Региоселективное взаимодействие синтетических олигонуклеотидов с РНК. Результаты, перспективы дизайна лекарственных препаратов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ОЛ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На пранах рукописи

МЕТЕЛЕВ Валерий Георгиевич

РЕГИОСЕЛЕКТИВНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВС РНК. РЕЗУЛЬТАТЫ, ПЕРСПЕКТИВЫ ДИЗАЙНА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

02.00.10 - биоорпшическяя химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация п виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Мел-факультетской проблемной НИЛ им.А.Н.Белозерского МГУ им.М.В.Ломоносова и Вустерском центре экспериментальной биологии (США)

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, чл. - корр. РАН, профессор

Е.Д.Свердлов

доктор химических наук, профессор

Н.И.Гринева

доктор химических наук, профессор

Б.П.Готгих

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Государственный НИИ генетики и

Защита состоится 28 мая 1996 года в 16 часов на заседании диссертационно!о совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова но адресу: Москва 119899, Воробьевы юры, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Диссертация в виде научною доклада разослана 25 апреля 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного сонета, / //

кандидат химических наук

селекции промышленных микроорганизмов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтетические олигонуклеотиды незаменимы при решении многих задач молекулярной биологии благодаря присущему им уникальному свойству — способности к комплемента-шимшым взаимодействиям с природными нуклеиновыми кислотами. За последние годы область использовании синтетических олигоде-зоксирнбонуклеотидов значительно расширилась. Эти соединения сейчас применяются не только как инструменты исследования природных структур и процессов, но и для направленного воздействия на процессы реализации генетической информации как in viiro, так и in vivo. Антисенсовые олигонуклеотидтиофосфаты, например, являются новым классом противовирусных реагентов, проходящих в настоящее время нрелклиническис и клинические испытания. Происходит становление "антисенсовой" технологии, основанной на подавлении трансляции синтетическими олигопуклеотидами, и дальнейшее ее развитие требует решения очень сложных органо-химических, молекулярно-биологических, фармацевтических, медицинских и др. залач. На долю химиков—биооргаников выпадает разработка методов синтеза и очистки олигонуклеотидов и их производных в препаративных и суперпрепаративных количествах, создание соединений, обеспечивающих эффективное проникновение в клетки, высокоэффективное и высокосиепифичное взаимодействие с нуклеиновыми кислотами-мишенями и др. Поэтому работы, направленные на изучение и повышение специфичности (регносе-лективности) взаимодействия синтетических олигонуклеотидов — основы успешного использования их в самых разных аспектах — являются актуальными и в настоящее время. •

Основная цель работы состояла в осуществлении направленного ферментативного воздействия на высокомолекулярные РНК через короткие участки макромолекулы, образующие специфические гибридные дуплексы с комплементарными им синтетическими олиго-дезоксирибонуклеотидами. Особое внимание уделено модификации сахаро-фосфатного остова олигонуклеотилных зондов для повышения специфичности гибридазного расщепления, а также для обеспечения их биологической активности в опытах in vivo.

В ходе исследования решались следующие задачи: изучение и оптимизация условии комплексообразования синтетических 6~12-звен-ных олигодезоксирибонуклеотидов с РНК бактериофагов R17 и MS2; доказательство pei иоселективности гибридизации синтезированных олшонуоеотидов с РНК-матрицами; разработка метода инициации обратной транскрипции высокомолекулярных РНК с фиксированного участка матрицы с помощью синтетических гетерогенных по составу олигодезоксирибонуклеотидов—затравок; разработка метода региоселектииного расщеплении природных РНК РНКазои Н в гибридных дуплексах с синтетическими олигоде юкси-рибонуклеотидами; изучение расщепления РНК РНКазои Н в несовершенных гибридных дуплексах; разработка метода региоспеци-фического расщепления природных РНК; конструирование олшо-нуклеотидных ирон ¡водных в плане повышения их биологическом активности в системах in vitro, синтез и практическое использование их как ацтисенсовых соединений.

Научная новизна работы. В работе впервые показано, что короткие 8-12-звенные олигодезоксирибонуклеотиды могут региоселективно взаимодействовать с целевыми участками высокомолекулярных природных РНК; ровер газа и РНКаза Н способны узнать такие искусственно созданные гибридные дуплексы и начать элонгацию затравки с топографически фиксированной точки (в случае обратной тран-скринтазы) или реиюселективно расщепить полирибонуклеотидную цепь в случае РНКагы Н из Е. coli. Впервые показано, что в присутствии загранки ревертата осуществляет полную обратную транскрипцию фрагмента РНК, имеющего прочную вторичную структуру. Разработан метод региоселектииного расщепления молекул РНК в гибридном дуплексе с гетерогенным по составу синтетическим олигодезоксирибонуклеотидом. С помощью лого метода показана возможность получения функционально-активных фрагментов генома полинистронных вирусных РНК. Впервые осуществлен ре-гиослепифический гидролиз РНК РНКазои Н в дуплексе со специально сконструированным олигонуклеогидом. Предложены новые структуры олигонуклеотидтиофосфатов, обладающие повышенной устойчивостью к действию нуклеаз, сродством к РНК мишени, сохраняющие способность активировать РНКазу Н и проявляющие

J

более высокую противовирусную актипность, чем исходные соединения.

Практическая ценность работы. Получение результаты значительно расширили возможности использования синтетических олигонуклео-тидои и их производных в генетической инженерии ДНК и РНК, а также при определении перпнчной структуры РНК. Предложенные впервые нами, а позже подтвержденные в работах других исследователей методы направленной обратной транскрипции и регноселек-тивного растепления РНК в настоящее время являются стандартными лабораторными методами при работе с РНК. Олигонуклеотид-тиофосфаты и их производные, успешно использованы для подавления in vitro роста ВИЧ-1, М. smegmatis, Plasmodium falciparum и др. Для обеспечения проникновения антисенсовых олнгодезоксирибо-нуклеотидтиофосфатов в микобактерии предложено и осуществлено на практике использование низкомолекулярных, ковадентно присоединенных лигандов (в частности, D-циклосерина). Разработаны условия хроматографнческого анализа олигонуклеотидтиофосфатов и смешанных олигонуклеотндов на слабых анионообменниках.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на советско-французском симпозиуме (Пушино, 1974), на 111 Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974), на советско-американском симпозиуме "Структура и функции нуклеиновых кислот" (Киев, 1975), на 1-ой Всесоюзной конференции по химии нуклеотидов и нуклеози-яов (Рига, 1975), на Всесоюзном рабочем совещании по химии и биохимии олигонуклеотндов (Вильнюс, 1979), на IV двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" (Ереван, 1981), на конференции "Вирусы микроорганизмов" (Пушино, 1981), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на V Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов" (Юрмала, 1987), на Международном рабочем совещании "Перспективы применения в терапии и диагностике производных олигонуклеотндов" (Новосибирск, 1988), Всесоюзных рабо-111 х совещаниях по органической химии ДНК-дуплексов (Тбилиси, 1987; Киев, 1989), Международном симпозиуме "Синтетические ишгонукдеотиды: проблемы и перспективы практического примене-!ия" (Москва, 1991), на международной конференции "Стратегии в штисенсовой технологии" (Филадельфия, США, 1992), на Между-

народной конференции "Применение нуклеиновых кислот в медицине" (Канкун, Мексика, 1993), на конференции "Новые методы в научных исследованиях" (Бостон, США, 1993), на 2-ой Международной конференции "Антисенсовые нуклеиновые кислоты" (Гармиш-Партенкирхен, Германия, 1995), а также на научных конференциях Г1НИЛ им.А.Н. Белозерского и Химического факультета МГУ и на заседании кафедры химии природных соединении Химического факультета МГУ, на семинарах в Вустерском центре экспериментальной биологии (Шрусбери, США).

Циклы работ, в которых были представлены отдельные л апы гни о исследования, получили премии Минвуза СССР в 1979 и 1986 п. Часть представленного в диссертации материала получила I место и конкурсе работ Межфакулыетской лаборатории им.А.Н.Белозерского МГУ в 1980 г.

Диссертация обобщает данные 46 основных публикации. Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены и настоящем докладе. Работа выполнена в 1974-1995 п .

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, в разработке подходов для решении поставленных задач, обсуждении и оформлении полученных результатов в совместных исследованиях с сотрудниками МГУ, И МБ, Института органического синтеза (Латвия) и Вустерского центра экспериментальной биологии. Автор лично принимал активное участие в выполнении экспериментальной работы во всех этапах исследования (в проведении синтеза и очистки олигонуклеотидо», выполнении молекулярно-биоло! ическнх и фи шко-хнмнческнх экспериментов).

I. ИССЛЕДОВАНИЕ КОМГ1ЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ С РНК БАКТЕРИОФАГОВ.

К моменту начала наших исследований подавляющее большинство работ по изучению взаимодействия синтетических олигодезок-сирибонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами проводилось на системах, включающих одноиепочечные ДНК и олиго- иди полидезок-

сирибонуклеопшм. Мсжлу тем, РНК вирусов, на наш вилял, представляли не меньший интерес, имея в виду не только разработку методов исследования структуры и функций РНК с помощью синтетических олнгопуклеотидов, но и потенциал!,мою активною воздействия на такие важнейшие биохимические процессы, как репликацию, трансляцию, обратную транскрипцию л их макромолекул. Более тою, к тому времени первичная и вторичная структура некоторых видов »тих РНК были изучет,i и имелись сведения о фуикиио-нально-активпой роли отдельных фрагментов РНК. В частности, для РНК антигеппо родственных бактериофаюв KI7 и MS2, выбранных нами в качестве объекта—модели исследования, была установлена нуклеотндная последовательность цистрона структурною белка, межцистроннои области, участка инициации трансляции гена РНК-полимеразы и лр., а также выдвинуты предположения о вторичной структуре ряда участков. Эти сведения позволили нам выбрать для синтеза олигонуклеотилы d(pGGTAAT), d(pGGTAATCC) (см. схему 1), а позже сКССЛТСПТГ). d(TTTCCATCTTTT) и d(CTCATGTT), комплементарные участкам РНК, которые по косвенным данным могли быть доступны для коммлексообразопания. Важной особенностью выбранной для исследования системы является возможность проведения экспериментов не только с целой РНК фига MS2 длиной 3569 нуклеотидных остатков, но и с ее относительно доступным 59— звенным фрагментом с известной первичной и установленной вторичной структурой и включающим в свой состав участки, комплементарные синтезированным гекса- и октадезоксирибопуклеотидам.

Схема I.

Структура генома бактериофага MS2 и участки РНК,

комплементарные синтезированным олигопуклеотидам

Работы по исследованию взаимодействия синтетических олигодезок-сирибонуклеогидов с фаговыми РНК были проведены совместно с сотрудниками кафедры вирусологии Биологического факультет МГУ.

Для изучения взаимодействия синтезированных олигонуклео-тидов с РНК фага К17 и РНК из ряда других источников, которые использовались для сравнения, был применен метод комплексообра-зованин .ч растворе с последующим отделением комплекса "РНК:-олиголезоксирибонуклеотид" от избытка последнего гель-фильтрацией на сефадексе Cj-75. Для удобства тестирования комплекса в олигонуклеотид предварительно вводилась метка (тритиевая или |32Р|). Кроме РНК фага RI7 в опытах по комплексообразованию были использованы формилированнаи РНК фага R17. 3S фрагменты РНК фага RI7, РНК аптигенно родственных фаюв MS2 и 12, а также ангигепно отдаленного фага Qf) и I6S РНК из рибосом Е. coli. Отметим, что при гель-фильтрации в неравновесной системе обнаруживаются только достаточно прочные комплексы "НК:олигонук-леотид", и само по себе связывание, регистрируемое по появлению метки в зоне выхода РНК, еще не является доказательством региосе-лективности комплексообраювании. Связывание РНК фа гон R17 н MS2 с d(pGGTAAT) и d(CCATCTTT) удается обнаружить лишь при использовании значительных (100-кратных) молярных избытков олигонуклеотндов. 13 случае d(CTCATGYl), d(pGGTAATCC) и d(TTTCCATCTITT) связывание значительно выше, особенно дли d(CTCATOTT), но, тем не менее, молярное соотношение РНК : олигодезоксирибонуклеотид в комплексе составляет лишь 1,00:0,15 -1,00:0,25 при 10—15 кратных избытках одшопуклеотидов в гнбриди-зационных смесях. Низкое связывание может объясниться тем, что РНК бактериофагов имеют высокоразвитые вторичную и третичную структуры, которые могут существенно затруднять доступность отдельных участков РНК, в том числе и выбранного для исследования. Подтверждением этому является значительное увеличение связывания гексапуклеотида при разрушении вторичной структуры РНК (мягкой обработкой формальдегидом или гидролизом РНК панкреатической РНКазой до 3S фрагментов). Кроме того, исследуемый участок, согласно модели (F;iers W. el. al., 1972), сам вовлечен н образование вторичной структуры, поэтому скорее всего имеет место конкурентное связывание олиголезокскрпбонуклеотидов с РНК. Тем

не менее можно предположить, что связывание олнгонуклеотидоп в исследуемой системе проходит региосслсктивно. Свидетельством специфичности связывания синтетических олигонуклеотидов с РНК фага R17 может служить тот факт, что РНК ролстпеннных бактериофагов MS2 и Г2, имеющих ту же первичную структуру изучаемого участка, что и РНК фага RI7, образуют с ним комплексы "РНК:оли-гонуклеотнд" с тем же молярным соотношением. В то же время 16S РНК рибосом Е. coli и РНК антигенно отдаленного фага Qß связывают tl(pGGTAATCC) в тех же условиях в значительно меньшей степени. Отчетливое различие в 'эффективности связывания d(pGGTAAT) и d(pGGTAATCC) с РНК фага R17 также можно рассматривать как косвенное свидетельство специфичности комплексо-образования.

И. ИНИЦИАЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ РНК С ФИКСИРОВАННОГО УЧАСТКА МАТРИЦЫ С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ГЕТЕРОГЕННЫХ ПО СОСТАВУ ОЛ И ГОД ЕЗОКСИ РИ Г.ОНУКЛ ЕОТИДОВ—ЗАТРАВОК.

Подтверждение и доказательство специфичности взаимодействия синтетических олигодезоксирибонуклеотилов с РНК было продемонстрировано и опытах по обратной транскрипции фаговых РНК рсвертазой из вируса птичьего миэлобдастоза — фермента, открытого незадолго до начала наших исследований и вызвавшего огромный интерес у исследователей. Академиком В.А.Энгельгардтом была организована международная программа "Ревертаза", в котором приняла участие и наша лаборатория химии нуклеиновых кислот. Было известно, что гетерогенные олигодезокенрибонуклеотиды могут служить в качестве затравок при синтезе ДНК на односпи-ральных ДНК-матрипах, катализируемом ДНК-полимераэой. Но в случае рсвертазы до наших экспериментов в качестве затравок при обратной транскрипции мРНК использовались исключительно оли-гомеры тимидиловой кислоты. Отсутствовали сведения о возможности получения ДНК-копий отдельных участков фаговых РНК с участием обратной транскриптазы. В связи с этим мы предприняли поиск подхода к созданию управляемой системы обратной транскрипции, который позволил бы вести синтез кДНК с заранее выбранной точки на РНК—матрице. Поскольку синтез ДНК-копии

начинается с загранки, то образование комплекса между заранее выбранной, определенной точки матрицы и комплементарным олиго-дезоксирибонуклеотидом-затравкой должно, в принципе, контролировать получение требуемой ДНК-копии с фиксированной точки РНК-матрицы. Уже первые опыты показали (работа была выполнена совместно с сотрудниками ИМ Б АН СССР), что РНК фага RI7 в полной системе обратной транскрипции, но в отсутствии затравок (синтетических олигодезоксирибоиуклеотидои) не обладает матричной активностью в синтезе гюлидезоксирнбонуклеотидов. Только при одновременном присутствии РНК фага, ревертазы и затравочного гетерогенного по составу олиюдезоксирибонуклеотида наблюдается заметное включение в синтезируемую цепь ДНК |3Н|'ГМР или |3HJGMP. Данные по комплексообразовашно олигонукдеотидов с РНК хорошо соответствовали результатам опытов по обратной транскрипции:

а) октануклеошд d(pGGTAATCC) был значительно более активен гексануклеотида d(pGGTAAT);

б) затравка стимулировала синтез ДНК с РНК фагов R17, MS2, О, но не инициировала синтез ДНК с РНК фага Q|).

