Аффинная модификация 40S субчастиц рибосом из плаценты человека производными олигонуклеотидов, содержащих инициирующий кодон AUG тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ8 ео

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 1 5 ПАа 1333 СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.217.34

МУВДУС ДМИТРИЙ АРКАДЬЕВИЧ

АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ 40S СУБЧАСТИЦ РИБОСОМ ИЗ ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ИНИЦИИРУЮЩИЙ КОДОН AUG.

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1993 г.

Работа выполнена б Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель -

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Г.Г.Карпова

доктор биологических наук С.Н.Загребельный кандидат химических наук Н.Д.Кобец

Ведущая организация: Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Российской академии-наук

Отделение молекулярной и радиационной биофизики

Защита состоится ■л. ^■оу^С-С Т99Я года в часов на заседании Специализированного Совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского. института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан е^С^мЛ^ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат химических наук j . О.С.Федорова

Актуальность проблемы. Изучение биосинтеза белка - одна из главных задач молекулярной биологии. Образование полипептидной цепи представляет собой заключительный этап, на котором осуществляется перевод генетической информации, заключенной в молекулах ДНК, в белковые структуры. Одним из центральных событий процесса трансляции является взаимодействие матричной и транспортных РНК с рибосомами. Существует ряд принципиальных отличий в механизмах белкового синтеза у эукариот и прокариот, причем основные различия проявляются на стадии инициации трансляции. Последовательность событий в цикле реакций, приводящих к образованию полипептидной цепи, хорошо известна. Однако молекулярные механизмы происходящих при этом процессов остаются во многом непонятыми, и в особенности это касается стадии инициации белкового синтеза в эукариотических клетках. Существенный сдвиг в этом направлении, по-видимому, возможен после детального изучения структурно-функциональной топографии главного компонента аппарата трансляции - рибосомы. Очевидно, что изучение структурной организации функциональных центров прокариотических и эукариотических рибосом наряду с выяснением структурных особенностей, обуславливающих различия в механизмах функционирования на стадии инициации позволило бы получить информацию для построения молекулярной модели функционирующей рибосомы и расширило бы наше понимание молекулярных механизмов процессов, происходящих при синтезе полипептидной цепи. Одним из подходов к изучению структурных элементов рибосомы, вовлеченных в формирование тех или иных функциональных центров является метод аффинной модификации рибосом реакционноспособными аналогами компонентов аппарата трансляции (мРНК, тРНК, АТР, факторов инициации и GTP). С использованием этого метода были достигнуты значительные успехи в изучении структурно-функциональной топографии рибосом E.coli (Graifer et al., 1989, Yladimirov et al., 1990). В этом отношении эукариотические рибосомы и, в частности, рибосомы человека, оставались малоизученными. Так, например, до начала настоящей работы практически отсутствовали данные о том, какие контакты матрицы с 40S субчастицей реализуются на стадии инициации трансляции.

Цель работы. Целью настоящей работы было исследование взаимодействия аналогов мРНК: [4-(Ы-2-хлорэтил)-Ы-метиламино]бен-зилметилфосфамидных производных олигорибонуклеотидов pAUGU^

(где n=0,3) и 2',3'-0-[4-(И-2-хлорэтил)-М-метиламино]бензилиде-новых производных олигорибонуклеотидов augu с (где п=о,з) с 40S рибосомными субчастицами из плаценты человека в составе модельного инициаторного комплекса 40s,elF-2,GTP*Met-TPHK|¡!et'a[^or мРНК.

Научная новизна. Впервые изучена аффинная модификация 40S субчастиц рибосом из плаценты человека производными олигорибонуклеотидов разной длины, содержащих инициирумций кодон AUG, с алкилирупцей группой на 5'- или 3'-конце в составе модельного инициаторного комплекса 40S*elF-2*GrP'Met-TPHK^et-аналог мРНК. Идентифицированы фрагменты I8S рРНК (длиной 81-138 нуклеотидных звеньев), внутри которых расположены участки I8S рРНК, принимающие участие в формировании 5'- или 3'- зоны области кодон-антикодоновых взаимодействий. С помощью олигонуклеотидных зондов, комплементарных 15-звенным участкам внутри одного из этих фрагментов, выявлены последовательности IBS рРНК, имеющие функциональную значимость во взаимодействии 40S субчастицы с тройным комплексом elF-2'GTP-Met- тРНК^ Я матрицей. Идентифициро-ваш рибосомные белки, формирующие область кодон-антикодоновых взаимодействий или примыкающие к ней в 40S инициаторном комплексе .

