Исследование структуры комплекса эндонуклеазы рестрикции EcoRII с ДНК с помощью биохимических и спектральных методов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. МЛ. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СУБАЧ ФЕДОР ВАСИЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ЕсоМ1 С ДНК С ПОМОЩЬЮ БИОХИМИЧЕСКИХ И СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ

им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель : доктор химических наук, профессор

Громова Елизавета Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

Демидкина Татьяна Викторовна

кандидат биологических наук, Солонин Александр Сергеевич

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 20 декабря 2005 года в 17 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 18 ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук / И.Г. Смирнова

<?/?0£ - Ч ¿3/7 9

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Эндонуклеазы рестрикции (ЭР), входящие в систему рестрикции-модификации в прокариотах, защищают клетку от проникновения чужеродной ДНК путем узнавания и расщепления коротких нуклеотидных последовательностей. ЭР являются удобными модельными системами для исследования молекулярных основ сайт-специфического взаимодействия белков с ДНК. Как показано в последнее время, среди большого многообразия ЭР (более 3700) часть ферментов при расщеплении ДНК взаимодействует одновременно с двумя участками ДНК. Изучение таких ЭР позволяет понять сложные генетические процессы, в которых ферменты взаимодействуют с несколькими участками ДНК. Эти ЭР интересны с точки зрения изучения эволюционных взаимосвязей между ЭР и другими ферментами, обладающими яуклеазной активностью (рекомбиназы, резольвазы, транспозазы, иэтегразы, и т.д.). Открытие ЭР, взаимодействующих с двумя участками узнавания в ДНК, в практическом применении позволяет разработку новых подходов в генной инженерии.

Объектом исследования данной работы является ЭР EcoR.II (Я.ЕсоЯН), существующая в растворе в виде гомодимера и относящаяся к подтипу НЕ ЭР, для функционирования которых необходимо одновременное связывание двух копий участка узнавания, причем одна копия участка узнавания (аллостерический эффектор) активирует расщепление фосфодиэфирных связей в другой копии участка узнавания (субстрате). Я.Есо]Ш узнает в

ДНК пятизвенную нуклеотидную последовательность ( у-*ССА£3° ) и за один

3- остсс'ж

каталитический акт в присутствии кофактора, ионов расщепляет две фосфодиэфирные связи в одном из двух участков узнавания в положениях, указанных стрелками. Как было показано с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) фермента и биохимических методов, каждая субьединица К.ЕсоЫ1 состоит из двух доменов: М-концевого (эффектор-связывающего) и С-концевого, содержащего каталитический центр (каталитического). Показано, что два каталитических центра, уяждый из которых отвечает за расщепление одной фосфодиэфирной связи, стерически блокированы эффекторными доменами. Сделано предположение, что вначале эффекторные домены К.ЕсоШ1 связывают один из двух участков узнавания (эффекторную ДНК), открывая доступ к каталитическим доменам. Затем происходит связывание и расщепление другого участка узнавания (ДНК-субстрата) двумя каталитическими доменами. В нашей лаборатории Бабкиной О.В. было показано, что аминокислотные остатки (а.о.) из обеих субъединиц фермента формируют каждую из двух ДНК-связывающих полостей Я.Есо1Ш в комплексе К.Есо1Ш-ДНК.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение ДНК-белковых контактов и определение взаимного расположения двух участков узнавания EcoRII в комплексе эндонуклеазы рестрикции EcoRII с ДНК.

В работе решались следующие задачи. (1) Определение контактов R.EcoRII с углеводофосфатным остовом и с группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке двойной спирали, путбм изучения субстратных свойств ДНК-дуплексов, содержащих в участке узнавания EcoRII остатки 1-ф-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)шггозина (dC,) или 1-(Р-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)тимина (dT„) вместо dC или dT, межнуклеотидную хиральную тиофосфатную группу, замещающую фосфатные группы, и остатки (+)- или (-)-транс-анты-бензо[а]пирена-Ы2кЮ ((+)dG* или (-)dG*) вместо dG. (2) Определение участка(ов) в R.EcoRII, взаимодействующего(их) с А/Т-парой участка узнавания EcoRII, методом фотоаффинной модификации R.EcoRII. (3) Анализ топографии двух участков узнавания EcoRII в комплексе R.EcoRII-ДНК с помощью изучения переноса энергии возбуждения флуоресценции между флуоресцентными метками, введенными в молекулу ДНК, содержащую два участка узнавания EcoRII.

иовизи» н практическая ценность работы. Впервые проведено зондирование контактов R.EcoRII с отдельными фосфатными группами ДНК с помощью изменения пространственного расположения этих групп. Установлен различный вклад отдельных фосфатных групп во взаимодействие с эффекгорными и каталитическими доменами R.EcoRII, что предполагает разные механизмы взаимодействия отдельных доменов фермента с ДНК. Разработан подход для получения аналогов субстрата R.EcoRII, в которых каждая межнукпеотидная фосфатная группа участка узнавания замещалась на хиральную тиофосфатную группу. С помощью этих аналогов субстрата показано, что не только гетероциклические основания, как было установлено ранее, но и большая часть фосфатных групп участка узнавания EcoRII играют важную роль во взаимодействии R.EcoRII с ДНК. Впервые показано, что в процессе расщепления ДНК R.EcoRII фосфатные группы, расположенные с 3'-конца от расщепляемых связей, принимают участие в координации ионов Mg2*, что подтверждает гипотезу об участии данных фосфатных групп в расщеплении соседней связи ЭР (Pingoud et al, 2005). Впервые с помощью аналогов субстрата, содержащих остатка (+)dG* или (-)dG* вместо остатков dG в участке узнавания EcoRII, было установлено, что R.EcoRII образует контакты не только с группами атомов, расположенными в большой бороздке ДНК, как было найдено ранее, но я в малой бороздке.

В каталитическом домене R.EcoRII, вне каталитического кора R.EcoRII, определена область 224VEYD227, ответственная за взаимодействие R.EcoRII с центральной нуклеотндной парой участка узнавания.

Разработан подход для структурного анализа комплекса R.EcoRII-ДНК в растворе, базирующийся на изучении переноса энергии возбуждения флуоресценции в комплексе R.EcoRII-ДНК между флуоресцентными метками, присоединенными рядом с участками узнавания EcoRII, находящимися на разных концах протяжённой молекулы ДНК. Предложена модель, описывающая взаимное расположение двух участков узнавания EcoRII в комплексе R.EcoRII-ДНК.

Разработанные в работе подходы могут быть рекомендованы для изучения ДНК-белковых контактов и структуры ДНК-белковых комплексов для ферментов, взаимодействующих с двумя участками ДНК.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты работы были представлены на 8-ой Менделеевской конференции студентов-химиков (Москва, Россия, 1997), международном симпозиуме стипендиатов научного фонда Медицинского института Говарда Хыоза стран Балтии, Центральной Европы и бывшего Советского Союза (Москва, Россия, 1999), на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2000" (Москва, 2000) и на международной конференции "Биокатализ-2000" (Москва, 2000)

Структур» и объем работы. Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список литературы ( 200 цитируемых работ). Материал иллюстрирован 38 рисунками и 20 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Зондирование контактов эндонуклеязы ЕсоКП с фосфатными группами ДНК.

Высокая специфичность расщепления ДНК ЭР обусловлена образованием контактов ЭР с гетероциклическими основаниями ("прямое считывание") и межнуклеотидными фосфатными группами ДНК ("непрямое считывание") участка узнавания ЭР. Ранее были исследованы контакты ЭР EcoRII с гетероциклическими основаниями ДНК, однако данные относительно контактов R.EcoRII с фосфатными группами ДНК практически отсутствовали.

ДНК дуплексы, содержащие модифицированные углеводные остатки. Для зондирования контактов R.EcoRII с межнуклеотидными фосфатными группами ДНК в участке узнавания EcoRII в пяти позициях 2-4, 8 и 9 изменялось пространственное положение фосфатной группы с помощью замещения остатков dC или dT в участке узнавания EcoRII на остатки 1-(р-0-2'-дезокси-шрео-пентафуранозил)цитозина (dC,) или 1-

ф-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)тнмина (ОТ,), соответственно, (схема 1 и табл. 1) и исследовалось влияние этих модификаций на субстратные свойства ДНК-дуплексов П-У1.

1 2 3 4 5 6 5'-ОССАА'рСрСрТрСрСр СТСТ З'-СОСТТ^СрС^АрСрСйС АСА

9 8

Выделены межнуклеотидные фосфатные группы, пространственное положение которых менялось; места расщепления К.ЕсоЯП указаны стрелками.

\ \

о—, с о—, т

О^ял Оллл

асж <ггх

Схема 1

Табл. 1. ДНК-дуплексы, содержащие остатки (1С, или сГГ, и их температуры плавления.

№ ДНК-дуплекс

I 5,-СССААССТСССТСТ З'-ССХЛТССАСССАОА 58

П 5'-ОССААС,СТСССТСГ 3'-С(ЮТТС САССОАСА 55

III 5 '-ОССААССДСССТСГ З'-ССКЗТТСС АСХХЗАОА 54

IV 5'-ОССААССТ,СССТСТ З'-ССХЗТГССА «ХЗАСА 49

V 5 ЧЗССААССТСС СТСТ 3'-С(ЮТТССАСС,ОАОА -

VI 5'-СССААССТС ССТСТ 3'-СООТТССАСхССАаА -

" - определены с точностью ±0.5 градуса; Сдае 2 мкМ, X 260 ни.

ДНК-дуплексы II и III, содержащие остаток йСж, имели термическую стабильность на 3-4 градуса меньшую, чем ДНК-дуплекс I, тогда как температура плавления ДНК-дуплекса IV, содержащего остаток (П\, была на 9 градусов ниже, чем у ДНК-дуплекса I (табл. 1). С помощью КД-спектроскопии показано, что происходит локальное изменение структуры ДНК, но В-форма ДНК-дуплексов сохраняется (данные не приведены).

В отсутствие ионов Я.ЕсоЫ1 связывала ДНК-дуплексы III, IV и VI (рис. 1, дор. 4, 5 и 7) с той же эффективностью, что и немодифицированный субстрат I (рис. 1, дор. 2); связывание ДНК-дуплекса П ухудшалось в 2.5 раза, а ДНК-дуплекс V вообще не связывался 11.Есо1Ш (рис. 1, дор. 3 и 6). Можно предположить, что в отсутствие ионов М^* К.ЕсоЯП образует контакты с фосфатными группами ДНК в позициях 2 и 8 (схема 1), расположенными с 3 '-конца от расщепляемых связей, и не образует контактов с фосфатными группами в позициях 3, 4 и 9. Возможно, эти контакты отвечают за взаимодействие эффекторных доменов Я.ЕсоКП с ДНК, так как в отсутствие ионов Мв2* эффекторные домены, полученные путбм удаления каталитических доменов из полноразмерной К.ЕсоЯН с помощью молекулярного клонирования, прочно связывают субстрат, а каталитические

домены, полученные аналогичным способом, практически не связывают ДНК при используемых нами концентрациях R.EcoRII и ДНК-дуплексов (Tamulaitis, G., and Siksnys, V., неопубл. данные).

Рнс. 1. Связывание 32Р-меченных немодифицированного ДНК-дуплекса I (дор. 1 и 2) и ДНК-дуплекса VII, не содержащего участка узнавания EcoRII (5'-

TAGAGCCGGTTGGC/3 ATCTCGGCCAACCG) (дор. 8), И ДНК-дуплексов II-VI,

содержащих в указанных позициях участка узнавания EcoRII остатки dC, или dT, (дор. 3-7) (Сднк 0.35 мкМ), с R.EcoRII (CrEcdRD димер 0.13 мкМ), 5°С, в буфере А: 40 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 50 мМ NaCl, 7 мМ ДТТ.

Расщепление 11.Есо1Ш обеих цепей ДНК-дуплексов П, III, V и VI, содержащих остатки ЙС„ было полностью блокировано (данные не приведены). ДНК-дуплекс IV, содержащий остаток й'Г„ обладал такими же субстратными свойствами (К** 4.6 мкМ, к» 3.4 мин"1), как и немодифицированный субстрат I 2.3 мкМ, ко, 3.0 мин"1). Следует отметить, что и эффекторные, и каталитические домены К..ЕсоШ1 образуют контакты с ДНК, поэтому нарушение ДНК-белкового контакта хотя бы в одном из доменов может приводить к нарушению расщепления ДНК К.ЕсоШ1. На основании влияния нарушения пространственного расположения межнуклеотидной фосфатной группы на расщепление ДНК К.ЕсоЯН можно предположить, что эффекторные и/или каталитические домены К.ЕсоЯП образуют контакты с фосфатными группами ДНК в позициях 2, 3, 8 и 9 и не образуют контактов с фосфатной группой в позиции 4. Однако по данным расщепления Я ЕсоЮ1 ДНК-дуплексов, содержащих тиофосфатную группу (см. ниже), К.ЕсоЯП образует контакт с фосфатной группой в позиции 4, поэтому, мы полагаем, что введение остатка (ГГ„ вызывающее наибольшую дестабилизацию ДНК, приводит к локальному изменению конформации ДНК-дуплекса, благоприятствующему изменению конформации ДНК-дуплекса в переходном фермент-субстратном комплексе и компенсирующему энергетические потери от нарушения ДНК-белкового контакта.