Для доказательства региоселектнвностн связывания затравок с фаговыми РНК мы воспользовались тем фактом, что белок оболочки фага MS2 связывается с РНК фага исключительно в районе 17081766, куда входит участок 1752—1759, комлементарный октануклео-тиду d(pGGTAATCC). Т.е. белок оболочки и олшонукдеотид конкурируют за один и тог же участок связывания, тем самым сишез ДИК при использовании в качестве затравки октануклеогида подавляется в присутствии белка, тогда как в случае нонануклеотида d(CCATCTTTT), комплементарного участку 1679-1687, конкуренции нет и обратная транскрипция в присутствии белка оболочки идет также, как и без нею. Таким образом было показано, что обратная транскрипция может быть инициирована как с межнистронного участка, так и с последовательности внутри цисзрона структурного белка РНК бактериофагов с помощью затравок, комплементарных не З'-концевой последовательности РНК, а ее внутренней области. Продукт синтеза состоял из дискретных ДНК-фракций различной длины, включая транскрипты длиной более 1000 нуклеогидов. Для прямого ответа на вопрос о роли вторичной структуры РНК-мат-

рицы в обратной транскрипции мы провели опыты с 59-эвенным фрагментом РНК фага МБ2 (совместная работа с ИМБ и Институтом органического синтеза АН Латвийской ССР) (см. рис. 1):

d а

и v

а а

о с

о с

А I

а с

и А

А V

с а

и А с а а о

U А с о U А

(а и»

А с

^0) с ju'А

|а' о

\с)а

5' caaactj ccawcaaa исо 3' 5'caaacu сса1гос/шл uc0 3'

А Б А "Б

Рис. la. Вторичная структура фрагмен- Рис. 16. Предполагаемая вторичная структура та РНК фага RI7 по данным Gralla ft. фрагмента РНК фага MS2; пунктиром отмече-al., Nature (1974), v.248, 204-208 ны райони, комплементарные затравкам

d<GGTAATCC) и d(CTCATOTT)

По данным Gralla et. al., фрагмент РНК фага R17 имеет структуру, приведенную на рис. 1а. Тпл шпилечной структуры А в условиях близких к таковым при синтезе ДНК равна 88* С (для фрагмента РНК фага MS2 из-за одной замены U на С не ниже 70°), а структуры Б - 64° С. Синтез ДНК с затравкой d(GGTAATCC) и другим ок-тануклеотидом d(CTCATGTT) проходит более эффективно на фрагменте, чем на целой РНК, по-видимому, из-за большей доступности участков связывания для межмолекулярных взаимодействий. Для синтеза ДНК использовались 5-8% молекул матрицы. Это исключает предположение, что синтез при 37' С шел только на той ничтожной фракции молекул матрицы, которая могла спонтанно терять вторичную структуру. Продукт синтеза не содержал высокомолекулярных полирибонуклеотидов, что указывает на отсутствие "проскальзывания" (slippage) матрицы, обнаруженного на синтетических гомополимерах. Длина синтезированных ДНК (примеси не превышали 7%) соответствовала копированию всего фрагмента от места посадки затравочного октануклеотида до 5'-конца полирибо-нуклеотидной цепи, следовательно, вторичная структура РНК матрицы не является непреодолимым препятствием для обратной траи-скриптазы. Из этого однако не следует, что она не важна для работы

с

А

Ill

фермента. "Структурные" остановки, наблюдаемые при синтезе ДНК с вирионных фаговых РНК и выражающиеся в дискретном характере синтезируемых ДНК фракций, скорее всего и связаны со вторичной структурой матрицы.

Ферментативный синтез полидезоксирибонуклеотидных цепей по коротким матрицам с известной первичной структурой открывает дополнительные возможности использования обратной транскрипции: с фрагментов РНК, выделенных из природных объектов или синтезированных in vitro, можно получить фрагменты ДНК желаемой структуры, размножить их методами генетической инженерии и использовать затем в разных направлениях.

Для выяснения влияния длины и степени комнлементарности затравки на эффективность синтеза ДНК была изучена обратная транскрипция РНК фага MS2 и ее фрагмента в присутствии различных полностью и частично комплементарных олигодезоксирибо-нуклеотидов-загравок. Было показано, что неспецифический фон возможен, особенно в тех случаях, когда З'-концевой фрагмент олигодезоксирпбопуклеотида полностью комплементарен нецелевому участку РНК. Наблюдается небольшой, но отличающийся от нулевого синтез с тетрапуклеотидом. Несмотря на способность пенга-нукдеотида d(ATGIT) служить затравкой, выход продуктов реакции весьма низок; например, за 90 мин реакции при 25° С он в 18 раз ниже, чем с октануклеогидом, комплементарным к тому же участку РНК. Применение коротких олигонуклеотидов для инициации обратной транскрипции, как и следовало ожидать, нецелесообразно из-за крайне низкой скорости синтеза и возможности множественной инициации при достаточно протяженных матрицах за счет идентичных последовательностей. С другой стороны, излишне протяженные затравки, обеспечивая высокую скорость синтеза, создают »акже принципиальную возможность инициации синтеза при неполной комнлементарности, т.е. могут привести к гетерогенности кДНК, что крайне нежелательно при дальнейших структурных исследованиях.

Для уточнении размеров затравки, обеспечивающей максимальную эффективность синтеза, были использованы полностью комплементарные затравки от октануклеотида до 45—»венного поди-дезоксирибонуклеотида (45-кДНК). Эффективность обратной транскрипции при использовании 45-кДНК и додекадезоксирибонуклео-

типа в качестве затравок почти не различалась, тогда как при применении нонануклеотнла она Г>ыла меньше, а октлнуклеотида еще меньше. По-видимому, ревсртаза не нуждается для своего функционирования в протяженной двусниральной области гибридного дуплекса и роль затравки состоит не столько в создании такой области, сколько во внесении в систему З'-ОН группы, с которой начинается синтез. При оптимальной для действии рснертазы температуре в 3742° С затравки, обеспечивающие достаточно интенсивный синтез при минимальном фоне неспенифической инициации, должны иметь длину 8—12 нуклеотидов. При большей длине может возрастать неспенифический фон, а при меньшей — падает скорость синтеза и также возрастает неспецинифическнй фон.

III. РЕГИОСЕЛЕКТИВНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПРИРОДНЫХ РНК РНКазой Н В ГИБРИДНЫХ ДУПЛЕКСАХ С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДАМИ.

Данные о специфичности комилсмснтационных взаимодействий синтетических олигодсзоксирибонуклеотидов с высокомолекулярными протяженными РНК позволили нам поставить задачу направленной фрагментации РНК. При решении различных задач молекулярной биологии возникает необходимость позинионно направленного (региоселективиого) растепления нуклеиновых кислот. Если в случае ДНК такое расщепление достигается с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз), то надежных методов направленной фрагментации РНК » середине 70х годов не существовало. Было известно, что фермент РНКаза Н гидролизует РНК в протяженном дуплексе РНК:ДНК, не затрагивая при этом односпиральные РНК или ДНК, а также двуспнральные структуры РНК.РНК и ДНК:ДНК. Мы предположили, что этот фермент может узнать (как и в случае ре-вертазы) искусственно созданный гибридный дуплекс "РНК:ко-роткий синтетический олигодезоксирибонуклеотид" и только в нем расщепить полинуклеотидную цепь РНК. Работа выполнена совместно с сотрудниками лабораторий химии и биохимии нукдеопро-геидов и биохимии вирусов растений МГУ.

В первоначальных опытах использовали те же олигонуклеоти-ды сКСТСАТСТТ), сНССАТСПТТ) и с1(ТТТССАТСТТТТ), которые были затравками при обратной транскрипции фаговых РНК. Пробы,

содержащие 20-30 мкг РНК фага R17 или MS2 и 0,03-0,05 А2ы> олигонуклеотида инкубировали 30 мин при 4° С, после чего добавляли 0,15 единиц активности РНКазы Н из Е. coli и смесь выдерживали 5 час при 4° С. Разделение продуктов ферментативной реакции проводили электрофорезом u 3%-iiom полиакриламидном геле. Кик следует из данных, приведенных на рис. 2, происходит эффективное расщепление РН К, о чем свидетельствует появление дополнительной по сравнению с контролем одной (в случае окта)- или двух (в случае нона- и додекадезокеирнбонуклеотидов) полос:

Рис. 2. Рашеленнс продуктов гидролта РНК фага К17 и тбриднич дуплексич с олнгиде юксирнбонуклеогидими. 'Злскцт форе! в 3% нолнакриламидном |сле, опрас кл межлснивым синим А - РНК блкк-риофага К17, Ii - РНК + PHKaia II, I) РНК * PH Kau II + illCI С'АГСГП), I -РНК » PHKatu II »• il<(XATCTJTI), Д PIIK t PIIKaiall t iKTTKC'AKTI I I)

Набор продуктов гидролиза ограничен, что указывает на избирдтель-ность процесса. Причем полученную картину разделения можно объяснить, если предположить, что растепление РНК происходит только в участках, комплементарных олнгодезоксирибонуклеогидам: участок 1745-1752, например, находится практически в середине РНК, а фрагменты, получающиеся при расщеплении н участке 16731684, также близки друг к другу по молекулярной массе. В денатурирующих условиях удается ра (делить фрагменты, полученные нрц расщеплении РНК с использованием октануклеотида и определить молекулярные массы получения фрагментов. В качестве маркеров использованы РНК вируса мозаики коара и I6S и 23S РНК рибосом Е. coli. Получение значения молекулярных масс фрагментов хорошо соответствовали рассчитанным при условии осуществления региоселектииного расщепления.

Позиционная направленность нуклеазного гидролиза подтверждена также и и опытах но растеплению 59—звенного фраг мента РНК фага MS2 в гибридном дуплексе с октануклеогидом

(1(СТСАТОТТ) или гептануклеотидом <)(ТГ(;ААТ(>). При использовании ЩСТСАТСГТ) растенлснне РНК проходит в основном по МСЖНуКЛСОТИДНОН фосфодиэфирной связи между А. и, и С1.9.

+6 РИКаэа В «ЦТТОААТО) -53

3' ОСООиАСССАииАО^АОиАСАААСииАСССаССССАОАиААиСАасиАСесССиСАААС 5' а (стслтвт

Оптимизация условий проведения нуклеазного гидролиза позволила значительно повысить эффективность процесса: например, при использовании сЦСТСАТОТТ) удается расщепить до 70% макромолекул РНК в заданном районе. Таким образом и в этом случае применение олнгодсзоксирнбонуклсогилных зоилов позволяет при комплексообразовании вычленить для направленного воздействия РНКазы Н небольшой фрагмент макромолекулы РНК. Однако, как показали эксперименты на одних и тех же системах (полная молекула РНК фага МЯ2 нли ее 59-звенный фрагмент и комплементарные олигодезоксирибоиуклсотиды), во всех случаях эффективность направленного гидролиза РНК (расщепляется 50-70% макромолекул) была значительно выше эффективности обратной транскрипции (5— 10%). Можно предположить, что РНКаза Н играет большую роль в стабилизации гибридных дуплексов.

Уже в первых опытах по направленной фрагментации фаговых полинистронных РНК была продемонстрирована принципиальная возможность получения предложенным методом отдельных цнетро-нов: при использовании с)(рСОТААТСС), комплементарного нуклеотидной последовательности из межцистронной области, при направленной фрагментации РНК РНКазой Н один из образующихся фрагментов должен содержать только один цистрон, кодирующий РНК-полимеразу фага, однако ни препаративного выделения фрагмента, ни испытания его функциональной активности проведено не было. Эта задача — изучение возможности использования разработанного метода для получения препаративных количеств функционалыгаактивных участков полинистронных геномных РНК - была поставлена в опытах по направленному растеплению РНК вируса табачной мозаики (исследование проведено совместно с со-

трудниками лаборатории биохимии вирусов растений МГУ) (см. схему 2).

Схема 2

Структура генома РНК ВТМ и участков, комплементарных синтезированным олигонуклеотидам

5714 570«

.AGAAAAAAGGCC. d(TTTTTTTCCGG)

iras:

5'пв-

126/183к

ЗОк

еб

— Hi»

81 68

..ACACAUA-CGGUAAC.

d(TGTGTAT-GCC)

d(TGTGTAT)GCCAU

d(TGTGTKT> GCCAU i I PP

6217 6205

..CAAUAAAUAAUAC. d(GTTATTTATTATG)

сб - iHicipoii структурного белка, — Mis - тРНК-иодобнаи структура

Известно, что при инициации сборки ВТМ агрегаты вирусного структурного белка связываются со специфической последовательностью РНК ВТМ, называемой участком инициации сборки (Ои). Этот участок локализован в районе от 830 но 1003-й нуклеотид с 3'-конца РНК; определена первичная структура в пределах Оа и предложена вторичная структура З'-концевого участка РНК ВТМ, включающего 0„. Для направленной фрагментации РНК был выбран участок 0„ с 842-го по 852-й. Этот район 0,„ по-видимому, не вовлечен во вторичную структуру, что делает его доступным для образования гибридного дуплекса с комплементарным олигодезоксири-бонуклеотидом dOTHTTTCCGG). При расщеплении РНК вируса табачной мозаики в выбранном районе, должны образоваться два фрагмента: тяжелый (Т) 5'-концевой, несущий в своём составе Оа, и легкий (Л) З'-конпевой, потерявший Оа, но содержащий ген белка оболочки и З'-коннсвую тРНК-иодобную структуру, способную акцептировать гистидин. Исследование кодирующей способности этих фрагментов и особенности их поведения в процессе сборки вирусных частиц представляли интерес в плане изучения общих механиз-

мои трансляции и сборки вирусов растений. Как и в случае направленного растепления фаговых РНК, эффективность, расщепления РНК ВТМ оказалась высокой (гилролнзовалось до 70% макромолекул) и, в основном, образовывались Т- и Л-фрагменты. Эти фрагменты были выделены центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы. Определение мол. массы фрагментов, результаты трансляции Т—фрагмента и эффективное аминоанилирование Л— фрагмента однозначно показали, что было достигнуто расщепление в выбранном районе РНК. Максимальное количество Л-фрагмента образуется в условиях эксперимента после 3-х часовой инкубации. Т-фрагмент значительно менее стабилен, чем Л-фрагмснт при инкубации с РНКазой Н и d(TTTTTTTTCCGG). Частичная реконструкция РНК с вирусным белком в условиях дефицита белка приводит к появлению частично реконструированных вирусных частиц, у которых закрыто от 50 до 500 нуклеотилов, в том числе участок Оа, Л-фрагмснт не образуется в результате инкубации частично реконструированного вируса с РНКазой Н и d(TTTTTTTCCGG). С другой стороны, РНК, выделенная из этого вируса, после инкубации в тех же условиях продуцирует Л-фрагмснт. Это подтверждает предположение, что у РНК в составе вируса место атаки РНКазой Н в присутствии d(TTTTTTTCCGG) защищено белком оболочки ВТМ.

Эффективное и специфичное расщепление РНК ВТМ РНКазой Н из E.coli было также достигнуто и при использовании олнгодезок-сирибонуклеогидов d(TGTGTATGCC) и d(GTTATTTAITATG) (см. схему 2 на стр. 14), что позволило получить после выделения 5'-лидерную последовательность и З'-концевую последовательность, содержащую тРНК—подобную структуру, соответственно, которые были использованы для получения рекомбинантных РНК в отделе биохимии вирусов растений.

Суммируя, отметим, что РНКаза Н из E.coli и синтетические олигодезокенрибопукдеотиды, несомненно, могут быть применены при инженерии молекул РНК с полностью или частично известной нуклеотидной последовательностью, в частности, для вырезания отдельных цистронов и функционально-активных участков.