Практическая ценность. Разработан метод выделения модифицированных рибосомных белков с ковалентно присоединенным остатком олигонуклеотида с помощью одномерного гель-электрофореза. Предложена модель расположения матрицы в участке кодон-антикодоновых взаимодействий в комплексе инициации 40S•е1Г-2•GTP•Met-TPHK^et•аналог мРНК.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международной конференции "Биосинтез белка" (Пущино, 1991), франко-российском симпозиуме по молекулярной биологии "Биосинтез белков. Структура генома" (Конкарно, 1992), международной конференции "Аппарат трансляции" (Берлин, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов я списка цитируемой литературы из 240 наименований и содержит 9 таблиц и 13 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.' Связывание меченых 32Р олигорибонуклеотидов, содержащих AOG кодон, с 40S субчастицами в присутствии тройного комплекса eIF-2'GTP'Met-TPHK^et.

Для проверки функциональной активности аналогов мРНК -5'-[32Р]меченых олигорибонуклеотидов' pAUGUn (п=0,3) проводили их инкубацию с 40S субчастицами в присутствии тройного комплекса eIF-2•GlP*Met-TPHK^et при 37°С в'буфере с'8 мМ MgCl2. После инкубации в течение 10 мин количество связавшегося олигонуклеотида определяли фильтрованием через нитроцеллюлозные фильтры.

Связывание аналогов матрицы с 40S субчастицами сильно зависит от присутствия инициаторной Met-TPHK^et и eIF-2. Уровень связывания (0.96-1.65 пмоль аналога матрицы на 10 пмоль 40S) не превосходит количество [35s]Met-TPHK^et, связанной в тройной комплекс с eIF-2 и GTP (2.35 пмоль, как было определено в отдельном ■эксперименте).

2. Исследование аффинной модификации 40S субчастиц в 40S комплексе инициации производными pAUG и pAUGU-j с алкилирующей группой на 5'-конце.

2.1. Проверка функциональной активности аналогов матрицы ClRCH2N(CH3)[32P]pAUG И C1RCH2N(CH3)[32Р]pAUGU3 В образовании 40S комплексов инициации.

Связывание алкилирущих производных pAUG и pAUGU3 с 40S субчастицами так же, как и связывание pAUGUn, сильно зависело от присутствия тройного комплекса eIF-2'GTP*Met-TPHK^et. Степени связывания ciRCTyi(СН3 )pAUGUn практически не отличались от таковых для немодифицированных олигорибонуклеотидов в тех же условиях и составляли 1.72 и 0.86 пмоль на 10 пмоль 40S субчастиц для CiRCH2N(CH3)t32P]pAUG и C1RCH2N(CH3)[32P]pAUGD3> соответственно. В отсутствие тройного комплекса связывание ClRCH2N(CH3)[32P]pAUGUn с 40S субчастицами практически не наблюдалось. Следовательно, связывание ciRCH2N(CH3)[32P]pAUGUn, также как и связывание pATJGUn, с 40S субчастицами в присутствии тройного комплекса eIF-2•gtp•Met-TPHK^e^ происходит специфично, т.е. в участке кодон-антикодоновых взаимодействий, при этом модифицирующая группа не приводит к заметному понижению сродства аналогов мРНК к 40S субчастицам.

2.2. Ковалентное присоединение С1РСН2Ы(СН3)[згр]рА1ГС и С1Ш12Ы(СН3)[32р]рАиси3 к 4Об субчастицам. Использованше в настоящей работе для аффинной модификации 40Б субчастиц [4-(И-2-хлорэтил)-ы-метиламино]бензилметилфосфа-миды олигорибонуклеотидов рАисип (С1РСН2Ы(СН3) [32р]рАшип) приведены на рис. 1.

Рис. I. Реакционноспособ-ные аналоги матриш с ал-килирущей группой на 5'-конце - 4-[Ы-(2-хлор-этил )-ы-метиламино]бензил-метилфосфамиды рлаа и рАГОи3.

С1—сн2- сн2

>-<ОУ

сн:

/ \ /

о

32'

СН,-М - р -о - сн,

¿11 I

сн3 о"

(1=0; 3

0

1

рирО|ри)

Таблица 1.

Аффинная модификация 4Об субчастиц из плаценты человека

реагентами сигсн^сн^[32р]рАШ и сш:н2ы(сн3) [32р]рАиот3 1-6 „ 406

(1.8x10

М)

мРНК-е1Т-2'ОТР-Ме^тРНК^.

