Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека аналогами мРНК-производными олигоуридилатов с алкилирующей группой на 5'-конце тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

р V ь

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.217.34

Малыгин Алексей Аркадьевич

АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ 8GS РИБОСОМ ИЗ ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА АНАЛОГАМИ мРНК - ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОУРИДИЛАТОЁ С АЛКИЛИРУЮЩЕЙ ГРУППОЙ НА 5'КОНЦЕ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АИГОРЕФЕРЛТ

.нкчч'ртшии на соискание \ченои степени Kjn.nriaia химических на\ к

I (опосмбмрск - 1994 i

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель - доктор химических наук профессор Карпова Г.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С.Н.Загребельный кандидат химических наук Н.Д.Кобец

Ведущая организация: Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова Российской Академии наук

Отделение молекулярной и радиационной биофизики

Защита состоится " &" ^^^ Т9Я4. года в & часов на заседании Специализированного Совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан ^-^г^-^^^таэд г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат химических наук

Актуальность проблема. Одпим из центральных направлений в молекулярной биологии является изучение биосинтеза белка на рибосомах - трансляции. Ключевым событием этого процесса является взаимодействие матричной и транспортных ГНК с рибосомами. Именно на этом этапе осуществляется перевод информации, заключенной в последовательности нуклеотидов мРНК, на "язык" аминокислотной последовательности белков. Хотя к настоящему моыанту основные стадии этого процесса уае изучены, молекулярные механизмы многих протекапщх при этом реакций остаются пеЕыясняины-ми. По-видимому, существенный сдвиг в этом направлении возмоген только после детального исследования структурно-функциональной топографии главного участника трансляции - рибосомы, особенно тех элементов eS структуры, которые формируют район ксдон-антикодоповых взаимодействий.

Одним из наиболее продуктивных подходов для роитошш этой проблемы является метод аффинной модификации рибосом реакционно-способными аналогами компонентов аппарата трансляции (t.íPHK, тРКК и т.д.). Этод метод ранее бнл успешно использован при изучении рибосом E.coli (Карпова и Кнорре, 1Э91). Полученная при этом информация существепно дополнила представление о структуре рибосом в процессе трансляции, в частности, позволила выдвинуть гипотезу о динамичности структур, формирутоих мРНК- и тРНК-связывапцие центры рибосомы (Graifer et al., 1989: Vladimirov et al., 1990). Известно, что существует ряд принципиальных различий в механизмах биосинтеза белка у прокариот и эукариот (Nygard and Nilsson, 1990). Однако до сих пор наблюдается резкое отставание в изучении структурно - функциональной топографии рибосом высших организмов. Так, например, до начала настоящей работы практически отсутствовали данные об изменении окружения кодон-антикодоновых дуплексов на 803 рибосоме в ходе элонгационного цикла.

Цель работы. Целью настоящей работы было исследование взаимодействия аналогов мРНК - 4-[Н-(2-хлорэтил)-Ы-метиламино]-бензилметилфосфамидных производных олигоуридилатов (pU)n (где п=3,4,6,12) с 80s рибосомами из плаценты человека в составе различных модельных комплексов (с одним или двумя кодон-антикодоновыми взаимодействиями), образованных при участии Phe-TPHKphe.

Научная новизна. Изучена аффинная модификация 80S рибосом

из плаценты человека реакционноспособными аналогами мРНК -4-[Ы-(2-хлорэтил)-ы-метилыжшо]бегоилметилфосфамидаш олигоури-дилатов (pU)n. где п = 3, 4, 6, 12, в составе модельных комлек-сов, имитирующих различные состояния 80s рибосом в процессе элонгации. Показано, что модификации в этих комплексах подвергается исключительно малая субчастица. Установлена зависимость распределения модификации между I8S рРНК и белками от длины аналога матрицы, т.е. от типа комплекса. Показано, что I8S рРНК является основной мишенью алкилирования. в случае производных (pu)^ и (pU)4, т.е. в комплексах с кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-сайте, а рибосомный белок S26 - основная мишень модификации производными (pU)g и (pU)12> т.е. в комплексах, моделирующих претрапслокационное состояние рибосомы. Установлены районы I8S рРНК, внутри которых расположены сайты модификации. Впервые в рибосомах эукариот с помощью метода обратной транскрипции идентифицированы нуклеотидные остатки I8S рРНК, подвергающиеся модификации аналогами мРНК.