Таким образом, если и начале исследований мы ставили вопрос, могут ли синтетические олигодезоксирибонуклеотнды с заданной последовательностью мономеров образовывать специфические комплексы с экспонированными участками высоконолимерных нуклеиновых кислот, то рассмотренные выше примеры процессов, направляемых олигодезоксирибонуклеотидами, несомненно, дают положительный отпет. Однако для успешного использования синтетических олигодезоксирибонукдео гидов прежде всего необходимо (кроме знании первичной структуры участка "узнавания") иметь сведения и о "липкости" исследуемого участка, т.е. эксионировап-ности и способности по чисго конфирмационным причинам к ком-нлемептационным взаимодействиям. Попятно, что только тогда, когда межмолскулирные взаимодействия между олигонуклеотидным зондом и РНК~мишепыо, стабилизируемые РНКазой Н, оказываются предпочтительнее внутримолекулярных, можно гарантировать последующее эффективное расщепление РНК и полученном гибридном дуплексе РНКазой Н.

IV. ГИДРОЛИЗ РНК РНКазой Н В НЕСОВЕРШЕННЫХ ГИБРИДНЫХ ДУПЛЕКСАХ С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКДЕО ГИДАМИ.

Известно (Donis— Keller, 1979), что PHKaja Н может гидролизо-вать РНК в дуплексе с тстрадеэоксирибонуклеотидом. Экспериментальные условия проведения гибридизации и гидролиза допускают образование несовершенных дуплексов "целевого" олигодезоксири-бонуклеотидпого с "нецелевым" участком РНК. Полому возникает вопрос: какие гибридные структуры кроме совершенной "зонд — мишень" могут также приводить к гидролизу РНК РНКазой Н?

Анализируя результаты расщепления РНК фага MS2 РНКаюй Н в гетеродуплексах с d(CTCATGTT) и «ДТТТССАТСГПТ'), можно отметить удивительно высокую специфичность процесса: РНК гид-рол изо вала с ь только в гибридных дуплексах, в которых комплемен-тационные взаимодействия реал изо вывались полностью (районы 1745-1752 и 1673—1684 соответственно), причем практически не расщеплялась в потенциально возможных участках неполною или несовершенного связывания, таких как:

1017 1042

..GUACAA.. d (CTCATGTT)

937 930

..GUAGCAAA. d(TTTCCATCTTTT)

2041 2036

..AGUACA.. d(CTCATGTT) 1002 995 ..GUGGAAAA. d(TTTCCATCTTTT)

2663 2656

..AAGGGUAG.. d(TTTCCATCTTTT)

«Я6 677

..AAAGCUAGAA.. d (TTTCCATCTTTT)

1604 1595

..AAGGUAUAAA.. d(TTTCCATCTTTT)

3481 Í474

..GGUGGAAA.. d(TTTCCATCTTTT)

Аналогичные результаты получены при расщеплении РНК ВТМ в гибридных дуплексах с il(TTTTTTTTCCGG). Несмотря на то, что в этом случае возможно образование несовершенных дуплексов с непрерывно комплементарными rieirra- (25 участков), гекса- (II участков) и гейта- (3 участка)нуклсотилнымн последовательностями, расщепление в основном проходило в одном целевом участке. Т.е. в использованных условиях не отмечен гидролиз таких потенциально возможных структур, как:

3844 ЗРЗв 4479 4472 4960 4950

.. AAAAAAG.. ..AAAAGAGG.. ..AAAAACAGUCC..

d(TTTTTTTCCGG) d(TTTTTTTCCGG) d(TTTTTTTCCGG)

и многих других.

В то же время в других экспериментах РНКаза Н эффективно гидролизовала РНК в частично комплементарных (несовершенных) комплексах. Так, зонды d(CTCATGTT) и d(ITTCCATCTTTT) не имеют полностью комплементарных последовательностей на 16S рРНК из Е. coli, тем пе менее в нх присутствии РНКаза Н расщепляла эффективно (на 50%) полирибонуклеотндную цепь предположительно (суля по положению продуктов гидролиза на электрофоре-грамме) в районах 319-325 или 343-349, I0i I — 1021 или 1176-1187, соответственно:

325 319 349 343 1021 1011

..GAGU-CAA.. ..GAGGGCA.. ..AAGAGUAGAGA..

d(CTCATGTT) d(CTCATGTT) d(TTTCCATCTTTT)

1187 117«

..AGGGGUGGAAGG.. d (TTTCCATCTTTT)

Более того, в некоторых случаях "нежелательный" гидролиз в несовершенном дуплексе проходит также эффективно, как и в совершенном. Например, при гибридазном гидролизе РНК фага MS2 в присутствии зонда d(TTGAATG)G вместо одного расщепления в районе 1735-1745 четко видны еще два продукта гидролиза, образование которых можно объяснить гидролизом в несовершенных дуплексах, предположительно в районах 1193, 2548 или 2559:

119» 1193 2554 2548 2603 2bi.ii

..ACGUACC... ...CUUAGCC... ...ACUUA...

d (TTGAATG)G d(TTGAAT-G)G d(TTGAATG)G

Аналогичная картина наблюдается и в случае гидролиза 5S рРНК нз Е. coli. Использование d(GGTGGGACCACCGCGCTACG), полностью комплементарного 5S рРНК в районе 12-31, должно приводить к появлению фрагмента РНК с длиной около 90 нуклеотидных остатков. Однако уже через 2 мин после инкубации реакционной смеси обнаруживается фрагмент с длиной ценн 60 нуклеотидных звеньев. Очевидно, в данном случае имеет место одновременный эффективный гидролиз РНК как в районе 12-31, так и в районе 6377. По-видимому, реализуется альтернативная гибридная структура:

31 12 72 «3

..CCACCCUGGUGGCGCGAUGC.. ..UGGUAGCCGCGAUQC..

d(GGTOGGACCACCGCGCTACG) d(GTGGGACCACCG-CGCTACG)

и гидролиз u этом несовершенном гибридном дуплексе также эф-фекти вен.

Для сравнения эффективности гибридаэного гидролиза РНК были синтезированы одигодезоксирибопуклеотидные шили, образующие с 5S РНК рибосом Е. coli совершенные и несовершенные дуплексы. Эффективность расщепления фрагмента |5'-J2P|-1—■41 5S рРНК была исследована в дуплексах 1-8 (см. рис. 3).

Полный гидролиз исходного фрагмента РНК проходит за 30 мин при комнатной температуре лишь в дуплексе I с полностью комплементарным олигонуклеотидом (в совершенном гибридном дуплексе). Во всех остальных случаях гидролиз проходит менее эф-

фектииио. В несовершенных дуплексах 6—8 гидролиз иди вообще не наблюдается, или проходит в незначительной степени (не более 10%). Напротив, следует обратить внимание на существенное расщепление РНК в гетеродуилексах 2-5, близких но структуре к совершенному дуплексу I и содержащих центральную некомплементарную пару, особенно эффективен гидролиз в случае дуплекса 3, имеющем некомплементарную нейтральную С~Л пару (гидролиз проходит за 30 мин более, чем на 80%).

3'оиАССссА(гассАСсси-о-о-о-с^о^с^а^с-а-Аиассйосеоиссаис3,Р)5' 541 <1(А-С-С-А-С-С-<3-С-0-С-Т) 1 3* <1)

3' еиАСсссА(;иссАссси-о-о-и^о^о-с-в-с-а-Аисссоосесиссси ("р) 5' 5' А(А-С-С-А-С-С - ¿-¿-С-Т) 3' (2)

3'оиАССссАоиссАсссо-с-е-у-9^о-с-9-с-в-Аовсссесооиссои1"р)5' 3' (КА-С-С-А-С-С-Л-С-Я-С-Т) 3' (3)

5' сИА-а-С-С-А-С-С-Т-С-<3) 3' <4)

3'соАССссАвоссАссси-о-о-и^а^в^с'а^с-о-Аиосссоссаоссао!52?) 5'

5' е1(А-С-С-А - С-Й-С-О-С-Т) 3' (5)

3'СиАССССАСиССАСССи-0-0-у-а-<;-С-(5-С-0-АОСССООСОйисССи1"р}5' 5' а(А-С-С-А-С-С-А-О-В-Т-АвСТ) 3' (6)

3' оилссссА(зиссАССс-и-(5-а-и-а-а-с~а-ссАиоссс;осссиссои["р) 5' 5' а(ТСО-А-С-С-А-Т-А-А-А-А) 3' (7)

3' силссссАаоссАсс-с-\:-а-в-и-а-о-с-в-с-а-массввсааиссви(,}р}5' 5' <ЦО-С-к-Т-С-к-С~С-в) 3' (8)

Рис. 3. Структуры гиСрилных луплсксов. Стрелками отмечены пшрошпуемме 1Ч1Ка юИ Н фосфолиэфнрные скнзк.

Полученные данные позволяют заключить: если выбранный для гидролиза участок РНК доступен для взаимодействия с соответствующими олигодезоксирнбонуклеотидными зондами, то эффективность гидролиза РНК РНКазой Н максимальна в совершенном дуплексе. Но в тех случаях, когда комплексообразование с выбранным участком затруднено (участок вовлечен в образование устойчивой вторичной структуры или закрыт белком), а имеются близкие но структуре и доступные для взаимодействия с олигодезок-

сирибонуклеотидиыми зондами участки РНК, может проходить "нецелевой"(но тем не менее сиквенсзависимый) гидролиз РНК-мишени, как, например, и опытах с 16S рРНК п присутствии зондов d(CTCATGTT) и ii(ТТГСС АТСТТТТ) или РНК ВГМ, частично закрытой белком оболочки, в присутствии «.Ц'ГГТГГГ TC'CGG).

Несмотря на то, что в большинстве наших экспериментов и по литературным данным реализуется преимущественно (иди исключительно) совершенная структура зонд-мишень и в общем случае расщепление РНК в несовершенных гибридных дуплексах проходит со значительно меньшей эффективностью, тем не менее могут возникать ситуации, при которых "нсенецнфический" (но сиквенсзависимый) гидролиз мишени может проходить в заметной степени.

Таким образом при использовании обычных немодифициро-ванных олигодезоксирибонуклеотидов для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты нельзя исключит!, расщепление "нецелевых" районов РНК, экспонированных ни поверхности молекулы и способных к гибридизации. Для повышения точности воздействии зондов на нуклеиновые кислоты необходимо использовать такие конструкции олшонуклеотплных зондов, которые позволили бы существенно повысить точность и эффективность последующего гиб-ридазного расщепления РНК. Перспективными в эюм плане Moiyr быть предложенные нами олигодезоксирнбонукдеотпдные зонды, в которых отдельные звенья заменены на рибонуклеотнды, или 2'-дезоксн—2'—фторпуклеотнды, или 2'-0-метилрибонуклеогиды.

V. РЕГИОСПЕЦИФИЧЕСКОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПРИРОДНЫХ РНК РНКазой Н В ГИБРИДНЫХ ДУПЛЕКСАХ С СИНТЕТИЧЕСКИМИ OJ1И Г О Н У KJ1ЕОТИДА М И.

РНКаза 11 из E.coli в отличие от эпдонуклеаз рестрикции, "узнающих" в двуспиральных ДНК определенные последовательности из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляющих и них строго определенные межнуклеотидные связи, не гидролиэует ни одно-, ни двусииральные области РНК. Фермент расщепляет РНК в неприсущей для макромолекулы структуре (наши данные, 1978 и Donis-Keller, 1979): в гибридном дуплексе с олигодезоксирибонуклеотидом, в состав которого должно входить не менее четырех-шести основа-

ний. Полому не удивительно, что при использовании для направленного гидролиза РНК обычно 10~20-ти(и более)звснных олиго-дезоксирнбонуклеотидов происходит расщепление РНК п разных позициях выбранного участка (в пределах гетеролуилекса), вплоть до полного вышепления участка комнлементарности. Если для решения одннх задач это обстоятельство не важно, то для других, в частности, для получения фрагментов РНК со строго определенной длиной, например, для работ по конструированию гибридных РНК - оно нспреемлсмо. Поэтому в настоящей работе был предпринят поиск подходов к повышению избирательности гидролиза РНК РНКазой Н в гибридных дуплексах. Конечной целью этого исследования было создание метода, позволяющего проводить расщепление заданной межнуклеотидной связи, т.е. разработать метод - "аналог" растепления ДНК эндонуклеазами рестрикции.

Исходно мы воспользовались тем фактом, что РНК:РНК дуплексы не гилролизуются РНКазой Н из E.coli. Была сделана попытка вместо олнголезоксирибонуклсотида использовать смешанный олигонуклеотид с той же самой нуклеотидной последовательностью (с учетом замены Т на U), но состоящий из олигояезоксирибобло-ка— и олигорибоблока (или, в общем случае, блока, который при комплексообразопании с РНК дает структуры, не являющиеся субстратом РНКазы Н). Мы предположили, что специфичность взаимодействия модифицированного олигонуклеотнда с РНК, обеспечиваемая всем олигонуклеотидом, должна при этом если и измениться, то незначительно, а вот направленность гидролиза, прежде определяемая всей последовательностью олигодезоксирибонуклеотида, будет задаваться только олигодезоксирибонуклеотидной частью смешанного олигонуклеотнда и тогда число гидролизуемых связей в РНК должно сокращаться. Как показали эксперименты, использование смешанных олигонуклеотндов d(TGTGTAT)GCCAU и d(TGTGTAT)ppGCCAU (олигонуклеотиды комплементарны последовательности 70-81 РНК ВТМ <см. схему 2 на стр. 14> и гептздез-оксирибо- и пентарибоблоки соединены в них обычной или пиро-фосфатной межпуклеотидными связями) привело к существенному повышению избирательности гидролиза как додекарибонуклеотила AAUGGCAUACAC (см. рис.4), так и целой РНК ВТМ. В гибридном дуплексе с d(TGTGTATGCC) РНК гидролизуется РНКазой Н из

Е.соП по четырем межнуклеотидным связям, тогда как в дуплексе с сКТОТОТАТ)ОССАи - только по диум, а с с)(ТСТСТАТ)ррОССАи удается провести региоснецифическое (одной связи) расщепление.

3' С-

3' а(т-о-т-б-т-А-т-с-с-с)

3' С-А^С^А-и-А-С-С-в-и-А-А

5' с1(Т-0-Т-а-Т-А-Т)0-С-С-А-и

3' С-А^С-А-и-А -С-О-в-Ц-А-А

5' <1(Т-0-Т-е-Т-А-Т)ррС-С-С-А-и

5' 3'

5' 3'

3' 5'

■■-А^Г

3' 5'

3' 5'

3'

Г-А^С^А-^и-!

3' С-АвС-А-и-А ^с-в-а-и-А-А 3'

5' а(Т-С-Т-в-Т-А-ТррО-С-С-А-Т) 5'

3' . .А-С-А-С^С^А^и-А-С-С-С-и-А-А-С. . . .врррт'в 5'

5' ¿ИТ-С-Т-С-Т-А-Т-С-С-С) 3'

. Срррт?0 5' 3'

.А-С-А-С^А^С-А-и-А-С-С-О-и-А-А-С-----.врррт7в 5'

¿ИТ-О-Т-О-Т-А-ТХЗ-С-С-А-и 3'

.А-С-А-С^А-С-А-и-А -С-в-в-и-А-А-С....врррт1а а (Т-С-Т-в-Т-А-^ррС-С-С-А-и

.А-С-А-С-А*СдАли-А-С-0-0-и-А-А-С. сКТ-в-Т-О-Т-А-Т)

5' 3'

Рис. 4. Структуры гибридных дуплексов. Стрелками отмечены гидролизуемые РНКаэой Н фосфолизфирные снял!

Одновременно и независимо с нашим исследованием аналогичный подход был осуществлен японскими исследователями (8ЫЬа)1а1а et.nl., 1987), использовавших олигонуклеотиды с олиго-2'-0-метилрибонуклеогидными блоками для региоселективного расщепления 90-звенной энзиматически синтезированной WS-8(+)РНК.