комплексах инициации 403*аналог

Реагент

Компоненты

еТР-2 Мег-тРНК^е(;СТР АШи^

Ковалентно присоединенный реагент, пмоль на 10 пмоль 40Б субчастиц

+ + ■ + _ 0.19

- + + - 0.04

с1ксн2ы(сн3)рАте + + + + 0.05

- - + - 0.01

+ + + _ о.'зз

- + + - 0.12

С1ЕСН2Ы(СН3)рАисиз + + + + 0.11

- - + - 0.03

Для проведения аффинной модификации 403 комплексы инициации инкубировали при 25°С в течение времени, соответствующего практически полному превращению, реагента в активную промежуточную частицу (Малыгин и др., 1992). После окончания реакций комплексы подвергали диссоциации'и анализировали включение метки Р в 4ОБ субчастицы с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (см. табл.1). Видно, что модификация 4СВ субчастиц во всех случаях зависит от присутствия тройного комплекса еИГ-2,стР*Ме"Ь-тРНК^е^ и значительно ингибируется 50-крагным избытком соответствующего немеченного олигонуклеотида по отношению к реагенту. Следовательно, ажилирование 40Э субчастиц С1ЕСН2Н(СН3)[32Р]рАиоип протекает в специфических комплексах в области кодон-антикодоновых взаимодействий (с 5'-стороны), модификация 40э субчастиц избытком реагента из раствора (вне комплекса) не происходит.

Таблица 2.

Распределение метки Р32 между рРНК и белками в 40Б субчастицах, модифицированных реагентами С1ЕСН2м(СН3) [32Р]рАиО и с1ксн2жсн3) [32Р]рАШи3.

аналог мРНК Распределение метки 32Р, %

рРНК белки

CIRCHgN(СН3)[32Р]pAUG 69 31

CIRCHgN(СН3)132Р]pAUGU3 55 45

Для анализа распределения радиоактивной метки между рРНК и белками модифицированные 40s субчастици после отделения от тройного комплекса и неприсоединившегося реагента центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы (5-20$) в присутствии edta и додецилсульфата натрия. Данные по распределению радиоактивной метки между рРНК и белками приведены в табл. 2. Видно, что модификации подвергаются как I8S рРНК, так и белки. Однако, относительные степени модификации рРНК и белков в 40s субчастице зависят от длины матрицы. Иными словами, наличие второго кодона (в декодирующем сайте) влияет на окружение кодона aug в донорном сайте.

2.3. Идентификация участков I8S рРНК, модифицируемых

CIRCHgN(СН^ ) [ "^Р ]pAUG и CIRCHgN(СН3)[32Р]pAUGU3.

Идентификацию участков I8S рРНК, модифицированных ClECH2N(CH3)[32P]pAUGUn (п=0,3) проводили с помощью гибридизации модифицированной I8S РРНК, несущей метку 32Р, с фрагментами рестрикции плазмиды рнпз, содержащей полные копии последовательностей рРНК из плаценты человека (Maden et al., 1937). С помощью рестриктаз Sali и КрЩ из плазмиды был вырезан фрагмент (длиной примерно 3200 п.о.), содержащий полную копию I8S рРНК, а также часть внутреннего и внешнего транскрибируемых спейсеров. Этот фрагмент (рДНК) был гидролизован в четырех параллельных экспериментах эндонуклеазами рестрикции Мзр1, HaelII, AluI, И Sau3A. Полученные фрагменты рДНК были разделены электрофорезом в 10$ полиакриламидном геле в нагивных условиях, Mspl-гидролизат плазмиды pTZi8U был использован в качестве маркера длины. По окончании гель-электрофореза фрагменты рестрикции окрашивали бромистым этидием и переносили на нейлоновую мембрану. Для определения положения фрагментов рестрикции, содержащих определенные участки рДНК, их гибридизовали с немодифицированной I8S рРНК, фрагменти-рованной с помощью частичного щелочного гидролиза (100 мМ NaHCOj, pH 8.9, эо°с, 15 мин) и меченной с помощью [ï-32PJatp и Т4-полинуклеотидкиназы. После промывки мембраны с иммобилизованными фрагментами рестрикции рДНК использовали для гибридизации с фрагментированной как указано выше I8S рРНК, выделенной из модифицированных 40S субчастиц. Во всех случаях по окончании гибридизации мембраны обрабатывали раствором РНКазы А. После такой обработки, лишь фрагменты рРНК, полностью занятые в образовании дуплексов, остаются связанными с фрагментами рДНК на мембране. Таким образом, метка, обнаруживаемая в участке, соответствующем определенному фрагменту рестрикции, указывает на существование сайта аффинной модификации I8S рРНК внутри фрагмента, соответствующего данному фрагменту рестрикции. Радиоавтографы мембран с фрагментами рДНК, гибридизованными с модифицированной I8S рРНК (несущей метку 32Р) приведены на рис.2. Сравнивая размеры гибри-дизующихся фрагментов (см. рис. 2) с картой рестрикции рДНК и последовательностью I8S рРНК из плаценты человека (Maden et al., 198?), можно идентифицировать участки модификации I8S рРНК.

•J»

CL

552

370 370

341 00. 341

279 f-ф 279

121 г 121

Рис. 2. Блот-гибридизация по Саузерну фрагментов рестрикции рДНК с I8S рРНК: модифицированной C1RCH2N(CH3 H32P ]pMJG (а) и CLRCH2K(CH3)[32p]pAUGU3 (б), радиоавтографы.