Практическая ценность. На основании данных по аффинной модификации 80S рибосом производными олигоуридилатов с алкилиру-ющей группой на 5'-конце предложена схема изменения окружения 5'- стороны кодона, взаимодействующего с тРНК в Р-сайте, при переходе от комплекса с одним кодон-антикодонов™ взаимодействием к претранслокашонному состоянию с двумя кодон-антикодоновыми взаимодействиями.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международной конференции "Биосинтез белка" (Пущино, 1991) и международной конференции "Аппарат трансляции" (Берлин, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 печатные работы.

Структура работы. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста, состоит из введения, трёх глав, выводов и списка цитируемой литературы из 131 наименования и содержит 4 таблицы и 17 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Испожзуеше_1^ агента ji_coct§b^

В настоящей работе для аффинной модификации 80s рибосом из плаценты человека в составе соответствующих специфических комплексов нами были использованы 4-Ш-(2-хлорэтил)-Ы-метил-амино]бензилметилфосфамиды олигоуридилатов, circh2n(ch^)(ри)n> (рис.1). Были выбраны олигоуридилаты четырех различных длин: три-, тетра-, гекса- и додекамеры. На основании данных, полученных для рибосом E.colt (Vladimirov et al., 1990) предполагалось, что в присутствии родственной Phe-TPm^*10 три-и тетрауридилаты будут образовывать комплекс с 80S рибосомами с кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-сайте. Как показано ранее на рибосомах из плаценты человека (Graifer et al. , 1992), аналоги мРНК, несущие два и более кодонов UUU Jksk з

CI-CH2-t|:? _

KQWr

ск3

Рис.1. Аналоги мРНК - 4-[М-(2-хлорэтил)-Ы-метиламино]бензил-метилфосфамиды олигоуридилатов с ажилирупцей группой на 5'-конце.

а) химическая формула алкилирующей группы

б) пространственная стержневая модель гексауридилата (А-форма) с алкилирующей группой на 5'-конце (любезно предоставлена Васи.ИгРрпм В.В. ( НИоХ СО РАН)).

случае CpU)g и (pU) 12), стимулируют связьтание Phe-TPHKPhe одновременно в А- и Р-сайтах, что приводит к транспептидации. В результате в A-сайте рибосомы оказывается PhePhe-TPHKphe, а в Р-сайте - деацилировэнная тРНК^6; т.е. моделируется пре-транслокационное состояние рибосомы, в цикле элонгации.

Связшзаоте_ошгоуридилатов^ __производ-

™2_5_80§_рибосома^_из_плацееты_челдвека.

Связывание олигоуридилатов и' их производных полностью зависело от присутствия кодон-специфичной Phe-TPHK^16. Предельные уровни связывания олигоуридилатов и их производных практически не отличались и не зависели от длины олигоуридила-та. Степени связывания в условиях насыщения составляли примерно 0.5 моль аналога мРНК на моль 80S рибосом, что коррелировало с активностью 80S рибосом. Следовательно, каздая рибосома могла связать только одну молекулу аналога мРНК в присутствии специфичной тРНК. Гекса- и додекауридилаты и их алкилирупцие производные имели более высокое сродство к 80S рибосомам, чем три- и тетрауридилаты и их производные. Эти различия могут быть объяснены тем, что (pö)g и (pU)12 фиксируются на рибосоме двумя кодон-антикодоновыми взаимодействиями. Модифицирующая группа вызывала некоторое уменьшение сродства аналогов мРНК к 80s рибосомам по сравнению с нативными олигоуридилатами. Тем не менее, в условиях насыщения эта группа практически не влияла на уровень связывания аналогов мРНК с 80s рибосомами.

Ковалентное_присоедшение__ажилир^щих__производных

одагоуридалатов_к_80§_рибосомам.

Для образования комплексов в экспериментах по аффинной

модификации 80S рибосом были взяты концентрации

CIECH2N(CH3)[5'-32P](pu)n, соответствующие насыщению рибосом

аналогами мРНК. Модификацию рибосом проводили при 25°С в

течение 5 ч, что соответствует практически полному превращению

реагента в активную промежуточную частицу. Было показано, что

на протяжении времени инкубации уровень связывания меченных 32

Р производных олигоуридилатов с рибосомами практически не изменялся. После проведения реакции рибосомные комплексы

ор

разрушали и анализировали распределение метки Р между рибосомными субчастицами центрифугированием в градиенте

QO

плотности сахарозы. Во всех случаях метка Р присутствовала

только во фракциях градиента, содержащих 40S субчастицы рибосом. В контрольных экспериментах с химически переакщкшно-спо с о бными аналогом! мРНК H0RCH2N(CH3H5'-32P](pU)3 и нсжстуксн^) [5'-^Р] (pij)g, предельные уровни связывания которых с рибосомами нэ отличались от таковых для алкилирующих

ор

производных (pU)3 и (pü)g, метка Р во фракции 40S суо'частиц

не регистрировалась. Это значит, что в выбрзшгах условиях

происходит количественное разрушение комплексов рибосом с

ЯР

аналогами мРНК и наличие метки Р во фракции 40S субчастиц связано исключительно с ковалентным присоединением аналога мРНК к рибосомам.