Для зондирования контактов между каталитическими доменами К.ЕсоМ1 и фосфатными группами ДНК было проведено расщепление ДНК-дуплексов II, Ш, V и VI в присутствии 14-звенного немодифицированного ДНК-дуплекса VIII (5'-

АССТАССТсетсст/з'-тсоАТССАССАССА), выступающего в качестве аллостерического эффектора, когда сохраняются контакты между эффекторными доменами Л.Есо1Ш и ДНК, а могут нарушаться контакты между каталитическими доменами Я.ЕсоЯП и ДНК. В этих условиях ДНК-дуплексы II, V и VI не расщеплялись К.ЕсоШ1, но наблюдалась активация расщепления обеих цепей ДНК-дуплекса III (данные не приведены). Можно предположить, что каталитические домены Я-ЕсоЯН образуют контакты с фосфатными группами ДНК в позициях 2,8 и 9 и не образуют контактов с фосфатной группой в позиции 3.

ДНК-дуплексы, содержащие межнукпеотидную хиральную тиофосфатную группу.

Для систематического исследования взаимодействия Л.ЕсоШГ с каждой из фосфатных групп участка узнавания ЕсоШ1 использовались ДНК-дуплексы, в которых одна из межнуклеотидных фосфатных групп замещалась на тиофосфатную (Ре-) группу. Данная модификация вносит минимальные изменения в структуру ДНК. Р5-группа существует в виде И,,- и диастереомеров (схема 2).

Межнуклеотидные фосфатные группы ДНК участвуют в образовании как электростатических, так и Н-связей с а.о. ферментов. В фосфатной группе отрицательный заряд делокализован между двумя немостиковыми атомами кислорода (про-Я,, и про-5Р атомами кислорода), тогда как в Рз-группе оя локализуется преимущественно на атоме серы; связь Р-Б длиннее связи Р-О на 0.5А и атом серы хуже образует Н-связь, чем атом кислорода. Ввиду этих различий, при введении Ре-группы следует ожидать изменений во взаимодействии замещаемой фосфатной группы с а.о. фермента. Один контакт между фосфатной группой ДНК и а.о. ЭР вносит вклад в энергетику ДНК-белкового взаимодействия в среднем -1 - -2 ккал/моль или нарушение этого контакта должно приводить к изменению кинетических констант в 4-30 раз (на основании изучения взаимодействия ЭР ЕсоВД или ЕсоКУ с ДНК). Поэтому мы приняли, что ИЕсоЯП образует контакт с фосфатной

л

,,1 2 3 4 5 6 5'-ССААрСрСрТрСрСрСТС

З'-СЮТТрСрСрАрСрСрОАС

12 11 10 9 8 7

Пронумерованы межнуклеотидные фосфатные группы,

которые замещались на тиофосфатную;

места расщепления ИЕсоШ! указаны стрелками_

Яр-двастереомер 5р-дтсгереомер

Схема 2

группой ДНК, если ев замещение на Рз-группу приводило к изменениям кинетических констант в 4 или большее число раз.

Табл. 2. Кинетические параметры расщепления К.ЕсоЯП модифицированной цепи ДНК-дуплексов, содержащих межнуклеотидную тиофосфатную группу Яр- или .^-конфигурации.

ДНК - дуплекс" Обозначение КЦ}* -10, мкМ*

*,-изомер | ^-изомер ^гашер | 5,-нзоиер

5'-ССААССГСССТС з'-сюттссассоао IX 14+2 11+2 22+2 14.6±0.9

...»сстсс... .. свасс... X» - 4%*

...ост«;... ...&<;асс... XI, или XI5 20+4 10+5 24+3 3.5+0.9

,.сс»тсс... ...с&асс... ХПцШшХПз 5.1+0.9 10+2 13.0+0.9 21+2

...сст«сс... ...сса-сс. ХШкилиХШ, 12+2 1.5+0.4 12.7+0.9 1.5+0.09

...сстсяс... ...ссас-с... XIV. или XIV, 8+2 8+2 5.9+0.6 15+2

..сстсс»... ...ссасс... XV, или XV,, 17+4 17+3 24+3 31+2

...сстсс... ...ссасс» .. XVI,« 4%'

...сстс-с... ...ссас»с... XVII, или ХУН5 10+3 8+2 7.0+0.9 3.2+03

...сст-сс... ...«глясс... ХУШК или Х\'Ш5 9+1 16+2 15.1+0.9 11.9+0.9

...сс-т«;... ...сгсяасс... Х1Х„ или Х1Х8 4.0+0.4 3.0+0.5 9.5+0.6 2.1+0.1

...с-стсс... ...(исасс... ХХкилиХХ$ 5.3+0.5 4.5+0.8 8.9+0.3 8.4+0.6

...сстсс... ...»ссасс... ХХ1В или ХХ1„ 9+1 15+3 12.4+0.6 17+2

« _ р,-группа 6 Верхняя и нижняя строга соответствуют параметрам расщепления верхней я нижней цепей ДНК-дуплексов Значения и к^ рассчитаны из концентрационных зависимостей начальных скоростей

расщепления модифицированной цепи ДНК-дуплексов ИЕсо1Ш с использованием уравнения Михаэлиса-Меитен Растепление ДНК проводили 30 мин при 37°С, Сдщс 350 нМ, Сцесош нч ' 1 нМ, в буфере а, содержащем 5 мМ MgCЬ " Относительная степень расщепления ДНК-дуплексов Хи и ХУ1Ю, содержащих рацемическую смесь и ^-диастереомеров Определена относительно степени расщепления ДНК-дуплекса ix, принятой равной 100%

Использование стереоспецифических аналогов субстрата позволяет избежать усреднения найденных эффектов по диастереомерам.

Были получены 12-звенные ДНК-дуплексы, в которых хиральная Ря-группа последовательно замещает одну из фосфатных трупп в участке узнавания Есо1Ш в позициях 2-6 и 8-12 (схема 2 и табл. 2). Индивидуальные диастереомеры 12-звенных олигонуклеотидов получали путвм разделения рацемических смесей Яр- и 5р-диастереомеров с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), либо путём ферментативного лигирования предварительно разделенных с помощью ВЭЖХ Яр- и 5р-диастереомеров 5-7-

звенных олигонуклеождов с соответствующими короткими олигонуклеотидами на комплементарной ДНК-матрице.

Для ДНК-дуплексов Х1К - ХУ5 и ХУИи - ХХ15 с помощью метода стационарной кинетики определены значения эффективных констант Михаэлиса (К]**) и констант скоростей расщепления (кт) (табл. 2).

А)*™ Б

| Л,-дн»стереомеры | 15#-днтсгереомеры I | Л,-днастереомеры | ] 5,-диастерсомеры |

1 2 3 4 5 6 12 И 1« 9 8 7 и Д» I ...рср^гтрс^»:.. 12 11 10 9 8 7 \ «А 2 3 4 5 6 ...-додовдр... ..^р^рСОДрОрС-... 12 11 10 9 8 1 2 3 4 5 6 ...-ОрО/КрСрСр!.. ...^^рА^рС-... 12 И 10 9 8 ♦

»немвдтф / шмодпф , тгнемодиф / т/»МОдиф __ 1 - длина данной стрелки соответствует лш / *кят — 4 или Лд^ /Лд^ — 4

Рис. 2. Фосфатные группы ДНК, необходимые для функционирования Я.ЕсоШГ Определены путём анализа значений к^ (А) и (Б), полученных при изучении стационарной кинетики расщепления К.ЕсоЯН ДНК-дуплексов, содержащих Яр- или 5р-Р»-группу. фосфатные группы, при замещении которых на Яр- или .^-Рз-группу /к^* > 4 или

К"^*/^* > 4 (размер стрелок пропорционален или

'-^ - фосфатные группы, при замещении которых на нехиральную Ря-группу наблюдалось

сильное ишибирование расщепления ДНК. Зачёркнуты фосфатные группы, при замещении которых на Я,- или ¿„-Гг-группу = 0.7 - 2.1 или К"^*= 0.7 - 2.7.

В случае ДНК-дуплекса Х1Хц, содержащего Л,-Р»-группу в позиции 10, и ДНК-дуплексов ХШв и Х1Х$, содержащих ^-Ре-группу в позициях 4 и 10, соответственно, значение уменьшалось по сравнению с ДНК-дуплексом IX в 4-9 раз (табл. 2). В случае ДНК-дуплексов, содержащих Яр-Рз-группу или 5,р-Р$-группу в других позициях, значения изменялись слабо. Можно предположить, что К.ЕсоИ1 не образует контактов с фосфатными группами в позициях 2, 3, 5, б, 8, 9,11 и 12 и образует в позициях 4 и 10 (рис. 2Б). Наблюдаемые уменьшения значений для позиций 4 и 10, вероятно, связаны с наличием отрицательного заряда на атоме серы Ре-группы, улучшающего электростатические взаимодействия фосфатных групп со сближенными положительно заряженными а.о. Я.Есо1Ш.

В случае ДНК-дуплексов Хщ и ХУГ^, содержащих /?рД,-Р5-группу в позициях 1 и 7, соответственно, наблюдалось наиболее сильное ингибирование расщепления К.Есо1Ш (табл. 2). В случае ДНК-дуплексов Х1Уц и ХУ11в, содержащих /?р-Р5-группу в позициях 5 и 8, соответственно, н ДНК-дуплексов ХП1$, XVI15 и Х1Х$, содержащих 5р-Р5-группу в

10

позициях 2, 4,8 и 10, соответственно, наблюдалось уменьшение значений к^ по сравнению с немодифицированным ДНК-дуплексом IX в 4-14 раз. В случае ДНК-дуплексов, содержащих Лр-Ps-rpynny или Sp-Ps-rpyrmy в других позициях, значения к^ практически не изменялись. Таким образом, замещение семи фосфатных групп в позициях 1, 2,4,5,7, 8 и 10 на Ps-группу оказывает влияние на каталитическую стадию ферментативной реакции, которая включает расщепление фосфодиэфирных связей и диссоциацию продуктивного комплекса. Если предположить, что химическая стадия является скорость лимитирующей во всех случаях (это может быть справедливо в случае коротких ДНК-дуплексов), то немостиковые атомы кислорода фосфатных групп в этих позициях (рис. 2А) образуют контакты с R.EcoRII и вносят вклад в стабилизацию переходного состояния ферментативной реакции. В целом, число фосфатных групп участка узнавания EcoRII, необходимых для эффективного протекания катализа R.EcoRII (рис. 2А), больше числа фосфатных групп, необходимых для связывания ДНК ферментом (рис. 2Б). Можно предположить, что после образования комплекса R.EcoRII-ДНК происходит доузнавание ферментом субстрата. Наблюдается тенденция к симметрии контактов, образуемых R.EcoRII с фосфатными группами относительно оси второго порядка, проведенной через центр (А/Т-пару) участка узнавания (рис. 2). Это связано с тем, что две одинаковые субъединицы R. EcoRII одинаковым образом взаимодействуют с участками узнавания EcoRII. В большинстве случаев замещение на атом серы в фосфатных группах про-5р-немостикового атома кислорода, расположенного ближе к малой бороздке ДНК, оказывает влияние на значения кинетических констант, а замещение про-Лр-атома кислорода, направленного в большую бороздку ДНК, - нет. Можно предположить, что R.EcoRII образует контакты с фосфатными группами преимущественно со стороны малой бороздки ДНК.