Проведенный анализ показал, что участок ковалентного присоединения сшж2М(СН3)[32Р:!рАШи3 расположен внутри района 9?в-1057 18S рРНК. В случае с C1KCH2N(CH3)[32P]pAUG модификации в рРНК подвергалось два прилегающих друг к другу участка 9761057 и 1058-1164.

В связи с отсутствием данных о функциональном значении идентифицированных участков ковалентного присоединения аналогов мРНК к I8S рРНК наши результаты можно сравнить главным образом с данными, полученными на прокариотических рибосомах. Что же касается эукариотических рибосом, то согласно модели инициации белкового синтеза, предложенной в работе (Sarge and Maxell, 1991), область 1157-1180 I8S рРНК взаимодействует с 5S рРНК и мРНК. В непосредственной близости от этого района находится один из участков модификации I8S рРНК CIRCON(СН3 )pAUG.

Фрагмент 976-1057 18S рРНК соответствует району 707-788 16S рРНК Е.coli (спирали 20, 22, 23 и 24 (Raue et al., 1988)). Основания 16S рРНК в петлях, замыкающих спирали 23 и 24 защищались от химической модификации молекулой тРНК, связанной в рибо-сомном Р-сайте (Moazed and Noller, 1986). Эти данные согласуются с результатами по модификации соответствушего района I8S рРНК

аналогами мРНК с алкилирущей группой на 5'-конце (т.е. модификация происходила в 5'-области участка кодон-антикодоновых взаимодействий).

2.4. Идентификация рибосомных белков, модифицируемых ClRCH2N(CH3)[32P]pAUG И ClECHgNfCHj)[32P]pAUGU3.

Для анализа модифицированных белков 40S субчастицы после алкилирования разделяли на фракции рРНК и белков центрифугированием в градиенте плотности сахарозы в, присутствии додецилсульфа-та натрия. Рибосомные белки (немодифицировэнные и модифицированные) выделяли из верхних фракций градиента осаждением ацетоном. Модифицированные рибосомные белки отделяли от немодифицированных с помощью одномерного гель-электрофореза. При этом использовали тот факт, что олигонуклеотидная часть коваленгно присоединенного остатка реагента вносит заряд -3 или -6 (в зависимости от длины олигонуклеотидной части реагента) в общий заряд модифицированного белка. Таким образом, модифицированные белки обладали отрицательным зарядом при использованных условиях электрофореза в отличие от большинства немодифицированных рибосомных белков и могли быть легко от них отделены. После выделения модифицированные

1 pr

белки подвергали иодированию с помощью Ыа Jl. Далее иодированные модифицированные белки анализировали двумерным электрофорезом в полиакриламидном геле, предварительно подвергнув гидролизу фосфамидную связь в остатках реагента, ковалентно связанных с белками. Результаты анализа представлены на рис. 3.

Рис.3. Двумерный гель- ;

электрофорез меченых Sj/3a sî/3a^l s2

125I рибосомных белков, : сс^ S4

с с. ^ 4

модифицированных S7 > ьь S7 S6

С1ЕСНгЫ(СН3)рАШ (а), Ф S9

ClRCH2N(CH3)pAUGU3 (б), ^su/15 О S1V15

радиоавтографы гелей.

a. s

Анализ показал, что в случае ClKCHgN(СН3)pAUGU3 модификации подвергались преимущественно белки S3/S3a, S9, S14/S15. Белки S2, S4, S5, S6, S7 модифицировались в гораздо меньшей степени. Для circHjN(CH-j)pAUG набор белков, подвергавшихся модификации, состоял из S3/S3a, S6, S7, S14/S15, S17. Причем наиболее интенсивно метился белок S14/S15, белки S3/S3a, S7, S17 метились сла-

Сип; и примирю и сопоставимой степени, а белок S6 модифицировался так же незначительно, как в случае с C1RCH2N(CH3)pAUGU3. Из этих данных можно сделать вывод, что белковое окружение кодона AUG с 5'-стороны (т.к. модифицирующая группа била присоединена к 5'-концу аналогов матрицы) зависит от наличия соседнего кодона с 3'-стороны.

3. Исследование аффинной модификации 403 субчастиц 2',3'-бензилиденовыми производными олигорибонуклеотидов, содержащих AUG кодон.

Использованные в настоящей работе о-[4-м-(2-хлорэтил)-ы-метил-аминоЗбензилиденовые производные олигонуклэотидов augc и augu^c приведеш на рис.4. Как и в случае 5'-фосфамидных производных олигорибонуклеотидов, модифицирующая группа на З'-конце не очень значительно влияла на зависимое от тройного комплекса elF-2,gtp,Met-tphk^et связывание этих аналогов матрицы с 40S субчастицами. Уровни связывания aug[32P]pC>CHRCl и AUGU3[32P]pC>CHRCl составляли 2.1 и 0.6, соответственно.