В отдельных случаях для получения региоспецифического расщепления нет необходимости синтезировать протяженный нена-

¿гравляющий действие РНКазы H блок. На примере гидролиза фрагментов 5S рРНК в гибридных дуплексах с ундекануклеотидами d(ACCACCGCGCT) и d(ACCA)CmCmdGCmdGCmT нами было показано, что частичная замена дезоксирибонуклеотидов (четырех остатков дезоксирибоцнтилина на 2'-0-метилиитидин) эквивалентна введению протяженного олиго-2'-0~метнлрибонуклеотилного фрагмента и обеспечивает региосиенифичность растепления. Структуры гибридных дуплексов, которые подвергались действию РНКазы Н, приведены на рис. 5. Выбранные для нуклеазного гидролиза РНК представляют собой фрагменты 5S рРНК 1-41 и 1-36. Для получения полной картины гидролиза РНК в первый фрагмент вводили 5'-концевую метку с помощью |у -12Р|АТР и Т4-полинукдеотидки-назы, а во второй - З'-концевую метку с помощью |5'-32Р|рСр и Т4 РНК-лигазы.

3' OUACCCCAaUCCACCCU-0-e-0-Q^G^C^O^C-0-AUOCCOCCOGUCCGU("P] 5' S'il d(A-C-C-A-C-C-G-C-G-C-T) 1 3'

3'GOACCCCAOUCCACCciu-0-G-U-G-(ï-C-0-CG-AOGCC<;OCGOUCCGO["P15' 5' d(A-C-C-A(C-C»dGC«dGC«T 3'

3'рС{"р]САоисс\ссс*и»о-с*и"о"а"с-о-с-а-Аиоссоосоооссси 5* 5' ¿(А-С-С-А-С-С-О-С-О-С-Т! 3'

3'рС("р]слвиссАссс^и-о-а-и-а-с-с-о-са-Аиасссасасиссаи 5' 5' а<А-С-С-А)С«С^аС,^СС.Т 3'

Рис. 5. Структуры гибридных дуплексов. Стрелками отмечены гидролизуемые

РНКязой Н фосфодиэфирныс спязи .

Использование немодифинированного олигодезоксирибонуклео-тидного зонда ^(АССАССССОСТ) проводит к множественному ре-гиоселективному гидролизу РНК. Гидролизуются с разной эффективностью 8 фосфодиэфирных связей: С'-С8, С^-С19, С|9-С20, С20_о21, 02'-и22, и22—С23, С24-и25, и25-С26. При использовании же частично модифицированного зонда

d(ACCA)CmCmdGCmdGCmT наблюдается резкое повышение селективности расщепления - гидролизуется только одна связь между и25~С26, т.е. первая межнуклеотидная связь РНК вне дуплекса в 3'-направлении со стороны РНК. Единичное расщепление между и23-С26 обнаружено как для 5'-, так и для З'-меченых фрагментов РНК. Таким образом, »имена дезоксирибоцитидина в d(ACCACCGCGCT)

в положениях 5, 6, 8, 10 на 2'-0~мепищитидин блокирует множественное расщепление РНК в соответствующем дуплексе и обеспечивает региоспецифическое расщепление. Следует отметить, что в использованных условиях гидролиз РНК РНКазой Н в дуплексе с сНАССАССССССТ) заканчивается за 10 мин, тогда как в дуплексе с (.1 (АСС А) С тС гт! О С т С С тТ за это время расщепляется около 30%, а за I час около 80% РНК (см. рис. 6).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 6. Разделение в 20%-ном ПАЛГ продуктов гндролта 5'-|'-'Р| меченою фр;и-менга 1 — 41 5Ь рРНК и гибридных дуплекса* с 1)(АССАС('(|С'(|СТ) - дорожки 2-5 и с с1(АССА)Сп1СииК;Сшс1()Ст Г - дорожки 6-9 после инкубации с РНКпшИ Н в течение 3, 10, 30 и 70 мин соотеигненно. Дорожка i - маркер 5'-|,!Р|-(К;с;аОС()С-

ооисюисс.

Т. е. повышение специфичности процесса сопровождается понижением его эффективности. При использовании в качестве зонда гек-садезоксирибонуклеотида сЦАССАСС) нет региосиецнфического расщепления РНК и нуклеазный гидролиз протекает крайне неэффективно (за 1 час РНКазой Н гидролизуется не более 15% РНК), т.е. тетрадеэоксирибонуклеотидный блок в составе модифицированного ундекануклеотида уже как бы "закреплен" на матрице в составе протяженной нуклеотидной последовательности, в отличие от с1(АССАСС), образующего с РНК слабый комлекс "самостоятельно".

Кроме того отметим, что положение олигодезоксирибонуклео-тидного блока в используемом для расщепления РНК олигонуклео-тиде также влияет на эффективность нуклеазного гидролиза, например, в случае использования АСс1(САСС)ССССи процесс идет значительно медленнее (в 2-2,5 раза), чем при использовании с)(АССА,'ССс10СсЮСТ.

Региосиецифическое растепление 58 РНК было осуществлено нами и при использовании модифицированных олигонуклеотндов

¿(АССАЭХХсЮХсЮХТ, где Х= рибоцнтидин или 2'-дезокси-2'-фторцитидии, во всех случаях вводимые в олнгодсзоксирибонуклео-тид звенья имеют СЗ'-эндо(М)-конформацию сахарного кольца.

Оптимальной структурой олигонуклеотидов (учитывая синтез, стоимость и устойчивость полученных соединений), предназначенных для проведения регноспецифического расщепления РНК, мы считаем в настоящее время следующую:

5' Ц-х звениый блок из дезоксирибонуклеотидов!—в~10 звеиный

В плане проведения совместной работы с лабораторией химии и биохимии нуклеоиротеидов МГУ по выяснению механизма функционирования рРНК нами был осуществлен синтез ряда таких олигонуклеотидов, которые успешно используются для направленного расщепления 165 рРНК по заданной единичной межнуклеотидной связи.

Таким образом, с помощью направленного изменения структуры олигонуклеотидного зонда можно активно влиять на селективность и эффективность гидролиза РНК РНКазой Н. Мы предполагаем, что использование олигонуклеотидов с блочным или чередующимся включением модифицированных звеньев, которые при ком-плексообразовании с РНК дают структуры, не являющиеся субстратом РНКазы Н, позволит повысить точность расщепления "целевых" участков РНК.

Получение субстрата (гибридного дуплекса синтетического олигодезоксирибонуклеотида с выбранным для расщепления участка РНК) и последующий гидролиз в нем РНК РНКазой Н зависят от многих факторов (температуры, ионной силы, концентраций зонда, мишени, фермента и т.д.), которые могут значительно различаться в каждой конкретной системе, поэтому для достижения максимальной эффективности направленного расщепления РНК необходимо экспериментально подбирать условия проведения опытов практически для каждой изучаемой системы.

VI. КОНСТРУИРОВАНИЕ, СИНТЕЗ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИСЕНСОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ.

Как уже отмечалось, синтетические олигонуклеотиды сейчас применяются не только как инструменты исследования природных структур и процессов, но и для направленного воздействия на процессы реализации генетической информации как in vitro, так и in vivo. В первую очередь, речь идет об использовании антисенсовых олиго-нуклеотидов. Под понятием антисенсовый (антнсмысловой) олиго-нуклеотид обычно подразумевается синтетическая односпиральная нуклеиновая кислота, состоящая из 12—30 мононуклеотидных звеньев, способная привести к подавлению трансляции (синтеза белка) РНК за счет связывания но Уотсон-Криковскому тину с определенными комплементарным (смысловым) участком этой РНК. В 1978 году Замекник и Стефенсон, считающиеся основоположниками нового направления исследований, впервые доказали на практике возможность ингибнрования репликации in vilro вируса саркомы Рауса с помощью 13—ти-звенного олигодезоксирибонуклеотнда, комплементарного нуклеотидной последовательности концевых повторов РНК этого вируса, и предложили механизм ингибнрования. Однако идеи о направленном блокировании участков природных РНК с помощью синтетических олигомуклеотидов, комплементарных определенным участкам РНК, и подходы к их осуществлению были сформулированы ранее, и, в первую очередь, в работах Новосибирской школы химиков-биооргаников (Н.И.Гриневой, Д.Г.Кнорре и др.) при разработке метода "комплементарно адресующих реагентов". До 1985 г. но антисенсовой тематике практически не было работ, несмотря на то, что появились работы П.Ч.Замекника, в основном по трем причинам:

1) широко было распространено мнение, что олигонуклеотиды не могут входить в эукариотические клетки;

2) до 1982-1983 г.г. еще было трудно синтезировать достаточно протяженные олигонуклеотиды, обеспечивающие хорошую гибридизацию при 37° С;

3) было расшифровано совсем немного нуклеотидных последовательностей РНК или ДНК-геномов как мишеней для антисенсовых одигонукдеотидов.

В конце 1970-х и начале 1980-х были пронслены исследования, которые обеспечили дальнейшее развитие антисенсового подхода. Во-первых, это были открытия в области анализа первичной структуры ДНК: метод химической деградации Максама-Гилберта и ферментативного метода Сэнгера с использованием дидсзоксприбонуклеоти-дов. Во—вторых, были предложены новые подходы к синтезу олиго-нуклеотидов на твердой фазе Летсингером и Карудерсом, позволившие создать метод с практически количественным выходом на каждой стадии синтеза. В это же время стадо утверждаться мнение, что олнгонукдеотиды могут проходить через мембраны эукариот и таким образом проникать в клетки. В конце концов начало появляться, по выражению Замекннка, "множество потенциальных мишеней подобно фейерверкам на темном до этого генетическом небе". Перечисленные исследования привели к бурному развитию работ по ан-тисенсовой тематике, в частности, по химии олигонуклеотидов. Это новое направление, целью которого является создание противовирусных, противобактериальных и противораковых так называемых информационных (informational) лекарств, нашло свое отражение в работах нашей лаборатории, тем более что наши исследования, выполненные в 70* годах, по специфичности взаимодействия синтетических олигодезоксирибонуклеотидов с РНК имели к нему непосредственное отношение. Более того, было постулировано (Walder J.A. и др.) на основании обобщения опыта по нуклеазному расщеплению РНК в гибридных дуплексах с олигонуклеотидами и факту присутствия РНКазы Н во всех клетках, что именно этот процесс может быть одной из основных причин подавлении транскрипции. Это было подтверждено в опытах по трансляции РНК в присутствии комплементарных олигодезоксирибонукдеотидов в бесклеточной системе, в ооцитах, и недавно показано на клеточном уровне. Таким образом, уже наши первые опыты по нуклеазному расщеплению РНК имели прямое отношение к антисенсовой тематике, не смотря на то, что они были выполнены на простейших системах (включавших только индивидуальные РНК или полирибонуклеотиды, комплементарные им синтетические олигонуклеотиды и РНКазу Н из Е. coli). Нами впервые была отмечена высокая эффективность нуклеаз-ного гидролиза протяженных РНК в гибридных дуплексах (в ряде случаев гидролнзовалось от 70 до 100% молекул РНК) и впервые показано, что короткие устойчивые шпилечные структуры в РНК могут

быть разрушены РНКазой Н в присутствии комплементарных олиго-дезоксирибонуклеотидов. Эти факты могут служить объяснением высокой биологической активности антисенсовых олигонуклеотидов,

В наших работах большое внимание было уделено изучению гидролиза РНК РНКазой Н в несовершенных гибридных дуплексах с синтетическими олигодезоксирибонуклеотидами (см. раздел IV на стр. 16). При использовании олигонуклеотидов и их производных в качестве потенциальных терапевтических средств в идеале должна быть поражена только мишень, однако при проведении опытов in vitro, а тем более in vivo, когда условия гибридизации строго детерминированы (т.е., недопустимо применение высоких температур, денатурирующих реагентов) нельзя исключить возможность образования неполных и несовершенных дуплексов антисенсового олигодез-оксирибонукдеотида с "нецелевыми" клеточными РНК, и соответственно, нуклеазного гидролиза РНК. Необходимо каким-то образом заставить "молчать" (но отношению к клеточным РНКазам Н) зонд в соответствующих гибридных дуплексах или свести к минимуму побочные эффекты. Скорее всего этот побочный сиквенсзависи-мый эффект (расщепление в несовершенных дуплексах с клеточными РНК) может заметно проявляться лишь при высоких концентрациях олигодезоксирибонуклеотндов или в быстро делящихся клетках с высоким уровнем РНКазы Н, и в таких случаях мы рекомендуем применять модифицированные олигонуклеогиды, содержащие в своем составе протяженные фрагменты, которые при комплексообразо-вании с РНК дают негидролизуемые РНКазой Н структуры.

Важная роль при взаимодействии РНКазы Н с гибридными дуплексами отводится ионным взаимодействиям (взаимодействуют по-, ложительно и отрицательно заряженные молекулы соответственно). Нами было показано, что для повышения эффективности гидролиза желательно использовать 5'-фосфорилированные зонды (особенно в случае коротких олигодезоксирибонуклео гидов), 3'-фосфорилированные зонды наоборот замедляют гидролиз. При повышении концентрации фермента различия исчезают.

Модификация концевых 3'- и 5'~i идроксильных групп олиго-дезоксирибонуклеотидных зондов практически не мешает нуклеаз-ному гидролизу РНК в соответствующих дуплексах. Например, гидролиз РНКазой Н 5S РНК в присутствии d(ACCACCGCGCT) или X-d(ACCACCGCGCT), где X - 4, 4'- диметокситритильная, доде-

нилфосфатная, 5'-адамантилфосфатная группа в использованных условиях проходит во всех случаях одинаково. Переаминирование дезоксирибонитидина этнлендиамином, по-видимому, также не влияет заметно на нуклеазный гидролиз.

Опыт и знания, полученные нами при изучении специфичности взаимодействия синтетических олигодезоксирибонуклеогидов с РНК, а также при проведении направленного растепления РНК РНКазой Н в гибридных дуплексах с обычными и модифицированными олигонуклеотидами, позволили предложить тактику проведения работ по антисенсовой тематике на конкретных системах в Ву-стерском центре экспериментальной биологии (Шрусбери, США) в лаборатории П.Ч.Замекника.

Проведению исследований по испытанию биологической активности антисенсовых олигонуклеотидов in vitro на клеточном уровне предшествовали предварительная работа по выбору объектов исследования,РНК-мишеней и синтез олигонуклеотидов, комплементарных конкретным участкам этих РНК. В отличие от опытов по региоселективному расщеплению РНК в простейших системах, описанных в докладе ранее и включавших индивидуальную РНК, анти-сенсовый олигодезоксирибопуклеотид и РНКазу Н, для проведения работ по антисенсовой тематике нами были синтезированы главным образом олигодезоксирибонуклеотидтиофосфаты (здесь и далее использовано сокращение ОДРТФ), изучены свойства этих соединений, разработан методы их анализа и очистки, так как полностью немоднфинированные олигодезоксирнбонуклеотиды из-за высокой чувствительности к гидролизу клеточными нуклеазами с временем иолужнзни в клетке обычно около 20 мин, скорее всего, имеют ограниченное применение. Однако ^модифицированные соединения имеют важное преимущество: вызывают меньше побочных эффектов и эффективность гидролиза РНК РНКазой Н в соответствующих гибридных дуплексах выше, поэтому не исключено, что в будущем они могут быть успешно использовгны после проведения минимальной модификации сахаро-фосфатного остова и/ или использования усовершенствованного способа "доставки" олигонуклеотидов в клетки.

ОДРТФ, в которых один кислород в каждой межнуклеотндной фосфатной группе заменен на серу, легко синтезировать, так как для синтеза используются те же самые синтоны, что и при синтезе природных олигодезоксирибонуклеотидов. Удовлетворительною метода стереоспецифического синтеза ОДРТФ еще нет, поэтому в экспериментах используется рацемическая смесь. Введение серы приводит к резкому увеличению устойчивости ОДРТФ к гидролизу нуклеазами в различных системах. ОДРТФ сохраняют способность образовывать гибридные дуплексы с РНК, причем РНКаза Н расщепляет РНК в таких дуплексах, хотя и менее эффективно, чем в гибридном дуплексе с ^модифицированным олигонуклеотидом, как было показано нами и другими исследователями.