Следует отметить, что концентрационные зависимости расщепления коротких 12-звенных ДНК-дуплексов IX-XXIs R.EcoRII имеют несишоидальный вид. Это связано с тем, что в диапазоне концентраций ДНК-дуплексов IX-XXIs, используемых для определения кинетических констант, эффекторные домены R. EcoRII насыщены аллостеркческим эффектором (аллостерическая активация уже прошла). Можно предположить, что изменения кинетических констант, найденных на основании стационарной кинетики расщепления R. EcoRII Ps-содержащих ДНК-дуплексов, связаны с нарушением контактов между каталитическими доменами R.EcoRII и фосфатными группами ДНК, а нарушение контактов с эффекторными доменами не оказывает влияния на значения этих констант. Чтобы подтвердить это, была изучена активация расщепления ДНК фага Т7, которая устойчива к расщеплению R.EcoRII, так как участки узнавания EcoRII в ней удалены друг от друга на расстояние >1000 н.п. (рис. 3, дор. 1). Расщепление такой ДНК наблюдается в присутствии

коротких немодифицированных ДНК-дуплексов, выступающих в роли эффектора (рис. 3, дор. 2). Была изучена активация расщепления ДНК фага Т7 в присутствии эффекторов, в качестве которых выступали модифицированные ДНК-дуплексы Хщ, ХЬ, ХПЬ, Х1Уц, ХМю, ХУП8 и ХКв, плохо расщепляемые Я.ЕсоЯН (к^* /к^* > 4). Расщепление проводили в условиях насыщения Я.ЕсоЯН эффекторами, при концентрации эффекторов значительно больше . В этих условиях активация расщепления ДНК фага Т7 в присутствии Ра-содержащего ДНК-дуплекса должна быть такой же, как и в случае немодифицированного ДНК-дуплекса IX, если нарушение контактов между эффекторными доменами Я.ЕсоЯН и Ря-содержащим ДНК-дуплексом не будет приводить к нарушению контактов между каталитическими доменами и ДНК фага Т7.

Ряс. 3. Активация расщепления ДНК фага Т7 эндонуклеазой ЕсоЯН в присутствии ДНК-дуплексов, содержащих тиофосфатную труппу ДНК фага Т7 (4 нМ) инкубировали с Я.ЕсоЯН (Ск.Есо1Ш лгакр 225 нМ) в присутствии (дор. 2-8) или в отсутствие (дор. 1) указанных ДНК-дуплексов (5 мкМ) при 37°С, 60 мин, в буфере А, содержащем 5 мМ \lgCl2. Продукты расщепления анализировали в 0.5% агарозном геле, прокрашенном этидий бромидом.

Модифицированные ДНК-дуплексы Хщ, ХЬ, ХИЬ, Х1\'в, ХУ1ця, ХУПя и Х1Х$ активируют

расщепление ДНК фага Т7 (рис. 3, дор. 3-9) так же, как и немодифицированный ДНК-

дуплекс IX (рис. 3, дор. 2). Вероятно, изменения кинетических констант, наблюдаемые при

расщеплении ДНК-дуплексов Хи, ХЬ, ХПЬ, ХГУц, ХУ1К5, ХУ1Ь и XIХ5 (табл. 2) связаны с

нарушением контактов между каталитическими доменами Я.ЕсоЯН и фосфатными труппами

ДНК в позициях 1, 2, 4, 5, 7, 8 и 10 (рис. 2). Таким образом, можно предположить, что

контакты, найденные на основании изучения стационарной кинетики гидролиза Рз-

содержащих ДНК-дуплексов, отражают контакты между каталитическими доменами

Я.ЕсоЯН и фосфатными труппами ДНК.

Для расщепления ДНК ЭР необходимы один или несколько ионов Согласно механизму расщепления ДНК ЭР и по данным РСА комплексов ЭР с ДНК, ионы образуют контакт с расщепляемой фосфатной группой и в некоторых случаях - с фосфатными труппами, расположенными рядом с расщепляемой связью. В случае Я.ЕсоЯН, чтобы определить, участвуют ли в координации ионов фосфатные группы,

расположенные рядом с расщепляемой фосфатной группой, была изучена стационарная кинетика расщепления ДНК-дуплексов ХЬ и ХУПэ в присутствии ионов Мп2+. Эти ДНК-дуплексы плохо расщепляются в присутствии ионов (табл. 2). Ионы обладают

ДНК-дуплексы ■ 3 Г 1 3 1 1 | И

1 2 3 4 5 6 7 8 9

хорошим сродством к атому кислорода и плохим сродством к атому серы, поэтому замещение атома кислорода фосфатной группы ДНК на атом серы может нарушать контакты с ионами Ионы Мп2+ обладают хорошим сродством к атому серы, поэтому если

ухудшение расщепления в присутствии ионов Ра-содержащих ДНК-дуплексов связано с нарушением координации ионов то замена ионов на Мп2+ будет улучшать *> расщепление таких ДНК-дуплексов. В случае ДНК-дуплексов ХЬ и XV] 1$, в которых про-5я

атом кислорода фосфатных групп в позициях 2 и 8 замещен на атом серы, соответственно, замена ионов М^* на ионы Мп2+ приводила к увеличению значений к^ относительно значений для немодифицированного ДНК-дуплекса IX, в 3 и 9 раз, соответственно. Вероятно, про-5р атомы кислорода фосфатных групп, расположенных рядом с расщепляемыми связями с 3'-конца, участвуют в координации кофактора.

2. Зондирование контактов эндонуклеазы ЕсоЮ1 с группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке, с помощью ДНК-дуплексов, содержащих остатки (+)- или (-у-транс-анти-бето [я]пирена-1Ч2-<Ю.

Для зондирования контактов Я.Есо1Ш с группами атомов, расположенными в малой бороздке ДНК, получен набор 18-звенных ДНК-дуплексов (-)ХХП1-(+)ХХ1У, содержащих в участке узнавания ЕсоШ1 остатки (+)- или (-)-транс-анти-бензо[а]пирена-1Я2-(Ю ((+)<1С* или (-)сЮ*) вместо одного из остатков <Ю в верхней цепи ДНК-дуплекса XXII (схема 3)

v Р

Х>

С помощью ЯМР-спектроскопии установлено, что в случае (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-К2-<Ю-аддукгов остаток бензо[а]пирена расположен в малой бороздке ДНК, причем в случае (+)-диастереомера он направлен к 5'-концу модифицированной цепи, а в случае (-)-диастереомера - к З'-концу (СеастЮу « а1, 1997). Таким образом, введение остатков (+)«Ю* или (-)(Ю* может стерически препятствовать образованию контактов К.ЕсоМ! с группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке двойной спирали.

5'-0А0ССААССТС1С2СТСТСА 3 '-СТСОСГГСС АС-СгОАОАСТ XXII '

(-)ХХШ- 01 = (")ас*; (+)ХХШ - в, = (+><Ю*; (-)ХХ1У- о2=(-)«ю*; (+)хх1У-о2=(+)ас*.

Схема 3

В присутствии аналога кофактора, ионов Са , И.Есо1Ш не расщепляет ДНК, однако образуется специфический комплекс Я.ЕсоКИ с ДНК, состоящий из димера И.ЕсоКП и двух молекул ДНК, одна из которых находится в эффекторном, а другая - в каталитическом доменах К.ЕсоЯП (ВаЬкша а/, 2002).

ДНК-дуплексы I £ £1 £ Р £1 и§ 1 00 &} 1 II и £1 и

П.ЕсеКП - - . + + + + +

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Комплекс иесокщднк

ИЩ*

Рис. 4. Связывание Я.Есо1Ш с немодифицированным ДНК-дуплексом XXII (дор. 6) и В[а]РОЕ-модифицированными ДНК-дуплексами (дор. 7-10). 32Р-мсченные ДНК-дуплексы (Сднк 0.25 мкМ) инкубировали С Я.ЕС0И1 (Ск.ЕсоМ димер 0.2 мкМ) в буфере А, содержащем 5 мМ СаС12. Радиоавтограф неденатурирующего 6%-ного ПААГ. "+" и "-" обозначает присутствие и отсутствие Я.ЕсоЯП, соответственно.

ДНК- Г"

дуплексы |

Образование комплекса К.ЕсоЯН с ДНК в присутствии ионов Са2+ ухудшалось при модификации остатка «Км (рис. 4, дор. 7 и 8) и полностью отсутствовало при модификации остатка <Юг (рис. 4, дор. 9 и 10). Как упоминалось выше, при расщеплении ДНК ИЕсоЯН оба домена К.ЕсоЯН образуют контакты с ДНК, поэтому расщепление 11.Есо1Ш В[а]РОЕ-модифицированных ДНК-дуплексов может ухудшаться, если нарушаются ДНК-белковые контакты хотя бы в одном из доменов. Расщепление К.ЕсоШ1 модифицированной и немодифицированной цепей ДНК-дуплексов (-)ХХШ-(+)ХХ1У было полностью блокировано (данные не приведены). Таким образом, нарушение комплексообразования и расщепления Я.ЕсоШ1 В[а]РБЕ-модифицированных ДНК-дуплексов предполагает существование контактов между эффекгорными и/или каталитическими доменами К.ЕсоЯП и группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке.

Для зондирования контактов между каталитическими доменами Я.Есо1Ш и малой бороздкой ДНК было изучено расщепление В[а]Р-А^чЮ-содержащих ДНК-дуплексов в присутствии короткого немодифицированного ДНК-дуплекса XXV (5'-асстасстсстскзт/3'-тскэатссассасса), выступающего в качестве эффектора, когда контакты между эффекгорными доменами Я.Есо1Ш и ДНК сохраняются, а могут нарушаются контакты между каталитическими доменами и ДНК. В присутствии эффектора XXV, расщепление

Л.ЕсоШ1 обеих цепей ДНК-дуплексов ХХШ и XXIV было блокировано (данные не приведены). Следовательно, контакты между каталитическими доменами ИЕсоКП и малой бороздкой ДНК, по-видимому, необходимы для функционирования К ЕсоЯИ.

Для зондирования контактов между эффекторными доменами Я-ЕсоЯИ и ДНК была изучена активация расщепления Я.Есо1Ш ДНК фага Т7 в присутствии ВИР-Л^-ЛЗ-содержащих ДНК-дуплексов, выступающих в качестве эффекторов (рис. 5).

Рис. 5. Активация расщепления ДНК фага Т7 эндонуклеазой ЕсоШ1 в присутствии ДНК-дуплексов, содержащих остатки В[а]Р-Л^чЮ. ДНК фага Т7 (12 нМ) инкубировали с Я-ЕсоЯИ (400 нМ) в присутствии (дор. 2-9) или в отсутствие (дор. 1) указанных ДНК-дуплексов (5 мкМ) при 37°С, 60 мин. Продукты расщепления анализировали в 0.5% агарозном геле, прокрашенном этидий бромидом.

Как упоминалось выше, расщепление К.ЕсоЯН ДНК фага Т7 будет наблюдаться только при условии, если не нарушаются ДНК-белковые контакты в эффекторном домене Я.Есо1Ш. Только ДНК-дуплексы XXIII сохраняют способность активировать расщепление ДНК фага Т7 (рис. 5, дор. 3 и 4), хотя и в меньшей степени, чем немодифицированный ДНК-дуплекс XXII. Отметим, что неспособность ДНК-дуплексов XXIV активировать расщепление ДНК фага Т7 может возникать из-за отсутствия их связывания с Я.ЕсоШ1 (рис. 4, дор. 9 и 10). Эти данные предполагают наличие взаимодействий между эффекторными доменами Я.ЕсоШ! и группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке.

Таким образом, для функционирования К.Есо1Ш необходимо образование контактов между группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке, и как эффекторными, так и каталитическими доменами К.ЕсоКП.

3. Идентификация участка эндоиуклеазы ЕсоШ1, взаимодействующего с центральной нуклеотидной парой участка узнавания в ДНК, методом фотоаффинной модификации.

Для идентификации области(ей) ЕсоЯП, образующей(их) специфические контакты с каждым гетероциклическим основанием АЛ'-пары участка узнавания ЕсоЯП в фермент-субстратном комплексе, была проведена фотоаффинная модификация II. ЕсоЯП ДНК-дуплексами, содержащими в участке узнавания EcoR.II остаток 5-иододезоксиуридина (МЦ)

вместо остатка <1А (XXV, 5'-АСАОССАССТШОС/3'-ТСТССС-1<Ш-ССААССС) или сГГ (XXVI, 5'-АСАОСС-Ии-Ссттссс/З'-ТСТСССТССААССО) в условиях, разработанных ранее Бабкиной О-В. Комплекс Я.Есо1Ш-ДНК формировали в присутствии ионов Са2+, при молярном соотношении Я.ЕсоЯНдт^ДНК-дуплекс, равном 1:2 (схема 4). Фотоаффинную модификацию Я-ЕсоМ! ДНК-дуплексами XXV и XXVI проводили мягким УФ-облучением (X > 300 им) комплекса Я.ЕсоКП-ДНК. Установление места фотоприсоединения ДНК-дуплексов XXV и XXVI к Я.ЕсоЯП осуществляли с помощью полного расщепления белка химотрипсином в составе каждого ковалентного конъюгата (при соотношении К.Есо1Ш:химотрипсин, равном 30:1 (по массе)). В этих условиях из каждого конъюгата был получен только один олигонуклеотидопеэтид (ОН-пептид) (схема 4).