о

Рис.4. Реакционно способные «дедеь»р-э-ац

- " I I

аналоги матрицы с алкилирую- 0 ^

щей группой на 3'-конце - J

2' , 3' -0- [4-И-(2-хлорэтил )-N- и'

-метиламино]- бензилиденовые

I ' з

ПрОИЗВОДНЫе augc и augu^c. -=!,з си2-снг-с1

2.4.1. Ковалентное присоединение бензилиденовых производных AUGUn[32PlpC к 4OS субчастицам.

АФфинную модификацию 40S субчастиц в составе 40S комплексов инициации реагентами aug[32p JpOCHRCl и augu3[32PJpC>CHRCi проводили, инкубируя соответствующие комплексы при 25°с в течение 28 ч (это время соответствует практически полному превращению реагентов в активную промежуточную частицу (Булыгин и др., 1992)). Данные по ковалентному присоединению реакционноспособных аналогов матрицы к 40S субчастицам в присутствии и в отсутствие компонентов тройного комплекса, а также по ингибированию модификации 40S субчастиц избытком немодифишрованного олигорибонук-леотида приведены в табл.3. Из этих данных можно заключить, что модификация 40S субчастиц является специфичной, т.к. в отсутствие тройного комплекса elF-2-gtp*Met-tphk1fet модификация не

наблюдалась, а в присутствии ЕЮ кратного мплмрногч) избытка 1:00т ветствующего немодифицироватюго олпгорибонуклеотида степень модификации 40Б субчастиц уменьшалась в 8 раз случае Аиас>сш?с1, и в 15 раз - в случае Аши3с>снкс1.

Таблица 3.

Аффинная модификация 40Э субчастиц из плаценты человека реагентами Аиои3[32р]рс>снкс1 и Аиси3[згр]рс>снкс1 в 40Б комплексах инициации доэ-аналог мРНК'е1Р-2,СТР,Ме1;-тРНК,!!е^

Реагент Компоненты Ковалентно присоединенный реагент,пмоль

elF- -2 Met-TPHK^etGTP AUGUn на 10 пмоль 40S субчастиц

+ + + + + - 0.87 0.19

AUGpOCHECl + + + + + 0.11 0.00

+ + + + + - 0.15 0.07

AUGU3pC>CHRCl + + 4 . + + 0.01 0.00

Разделение модифицированных 40S субчастиц на фракции рРНК и белков проводили, как описано вше. Данные по распределению радиоактивной метки между I8S рРНК и белками приведены в табл.4. Видно, что в обоих случаях модифицируются рРНК и белки в сопоставимой степени.

Таблица 4.

on

Распределение метки Р между рРНК и белками в 40S суб-

ор

частицах, модифицированных реагентами AUG[ Р]рС>СНЕС1 и

AUGTJ [32P]pOCHRCl.

аналог мРНК Распределение метки 32Р, %

рРНК белки

AUG[32Р]pC>CHRCl 40 60

AUGU-, [ 32Р ]pC>CHRCl 44 56

11ju;ii-riKjHiK<umit участком inr> рнж, модифицируемых оинзили-дццоними ПроИНИОДШМИ AlKiC И AUGU^C.

Идентификации участков I8S рРНК, подвергающихся алкилиро-ванию в составе 40S комплексов инициации реагентами augochrc1 и AUGU^ochrci проводили с помощью блот-гибридизации модифицированной I8S рРНК, несущей метку 32р, с фрагментами рестрикции соответствующей рДНК, как описано выше. Радиоавтограф мембран приведен на рис.5. В результате проведенного анализа было установлено, что основные сайты модификации I8S рРНК реагентом augochrc1 расположены в 3'-концевой части молекулы I8S рРНК внутри двух примыкающих друг к другу фрагментов в положениях I6I0-I747 и 1748-1869. Для AUGU3[32P]pC>CHECl участок модификации был локализован внутри района 593-673.

Как уже упоминалось, данных о функциональном значении отдельных участков I8S рРНК, практически нет, за исключением работ

113 3

402

191

468 428

242

13S 111

95

Рис. 5. Блот-гибридизация по Саузерну фрагментов рестрикции рДНК с I8S рРНК: модифицированной AUG[32P]pC>CHECl (а) и модифицированной AUGU3[32P]pC>CHRCl (б), радиоавтографы.

по аффинной модификации рибосом из плаценты человека, выполненных в нашей лаборатории (Малыгин и др., 1992, Graifer et al., 1990, Булыгин и др., IP92). Для рибосом E.coli имеется достаточно данных, которые могут быть сопоставлены с результатами, описанными в настоящем разделе.