Опубликовано много работ по изучению токсичности ОДРТФ, которые показали, что эти соединения могут быть использованы в клинической практике. В частности, нами в 1993 г. были синтезированы ОДРТФ для изучения их влияния на беременных мышей и эмбрионы, что могло выразиться в прерывании беременности или в появлении существенных дефектов у плода или новорожденных. Синтетические ОДРТФ были введены 62 мышам и проведено последующее исследование 291 плода или новорожденных. Эти эксперименты показали, что инъекции ОДРТФ в дозах от 0,5 до 5 мг на кг (что соответствует 0,1-1 мкМ и считается терапевтически эффективной для лечения взрослых людей) трех различных 20-звенных олигонуклеотидов безвредны для будущего потомства: не отмечено ни дефектов у плода или новорожденных, ни изменений в частоте беременности и размере потомства. Однако отметим, что хотя в выбранных условиях (дозы, конкретные олигонуклеотиды, время инъекции их и т.д.) ОДРТФ не нарушают развития эмбрионов, это исследование ограничено но масштабу и проанализированы не все параметры, какие могут оказаться важными. Нельзя исключить, что в других условиях влияние ОДРТФ может быть иным.

Основное внимание в наших исследованиях было уделено выяснению специфичности и повышению эффективности действия синтетических ОДРТФ в биологических системах in vitro: при подавлении размножения ВИЧ-1, малярийного паразита Plasmodium falciparum и микобактерий М. smegmatis.

А. ОЛИГОНУКЛЕОТИДТИОФОСФАТЬ! С 0ЛИГ0~2'-0-МЕТИЛРИБОНУКЛЕОТИДТИОФОСФАТНЫМИ БЛОКАМИ. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ. . '

Несомненно, нам было интересно сконструировать антисенсо-вые тиофосфатные олигонуклеотиды, содержащие сегменты ОДРТФ и ол1но-2'-0-метнлРТФ (здесь и далее РГФ означает риб^нуклео-тнлтиофосфаты, в олиго—2'-0—метнлРТФ модифицированы все ри-бозвенья) н исследовать их физико-химические и биохимические свойства. До наших исследований было показано, что олигоРТФ и ол1НО-2'-0-метилРТФ являются ингибиторами ренднкации ВИЧ-I, однако они менее эффективны, чем ОДРТФ той же нуклеотидной последовательности. С другой стороны, олиго-2'-0-метилРТФ более устойчивы к нуклеазам и образуют дуплексы с РНК с более высокой Тш„ однако последние дуплексы не являются субстратами для РНКазь; Н. Мы предположили, что олигонуклеотиды, составленные из блоков олнго-2'—О-метилРТФ и ОДРТФ должны сочетать благоприятные антисенсовые свойства (способность направлять действие РНКазы Н за счет ОДРТФ блока) и повышенную устойчивость к нуклеазам и стабильность дуплексов (за счет олиго-2'-0-метилРТФ блока), что в итоге может повысить противовирусную эффективность.Для исследования был проведен синтез ряда олиго-нуклеотидов, комплементарных акцепторному сайту сплайсинга гена tat ВИЧ-1 (см. табл. 1):

Табл. I .

Структура синтезированных олигонуклеотидтиофосфатои и Тш, их

дуплексов с дезоксирибо- и рибоматррцами.

N ОЛ И ГО НУКЛЕОТИДТИОФОСФАТ u 6

I d{АСACCCAATTCTGAAAATGG) 51,1 43,4

и d (АСАСССААТТС) UmGmAmAmAmAinTJmGmdG 48, 3 50, 9

Iii AmCmAmd(CCCAATTCTGAA)AmAmlimGmdG 49,9 48, 9

IV AmCmd <ACC)CmAmd(ATTC)UmGmd(AAAA)UmGmdG 45,1 50, 9

V dACiriAmCraCmCmAmAinUmd (TCTGAAAATGG) 47,2 51, 1

VI AmCmAmCmCmCMAmAinUmUmCmUmGniAit^ 47,6 61,1

а - Тпл с d(CCATTTTCAGAATTGGGTGT)

б - ТмЛс CCAUUUUCAGAAUUGGGUGU

Олигонуклеотиды I, т и VI были исследованы на устойчивость к фосфодиэстеразе змеиного яда: олигонуклеотид I почти полностью расщеплялся за 420 мин в выбранных условиях, олигонуклеотид II приблизительно на 50%, тогда как олигонуклеотид VI гидролизовал-ся в незначительной степени. Эти результаты указывают на то, что включение олиго-2'-0~метилОРТФ фрагментов ОДРТФ приводит к увеличению их стабильности in vitro. Можно предположить, что время полужизни этих соединений может увеличиться и в экспериментах in vivo, что позже было показано в предварительных фармакологических исследованиях на крысах (S. Agrawal, неопубликованные результаты): ОДРТФ с включенными олиго-2'-0-метилРТФ на обоих концах оказались значительно устойчивее исходных соединений in vivo. Исследована температурная устойчивость дуплексов, образованных олигонуклеотидами 1—VI с комплементарными дезок-сирибо- или рибоматрицами (см. табл. 1). Дуплексы, образованные химерными олигонуклеотидами II-V1 и d(CCATTTTCAGAATTGG-GTGT), во всех случаях имели Тш, ниже, чем с I. Обратная картина наблюдалась с рибоматрицей CCAUUUUCAGAAUUGGGUGU: например, ее комплекс с 1 имел Т11Л 43,4° С, с олигонуклеотндом VÍ -на 17° выше, а с II - 50,9° С. Результаты ясно демонстрируют, что введение сегментов олиго-2'-0-метилРТФ приводит к увеличению устойчивости дуплексов, на основании чего можно предположить повышенное сродство таких зондов к целевой РНК in vivo.

Олигонуклеотиды I-V сайтспецифически направляют расщепление комплементарного 32~звенного синтетического полирибо-нуклеотида РНКазой Н, тогда как в присутствии VI расщепления нет (см. рис. 7)

• 2 3 _ 4 5 б 7 .

(-1 I-1 I——■П |-1 |-1 I-1 V I

О И М во | I] я я в I] к н о 15 U U * И » <0 Mi » И Í It » «

«Ь _ _ ikw II я г ' ц « <ff» ^ Qp ^ щ

—— .

Рис. 7. Расшспленнс |"P]GUUUAUCCAUUUUCAGAAlJiJGGGUGUCGACAU РНКазой Н в дуплексах с олигонуклеотидами 1 - 1, VI - 2, III - 3, II - 4, V - 5, в смеси с нскомплсмснтарным ОДРТФ d(ACAGACTTACCTCAGATAAT) - 6, и без олигонуклеотида - 7 через 0, 15, 30, 60 мин нмкубаиим.

Испытание биологической активности I-VI (проведено J.LÍszie-wicz и др. в Национальном институте рака, США) показало, что олигонукдеотиды иигибировали репликацию вируса ВИЧ-1(см. рис. 8), однако III и IV, содержащие олиго-2'-0-метилРТФ-блоки на обоих концах, были предпочтительнее в ингибированни репликации вируса.

в гч

а

I

601

50-

40-

30

8 20 & J

g ю-1

СП

и

fШгт

«" V J

II III

IV V VI

Синцитий

+ + '

+ +

+ +

+

Рис. 8. Противовирусная активность олигоиуклеотидо» ( -VI, определяемая но экспрессии белка р24 и синцитию (каждый знак '+ означает 25% клеток, образующих синцитий)

Причем олнгонуклеотид VI был менее активен, чем I, хотя и образует самый устойчивый дуплекс с РНК и является самым устойчивым к нуклеазам, но РНКаза Н не расщепляет РНК в дуплексе с VI.

Таким образом, испытания биологической активности одиго-нуклеотидов I—VI подтвердили наши изначальные предположения: включение олиго-2'-0~метилРТФ фрагментов в ОДРТФ приводит к увеличению устойчивости таких соединений к нуклеазам и сродства к целевым РНК без потери свойства направлять гидролиз РНК РНКазой Н. In vitro эти олигонукдеотиды сказались более активны в ннгибировании репликации ВИЧ—1, чем менее устойчивый к нукде-

0

азам олигонуклеотид I или более устойчивый VI. Аналогичные результаты получены другими авторами (Могла е1. а!., 1993) при использовании для ингибирования На-пм онкогена синтетическими ОДРТФ, содержащими олиго-2'-0-алкилРТФ блоки.

Б. ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИСЕНСОВЫХ ОДРТФ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОЙ ОБРАБОТКЕ КЛЕТОК, ЗАРАЖЕННЫХ ВИЧ

Для изучения противовирусной активности антисенсовых олиго-нуклеотидов in vitro в модельной системе, позволяющей проводить эксперимент в течение длительного времени (до 100 дней), нами было синтезировано двадцать пять 20-28-звенных ОДРТФ (22 ОДРТФ, комплементарных различным районам генома ВИЧ-1 и 3 контроля: олнгонуклеотиды VII, VIII и IX, теоретически содержащих 420, 424 и 428 последовательностей соответственно, так как при конденсации использована смесь всех четырех мономеров). После предварительных экспериментов для дальнейших опытов было выбрано 7 антисенсовых олнгонуклеотидов, проявивших наибольшую противовирусную активность (справа указано положение комплементарных участков в геноме ВИЧ—1, а слева — обозначения):

5767-5786 5758-5782 5763-5790 778-SOO 776-802 5970-5997 5976-6003

VII VIИ IX

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

{|(A.,G1C,T)20.................................................................................... .....

d(A,G,C,T)24______________________________________________________________________________

tl(A.GfC,Tb......................................................................... . ......

________________ d(ACACCCAATICTf;AAA/VrCiG)

d(GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA)

_________d(GTCGACACCCAAn.CTr. AAAATGGATAA)

d(C;rCTCGCACCCATCTCTCTCClTC) d(CGCTCTCGCACCCATCrCTCTCCnTCrA) (l(JC(iTCGCrGTCTCCGCrrC"lTCCTGCCA)

d(CTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCATAGGAG)

Х-ХП комплементарны акцепторному сайту сплайсинга первого кодирующего экзона гена /я/, XIII и XIV - gag-мPHK, XV и XVI - геу-мРНК. Выполненные исследования, во-первых, подтвердили данные, полученные ранее в другой модельной системе (А£гау.а! еь а!.,

1988), что контрольные ОДРТФ обнаруживают заметную противовирусную сиквенснезависимую активность, однако значительно менее эффективны, чем антисенсовые (см. рис. 9а и 96):

без олиго- VII X VIII XIIJ XI

нуклеотида

Рис. 9а. Специфическое ингибирование Рис. 96. Специфическое ингибиронание

репликации ВИЧ-1 после II дней обра- репликации ВИЧ-1 после 18 дней об-

ботки олигонуклеотидом X. работки олигонуклеотидом XI и XIII.

Однако при более продолжительной инкубации X—XI!I перестают ингибировать репликацию ВИЧ-1, Наиболее активными оказались XIV и XV, которые полностью ингибировали репликацию вируса при 90-дневной и более длительной инкубации. Интересно отметить, что олигонуклеотид XVI, имеющий в своем составе 22-звенную одинаковую с XV нуклеотидную последовательность, был значительно менее эффективен. Наши исследования показали, что обработка клеток, зараженных ВИЧ-1, отдельными (в данном эксперименте из 22 ОДРТФ выбрано 2) антисенсовыми ОДРТФ при 1 мкМ концентрации практически полностью блокирует репликацию вируса. Это ингибнроваиие можно поддерживать последующими обработками клеток ОДРТФ в значительно меньших концентрациях: 0,1 мкМ и ниже, что, возможно, будет использовано в будущем при терапии антисенсовыми олигонуклеотидами in vivo.

В. ПОДАВЛЕНИЕ РАЗМНОЖЕНИЯ МАЛЯРИЙНОГО ПАРАЗИТА PLASMODIUM FALCIPARUM С ПОМОЩЬЮ АНТИСЕНСОВЫХ ОДРТФ.

Выяснение специфичности действия ОДРТФ было продолжено при изучении влияния антисенсовых олигонуклеотидов на размно-

жение малярийного паразита Plasmodium falciparum. Выбор именно этого объекта исследования обусловлен рядом факторов:

1. Малярией заболевает около 200 миллионов человек каждый год, однако лечение и контроль этой болезни становится все более затруднительным из-за роста штаммов, устойчивых к используемой в настоящее время хемотерапии. В общем, многие лекарства, используемые сейчас для борьбы с малярией, действуют посттранскрипци-онно на белки: например, антифолатные соединения ингибируют дигидрофолатредуктазу, сульфаниламидные препараты ингибируют дигидроптероатсинтетазу. Общим недостатком этого подхода является то, что 1 или 2 мутации в генах паразита, кодирующих мРНК соответствующих ферментов, могут привести к приобретению лекарственной устойчивости к таким препаратам. Использование антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на мРНК и ингиби-рование трансляции, может явиться альтернативным подходом, при котором предполагается, что единичные и даже двойные мутации не приведут к появлению устойчивости к ОДРТФ, тем более если оди-гонуклеотиды будут направлены на высоко консервативные районы мРНК.

2. Известно, что немаловажно при проведении работ по антисенсо-вой тематике, "с чего начать". Малярийный паразит не способен использовать экзогенный тимидин для синтеза ДНК и сам должен синтезировать пиримидиновые нуклеотиды. Поэтому, в принципе, лекарства (потенциально и антисенсовые олигонуклеотиды), подавляющие синтез пиримидиновых нуклеотидов у паразита должны быть клинически эффективны для лечения малярии.

3. Эксперименты с {-2Р)~ и [3Н)-олнгодезоксирибонуклеотидами, проведенные ранее в лаборатории П.Ч. Замекника продемонстрировали, что эритроциты человека непроницаемы для этого класса соединений (E.Rapaport et. al., 1992), так же как и эритроциты кролика (J.Goodchild et. al., 1991). Однако транспорт олигонуклеотидов через мембраны становится возможным у эритроцитов, зараженных малярийным паразитом, и это очень удачная ситуация для потенциального использования антисенсовой технологии.

Для проведения исследования было синтезировано 88 различных олигонуклеотидов, из которых на начальном этапе исследовались следующие (см. табл. 2):

Табл. 2.

Некоторые ОДРТФ, использованные для подавления размножения ______малярийного паразита_______________;________

N Нуклеотидная последовательность Целевая РНК,

кодирующая *

XV If d(TCTTCC'TCTCTCTACCCACGCTCTC) m__________

XVIII d(ATAAATATCGAAAACGTCGCA) ДГФР

XIX d(ATAAATATCGAAAACGTCGCAC) ЙГФР

XX d(TAAAATATG ACAAG G AG GTAATG CCAT) Ж.ФР _ .

XXI d(TC'ITAAAAATAATTTCTTCGTAGTTAA) ДГФР

XXII d(TgrrAjAIA^^TT^nç£TA^TrAA) _ _ ДГФР________

XXIII d ( ТС ДТА1ААХТАГТТД СТД CGTJGTôAA) ДГФР

XXIV d(rrAACTACGAAGAAATTATTnTAAGA) ДГФР

XXV d(iïAAAGTATTAGTTCTTGTATAGTTTCC) ДГПС

XXVI d(TAACA'nTAATATrCGAACAATATTTG) ДГПС

XXVH d(CAAAAATACCTCCATCTGAAAAAGAATC) ДГПС

XXVIII d(GGAGCAGAGGATTCTCCACCTATATC) ДГПС

XXIX d (CA1TTGTTCCTAAGTTTAATACG G Ç)______________ ДГПС

XXX d( G G G AAAAC АТС AG G ATATAATATTG G ) РР

XXXI d( AAG ACATG ATCCTTTCGTTGAGCCATG ) РР

XXXII d(CCGT(iTAATTTATTTTGlTTCTTAAACC) РР

XXXIII d (A IT ГС i С i TACATC'CAG TG G TTC ACITR i ]________ RHO___________

XXXIV d(CCAC7ACiG|TÇTA(iTACCACTTCACC)________________ RHO___________

XXXV d(CGGTrGTGTATTGAATGGAATATCTCC) RHO__________

XXXVI t!{OCATA.ATrGGAnCTACGATCAGCiAATA(:ATAC) ЕВА175

XXXVII d(TnTAATAAATAAATIXATATATACAT) ___ А"_______________

XXXVIII d(CCTCATTTTCTITAATTTGAA'nTCC) m___________________

XXXIX ^{0А,Л'П1С'ПС'1Т1'С;С'П'АА1*ГГАТТГСС') _________ дп_______________

XL d(TAATrAITATrA'ITATrATrATnTCG) ДП

XL! а(СССТА07'ПТСС'1"ПТГС1ТаТГСТСв) ________ ДП ......