Данные по аякилироваш® 80S рибосом из плаценты человека производными олигоуридилатов с алкилирушей группой на 5'-конце суммированы в таблице I. Видно, что немеченые олиго-уридилаты, добавленные в реакционную смесь в концентрации, на

Таблица X.

Степень модификации 40S субчастиц в составе соответствующих комплексов 80s рибосом с производными олигоуридилатов. (Относительная ошибка не более 10$.)

Добавленные компоненты Ковалентно присоеди-

Реагент ~Phe нбнный реагент, моль

_phe~TFHK (pU)n на моль 40S субчастиц

ClRCH2N(CH3)[32P](pU)3 + • - 0.36

С1ЕСН2Ы(СН3)[32Р](pU)3 - - 0.01

ClRCHgNfC^) [32р] (pU)3 + + 0.02

circhgn(сн3)[32р](pU)д + - 0.29

ClRCiyHCH-jH^PHpU^ - 0.01

ClRCH^NfCJ^) [32Р] (pU)^ + + 0.01

ClRCH2N(CH3)[32P](pU)6 + - 0.24

ClECH2N(CH3)[32P](pU)g - - 0.02

ClRCH2N(CH3)[32P](pU)6 + ч 0.05

ClRCH2N(CH3)[32P](pU)12 + - 0.28

ClRCH2N(CH3)[32P](pU)12 - - 0.04

ClRCH2N(CH3)[32P](pU)12 + + 0.06

порядок превышатоей концентрацию соответствующего производного, почти полностью защищали 40S субчастицы от модификации. Это означает, что присоединение аналогов мРНК к рибосомам происходит только в составе соответствующего специфического комплекса (модификация рибосом избытком реагента из раствора не наблюдается). Наконец, последняя серия контрольных экспериментов показывает, что модификация полностью зависит от наличия специфичной тРНК. Следовательно, алкилирование рибосом происходит в области кодон-антшсодоновых взаимодействий (вблизи 5'-концевого нуклеотида кодона, связанного с тРНК в Р-сайте). Необходимо отметить также, что с изменением длины олигоуридилатной части реагента степень модификации изменяется незначительно.

Ранее при изучении аффинной модификации рибосом е. сои было показано, что в комплексах с последними аналогичные производные олигоуридилатов - модифицировали наряду с малой, также и большую субчастицу в сопоставимой степени (Vladimirov et al., 1990). В комплексах, рибосом из печени крысы эти же производные, как и в случае рибосом из плаценты человека, алкилировали в основном 4OS субчастицы (Stahl and Kobetz, 1984i stahl and Karpova, 1985). Таким образом, представленные в работе результаты в совокупности с данными, полученными ранее на рибосомах E.coli и печени крысы указывают на существенные различия в' организации области кодон-антикодоновых взаимодействий в рибосомах бактерий и эукариот.

^§™2_Е§сПЕ§далетя_модафжации_межд2__I8S__рРНК__и

бежа™_ыдтри_40§_субчастиц.

Для анализа распределения радиоактивной метки между i8s рРНК и 40s рибосомными белками модифицированные 40s субчастицы диссоциировали на рРНК и белки инкубированием в буфере, содержащем sds, и ценрифугировали в градиенте плотности сахарозы (5-20$), содержащем sds и edta. Результаты экспериментов представлены в табл.2. Видно, что модификации подвергаются как i8s рРНК, так и белки. Причем с увеличением длины олигоуридилатной части реагента уменьшается доля модифицированной i8s рРНК и увеличивается доля модифицированных белков, тогда как общая степень модификации рибосом остаётся примерно одинаковой для всех реагентов (см. табл.1).

Таблица 2.

op

Распределение метки Р между фракциями рРНК и рибосомных белков в 40S субчаствдах после модификации 80S рибосом производными олигоуридилатов. (Относительная ошибка не более ЮТ.)