Так, З'-яонцевому фрагменту I6I0-I869 I8S рРНК человека соответствует фрагмент I3I0-J542 в I6S рРНК E.coli. В этой об-

ласти находится основание Cj400> сшивающееся с 5' -антикодоновым основанием ТРНК (Ofengand et al., 1982, Prince et al., 1982), и участок 1394-1399, сшивающийся с синтетической матрицей поли(А) в присутствии родственной TPHKLys (Stiege et al.,. 1988). При аффинной модификации рибосом е.coli реагентом (Up)gU>CHRCl было обнаружено, что один из сайтов модификации I6S рРНК находится на расстоянии примерно IIO нуклеотидов от 3'-конца (Карпова и др., 1981), что соответствует положению 1432 в этой рРНК. Фрагмент 593-673 в I8S рРНК соответствует высококонсервативной области 530-"stem-loop" в I6S рРНК, которая, как предполагается в (Triionov, 1987, Powers and Noller, 1990), вовлечена во взаимодействие с тРНК и/или с мРНК. В этой же области I6S рРНК находится основание А-532, сшивающееся с фото активируемыми аналогами мРНК, несущими остатки тиоуридина (Wollenzien et al., 1991). Более того, имеются данные, позволяющие отнести указанные районы I6S рРНК именно к З'-зоне участка кодон-антикодоновых взаимодействий. Так, ряд нуклеотидных остатков I6S рРНК, расположенных в районе 1400-1500 и в области 530-"stem-loop", защищаются от химической модификации при связывании тРНК в А-сайте рибосом (Moazed and Noller, 1986, Moazed and Noller, 1989). Поэтому, есть все основания полагать, что области I6I0-I869 и 593-673 i8s рРНК, соответствующие вышеуказанным районам I6S рРНК, принимают участие в организации З'-зоны участка кидон-антикодоновых взаимодействий в рибосомах эукариот.

2.4.3. Рибосомные белки, подвергающиеся модификации бензилидено-выми производными олигонуклеотидов в составе 40S комплексов инициации.

Идентификацию белков, модифицированных реагентами AUGOCHEC1 и AUGUjOCHRCl в составе 40S комплексов инициации проводили, как описано выше.

Рис.6. Двумерный гель-электрофорез меченых 1251 рибосомных белков, модифицированных: AUGpOCHRCl (а) И

AUGU3pC>CHRCl (б), радиоавтографы гелей.

П/За S?

S4-

S7 S6

se

314/15

£5/3» «

s?

SB

О S14/11:

Анализ показал, что основной мишенью алкилирования в обоих случаях является белок S14/S15 (см. табл.5, а также рис. 6). Белки S2, S3/S3a, S4, S6, S7, S3 в случае augochrci и белки S3/S3a, S6, S7 в случае augu3c>chrci метились слабее.

2.5. Белковое окружение матрицы в участке кодон-антикодоновых взаимодействий.

В табл. 5 суммированы данные по модификации рибосомных белков в составе 40S комплексов инициации реагентами ClECH2N(CH3)pAUGÜn И AUGÜnC>CHECl.

Белки S3/S3a, S6, S7 и S14/S15 модифицируются как ClECH2N(CH3)pAUGUn, Так И ATJGUnC>CHECl, т.е. модификация этих белков не зависит от точки присоединения реакционноспособной группы к олигонуклеотидному фрагменту. Следовательно, можно предположить, что эти белки формируют непосредственно зону кодон-антикодоновых взаимодействий. Причем белки S6, S7 расположены, по-видимому, ближе к 3'-стороне декодирующего сайта, поскольку их модификация более значительна в случае реагентов с модифицирующей группой на 3'-конце.

Белки S5, S9 и S17 модифицируются только ciBCH2H(CH3)pAUGUn. Следовательно, эти белки могут быть отнесены к 5'-стороне области кодон-антикодоновых взаимодействий. Белки S2 И S4 модифицируются ClRCH2N(CH3)pAUGU3 И AUGOCHRC1, НО ИХ модификация не наблюдается в случае AUGU3C>CHRC1. Следовательно, эти белки расположены примерно одинаково по отношению к 5 ' - и 3'-сторонам кодона AUG. Белок S8 модифицируется только в случае AUGOCHRCI, но не модифицируется CiRCH2N(CH3)pAUGUn и AUGUjOCHRCl. Следовательно, можно предположить, что этот белок расположен вблизи 3'-стороны кодона AUG.

Таблица 5.

Рибосомные белки, подвергающиеся модификации ClRCH2N(CH3)pAUGUn и AUGU OCHRC1 в составе 40S комплексов инициации.