XLjl_____ d(CCCirnCiAAACrrnCAIcnAlAGG) дп____________________

XLIII а(САААА.ГСС^СТСТГААААСГ(5ГГГ(;) ______ ТФИ

* ДГФР - дигидрофолатредуктазу/тимидилатсинтета iy, нуклеотндные шмоны в контрольных олигонуклеотидах подчеркнута; F.BAI75 - поверхностный белок мероэоитн; ТФИ - триозофосфатизомеразу; ДГПС - дшидронтсроатсинтетазу; RHO - ровтри белки; РР - рибонуклеотидредуктазу; ДП - ДНК полимер,ну

и

Штаммы (устойчивый к хлорохину) и \V2mef (устойчивый к хлорохину и мефлохину) инкубировались с ОДРТФ в течение 48 час, после чего о размножении паразита судили по включению (3Н|-гипоксантина или непосредственным подсчетом под микроскопом (исследование биологической активности синтезированных соединений проведено Робертом Баркером).

В первых опытах проверена активность четырех ОДРТФ ХУТИ-ХХ!, комплементарных участкам мРНК дигидрофолатсинте-тазы, которая катализирует реакцию образования 5,6,7,8-тстрагид-рофолата из 7,8-дигидрофолата и МОРН, что необходимо паразиту при синтезе 5'-ти мил иловой кислоты. Подавление роста паразита олигонуклеотидами XX и XXI значительно отличается от контроля XVII и заметно выше, чем с XVIII и XIX (см. рис. 10А и ЮБ);

Рис. 10. Подавление размножения паразит антисенсопыми олигонуклеотидами, комплементарными мРНК ДГФР. Приведены средние значения 5-S экспериментов. А - Ингибироаанис олигонуклеотидами (слева направо в каждой серии опытов) XXI; XVII, XVIII, XIX, XX; Б - олигоиуклеотидом XXI и контрольными XVII, XXII и XXIII, содержащими по 8 нуклеотидных замен, и XXIV - сенсошм ол и го I iy клеот идом.

Так как в среднем ингибирование при использовании олигонуклео-тида XXI было выше, чем другими ОДРТФ, он был использован как положительный контроль во всех последующих опытах. Для проверки специфичности воздействия олигонуклеотида XXI были использованы три различных типа отрицательных контролен. Это XVII -антисмысловой олигонуклеотид к gag-мРНК ВИЧ-1, который не имеет полной гомологии с известными нуклеотндкыми последовательностями Plasmodium falciparum; олигонуклеотиды XXII и ХХШ, последовательность которых происходит or XXI, Но отличается в 8 местах (при 19 одинаковых); и олигонуклеотид XXIV - смысловой

«ю

к»

концентрация ОДРТФ (мкМ) А

концентрация ОДРТФ (мкМ) Б

нуклеотнд. Согласно полученным данным при концентрациях ОДРТФ I мкМ и выше ингибирование роста паразита идет на 90% независимо от последовательности используемого олигонуклеотида. Однако при концентрациях между 0,5 н 0,05 мкМ существует очень заметная разница в противомалярийной активности антисмысловых и всех отрицательных контрольных ОДРТФ (см. рис. 10): 1С50 для отрицательных контролей в 10-15 раз выше, чем для олигонуклеотида XXI.

При концентрациях 0,005 мкМ-0,5 мкМ антисмысловые оли-гонукдеотиды ХХУП-ХХХУ1 также оказывают значительное инги-бпруюшее воздействие на рост паразита по сравнению с контрольными (см., например, рис. НА и IIБ):

А Б

Рис. II. Влияние ОДРТФ ни рост маляриИвых мерозоитон. Приведены средние значении 8 'экспериментов. А - ингибирование олигонуклеотидамн (слепа направо н каждой серии омытой) XXI, XVII и ХХ\'-ХХ1Х, комплементарными мРМК, колирующей дигидроптероатсинтетазу; Б - мнгибиронание олигонуклеотидамн XXI, XVII и ХХХ-ХХХП, комплементарными мРМК, кодирующей рибонуклео-тидредуктазу.

Антисенсовые одигонуклеотнды ХХХУП-ХЬН. комплементарные мРНК, кодируюшей ДНК-иолимеразу, менее активны, а олнго-нуклеотид XL.HI влияет на рост паразита практически так же, как и контрольный XVII. Основной вывод: при концентрациях ниже 0,5 мкМ именно антисенсовые олигонуклеотидтпофосфаты подавляют рост паразита сиквенсспецифически и эффективно.

Причины снквенсиеспецифических эффектов антнсенсовых ОДРТФ не ясны, хотя и предложены разные гипотезы. В первую очередь, ОДРТФ являются полианионами, которые, как показано в

других системах, связываются с рядом белков как на поверхности клетки, так и внутри ее. В случае малярии несиквснсснецифичсские эффекты, как было показано раньше, пропорциональны длине, концентрации антисенсового олигонуклеотида. Предложено, чти при высоких концентрациях ОДРТФ могут ингибировагь проникновение паразита в эритроциты аналогично декстран-сульфату (ßcuria M.К., 1951).

До настоящего времени нами проанализирована биологическая активность ОДРТФ, комплементарных семи различным мРНК. Функционально они попадают в 3 категории: 1) мРНК белков, включенных в биосинтез фолатов и репликацию ДНК (дигндрофолатредук-тазы, дигидроптероатсинтетазы, рибонукдеотидрелуктазы и ДНК-полимеразы); 2) мРИК белков, потенциально вовлеченных в проникновение мерозоита в эритроциты (RHO и ЕВА175); 3) мРНК белков, участвующих в синтезе Сахаров (триозофосфатизомеразы). Нами планируется проведение экспериментов по одновременному использованию ОДРТФ, комплементарных разным мРНК, как из одной, так и разных категорий. Результаты проведенного исследования подтвердили данные о сиквенснеспецифическом ингибировании размножения паразита синтетическими ОДРТФ при использовании концентраций 1 мкМ и выше (Clark D.L. et. al., 1994), однако наглядно показали, что мнение о сиквенснезависимом ингибировании неверно для концентраций 0,005 - 0,5 мкМ, когда сиквенсзаписимое ингибирование намного выше. Надо отметить, что наблюдалось значительное варьирование эффективности как при использовании олигонуклеотидов, комплементарных одной и той же мРНК, так и разным мРНК. Это может быть связано с различием в гибридизации ОДРТФ и разной доступностью участков РНК для взаимодействия. В конкретной серии экспериментов антисмысловые ОДРТФ, комплементарные участкам мРНК вблизи инициирующего трансляцию AUG кодона, оказались менее эффективны, чем комплементарные участкам, расположенным вправо от него (возможно, это объясняется особенностью паразита: геном содержит много AT богатых участков). Отметим также, что синтезирован и испытан лишь ограниченный набор ОДРТФ, не факт, что нами были выбраны самые лучшие последовательности (в смысле эффективности действия).

В продолжение исследовании но поиску более эффективных антисенсовых олигонуклеотидов нами был осуществлен синтез ряда

модифицированных олигонуклеотидов, в первую очередь, содержащие одиго-2'-0-метидРТФ-бдоки, которые сейчас находятся в работе, в том числе:

СгоишСшйтСтАтСл^С^итишйтититСтСпЛп^тОлАсДТ йпитСгоСтСгшЗ (АСАСТТвТТ) СгаСтКгаитСтАгаат

СтМтСтСтМтАтаОпАтЬ6пититС11Мгои^^^ М-(А, О, С, и)

а (ТСТТАААААТ) АцАтитититСтититС.пСтитАгаСп1ишОтАтс1А ОтСтититАтАтАтАтАтитс! (ААТТТСТ' ^тСтСтоитАгаСшититАтдА <1 (ТСТСКТСйАА) АтититСтСпЛтишАт--лпСтСшАтигаи1пС1патс1А итСтс! (ТТАААА) АтитАтАтитТМитСтититСтСтитАтСтиюипАтсЛ итСтититАтАтАтАтАгаитАтАтитититСгаититСс! (СТАСГТАА) с1(ТСТТССТСТСТСТАСССЛСЙСТСТС; и невыделенных участках а (ТСТТАЛАААТАЛТТТСТТССТАСТТ::Л) межнуклеогидные природные связи, а (ТСТТАААААТААТТТСТТССТАСТТАА) а не тиофос<|юди:>фирные

Прниеденные выше эксперименты четко показали, что подавление роста малярийного паразита антисмысловыми олпгонуклео-тидтиофосфатами нри определенных условиях (низкой концентрации) является специфичным (т.е. сиквеисзаииснмым). Дальнейшее выяснение причин различий в доступности ОДРТФ' к мРНК-мише-ним крайне важно для потенциального клинического применения лих соединений. Синтетические антисенсовые олнгонуклеотиды могут быть новым инструментом для идентификации генов, наиболее важных для биологии паразита. И хотя очевидно, что цель проведенных работ » настоящее время сфокусирована на создание анти-сенсовых олигонуклеотидов как лекарственных препаратов, идентификация с помощью ОДРТФ мишеней, на которые будут направлены противомалярийные препараты, может быть полезна и для создания других лекарств.

Г. ПОДАВЛЕНИЕ РОСТА МИКОБАКТЕРИЙ М. 8МЕСМАТ1$

СИНТЕТИЧЕСКИМИ ОДРТФ И ИХ ПРОИЗВОДНЫМИ.

В описанных выше биологических системах проблема проникновения синтетических ОДРТФ в клетки остро не стояла (хотя это и не означает, что ее нет). Но в других исследованиях, например, по ингибированию роста бактерий антисенсовыми олигонуклеотидами,'

ома становится первоочередной. Предпосылка к созданию нротиво-бактериалышх лекарств на основе олигонуклеотидов та же, что и для малярии: если раньше с бактериальными инфекциями боролись с помощью дещевых, легко доступных и эффективных бактериальных препаратов, то сейчас это огромная проблема из-за приобретения бактериями устойчивости ко многим лекарственным препаратам.

В проведенном нами исследовании (выполнено совместно с А.Левиной и Э.Рапапортом) впервые показано, что рост бактерий М. вп^та^, устойчивых к ряду лекарств, может быть эффективно подавлен с помощью антисенсовых ОДРТФ, в частности, комплементарных авк-мРНК. В целом, в проведенном исследовании было синтезировано и изучена противобактериальная активность 64 олигонуклеотидов и их производных.

Предварительные эксперименты с М. хгг^таш показали, что бактериальные клетки непроницаемы для ОДРТФ, т.е. при использовании серии антисенсовых ОДРТФ, комплементарных различным бактериальным мРНК, никакой активности (подавления роста) не отмечалось даже при использовании 25 мкМ концентраций ОДРТФ. В общем, это не явилось неожиданным фактом, так как давно известно, что архитектура стенок микобактерий, особенно внешнего слоя, не позволяет гидрофильным лекарствам (а ОДРТФ и являются таковыми) проникать в бактериальную клетку, в то же время гидрофобные соединения, которые легко растворяются в липидной фракции, могут входить внутрь клеток бактерий, (Отмстим, что стенки микобактерий представляют собой сложный тАОР-муколиларабинога-лактанпептидогликановый комплекс или, другими словами, клеточные стенки микобактерий состоят из ковалентно связанных муколи-евых кислот, арабиногалактана и пептидогликана). Нам не удалось добиться заметного ингибирования роста бактерий и с помощью различных производных олигонуклеотидов, в частности, ОДРТФ с ковалентно присоединенными гидрофобными группами (диметокси-тритильной, стеароильной и др.), которые успешно используются для повышения эффективности антисенсовых олигонуклеотидов в других системах, а также модифицированных по межнуклеотидным фосфатам, в том числе:

d(П")<'(¡СЧ.Л С'ПССДП подчеркнут метилфосфоиатные Л(<;<ХП1СТ1ТАШГЦ межнуклеотшише

<1<ОГГМС£1С1СС1АСП связи

d((iТПТГОССОТС'П'ССАТ) курсивом отмечен фрагменте метокснэтиламид-

ными межнуклеотидными связями

Тем не менее нам удалось добиться подавления роста бактериальных клеток с помощью антисенсовых ОДРТФ при использовании их совместно с лекарством, действие которого связано с изменением структуры стенок бактерий. Было известно, что этамбутол -СНзСН2СН(СН20Н)ЫНСН2СН^НСН(СН20»1)СН2СНз , введений с 1966 г. в клиническую практику для лечения туберкулеза и инфекций, вызванных другими микобактериями, повышает проницаемость лекарств в микобактерии. Предложено несколько возможных механизмов действия этамбутола, реализация которых приводит к подавлению синтеза компонентов клеточных стенок: в частности, в его присутствии ингибируется перенос муколиевой кислоты к клеточным стенкам (Takayama К., 1979); добавление этамбутола к М. smeg-matis приводит к быстрому накоплению декапренил-Р-арабипознда (Silve G., 1993), что указывает на его влияние или на перенос араби-нозы от донора, или на синтез самого акцептора арабинозы. Нами была испытана противобактериалытая активность ряда антисенсовых ОДРТФ, в частности, комплементарных участкам опубликованных нуклеотндных последовательностей ask-, asd- и inh-мРНК. Оказалось, что одигонуклеотиды, комплементарные ask-мРНК, эффективно подавляли рост IVL smegmatis в присутствии этамбутола в концентрациях 0,5-5 мкг на мл (см. табл. 3). Наиболее активными ока зались ОДРТФ: XLIV- d(TGCCGCAGCCACGGCGACGGC), ком племен тарный последовательности 1533-1553 ask-asd оперопа М. smegmatis; XLV - dtTGCCGCAGCTACGGC'GACGGCCGTGGT) -1527-1553; X1.VI - d(TGCCGCAGCCACGG(GACGGCCGTCiCJ I G TCCGAACC) - 1518-1553 - комплементарные области 1499-1553, нуклеотидная последовательность которой является высококонсерва-тивнон среди микобактерии и других бактерий и, как предполагается, кодирует активный центр асиартаткпназы. Основные результаты приведены в табл. 3:

Табл. 3.

Подавление роста М. smegmatis (штамм АТСС 607)в жидких средах антисенсовыми ОДРТФ.

этамбутол мкг/мл ОДРТФ (2,5 мкМ) число клеток М. smegmatis в мл х I0'6 24 ч 48 ч 72 ч

- 620 605 582

- XL1V 610 Ы)2 593

- XLV 612 603 590

- XLVI 615 600 575

0,5 - 71 240 • 411

0,5 XLIV 32 49 60

0,5 XLV 33 48 37

0,5 XLVI 30 45 52

1,0 - 39 109 172

1,0 XLIV 18 37 40

1,0 XLV 15 20 33

1,0 XLVI 15 21 34

5,0 " - 25 68 111

5,0 XLIV 14 27 44

5,0 XLV 14 21 37

5,0 XLVI 13 13 20

Ask и asd белки катализируют биосинтетические реакции, которые влияют на целостность клеточных стенок микобактерий. Несколько олигонуклеотидов. комплементарных различным сегментам этой области, проявляют в сочетании с эгамбутолом ингибируюший эффект, другие же нет. Олигонуклеотиды испытаны при концентрации этамбутола 0,5-5 мкг на мл, эффективно "работающие" ОДРТФ приводили к значительному (до 90%) ингибированию роста бактерий при 2,5-10 мкМ концентрациях (но сравнению с ростом в присутствии только этамбутола).