аналог мРНК 1 ■■■ ол ■ Распределение метки Р ($)

I8s рРНК белки

СlRCHgH(СН3)[32Р](pü)3 96 4

CIRCON (СН3 ) [ 32Р ] (pU) 4 93 7

СlRCHgN(СН3)[32Р](pU)g 24 76

СlRCHgM(СН3)[32Р](pU) 12 4 96

Особенно резкий "скачок" в распределении метки между рРНК и белками наблюдается при переходе от производного (pU)^ к производному (pü)g, т.е. при переходе от комплекса с одним кодон-антикодоновнм взаимодействием к комплексу с двумя кодон-антикодоновыми взаимодействиями (см.стр.3). Следовательно, связывание второй молекулы тРНК В A-сайте вызывает существенные изменения в окружении матрицы вблизи 5'-конца триплета, связанного с тРКК в Р-сайте. Для рибосом Е.соЛ имеются данные о существовании излома меяду двумя соседними колонами, обеспечивающего одновременное связывание двух молекул тРНК в А- и Р-сайтах (Fairclough and Cantor, 1979). В нашем случае такой излом мог бы реализоваться в комплексах рибосом с производными (pu)g и (pU)12> фиксированными на рибосоме кодон-антикодоновыми взаимодействиями одновременно в Р- и A-сайтах. Для производных (pü)j и (pU)4 реализуется другой тип комплексов, когда аналог матрицы фиксирован на рибосоме лишь кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-сайте.

Не исключено также, что полученные данные объясняются функциональной динамичностью структуры самой рибосомы. Как было показано ранее при изучении аффинной модификации рибосом Е.coli аналогами мРНК, структура декодирующего центра рибосом не является статической, она меняется в процессе трансляции (Vladimirov et al., 1990). В зависимости от функционального состояния рибосом, те или иные рибосомные компоненты могут

попадать в область кодон-антикодоновых взаимодействий, отражая тем самым динамику функционирования рибосомы в процессе трансляции, В нашем случае комплекс SOS-Phe-TPHK^tP-cañT) • •ClRCHgNCCHj)(pU)n> где п=3 или 4,--имитирует посттранслокаци-онное состояние рибосомы с вакантным A-сайтом, а комплекс 80S•тРНКРЬв(Р-сайт)•(Phe)2-тРНКРЬе(А-сайт)• C1RÇH2N(CH3)(pU)n, где fi-б или 12, отражает претранслокационное состояние рибосомы. "

Идентифик ация_районов__ISS__рРНКл__содержащих__сайты

ковалентного____присоединения____

Идентификацию фрагментов I8S рРНК, внутри которых расположены сайты ковалентного присоединения аналогов мРНК, проводили с помощью блот-гибридизации модифицированной I8S рРНК с фрагментами рестрикции плазмиды рНг13, содержащей транскрибируемую единицу рибосомных РНК человека. Из плазмиды рнпз с помощью рестриктаз Sali и Kpni был вырезан фрагмент, содержащий копию I8S рДНК, а также часть фланкирующих транскрибируемых спейсеров, внутреннего и внешнего. Этот фрагмент был гидролизован в четырёх параллельных экспериментах рестриктаза-ми Mspl, НаеШ,- Alui и Sau3A. Образовавшиеся фрагменты были нанесены на дорожки 8% полиакриламидного геля и разделены электрофорезом в нативных условиях. В качестве маркера длины был использован Мзр.1-гидролизат плазмиды pTZi8U. По окончании электрофореза гель прокрашивали бромистым этидием и фотографировали. Фрагменты рестрикции переносили из геля на нейлоновую мембрану методом электропереноса и фиксировали на мембране ультрафиолетовым, облучением. Положение иммобилизованных фрагментов рестрикции I8S рДНК на мембране определяли с помощью блот-гибридизации по Саузерну с меченными Р продуктами частичного щелочного , гидролиза ^модифицированной I8S рРНК. После соответствующей отмывки мембраны с иммобилизованными фрагментами рестрикции I8S рРНК использовали в экспериментах по блот-гибридизации с частично гидролизованной I8S рРНК, выделенной из модифр^цированных 40S субчастиц.

Во всех ■ случаях по окончании- гибридизации мембраны обрабатывали РНКазой А, чтобы удалить одноцепочечные участки РНК, не занятые в образовании дуплекса с рДНК. Таким образом,

метка, обнаруживаемая в уч&стке, соответствующем определенному фрагменту рестрикции,■указывает на существование сайта модификации I8S рРИК внутри района, комплементарного данному фрагменту рестрикции. Сопоставляя размеры гибридизушихся фрагментов с картой рестрикции рДНК и с последовательностью I8S рРНК человека (Maden et al., 1987), мы идентифицировали области I8S рРНК, содержащие участки ковалентного присоединения реагентов. Результаты экспериментов по блот-гибридизации приведены в табл.3.

Таблица 3.