II

щ р

п

Н-ЕсоКП

Ьу -Ш

ОН-пмттид

П^ - димер К-ЕсоКП, каждая субьединшп союяп з^осприый (|—ри ЦУ) эядоиуклсягшый (^у домен._

Схема 4

Полученные ОН-пептиды, были проанализированы методами МАЬ01 масс-спектрометрии и секвенирования по Эдману. Молекулярная масса (Мс) каждого из пептидных фрагментов в обоих ОН-пептидах была равна 2713 Да. Она наиболее соответствует пептиду ^^ТСЫЗЬОРОЕОилжкяУЕУГЯР22', теоретическая масса которого составляет 2718 Да. Определены аминокислотные последовательности ОН-пептидов, полученных при фотоприсоединении к Я.ЕсоЯП ДНК-дуплексов XXV и XXVI: У*ши>РОЕ<}1Х'"1ЖУ и У'^шр ("*" - непрочитанный а.о.), соответственно. М, и первичная структура пептидных фрагментов совпадают для обоих ОН-пептидов, значит, места присоединения к ферменту ДНК-дуплексов XXV (замещение остатка ¿Т на 1<Ш) и XXVI (замещение остатка <1А на 1(Ш) в составе ДНК-белкового конъюгата совпадают. Ранее такой же вывод был сделан Бабкиной О.В. на основании того, что при расщеплении продуктов фотоприсоединения Л.Есо1Ш к ДНК-дуплексам XXV и XXVI химическими реагентами получались идентичные наборы ОН-пептидов. Последующая обработка неспецифической протеиназой К ОН-пептвда, полученного из конъюгата Я.ЕсоМ1-(ДНК-дуплекс XXV), и анализ полученных продуктов с помощью МА1Л)1 масс-спектрометрии позволили сузить район фотоприсоединения до области 2МУЕУЛ227 Найденная область находится в каталитическом домене Я.Есо1Ш (схема

4 и рис. 6). Фотоприсоединение остатка IdU обычно происходит к электрон-богатьш а.о.: Туг, Phe, Tip, His или Met Поэтому, возможно, что из области "VEYD227 ковапеитно присоединяется к А/Т-паре участка узнавания остаток Y226. Отсутствие фотоприсоединения IdU-содержащих ДНК-дуплексов к эффекторным доменам R.EcoRII позволяет предположить, что А/Т-пара участка узнавания, расположенного в ДНК-связывающей полости, образованной эффекгорными доменами R.EcoRII, не сближена с электрон-богатыми а.о. По данным РСА фермента R.EcoRII область 224VEYD2i7 находится внутри ДНК-связывающей полости, образуемой каталитическими доменами R.EcoRII (рис. 6), вне каталитического кора R.EcoRII и принадлежит центральной части а-спирали Н-10, принимающей участие в димеризации субьединиц R.EcoRII (Zhou el al, 2004).

Рис. 6. Структура ДНК-связывающей полости, образованной из двух С-концевых каталитических доменов R.EcoRII, по данным РСА мутаншой формы R88A R.EcoRII (PDB код 1NA6). черным цветом выделена область 224VEYD227. N-концевые эффекторные домены R.EcoRII не приведены.

По данным моделирования комплекса каталитического домена R.EcoRII с ДНК-дуплексом 5'-CCTGG/3'-GGACC центральная часть спирали НЮ сближена с А/Т-парой участка узнавания (Zhou et al, 2004). Таким образом, в комплексе R-EcoRII-ДНК область фермента 224VEYD227 сближена с А/Г-парой участка узнавания. Участие а-спирали, обеспечивающей димеризацию субьединиц ЭР, в узнавании ДНК характерно для семейства ЭР, образующих 5 ' -выступающие концы при расщеплении ДНК.

4. Изучение структуры комплекса К.Есо1Ш-ДНК с помощью флуоресценции.

Ввиду отсутствия РСА комплекса R.EcoRIl-ДНК неизвестно, как ориентированы участки узнавания EcoRII друг относительно друга в комплексе. Для решения этого вопроса мы изучали резонансный перенос энергии возбуждения флуоресценции (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) в комплексе R.EcoRII-ДНК между флуоресцентными метками, находящимися на разных концах молекулы ДНК, содержащей два участка узнавания EcoRII (табл. 3). Эффективность FRET определяли в присутствии ионов Ca2* в комплексе R.EcoRII-ДНК между 5(6)-карбоксифлуоресцеином (ГАМ) (донором) и 5(6)-карбокситетраметилродамином (TAMRA) (акцептором), ковалентно присоединенными к 5'-

концам молекулы ДНК, содержащей два участка узнавания ЕсоЯН на расстоянии 309 н.п. (табл. 3).

Табл. 3. ДНК, содержащие два участка узнавания ЕсоШТ и флуоресцентные метки.

Обозначение К, ЗМш.п. rl S'-FAM—CCTGG-GGTCC — — GGACC-CCAGG— TAMRA-5'

rl r>

ш.рлию 5 '-FAM-ACGTGGCTGG TGCACCGACC CAGGTAGATG GTCCAT CTAC-TAMRA-5 '

DNÀFMna и"ятмалъ 5-FAM-ACGTGGCTGG TGCACCGACC CAGGT GTCCA-TAMRA-5'

пшглию и"лтлшлг 5-FAM-ACGTGGCTGG TGCACCGACC CAG GTC-TAMRA-5'

DNÀfau5 5 '-FAM-GCTGG CGACC CAGGTAGATG GTCCAT CTAC-TAMRA-5*

^■^тлшль 5'-FAM-GCTGG CGACC CAGGT GTCCA-TAMRA-5'

DNA"ли> TAMRAÏ 5-FAM-GCTGG CGACC CAG GTC-TAMRA-5'

DNA?m 5'-FAM-GCTGG CGACC CAGGT GTCCA-5'

Определение эффективности FRET (Епозволяет согласно уравнению Фёрстера EFR£T = Л06/(Д06 +Л6) (где Ro - расстояние Фёрстера, равное 55Â) определить расстояние (R) между красителями. Однако для определения пространственного расположения двух участков узнавания в комплексе R.EcoRII-ДНК необходимо иметь набор расстояний между красителями, расположенными на различном удалении от участков узнавания.

Рис. 7. Изменение спектра флуоресценции ' красителей в составе ДНК при

образовании комплекса Я.ЕсоМ1-ДНК. Ха 495 нм, Сднк 50 нМ, буфер А, содержащий 5 мМ СаСЬ. Вставка: схематическое изображение образования петли ДНК при связывании Я.ЕсоКП двухсайтовой ДНК, содержащей на концах донор (О) и акцептор (А). ЮЗ - участок узнавания Ш

ЕсоВД1. ИЗ - димер К.ЕсоШ1, каждая субъединица содержит эффекгорный- (квадрат) и каталитический- (кружок) домены.

Для получения этих данных варьировали расстояние между участком узнавания и FAM (У=5 или 10 н.п.) или между участком узнавания и TAMRA (Х=3, 5 или 10 н.п.) (табл. 3 и рис. 8А), изменяя длину ДНК. Эффективность FRET между красителями в комплексах R.EcoRII-ДНК определяли по тушению флуоресценции донора (FAM) при 520 нм и по разгоранию флуоресценции акцептора (TAMRA) при 580 нм. В качестве примера на рис. 7 показано, как

по мере увеличения концентрации R.EcoRII до 46 нМ (до молярного соотношения R.EcoRUnmep равного 1:1) происходило увеличение эффективности FRET

вследствие сближения красителей в комплексе R.EcoRII-ДНК.

Рис. 8. (А) Схематическое изображение двухсайтовой ДНК, содержащей на расстоянии Y и X н.п. от участка узнавания EcoRII донор (FAM) и акцептор (TAMRA), соответственно. (Б) Зависимость Е*мт между красителями, расположенными на концах ДНК в комплексе R.EcoRII-ДНК от расстояния X, н.п. (■ и А) - значения Е1™7 для Y=5 и 10 н.п., соответственно, полученные в условиях: Сднк 50 нМ, С^Есомьянер 50 нМ, 5 мМ СаС12. (-о- и -V-) - теоретические значения EF"ET для Y=5 и 10 н.п., соответственно, рассчитанные исходя из модели, изображенной справа и из того, что 26% ДНК в комплексе R.EcoRII-ДНК находится в форме петли. (В) Предполагаемая модель петли ДНК, образуемой R.EcoRII, а=70+10 градусов и h=20+10 Â. wm - участок узнавания EcoRII. Указаны расстояния в ангстремах.

Для различных расстояний от красителей до участков узнавания (X и Y нуклеотидных пар) был получен набор значений эффективностей FRET (рис. 8Б, ■ и А). Так как неизвестно, какая часть ДНК в комплексе R.EcoRII-ДНК находится в форме петли, анализировали не эффективности FRET, а их отношения, не зависящие от того, какая доля молекул ДНК находится в форме петли. Затем были рассчитаны теоретические отношения EFJŒT для всевозможных ориентаций двух участков узнавания друг относительно друга в комплексе R.EcoRII-ДНК. Минимальному отклонению теоретических значений отношений EFJI£T от экспериментально определенных соответствовала модель, приведённая на рис. 8В. Согласно этой модели, расстояние между центрами участков узнавания, h, составляет 20+10 À, а значение угла а составляет 70+10 градусов.

выводы

1. Для зондирования контактов эндонуклеазы рестрикции ЕсоЫ1 (Р.ЕсоШГ) с углеводофосфатным остовом ДНК было изучено взаимодействие этого фермента с ДНК-дуплексами, содержащими в участке узнавания ЕсоЯН остатки 1 -((5-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)цитозина (ЙС,) или 1 -(|3-В-2'-дезокси-трео-пентафуранотл)тимина ((ГГ,), а также хиральную (Яр)- или (ЗДтиофосфатную (Р«) группу.

а) Изменение пространственного расположения двух из пяти межнуклеотидных фосфатных групп при введении остатков с!С, или ЙТ, нарушало образование комплекса Я.Есо1Ш-ДНК в отсутствие ионов Сделано предположение, что эффекторные домены Я ЕсоМ образуют контакты с этими группами. Модификация трёх из пяти фосфатных групп блокировала расщепление ДНК-дуплексов в присутствии аллостерического эффектора. Возможно, каталитические домены образуют контакты с этими фосфатными группами.

б) Последовательное замещение каждой из двенадцати межнуклеотидных фосфатных групп участка узнавания ЕсоЯП на хиральную (Яр)- или (5^)-тиофосфатную (Р«) группу в большинстве случаев не влияло на эффективные константы Михаэлиса (К**), а уменьшало каталитические константы гидролиза (кип) ДНК-дуплексов. Обнаружена зависимость значений К** и кот позиции и стереохимии Рмруппы. Выделены семь фосфатных групп, необходимых для каталитического превращения субстрата, осуществляемого II ЕсоЯП Эти фосфатные группы взаимодействуют с каталитическими доменами Я.ЕсоЫ1. Сделано предположение, что про-5^ атомы кислорода фосфатных трупп, расположенных с З'-конца от расщепляемых связей участвуют в координации ионов

2. С помощью анализа субстратных свойств 18-звенных ДНК дуплексов, содержащих остатки (+)- или (-)-транс-анти-беизо[а]пврева-'Ы2-Ю в участке узнавания ЕсоЛП, установлено, что как эффекторные, так и каталитические домены Я-ЕсоЯИ образуют контакты с группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке.

3. С помощью фотоаффинной модификации Я.ЕсоШ1 ДНК-дуплексами, содержащими остаток 5-иодо-2'-дезоксиуридина вместо остатков ЙА или сГГ участка узнавания ЕсоЯН, идентифицирована область 224УЕУТ)227, находящаяся в центральной части а-спирали НЮ каталитического домена Я.Есо1Ш, сближенная с центральной нуклеотидной парой участка узнавания ЕсоВД1.

4. Изучен перенос энергии возбуждения флуоресценции в комплексе К.ЕсоЯН-ДНК между красителями, присоединёнными к разным концам ДНК, содержащей два участка узнавания. Предложена модель комплекса Я.Есо1Ш-ДНК, согласно которой участки узнавания сближены на расстояние 20+10 А и располагаются под углом 70+10 градусов.

Основные результаты диссертация изложены в следующих публикациях:

1. Petrauskene O.V, Yakovleva J.N., Alekseev Ya.I., Subach F.V.. Babkina O.V., Gromova

E.S. DNA duplexes containing altered sugar residues as probes of EcoRII and Mval endonuclease interactions with sugar-pbospbate backbone. // Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 2000, v. 17, p. 857-870.

2. СУбач Ф.В.. Мюллер С., Ташлицкий В.Н., Пятраускене О.В., Громова Е.С. Получение ДНК-дуплексов, содержащих в различных положениях участка узнавания эндонуклеазы рестрикции EcoRII хиральные межнуклеотидные тиофосфатные группы. // Биоорганическая химия, 2003, т. 29, с. 623-631.