Другой подход обеспечения проникновения ОДРТФ в бактериальные клетки — постсннтетичсская модификации синтезированных соединений, а именно, ковалентное присоединение к ним некоторых лигандов, которые (по рабочей гипотезе) должны узнаваться бактериальными рецепторами, что в свою очередь будет способствовать проникновению ОДРТФ в клетки и тем самым 'обеспечивать

последующее шп ибированне роста М. ятевта^ и отсутствии этам-бутола. С! лон цедыо мы синтезировали я испытали ряд производных ОДРТФ, в том числе (см. Табл. 4):

Табл. 4

Некоторые производные ОДРТФ, использованные для подавления размножении М. япи^тапя без зтамбутола.

N

XI.VII XI.VIII XI.IX L

II

III (III I IV

IV I.VI LVII

1 VI1 i I.IX IX IX» I-XII

ОДРТФ

(HTGCCGCAGCCACGGCGACGGe)p

(l(TGCCGCAGCCACGGCGACGGC)p-Ala-Lys

<l( I CiC C(iCAGCCACGf;C'CiACCiGC)p-O-iiHWiix-epim*

iHTGCCGCAGCCACGGCGACGGC)p-l>-Ah

il( rCiCC4iCAGCCAC(;GCGACG(iC)p-L-iiiiK.'iocepiiu*

(inGCCGCAGCCACGGCGACG(iCp)-I)-uii0K0j;iMitH

cl(TGCCGCAGCCACGGCGACGGCCGTGGT)p-n- ииклосерин

il(T (iC'C '(iCAGCCACC;(K4iAC(i(iC)p-l.-ii liiccpim*

il(l(iCC:CiCA(iCCACG(iC(iAC(iGC)p-l.-Mct

cl(TGCCGCAGCCACGGCGAC'GGC)p- j гамйуюд*

bm.iим' pd(TGCCGCAGCCACGGCGACGGa

liiioimiiiyKjieojiw'"-pd(TGCCGC'ACiCCAC(i(jC'GACCiGC)

cl(TC)CC'(iCAGCCACG(iC4iACGGC)p-f)ii()TiiHiiyKJicojnii

lin<»niH-pil(TCCJCCiiAGC:GAC'CGC;CAGCGC) кон гриль

l>miiitH-p<in(jCCCiCA(iC'C'AC(i(i(4iAC(i(iCCCiTC>GT)

(l>m>imi-p)2it(TGCCGCA(iCCA<.4K;C(iAC4i(iC)

СИ,СН,С11(С'Н>ОН)ЫСН2СН^НСИ(СН2ОИК Н,С(1г этамбутод;

I

N >(..' I ЬС'ООС II ¿С 11 (N H )COOI I - aiacepim

NH

IIN \

О

L-никдосерин

D-аикдосерин

_. „

-- О

Положительные результаты получены только лишь с О-пиклосери-новыми и биотиновыми производными ОДРТФ. О-циклосеркн является антибиотиком с широким спектром действия и используется, например, как один из противотуберкулезных препаратов. Предполагается, что он усваивается клеткой через систему, которая используется для О-аланина. Олигопуклеотид Х1ЛХ значительно ингибирует рост М. вп^гшШя при концентрациях 5 мкМ (см . табл. 5):

Табл. 5.

Подавление роста М. Бпг^таия (штамм АТСС 607) в жидких средах модифицированным и олигонуклеотидами.

ОДРТФ 5 мкМ

число клеток М. ягги^шию в мл х 106

24 ч 48 ч 72 ч

650....... 609 582

268 213 128

581 477 " 417

604 541 446

576 492 407

77 189 388

52 63 105

45 67 120

46 65 ~ 98

31 26 44

Олигонуклеотнд XLVII (без D-циклосерина) или будучи присоединенным коналентно к этамбутолу, L-циклосерину, D- или L-ала-нину, L-азасерину без этамбутола практически не влияет на рост бактерий. D-цикдосернн (свободный) при концентрациях, соответствующих олигонукдеотидным (I мкг на мл) ишибирует рост М. smegmatis незначительно. 50% ингибирование роста достигается при использовании D-циклосерина в концентрациях 30 мкг на мл (см. Табл. 6):

Табл. 6.

Подавление роста М. smegmatis в жидких средах модифицирован ными олигонуклеотидами и D-цикдосерином.

Число клеток М. smegmatis в мл х 10 6 24 48 ч 72 ч _

"____632 560 513

. 6'° ~ 557.....495 7"

'""1. 291 233 ~ 168 _ ' _ J 381 " 287 225 " ~ 617 549 504

551 ........482 420

363 291 236 ^" I" '

Важно отметить, что D—циклосерии при концентрации 30 м'кг/мл не увеличивает активность модифицированнного олигопуклеотида XL1X, а (фактически уменьшает ее до уровня, достигаемого свободным D-цикдосерином. Эти данные предполагают, что свободный D-цнклосернн конкурирует за тот же самый рецептор, тем самым блокируя проникновение ОДРТФ с коналентно присоединенным D-ииклосерином и, естественно, последующее ингибирование им роста бактерий. Кроме того высокие концентрации 1)~адапнпа (0,2-0,5 мМ), по не L-аланина эффективно блокируют проникновение 1)~ цикдосеринмодифицированных олигонукдеотидо».

Кроме D-циклосерина другим ннзкомолекулярным лигапдом, позволяющим олигонуклеотиду проникнуть в клетки М. smegmatis в качестве ковалентного аддукта с ним, оказался биотип. Для начальных исследований синтезированы биотипилнроиапные олигонукдео-тиды LVII-LXI1 и исследована их активность как в присутствии, так

ОДРТФ, 5 мкМ

XLVII

XLIX

XL.IX

D-циклосерин, мкг/мл_______

30 I 5

30

и в отсутствии этамбутола. Важно отметить, что только 5'-биотини-лированные ОДРТФ (например, олнгомуклсотилы ГУН и 1^111) вызывали существенное ннгибирование роста бактерий без этамбутола. тогда как 3'—биотинилированный 1.1 X обладал значительно меньшей и только в присутствии этамбутола (см. Табл.7):

Табл. 7.

MIC биотинилированных олигодсзоксинуклеотидтнофосфатов для штамма АТСС 607 М. smegmatis.

Эта niбутол, м к г/мл

_ Олигонуклеотид MIC, мкМ

LVU 10

LVIII 10

L1X 20

____ LX больше 20

5 "" LVII 5

LVIII 5

5 LIX 7,5

5 J l.X " 20

MIC* -минимальная концентрация ОДРТФ, при котярой происходит шиибнро-ванис роста бактерий на 99% в течение 2 недель.

Таким образом, настоящие эксперименты, проведенные на лекарственно устойчивых штаммах М. smegmatis (как упрощенной модели М. tuberculosis), продемонстрировали, что антисенсовые олиго-нуклеотиды (в форме их тнофосфатных аналогов) могут быть успешно использованы для подавления роста бактерий при обеспечении им способности проходить через клеточные стенки и мембраны бактериальных клеток выше рассмотренными способами.

VII. СИНТЕЗ И ХРОМАТОГРАФИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ.

В изложенных выше работах было использовано более двухсот различных синтетических олигонуклеотидов и их производных. Уже один этот факт свидетельствует об огромных успехах, достигнутых в олнгонукдеотидной химии за относительно короткий промежуток времени. Если в начале исследования в начале 70х годов мы только начинали осваивать синтез одшодезоксирибонуклсоти-

дон гак называемым фосфодиэфирным методом, разработанным Г.Кораной, и синтез гетерогенного но составу октадезоксирнбо-нуклеотида занимал месяцы напряженной работы, то в начале 90х годов синтез олигорибо- и олигодезоксирибонуклеотндов и особенно 25~28-звенных ОДРТФ в количествах даже 40-50 мг занимал уже только несколько дней (учитывая очистку и обессолива-ние). Синтез проводился на твердой фазе в обычных синтезаторах. Теперь резко надает и стоимость олигонуклеотидного синтеза, что позволяет надеяться на доступное для многих лечение на основе ангисепсовых олигонуклеотидов, если антисенсовая технология оправдает возложенные на нее надежды. По самым оптимистичным прогнозам I грамм антисенсового олнгонукдеотида в конце 1997 года может стоить около $200.

Однако, если синтез немодифицнрованных олигодезоксирибонуклеотндов на автоматическом синтезаторе сейчас относительно прост и рутинен, те синтез модифицированных олигонуклеотидов продолжает оставаться творческим процессом, требующим выбора оптимальной схемы и регламента синтеза, получения нестандартных синтонов, выбора и использования методов постсинтетической модификации, например, активации концевых фосфатных групп и т.д. В настоящей работе эти и другие задачи решались как самостоятельно, гак и коллегиально. Большое внимание было уделено ра»работке методов анализа и очистки синтезированных соединений. Практически всегда приходилось совершенствовать методы анализа при переходе к синтезу новых производных. Нами были не только внедрены в лабораторную практику известные методы 1Г)ЖХ в применении к синтетическим олнгонуклеотидам п. их компонентам, но и разработаны системы, позволяющие анализировать модифицированные олигонуклеотиды, нуклеозиды. Остановимся более подробно на анализе ОДРТФ, которые, как уже отмечалось, в настоящее время являются важнейшими олиго-нуклеотилными аналогами в развитии нового терапевтическою подхода на основе аптисмысдовых олигонуклеотидов. Естественно, крайне важно иметь надежные методы очистки н контроля чистоты используемых препаратов в качестве'лекарств. ОДРТФ трудно анализировать с помощью ВЭЖХ н обрате! ню-фазовом режиме из-за диастереомерной природы этих соединении. До проведенных нами исследований ОДРТФ,анализировали анионообмеинон

хроматографией на SAX, но из-за высокого "сродства" этих соединений к сильным анионообменникам хроматография ОДРТФ с длиной олигонуклеотидной цепи больше 10 звеньев невозможна в стандартных условиях. Мы предложили использовать для анализа слабые анионообменники Partisphere WAX, а позже Barkerbond WP PEI. WAX-носитель представляет собой силикагель с диметила-минопропильными группами. При отработке условий разделения синтетических смесей после синтеза 10-35 звенных ОДРТФ использовались различные солевые системы. Лунине результаты получены с использованием градиента концентраций сульфата аммония в 25% анетонитрилс иХ),02 М КН3Р04.

Стандартные условия хроматографии на Partisphere WAX колонке 4,6 х 12,5 см (5 мкм, Whatman):

- буфер А: 20 мМ КН2Р04, (рН 6,3) 50 мМ сульфат аммония, 25% ацетонитрил;

- буфер Б: 20 мМ КН2Р04. (рН 6,3), 0,5 М сульфат аммония, 25% ацетонитрил;

- градиент: 2 мин буфер А, далее за 30 мин от 100% А до 100% В,

- скорость элюции t,5 мл в мин. Разделение проводится при комнатной температуре.

В этих условиях наблюдается разделение по длине вплоть до 25-звенных ОДРТФ. Времена выходы некоторых ОДРТФ приведены в табл. 8:

Табл. 8.

Времена выхода отдельных ОДРТФ при хроматографии на Partisphere WAX - колонке в стандартных условиях.

ОДРТФ время пыхода (мин)

d(GGGAAGCTTT) 6,5

iKOGCAAGCTTTAITGA) 12,8

d(GGCAAGCTTTATTGAGGCTr) 20,5

d(GGCAAGCTTTATTGAGGCTTAAGCA) 24,8

d(GGCAAGC'TTTATTGAGGCTTAAGCAGTGGG) 26,0

d(GGCAAGCnTATTGAGGCTTAAGCAGTGGGTrCTC) 27,1

Причем три различных 20-эвснных ОДРТФ: d(GGCААС)СТТТАТ-TGAGGCTT), d(AGCCTCGGAGGCCCGGCCAT) и d(AGCCGTG-

GAGTCCCGTTCAT) имели практически одинаковое время выхода. Т.е. время выхода ОДРТФ определяется, в основном, зарядом олигонуклеотнда, а не его составом. При использовании более пологих градиентов сульфата аммонии можно заметно улучшить разделение ОДРТФ, особенно коротких 10-18-звенных.

Разработанный метод анализа был многократно использован для анализа как многочисленных ОДРТФ, так и различных производных, полученных постсинтетически.

Интересно отметить, что в случае ^модифицированных (содержащих фосфодиэфирные межнуклеотидные связи) олиго-нуклеотидов введение рибозвеньев в олигодеэоксирибонуклеотид приводит к уменьшению времени выхода смешанных одигонукле-отидов на WAX-колонке в противоположность хроматографии тех же олпгонуклеотидов на SAX-колонках, когда разделение проводится в градиенте фосфата калия и 25% ацетопитриле.

Недостатком хроматографии на WAX-кодонках являлась хглительная подготовка этих колонок к работе и нестабильность среды при длительной работе. Как мы показали, другой слабый аннонообменпик Wide~Pore PEI (силнкагель с широкими порами и с ковалентно связанным полиэтиленимином, но не лонеречнос-пштым) значительно устойчивее в работе и для него не требуется предварительное ;инггельиое уравновешивание.

Для анализа и разделения смешанных олнгодезокенрибонук-леотидов, содержащих фосфодиэфирные фосфатные и тиофосфат-ные межнуклеотидные связи, нами предложена ион-парная хроматография на колонках Partisphere €18 в следующих условиях:

- буфер А: 0,1 М фосфат калия, 2 мМ ТБАФ (тетрабутиламмо-нпйфосфат), 12,5% ацетонитрил;

- буфер Б: 0,1 М фосфат калия рН 7,14, 2 мМ ТБАФ, 50% ацетонитрил,

- скорость элкмши 2 мл в мин,

- градиент: буфер А в течение 2 мин, далее от 100% А до 40%А-60%Б за 40 мин.

Время элюции олигонуклеотнда в выбранных условиях определяется соотношением обычных н тнофосфашых межпуклеотид-

иых связей. Для олигонуклеотида d(TCTTAAAAATAATTTCTFCG-TAGTTAA) оно меняется от 8,88 мин до 23,47 мин:

число обычных число тиофосфзтиых время выхода межнуклеотидных связей межнуклеотидных связей (мин) 26 0 8,N8 24 2 10,94 23 3 11,67 20 6 14,14 16 10 16.41 _0__26___. 23,47 ____

V1H. ВЫВОДЫ.

1. Впервые показано, что синтетические 8-12-звенные гетерогенные по составу олигодезокенрибонуклеотиды могут региоселективпо взаимодействовать с цедепыми участками высокомолекулярных природных РНК; ревертаза и РНКаза H способны узнать такие искусственно созданные гибридные дуплексы и начать элонгацию затравки с топографически фиксированной точки (в случае обратной транскриптазы) или региоселективпо расщеплять полири-бонуклеотидную цепь в случае РНКазы H из Е. coli.

2. Впервые показано, что в присутствии синтетического олигонук-леотида-затравки обратная транскриптаза (ревертаза) осуществляет полную обратную транскрипцию фрагмента РНК, имеющего прочную вторичную структуру. При оптимальной для действия ревертазы температуре, олигодезоксирибонуклеотиды-затравки, обеспечивающие достаточно интенсивный синтез кДНК при минимальном фоне неспецифической инициации должны иметь длину 8-12 нуклеоти-дов.

3. Разработан метод региоселективного расщепления высокомолекулярных РНК в гибридном дуплексе с гетерогенным по составу синтетическим олигодезоксирибонуклеотидом. Продемонстрирована возможность получения функционально-активных фрагментов генома подицистронных вирусных РНК с помощью этого метода.

4. Цоканию, чю селективность расщепления РНК РНКазой Н в гибридных дуплексах синтетическим олпгодеюксирибонуклеотидом может быть изменена с помощью направленном модификации саха-ро-фосфатного остова олигонуклеотидиого зонда. Впервые осуществлено peí носпеиифическое (только одной межнуклеотндиой связи) расщепление РНК РНКазой Н в гетеродуплексе со специально сконструированным смешанным олигонуклеогидом за счет введения в нею модифицированного фрагмента, способного к комплемента-иионным взаимодействиям с РНК в заданном участке, но образующим с РНК структуры, не расщепляемые РНКазой 11.