Фрагменты I8S рРНК, содержащие сайты модификации производными олигоуридилатов, и соответствующие фрагменты в I6S рРНК е.col t.

Реагент Фрагмент I8S рРНК Соответствующий фрагмент В I6S рРНК E.coli

ClRCHgNíCltjHpin.j 975-1172 707-881

ClECH2N(CH3)(pU)4 975-1172 707-881

ClRCHgHíatjHpTDg 975-1061 707-793

ClECH2N(CH3)(pU)12 593-674, 498-578, ("530 ste^-loop")

975-1172, 707-881,

1748-1869 1440-1552 (3'-конец)

Наличие дополнительных сайтов модификации внутри фрагмента 1058-II72 IBS рРНК в случае производных (pU)3 и (рШ4, и отсутствие модификации внутри этого фрагмента в случае производного (pU)g указывает на различия в окружении матрицы вблизи 5'-концевого нуклеотида кодона, связанного в Р-сайте. Что касается производного (ри)12, то в данном случае наблюдается модификация ещй в двух районах I8S í>PHK: 593-674 и 1748-1869, соответствующих районам "530 ater.n--loop" и 3'-концевой части d I6S рРНК E.coli. Ранее модификация внутри этих фрагментов наблюдалась в составе модельных 40S комплексов инициации трансляции при использовании произведших AUGURO (ррйон 5ЭЗ-674) и AUGC (район 1748-1869), несущих алгшлирупау® группу на 3'-конце (Мундус и соавт., 1393), а также в составе претрсяс-

локационных комплексов при использовании аналогичных производных (Up)gC и (Up)12C (район 1748-1869) (Булыгин и соавт., 1992). По-видимому, при использовании производного (рЮ12 в качестве аналога матрицы образуется гетерогенный набор комплексов, имеющих различную длину 5'-концевой олигоуридилатной части реагента, не участвующей в кодон-антикодоновом взаимодействии. В одном из крайних положений в кодон-антикодоновом взаимодействии участвуют два первых триплета, и такой комплекс похож на комплекс, образованный производным (pU)g. Вероятно, именно в таких комплексах происходит модификация I8S рРНК внутри фрагмента 975-1061. В другом крайнем положении в кодон-антикодоновом взаимодействии принимают участие два последних триплета, при этом длина свободной олигоуридилатной части реагента позволяет алкилирующей группе реагировать с достаточно удалёнными участками I8S рРНК. По-видимому, в таких комплексах происходит модификация внутри фрагментов 593-674 и 1748-1869, лежащих по данным (Булыгин и соавт., 1992; Мундус и соавт., 1993) вблизи 3' конца аналогов мРНК, расположенных в декодирупцем центре.

0пр§2елеще_сайтов_модифжации__в__I8S_pPHK^

Алкилированные основания в I8S рРНК были определены с помощью обратной транскрипции. Этот метод широко используется для определения'сайтов сшивок различных лигандов (тРНК, мРНК и т.д. ) с рРНК, происходящих в составе соответствующих комплексов рибосом Е.coll (Cunningham et al., 1992(b); Bhangu and Wollenzien, 1992; Rinke-Appel et al., 1993). К I8S рРНК эукариотических рибосом метод обратной транскрипции был впервые применён в настоящей работе. Суть метода состоит в том, что синтез цепи кДНК с помощью обратной транскрипции останавливается (или замедляется) на модифицированном основании РНК. • Для определения остановок (или "пауз") обратной транскрипции на модифицированных нуклеотидных остатках использовали I8S рРНК, полученную фенольной депротеинизацией реакционной смеси после окончания алкилирования, с последующим осаждением этанолом. В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали 20-ти звенные дезоксирибоолигонуклеотиды, комплементарные районам I8S рРНК: II8I-I200 (праймер I) и I08I-II00 (праймер 2). Праймеры были выбраны на основании

экспериментов по блот-гибридизации (см. табл. 3). Расположение модифицированных нуклеотидов в I8S рРНК определяли с помощью электрофореза продуктов обратной транскрипции в денатурирующем ПААГ, параллельно анализировали сиквенсные и контрольные реакционные смеси (рис.2). В сиквенсных реакциях исользовали

aUGCA346K 6UGCA346K

I * т - "

_ А-1058 Ц

" «3 © е» - -G-I059 T

£

S _

О - • « w ^ -A-I023

° - ^ - -C-I026

4А-1027

О

<Т> л —

- о Î — © С» ч» OL _

с» <& щ а § ©

«sa

-A-I020

Рис.2. Анализ продуктов обратной транскрипции модифицированной I8S рРНК, полученных с использованием праймера I (а) и прайме-ра 2 (б), электрофорезом в денатурирующем ПААГ. Радиоавтографы гелей. 0, G, С, А - дорожки с сиквенсом I8S рРНК. На дорожках 3, 4, 6 для обратной транскрипции была использована I8S рРНК, модифицированная соответственно производными (pU)3, (pU)^, (pU)6. Дорожка К- контроль. В случае контроля для обратной транскрипции была взята I8S рРНК, выделенная из немодифициро-ванных 40S субчастиц, прошедших все те же стадии инкубации и обработки, что и модифицированные субчастицы. Отмечены нужлео-тиды, на которых происходит "остановка" (или "пауза") обратной транскрипции.