Реагент Белки

ClRCH2N(CH3)pAUG S14/S15> S3/S3a,S6,S7,S17

ClRCH£N(CH3)pAUGU3 S3/S3a,S9.S14/S15 (S2,S4,S5.S6,S7)

AUGOCHRC 1 S14/S15,S2,S3/S3a,S4,S6,S7,S8

AUGILjOCHRCl S14/S15,S3/S3a,S6,S7

На основании полученных данных иш предлагаем модель расположения матрицы в участке кодон-антикодоновых взаимодействий в комплексе инициации 40S•матрица1eIP-2-GTP•Met-TPHK^et (см. рис. 7).

Три основных района I8S рРНК, которые по данным аффинной модификации 40S субчастиц аналогами мРНК принимают участие в организации области кодон-антикодоновых взаимодействий, представлены на схеме тремя отдельными цепями. Белки S3/S3a, S6, ST и S14/S15 играют основную роль во взаимодействии четырехкомпонентного 40S комплекса инициации с мРНК (как следует из модификации этих белков всеми использованными в настоящей работе реагентами). Белки S2, S4, S5, S8, S9 и S17 также вовлечены в это взаимодействие.

Рис.7. Схематическое изображение расположения матрицы в участке кодон-антикодоно-вкх взаимодействий 40S комплекса инициации.

S5 S9 S17

S3/S3a S6

S14/S1E S7

РА

ч

и G

f

и и и С 3

У

в

3'-конец

П

976 1164 1610 1869

593 673

18S рРНК

2.7. Исследование влияния олигонуклеотидных зондов, комплементарных последовательностям I8S рРНК внутри фрагмента 9721061, на зависимое от тройного комплекса eIl'-2,GTP-Met-TPHK^et связывание [32P]pA0G с 40S субчастицами (олигонуклеотидный пробинг).

Для проверки функциональной значимости района 976-1057 I8S рРНК, внутри которого были локализованы основные участки

модификации

реагентами

c1rch2n(ch3)[

32

р]раш и

аффинными

32 ~

ClECHgNiCH-jH P]pAUGO.j, были использованы дезоксирибоолигону-

клеотиш, комплементарные И перекрывающимся последовательностям внутри фрагмента 972-1061 I8S рРНК. На рис. 8 изображена первичная структура района 972-1061 18а рРНК и использованные для

проблнга олигонуклеотиды.

В эксперимента, выполненных в нашей лаборатории, все олигонуклеотиды были проверены на способность связывания с 40S субчастицей. В результате были определены 5 олигонуклеотидов, способных образовывать комплекс с 40S субчастицей. На рис. 8 эти олигонуклеотиды выделены жирным шрифтом.

971 981 991 1001 1011

GACCGGCGCA AGACGGACCA GAGCGAAAGC AUUUGCCAAG AAUGUUUUCA

TGGCCGCGT TCTGCC CTTTCG TAAACGGTT AAGT

6 Т TCTGCCTGGT CTCG 10 AAACGGTTC ТТАСАА

11 TGGT CTCGCTTTCG Т 4 С TTACAAAAGT .5 9

1021 1031 1041 1051 1061

UUAAUCAAGA ACGAAAGUCG GAGGUUCGAA GACGAUCAGA UACCGUCGUA

AATTAGTTCT Т С CTCCAAGCTT CTGC а

3 AGTTCT TGCTTTCAG 7 GCTT CTGCTAGTCT А Т

ААТТ 8 GCTTTCAGC СТССАА 1 18S РРНК

2

Рис. 8. Первичная последовательность района 97I-I06I I8S рРНК и использованные для пробинга олигонуклеотиды.

Специфичность связывания была подтверждена данными экспериментов (выполненных А.А.Малыгиным) по расщеплению I8S рРНК в составе гетеродуплексов I8S рРНК-дезоксирибонуклеотид с помощью РНКазы Н. Можно предположить, что участки I8S рРНК, комплементарные этим олигонуклеотидам, экспонированы на поверхности 40S субчастицы и могут, таким образом, играть непосредственную роль во 'взаимодействии с тройным комплексом или мРНК. В таком случае олигонуклеотид, используемый для пробинга, связавшись в одном из таких участков, будет препятствовать образованию четверного комплекса инициации 40S'eIP-2,GTP*Met-TPHK^et или связыванию аналога матрицы с этим комплексом. Результаты экспериментов по изучению влияния олигонуклеотидов (2,5,6,8,11) на зависимое от присутствия тройного комплекса eIF-2*GTP'Met-TPHK^et связывание аналога матрицы [32Р]рАТО с 40S субчастицами представлены в табл.6.

Видно, что наиболее сильное ингибирование этого связывания наблюдается в присутствии олигонуклеотида 8 (степень связывания составляет 50£ от контрольного уровня). Олигонуклеотид 2 практически не ингибирует связывание [32P]pAUG с 40S субчастицами (степень связывания составляет 98$ от котрольного уровня). Ос-

оо

тальные олигонуклеотиды ингибировали связывание [ Р]рАШ в различной степени в этом интервале значений.

