьалксь л вцде ¿'-ацетатов

Таблица 20

Оиектри ВС-ЯЙР роедкяашй £55 - 25g

«Г. м.д.

l\z) C(4) C(5) C(G) C(7) C(8) C(9 ) C(Ï'J Г(2') С(3') С(4>) С(5') -С- 11 0 0

130,0 ÍCÍ.'" 120, S 1X5,9 143,5 106,9 I34,tl 134,С 86,8 73,5 71,2 83,0 61,5 - 20,6; 20

125,0 134,8 121Д 116,1 - IOS,9 - 129,2 06,8 73,3 70,7 80,2 63,2 - 29,9

¿5,8 г '¿1,4 I 124,5 д 115,2Д "143,3 с 102,2 Д 150,9 с 130,2 с E7.Ï с 70,Э д 70,0 Л 30,9 Д 62,3 т .169,6; 20,5;

Х7С.9 20,В

гт Cu ТТЦ IT ТАР. P_ r. ТП2.2 Л* 150.9 С 133,2 с 80,5 Д 60,8 Л 65,9 Д 70,9 д 05,4 т 169,6; 20.5; ы

АО.

дной связи. В спектрах присутствует п.-.ки, сэответстауцг;и.э гп/2, ¡иклкческих -оснований: 1Т, (В+Н)+, (В+2Н)+ и (В+30) + . Присутствуют :пектре интенсивные пики с т/г. 157 и. 139 - результат? фрагментации ■илрмбозы с отщеплением колеку.т уксусной кислоты, кетена и воды.

!. Алкилирование азокрасителями, синтезироваккьет на основе

уЗ-фенилзтилового спирта 1

¡ктироьание проб ДНК, расшифровку первичной структуры традиционно ' 'вляют анализом радиоактивно меченных проб ДНК. Введение метки, со->й по 5'-концу ^ Р-радиоизотол осуществляет? энзиматически, реакцией шинуклеотидкинагой и у-^Р-АТР. При том, что чувствительность гетода исключительно высока, он не лишен определенных недостатков -л как высокая себестоимость реагентов ферментативной реакции и неце-*" зазность использования проб, содержащих радио активный изотоп в юких целях.

юледние года в практику активно внедряется принципиально новый вечения олигонуклео'гидов с использованием'нерадиоактиенкх :»;эряерэа, как биотин и флуорофоры» Сильное специфическое сродство бкотина'с 1ально дериватизированным стрептавидином, либо авиднном яитаого бел-¡воляет прочно связывать эти парл без обраэозания ковалаггной связи шентное связывание). Биоткновому паркеру не уступают з оффехтив-^луоресцентные маркеры: пробы, содержащие подобные маркеры могут ?тектировани непосредственно на гела лазерной техникой и другими,-ш.

;реш:е биотиновых и флуоресцентных маркеров по б'-концу еннгегиро-олигонуклеотидов осуществляет либо в один прием, маркируя кепос-' гнно недериватиоированный олигонуклеотид, либо предварительно пре-г ого з производное с 5'-концевоЯ амина- либо фосфатной группами. 1у красителя присоединяют непосредственно, или, через "иошеу". Тех-I наиболее доступны методы, согласно которым введение биотинового 1 осуществляют через фэсфашдитшй, либо Н-фосфонатный линкер на ¡ей стадии автоматизированного машин:¡ого синтеза. Позднее был раз-1 альтернативный вариант•ввода этих групп по ходу синтеза: энзчма-5, либо химически, через фосфаиидктккй линкер. Остатки биотипа как остатки флуоресцентного маркера бшана и спинового маркера та) этим способом удалось ввести даже в виде множественного маркера, >иая практическая значимость нерадиоактивдого мечения ДНК саосоЗ-дальиейшеку поиску маркеров,, сходных с биотипом и флуорофора-чи, маркеров нового тапа. Паралзльно 'попеку новых маркеров ко меньшее, "о и:-ест отрабатывание новых химических методов их гко/'.гепня э ДНК» ¡опкт&пись испояьзооать длт мерхироемт олигс1-:ук.тсотн,\сз некоторые •.с.чмь-е тгто, например, кг:-; красится азос","."- Для. этого

мы в псзрву: очередь удостоверились в совместимости этих красителе Гансами ол^'онуклеотидного синтеза' и с условиями реакции кокденсг

•детритилирогения, фосфоршмровайяя, удаления защит.

При то«, что ранее был разработан метод включения бис-тинового по ходу олкгенуклеотидиого синтеза, работ, которые описывали бы v ванне вместо биотина цветных маркеров для введения мет;.я по ходу нукдеотидного синтеза, нет. Стратегия введения в олигонуклеотид г кера, предложенная впервые нами, предусматривает, именно такой под визна подхода заключается в тем, что наличке в синтезируемом олш отиде цветного маркепа заключает в себе преимущества, которых лиз тсды с использованием биотииового маркера, поскольку существенно чается хроматографи^еская очистка промежуточных продуктов, необхс на каждом этапе элонгации цепи в яидкофазном методе олигонуклеоте

■ синтеза. Тем салкм, дорогостоящая аппаратура для УФ-детектироваш быть заменена простыми спектральными приборами, работающими в в и; x¿»ct;i спектра; возможно без использования специальной техники orí в»зу%льной оценкой движущихся по хроматографической колонке зон.

Коммерчесгси доступные азокрасители, естественно, не содержат 3 кальках групп для ковакантного связывания с молекулой нуклеотида, гели, содержащие такие функциональные группы (гидроксил или амине

■ связанную с остатком красителя через "ножку" CgH^ - для бозмо;шс удал-знлк ощу-т отлеплять .остаток красителя по механизму 0~слимш ькя) легко синтезировать например из п-заверенного ароматическс на, в частности - из r.-еыинсфенилэтанола (полупродукт MI). Этот макет быть использован в качестве азосоставляюцей (в паре с соот: щей диазосоставляюцей реакции сочетания)равно как и диазососте ь пиш случае последнюю »¿окно сочетать с используемыми обычно азе е&чхн - нафтолеми, нефгкла.мин$ш и др.).

Синтез красителей 146-148 осуществили по схеме 53 послсдоватед нитрованием 6-фешлэтанола, восстановлением нитрогрупш и диазот r-Mcv полученного шиши Все красители представлены азоформой (под -)<>..;ания r.¡j:: 15-10-1500 см"* в ИК-спектрэ соединения). Таким образе гадрокзилсодершуа соединений 145 и I4S реализуется озоформа в с с значением энергии для этой формы. С другой сторонь

такчх' пргделчг'лен азо-форной, хотя для этого красителя предпочти бкда би кето-форма (кето-гвдрасон). Фецольный гидроксил

■ провал г. L'е.-хадаодП сопряженный комплекс (схема 54):

г носи.

í/í'c:;¿ch

1) (0.^00),0/1'у

г) к:о3

з) 11с1/ск..0ч

«осн^-^-гх.

огобс,!!

пк.,----

1ч-.

ии'"

ччг

ы

.-г^к-Сфга,

■ ногн2снг-(0)-кнг

ИС,

13-6

12

р-сг,си2-

7>

Г©"»-®

с,н.,осо

:редс красители 145 я 145 должны протошр!оь;;ться азо-зованкем стабилизированной сопряжением протонироваи^З е~о~ з ам-кнгаевоЯ форме положительный заряд локализован на атоме->й группы). Соответственно, углубление цзет-а в кислой срсдз ;биг) мояаю считать свидетельством в пользу азониевой формы, •снйй кислоты не содержащее' емшогр;'ппы соединения р44 и шивают сдвига в области поглощения. Наоборот, красители : 346) протснируются по азогруппе. Наблюдается батохроислй >56), визуально выражгкецийся з изменении красной окраски :тьора 145 на сиреневую окраску уксуснокислого.

Энергия первого возбужденного состояния а.30красителей выке экер) нормального состояния и они проявляют -'положительную сольватохромию тохромный сдвиг при увеличении полярности растворителя. Замена без: этанола води-:.: лишь незначительно увеличивает значение коэффициент! ишкции. Влк.чние воды на распределении зарядов в молекуле по всей i „ мости обусловлено исключительно эффектом сольватации и им и огр;

вается; протошроваюш, как такового, ке происходит. •• ' Алкилирование 6-0-положешя дезоксигуаяозина для введения остат: сил гля в пуклеозид осуществляли взаимодействием ^ с краси'

144 (в качестве первичного спирта), азодикарбонсвым эфиром и грифе) фосфинск (схема 53). Содержащий сопряженную систему связей 6-0-эалл тель оказывает некоторое влияние на гетероциклическое основание ну зида, проявлявшееся в виде батохромного сдвига (555 и 287 — 280 и в спектре кругового дихроизма (ВД) соединения 147: положительный и цатальшй иаксиыуш амплитуды удельной1'молекулярной эллиптичности диизния 147 по сравнению с соответствующими максимумами для ср^1"*" сменены в длинноволновую часть спектра. Величина амплитуды КЭ длин; новей полосы гетероциклического хромофора связана с заселенностью ' анта-конформаций вокруг гликозидиоЯ связи. При первом приближении чипы вкладов хиралькости при СС^ асимметрических атомов рибозы ¡¡ой стороны - и конфигурации гликозидной связи, конформацирнного с ния вокруг ы; - с друг1 ой - сравнимы, они могут складываться или. и; противоположный знак_. Наблюдаемое уменьшение амплитуды КЕ в спектр по сравнению с Ср^ •"'-"0) мокет gUTb обусловлено изменением конфор 147 с результате введения в гетероцикл объемистого заместителя.

Стр-сение производных Г.44-147 подтверждено также спектрами ПМР ( 16) и масс-спектрами (табл. 17). Для масс-спектрального анализа ме улоктрониого удара (EI) соединения 145-147 дериватизировали путем ; шваодого ацетилирозакия, соединения 140-144 анализировали без зш;: пользуясь специальными методами масс-спектрометрического анализа.

2» СИНТЕЗ Й^СЙЕЗШСИШ^ЖВДОБ.ССЙЕКЩИК 6-0-МКШ1РСВАНШЙ ШКС£Ш 3 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОДСС; ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ УЧАСТКА УЗНАВАЬШ С ЭНДОНУКЛЕАЗАМИ РЕСТРИКЦИИ Нае III и В^р I.

(Хадгонуглвотиды, содержащие модифицированный участок узнавания н/клеие«; рестрикции, удобно получать химическим путем, синтезируя i пр*роди„-х ч лсгриссдних ¡лономерев. В качества модифицированного 3bi ьи тризфирный сиктоц, получекнуЛ кз б-О-цетилдезоксиг;

зина cuj^j. - (j-O-utKiciibHoro производного гуаноэкна. С использование '..того ¡-я');. ■.с}".i nil синтезировали сьмоконплемектйршс олигодеэоксину 170-1V-:, счднряацие глследог-ательнссть (Ь')ЦСРС - участок узт

co'j.'v 1«+2Дс ï.tfAc if

Iii i

233(15)

Ьй j?5(ca) 332(5)

370(4?) -«¡¡О 3X5(30) " ' -,

377(1¿) 316(13).

. Л'П . •

JiS - i 373(6) г

374(2)

-ÎL.0 3X3(4) •

2SX(Ió)

4íH2,-a 2«8(3) '

221Î3)

£22(4)

* SHtjO М-а U-S с/ СтАс Sí'jí-ле ¿ршгмскты

£74(30) 251 íbOJ 247(50) K3Í2) ' 120(7) 171(35) 172(45) /.НАС

275(40) .248(50) 144(45) 148(40) 1-19(45) 130(80) , > M"<i 43UC0) Ас .

27Ä(25) &ЧК?) йч5(10) 141(2) ХСЗ(Ю)

273(15) 2С1{2) 240(5) 142(100)

274(5) -КН2 229(1) 143(25) \ «

-Л12 257(7) 230(3) +AS 184(90)

258 (3)

259(4) 1Ь2(?) 17е(20) ! 119(30) S 91(35) C6H3№Î2 88(13) 05H¿üH2, 43(ХШ) Ас

«f- 306(5) ' -•.- ■

;25) ЭД, 540(60) Eriln'iU, 495UQÛ) 4Ж(6С).1«1, &2H, 409(60) ki-d+H, 3S7(IÜG) Ibiíu-ctó, 2Э2Ц00) ' ' '.""•'" ' - ' . : - 368(7D) tt-i£u-ï

147 -SIKÎS) H, £12 i

L____ У--> • '

R H-cai.-raJ-^W^r^ —J (<g>

. •■ • Ш X « о-да .

. Ш ï " п-ЙНз / ■

itacca ледеригадыифоваквого соедгаеиая ***ûrï30iHj:b2»e тпеисхвиоаи w-vs дай в скаоках

jwi.