немодифицированную I8S рРНК, а в контрольных экспериментах -I8S рРНК, выделенную из немодифицированных 40S субчастиц, прошедших те же стадии инкубации и обработки, что и модифицированные субчастицы. Для I8S рРНК, модифицированной производными (pU)3 и (pU)4, были обнаружены "остановки" (или "паузы") обратной транскрипции на основаниях A-I023, C-I026, A-I058 и G-I059, а также (в меньшей степени) на основаниях A-I020 и A-I027. В случае I8S рРНК, алкилированной производным (pU)g, была обнаружена "остановка" (или "пауза") обратной транскипции

в единственном положении A-I058. I8S рРНК, модифицированная производным (pU)12> для обратной транскрипции не использовалась из-за низкой степени модификации, недостаточной для обнаружения "остановок" обратной транскрипции.

Принято считать, что сайтом модификации является нуклео-тидный остаток, расположенный после основания (в направлении к 5'-концу РНК), на котором произошла "остановка" обратной транскрипции. В нашем случае это означает, что модифицированными основаниями ЯВЛЯЮТСЯ U-I022, U-I025, C-I057 и A-I058, а также C-I0I9 и C-IQ26. Однако ранее было показано, что поиз-водные ароматических 2-хлорэтиламинов не способны модифицировать остатки уридина при pH, близких к нейтральным (для обзора см., Карпова, 1987). С другой стороны, в работе (Zenkova et al., in prep.) было показано, что при обратной транскрипции мРНК, алкилированной аналогичными производными дезоксирибо-олигонуклеотидов, "остановки" (или "паузы") могут наблюдаться не только на основаниях, расположенных перед модифицированным нуклеотщшым остатком, но также непосредственно на алкилиро-ванном основании, а в некоторых случаях и после него. Поэтому мы считаем, что в случае производных (ри)3 и (ри)4 основными сайтами модификации являются основания A-I023, С-Ю26, C-I057 и AI058, а минорная модификация происходит по нуклеотидным остаткам C-I0I9 и A-I027. В случае производного (pU)g модификации подвергается в основном единственный нуклеотидный остаток C-I057.

Функциональная роль оснований A-I023, C-I026, C-I057 и А-1058 I8S рРНК в процессе биосонтеза белка на рибосомах млекопитающих не установлена. Можно только отметить,что эти сайты расположены - преимущественно в высококонсервативных районах молекулы SSU рРНК (Haue et al., 1990), что указывает на функциональную важность этого района.

Идентифжация_рибосог™х_белков^ модифвдируемых СТЕСНЁН (СН3 ) [32Р ] (pu)£ И CIBCH^N(сн^ Н^РНеУ^ 2.

Анализ модифицированных рибосомных белков проводили только в случае производных гекса- и додекауридилатов, поскольку в экспериментах с производными три- и тетрауридилатов относительная степень модификации белков была незначительной (см. табл.2). Рибосомные белки выделяли из верхних фракций

сахарозного градиента осаждением ацетоном после разделения модифицированных 40S рибосомных субчастиц на белки и IBS рРНК. Белки анализировали двумерным электрофорезом в ПААГ в присутствии 7М мочевины. Остатки олигоуридилатов, ковалентно связанных с белками, предварительно разрушали гидролизом смесью РНКазы А и щелочной фосфатазы. После такой обработки модифицированный белок должен нести только один дополнительный отрицательный заряд. _____■__

Рис.3. Анализ рибосомных белков, выделенных из 40Э субчастиц, модифицированных СНгсту-ЦСН^) [5' -3гРКри)6, двумерным гель-электрофорезом. а) электрофореграмма после прокрашивания геля кумасси ярко-голубым С-250; б) радиоавтограф этого же геля.