3. Baskunov V.B., Subach F.V.. Kolbanovskiy A., Kolbanovskiy М., Eremin S.A., Johnson

F., Bonala R., Geacintov N.E., and Gromova E.S. Effects of Benzo[a]pyrene-Deoxyguanosine Lesions on DNA Methylation Catalyzed by EcoRII DNA Methyltransferase and on DNA Cleavage Effected by EcoRII Restriction Endonuclease. // Biochemistry, 2005, v. 44, p. 1054-1066.

Материалы работы также опубликованы в виде тезисов сообщений на международных конференциях (см. стр. 5).

4

ев - 2 2 7 о

РНБ Русский фонд

2006-4 23179

Подписано в печать 17 ноября 2005 г. Заказ 514. Формат 60 х 90/16. Тираж 110 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ЭР ТИПА IIИ СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭР ТИПА НЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Методы изучения ЭР типа II.

1.1.1. Кинетический подход.

1.1.1.1. Методы регистрации расщепления ДНК.

1.1.1.2. Стационарная кинетика гидролиза.

1.1.1.3. Однооборотная кинетика гидролиза ДНК.

1.1.1.4. Влияние условий на кинетику расщепления ДНК ЭР.

1.1.1.5. Классификация ЭР типа II согласно их кинетическим механизмам расщепления ДНК.

1.1.2. Использование модифицированных субстратов для изучения контактов, образуемых ЭР с ДНК.

1.1.2.1. Модификация гетероциклических оснований.

1.1.2.1.1. Классификация модификаций.

1.1.2.1.2. Энергетическая оценка ДНК-белковых взаимодействий в терминах теории переходного состояния.

1.1.2.1.3. Факторы, которые необходимо учитывать при определении ДНКбелковых контактов.

1.1.2.1.4. Наиболее охарактеризованные модификации.

1.1.2.1.5. Мало охарактеризованные модификации.

1.1.2.1.6. Определение контактов со стороны белка, с помощью модифицированных аналогов субстрата.

1.1.2.2. Модификация углеводофосфатного остова.

1.1.2.2.1. Статистическое алкилирование или футпринтинг.

1.1.2.2.2. Межнуклеотидная тиофосфатная (Ps-) группа.

1.1.3. Аффинная модификация ЭР типа II.

1.1.3.1. Зондирование ДНК-белковых контактов.

1.1.3.1.1. 5-Иодо-2'-дезоксиуридин (5-IdU) и 5-иодо-2'-дезоксицитидин (5-IdC).

1.1.3.1.2. 5-бромо-2'-дезоксиуридин (5-BrdU).

1.1.3.1.3. 6-тио-2'-дезоксигуанозин (d6SG) и 4-тио-2'-дезокситимидин (d4ST).

1.1.3.1.4. Азидофенацильная группа.

1.1.3.1.5. Замещённая пирофосфатная группа (ЗПГ).

1.1.3.1.6. Диальдегидная группа.

1.1.3.2. Определение механизма действия ЭР типа II с помощью аффинной модификации ЭР или модификации ЭР низкомолекулярными бифункциональными реагентами.

1.1.4. Использование спектроскопических методов для изучения ЭР типа II.

1.2. Сравнительный анализ ЭР типа НЕ.

1.2.1. Структурная организация.

1.2.2. Гомология с другими ферментами.

Ф 1.2.3. Механизм гидролиза ДНК.

1.2.3.1. Критерии двухсайтового механизма действия ЭР.

1.2.3.2. Число гидролизуемых связей.

1.2.3.3. Зависимость гидролиза от длины односайтового субстрата.

1.2.3.4. Цис- и /я/«шс-взаимодействия.

1.2.2.5. Механизм транслокации.

1.2.2.6. Кинетические модели гидролиза ДНК.

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ECORIIС ДНК С ПОМОЩЬЮ БИОХИМИЧЕСКИХ И СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ).

2.1. Зондирование контактов эндонуклеазы EcoRII с фосфатными группами ДНК.

2.1.1. ДНК-дуплексы, содержащие модифицированные углеводные остатки.

2.1.2. ДНК-дуплексы, содержащие межнуклеотидную хиральную тиофосфатную группу.

2.1.2.1. Синтез и хроматографическое разделение Rp- и »Ур-диастереомеров 12-звенных олигонуклеотидов.

2.1.2.2. Получение 12-звенных олигонуклеотидов, содержащих хиральную тиофосфатную группу, с помощью хроматографического разделения 5-7-звенных олигонуклеотидов и последующего ферментативного лигирования.

2.1.2.3. Определение конфигурации тиофосфатной группы.

2.1.2.4. Гидролиз эндонуклеазой EcoRII ДНК-дуплексов, содержащих в участке узнавания EcoRII тиофосфатную группу.

2.1.3. Зондирование контактов эндонуклеазы EcoRII с группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке, с помощью ДНК-дуплексов, содержащих остатки (+)- или (-)-/мрянс-ан/ми-бензо[а]пирена^ -dG.

2.2. Идентификация участка эндонуклеазы EcoRII, взаимодействующего с центральной нуклеотидной парой участка узнавания в ДНК, методом фотоаффинной модификации.

2.3. Изучение структуры комплекса R.EcoRII-ДНК с помощью флуоресценции.

2.3.1. Взаиморасположение участков узнавания EcoRH в комплексе R.EcoRII-ДНК.

2.3.1.1. Транс-локализация участков узнавания.

2.3.1.2. Zfuc-локализация участков узнавания.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы.

3.2. Приборы и методы.

3.3. Общие методики.

3.3.1. Выделение R.EcoRII.

3.3.2. Хроматографическое разделение Rp- и ^р-диастсрсомсров олигонуклеотидов и определение их конфигурации.

3.3.3.5'-Фосфорилирование олигонуклеотидов.

3.3.4. Ферментативное лигирование.

3.3.5. Выделение олигонуклеотидов из геля.

3.3.6. Гидролиз ДНК-дуплексов эндонуклеазой EcoRII.

3.3.7. Разделение (-)- и (+)-диастереомеров олигонуклеотидов, содержащих остаток (+,-)-TpaHc-aHTH-B[a]P-N2-dG.

3.3.8. Получение ДНК методом ПЦР.

3.3.9. Комплексообразование ЭР EcoRII с ДНК.

3.3.10. Фотоаффинная модификация ЭР EcoRII IdU-содержащими ДНК-дуплексами.

3.3.11. Гидролиз ковалентных конъюгатов протеолитическими ферментами с последующей очисткой и анализом.

3.3.12. Измерение переноса энергии и расчет геометрии петли ДНК.

ВЫВОДЫ.

Объектом исследования в данной работе является ЭР EcoRII (R.EcoRII), существующая в виде гомодимера. R.EcoRII одновременно связывает два одинаковых участка узнавания ( 5'-;CCAGG ) и в присутствие кофактора Mg2+, гидролизует две

3'- GGTCCT фосфодиэфирные связи в двух цепях одного из двух участков узнавания. Особый интерес к ЭР EcoRII связан с тем, что она относится к ЭР типа ИЕ, взаимодействующим с двумя участками узнавания. Для ЭР типа IIE получены данные РСА для эндонуклеаз Nael и EcoRII и комплекса Nael с ДНК [1,2,3]. Как было показано с помощью РСА белка и биохимических исследований, R.EcoRII состоит из двух доменов: каталитического (эндонуклеазного) и ДНК связывающего (эффекторного). Предполагается, что вначале эффекторный домен связывает один из двух участков узнавания (эффекторную ДНК). Это связывание активирует связывание и расщепление второго участка узнавания (ДНК субстрата) в эндонуклеазном домене фермента. В результате исследования взаимодействия R.EcoRII с модифицированными аналогами субстрата были идентифицированы группы атомов гетероциклических оснований ДНК, вовлеченные в образование специфических водородных связей с ЭР EcoRII со стороны большой * бороздки ДНК [4,5]. Контакты фермента со стороны малой бороздки ДНК и с углеводофосфатным остовом ДНК оставались неизученными. Поскольку к настоящему времени не удалось охарактеризовать структуру комплекса EcoRII с ДНК-дуплексом методом РСА, особую важность приобретает изучение этого комплекса с помощью различных подходов.

Целью настоящей работы явилось изучение контактов эндонуклеазы рестрикции EcoRII с углеводофосфатным остовом и малой бороздкой ДНК с помощью различных аналогов субстрата, определение области(ей) фермента R.EcoRII, контактирующих с ДНК, методом фотоаффинной модификации фермента, а также исследование структуры фермент-субстратного комплекса методами ИК-спектроскопии и флуоресцентной спектроскопии.

В работе решались следующие задачи. (1) Изучение субстратных свойств ДНК-дуплексов, содержащих в участке узнавания эндонуклеазы EcoRII: остатки l-(P-D-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)цитозина (dCx) и/или 1-(Р-В-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)тимина (dTx) вместо остатков dC и dT, единичную хиральную тиофосфатную группу, замещающую поочередно все фосфатные группы участка узнавания, остатки (+)- или (-)-транс-ант«-бензо[а]пирена-М2-ёО ((+)dG* или (-)dG*) вместо остатков dG; (5) определение участка в ферменте R.EcoRII, взаимодействующего с центральной А/Т парой участка узнавания в ДНК, методом фотоаффинной модификации; (5) изучение переноса энергии в комплексе 11.Есо11Н/ДНК между красителями, присоединенными к участкам узнавания EcoRII, расположенным на одной или на разных молекулах ДНК.

Работа содержит литературный обзор, посвященный используемым в данной работе методам изучения ЭР типа И: кинетический подход, методы с использованием модифицированных аналогов субстрата, фотоаффинной модификации фермента и флуоресцентной спектроскопии. Также проводится сравнительный анализ эндонуклеазы EcoRII подтипа НЕ с другими ЭР этого же подтипа.

выводы

1. Получен набор ДНК-дуплексов, содержащих в участке узнавания EcoRII остатки 1-(Р-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)цитозина (dCx) и/или 1-(Р-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)тимина (dTx) вместо остатков dC и dT. На основании анализа субстратных свойств полученных ДНК-дуплексов сделан вывод о неэквивалентном вкладе фосфатных групп ДНК во взаимодействие с R.EcoRII. Фосфатная группа, соседняя от расщепляемой связи с 3'-конца, по-видимому, наиболее важна для взаимодействия с ферментом.

2. Разработан подход для получения полного набора аналогов субстрата эндонуклеазы EcoRII, содержащих единичную хиральную тиофосфатную группу, которая последовательно замещает каждую фосфатную группу в участке узнавания и непосредственно рядом с ним. На основании анализа субстратных свойств полученных ДНК-дуплексов выявлен различный вклад фосфатных групп во взаимодействие с R.EcoRII на стадии связывания и катализа. Возможно, что npo-Sp атом кислорода фосфатной л I группы, соседней с 3'-конца от расщепляемой связи, контактирует с кофактором Mg .

3. Получен набор 18-звенных ДНК дуплексов, содержащих остатки (+)- или (-)л иранс-анти-бензо[я]пирена-Ы -dG вместо остатков dG в Т-цепи участка узнавания EcoRII. Анализ субстратных свойств полученных ДНК-дуплексов предполагает существование важных контактов между R.EcoRII и группами в малой бороздке ДНК, как для связывания, так и для катализа, осуществляемого ферментом.

4. С помощью фотоаффинной модификации эндонуклеазы EcoRII ДНК-дуплексами, содержащими остаток 5-иоддезоксиуридина вместо dT или dA центральной

1Ч1Ч i Attn н.п. участка узнавания, идентифицирована область фермента VEYD (в С-концевом эндонуклеазном домене белка), образующая контакты с центральной А/Т н.п. участка

УУЛ "УУ7 узнавания в ДНК. Наиболее вероятно, что в найденной области VEYD остаток тирозина Y образует ковалентную связь с ДНК.

5. Впервые с помощью ИК-спектроскопии установлено, что при образовании комплекса R.EcoRII/ДНК наблюдаются изменения как вторичной структуры R.EcoRII, так и структуры ДНК, затрагивающие гетероциклические основания и углеводофосфатный остов.

6. С помощью изучения переноса энергии в комплексе R.EcoRII-ДНК между красителями, присоединенными рядом с участками узнавания EcoRII, расположенными на одной или на разных молекулах ДНК, удалось установить взаиморасположение участков узнавания в комплексе. Установлено, что добавление аналога кофактора Са приводит к уменьшению сродства к ДНК N-концевого эффекторного домена R.EcoRII и либо повышает сродство С-концевого эндонуклеазного домена фермента к ДНК, либо сближает два участка узнавания за счёт конформационной перестройки в ДНК-белковом комплексе.