н-осн2-са2-

'Г

HS

рестриктазы Нас III и ее изошизомера B.Sp I. В 170 Нае Ill-сайт (подче! iyr) представлен е натигном виде, в остальных олигокуклеотидах jдин из гуаниножх остатков (внешний внутренний) или оба гуанина сс tepxai 5-0-ттяльнут группу (схема 61):

i- cqiG^'caqq ' Схеш 61

R = P,i = И "

123: К = Ri « С15Н33. •

.72: и » с^-Но,, й = к TCiicfcccrqA 31

I73:R = К! = С^^з 174: R = -CI6H33, ЕЛ

Ул ксследоьали взаимодействие зтих олигонуклеотидов (после их ферм« гативного б'-^Р-маркироьания) с фоифодиэстаразой змеиного яда (UEZJS), гакже о эндаиуилеаэалш рестрикции Нас III и B,íp I, анализируя реакциош ;меси электрофорезом в полиакриламкдком денатурирущем геле (ПМГ, соде шдай 7 М мочевину). При инкубации с этими ферментами немодифкциронанга ;убсгр&т 170 претерпевал - полный или частичный фосфодиэстергюннй гидрол! [действие VPXK) (с образованней соответственно и полного набс

тредуктоэ гидролиза с 3'-конца), или же сайт-специфическое расщепление [действие Каз III, Bsp I) с сбразоЕанием пентщуклеотида [[5 юследний Идентифицировали элактрофоретически путем прямого сравнения < продуктами частичного ' V РЛЕ-гидролиэа декануклеотида 170. В. то не вреи ■юдифицированьио декануклеотиды 171-174 оказались мало реакционно.спосо< rate; их УР^^г-гидролиз сильно затруднен (не удается обнаружить продук', расцепления короче октануклеотнда), а гидролиз рестриктазами полностью юдаилен. _ •

В принципе каошиземерн могут проявлять неодинаковые требования к ct¡ гуре рестриктног-о сайта, в частности, различную специфичность к модифш рованиьгм '/часткам узнавеник. В неоптимальном режиме, в услосикх снижен] кесткостн требований к структуре субстрата ферменты особенно склонны i телят-- различную реакционную способность в отношении модифицированных < гоь. случае синтезированных нами субстратов 170-174 мы попытались noi :игь (точнее, расширить) реакционную способность эндонуклеаз Нае III.и Sip I за счет елкяения специфичности фермент-субстратного взаимодейстз! ryitv, введения в реакционную смесь органических соединений с высокой Д1 электрической проницаемостью (глицерин, 0MF, МеСОКЫе^); В этих

позлю: реакционная способность рестриктасы I (второго изошизомера' fee II'I) например, повышается. Однако, в нашем случае модификация услси ripj-.tVH-wcr,: ко изменила картины гидролиза. Предполагается, что изошизо» В,?у.З av:to,:,c.":í;п.уэт с ДНК s большом яелобй двойной спирали, Б.*р I - ) излом xi-.-.o'Je, н Hue III - в сбоях. Ъохмхяо, что введение в область ре< Четного o-iussuiCTo« гйдрофсбноЛ груши: препятствует нормальному <

ítóBíuua; фг^ и содкпляе? рестрикции..

ЖТЕЗ ШЛРИР0ДЩЫ1 тКЬОЗЩОБ РИЬЗШ№0ШИ£К ГЪШШЖЖЧЕСКИХ

совдюмш и арктических ттв

У

. Синтез' 1-^-1>-рибофурзнозил- и рибоьирааозкл-б-нктроиндзла н

дндолина

^¡шкчеспис преобразования некрироднях яуклерздцов в ввде мономеров гтаболичёоком клеточном фонде исоледсваны достаточно полно. В иень-

стеаени изучены их свойства ь составе аомкеров - РНК и ДНК; d мости, каков характер отклонений в структуре и функции яуклеиио-нислот, содержащих неприродные аналоги нуклеозадоз. ]редстевлялось интереснкм попытаться экяхзчпть в состав олигонуклео-эв нелриродный нуклеозад исходя из тридеазэаналога пурина - индола частности, его б-нитроярокзвсдаого). Выбор последнего обусловлен вк-зй физиологической активностью производных индола и сравнительной Зольностью его 5- и 6-нитропроизяоднкх.' Введение ивдольного нукдес-з в синтетические олигэнуклеотвдц к фрагменты'ДНК. на осуществили • учла сначала . (дезокси)рибозвда шдолпяа и кндо;?з, а кз него - соот-ствуодие нуклеотидн - I- (5' -диметокситритил-2 • -О-ацет.ш-З1 - (4~х.пор-

тоны-кококеры в фосфотризфирно.м олигонуклеотидвом синтезе.

Для получения нуклеозидод кы рибозапировала 6-нитрокндолин 5-С-трл-

.СП .Пп ---г

■ О - ■ сч:

ГЦ oil

z$z

Art» ОАе

1SZ

:1 -Г ":<К

*•• ои оа .

j.TfA/KPC

Oil ОН 260

ISS

КО; Ас С-

Х.О,

-к

'V.

-£0

- 1

Схема 3',

Лео 0/4

f+v /

■ N

лда сде ""' Г~1 [ ■ . " oi*

261 253 2i6 ifj

Tr — tptcMiivi'M, Ac..О — уксусный ангидрид. YFVEDG — рсствор Vf..«+ro!>-

уксуской КИСЛОТЫ Ч ССмЗОД.ОМ П'-.Ц.р iTSIe ,

тшьЗЦ^Со&урьчзэоЁ а последующим дегвджрсваяхем производного иадолан (иадалйь-кц'хо.пняа-.кегод), (скеиа 90& с тек отличаем,, что гляногалгро-ваяие. ооуаеоть.-.члк в" условиях отгонки в езде огеотрола с бензсло:-: вч-деллющейся в- ре^льтехе: рвцкхии воды, змещак равновесие в сторону обра зевания нукдео-даэ.сухкорнкй выход которого б цззхстадикнпм синтезе (коьдзнсзщгя, асетилкровгнко, дегидрирование) составил 65'а. Детситгли-ровакае 264 осущесгзляли-растзором трифторукоуснок кислотл клз Сен змоуль^окгслоты в безводных дихлорэтане, хлористом метилене ялк хлоро фор;.;е-яре кошатной температуре.

¿¡Л

Строение,рибо£урзиозцца 6-нктрсиндола

/¡-Конфигурацию соединении 255 приписали исходя из следующих соображений: для того, чтобы 0Ас~группа оказалась в зоне магнитного поля индола, они должны Сеть сближены. Максимальное смещение величины' химсдви

j везультате сильного экранирования осуществляется '4i

и ¿E); допустимы такие гош конформации (рис, I)

в цис-конформации

j CíL,CH'

.-i ОСЕ-. А

pi

Я<

ОАо

3»

Iх •. ТВ

Однако, отсутствие смещения химсдвкга для 2'-0Ас и невысокое значения ^(порядка 4 Гц) для соединения 255 говорят о следующем: ¡"сближены;/2.-1-й. и £-Н не тра^с-ди-аксиальны. Таким

i.

и ОА:

образом, отпадает «С-:юнфигуращшг а круг возможных ко «формаций сильно <:скрг£:г.'-;'сДействительно, в случае «¿"-конфигурации следовало ожидать сш!Ь>;,>г<\: взагаяэдействмя В-0Ас„ Б и ОАс сближены,'например, в знергети-,чес..м ;«Ллагоиридтной и.дпупс: конформациях цис_ или гош (рис 2)

у.еьее ¿ьерлкг.чы

более СЕпОН вероятны

/З-Л

:н.-,:н о/н

^ и

■о \ ->г пд

ОАс

Рис

Gü'e&evsñ :ггь ^конфигурации. Относительно частот заселенности

tííD vjjc:' /5-шоиера соединения 255 согласно спектру IIÍÍ? 1.'..->»лс zu'¿kti, цтс менее вероятны такие конформации, как í'T,

• ' > ».О

г 3 :: л> ы«ходятся в положении гчи, a I'-Ii и почта транс

1 3 „ 3

кальки. Предпочтительны та иич кокфор/льми, как 2 Т, 2 1' ^ (рис.2),

троэние и конформация ркбсфурдаозкда и рибопиршсзи^ и: долгота

аналогии'с 1Ч/Н>рибоф:/рщтагил)-6-нитроиндоле;,1 25о, который после раобразований был использован как синтон в фоефэтризфирном о л;-, го- • тпдном синтезе, ш синтезировали 2* ,3'-ди-О-ацетидпроизвсдное его оанслога - Х-^е-Э-рибоф.уранознл-б-кктрождслина 260. Оказалось, , что детритилированию ссадинаоя 253 сопутствует изомеризация с нек'/ем размера углеводного цикла: 1-(2' ,3 '-лк-С^ацетил-у'ЬД-рибофу-л)-6-нитроиндолин 257 был получен лишь в качестве побочного про-(1!)% от суммарного выхода), тогда как основной продукт дегритилк-я представляет собой 1~(2' .З'-ди-О-ацетилтЗ-л'-рибопирш-юзшО-б-ндолин 258 (70%). •-*..!

оставляя спектры ПМР и 13С-ЯМР соединений 257 и 253 (см. табл. 19) видеть, что при 0-ацетилир6ваиии и.дегидрировании соединения 257 олучения соединения 256) сигнал 4'-Н незначительно изменяет только ие химсдвьга, мультштлетность .те сигнала ке меняется. В то же кре-еняэтся химсдвиг (на 0,3 м.д.) и мулътиплетность сигналов 5'-Н и Отсюда кокно заключить, что ацетилкрованиш подвергается о'-ОН, идетельствует в пользу фурансзяой формы рибозы в соединениях 256 При ацетилировании же соединения 258 (для получения соединения ак химсдвиг (на I м.д.), так к мультиллетность изменяет сигнал Это указывает на пиранознуи форму рибозы в соединениях 258 и 259. ш доказательством пиранозней формы можзт служгеь значение хим~ .'Сигнала атома 4'-С (см, табл. 20), разное 70 м.д. в спектре рачогида 258, при том, что значение химедвига атома 4'-С в спектра Р фуреиозида 2Ь§ составляет 80 м.д.

ее бша отмечена изомеризация углеводного кольца 1-/9-^~рибофурано-Т-/з-2.*-рибопирэнозида индола при действии кислых агентов. Для ри~ в б-нстроиндола такой изомеризации не ней'лмдали, что по Бидимому о с тем, что элехтроноакцепторяая нктрогруппа .уменьшает сгабилиаа-' ликоном про:,:ежуто'!5!о?о карбониевого катиона. При переходе к нет-' лину^ в котором электронная пара при атома азота не участвует в ки ароматической индолькой систоми, такая стабилизация стакоаитсл ■ ной.

еделенный интерес представляет вопрос о конфигурации глш:сзидной;;, риболлранозпда б-нитрокцдолина 258. Установить конфигурацию на ■ нии ПМР-епектра соединения не-представляется воэмояным, Е принципе, 0 /-конфигурации соединения возможно косвенным пут:;«, исходя >;тра ''С-В'Р, сопоставляя химедвигн атома 2'-С з ркбозидгт. б-.чит-' . тнна/нпдола (ишхр-гмзр, в 254-258) с жиксдЛ'ГОи 2'ГС в есс:;с<;ву~ ■"'•I'.' '"■''".' ■■ , Г: о ^'"".онгк с угмедг^гом 2* -С р.

il

>зйдо, в рибозиде химсдеиг этого.атома смещается б сильное поле в, гльтате аоздейсувия двух факторов: .дис-эффшсга З'-ОН 'а. ы.д, ) и имв-« та тог. же знак гране »эффекта ^р-аглгкона (для урада*.:; : . аягншш сос-[яющкй около 4,0-4,5 м.д. Такие образом,. для," /-г'-Дазонснрсббзвда, ¡равнению с р-рибозвдом, следует оквдать смещения'сигяйда.г'-^ е. ¡оку 'сильного поля »а 5 м.д. / ' . ; ■ '■'.

'чэеидно, для пары Х-аномеров'рибозиде и. 2' -дезоксир>;бозида сысще- 1 Судет . меньше, поскольку дас-э^фект аглждана будек частично номероваться шс-эффектом'З'-ОН; тзюш образом с помощью этого, метода ю надежно различать <£- я ^-аарн.. . '.:'1 , ' ■

дя исследования строения рибошфэнозздэв 258 (или 259) Сом., схему' с помощью спектроскопии ПМР, соединение 259 окисляли (большая часть ¡ства яри этом осмоляетоя. Еыход ркбопиранозида индола 231. не прззй-; 1 5-7%). О конфигурации и хокфошацзш 258 судили на основания строе-полученного в результате- окислезая пираяозида индола 261 (схем' 90). пиранозкдов (также, кзк й'для рассмотренных-выше фуранозидоз) индола зотропия последнего проявляется цра взаимном' сближении гетеродякла . '-ОАс-группы, максимальный эффгкг. наблидеется 'при. ди-экваторкальном'' 5. гош) расположеяш'агликоаа:* 2М)Ас '

иэенно, расположевы гранс-ди-акезальео),, что реализуется: в ^С-ркон-лации уЗ-пкранозилиидола. Эффект магнитного. доля осуцзствдле'сса . ие в рамках обоих'возможных ковфоршцяй /-дзраяозяякндола (конфр^ ' и , ,в, даторых аглизоа и 2'-0Ас;'взаиыно располагаются

2

¿е в положении гош (рис. 3): / .

3 спектре ШШ 261 сигнал одной" иэГ ац^гоксидьнах груда обнарукшза^я гносигельно'-сильно» "рола -о химедшгок 1,71д.д., в то время; как. , кна яшедвигов осталкшх. ацет^оьаых груш 261 (и Щ) составляют и'..д.; КССВ 7т 1 р 21 Н составляет а'гц. йким обрезом, сба /даря-;., ра однозначно, • /-конфигурацию Щ (и, соответственно,*;

) с треяс-ДЕ-га'ксиальншг расположением Яф, 2»-Н.. • . .. ' *

8.4. C"htí." »сириродных нуклеоаидов рибозалпрованиеы ароматических

Исходя кз задача синтеза иодифютровалншс .олкгодезоксануклеотвдс новые «эдифиадровашшв мономеры'для .введения в состав олпгодезоксш леотадсг. получали исходя из неприродных аналогов нухдеозщшв дезок» ряда. Последние (как рассмотрено в главе I) поручали ьодздшсвцвеи ¡ 4-0/6-0-наложениям природных нуклеозвдов дезоксиряда, либо реак&е, гдлхозклкровзняя гегероцжшгческих оснований, .используя в качестве девода дезокслрибозу. Для разработки методов преобразования синтзт] .ких нуклеозидов в г/.сноиеры олигонуклеотидкого синтеза (защшценнце : фосфаты или фоефаквдиты нуклеозадов) нужны граммовые количества по' них. Принимая во внимание значительно более высокую стойкость дезо. рябозы по сравнению с рибозой, синтез дезоксинуклеозидоь был в как, случае сдублирован синтезом соответствующего рибо-анадога на знача но больших загрузка;:.