Результаты анализа рибосомных белков, модифицированных производным (ри)£, представлены на рис.3. Аналогичная картина наблюдалась в случае производного (рШ12 (результаты не приведены). Таким образом, модификации подвергается один и тот же единственный белок. Однако положение радиоактивного пятна на радиоавтографе геля не совпадало ни с одним из прокрашенных на электрофореграмме белков. Можно предположить, что дополнительный отрицательный заряд уменьшает суммарный положительный заряд модифицированного белка. В этом случае электрофоретичес-кая подвижность последнего будет меньше таковой для соответствующего немодифицированного белка. Следовательно, пятно, соответствующее положению модифицированного белка, на электрофореграмме должно быть смещено (относительно положения немоди-фициронанного белка) в "северо-западном" направлении. Поскольку радиоактивное пятно расположено в геле между белками Б24 и Б26, то можно предположить, что модификации производными (рШ^

и (pU)12 подвергается белок S26.

Более строгое доказательство модификации белка S26 было получено с помощью иммунологического анализа, проведённого в группе др. Шталя (Центр молекулярной медицины им.Макса Дельбрюка, Берлин-Бух, Германия). Для иммунопреципитации белков использовали кроличьи поликлональные антитела против крысиного бежа S26. Следует отметить, что гомология между рибосомными белками крысы и человека довольно высокая, (примерно 90$) (Wittmann-Liebold et al., 1990). В процессе анализа к суммарному белку, выделенному из модифицированных 40S субчастиц, добавляли препарат кроличьих антител против белка S26, сорбированных на смоле Protein A-Sepharose 4MB (PAS-anti-S26). Белки, выделенные ' из осадков, содержащих PAS-anti-S26, и соответствующих надосадочных фракций, параллельно разделяли гель-электрофорезом по Лэммли (Laeiroili, 1970) и переносили на штроцеллюлозную мембрану. Анализ показал, что в обоих случаях более 90$ радиоактивной метки содержится в полосе, соответствующей белку S26.

Ранее было показано, что белок S26 был также основным продуктом модификации в комплексах 80S рибосом из печени крысы с 5'-алкилирующими производными (pU)7 или (pU)12 и родственной тРНК (Stahl and Kobetz, 1984; Stahl and Karpova, 1985). Однако данные о его функциональной роли и расположении на рибосоме отсутствуют. Оказалось сложным идентифицировать его расположение на рибосоме с помощью иммуноэлектронной микроскопии, поскольку поликлональные антитела против крысиного белка S26 не связывались с 80s рибосомами из печени крысы (Stahl, личное сообщение). По-видимому, его антигенные детерминанты недоступны для антител, когда белок находится в составе рибосомы. Имеются лишь данные по сшивкам, согласно которым белок S26 является соседом белков S3a и S6 (Tolan and Traut, 1981). Последние, как показано, участвуют во взаимодействии с инициа-торной тРНК (Westermann et al., 1981) и мРНК (Takahashi and Ogata, 1981). Согласно данным, полученным в настоящей работе, Солок S26 расположен вблизи района кодон-антикодоновых взаимодействий (со стороны Р-сайта), рядом с нуклеотидом C-I057 183 pFHK. Возможно, этот белок вовлечён во взаимодействие с мРНК нч сплин элонгации.

1 4

Сх§ма_изменетя_окружеотя^^^

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что окружение 5'-конца кодона, связанного с тРНК в Р-сайте рибосомы, зависит от типа коплекса. Так в комплексах с вакантным А-сайтом, имитирувдих посттранслокационное состояние рибосомы, I8S рРНК (а именно, нуклеотидные остатки A-I023, С-1026, C-I057 и А-1058) является основным рибосомным компонентом, формирующим район, расположенный вблизи 5'-конца кодона, взаимодействующего с молекулой тРНК в Р-сайте. (Нет оснований полагать, что окружение матрицы, фиксированной на рибосоме кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-сайте, существенно зависит от состояния тРНК (аминоацил- или пепти-дил-тРНК), локализованной в Р-сайте.) В комплексе, моделирующем претранслокационное состояние рибосомы, в формировании этой же области принимает участие в основном белок S26. Выше (см. стр.7) уже высказывалось предположение, что такое изменение окружения матрицы вызвано связыванием молекулы тРНК в А-сайте. С другой стороны, полученные нами данные не исключают того, что для подобного изменения достаточно наличия собственно кодона в А-сайте рибосомы. Однако ранее в работе (Mundus et al., 1993) при модификации 40s субчастиц рибосом из плаценты человека в составе 40S комплексов инициации аналогичными производными pAUG и pAUGU^ распределение модификации между I8S рРНК и белками мало зависело от присутствия кодона UUU. Таким образом, в случае 40S комплекса инициации наличие соседнего кодона не вызывало существенных изменений в окружении 5'-конца кодона, фиксированного на рибосоме взаимодействием с инициа-торной тРНК. По-видимому, в нашем случае наличие собственно кодона в А-сайте • рибосомы также не приводило к изменению окружения аналога мРНК в соответствующей области вблизи декодирующего сайта. Следовательно, есть все основания считать, что изменение окружения 5'-стороны матрицы вызвано образованием кодон-антикодонового дуплекса в А-сайте. С учётом вышесказанного можно предположить, что подобные изменения происходят на рибосоме в ходе элонгационного цикла (см. схему, представленную на рис.4). Так, в посттранслокационном состоянии рибосомы, когда в Р-сайте находится пептидил-тРНК, а А-сайт свободен, область вблизи 5'-конца триплета, взаимодей-