5. Найденные закономерности взаимодействия олигодезоксирибо-нуклеогидон с вирусными РНК позволили предложить для практического использования в качестве антнсенсоных олигонукдеотидов химерные олпгодезоксирнбонуклеотидтиофосфаты, обладающие повышенной устойчивостью к действию нуклеаз, сродством к РНК мишени и проявляющие более высокую противовирусную актив ность, за счет введения в них олиго—2'-0-метилрибонуклсо-тндтиофосфатных фрагментов.

6 Показано, что антисенсовые олигодеюксирпбонук;н июфос фагы при I мкМ практически полностью блокирую! ¡ . шкашпо ВНЧ-1. Это ингибирование можно поддерживать последующими обработками клеток антнсенсовыми олигонуклеогидами в значительно меньших концентрациях: 0,1 мкМ и ииж£.

7. Показано, что антисенсовые олигодезоксирибонукдеотидтиофос-фаты, комплементарные шести мРНК малярийного паразита Plasmo diiim lalciparum, при концентрациях Ü.5 мкМ и ниже эффективно и сиквеисспенифическн подавляют его рост.

8. Впервые продемонстрировано подавление роста мнкобактернй М smegmalis антнсенсовыми олишнуклеотилтнофосфатами га счо обеспечения им проникновения в бактериальные клетки в присутствии ламбутола, а также ковалентпого присоединения к олшо-нуклеотидам D-циклосерииа или биотина.

9. Осуществлен синтез более двухсот различных олигонукдеогидов и их производных, использованных в качестве затравок в обратной транскрипции РНК бактериофагов, антисснсовых олигонуклеотидон для подавления роста ВИЧ-t, малярийного паразита Plasmodium falciparum и бактерий М. smegmatis.

10. Разработаны методы хромагографичсского анализа и очистки олигодезоксмрнбонуклеотидтиофосфатов в аналитических и препаративных количествах.

Список основных публикаций по теме диссертации

J, Метелев В.Г., Друца В.Л., Смирнов В.Д., Шабарова ЗА, Прокофьев М.А. Синтез меченого тритием гексадезоксирибонуклеотида, комплементарного участку РНК фага RI7. // Докл. АН СССР. 1974. Т. 215. N 6. С. 466-469.

2. Метелев В.Г., Степанова О.Б., Смирнов В.Д., Шабарова ЗА, Прокофьев М.А., Фролова Л.Ю., Граевская H.A., Киселев Л.Л. Избирательная транскрипция фаговой РНК-ревертазой с использованием "адресованной" затравки. // Докл. АН СССР. 1974. Т. 217. N 4. С. 957-960.

3. Метелей В.Г., Степанова О Б., Родионова H.H., Друца В.Л., Смирнов В.Д., Шабарова З.А., Атабеков И.Г., Прокофьев М.А. Изучение комплексообразования синтетических олигодезоксирибонуклеотидов с РНК фага R57. // Докл. АН СССР. 1974. Т. 218. N 4. С. 976-979.

4. Метелев В.Г., Смирнов В.Д., Шабарова З А. Синтетические олиго-нуклеотиды как инструмент исследования природных структур и процессов (обзор). // Биоорган, химия. 1976. Т. 2. С. 293-314.

5. Джапаридзе Н.Ш., Метелев В.Г., Смирнов В.Д., Шабарова ЗА Синтез додекадезоксирибонуклеотида. // Известия АН Грузинской ССР. 1976. Т. 2. С. 545-546.

6. Фролова Л.Ю., Берзинь В.М., Янсоне И.В., Грен Э.Я., Метелев В.Г., Смирнов В.Д., Шабарова З.А., Киселев Л.Л. Обратная транс-

крииция фрагмента РНК, имеющего вторичную структуру. // Докл. АН СССР. 1977. Т. 232. N 3. С. 710-713.

7. Джапаридзе Н.Ш., Метелев В.Г., Смирнов В.Д., Шабарова З А., Прокофьев М.А. Синтез додекадезоксирибонукдеотида, соответствующею последовательности 5—16 rPHKVul (дрожжи). // Биоорган, химия. 1977. Т. 3. С. 501-510.

8. Frolova L.Yu, Metelev V.G., Ratmanova К.I., Smirnov V.D., Shabarova Z.A., Prokofev M.A., Berzin V.M., Jansone I.V., Gren E.J, Kisselev L.I... Reverse transcription of phage RNA und its fragment directed by synthetic heteiopolymerie primers. // Nucleic Acid Res. 1977. V. 4. P. 2145-2159.

9. Амбарнумян H.C., Метелев В.Г., Ратманова К.И., Сергеева Н.Ф., Смирнов В.Д., Шабарова З А., Берзинь В.М., Янсоне И.В., Грен Э.Я., Фролова Д .1С)., Киселев Д.Л. Механизм обратной транскриипни: требования к затравке. //Докл. АН СССР. 1978. Т. 242. N 3. С. 711-714.

10. Метелев В.Г., Степанова О.Б., Чичкона Н.В., Родионова ll.fl, Смирнов ВД., Богданова СЛ., Сергеева И.Ф., Ратманова К.И., Богданов А.А., Шабарова З.А., Атабеков И.Г. Метод направленной фрагментации рибонуклеиновых кислот. // Биологические пауки. 1978. N. 8. С. 27-30.

11. Stepaiiova О.В., Metelev V.G., Chichkova N.V., Smirnov V.D., Rodio nova N.P., Atabekov J.G., Bogdanov A-A., Shabarova Z.A. Addressed fragmentation of RNA molecules. // FEBS Letters. 1979. V. 103. P. 197-199.

12. Гупеев B.M., Мегелев В.Г., Шабарова З.А. Метод определения гуаиозиноных звеньев. // Химия природных соединений. 1979. выпуск 4. С. 570-573.

13. Metelev V.G., Rodionova N.P., Chichkova N.V., Atabekov J.G., Bog danov A.A., Shabarova Z.A., Berzin V.M., Jansone I.V., Gren E.J. Addressed fragmentation of RNA molecules. Determination of a specific cleavage site on MS2 bacteriophage RNA. // FEBS Letters. 1980. V. 120. P. 17-20.

14. Метелев В.Г., Степанова О.Б., Смирнов В.Д., Родионова II II Способ получения фрагментов рибонуклеиновых кислот. // Авторское свидетельство. 1980. N 722921.

15. Метелев В.Г., Степанова О.Б., Чичкова Н.В., Смирнов В Д., Родионова Н.П., Берзинь В.М., Янсонс И.В., Грен Э.Я., Богданов А.А , Шабарова З.А., Атабекоп И.Г. Направленный ферментативный гидролиз РНК. // Молекуляр. биология. 1980. Т. 14. вып. I. С. 200-211.

16. Родионова Н.П., Карпова О.В., Метелев В.Г., Богданова СЛ., Шабарова ЗА, Атабеков И.Г. Направленная фрагментация РНК вируса табачной мозаики: вырезание З'-концевого участка, содержащего ген белка оболочки вируса табачной мозаики. // Молекуляр. биология. 1983. Т. 17. Вып. 4. С. 809-817.

17. Elov А.А., Vinogradova M.N., Gromova E.S., Rosenthal A., Cecil D., Veiko V.P., Metelev V.G., Kosykh V.G., Burianov Ya.l., Bacv A.A., Sha-barova Z.A. Interaction of EcoRIl and modification enzymes with synthetic DNA fragments. IV. The binding and cleavage of substrates containing nucleotide analogs. // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. N 24. P. 8983-8998.

18. Грязнов C.M., Потапов В.К., Метелев В.Г.. Ел он А.А., Пурмаль А.А., Шабарова З.А. Полный автоматический синтез олигодезокси-рибонуклеотидов амидофос-фитным методом с помощью синтезатора "Виктория - 4М". // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. N 7. Р. 988-991

19. Грязнова О.И., Долинная Н.Г., Исагулянц М.Г., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Удалов Н.И., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Синтез и изучение термической устойчивости олигодезоксирибонуклеотилных дуплексов со структурными аномалиями. // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 124-132.

20. Заякина Г.В., Крынецкая Н.Ф., Метелев В.Г., Шабарова З.А. Химико-ферментативный метод синтеза смешанных олигонуклеотидов. и Биоорган, химия. 1987. Т. 13. N 2. С. 266-268.

21. Метелев В.Г., Крыненкая Н.Ф., Заякина Г.В., Родионова Н.П., Тюлькина J1.Г., Атабеков К.Г., Карпова О.В., Атабеков И..Г., Шабарова З.А. Повышение избирательности направленного гидролиза РНК РНКазон Н из E.coii с помощью смешанных олиго(дезоксирибори-бо)нуклсотидов. // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. N. 10. С. 1425-1427.

22. Metelev V.G., Zayakina G.V., Ryabushcnko I.L., Krynetskaya N.F., Romanova E.A., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. Influence of probe

structure on unique (regiospecific) cleavage of RNA by RNase H. // FEDS Letters. 1988. V. 226. N 2. P. 232-234.

23. Atabekov K.J., Tyulkina L.G., Karpova O.V., Metelev V.G., Rodionova N.P., Shabarova Z.A., Atabekov J.G. Site specific enzymatic cleavage of TMV HNA directed by deoxyribo- and chimeric (deoxyribo-ribo)oligonuc-leotides. // EEBS Letters. 1988. V. 232. N 1. P. 96-98.

24. Метелей В,Г., Крыме икая Н.Ф., Пурмаль А.А., Шабарова З.А. Гибрида шое расщепление РНК. Олигонуклеотндные зонды для регио-специфического расщепления РНК. // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. N 4. С. 507-513.

25. Романова Е.А., Орецкая Т.С., Сухомлинов В.В., Крынецкая Н.Ф., Метелев В.Г., Шабарова З.А. Гибридазное расщепление РНК. П. Автоматический синтез смешанных зондов. // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. N. 10. С. 1348-1354.

26. Metelev V.G., Krynetskaya N.F., Purmal А.А., Shabarovil Z.A., Tocik Z., Arnold L., Smrt J. Regiospecific cleavage of RNA by RNase H in the presence of complementary oligonucleotide with inserted alternating 2'-0-methylcytidine residues. // Collect. Czech. Chem. Comniun. 1990. V. 55. P. 2781-2786.

27. Krug A., Krynetskaya N.F., Metelev V.G., Cech D„ Shabarova Z.A. Synthesis of oligonucleotide probes containing 2'-deoxy-241uoronucleosides lor cleavage of RNA by RNase H. // Biomed. Biochim. Acta. 1990. V. 49. P. 161-166.

28. Крынецкая Н.Ф., Сухомлинов B.B., Рейнтамм Т.Г., Метелев В.Г., Шабарова З А. Влияние концевой фосфатной группы в олигонуклео-гидном зонде на эффективность гидролиза РНК рибоиуклеазой Н. // Вестник Московского Университета. 1990. серия 2. химия. Т. 31. N 3. С. 305-309.

29. Metelev V.G., Krynetskaya N.F. Influence of probe structure on hybri-dase RNA cleavage. // Collect. Czech. Chem. Comnum. V. 55. P. 253-256.

30. Крынецкая Н.Ф., Ташлицкий B.H., Белков B.M., Метелев В.Г., Шабарова З.А. Гибридазное расщепление РНК. III. Использование

спектроскопии для исследования кинетических свойств Е. coli РНКазы Н. // Биохимия. 1991. Т. 56. С. 687-693.

31. Шмидт С., Кузнецова Л.Г., Романова Е.А., Ниманн А., Орецкая Т.С., Крынецкая Н.Ф., Метелсв В.Г., Шабарова З.А. Гибридазное расщепление РНК. IV. Олитонуклеотидные зонды, содержащие 2'-дезокси-2'-фторнуклеозид и орабинофуранозилцитозин. // Биоорган, химия. 1991. Т. 17. С. 823-830.

32. Метелев В.Г., Крынецкая Н.Ф.. Волков Е.М., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Гибридазное расщепление РНК. V, Комплемснтационная точность расщепления. // Молекулярн. биология. 1991. V. 25. Р. 15801587.

33. Krynetskaya N.F., Metelev V.G., Tashlilski V.N., Sukhomlinov V.V., Shabarova Z.A. The hybridase RNA hydrolysis can be altered by oligonucleotide probes. // Nucl. Acids Res., Symposium Series. 1991. N 24. P. 268.

34. Schmidt S., Niemann A., Krynetskaya N.F., Oretskaya T.S., Metelev V.G., Sukhomlinov V.V., Shabarova Z.A., Cech D. The use of oligonucleotide probes containing 2'-deoxy-2'-fluoromicleosides for regiospecific cleavage of RNA by RNase H from Escherichia coli. // Biochimica el Biophy-sica Acta. 1992. V. 1130. P. 41-46.

35. Metelev V., Agrawal S. "Ion-exchange high performance liquid chromatography analysis of oligodeoxyribonucleotide phosphorothioates. // Analyt. Biochem. 1992. V. 200. P. 342-346.

36. Metelev V., Misiura K., Agrawal S. Ion exchange HPLC analysis of oligoribonucleotides and chimeric oligoribo-oligodeoxyribonucleotides. // Ann. NY Acad. Sci. 1992. V. 660. P. 321-323.

37. Lisziewicz J., Sun D., Metelev V., Zamecnik P., Gallo R., Agrawal S. Long-term treatment of human immunodeficiency virus-infected cells with antisense oligonucleotide phosphorothioates. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 1993. V. 90. P. 3860-3864.

38. Gaudette M.F., Hampikian G., Metelev V., Agrawal S., Crain W.R. Effect on embryos of injection of phosphorothioate-modified oligonucleotides into pregnant mice. // Antisense Res. and Dev. 1993. V. 3. P. 391397.

39. Agrawal Sudhir, Metelev Vale ri. "Hybrid" Oligonucleotide Phosphorothioates: Synthesis, properties and anti-HIV activity.// Proceedings of International Conference on Nucleic Acid Medical Applications. 1993. Cancun (Mexico). January 26-30. Poster Abstract 1-1.

40. Metelev V., Agrawal S. HPLC of phosphorothioates on the BAKER-BONO Wide-Pore PEI Media. // Proceedings of Science innovations. The Conference on New Research Techniques. 1993, Boston (USA). August 6-10. P. 46.

41. Temsamani J., Metelev V., Levina A., Agrawal S., Zamecnik P. Inhibition of in vitro Transcription by oligodeoxynucleotides. // Antisense Res. and Dev. 1994. V. 4. P. 279-284.

42. Metelev V., Lisziewicz J., Agrawal S. Study of antisense oligonucleotide phosphorothioates containing segments of oligodeoxynucleotides and 2'-0-methyloligoribonucleotides. // Bioorganic and Medical Chemistry Letters. 1994. V. 4. N 24. P. 2929-2934.

43. Chiang J.Li., Fiedman D.F., Wang C., Metelev V., Pardee A.B. Induction of Apopiosis in Uninfected Lymphocytes by HIV-1 Tat Protein. // Science. 1995. V. 268. P. 429-431..

44. Zamecnik P., Rapaport E., Metelev V., Levina A., Zamecnik M., Barker R. The Antisense Oligonucleotide Approach to Chemotherapy of Medical Diseases. // Proceedings of 2nd International conference on Antisense Nucleic Acids. 1995. Garmisch-Parkenkirchen (Germany). February. P. 8.

45. Rapaport E., Levina A., Metelev V., Zamecnik P. Antimycobacterial Activities of Antisense Oligodeoxynucleotide Phosphorothioates in Drug-Resistant Strains. // Proc. Natl. Acad. USA. 1996. V. 93. P. 709-713.

46. Barker R., Metelev V., Rapaport E., Zamecnik P. Inhibition of Plasmodium falciparum malaria using antisense oligodeoxynucleotides. // Proc. Natl. Acad. USA. 1996. V. 93. P. 514-518. e^^