Цривгкая -во гншшгс, что глвкозилирование 2-дезокслри»}озои нес сле^кфично гг за стcjtc'/вкя в положении' 2 группы, спогобноЯ осущес стерзэх&агаеский контроль реакции, кы отказались от использования ацгльнкх закит к пул глжозялирошши рибозой. В принципе, получен цуклеозадэ з виге с:-'еся номеров не является помехой для далей, о рых Говорилось вьэ;е.

Для схчтзза различных арилркбозвдов и дезоксиарилрибозидов (заь я их a ayjiz d ов'vx нуклеозадов) мы воспользовалась, следующими схемами обреээьезий (схеь;ы 91, 92):

' Лия р-анокера 2С4 КССВ Oxt-H 2'-Н в ®'С0 П£Ш 80° составляе'-(т.'ЗСл. 21), что свидетельствует о js-конфигурации и транс-ди-акси; разлологении 2»-Н. В спектре Ш* (JlíúGO) .¿-аномера КССВ

сосгаььяет • 3 Гц. Соотношение и ' jS-aaolaepoB по ПКР-сдектру pea: hoíí скоси получено сопоставлением интегральных интенсивностей сиг I.'—п ll,iS) к составляет 3:7..'

Нитро'гпушу (дезокси)рибозидов (d)264 преобразовали в амшогр "•."сокг.^слаце .(ti/266? восстановление»! ниикобык порошком в воде..Со гльтернатавным путем - рибозилировешгем ;лоно-1-ацетйл-п-а бяйлинг. вс удалось: -Еря кислотном или щелочном удалении 4-Я-ацет тт.ул'м: j.po/.cxo.niiT расщепление С-Л-гликозвдноЙ связи). -Ди&зотироьг Аф2£1 '.¡огу^тли соответствующие (де&окси)рис5озилировашше, красите /о)2С;—.->'272. Тригклирмгаяиек та, а-также производного (d)2¿4) t jÍí!EObZ.:Tv... г, соединения (d)27ii.-r. Строение синтезированных сое í.::::- ; .п скектралькиьк ¡гатодоак (rete. 21).

. :Г.-.Л- оаборяда 271а-с гате.м поййедоьательяо ацетилировм;

s

< a Ъ И

ITwûRlCEb —— Uu-iOKiBzlCCl.,) -----ITibBOPSBzlCCl-)

\ - ' I ^ I ¿

wiü&O • OlffitO СШЛО

ёж , .

148» 192 95

a: 2.i1CC12)SH, .ïctr, Ы S2,

Et,К - СН,СЯ4

а

к

f. HucOPSbz 1С С1 p ) -

o~ mist, ?

2?6 '/2

А

и

ÙISBa lCClO-I ¿

OiíEüQ 222 95

Схема 92

НиоОГЗЕа 1С G X) 1

V/T

\ ^ " 1 '1! OPSBzKc I

СП-ЛгО. '¿¿À

CC15CC0H/G1¿GK2, ßt TiS-Gl, líela.

о к>

¿o К

о

я о

Е-: .HS О

Pf

S

О

О

о «

п

g

й /-ч

О

4)

0Í

I

i

-Í

"TV.

«

о

Ш

о—oi-o к «i

см «

CVJ

и

tn t: !

О О О а'

cu

о о

ф. n . Ii m u

в ei

си CVJ

II » и « - «

«

т m TV 14

« О m о

s it и II

rt и П PO

•• «er-*»

CTJ

г:

i

о о о см

OJ

О о 1

Q я о с

К Ii II Ii iS

CM СУ CO w

« PS tu « (4

64 ■

к

«

г- «

га р . о

I! «

H

M О

Ii

и

«

II

«

m ' о

i:

й

со

M

ft -р

С-1

С\1 гН

О "

H

«

« -о

п й

êr*

о 3

L '

ÍH

V

а

о

M «

СМ оо r-î —

О "3

«

(1

Ci.

Cxe.vst 95

'..uc ';ст1:аь0-"0:л ¡юооч.чае pcai-^i трехкиизлтикц ní0t,.~yv0соедляекий

H,О

£uoO?CPri2102—----SucOPCa1 ■

78" ft^jî

22&

.-ri, :;ao, Î, s- и s схем 94( *

= \_7

сяг

Известно. что амидюсны* синтез олкгонуклеотиддитиоаюБ сопровоад?

ся оОре.ео»оп;:8л: ряда побочных продуктов, в результате чего зкход це; бого преду,-,аз лрзвяззкг 50-5БГ. Это обс-гоятвльстзо аоОудоо нас цреаде чей. .уступать г. тлоачвдЕт&оку синтезу длинных последовательностей, отдельно исследовать реакционную сг.есь, образующуюся яри сш • тезе дилеров 280 в растворе (схема 94). Вопреки охкд&нго, спектр ох1 ЯМ? показал, что исходный ткоамкдит, взятый з 2-кратком, избытке, е реакционной смеси отсутствует. Таким образок, учитывая расход ткоам; дита на ¿юйочнче реакция, его следует брать не менее чем в 2,5-кра' кгйьгке,

Дальнейшее ивучонде спектров 31Р~Я!'ЛР первой и второй стадий реак (т.е. кояденсааяк мономеров и'последующею окисления серой, схема 9 подтвердило, что ооноеным продуктом реакции является целевой динукл зидаос^одктио&т (ог 123 м.ц. до окисления и 93 к.д. после окисления) При увеличении чувствительности, однако, дополнительно обнаруживает ряд пиков, соответствующих различным побочным продуктам, оорзЕующк;,; в регулв^ете сопуютвуюцях реакдаи дегригилированкя, окисления, гид л!'за' и первгрулБирозкх Арбузове соединения трехвалентного ¿ос^ора, крайне нестабильного в присутствии тетрааола (катализатора .реакции) При х^окатот'ра'Ьическог! взделекии продуктов конденсации большинство зчпх пс-Зочных продуктов (27о,252-264) было получено в индивидуальн: видь и охарактеризовано спектрами ^Р- и ■'Н-ЖЗ? (схема 95).

¿¿■нкцдоналазацяю ПЭГ £ '-дикетокситритилтимлдин-З'-сук-динатом дл сгнтег^а на "твердой адцкой фазе" осуществили по изве но?,.у ;,.еюду. Яри эти/. количество .шкобклкзованного нуклеозада с ос зело 135 м.лксль/г носителя. После' кэпчрованкя (СНдСО^О/Ру и детри лирсзвглА ТлУ/ДИЭ получили ПЭГ с пришитым первым звеном, готовый к сборке олигонуклеотздюй цепи.

Новый полимерный носитель' был попытан на примере синтеза октан л* ладдмиоета СВ7'7Т(£*2) 2816 исходя из 1,2'юлоль иымобклизов&нног е;клеос<да. Элсягашю цепи проводили, -действуя 2-кратнык избытком. . г-г.ратныв избнтко. тетразола. Вкход каждое отделнои кея

.-.-.отидпо»'. конденсации определяли до величине А^од; наблюдавшееся з пьккз это:: величины (более 100%), пэ-видикоку, обусловлено неполном от'.-.^т'л.'..;) 7р\4Уа»содв£&адига примесями.

В сиЪглр» ^Рч^октануклйотиддитиоата С"£7Т(£9)-ПЭГ 2о1 основа Г,'»к х. ь&исм .53-96 м.-д. соответствует дктговтиоь ¡¿рекцпи

;—-0тад!.'01 ■: :х-гсркула: Присутствую! такие пгкк (25,5/;) продуктов ря яхеччкч окислена^ кэдэтдоат лр:: 26 м.д., 0,0

г/1:4.« следуй::.-.« окислит-:- кгслэредэк- (дйа*»-рг.як. гляопки; при 5,5;.*? - ¡ш; серей (тю-чли-н:.;..: дкггог? при 11Г--П<; ¿.д.

ílo:.-,::,-.y откх ар'^сзП образец, г.о дзляда спэхгра, ccsecptr: t-aK:«3

ял ps2TJ23Uî:;.::iX, :ÍD A.;'J7Ù::-:B3tv.i¿>: oi¿::vs:.: r.y¡:rocj:i - щ'о;'у;<Г1'. оп/олзщш

йоа:.:гдигс <SO-SI и.д., других сэчдгя&юи (20>). 3 pe-

ультсте 04í ст:'я нибо.а^оЛ навеска яог.естьа нерикьисгалл^а-

иэ:1 v.5 этанола (пра это:,: утрачиваете-; ополз 4С% паллив^-но:-» материала, зличество раствор:;:,примесей удалось сущвсгие«шс еккздть.

Наконец, кн проьел:: синтез охтауерс Tgf^) 38Гг (э шзсагебв 0,1 голь), используя Е-кратиьк* кгбыток тгоеквдста. Согласно спектру wiP-;iP йс.-очк.й'знного oxxaxspa 281г, г.роцемгкое соогкоасико ирояу'лов скеси этом случае изкенпется з пользу ллтне.^та (т.етранша, содер;-:-ецеи це-эьок октйУ.ер): дитпоат - 58.5$, ¿юбочные продукты - 27,Ь^, растворимы« ркмеси - 13,ой. По всей видимости, такое cooTaossunc отражает 'реальны' редел синтетических возможностей ткоемидитного we годэ конструирования лкго-нуклеотгддктковтов ча ЛЭГ.

. СКНТКЗ К СЬС>;.С1ЬЙ. НШЛЖХ КСХУССТВБЙНЬЙ ГЬ&ЯЙШУШЛ. Ш^йЛШГС-

,.1. Синтез здапюрных олкгодезохсш:углеот:щов Rín-d I Il/Eco В Г к Eco KI, - Бат KI, содержащие участки узназакия эндонуклеаз рестрикции Cía I

и Pst I.

Синтез линкеров л адаптороз, содержащих различные комбинации участ-:ов узнавания ендонуклеаз рестрикции значительно расширил возможности юнетруировання рекомбинантных ДНК-, вызвавших порезерот ь изучении стр :уры к функции генома низших и высших организмов'. Существенную роль в гаком конструирования кгргют синтетические олигонуклеотиды (линкеры, здаптори), которпе целиком ми частично содержат участки узнавания раз т/ч:-ых рзегепктаз к позволяют вводить зти участки в молекулы ДЖ для юследующего встраивания этих ДНК в клонирующий вектор. Кроме этого, эти олчгопуг-леотэды представляют интерес в качестве субстратов дрк изу чении функционирования рестриктаз. Мы осуществили синтез 2-х дезокси-¿уклеоидаых дуплексов 291-297 и 302-304,которые могут'быть кспользова для замени го фрагментах ДНК Eco BI-выступавдего конца на Hind III- iu BemHI-кочбц для введения в ДНК.участков узнавания рестриктаз Cía I (ATCÇAT) и Pst I (CTGjCAq) (схема 9S) :

5t-A-k-C-T-T-A-T-C-Q-A-T-Ç А-А-Т-Т-С-Т-Ц-С-Л-^

• A-T-A-Q-C~T-A-C-T~T-A-A . G^A-C-G-T-C-C-T-A-G - 3' 291-297 . ' Ш-Ш

Сгктзз был осуществлен фосфстриэфирним методом, исходя из нух-.зозд? с-сс^т^ F kotov* аминогруппа аиидирозана (беаэогапроадна s где-,па; л írosme, мз^ДОЧюэана в гузнккв), У-гздокм «we«

с ï t t . в <;;

¡U е*>).: i] I.ÏMC11 í!>tcnet> — -r-----_Î;k«0) jJ bîC^;(Cirh)CC:iï.t) -'■• ,*'■•?-—-------_ fc<r \

г- 1 г г. [i^i^bzt^Oticub) ^ '2 ......l( "

biCiAC-U'hie.-I.-'Jt) ■ I-iSOJI 1. 860 ¡;: o)-;-];: -------[(KoO^ftjbi/.*T=bi5i>«ar»<e:îu)----V.b2A.i«-ozC;,(cin>>(a.i-t) -

282 » 2ñ§ г- Etj"

; ...„А, пз-ъ^т^ъгА-.г-ЬгЯгСст))

m

■ .OiTrJibWi-r.VrttXTl.J------ib3.-b:.»sr=ibClA0)

fu'-O'. :'r!b■.ü=i'J"-.b5Csr='r=bóA^i=bjriibGibsA=T^ibo(íc) ~--Jb- A-S-C-Í-I-A-Í-C-C-A-Í-I

г. »i,

................Г n T, t^Ll

!--НСх1::ДС;;..л) ----r- -—,------kteOKçrlbijUbsi^îïiClJ-fc) --—-

г. ¿1КеО)гТг1 tií-.bsAK'-.jf's) - гг., г. st-ii

3. Lt,и J J

1. t.;Cj.(Cm>,4Clí£t)

го

якхс-тохскъ'рйТАйьио* группой, а - к /$-¡д-анзт:

но;, Нуйлеоткмую цель нзрцадшй ь направления зг- 3'- к о

концу, вторичную елкэтевую грмяу на З'-концобо;.- нуклеэззде блокпро: вцет^шнах или Сеизош.ьшл»: остаткок. 3 качестве кондекслрущего роа] та сэбрвг-оозвкя нуилеоткяцкх связей ясшш»зоаалк ТК-Тс-и :: Те«.'". Ход о::нтег>а представлен на схе.чь 97.