Л I

Показано, что в присутствии Са сродство к ДНК эндонуклеазного домена фермента выше, чем у эффекторного домена.

1. Huai, Q., Colandene, J.D., Chen, Y., Luo, F., Zhao, Y., Topal, M.D., and Ke, H. (2000) Crystal structure of Nael an evolutionary bridge between DNA endonuclease and topoisomerase. EMBOJ. 19, 3110-3118.

2. Huai, Q., Colandene, J.D., Topal, M.D., and Ke, H. (2001) Structure of Nael-DNA complex reveals dual-mode DNA recognition and complete dimer rearrangement. Nature Struct. Biol. 8, 665669.

3. Zhou, X.E., Wang, Y., Reuter, M., MUcke, M., Kriiger, D.H., Meehan, E.J., and Chen, L. (2004) Crystal structure of type IIE restriction endonuclease EcoRII reveals an autoinhibition mechanism by a novel effector-binding fold. J. Mol. Biol. 335,307-319.

4. Gromova, E. S., Kubareva, E. A., Vinogradova, M. N., Oretskaya, T. S., and Shabarova, Z. A. (1991) Peculiarities of Recognition of CCA/TGG Sequences in DNA by Restriction Endonucleases Mval and EcoRII. J. Mol. Recognition 4,133-141.

5. Petrauskene, О. V., Schmidt, S., Kaiyagina, A. S., Nikolskaya, 1.1., Gromova, E. S., and Cech, D. (1995) The interaction of DNA duplexes containing 2-aminopurine with restriction endonucleases EcoRII and SsoII. Nuceic Acids. Res. 23, 2192-97.

6. Kim, Y.G., Smith, J., Durgesha, M., and Chandrasegaran, S. (1998) Chimeric restriction enzyme: Gal4 fusion to Fold cleavage domain. Biol. Chem. 379,489-95.

7. Kim, Y.G., and Chandrasegaran, S. (1994) Chimeric restriction endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 883-7.

8. Kim, Y.G., Cha. J., and Chandrasegaran, S. (1996) Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fokl cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1156-60.

9. Pingoud, A., Fuxreiterb, M., Pingoud, V., and Wendea, W. (2005) Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cell. Mol. Life Sci 62,685-707. Review.

10. Roberts, R.J., and Halford, S.E. (1993) Type II restriction endonucleases. In S.M. Linn, R.S. Lloyd and R.J. Roberts (eds), Nucleases. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, NY, 35-88.

11. Heitman, J. (1993) On the origins, structures and functions of restriction-modification enzymes. In J.K. Setlow (ed.). Genetic Engineering. Plenum Press, New York 15,57-108.

12. Pingoud, A., and Jeltsch, A. (1997) Recognition and cleavage by type-II restriction endonucleases. Eur. J. Biochem. 246, 1-22. Review.

13. Pingoud, A., and Jeltsch, A. (2001) Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29, 3705-3727.

14. Advani, S., and Roy, K.B. (2000) Properties and Secondary Structure Analysis of BanI Endonuclease: Identification of Putative Active Site. Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 11-16.

15. Taylor, J.D., Badcoe, I.G., Clarke, A.R., and Halford, S.E. (1991) EcoRV Restriction Endonuclease Binds All DNA Sequences with Equal Affinity. Biochemistry 30, 8743-8753.

16. Roy, K.B., Vrushank, D., and Jayaram, B. Use of Isotop-Dilution Phenomenon to Advantage in the Determination of Kinetic Constants Km and Kcat for BamHI Restriction Endonuclease: An Empirical and Iterative Approach. (1994) Anal. Biochem. 220, 160-164.

17. Grazby, J.A., and Connolly, B.A. (1992) Stereochemical outcome of the hydrolysis reaction catalyzed by the EcoRV restriction endonuclease. Biochemistry 31,7855-61.

18. McLaughlin, L.W., Benseler, F., Graeser, E., Piel, N. and Scholtissek, S. (1987) Effects of functional group changes in the EcoRI recognition site on the cleavage reaction catalyzed by the endonuclease. Biochemistry 26, 7238-45.

19. Jeltsch, A, Fritz, A, Alves, J, Wolfes, H, and Pingoud, A. (1993) A fast and accurate enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of the DNA cleavage activity of restriction endonucleases. Anal. Biochem. 213,234-40.

20. Waters, T.R., and Connolly, B.A. (1992) Continuous spectrophotometric assay for restriction endonucleases using synthetic oligodeoxynucleotides and based on the hyperchromic effect. Anal. Biochem. 204,204-209.

21. Ghosh, S.S., Eis, P.S., Blumeyer, K., Fearon, K., and Millar, D.P. (1994) Real time kinetics of restriction endonuclease cleavage monitored by fluorescence resonance energy transfer. Nucleic Acids Res. 22, 3155-3159.

22. Eisenschmidt, K., Lanio, Т., Jeltsch, A., and Pingoud, A. (2002) A fluorimetric assay for on-line detection of DNA cleavage by restriction endonucleases. J. Biotechnol. 96, 185-91.

23. Halford, S.E., and Goodall, A.J. (1988) Modes of DNA cleavage by the EcoRV restriction endonuclease. Biochemistry 27, 1771 -1777.

24. Gowers, D.M., Bellamy, S.R., and Halford, S.E. (2004) One recognition sequence, seven restriction enzymes, five reaction mechanisms. Nucleic Acids Res. 32,3469-79.

25. Newman, P.C., Williams, D.M., Cosstick, R., Seela, F., and Connolly, B.A. (1990) Interaction of the EcoRV Restriction Endonuclease with the Deoxyadenosine and Thymidine Bases in Its Recognition Hexamer d(GATATC). Biochemistry 29, 9902-9910.

26. Fliess, A., Wolfes, H„ Seela, F., and Pingoud, A. (1988) Analysis of the recognition mechanism involved in the EcoRV catalyzed cleavage of DNA using modified oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 16, 11781-11793.

27. Fliess, A. Wolfes, H., Rosenthal, A., Schwellus, K., Blocker, H., Frank, R., and Pingoud, A. (1986) Role of thymidine residues in DNA recognition by the EcoRI and EcoRV restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 16, 3463-3474.

28. Taylor, J.D., and Halford, S.E. (1989) Discrimination between DNA sequences by the EcoRV restriction endonuclease. Biochemistry 28, 6198-6207.

29. Modrich, P., and Zabel, D., (1976) EcoRI Endonuclease. Physical and Catalytic Properties of the Homogeneous Enzyme. J. Biol. Chem. 251, 5866-5874.

30. Kang YK, Lee HB, Noh MJ, Cho NY, Yoo OJ. (1995) Different effects of base analog substitutions in BamHI restriction site on recognition by BamHI endonuclease and BamHI methylase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 997-1002.

31. Mukhopadhyay, P., and Roy, K.B. (1998) Protein engineering of BamHI restriction endonuclease: replacement of Cys54 by Ala enhances catalytic activity. Protein Engineering 11, 931-5.

32. Nardone, G„ George, J., and Chirikjian, J.G. (1986) Differences in the Kinetic Properties of BarnHI Endonuclease and Methylase with Linear DNA Substrates. J. Biol. Chem. 261, 12128-12133.

33. Aiken, C.R., McLaughlin, L.W., and Gumport, R.I. (1991) The Highly Homologous Isoschizomers RsrI Endonuclease and EcoRI Endonuclease Do Not Recognize Their Target Sequence Identically. J. Biol. Chem. 266,19070-19078.

34. Yang, C.C., Baxter, B.K., and Topal, M.D. (1994) DNA Cleavage by Nael: Protein Purification, Rate-Limiting Step, and Accuracy. Biochemistry 33,14918-14925.

35. Williams, S.A., and Halford, S.E. (2001) Sfil endonuclease activity is strongly influenced by the non-specific sequence in the middle of its recognition site. Nucleic Acids Res. 29, 1476-83.

36. Jeltsch, A., Alves, J., Wolfes, H., Maass, G., and Pingoud, A. (1993) Substrate-assisted catalysis in the cleavage of DNA by the EcoRI and EcoRV restriction enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8499-503.

37. My D.S., and Perona, J.J. (1999) Catalytic Roles of Divalent Metal Ions in Phosphoryl Transfer by EcoRV Endonuclease. Biochemistry 38,6576-6586.

38. Lesser, D.R., Kurpiewski, M.R., Waters, Т., Connolly, B.A., and Jen-Jacobson, L. (1993) Facilitated distortion of the DNA site enhances EcoRI endonuclease-DNA recognition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7548-52.

39. Jen-Jecobson, L., Engler, L.E., Lesser, D.R., Kurpiewski, M.R., Yee, C., and McVerry, B. (1996) Structural Adaptations in the Interaction of EcoRI Endonuclease with Methylated GAATTC Sites. EMBOJ. 15,2870-82.

40. King, K., Benkovic, S.J., and Modrich, P. (1989) Glu-111 Is Required for Activation of the DNA Cleavage Center of EcoRI Endonuclease. J. Biol. Chem. 264, 11807-11815.

41. Langowski, J., Pingoud, A., Goppelt, M., and Maass, G. (1980) Inhibition of Eco RI action by polynucleotides. A characterization of the non-specific binding of the enzyme to DNA. Nucleic Acids Res. 8,4121-26.

42. Hensley, P., Nardone, G., Chirikjian, J.G., and M.E. Wastney (1990) The Time-resolved Kinetics of Superhelical DNA Cleavage by BamHI Restriction Endonuclease. J. Biol. Chem. 265, 1530015307.

43. Nardone, G., Wastneyn, M.E., and Hensley, P. (1990) DNA Structural Polymorphism Modulates the Kinetics of Superhelical DNA Cleavage by BamHI Restriction Endonuclease. J. Biol. Chem. 265, 15308-15315.

44. Alves, J., Pingoud, A., Langowski, J., Urbanke, C., and Maass, G. (1982) Two identical subunits of the EcoRI restriction endonuclease Co-operate in the binding and cleavage of the palindromic substrate. Eur. J. Biochem. 124, 139-42.

45. Baldwin, G.S., Vipond, I.B., and Halford, S.E. (1995) Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease. Biochemistry 34, 705-14.

46. Erskine, S. G., Baldwin, G. S., and Halford, S. E. (1997) Rapid-Reaction Analysis of Plasmid DNA Cleavage by the EcoRV Restriction Endonuclease. Biochemistry 36, 7567-7576.

47. Bitanaite, J., Wah, D.A., Aggarwal, A.K., and Schildkraut, I. (1998) Fokl dimerization is required for DNA cleavage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10570-10575.

48. Petrauskene, O.V., Karpova, E.A., Gromova, E.S., and Guschlbauer, W. (1994) Two subunits of EcoRII restriction endonuclease interact with two DNA recognition sites. Biochem. Biophys. Res. Commun. 198, 885-890.

49. Bath A. J., Halford S.E., Scott D.J. (2004) Analysis of Type II restriction endonucleases that interact with two recognition sites. In: Restriction Endonucleases. Ed.Pingoud A. Berlin: Springer-Verlag, 297-317.

50. Gowers, D.M., and Halford, S.E. (2003) Protein motion from non-specific to specific DNA by three-dimensional routes aided by supercoiling. EMBOJ. 22, 1410-8.

51. Halford, S.E., and Marko, J.F. (2004) How do site-specific DNA-binding proteins and their targets'? Nucleic Acids Res. 32, 103040-3052.

52. Wood, K.M., Daniels, L.E., Halford, S.E. (2005) Long-range Communications between DNA Sites by the Dimeric Restriction Endonuclease SgrAI. J. Mol. Biol. 350, 240-253.

53. Szczelkun, M.D., and Halford, S.E. (1996) Recombination by resolvase to analyse DNA communications by the Sfil restriction endonuclease. EMBOJ. 15, 1460-1469.

54. Seeman, N.C., Rosenberg, J.M., and Rich, A. (1976) Sequence-specific recognition of double helical nucleic acids by proteins. Proc.Natl.Acad. Sci. USA 73, 804-08.

55. Hashimoto, H., Shimizu, Т., Imasaki, Т., Kato, M., Shichijo, N., Kita, K., and Sato, M. (2005) Crystal structures of type II restriction endonuclease Eco0109I and its complex with cognate DNA. J. Biol. Chem. 280, 5605-10.

56. Wenz, C., Jeltsch, A., and Pingoud, A. (1996) Probing the indirect readout of the restriction enzyme EcoRV. Mutational analysis of contacts to the DNA backbone. J. Biol. Chem. 271, 5565-73.

57. Thielking, V., Selent, U., KGhler, E., Wolfes, H., Pieper, U., Geiger, R., Urbanke, C., Winkler, F. K., and Pingoud, A. (1991) Mg2+ confers DNA binding specificity to the EcoRV restriction endonuclease. Biochemistry 30, 6416-22.