Таблица 6.

Ингибирование зависимого от присутствия тройного комплекса е1Р-2'СТР'Ые1;-тРНК^е1;связываш1Я [32Р]рАШ с 4СВ субчастицами в присутствии олигонуклеотидннх зондов.

Олигонуклеотид Связывание, % от контрольного уровня

2 98

5 58

6 83

8 50

11 74

Таким образом, можно заключить, что последовательности 9721001 и 1025-1039 (см. рис. 8) I8S рРНК, расположенные внутри фрагмента 972-1057, выявленного с помощью аффинной модификации 40S субчастиц аналогами мРНК, вовлечены во взаимодействие с матрицей И/ИЛИ ТРОЙНЫМ комплексом eIF-2'GTP'Met- в процессе инициации трансляции.

ВЫВОДЫ.

I. Изучена аффинная модификация 40S субчастиц рибосом из плаценты человека реакционноспособннми аналогами мРНК 4-[Ы-(2-хлорэтил)- Н-метиламино]бензилметилфосфамидными производными pAUG И pAUGU3 (ClRCHgN(CH3)pAUGUn) И 2',3'-О-[4-(N-2-хлорэтил)-Ы-метиламино]бензилиденовыми производными AUGC и AUGU3C (AUGUnOCHRCl ) в составе модельных комплексов инициации 40S-eIF-2-GTP•Met-TPHK^6t•аналог мРНК.

1). Идентифицированы фрагменты I8S рРНК, внутри которых локализованы сайты ковалентного присоединения аналогов мРНК: фрагмент 976-1164 - для C1RCH2N(CH3)pAUG, 976-1057 - ДЛЯ ClRCHgNfCJLjJpAUGU^ I6I0-I869 - ДЛЯ AUGOCHRC1 И 593-673 - для AUGU3C>CHRC1.

2). Идентифицированы рибосомные белки, подвергающиеся модификации аналогами мРНК. Установлено, что белки S3/S3a, S6, S7 и S14/S15 модифицируются всеми использованными реагентами. Модификация белков S2, S4, S5, S8, S9 и S17

зависит от точки присоединения модифицирующей группы к олигонуклеотидному фрагменту и его длины.

II. На основании данных по аффинной модификации 40S субчастиц аналогами мРНК предложена модель расположения матрицы в участке кодон-антикодоновых взаимодействий в комплексе инициации 40S•еIF-2•GTP•Met-тРНК^е^•аналог мРНК.

III. С использованием пентадекадезоксирибонуклеотидов, комплементарных участкам I8S рРНК внутри фрагмента 976-1057, выявлены последовательности рРНК в составе 40S субчастиц (972-IOOI, 1025-1039), взаимодействующие с матрицей и/или тройным комплексом elP-2'GTP'Met-TPHK^et в процессе инициации.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Мундус Д. А., Малыгин А. А., Зенкова М.А., Репкова М.Н., Вень-яминова А.Г., Смаилов С.К., Ли А.В., Искаков Б.К., Врацких Л.В., Ямковой В.И., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 40S субчастиц из плаценты человека производными pAUG и pAUGU^. // Мо-лекуляр. биология. 1992. Т. 26. Вып. 4. С. 949-956.

2. Karpova G.G., Graifer D.M., Malygin A.A., Mundus D.A., Zen-kova M.A., Mamaev S.Y. Functional topography of human ribosomes as studied by affinity labeling with reactive mENA analogs. // Biochimie. 1992. V. 74. P. 373-380.

3. Мундус Д.A., Булыгин К.H., Веньяминова A.Г., Владимиров С.H., Врацких Л.В., Репкова М.Н., Ямковой В.И., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 40S рибосомных субчастиц из плаценты человека, производными олигонуклеотидов, содержащих кодон AUG. Рибо-сомные белки, формирующие область кодон-антикодоновых взаимодействий. // Молекуляр. биология. 1993. Т. 27. Вып. I. С. 153-9

4. Мундус Д.А., Булыгин К.Н., Веньяминова А.Г., Врацких Л.В., Зенкова М.А., Малыгин А.А., Репкова М.Н., Ямковой В.И., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 40S рибосомных субчастиц из плаценты человека аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов AUGUnC с алкилируицей группой на 3'-конце. У/ Биоорган, химия. 1993. Т. 19. № 3. С. 27-32.

5. Graifer D.M., Malygin А.А., Mundus D.A., 2enkova М.А., Karpova G.G. Deoxyribooligonucleotide probing of human placenta 18S rRNA région in vicinity of the decoding région. // International conférence "The translational apparatus", abstracta.

P. 188,