а.дслоц'.е прокелуточнюс оллгонуклеотедаых олохоз и продуктов пае; зав-'р-денкн синтеза, их деблегскрозрние и оч;:с?ку, г.нал;:з ::ад::ьадуал: пост/ :: доказательство перькчнок структуры осуществляли с аезн^чкте; нц'/.;1. отхлонашаги сходны* обрэзэи как в дашс?: кеследозанак, так и I скнгезс о-йг-гокуклесткдов д.ля разлг-аш целед п рз-х-сьх другое работ. 5й1вк.ч»;:>.нас олггоьуккеотады выделяли келоиочнэк хроматографе;: на от ксгеле, а после деблокирования - енаокообгг'гнной хроматографе* на ЯьАЕ-цо.члолозе последовательно в нейтральное кисло:/, 7 !/. растхюре уочевиаи. И;даш;:дуольность полученных одлгонуклеотддов контролировал путо:;. 1.".;'.крС';<олонзчтй'анионообмэннэй хрокетографии в аналогичных уел впх, а иеряичнуа структуру под-гьеркдаяи, иасле 5' -^Р^осуоркюуок апл с пскоцьа нуклеотидннх карт :1 «оди^иц^роваинсго кетоде !.;аксз.\'.а-Гипоорта.

Ь.2. С:;нтез тетрадекадезокеппуклеотвда ^АССССС/^СО/.ТТ для. напрев яоа-ного .мутагенеза бактериофагов /</ к !Л13..

1уть на^е.ч работы заключалась в полытке кндуцхровоть гочечную кутай;::-; * ДЧК фагов /с/ и м13. С этел гель» кц госцользоьглг.сь :..е-т до:.: ц?«енояравАСккогэ иоуцирэгания кутацнк - направленного :,.утагзн за. В основе этого «зтода лежит образование несовершенного дуплекса ДНК (пйпргл.ер, ДНК фагов ус/ и :г1й) о- сЕитетгчаскаи ол-кгодерэхекну леотадок с заданный строением - п^айкероц, ззтравха« фор:.:еч:а?/лког: скатезг .К'. Б настоящей работе такой гатрзшзЛ слувкл с,:н;;ог::;.эргн, паки те-градекалезоксинуклеотед ^СССССАЗДЛТТ, хсиляеиентарниХ (зс. . точек::«» 10-го звека) участку ДНК, рсспудоа<?акоку ъ концу гена УГ перед началом ^•ренеяркпаг.г соотй короткой пР'пК, кодпруюцз,. осаляо»; белок соэлочки. Обрдзоязгацйся дуплоке содержа? охну х-яж^лехврльр-ну с пару основан;*.?. в яслсаеш» 119Т М уь'.ер^щ-.к ааг.-: ИЗКй&тркчкск элокгадас^: гл::гоиуклзоткда с аошць» .ЛН-полахерази .111 к '1-х дугск-^жну.слеотвд-б'-тркуосфатов :: ;;ол;.ц? дз^си-кек

нолу чили дзухцепочечпу» ДЧК с соэтеетству^гд;::.: дефект.".. б реплике; ди такой ДНК из ху.па, содеркеаой с.г/д-окуклеотпад:у>; катрану по;увила кутантную дьухисяочзчиу« ДНК, сэдзрьйду» в со.!?-, »ьлл ДЛ трансьсрсию (} -—С. В ре-зульт.X; эхо,; точ:^ скс':;'/;:у;\ • С;СрОС, ь сост£:го .:;■- ЛК л:.-.; .. .' ся •• '

5'- ОАСССССлф^АТГ

з1-.. GTqQqqqToljCiAA.... 12СО | 1191 1185

. ...^сисрадцлтт... .. .'crqqqc^Tcc|cTAA.

• • • QACCC^CAQQQATÎ'. » »

jbco BII

ccaî^ÏT... • CTAA...

Рис. ma,6. q ~>C трашвероия Д1К 4&гоа /</ и ;,îI3 в полохеки:

1191 синтетическим тег^екадезоксшуклеотадом 306.

, >

донуклеазы Eco RII (Рис. 4) Это позволит встраивать по атому саму р; личные фрагмента ДНК, а также вычленить прилегающий участок, содержг щий эффективную про моторную область, и использовать его для конструирования реком-Злнантных иолейул ДНК.

. 5.3. Хккияс-фермеятативный синтез 5!-концевого фрагмента структуркогс

гена дродаегой тРНК. ' Важную роль, з структурном и функциональном изучении НК играют ;;етс хиникэ-ферментативного синтеза ДНК, позволяющие искусственно получат; генетический материал заданного содержался, вводить синтетические по; ■нуклеотиды в плазкидкые и фаговые векторы, осуществлять их клонирова! и ашикфякацяа. Большой интерес представляет введение в геном бактер1 альной клетю&скусетвенно синтезированных генов высшкХ организмов.

В Лаборатории хкмш генов Института биоорганкческой >:ша:и им.М.Ыек кйна АН СССР. г.Мэсквн разработали алан химико-ферментативного синтезг структурного гена, кодирующего .валиновую тРНК. Нуклеотиднук последовЕ тельность гена составили исходя,из нуклеоткдной последовательности т! н "нэодклп на концах половинными сайта™ рестриктаз Eco EI и Hind II] для встраивания в клонирующий вектор. Последовательность распредели» .на одаоцеиочечянз фрагменты» которые синтезировали химически» ¡!'>та;л 1 й'зтз:/ ^еркгнтгтпЕНо спили г/.гяду собой. Синтез и оборку осуществила груляс сэт!;;.'Д:".:кг)3 КБХ. Оеусеоталенкзя паки часть хохя^ктктюгс после

доЕи-.кк в eiv.-rcce дг^хкелочечнота

проимер J

r,fùi*STOf> / /),cji

>f ! M.I

ЯП I

а.

рагкента, соответстБущеу.у участку I-16 этой РНК к кг.хздего внступа-вде концы, oju'a из которых представляет собой половинный сайт рестрая-ьзы Eco El, е второй предназначен для соединения с центрально!: часть» еча. Перпь;.' этапом наотояяэй работы бил хякическш: синтез двух частич-э кокглегентгрных олигодезоксинухлоотидов 215 и 324, которы-1 осуществи ц ^осфэтра&дадош ;«:е-:сдо;л (схема 99). На следующем этапе понануклео-эд Sifj к ундзкануклеэтвд 224 в составе 4-х компонентного кс.'/ллекса с-¡штендовашшки ранее додекануклеотвдаки 325 и 526. были сшиты с пошью 14-ДЖ-.лк:'агы с образованием двухцепочечдого нуклеотида 327«32d :хе:,-а 100/. Б гтой стькз З'-кокцеьые компоненты использовались в виде

з 5-хонцовь'г оставались нефосфоркдирозгккыг..и. Продукт лгазнои с&ивжи 327-326 был выделен с выходов .Его анализ методом

соседе« покапал переход метки из рТ и рС в Тр и Ар, что ггласуется с ожидаемой структурой. Для окончательного доказательства tpofeiuai синтез-прозваний фрагмент теиа 327,S28 бил б'-фос^эрилирован его кокпломентаркке цепи разделены электрофорезом на ацетилцеллюлозе гоиохроматогрэфией. Индивидуальные олигонуклеотиды р327 й р328 или ьяхировяны 50/S расгьорок ТЭ/.Б и их куклеотиднвя последовательность [¡ределзна кодкфицкроьаннпн ьгетодоу. Мзксаха-Гилберта

■ 4. !&доф:какия твердофазного сегментного метода'олигонуклеэтидаогст

синтеза и использование синтезированных олигонуклеотэдов для

ловструировеиил синтетических генов дянорфинов и нео-авдор^инов

*

. Оригинальны:.-, вариантов твердофазного слигонуклеотвдного синтеза яв-зется оглматкый иетод. Б производительности к эффективности он не .•тулает полностью автоматизированному методу и его синтетические воз->:?:нг.-сп: г поля' отвечлют задаче бкстро каработэт$ одновременно большое :сло елигонуклеотидов длиной 10-20 нукдеогкдоЕ.

Цель наших поисков в этом направлении заключалась в лсоди^йквцик сег-ihthoro подхода в плане увеличения егмсста дкскор.-кзсит&лзп к iioeiiae-•я выходоь иа наагльнкх' этапах олонгами цепи. Полученные результате I использовал»: в оппгах по хкл'-ико-фер^ентаткваому синтезу генов биоло-¡ческн-актнзчых пептидов и при-лроектирианкк систем их геторологичзс-й экспрессии.

уунк'лионалкззшя бумэч.чнх л-'.сков. В качестве реакции кодификации лл&поац t-:u использовали реакикм '¿осфорилирОЕания (схека I0E). диски аметрок £ им Батман Б обрабатывали а-хло^-еш^оадодихлорздатотл, Te.v зминоспиртом SJC-CClig^OF. (и= 2,4 иди Ь, ирзчеь. степень .ж.унк1Л-алпзацпп (т.е. выход 322) возрос!зет с ?в<гл:чзкш'. а). 'Лот \етод вкгаошшзвда нь требует дорог-столах' но-~.т?леи, рейтов, зс-н..::--

OKV. лег;:} осудеств'.... .

il

s

• о

&

M

y

CkiJ

о

а

о

п

Я '•I

О

??t

CN

sr.

g о

S1

■4 fi

а у

Я

il ri

3 <¿1

i я:

-

о

d о Л си

(I (CN

Ч

И

о

ЕЗ

SI

s!

.—. &

о

о

о о

3

со

сг

0

1

0

1

ч;

3

e-i

CT

!

--5-

1 с f

rLi

X to ; ^

dr £-0

1 O,

., ¡ 1 3

;t

t

1

е->

I

Y

0

1

S-1 1

H I

1Л|

3!

су i

CJ

I "У

^ с\г í оз р.

i го «

i

Р

О) п СО

I «

0 i

■fl

1 <û + W »Л)

I M о 1

о

I I

2

и

s- ! С--*

ft.

Esse более эффективны» оказалось пслользовагче монофункционального ^осфррилируюцего реагента (cxev.a 102) .который был синтезирован с единственной целью кодифицировать целлюлозные, носители: Р-'Д.Л'-дда.етокси-грвтшюкси)-гегт-7-илч^оо£ата 353. С покощьв этого pcarsuia злс4.ор.«и-рованае бумажных, дисков осуществлял:! зз присутствен: эффективных конденсирующих реагентов, таких, как Ti*>-CI и i,;eln с последувдИ|; кэпкрога-ниек(СИ^СО)20/Ру и дйтрнтилированием 3_34 действием 2$ ТфУ/ДлЭ.. Трзх-стаднинуп обработку повторяли 3-4 раза до достижения постоянного уров: %зО)уТ г при обработке кислотой. .При так о::, подходе достигали ксчерлы-вещей кодификации гидроксилов спиртовой- или аккногрупаоН, присоединенной к длпяноцепочечиой "ноже", снижали до л'инш/.ума количество по-бочках, ложных и укороченных последовательностей. ДзриЕатизиро£Ьйний такик "öpacori носитель в зав^рыеиие аудировали б'-димстокситритил-нуклеозид-З'-оунцинаток 331, активируя последний дицкклогексплкарбс-дикквдом МО, яли в эиде пентахлор^онялового г&яра, и выделяли фуик-ционадвзарованнае носители 335, содержащие до 0,1-0,2 ммоля ал'мобилизо ванного нухлзозЕда на граг/м целлюлоза.

В шогостадийнок синтезе различных 10-15-звецных олигодезоксинук-леотидов m использовала оба варианта кодифицированных лодлсдек. Цеш наращивали в 3'-5»-направлении полностью защищенными синтонакл-юноке рами или ди- и тринуклеотидныки блоками (последние чаще использовали для синтеза более длинных последовательностей). I цикл алонгзши цепк занимает 25 кинут . (или 15 минут при форсировании условий конденсации) средний выход на стадию, ..рассчитанный по целевому продукту, составляв 80-85% (порядка 70^ на первых стадиях роста цепя). С одного диска 5 и получали несколько оптических единиц плкгонуклвотиДа.-

Синтез генетических структур. В ходе изучения строения и свойств искусственных генетических детерминантов мы синтезировали структурны« гены ряда опиатных пептидов, играющих роль в процессах, связанных с мозговой деятельностью. .Множеству эндогенных пептидов соответствуют три биогенетических предшественника -,уз-зндоралн--АКТГ-предшествеяник1 проэякефзлкн и'продинорфин. Последний служит источником я ß-nao-эндорфиков и серии дияорфияов. Мы составили общую схему конструирования генов. В гены включили кодоны, инициирующие и терминкрусгиз трат ляцию. Триплеты,кодирующие аминокислоты подобрали исходя из сгатистй-чеочих частотзстречаеюсти, полученных для структурных генов E.coTt. Разбивка полинуклеотидов верхнего и нижней цепей дуплекса при еоставл< пни плена синтеза учитывала соображения как химического синтеза оли* дезошшуягеогвдов, ток к последующей их'сборки фзртентатившл;. -лугем i'söpai-.KKi, atUE карн-лт к«оора структура« генов данор|.:шов и н.и-эн-до1.^>:яо1, по^ашжи из сшггезярокшк: хшаиюскмг луге« снп.ейт о;ч,

' - ' Схема 101

• фушшиоваяизадая оу>ажнкх дисков |;езкдаой фосфоришрогання I " -

И - __ ' • Ü р.-, H2H(CH2)rt0Il О /(МеО)2Тг]^ОСО(СНд)2СООН

<CIPh)ü-PCI¿ + EO-m —-> CI-^-Oj-Gj----* K¿H(CH¿)n0-P-(4£j-----------

: 0(PÍ,CI) , ■ ■ Umv

: 32s ; .330 '

[(Meo T-OCO (CÍI^^cokíí (a¡2)n O-P-C-[

... 832 ■ - 0 П = 2,4 ила 6.