58. Mazzarelli, J., Scholtissek, S., and McLaughlin, L.W. (1989) Effects of functional group changes in the EcoRV recognition site on the cleavage reaction catalyzed by the endonuclease. Biochemistry 28,4616-22.

59. Kiss, A., Posfai, G., Zsurka, G., Rasko, Т., Venetianer, P. (2001) Role of DNA minor groove interactions in substrate recognition by the M.SinI and M.EcoRJI DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res. 29, 3188-3194.

60. Fersht, A. (1999) Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Freeman, 1999.

61. Sapienza, P.J., Dela Torre, C.A., McCoy, W.H. 4th., Jana, S.V., and Jen-Jacobson, L. (2005) Thermodynamic and kinetic basis for the relaxed DNA sequence specificity of "promiscuous" mutant EcoRI endonucleases. J. Mol. Biol. 348, 307-24.

62. Winkler, F.K. et al. (1993) The crystal structure of EcoRV endonuclease and of its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments. EMBOJ. 12, 1781-1795.

63. Xu, Q.S., Kucera, R.B., Roberts, R.J., and Guo, H.C. (2004) An asymmetric complex of restriction endonuclease Mspl on its palindromic DNA recognition site. Structure 12,1741-1747.

64. Busslinger, M., deBoer, E., Wring, S., Grosveld, F.G., and Flavell, R.A. (1983) The sequence GGCmCGG is resistant to Mspl cleavage. Nucleic Acids Res. 11,3559-3569.

65. Tardy-Planechaud, S., Fujimoto, J., Lin, S.S., and Sowers, L.C. (1997) Solid phase synthesis and restriction endonuclease cleavage of oligodeoxynucleotides containing 5-(hydroxymethyl)-cytosine. Nucleic Acids Res. 25, 553-558

66. Kim, Y.C., Grable, J.C., Love, R., Greene, P.J., and Rosenberg, J.M. (1990) Refinement of EcoRI endonuclease crystal structure: a revised protein chain tracing. Science 249, 1307-9.

67. Hentosh, P., and McCastlain, J.C. (1991) Effects of 2-chloradenine substitution in DNA on restriction endonuclease cleavage reactions. Nucleic Acids Res. 19,3143-8.

68. Viadiu, H., and Aggarval, A.K. (1998) The role of metals in catalysis by the restriction endonuclease BamHI. Nature Struct. Biol. 5, 910-916.

69. Kostrewa, D., and Winkler, F. (1995) Mg2+ binding to the active site of EcoRV endonuclease: a crystallographic study of complexes with substrate and product DNA at 2 A resolution. Biochemistry 34, 683-96.

70. Lesser, D.R., Kurpiewski, M.R., and Jen-Jacobson, L. (1990) The energetic basis of specificity in the Eco RI endonuclease-DNA interaction. Science 250, 776-786.

71. Parry, D„ Moon, S.A., Liu, H.-H., Heslop, P., and Connolly, B.A. (2003) DNA Recognition by the EcoRV Restriction Endonuclease Probed using Base Analogues. J. Mol. Biol. 331, 1005-1016.

72. Waters, T.R. and Connolly, B.A. (1994) Interaction of the Restriction Endonuclease EcoRV with the Deoxyguanosine and Deoxycytidine Bases in Its Recognition Sequence. Biochemistry 33, 18121819.

73. Stover, Т., Kohler, E., Fagin, U., Wende, W., Wolfes, H., and Pingoud, A. (1993) Determination of the DNA Bend Angle Induced by the Restriction Endonuclease EcoRV in the Presence of Mg2+. J. Biol. Chem. 268, 8645-50.

74. Rosenberg, J. M. (1991) Structure and function of restriction endonucleases. Curr. Opin. Struct. Biol. I, 104-113.

75. Perona, J.J., and Martin, A.M. (1997) Conformational transitions and structural deformability of R.EcoRV endonuclease revealed by crystallographic analysis. J. Mol. Biol. 273,207-25.

76. Szekeres, M., and Matveyev, A.V. (1987) Cleavage and sequence recognition of 2,6-diaminopurine-containing DNA by site-specific endonucleases. FEBS Letters 222, 89-94.

77. Bodnarz, J.W., Zempsky, W., Warder, D., Bergson, C., and Ward, D.C. (1983) Effect of Nucleotide Analogs on the Cleavage of DNA by the Restriction Enzymes AM, Ddel, Hinfl, Rsal,and Taql. J. Biol. Chem. 258,15206-15213.

78. Advani, S., and Roy, K.B. (2000) BanI restriction endonuclease binds in the major groove of DNA: an inhibition kinetic study using substrates with mismatch basepairs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 269,35-40.

79. VanderVeen, L.A., Druckova, A., Riggins, J.N., Sorrells, J.L., Guengerich, F.P., and Marnett, L.J. (2005) Differential DNA Recognition and Cleavage by EcoRI Dependent on the Dynamic

80. Equilibrium between the Two Forms of the Malondialdehyde-Deoxyguanosine Adduct. Biochemistry 44, 5024-5033.

81. Jones, D.S., Nemoto, F., Kuchino, Y., Ohtsuka, E., and Nishimura, S. (1990) 8-Hydroxydeoxyguanosine in DNA inhibits restriction endonuclease digestion. Nucleosides&Nucleotides 9,223-233.

82. Voigt, J.M., and Topal, M.D. (1990) 06-methylguanine in place of guanine causes asymmetric single-strand cleavage of DNA by some restriction enzymes. Biochemistry 29, 1632-1637.

83. Шефлян, Г.Я., Кубарева, E.A., Громова, E.C., и Шабарова, З.А. (1993) Изучение гидролиза ДНК-дуплексов, содержащих 5-фтородезоксицитидин, с помощью эндонуклеаз рестрикции. Биохимия 58, 1806-1811.

84. Kuroyedov АА, Grokhovsky SL, Zhuze AL, Nosikov VV, Polyanovsky OL. (1977) Distamycin A and its analogs as agents for blocking of endo R. EcoRI activity. Gene 1,389-395.

85. Horton, N.C., and Perona, J.J. (1998) Role of protein-induced bending in the specificity of DNA recognition: crystal structure of EcoRV endonuclease complexed with d(AAAGAT) + d(ATCTT). J. Mol. Biol. 277, 779-787.

86. Etzkorn, C., and Horton, N.C. (2004) Mechanistic Insights from the Structures of HincII Bound to Cognate DNA Cleaved from ddition ofMg2+ and Mn2+. J. Mol. Biol. 343, 833-849.

87. Szczelkunt, M.D., and Connolly, B.A. (1995) Sequence-Specific Binding of DNA by the EcoRV Restriction and Modification Enzymes with Nucleic Acid and Cofactor Analogues? Biochemistry 34, 10724-10733.

88. Mayer, A.N., Barany, F. (1994) Interaction of Tuql Endonuclease with the Phosphate Backbone. Effects of steteospecific phosphate modification. J. Biol. Chem. 269,29067-29076.

89. King, J.B., Bowen, L.M., and Dupureur, C.M. (2004) Binding and Conformational Analysis of Phosphoramidate-Restriction Enzyme Interactions. Biochemistry 43, 8551-8559.

90. Громова, E.C., Виноградова, M.H., Упорова, T.M., Грязнова, О.И., Исагулианц, М.Г. (1987) ДНК-дуплексы с амидофосфитной связью: взаимодействие с эндонуклеазами рестрикции EcoRII и SsoII. Биоорг. Хим. 13,269-272.

91. Siebenlist, U., and Gilbert, W. (1980) Contacts between Escherichia coli RNA polymerase and an early promoter of phage T7. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 122-26.

92. Lu, A-L., Jack, W.E., and Modrich, P. (1981) DNA Determinants Important in Sequence Recognition by Eco RI Endonuclease. J. Biol. Chem. 256, 13200-13206.

93. Engler, L.E., Sapienza, P., Dorner, L.F., Kucera, R., Schildkraut, I., and Jen-Jecobson, L. (2001) The energentics of the interaction of BamHI endonuclease with its recognition site GGATCC. J. Mol. Biol. 307, 619-636.

94. Withers, B.E. and Dunbar, J.C. (1995) DNA determinants in sequence-specific recognition by Xmal endonuclease. Nucleic Acids Res. 23,3571-3577.

95. Engler, L.E., Welch, K.K., and Jen-Jacobson, L. (1997) Specific Binding by EcoRV Endonuclease to its DNA Recognition Site GAT АТС. J. Mol. Biol. 269, 82-101.

96. Frederick, C.A., Grable, J., Melia, M., Samudzi, C., Jen-Jacobson, L., Wang, B.-C., Greene, P., Boyer, H. W., and Rosenberg, J.M. (1984) Kinked DNA in crystalline complex with EcoRI endonuclease. Nature 309,327-331.

97. Zebala, J.A., Choi, J., Trainor, G.L., and Barany, F. (1992) DNA recognition of base analogue and chemically modified substrates by the TaqI restriction endonuclease. J. Biol Chem. 267, 810616.

98. Frey, P.A., and Sammons, R.D. (1985) Bond order and charge localization in nucleoside phosphorothioates. Science 228, 541-545.

99. Liang, C., and Allen, L.C. (1987) Sulfur does not form double bonds in phosphorothioate anions. J. Am. Chem. Soc. 109, 6449-6453.

100. Bertrand, H.O., Pullman, A., Zakrzewska, K., Hartmann, В., and Fermandjian, S. (1999) Determination of a set of parameters for the molecular modelling of phosphorothioate DNA. Theor. Chem. Acc. 101,269-273.

101. Cruse, W.B., Salisbury, S.A., Brown, Т., Cosstick, R., Eckstein, F., and Kennard, O. (1986) Chiral phosphorothioate analogues of B-DNA. The crystal structure of p-dGp(S)CpGp(S)CpGp(S)C. J. Mol Biol 192, 891-905.

102. Koziolkiewicz, M., and Stec, W. J. (1992) Application of Phosphate-Backbone-Modified Oligonucleotides in the Studies on EcoRI Endonuclease Mechanism of Action. Biochemistry 31, 9460-9466.

103. Potter, В., and Eckstein, F. (1984) Cleavage of Phosphorothioate-substituted DNA by Restriction Endonucleases. J. Biol Chem. 259,14243-8.

104. Sayer, J.R., Olsen, D.B., and Eckstein, F. (1989) Inhibition of restriction endonuclease hydrolysis by phosphorothioate-containing DNA. Nucleic Acids Res. 17, 9495.

105. Taylor, J.W., Schmidt, W., Cosstick, R., Okruszek, A., and Eckstein, F. (1985) The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reaction to prepare nicked DNA. Nucleic Acids Res. 13, 8749-8764.

106. Nobbs, T.J., Williams, S.A., Connolly, B.A., and Halford, S.E. (1998) Phosphorothioate Substrates for the Sfil Restriction Endonuclease. Biol Chem. 379,599-604.

107. Horton, N.C., Newberry, K.J., and Perona, J.J. (1998) Metal ion-mediated substrate-assisted catalysis in type II restriction endonucleases. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 13489-13494.

108. Jeltsch, A., Alves, J., Maass, G., and Pingoud, A. (1992) On the catalytic mechanism of EcoRI and EcoRV. A detailed proposal based on biochemical results, structural data and molecular modelling. FEBS Lett. 304,4-8.

109. Connolly, B.A., Eckstei, F., and Pingoud, A. (1984) The Stereochemical Course of the Restriction Endonuclease EcoRI catalyzed Reaction. J. Biol. Chem. 259, 10760-10763.

110. Geyer, H., Geyer, R., and Pingoud, V. (2004) A novel strategy for the identification of protein-DNA contacts by photocrosslinking and mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 32, el32.

111. David L. Wong, James G. Pavlovich and Norbert O. Reich (1998) Electrospray Ionization Mass Spectrometric Characterization of Photocrosslinked DNA-EcoRI DNA Methyltransferase Complexes. Nucleic Acids Res. 26, 645-649.

112. Mucke, M., Pingoud, V., Grelle, G., Kraft, R., Kruger, D.H., and Reuter, M. (2002) Asymmetric photocross-linking pattern of restriction endonuclease EcoRII to the DNA recognition sequence. J. Biol. Chem. 277, 14288-93.

113. Norris, C.L., Meisenheimer, P.L., and Koch, Т.Н. (1996) Mechanistic Studies of the 5-Iodouracil Chromophore Relevant to Its Use in Nucleoprotein Photo-Cross-Linking. J. Am. Chem. Soc. 118, 5796-5803.

114. Willis, M.C., LeCuyer, K.A., Meisenheimer, K.M., Uhlenbeck, O.C., and Koch, Т.Н. (1994) An RNA-protein contact determined by 5-bromouridine substitution, photocrosslinking and sequencing. Nucleic Acids Res. 22,4947-4952.