18 Sp РНК

/4

//щи) nwT-Tf:Hl<

5' <ы N-N-N tnt /íPA„„ i з к

\ \

^ P-caÚT A-cqút __ (Оакантныи]

//''Л Пепт-т РНК ■

ЩСяь

/л РНК

,0" \ N-N-Nhsj

\ 1 ' "

P-caúT А-саит

Рис.4. Схема изменения окружения 5'-стороны кодона, связанного в Р-сайте рибосомы в ходе элонгационного цикла на основании данных по аффинной модификации 80S рибосом производными олигоуридилатов.

ствупцего с тРНК в Р-сайте, формируют остатки A-I058, C-I057, С-1026 и А-1023. В случае, когда рибосома находится в пре-транслокационном состоянии (деацилированная 'тРНК в Р-сайте, пептидил-тРНК в A-сайте), эту же область формируют белок S26 и в меньшей степени остаток С-1057.

ВЫВОДЫ

Изучена аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека реакционноспособными аналогами мРНК - 4-Ш-(2-хлор-этил)-Ы-метиламино]бензилметилфосфамидами три-, тетра-, гекса-и додекауридилатов в составе комплексов, моделирующих различные состояния рибосомы в процессе трансляции.

ЯА \02Ъ

CTCIOJ

l8SpPKK Л

1). Показано, что модификации во всех случаях подвергается исключительно малая субчастица рибосом.

2). Установлено, что в комплексах с кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-сайте, образованных с участием Phe-TPHKphe и производного (pU)3 или (pU)4, основной мишенью модификации является IBs рРНК. В комплексах с кодон-антикодоновыми взаимодействиями в А- и Р-сайтах, образованных прозводными (pU)g или (ри)12 при участии Phe-TPHKPhe, модификации подвергаются в основном рибосомные бежи.

3). Определены районы I8S рРНК, внутри которых расположены сайты модификации. Впервые метод обратной транскрипции применён для идентификации нуклеотидных остатков I8S рРНК, подвергающихся модификации аналогами мРНК. Показано, что производные (pU)3 и (ри)4 модифицируют остатки A-I023, C-I026, CI057 и A-I058, а производное (pU)g - остаток C-I057.

4). Установлено, что основной мишеныэ модификации производными (pU)g и (pU)12 является рибосомный белок S26.

5). На основании данных по аффинной модификации 80S рибосом производными олигоуридилатов предложена схема изменения окружения 5'-стороны кодона, взаимодействующего с тРНК в Р-сайте, в ходе элонгационного цикла.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Грайфер Д.М., Зенкова М.А., Карпова Г.Г. Малыгин А.А., Матасова Н.Б. Особенности неэнзиматического связывания

РЪр

олигорибонуклеотидов - аналогов мРНК и Phe-TPHK с 80S рибосомами из плаценты человека. // Молекуляр. биология 1990. Т.24. Вып.4. С.1076- 1083.

2. Малыгин А.А., Грайфер Д.М., Зенкова М.А., МамаевС.В., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека производными три- и гексауридилатов в качестве аналогов мРНК. // Молекуляр. биология. 1992. Т.26. Вып.2 С.369-377.

3. Karpova G.G., Graifer D.M., Malygin A.A., Mundus D.A., Zenkova M.A., Mamaev S.V. Functional topography of human ribosomes as studied by affinity labeling with reactive mRNA analogs. // Biochimie. 1992. V.74. №.4. P.373-380.

4. Малыгин А.А., Зенкова M.A., Смоленская И.А., Карпова Г. Г. Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты

человека аналогами мРНК - производными олигоуридилатов с алкилирупцей группой на 5'-конце. // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. № 8. С.791-799.

Подписано к печати 29.08.94

Формат 60x84 1/16 Печ. л. Уч.-изд.л. Заказ N>2, .

Тираж 100.