■,', Y ■ Схема 102'

.. .". фуккцйоййпазащш бушагаяс дисков реакцией, 'фосфоралирошшя II - .. ;'. . '■;-'..'

нг/"Т ) ш I) (MeOjn'x^I с 7, и I) HO-fcj Г, \ 1 / \ » Г~1

ЩА^г^Ш ----------}CMeübIr/0 CíbkO-P-OH ----—> Kí.ieC)?Тг]0(Clin)70-P-C-fC

■'•2 {Cffli 0Р{0 И« . L f -J ЧР^-ЧеНш L ¿ ^ пгРкгП

' - - ':■-.■, " .••■.■"."• * - 'Y ■; ; Г'-\Г - ' . "-."• - '• ' о ;; . , ..

Ас20 I) ТФ7/ДХЭ г, " ч т ' , 4 »

_______■ __ ~

2) МУ/да 2) 331

3) 333 ....' ' ■ . . . ■. , ■ ■ ■;

п = 1-4 [с] - Ц6ЛЛЮА0Л0

[аш^Тг] O-HUC-oco(CH2)2COO(CH2)7O-P-O-^1

■ • 3§5 .;•■•,•.

:-, V" Т" ■ 43.

.представлен; в схеме'104« . • • t.

В ходе сшлвки олигояуклеотидов в двухцепо-лчные пшвшуклеотвдн кавдув цепь синтезировали в отдельности. /Олигонуклеотвды, составляв ше отрезки одной цепи, 5»-фсфорилировали (за исключением 5 '-концевых сегментов, для предупреждений возможности датирована* липких, км дав дуплекса), в'то врем, как 5»-гвдроксильний фрагмент кошаешш ной цепи играл роль катриш.й йог быть затем вновь использован из ] акцдонной смеси егсг-выд? пяля, гель-фильтратдай на Свдадекс Q 50 или I ■ Для клонирования синтетических генов мы использовали з качеств, ветора плазмиду РВВ 322. Бе обработали рестриктазаш Eco ВТ и Hoitf. и затем дефосфорилировали. Синтезированные дуплексы встроили в ¿coj НЫ Ш-вектор, предварительно их St-фосфорюшруя. Тренсфоркашя В coil полученным рекокбкнаятнш -вектором (рШ 322 dyn или пеп), сод жапда взамен тетрашклшового.гена искусственный фрагмент включения

" Схема 104. -г. Некоторые опкатные пептиды и их структурные гены^-

' EcoRIMet_|_ ' ■ : . • - ■ .■'''••' stop

мпшбТА^тжтс^есеттлкЪтссшА/ЛйШт^^СмсАвгмте/С

. .GTftCATSCCAQC/AAGCACGCA^C^T^GCC^GGCTTTCACTTTACCCTaTTUGTCATT">CTTCf:A,

TyrGlyGTyPheleuArsArglleAi'^Protysi.eut.ysTrpAscAsnSIn

1Ц1 iwun.

■ a¡raiii

4-A-

•tysTyrfroUs

i OYKORPHJNÎt-17) ' DYN0RptfIN(t-13) DmiPHINÎ 1-8) OYOTRPHÎKd-J) WIIDRPHIN(1-6) b-neo-EWMRPtllN MED^MORPHW

Схека -105. Клонирование исщкуственных генов.

i

pBR322dyn (Ар Тс ) , . . ;

■■. I.EcoRI : /, '. V,:

. " • 2.CIP ■- „■ • ■>•

з.рддпзедтсс

. CCTASGATCCp 358 . a.Ugase ' ■■..'. !

В Я 8 S ■ ' 4 ':. -- I....'. t.. ...

'S*

'a-;

pBR322sn-<lyn ,

'■ )l.pW?29Z/BiMHI,H1ndm |г. lîgase , ... , <■■-■;,-.

Е в ч e; Л-UJ-1----

. ptfS232dyn (ApTcLâc*) •

ДС 6AC 6AC CAC BAC A • ÇfOQ ' e.CTS сте ста ГГТ AA.' «S», -" EntinoptpttiUse linker ,"

¡(.НглМгл . : ••..« I. of upper сЫп ' '— -;.. liasse . ., x

! MTTrGTœTCnTCîSgJSSACCACSACA . 340 i ACAGCASCAGC^CTGCTGCTGCTSTTTRA-•

■■' ■•• -, Sa" •

ktotion.' • '>

pEIWMdyn/ScoRI.CIP -1 içtse ■■.,■<■ H . .8 S • • ' . ''

J.-1_JL_ .... .

/ 5

¿W,

ревзгг Hr-drn , . [(.рисгэуйщшп^ш.

- ' : |2.1tS9sè

pUR29t, Hn-tjyn.'(Ap^Lac*)

ô^galactosidaje v - , v . . ■ . % ^ . - \ - . .

" £iSEL 1020 ЯЯ. . ВадК! . . -Asa Am Asp Aso'tvs «et

.'..gmTtc...tgg tgt ces дел,тсс;sjtfjeac.Щ'TTC atû т»г. ..op-

tiialLH ' Sell " Lnl.^J^îtloâ"К*. . iynorpuln

" .--TAA Т0ГШТТ...СШ5... • ' Ир<гг . -stop stop cmri

jocœsfev ь/- енохашш;: ¿dsoiiUi , ьк:ю, сгаугг отооралн

> .пй;;ог;'аiy. Ьхжгчеквке r плазгзду «¿para-eara метили со в^стула^-

н,; коигам о лопщаи достройки ДЛК-аошасеразой и сккхенсхровгли моди-тнроваиним .методов 1лхсака-Гйлборга.

Ляк игучзьая экспрессы: синтетических генов кы реююкироьалк их в кшччах р- Iï, сочетая с длстальнык концом гена Lac в любой из трех во шт рамок считывания, окспреесируя синтетический ген вместе с моле-'лой. галактозйдааь! как часть . слитной, гибридной молекулы проте-;а. С t'Toü шлъа кы синтезировали BsmHI/Eco BI адаатор 838 и встроил ■о г pLR £22dya, удрзздняя, ликвидируй: Eco RI сайт. Путем этих ареоб-яовакий сконструировали рБК Sí'2 ms-àjp плазквди (схема 105). Акцептор В 29Vbfjfn HI, Hir.cf III лигпровалп с pBR 322m?-4,*/EaM HI, HUd III. c+ колонии анализировали ;:a наличие внедренного синтетического сораг-htö (pUR 292dyo плазкиды), сихвеноируя по ¡'¿аксаму-Гилберту фрагмент есте с близлежащими сегментами плазмиднои ДИК.. Спквелс подтвердил по. е соответствие структур. Первичная структура не была нарушена ни б ко«; из вариантов набора фрагментов (схема 104). Б'этих плазмидах сик-тпчесхи" гены находятся под контролем регуляторных элементов гена с Z зкспрессируытся как С-концевэй придаток {3-галактозэдазыЛ.1ети-пяивый кодон, предшествующий геяу пептида (последний не содержит cito: инохпслоты) позволяет отщеплять пептид от остальной части химерного лка действие?/. циалогенброг/яда.

Б качестве альтернативы расщеплению химическим путем га синтезкрова 1нкер, кодирующий сайт энтероаептидззы Asp¿bL¿, ао которому происходи' :еш4ическое расцепление де^.ствизгл этой прстеа'зы, В дзухцепочечнои плекса 229 i/.етилл только верхшго цепь и лигироъали дуплекс на сгмого •ол ио половинному сайту iJal Ï. Ii результате образовался сдвоенный .шсер - пали.чдрокни!: дуплекс £40. • 11олинуклеотпд встроили s рБВ 322 ш йту Eco 1(1 (ликвидируя сзЗг) с оЗразовгниеа содержала!! половину сдво-ного линкера рЗВ плазмиды. Небольшой S.al 1/Hi.nd III ¿par-

нт последней зятек перенесли в ялзр?.:иду pUR 291, обеспечиаа^дуя лин-р и синтетический ген фиксированной рамкой считывания. .

Целевая ллазмида pUR 29lE¡.n-cíun сод t. скит в виде единой структуры reí галсктозидазы с срикикавиглу. к его дас..сальному концу энтеропептидаз-сайтом, кегионшовьъ'. кодсном,одним из чаоора генов дкнорршш или о-эядор&ша. Такое построение обеспечивает возкокнссть отщепления одукта пскусстЕекного'от остальной части гибридного протеина двумя элнчиьщз катодами или же в дв/í приема, о ьодстраховкой: отцешюняе« ачхла действием витеропеигидазк- i:, после его очистки, окончательным одчищенкем" Я^-конца путем удалепгл кзтаокане даЦуьшх бр^мина^з.

ОСНОВНЫЕ ВЫБСИ

• I. Предложен новый способ модификации риоо- и дезоисирибогуенс»-зина (в дальнейшей - (дезокси)гуанозжна) реакцией трккеталсилил-

илк игобугярилпроизъодннх (дезокси)гуанозина с фенЕлхло^тас4юсл31-

атом и-затем с алифатическими спиртами. ¿Знервые получек рад ал-

т;

килпооязводннх (дезокси)гуаяозша (сОЦ (П = ОСН^, ОС^Ид, ОСгЛ^, ^14%°* ^15^33^' игращих х>сль глугагенного, канцерогенного факторов в нуклеиновых кислотах (НК).

2. Исходя из фешлэтанола, уЗ-нафтола, п «¿-аминонафталина виер~ вне синтезирован ряд азокрасктелей, содержащих ^ушшиокализованиуь» гвдроксилом углеводородную "ноаду" (О^)^^-, т.е. ^д-замеченных спиртов, для специфической 4-0/б-0-ыодидикацщ5 нуклеиновых оснований. Данными спектрального анализа показано, >что: '

а. из двух возможных (кетоггтразо- либо аэо-)шорм получешшм красителям следует приписать азоформу (азоешл, азоаши), в которой ОН-грулла связана с азогруппой через щкличзский шестичлеякай хе-латный комплекс сильной внутримолекулярной- водородной сгяйью;

б. псогошрование в уксусной кислоте 4-а1/_ини- Г(2-г.1дрокспэт;1г|)-фенилазо] нафталина, содеряащего аминогруппу, протекает со азогруппе, с образованием азониевой формы - граничной резонансной структуры с разделенным зарядом, делокализащя которого в рамках азониевой форш Еозыокяа ы сопровождается наблвда&мш в действительности сильным батохрошкм сдвигом (444 —»-555 им), углублением цвета. • •

3. Реакцией полученного сочетанием диазотпрованного 2-(н-аш-нофенил)этанола с ^-нафтолом красит-ели - 2-гвдроксн- |(2-гкдрок-СЕэа'йл)фенилазо]нафталина с , б'-триизсбутиридцезоксигушо-зипоы, даотилазодикйрбояевнм эфиром и трифенилфосвином впервке получен мсоафецхгеаниаа но аолояеша '6 молекулой езокрасысли гуакоз;;а, который преобразовывали в соотаетстнувди ^-сл'нтон-

чь.

-ляномер ¿-осфотрпа^лхного олпгонуклеотидногс синтеза. С цоыадыо аосдедг.зго осудчсявляли введение в олпгонуклеотид цветного i«iy-jtepu • f, наживных этапах олих-онук^еотидкого синтеза. Связывание остатка £мокрасатели с нукдеозидом не непосредственно, а через "нохку" С^!^ подразумевает воапойлость сравнительно ¡.лгкох-о от-цеолвгия этого остатка. но иеханпзыу уй-э&изпйцюванпя.

i. Ьосяедователани.1 Ы~изс6утир£Л1\ро:.шием, о'-дшетокснтрити-лкроышаеч и 8'-'¿осфорлдгроьаяц«»! дезочсигуапсзинов, аикилпроьан-ьых ьди^атически.; радшшлом G}® (й = ОС^Нд пли OCj^lf^g), лиоо остатком аззяраситедя, впервые получены полноотъ-и защищенные. б-О-ашсодезоксигуонозш^-Б'-^лос^тц - Ц-синто;ш в t¿ : э^црнсД! олпгонугслеотддного синтеза). 5. йас^ютризфирнкк методом в растворе виерше.сшиозпроьаа ряд .е«докс»г.т<?«екгаряых дезоксадекгнуклеотидоь с ойцсп фораддой (ФЦ^'ССИСС и rCÁÍl8qCOTq¿ (субстратов Bsp I п Паи ИХ • лзотазоыелэв .экАомукдеааы рестрикаш), содорзшцдх шч портальный, какоьичосхлй (К, R' = ОН), так и шдпЛпшроьашшИ, резистен-т;шц- (R, HJ = 0С4НЭ или OCj-çL'gg) Eae IlJ/bsp I-cain v&CC, в Koropoi.í внешний. (Sj^), внутренний (Q^' ) - либо-oca гуанина )

участка узнаванил заы^неш на б-О-адкллгуанпн. - .•:'■

и~ Изучено взаимодействие снн^ерцу&вьляых .олигсдезокснпуклсотн' доь с нукле&заш: £осфод»&с5ера?ой згжияого «да (VPÄJ) к эвдо~ нукчеазиш рестрикции Bsp I u Hau III. Показано, что ь то время, как коатрслькыЙ, cydctpat аориш>ио гидроди-

зуетен куклеазам»-:, вззАеале алкильнсд груши по положении 6, как •i следовало оаздагь, силь::о сшааез реакщоцчув сиосооность сус-стрс:тоь; заярудкиет ггдроща VPßÜ и -дояцостьи шдавляет рестрикция эндон,укл'сааа.ми.'.Яалич.а в главком иелобс- двухспальной oïpyi туры деухцедоч^чкого додбксе ооъе:,истого б-О-аяки-чьяого замести-

геля препятствует необходимому для образования продукт:¡вногс ферменг-с.убстратиого комплекса сближению л сайт-спешфичестому связываки.'! фермента с ДЛН з области участка- .узнавания, ь результате чего шдкшцироваякые елигокуклеоадш утрачивают способность слугить субстратш-и 'куг :еаз.