115. Meisenheimer, K.M., Meisenheimer, P.L, Willis, M.C., and Koch, Т.Н. (1996) High yield photocrosslinking of a 5-iodocytidine (1С) substituted RNA to its associated protein. Nucleic Acids Res. 24, 981-982.

116. Babkina, O.V., Chutko, C.A., Shashkov, A.A., Dzhidzhoev, M.S., Eritja, R.I., and Gromova, E.S. (2002) Iodouracil-mediated photocrosslinking of DNA to EcoRII restriction endonuclease in catalytic conditions. Photochem. Photobiol. Sci. 1, 636-40.

117. Шефлян, Г.Я., Кубарева, E.A., и Громова, Е.С. (1996) Методы ковалентного присоединения нуклеиновых кислот и их производных к белкам. Успехи Химии 65, 765-81.

118. Wolfes, Н., Fliess, A., Winkler, F., and Pingoud, А. (1986) Cross-linking of bromodeoxyuridine-substituted oligonucleotides to the EcoRI and EcoRV restriction endonucleases. Eur. J. Biochem. 159, 267-273.

119. Pleiss, M.G., and Cerutti, P.A. (1971) Phototransformation of 4-thiouridine in Escherichia coli valine-transfer ribonucleic acid to uridine, cytidine, and N4-methylcytidine. Biochemistry 10, 30933099.

120. Nikiforov, T.T., and Connolly, B.A. (1992) Oligodeoxynucleotides containing 4-thiothymidine and 6-thiodeoxyguanosine as affinity labels for the Eco RV restriction endonuclease and modification methylase. Nucleic Acids Res. 20, 1209-1214.

121. Mayer, A.N., and Barany, F. (1995) Photoaffinity cross-linking of TaqI restriction endonuclease using an aryl azide linked to the phosphate backbone. Gene 153, 1-8.

122. Sheflyan, G.Ya., Kubareva, E.A., Kuznetsova, S.A., Karyagina, A.S., Nikolskaya, I.I., Gromova, E.S., and Shabarova, Z.A. (1996) Cross-linking of SsoII restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs. FEBS Lett. 390, 307-10.

123. Sheflyan, G.Y., Kubareva, E.A., Gromova, E.S., and Shabarova, Z.A. (1998) Conformational transition of restriction endonuclease Mval-substrate complex under the influence of Mg2"1" probed by DNA-protein cross-linking studies. Bioconjug Chem. 9, 703-7.

124. Becker, M.M., Lesser, D., Kurpiewski, M., Baranger, A., and Jen-Jacobson, L. (1988) "Ultraviolet footprinting" accurately maps sequence-specific contacts and DNA kinking in the EcoRI endonuclease-DNA complex. Proc. Natl. Acad Sci. USA 85, 6247-51.

125. Liu, W., Chen, Y., Watrob, H., Bartlett, S.G., Jen-Jacobson, L., and Barkley, M.D. (1998) N-termini of EcoRI restriction endonuclease dimer are in close proximity on the protein surface. Biochemistry 37, 15457-65.

126. Фрайфельдер (1980) Физическая Биохимия. М:Мир.

127. Watrob, Н., Liu, W., Chen, Y., Bartlett, S.G., Jen-Jecobson, L., and Barkley, M.D. (2001) Solution conformation of EcoRI restriction endonuclease changes upon binding of cognate DNA and Mg2+ cofactor. Biochemistry 40, 683-692.

128. Erskine, S.G., and Halford, S.E. (1998) Reaction of the EcoRV restriction endonuclease with fluorescent oligonucleotides: identical equilibrium constants for binding to specific and non-specific DNA. J. Mol. Biol. 275,759-772.

129. Reid, S.L., Parry, D., Liu, H.-H., and Connolly, B.A. (2001) Binding and recognition of GAT АТС taget sequences by the EcoRV restriction endonuclease: a study using fluorescent oligonucleotides and fluorescence polarization. Biochemistry 40,2484-2494.

130. Hiller, D.A., Fogg, J.M., Martin, A.M., Beechem, J.M., Reich, N.O., and Perona, J.J. (2003) Simaltaneous DNA binding and bending by EcoRV endonuclease observed by real-time fluorescence. Biochemistry 42, 14375-14385.

131. Norman, D.G., Grainger, R.J., Uhrin, D., and Lilley, D.M.J. (2000) Location of cyanine-3 on double-stranded DNA: importance for fluorescence resonance energy transfer studeis. Biochemistry 39, 6317-6324.

132. Hillesch, A., Lorenz, M., and Diekmann, S. (2001) Recent advances in FRET: distance determination in protein-DNA complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 11,201-207.

133. Weiss, S. (1999) Fluorescence Spectroscopy of Single Biomolecules. Science 283,1676-1683.

134. Eigen, M., and Rigler, R. (1994) Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5740-5747.

135. Katiliene, Z., Katilius, E., and Woodbury, N.W. (2003) Single Molecule Detection of DNA Looping by NgoMIV Restriction Endonuclease. Biophys. J. 84,4053-4061.

136. Kettling, U., Koltermann, A., Schwille, P., and Eigen M. (1998) Real-time enzyme kinetics monitored by dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1416-1420.

137. Reuter, M., Kupper, D., Pein, C.-D., Petrusyte, M., Siksnys, V., Frey, В., and Kruger, D.H. (1993) Use of Specific Oligonucleotide Duplexes to Stimulate Cleavage of Refractory DNA Sites by Restriction Endonucleases. Anal. Biochem. 209,232-237.

138. Mucke, M., Kruger, D.H., and Reuter, M. (2003) Diversity of Type II restriction endonucleases that require two DNA recognition sites. Nucleic Acids Res. 31, 6079-6084.

139. Friedhoff, P., Lurz, R., Luder, G., and Pingoud, A. (2001) Sau3AI, a Monomeric Type II Restriction Endonuclease That Dimerizes on the DNA and Thereby Induces DNA Loops. J. Biol. Chem. 276,23581-23588.

140. Mucke, M., Grelle, G., Behlkel, J., Kraft, R., Kruger, D.H., and Reuter, M. (2002) EcoRII: a restriction enzyme evolving recombination functions? EMBO J. 21, 5262-5268.

141. Reuter, M., Kupper, D., Meisel, A., Schroeder, C., and Kruger, D.H. (1998) Cooperative binding properties of restriction endonuclease EcoRII with DNA recognition sites. J. Biol. Chem. 273, 8294-300.

142. Carrick, K.L., and Topal, M.D. (2003) Amino Acid Substitutions at Position 43 of Nael Endonuclease. J. Biol. Chem. 278, 9733-9739.

143. Berger, J.M., Fass, D., Wang, J.C., and Harrison, S.C. (1998) Structural similarities between topoisomerases that cleave one or both DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7876-7881.

144. Jo, K., and Topal, M.D. (1995) DNA topoisomerase and recombinase activities in Nae I restriction endonuclease. Science 267, 1817-1820.

145. Topal, M.D., and Conrad, M. (1993) Changing endonuclease EcoRII Tyr308 to Phe abolishes cleavage but not recognition: possible homology with the Int-family of recombinases. Nucleic Acids Res. 21,2599-2603.

146. Krueger, D.H., Barcak, G.J., Reuter, M., and Smith, H.O. (1988) EcoRII can be activated to cleave refractory DNA recognition sites. Nucleic Acids Res. 16, 3997-4008.

147. Reuter, M., Pein, C.-D., Butkus, V., and Kruger,D.H. (1990) An improved method for the detection of Dcm methylation in DNA molecules. Gene 95, 161-162.

148. Conrad, M., and Topal, M.D. (1989) DNA and spermidine provide a switch mechanism to regulate the activity of restriction enzyme Nael. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9707-9711.

149. Pein, C.-D., Reuter, M., Cech, D., and Krueger, D.H. (1989) Oligonucleotide duplexes containing CC(a/t)GG stimulate cleavage of refractory DNA by restriction endonuclease EcoRII. FEBSLett. 245,141-144.

150. Conrad, M., and Topal, M.D. (1992) Modified DNA fragments activate Nael cleavage of refractory DNA sites. Nucleic Acids Res. 20, 5127-5130.

151. Gabbara, S., and Bhagwat, A.S. (1992) Interaction of EcoRII endonuclease with DNA substrates containing single recognition sites. J. Biol. Chem. 267, 18623-18630.

152. Yang, C.C., and Topal, M.D. (1992) Nonidentical DNA-binding sites of endonuclease Nael recognize different families of sequences flanking the recognition site. Biochemistry 31,9657-64.

153. Petrauskene, O.V., Babkina, O.V., Tashlitsky, V.N., Kazankov, G.M., and Gromova, E.S. (1998) EcoRII endonuclease has two identical DNA-binding sites and cleaves one of two coordinated recognition sites in one catalytic event. FEBS Lett. 425, 29-34.

154. Embleton, M.L., Siksnys, V., and Halford, S.E. (2001) DNA cleavage reactions by Type II restriction enzymes that require two copies of their recognition sites. J. Mol. Biol. 311, 503-514.

155. Petrauskene, O.V., Kubareva, E.A., Gromova, E.S., and Shabarova, Z.A. (1992) Mechanism of the interaction of EcoRII restriction endonuclease with two recognition sites. Eur. J. Biochem. 208, 617-622.

156. Krueger, D.H., Kupper, D., Meisel, A., Reuter, M., and Schroeder, C. (1995) The significance of orientation of restriction endonuclease recognition sites in viral DNA genomes. FEMS Microbiol. Rev. 17, 177-184.

157. Topal, M.D., Thresher, R.J., Conrad, M., and Griffith, J. (1991) Nael endonuclease binding to pBR322 DNA induces looping. Biochemistry 30, 2006-2010.

158. Halford, S.E. (2001) Hopping, jumping and looping by restriction enzymes. Biochemical Society, Medal lecture 363-373.

159. Jeltsch, A., Alves, J., Wolfes, H., Maass, G., and Pingoud, A. (1994) Pausing of the restriction endonuclease EcoRI during linear diffusion on DNA. Biochemistry 33, 10215-10219.

160. Кирсанова, O.B., Баскунов, В.Б., и Громова, Е.С. (2004) Эндонуклеазы Рестрикции Типа IIE и IIF, Взаимодействующие с Двумя Участками Узнавания в ДНК. Молекуляр. Биол. 38, 886-900. Обзор.

161. Oiler, A., Broek, W.V., Conrad, М., and Topal, М. (1991) Ability of DNA and spermidine to effect the activity of restriction endonucleases from several bacterial species. Biochemistry 30,25432549.

162. Thorogood, H., Grasby, J.A., Connolly, B.A. (1996) Influence of the phosphate backbone on the recognition and hydrolysis of DNA by the EcoRV restriction endonuclease. A study using oligodeoxynucleotide phosphorothioates. J. Biol. Chem. 271, 8855-8862.

163. Iyer, R.P., Phillips, L.R., Egan, W., Regan, J.B., Beaucage, S.L. (1990) J. Org. Chem. 55, 46934699.

164. Tamura, Y., Miyoshi, H., Yokota, Т., Makino, K., and Murakami, A. (1998) Preparation of stereoregulated antisense oligodeoxyribonucleoside phosphorothioate and interaction with its complementary DNA and RNA. Nucleosides Nucleotides 17,269-282.

165. Stec W.J., Zon G. (1984) Tetrahedron Lett. 25, 5275-5278.

166. Schleif,R. (1992) DNA looping. Annu. Rev. Biochem. 61, 199-223.

167. Deibert, M., Grazulis, S., Sasnauskas, G., Siksnys, V., and Huber, R. (2000) Structure of the tetrameric restriction endonuclease NgoMIV in complex with cleaved DNA. Nature Struct. Biol. 7, 792-799.

168. Ferrer, E., Wiersma, M., Kazimierczak, В., Mueller, C.W., and Eritja, R. (1997) Preparation and properties of oligodeoxynucleotides containing 5-iodouracil and 5-bromo- and 5-iodocytosine. Bioconjugate Chem. 8, 757-761.

169. Sambrook, J., Fritch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor, 1989.

170. Gohlke, C, Murchie, A.I., Lilley, D.M., and Clegg, R.M. (1994) Kinking of DNA and RNA helices by bulged nucleotides observed by fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11660-4.

171. Clegg, R.M., Murchie, A.I., Zechel, A., and Lilley, D.M. (1993) Observing the helical geometry of double-stranded DNA in solution by fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,2994-8.

172. Edelman, L.M., Cheong, R., and Kahn, J.D. (2003) Fluorescence Resonance Energy Transfer over-130 Basepairs in Hyperstable Lac Repressor-DNA Loops. Biophys. J. 84,1131-1145