7. Реакцией гликозплирсгания 6-нптрокндолииа 5-тритилрлбозой синтезированы 1-уЗ- 2)~рпбосиурансзлд- к Э-ркбошц-акозид б-китрошщолша, дегидрированием ксторкх цолучени соответствуйте рибозйда индола - тридеазааналога пуринов, фуранозиды 6-нитроин~ долина и индола впервые преобразованы в соответствующие синтоны. олигонуклеотидного фоофотрпофирного синтеза. Благодаря интенсивной окраске индольяш спнтон непосредственно г,;онет быть пршенен для яерадаоактивного мечения олигснуклествдов., ,

8. Реакшей рибознлирозания 4-нкгроанллина (двзоксп)рпбозой впервые осуществлен прямой синтез (дезокси)рпбозздов 4-нитроаш-лина (опрагенк в желтки цвет), восстановлением которых получены соответствующие 4-аг,шцопроизводные. Сочетанием диазояиевых соле:Ч,-

■ полученных из 4-ашшс>производных:, с уЗ-н^тол^м ы^-найтилашлом получены соответствующие (дезокси)рибозидн. Показано» что:

а. полученные путем последовательного З'-даметокеитритилирова-шя, 21.3'-ацетилирования, детритилпрования и 5:> -фюсфорилиро.вашш 5'-фосфагы рибозидов -й-яитроанилика и азокрасцтелей возможно использовать для 5'-мечения синтетических олигонуклеотйдов поело завершешш олкгонуклео медного синтеза;

б. для функшонализации красителей дезокспряда иХ также можно 5'-дшлетокситритшировать, З'-фрсфорилцроватъ и использовать в

качестве универсальных синтоков олигонуклзотидкога тряэфирного

>

'синтеза для 3'-маркирования олигонуклеотидов, яа начальных этапах олигонуклеогадюго синтеза, по мере наращивания оллх'онуклеотэдяой цепи в 3! 5'-направлении;

( 4о.

в. о?ш ыетодои апоувие пслучыш цветные ыаркери, исдальзо- ' ванне которых дает гозшадость'на вдохяшвш всего синтеза работать с окрашеншмп зретар&тадщ олагсяукпооглдов, что существенно облегчает виделе.ше промежуточна продуктов гэдкофазкого олигокукчеотпдкого сшгоза. Для ухеличеяня интенсивности поглощения в сдигонуклеотид зозмозсно вводить неограниченное колмчес-1)0 остатков красителя (шэаестиеняое маркирование). При первом прн(5ллж21:;1и величина аогло4екйя находится в -линейной зависимости от числа маркеров...

&. шг;р!ие осуществлен круяномасштабшй синтез слкгснуклео-11 1 т^дотпоатов: ' ;

а. используя триэдафнаЛ жидаофазный подход сантозл^ованы; пол-¡'о'ть'о зшы:1е1цые'Д';а:ь'рнау-'гетра7.еукые нуклеоткдТдатжоатные блоки (к .•.:/ат.1о.г.лрнцх количествах) и октамерние дитиоаты (на заг-руоках порядка 0,1 ымш>). ; " -

с. те^ративнш синтезом по методу "жидкой твердел фазы" -т.к. ..ошльгуя в качестве иоллглера-косктеля нерастворимы;', в не-нсляряих-, до хорсв.о раствори:,шй в аолярннх растьори'гелях мояо-ыетиловай а^-нр полиэтклояхулколк (ПЭГ) - получегш октакуклеотвд-дитеоахл л С?Т^> £ ыасыхи&ис соответственно 0,02 и.

0,1 шсль.

10. Разработан новый способ очдсткл синтезированных твердо-#аОбС&1 ые'содоц оди<гслул~еотадд*»тиоатов, включащцй в себя: отщепление от носителя X Ы воднз-сяиртовш растворог. 1лаОК, осуцеетылацое без затративашл ¿гидогах групл л адсорби^ошуз ¿сосматох'ргфш на саликагике; полное /<ейяоа:роганпе, т.е. удаление дахдорбензильней зищгы меанукдеотидного фосфодетиоата' действием ткос^едола, дж^м [ЩеО)^'^ -группа, по келаншэ, удаляется шд сохраняется до. сэследаей сту^я очаемзч е, наконец, для оадчшера ¿ез защит - оораадашон^аэсву» хро^атогрч-^ю

низкого давления на силшсагеле элкируя градиентом конны;-трации ацстоннтрмла в ОД M гриэтил^мониШикарйэязиюм оулеуе (ТЭАБ), рН 8,0. Показано, что:

а. предлокешщи метод не требует использования дополнительно ыешпровашшх носителей, Cjg-фази, заводских условии набПЕКи хроыатограсрпческой колоше:, высокого давления;

о. в один прием на колонке со ЮОг с:иикагеля Gjq ыоано очистить до 5ü I.JP окталуклеогвддатиоата,

11. йосфотриэфирным ¡эдкофазнш методом впервые синтезировали частично комплементарные додекадезоксинуклеотидц AtJGTAATCGJATÇ

и AAÏïCAÏCGjâTA, а также декздезоксииуклеотндо AAÏTCTÇCAC н САТССТЦСЛЦ. Эти олигонузелеотзды попарно составляют два адаптор-ных дуплекса, один из которых (первая пара олигонуклеотидов) содержит сайт Cía I и половинные Eco RI- и Hind III-саита, а другой (вторая пара) содердат Psil-сайт и половинные i'co SI и lamHI-cafcra.

12. Впервые .осуществлен синтез олигодезоксинуклеотидов (JCCAÍj^< AÏT и GJAGCCCCA^GJATT, комплементарных (за исключением нуклеинового основания 6-го звена - для декамера и, соответственно, 10-го звена - для теградекамера) участку одноцёдсчешюй JÍHK бактериофагов J J и ЩЗ, расположенному в конце гзна УН, перед началом транскрипции самой короткой , иРНК, кодирующей основной белек оболочки. С помощью этих олиголуклеотидов осуществлена

т.рансж^сия Ц —>С нуклеотида II9I даговои ДНК (нумерация ШКрм MI3) и в результате в этой точке генерирован, сконструирован уиеток ОДТУС, который в составе двухцепо'чечноц ЛИК узнается и специфически расцепляется эядонуююазой уесгрикщи Ьсо Ш1 для конструирования рекомбинантных ДЦК, содержащих кксокогодектив-иын ibûKOTOp. IIjjîi этом оказалось, что декамер вообще не спосо-

Они оОр^зовыать дуетенс, ?огда как тет*)»декйщр талой дуплекс осрцаузт: двуз'ьеппчеадьк отрухгл® последнего способна служить eyocTjJctto:.'. эядонуклеазн реитрыаша ¿со BII и рестркцлруется ею.

13. иос^грюфиршаг гшдкодлзню. методом впервые схштезнроьаны, i:0iUUfc30Kci,nyiwie0ïax MÏÏU^'i'T, четыре звена которого гомолох-пч—

т

я» участку 1-4 д^слхеьои îPhii , и укдехадозоксинукдеотнд UîÀ&jAAACJlj, 10 звеньев .которого колашкгептиркы участку 1-10 той лсё тРНХ. Этд ол.и'оауклеогпдв вместе с додекадеэохенкувлеота-ЛЛХ ШСС'^АСЖЦА. и ТСЦ'ГЦ^ТСГА^Т сайты ирц поковд ¿КК-лдгазы бактериофага ¿4 с образованна-« 21- и ¿¿¡-зленных олпгонуклеотк-дов,' структура которых доказана методе;.! 1&ксама-йш5ерта. Синтезированные ол..гсиуклеотлды составляет 5!-кошгевой-щ.агаенг . VaT

Гена тРЛК , wewuib полошкный рестриктазы Eco -HI и выс-б-звешша конец для скцьашда с центральной частью гена.

14. ]\!ад;фиадрош сегмешгшгй метод олитонуклеотшшаг о типофир-' кого синтеза. Синтезированные ьлерк>е а'агодвзокишуклзотпды -

пакшлоьаин для коаструарошая структурных генов оерки олшатнда *

пептидов дняорфдясв д нео-звдор|рш4ов. ДНК-:.;одулн со структурой екгаалов транскриацш, трайедявдш к тергакаши белкового сак?еза , (стои-ойгпод) скаЗкаат с&онетруирозакше вкерше наьи гены рагу- ' ляторкыгла елеыенташ, узнаваемая синтетдчесл^.: аппаратом клотяа. Гены даоинрованы в пяазмвде рШ £22, редвонлроэана з планидах pli H 291 a 292 и экспрссскрованы б качестве С-тер.-.^хкального кон::£ единой шленды шбрддкого белка. аепткду кодон.

кетионлка служат для швдл^цця из гибридного белка путей

спецхфичезксго химического раецешилцш, той ке задаче служат '"■линкер, кодаруй;;:.; сищфршсклК энтеропент.и.азшзй сайт для расщепдешя биохимический ютадои. Ь результате экспресс-ки скоаструцроьаыщх наш сднуе?.;ческ1Х генов осуществлен бактерк-. a&tiàîi скитез. оьохд^тчесхи вгасхах компонентов гивых организмов, мало доступных ьз ecïtfUîbCiiHibc источа,::-. с.

Abstract of the dissertation. Synthesis, procedures and compounds c scribed axe reported hers for the i?i.r33 tine The following rj.iults arc obtained (suEicery):

The now method for modification, of 6-O-pccition of (<1 c oxy ) gu ano o ino has been proposed and'serie's of G-O-alJrylsub.itituted (deoxy^cosrio-ainer; (dooxy-and ribofjuanociiics) of potential careionogenie and nutaGenic activity havo "been synthesized by tho reaction of (dooxy)-guanosins with phenylchlcrtbyofcmate follov/ed by U-icobutyryJaticn, 5'--diaetho:xytritylc.tion and 3'-phosphory1ation. Ths fully protiofcnd 6-0-3llsylguanoDino-3* -phosphates thus obtained are versatile C-unita for tho oligonucleotide phoophotriestor synthesia, A nunber cf azoic dyes, f'irnished v/itli ¿zl extra group - so called' "carbohydrate linker arc", that ia previously X'uactio.ualised with hydroxy1 - yS-subatituted alcohols, otherwise, with OH-group npaoed by short non-polar (CH^J^-group - have boon synthesized on tho baaos of phenylethar.ol, yS-naphtol and «¿-ajiinbaaphtaleno for nu0l.e0bs.303 ¿j—0/6-0-nodification:

a. The spectral data cf compounds allows to ascribe, attribute to obtained dyea of two po3seble (cetohy&razo- or azo-) fona - the latter - asofom (azoenol or aaoaisine), in which OH-group ia attachac to the azogroup by a strong intramolecular hydrogen bond, forming a cyclic six-itenbered conjugated chain1;? complex.

b. It has been shov/n, that the, azogroup of 'amino- (2-hydroxy-ethyl)pheDyldso naphtalene'is supposed to be reapotisible for proton binding in the acetic acid medium, having the limiting structure

(in azoform) with the separate positive and negative electronic charges, the delocalisation of which i3 here well possible (being impossible in amnonitua form) and provides stabilisation owing to the conjugation., contributing to the actually observed str.<jn<s batochro-mic shift («4 55) s deepening of colour.

Employing 2--hydroxy- (2~hydroxyethyl)phenylazo naphtalene (azoic dye, obtained by the coupling of diazqtiaed 2-(p-aminophenyl)0thanol with 3-naphtole) the. residua of dye molecule has been introduced, incorporated at the position 6 of guanosine through the.reaction with diethylazodicarboxylate. (asodicarbonic ester)» and triphenylphocphine. ana it has been transformed into the versatile G-ua.it for the phoaph trioster oligonucleotide synthesis. Ibis procedure involves, implies derivatiaation of tho'nucleoside with the dye iioleoulo beforhanj.. pi'e lininarily, prior to ths incorporation of tho first into m. oli^onucl

»tide. Coupling;, connection of ar.oic dye residue to the nucleoside lot inacdiatoly, directly, but via the "linker, spacer am" (Ctig)^ .npliec cnc poss3.bij.ity of cleaving it (the moiety) in conparativoly liid conditions by the yS-eliaination mechanism, 'ariouo fully protected 6-0-alI<yldeo^yguanosine-5'-phosphates Mf;0)2TraG^p(0)C.PhCl)OCEtCH> (versatile G-units for the oligonuc-.Mtiàô phosphotriestor synthesis) have obtained through the

luocesaive H-ioobutirylation, J'-dimethoxytritylation and J'-phos-ihorylation of deoxyguartosineo, alkylated with the aliphatic group iR )(R = CC^Hç or OC^gHjj), or dye residue.

i series of self-coapleaentary decadeoxynucleotides CGTG^G^CCACG ad TCAG^GCCTGA, (that are substrates of endonuclease's Hae III and (sp I), containing the normal, canonical (R = R' = OH), as well as ; lodified ¿aid resiet'ent (T<, = OG^H^ or OC^Hjj) Hae ÏII/Bsp I

•C'Cogxiition site, sequence GGCC, in which external, outer (GR),

i> 1

jicide, inner (G ), or both guanines of the recognition site are

•eplcced for the 6-0-alkylguanin<a have been synthesiced.

ho reactivity of the synthesized oligonucleotides has been tested

snploying the snake venon phosphodiesterase (VTDS) and restriction ■

mdonvcleasefi Bsp I and Hae III. The control (standard) non-nodj.fied

Lecanucldotid33 are normally digested with the 7ÎD3, as well aa with j

Ssp X and Hae III restriction endonucleases, whereas incorporation

if the alkyl group at the position 6 of the guanine(s) reiaarkably

Leoreases the reaction ability of the substrates : strongly inhibits

;he VPIXS hydrolysis and coaplotely prevents the digestion v/ith the

¡ndonycleases. The presence of bulky 6-0-alky 1 substituent er-rposed

.nto the Lajor ¡prouve of tho double helix structure of ths comple-¡entar;/ complex (duplex) prevents the enzyme and DTÏA molecules froa

tewing together and sito-specific binding at the restrictase recog-

lition siio to foa a productive easyce-aubatràte cocplcx; in con-

lequence of this circunstance the modified oligonucleotides lose the

ibility for serving as substrates of Eae III and Bsp I enzyues, 'dis-

ilacexent of nucleosides within the canonical sequence discriminates

;uch constructs as substrates for vrdonucleases.

iy the glycosilation of b-nitroindolim with 5'-tritylribose -

i-ribofuranosl is and 1-p-D-;-ibopyranos,lde of 6-nitroindoline have ioen synthesized; the a<-:hyd; ocenation of the latter converts thei: nto the corresponding ribosides of indole (trideazaejnaloguo of purines). Puraaos.idea of- 6-nitroindoline and indolo have been trano-'orned into the correo\>ondiu:. v.-rnatile units fo" the-oli^or^iolr:. ,:icp hosphotrieeter oyathesis, indole sucl-ccide thcroapcR -„V ; ,';• '

b

fit, valid for non- r a>li o activo laacllir.j of oliconuoloot-doo, duo its intensive colour (though, lability to acidic .^oa^ont-j restrict its applicability).

3. Tmou'; : the ribosiiaticn of ¿t-niiroraniine with (deojovribcsf- the

direct synthesis cf 't-nitroanil.iu (d'.ioxy)ribot;idos (which are ooio

red yellow) has been carried out with the subsequent ; aduction,

resulting in. corresponding, 4-aninode:>ivativen. Alternately, ribosi

of IT-acetylaniliiie (1>T-acetyl-': ,^-diaLi.aobeuier.o) has been, obtain^

thresh the ribosilation of the latter v/ith 1-0-acetyj-2rjJ,5- tx'i-O-

£

bcnaoyiribosG' it has been shown, fchou~o, that the raoval of H-Ac-protecting GrouP preceded by the rjlycooidic bond cleavage.

By coupliajj of diazo saV;o, obtained from ^-aninodori'-ativeu vri ft-naphtole and ei-nophtilaainc; tho corresponding (dco:cy-)ribo3id< of o.zoic dyes have been obtained. It has been shw.ii, that:

a. By tho consecutive 5'-dirwthoxytritylation, '¿' ,^'-tt^p.tyl&ti( detritylation. and 5*-phosphorylation the ribocidea of 4-iu.trocnil: and of azoic dyes can be transformed into 5'--phosphates, that bavi be'en used for the ¿'-labelling of synthesized ol" Tjonuor. 30tides (1; belling after the synthesis is over, "post-assay labelling".

b. The dyes of deoxy series can. be functionalized through 5'" o±raetho:-:ytritylstion and 3'-phosphorylation, where jpon versatile units for the oligonucleotide pbosphotriester synthesis have been latcd. The latter have been employed for the J'-J&bellins o_ olig' nucleotides'(at the first step of oligonucleotide syn.th.esi3, in c urse of- the assembly of oligonucleotides): The coloured ¡aarksro h been obtained this way.. The application of then nakes it possible have coloured oligonucleotide sanples (meterial) throughout rhe « 'ie synthesis - the circumstance, that significantly facilitator t ciir-onatographic isilation of intermediate, intervening products c oligonucleotide liquid-phase synthesis. She unlimited, number of d residues - markers can. bo covalc-ntly incorporated into tho oli^on otide for the- intensification of absorption, if nesaosery (multip labelling)..Roughly, a linear increase of absorption, thus detect sensitivity, is observed with the increasing numoer of markers.

9. The large scale synthesis of oligonucleotide dithioates has been carried out:

a. Using the triester liquid-phase approach hi^h purity ft protected diner-tetraioer dithioat blocks (in rsaolar amouKtiO and ta&er dithioat (in 0,1 ffimol amount) have been obtained.

b. The i^rep.- "aeivQ synthesis, using thioanaaite f-.pproach has t performed to give 0,02 and 0,1 oaolar araouato of ootater. ditluoH!

t

^(¿V,) and O^ïCS^); the nr.v tb>e of polyner support (pclycthylencli-col noncnothvi otht?r (ïb'J) ), t'vxt ic insoluble in Eon-pole.'-- solvents but j.'j wo 11 .¡oluV.le in polar ones (rolorred to as e. "liquid solid vhuxe nupporv;'0 bus lioea utiliesd, applied to pcrioxa this, synthoçi , ¡The vi^hod. 03.' purif'!cation for tfts jliGonuciootido ditiv.toatos, athosirod b;y the solid phace approach, has 'bee:: proposed:. the oliço-nucl >::tidii to,-1 rœol) is first closvod b;/ '1 "aOH '.v.rter-alcoholio solution fro'a the poiyac-r support (all protecting groups are ooti-neryecO anil purified by oilica^el adoGrbtdon.^hroj.atoiciMphy. tlext, it ic fully dcprotoc.-od ( (IStOJglr-v'croun can to consorved or leiMvcd -.'.ill tie laat stop oX jwrificavion) taxe isol'sted ic;- its larg

0.1ala reycrcc--ph;i'jc chrosatocraphy on ciliogel C^g in an. ordinary glass oolxitx., vudttc gradient of acjtoiiitrilo ir. 0,1 IS S2aB. 50 a- of ccxanuclectice dithioate car.be purified on 100 g silica 0,,^ by a uirrlt chi-w:afcc£xcp]'y.

a'hr oli?;o.iuoleo bides cAGCMAa-C-GCTG andrtlAïTCA5D0GAÎA as well as ûAAïîCXGCîAC and dGACCQPCVoCAG have been synthesjsod by the pLosphotri-acbcr .ipproach. Tho nucleotides for« two adaptor duplexes. One of tber (the first pair) contains Ola X-eite as. v/oll jj Eco i and Kinc III ktJ.i-ait'js, and -ar.otner (the second oaii ) co.itau.iiG cite and Sco KI and Cou HI balf-cites. , DoccdooxyriboausZcocido CCC.AGGGaTT arid voCMdocadeoxyr-iLcr.v.cJ c-c tide (»ACCCCOAGGGASI* liave Tjoon cyncfcesis'id by tho pfcosphotriss:tr>r lintu.4 j?hasi> approach. ïhO'.se oligonucleotides aro complementary (escort fo: tho nucleoli «sssa oi' S-!;h link of tho decaaer ar.d 10-th lirùc of th<> t< radecwaer) to the region (r.ite) cf related phases fd and VA3, thut -located at t„c temird. of Gene VII, before tho start-point of the tranucrii>tioa or the shortest œBHft.,. coding i'or the basic calcul protein. of tho phaco. (I'odel of a target- HA and the addressed oligonucleotide).

licking use cf tho oynthosi^ed oligonucleotides tho vran"Vort':.on, chairre G—C of uuclsoxido 1191 of phage TS-TA (KIJ pha^o nucberir£) • has been, perforaed, generatins, creation the sequence Cj'^tgc-, in double stranded structure of T'IA bein- i ocof-rn.rc-d and apcoifically cli ¡rvid by the restriction eadonuileaso Itoo AH (to construct recoa-'oi-

1.ant .'OKA, containing incorpora-ei strong promoter). Kcnadeox,''r.uc.lecJ-ido ¿»wVPSCOGCT ozA undccadpoxynuclôotide d^pCCAOGA. ACGG ht.ve boon nyntheaiaod by 'be phorphotricster ct>rio--ich. Kicco oligonucleotides iogetil^r V/i^h .'>i:t Z-'otiv'.'C r'yj.OCC-. \ :,.:;.. ïCKK'CïâG-T v/erc li;;ated 'vicb 1-v .'liiv-.ca to jiold a .v,-:

whose .îtructar-ïa -hav » k'.;. rrcv:;. :

c

V

aad by the codified liajioa-Gilt.crt aethod. The synthetic duplf/ coi espendu to the nucleotide r.equon^e 1 -16 oi the yjnat t!UIA • efc: fcuxal gene and contain.- an 3uo HI hslf-cito c£.a protruding or a fo: ;ioiniK.; w:.th a cloning vector and tho central p.irt of the gcir. ¿>eotivoly.

Hcfpnont nethod oi oligonucleotide syntheoif. by th'j plionphotriestu jipproaoh has been modified. Oligoiruclootide.g obtained b? this mo vere employed to construct s true tiara?, genoa of a series of opioid peptides dinorphins ' and nso-endoxphins. DIM no Aula with fcranccr tion, translation and protein synthesis termination. (stop .<;ip,nal) structure (sequence) provide ¿jenes v/ith the regulatory elemeato, that are recognised by tho'ooll enzymes. Tho genet., cloned in pE: v. ore recloned in pUH 291 and 202 plasmido and expressed an C-tern part of fused protnlr.c. A. methionine codon preceding tho peptide Ceno. and linker coding for a specific entsropopUid30« sibe allc the peptide1 to be selectively out oi'f the rest of the hybrid pro! thus leading to the 'bacterial synthesii.; of the biologically itr.poi constituents of higher organisns les3 avail able fron raturuil goi

dfXioa^n HOQJdOdO

1. s^co^jsjeod rtoin- pdS.ijkortoamaodenSn&ofa -■ (^«i o'tin )$yjenSr,6r> f>"0-d$&mJvirtJ^iodviioQff djamsn. Jd .^.J&iiyffjprjC» ¿-ioS^ffli bocne- oS nanbcfiarjpcdjpcir.Qoli C>o-t>dooocs SqQq,

(¡Jrrtt$c&ct>&6} dnaodciQO

fioao ffofrjrteo 503050 dqR (R = OCHgi* 0C4H9, OCyKjg.

0Cj4ligS, oCjgHo>s<i6<ii)j6oQd£h ejdcooeorojjso^ &je<3jeocr>ajGo J*

2. 6adQ005dtf430&0ti Mjovpnjfo 4-0/6-0-8r>£">gnjiianait 6aS5oo> soCoejitdi COQJ6 3nV30Q4QM £¿33045 C<i,j03Bcxlo<io?o 6^0^300 Jo^nJbnQoh 80dQ30Q0 vi67 fi-g tfiQ&oOtxr, M. 6otn H(CH2)20H teodS'teQafa JSoooSob dnSoooSoS,oqa6 ¿^Sr.egotTort.-J 5oA

find'. ' • .

o) ¿Snli^QifSoSn ¿fab c,8ngr)rt6ob (jMoai ny?) ¿¡(",3033

Joer}o8n6aQn goMj). JnQfin.jbCQn eJjJSFnno&zzM dSdjcajSaoS

.jrto pyjc;tdcai po foridvdeenb QOJQ3II

COiSJrt jnQjQQjCili. •

S) eC&iiJSo <i8()6njis3gnl} ei^asxn

Jrtr^me-^oao tsp^ao 06^3,7^, ddnso^9i>b snidnb -OtOJWoQxOjSGMfa fioSrSstSlijQO ^OdS^-li PtfiSngeenz. Oryiy

w^joc'o^oeco, ondoc<-j ndsosngo ¿evonjd&inscii fiififiio&sn

¿rtlVJôx>n so'>v.'3ôêo idZ-.y'X-M ¿oS-r-íWjja.» K&íqtoíq

2i?r> oc>'~7*o Sojn~ícr>>¿Cc-5C>5í': <a (444 —'"bíió fTíJ), Ыу'Осг.г'Ь &jKob <jú

Crtív/^.'.r;.

3, согоо^-,; tfob-jí'fi 2-{^-¿Р.^/г.дс!>;> ).3®oerç>ot. fJ-r-'o^scwC

<-" líff,, "¿г ro 2- Y,cftn-{.' ::re,t'y e5eço.To,

.!..-;'■ '¿¿¿Ьы. H,íí' > b' -^'«'îrA-.^o'îf.CiPCÎ!'' 5, oínpojo

i-úZ'.^rÁt a -joí r. Soc~o, ¿Ci •j.j.j.ff^Vf jo.o aortpoiôc-oc

0o И«*х)»р.гЛ Cfbn',-: e-crtzêor.Hn, rtséço'j

р-'-.л toíf.jrjSni» to^&oO ¿jiojjdíj,. ftí» Cro Co6r-t> 0¿J¿3m

CVAjJO'^^^S лЛоОсв- ¿-it àbr.^-^çoo 6n'¿>*¿0\C\l,¿)r

XÔ'S-"** fiozjri* í-'-VjoC3З0О twJeíVVpoO S/JÍ'-Á r.r.c cqp.cA3'

bns ЛЙГ< w'o-î.-îïi'ïô.-! ( Ji -QQCOcUCifa, }.

4- Ojr-'iW.^r; rto^ojocrv; (y -- CC/v- (i. ) JS 6oJf

^ v it- j^j

) ^C.i'Cft^TOïC» ci'-Г.r.u ( с/ ) .-.a, 'ooOS'jC rf-«?<£гЛг,?.•-.'•¿So:», íj< ro^.^v^'iitxí ЗгмлггЛ^о» 21 ■jo'Vc.': 'r/ii-.'J ;ri"V?',->i;vs.s 6n:v;íС^^вЗС:

íKf.; f^.ií.' q -л- '„'гГ-^Зо ).

O. <\'jOr¿na '"Y. -'Y^i r

oo liltici 111 i- '

dr.) JC'^cocj'/o, jiGKfíj?" > ( V -• i." - Ci:)" ¿o »V/CV?.?

С;оЗо";л , cCc;<^> bKt'fl^o'ijiSQr, (?,>';• - 03,1

Of 00« ЛЬ,«) ayw^.^ktfóa.'j-y-;}С<>

V- - -

oqTC,4í,* ссАсс rcAq-qccTqi, ¿••"•í-.'.г .V-Vv^^o t^of

¿•s^ i-»;1 í<fT'* / oáj. ^ooi iSnbj,^, тяж ¿yj'.rù'o '.с-'с,'"' ) oóoj.

0- ônz'QàJCO «Çoaf.-sjîWTOoôj^roYrî.^i.'i)

Sr^c,rr^J-lo^cb., (JPX

QC ßSf« 1 ÍN' hind '-11 o no "o'v^ff. .•'A^Sji.i,,, r

Cjj6j5f.il, fr. ¿.i '"c"> 'J-'J:

ßov» о^о-^г- ü^atoe^cc r.c^.r.y i-z.-ь-. и -jrc'V

со,:', go сл^р o~c--J'<¿ 'o'r'rj^^ o. Lob r,r.~.¿¿i, Oir.' 10C'0(J yol?

','Ob JS'J 'Г.:':*; r,S'ú^r.n C^ : :í

oí'/б ç'O-Zr с: er: с? ' j'-'-Oí-.'л'с'' j'^ri^ci-.i. "■.-■-■•"v ."7 ■ ■ r-*-■ : \ •--г.-

V. '>. ■" - . ; V' ~ - •■ 1• - .

г';>. Takt íikishvili W.O., Sai tskishvili I'.iC. Им phoepbot.vioster !jynthc3i в of oligodcoxjruclooti :1ез, containing modified restriction oitrp fcx -Oco Л1 restriction oadonuoleaao, employing phosphc triecters о С ohlordcoxj'.auîleo::iucs of rito-, araMric- ar.ü xylose аз olí jorucJmetido oyattioaia versatile synthon kits. ï'orld Cor.gre To'iauii, Hnaorial University of li'c.vl'oiicdlaiid, 1VS0, '!Й9»

26. 1 октгдгсыщла M.O.» Табдкуи А., Ярцева И.В. Синтез 6~0~алм;лг}' oiijici'L'x синтонов деэоксирвбо- i: риборяда для фоефотрлзр'»:р1;ого емв олигонуклеотмдов. Би.оорган. ».(.гия, ISSU, 16, У> I, F/J-63.

27. Знктак/иьилп И.О., Ьйцкишвали Т.К., Табд-лун А., Клколадзе В.С ллакпдзе Л..'.!., Самсони.ч [I.A.„ Бадридз«. М.Г. С/нтез' f.î-0-алкилиром го гугшозпиа и '[»рлбогкл-С-нпгро'/ндола и икдолиии для фосфотригури го слигонуклеотвдного синтеза, JÍ3B. АН ГССР, 1ЭУи, IG, lí 2, 20-20

Йб. Тиктакклаилк 4.0., 1$1цхлшвйди Т.К., Хикодадэе d.O., Сомоония Преображенская М.К. Синтез 1-б"£--*м5опиранозкл- и рййофур&ь":>5КЛ-6 интрспидола и илдслина для фосфотряо^уного олг.гонуклеотидкого си за. ХГС IJSH1, it il, I50Ü-1506.

23. Гьктйктж'лл М.О., ТаОд^.ун А. Слигодезоксинукл^сíиди, елдер'ла б-О-илюш^о:<аш:иЯ по гуанину участок узнааи;:», эядс£уклеиг>; ЮЯ Ufe J XI. Кйоэрхин. х;'.::;!Н, 1901, 17. .'i б, 8CS-808.

30. Тактам 1*51 ли М.О.• '¿AixoLíaZM', Т.К., Ciu.:con/-4 П;.Л., иу'-'-орахе:; Ï.Î.H. Сангаз 2',3 Чзд-О-апэткл-арс'лззодгшх ркбофуракозйдсв :«л,\ол& шгдолина для синтеза 3'-:.,одк;::1и:рог;ачнь,к олкгодсзокс:яукл<-огидоэ. 17. Всесстиья конф. по хютл, окох.п.и:м :: •ичи.'.лно/.о?;;:: щ.оигводпчх индола, Тбилиси, ISbi, 1¿9.

у,. Ta^rtalcifihvili L'.C., Feitolciahvili Ï.X., J,;erbi К.Л., U.I, Azciu 'lytic. - a r.ev: virtion oí' ror.-rali oa-;tivo latollia^ ai' uuclcotido3 íor '.li¿onaoiootido Dyn.tb.sia. j'rococdl ne s с;' tho oea-¿eny oí' ccioaaeo of Georgia. 4 992. IS, HS 209-220.

3!*.- Тахтак;алькли М.О., 1&рузерс ?.!.£. Два подхода л круппо'.-.а-атаб;^ еялтезу o.T.troiiyicr.eoTUASit'DHOf^ïob. Еаосрган. хшом. 12, & 2,

¿11-222.

L'akfcakiahvili И.О., îidtskishvlli Т.К. Им phoephotr.iestor . ~ез1а of oligodeoxynuclootiiea, containing modified restric-oltos fer Eco RI restriction ondonucleass, employing phospfco-tere of chlordeoxynucleonici.cs of ribo-, arahinc- Mid xyloccrie »"igorruclMtide oynthoaia versatile cynthon kits. World Congress av.fi, Memorial University of lievifoundlaiid, 1989, -189.

],отг.:ц:ии::ли M.O., Табджун А., Ярцева И.В. Синтез 6-0-алкилгуано-;нь'х с и нтон о в дезокскрибо- и риборяда для фосфотриэфирного синтеза "онуклеотидов. Биооргин. IS30, 16, !i I, 53-68.

1ы:гак/.иы:.'и1 M.O., 1ц;цкш11вллл Т.К., Тасдаун А., Клколадзе 5.С., ivj з'.г .1.М., Самсония Ш.А., Бчдрадзе М.Г. Слнтез'в-О-алкиллрованно-'уанозака и 1~рибоэил-6-гштройндола и иидолини для фосфотриэ^ирнс-и-игонуклеотилчого синтеза. Изв. АН I'CCP, I99U, 16, Jt 2, 20-28.

Tr ктакииаилк М.О., Цицхиавилл Т.К., Киколадэе B.C., Самоония Щ.А., 'браженскоя М.К. Синтез Т-Ф^-рмОопиранозил- и риОофуракизил-б-;оикдола к инделина для фосфотриэфкрного олигонуклеотидного синте-ХГС 1.^90, .4 il, 1500-1506.

,. у.такииьхчи М.О., Табд&ун А. Слкгодезоксинуилеслчди, слдергад.е •и.:юышроы1иш2 по гуанкну участок узиазс^ш» ондоЕуклеай".- реотиич-йчо Ш. Unoojjïaii. xiïKnji, 1991, 17, !i 6, 8CS-8Û8.

Тактаjtai.ibK.Ba М.О.» Х&асиишкли Т.К., Са^соиая Ш.А., Пресох-агенская , Синтез 2'.З'-де-О-аиеткл-пропзводлнх рнбофуранозидов :'д\о.'.а и »липа для синтеза З'-г-здифихиров^ших ол^годезоксппукле-отндоз. »оесошшд коиф. но химия, окохлжи и фару, хкологи:: произвол!:?« >ла, Тбилиси, liai, 129. .

Taktakieir/ili U.C., Tsitskishvili Т.К., J^enti К.Л., Gudicvad^o Azoic dyoc - a nev; v-;rtion of r»or.-raiica-;tivo labelling of otid<:3 for cligonucleotide synth/. sis. Proceedings cf the sea-■)X' sciences of Georgia. '992. ÎIS

Тахтаккшъхли И.О., К&рузерс M.У.. Два :;здход& л к^угоошсзтьСначг ,'рзу олигонуклеотнддитиоатсь. Ьиоорган. .хи'.мя, I9.-3, 19, 2, •222.

Gl

¡оксикуклеотидов. Республиканская конф. молодых химиков, Сух у:.;, 1837,

'.7. Тактаюшвилц К.О., Табдхун А., цаякишвили Т.К. Дкн'зойутирилоксн-Лпленозая зэдпт. по кетогруппе гуаивка. Ресс. конференция колоу&х симиков, Тбилхси, 1287, 38-39. ' ■

[8.'Такгакиивили М.О., Самсония Ш.А., Чиковани И.И., Элашвали 3.IA. Синтез замещенных" жирно; .роглатичесхих углеводородов для получения сл& 4CTRX органических гетеросгрукгур. Изв. АН ГССР, Тбилиси, "М етыереО; ш.шя и химическая технология. 1368, 64-71.

[9. Тактаншвили 1.0., Самсошд Iii.А. Синтез третичных зцсшнх спиртов ii их тозилатов из эфиров карбодовых кислот. Всесоюзная кояф. пс цове. постно-активным соединениям и красителям, Ереван, Какавар, 1388.

20. Тактакшвили М.О., Цицюшшили Т.К.,. Табдаун А., Бадридзе Ы.Г.-Зинтез ркбозилиндол-3'-фосфата для фосфотршфирного синтеза олиго-цезоксинуклеотидов. 1У Респ. Научно-техническая конф., Кутаиси, 198 75.

\ *

21. ïaictakishvili 11.0., Tsitsîdshvill Т.К., Tabdjou: A., bamsonia

S h.. A. The synthesis of purin nucleotide analogues oonplietly protected б-nitroindolemicleosido-3'-phosphate: 1-(5'-0-(4,«.'-dJ.iaotho-xy)trityl-2' ,3'-di-0-aoetyl-ß-Il-ribofuranosil}-6-iiitroindolo. International Symposium, on the Electronic Structure and Properties,

of Molecules and Crystals. Zagreb. Yugoslavia, 1938, PDJ6. 179.

i

22. Тактаккшвили M.O., ЛебеденкЬ E.II. Фосфотриэфирный синтез олигоде зоксинуклеотидов - структурных блоков для конструирования генов опи-атных пептидов группы динорфина. Изв. АН ГССР, Тбилиси, "Мецикереба" 1988, 72-78.

23. Тактакишвили И.О., Табдаун А., Мамаладзе Л.Ы., Гудавадэе М.И. Модификация 6-0-кетогрупш гуанина фенилхлор.'иоформиадом. ХУ11 Всесоюзная конф.-по синтезу и реакционной способности органических соединений серы. Тбилиси, 1989, 167. ,' • х

24. Тактакишвили М.'О., Табдаун А*, Пааташвили Т.В. Синтез 6-0-алкил-производных дезокси- и 'рибогуанозина ж получение..на их основе 6-0-ш кодированных Gf-MOHOMepoB для олигонуклеотидпого синтеза. НУ Менделе евский-съезд по общей и-прикладной химии.; Фундаментальные проблема хишчездмх яасрс, Химия'в решении медицинских проблем. Москва, "Наук/ 1289, 223. ' - *'- -

SCfiQn Bjbrixo^JCOi* A3. bútSQQvbnb ¿/.cànçnbnb (x£(/Ç-

r.vp лб'о,30^0(50}00 rcßaoccxo ¿¡oOnc.b ¿¿t'X?»^ Qà О.Sodfhijfyt'r.l) ÔQQtânb fígboanb eoo6n£;'o&¿a¿ ¿jôQjôonh tf.Onbjnsrsb önnffiffaoffjtfo вооЬ nSb¿n¿j¡ün

п^п^озбс.пЗпбо^ВСр'о : ,jodnrjf> 6QQ6rjo6jZùa!ô Qr>d¡r,fío, МпзоЬпбп 5.bfcj^ñnQn ЗадпзП Gjo6oon,-)áóció QvfanrSn, 3ftr>£obnfín -—A-.^OQOfíág^ болсз^О" дзобекРдЭмо Qochnfm, bùjàiïacjQçnb' ôjùQOCnnb ífojilo, ojj?jCnjnbn n,by,odO

Qnüo^óo'joob Q¿o3¿ " Q " QjJüOt.fSb 1993 P. 1 '¡a.

_ »

7 /JoOooü Ssij^í^ojoü Joeo^fl OdOoaíínQíln

îoOOjôot) 6ntí5n3oájC bô' ''"koJ'-\5oüor bàbQvb >jfína> 02.00 П 2-1 bÜQn9¿&3

ónboOófízn: 3fíC028, bàjjrlinajçnb ñjbdrj&co.jó, oôoçrbn,

$¿a3¿aoúob ¿063. W 3, j^WjUo, . ц 37

c.,

bceooGoQ^ri bö^Qlii^Qor) bôt>$nb

oanaàôo, jfidn,-y) djo-cnjvoâjœô jo^Qoe^o, рлвэб^о

о. o^enb^cndj