Молекулярное окружение IRES-элемента РНК вируса гепатита C на 40S субчастице рибосомы человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

□ОЭ4681Б5

На правах рукописи

БАБАИЛОВА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНОЕ ОКРУЖЕНИЕ НЮв-ЭЛЕМЕНТА РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С НА 40в СУБЧАСТИЦЕ РИБОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

.Г

Новосибирск - 2009

003468165

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель: д.х.н., профессор Карпова Галина Георгиевна

Официальные оппоненты: д.х.н. Сергиев Петр Владимирович

д.б.н., доцент Булева Валентина Николаевна

Ведущая организация: ФГУН Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: Новосибирск, 630090, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru Автореферат разослан » ¿¿¿¿М/итт г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент ^ Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус гепатита С (ВГС) является одним из опаснейших патогенов, которым по данным ВОЗ инфицировано более 180 миллионов человек в мире. Этот вирус относится к РНК-содержащим вирусам (род Гепацивирусы семейства флавивирусов). Его геном представлен линейной одноцепочечной РНК (плюс-цепью) длиной около 9600 нт. Одной из ключевых стадий жизненного цикла ВГС в клетках является инициация трансляции геномной РНК, которая происходит по альтернативному кэп-независимому механизму благодаря наличию в ее 5'-нетранслируемой области высокоструктурированного элемента с уникальной вторичной и третичной структурой, так называемого «внутреннего сайта посадки рибосомы» (IRES, от англ. Internal Ribosomal Entry Site) (см., например, Pestova et al 1996). Связываясь с 40S субчастицей рибосомы на первой стадии инициации трансляции вирусной РНК, этот элемент образует 40S инициаторный комплекс, обеспечивая при этом правильное расположение инициаторного кодона на 40S субчастице в отсутствие каких-либо канонических факторов инициации трансляции. Эта уникальная способность IRES-элемента РНК ВГС (IRES ВГС) обусловлена его пространственной структурой. Для понимания молекулярных основ взаимодействий, обеспечивающих формирование 40S инициаторного комплекса, необходима информация о том, какие рибосомные компоненты вовлечены в формирование участка связывания IRES ВГС на 40S субчастице. Несмотря на множество работ, посвященных изучению роли IRES-элемента в инициации трансляции РНК ВГС, такого рода информация на момент начала настоящей работы практически отсутствовала. В последнее время для изучения комплексов рибосом эукариот с различными лигандами интенсивно используют метод криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Однако разрешения, которого пока удается достичь, недостаточно, чтобы выйти на уровень отдельных нуклеотидов РНК, поэтому работы по визуализации IRES ВГС в комплексах с рибосомами с помощью крио-ЭМ дают лишь общее представление о расположении IRES на рибосоме. Детальную информацию о молекулярном окружении отдельных структурных элементов IRES ВГС на 40S субчастице рибосомы можно получить с помощью производных IRES, несущих реакционноспособную группу в определенных функционально значимых участках его вторичной структуры. Подход к получению производных РНК, несущих фотоактивируемые группы в определенных положениях, основан на комплементарно-адресованном алкилировании РНК [4-(1Ч-2-хлорэтил-М-метиламино)бензил] фосфамидными производными олигодезоксирибонуклеотидов. Вначале этот подход был разработан для селективного введения фото активируемых групп в заданные положения тРНК (Венкстерн и др., 1990). Позже было показано, что данный подход может быть применен к более длинным РНК (до 300 нт), обладающим сложной вторичной структурой (Zenkova et al., 1995).

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение структурной организации области связывания IRES ВГС на 40S субчастице рибосомы человека в составе бинарного комплекса, имитирующего

начальную стадию инициации трансляции вирусной РНК, с помощью метода аффинной модификации. Для этой цели использованы производные IRES ВГС, несущие фотоактивируемую перфторарилазидогруппу на определенных нуклеотидах, полученные с помощью комплементарно-адресованной модификации соответствующих РНК-транскриптов алкилирующими производными олигодезоксирибонуклеотидов.

Основными задачами являлись:

• получение ковалентных аддуктов IRES ВГС с олигодезоксирибонуклеотидами, комплементарными его различным последовательностям в доменах II и III, и определение их активности в связывании с 40S субчастицами рибосомы человека;

• получение фотоактивируемых производных IRES ВГС, несущих перфторарилазидогруппу на различных нуклеотидных остатках в составе доменов II и III, и определение их активности в связывании с 40S субчастицами;

• аффинная модификация 40S субчастиц фотоактивируемыми производными IRES ВГС в составе бинарных комплексов и определение рибосомных компонентов, сшивающихся с этими производными.

Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе представлены результаты систематического исследования молекулярного окружения отдельных субдоменов IRES ВГС на 40S субчастице рибосомы человека в составе бинарного комплекса. В рамках данного исследования впервые получены производные IRES ВГС, несущие фотоактивируемую группу в субдоменах IIb, Hid и Ше, а также ковалентные аддукты IRES ВГС с комплементарными олигодезоксирибонуклеотидами, в которых нарушена структура этих субдоменов. Изучена активность полученных ковалентных аддуктов и фотоактивируемых производных IRES ВГС в связывании с 40S субчастицами. Показано, что субдомен ИИ вносит более высокий вклад в это связывание, чем субдомен Ше. Идентифицированы белки, сшивающиеся с фотоактивируемыми производными IRES ВГС. Полученные результаты дают новое, существенно детализированное, представление об организации участка связывания IRES ВГС на 40S субчастице в составе бинарного комплекса, образующегося на начальной стадии инициации трансляции вирусной РНК, показывая ключевую роль рибосомных белков р40, S3a, S5, S14 и S16 в организации этого участка. Эти результаты имеют принципиальное значение для понимания не только природы взаимодействий, лежащих в основе образования 40S инициаторного комплекса на первой стадии инициации трансляции РНК ВГС, но и молекулярных механизмов этого процесса в целом.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «International Conference on Chemical Biology» (Новосибирск, 2005), 3rd International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnology for Medicine" (Новосибирск, 2006), 2-ой международной конференции «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006), международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре (Новосибисрк, 2006),

Российско-французском симпозиуме по супрамолекулярной химии в рамках XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) и ARCUS Workshop "Development of new tools for fundamental research in health and disease" (Страсбург, 2008).

Личный вклад автора. В диссертационную работу включены материалы исследований, выполненных автором лично.

Структура работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы и содержит 4 таблицы и 38 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование роли различных доменов IRES ВГС в связывании с 40S

субчастицей

Для выявления функциональной значимости последовательностей в IRES ВГС использовали подход, основанный на комплементарно-адресованной модификации РНК производными олигодезоксирибонуклеотидов, позволявший вносить изменения в определенные участки пространственной структуры РНК, с последующим анализом активности образующихся ковалентных аддуктов в связывании с 40S субчастицей. Следует отметить, что на момент начала настоящей работы было известно, что субдомены ИИ и Ше играют критическую роль в связывании с 40S субчастицей, а домен II не вносит существенного вклада в это связывание (Kieft et al., 2001). Поэтому для комплементарно-адресованной модификации IRES ВГС использованы производные олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям в районе субдоменов Hid и Ше, а также в домене II, который по данным крио-ЭМ сближен с 40S субчастицей в составе бинарного комплекса (Spahn et al., 2001).

1.1. Критерии выбора олигодезоксирибонуклеотидов для комплементарно-адресованной модификации

Для эффективной модификации РНК производными олигодезоксирибонуклеотидов необходимо, чтобы температура плавления образующегося дуплекса превышала на 20-30°С температуру, при которой протекает реакция. Следовательно, производные олигонуклеотидов, используемые для комплементарно-адресованной модификации, должны быть достаточно длинными (15-20 нуклеотидных звеньев), а участок комплементации в РНК должен содержать как можно больше неспаренных оснований. Более того, желательно, чтобы на 5'-конце олигонуклеотида был остаток С или G, что способствовало бы более жесткой фиксации модифицирующей группы вблизи мишени (Zenkova et al., 1995, Bulygin et al., 1998). При выборе серии олигонуклеотидов можно также заранее учесть, что эти же олигомеры могут выступать в роли вспомогательных олигонуклеотидов для повышения эффективности комплементарно-адресованной модификации за счет увеличения эффективности образования гетеродуплекса (Malygin et al., 1996). С учетом сказанного выше для комплементарно-адресованной модификации IRES ВГС в

районе субдоменов Hid, Ше и IIb были выбраны 6 олигонуклеотидов длиной 1719 нуклеотидов (рис. 1).

1.2. Получение ковалентных аддуктов Р-меченого IRES ВГС с производными олигодезоксирибонуклеотидов

шь

и и и

и А G С

G С G С

сс Gc

A LT

G С.

5—CUCC ACCCCCCCUCCCGGG

4'°

в Сf

¡A UGCCU"~ GGAGGGCCC UGGG^U б CM3¿0

lllf

и-

и

А^Г-CUAAACCUCAAAGAAAAA-3

caUa

** А

С А G С

U А IV

G С

aCG

I />

Алкилирование IRES ВГС производными

олигодезоксирибонуклеотидов 1,2,3,4,5 или 7 (см. рис. 1) (в дальнейшем называемыми производными I, II, III, IV, V или VII соответственно) проводили при 25°С в течение времени, достаточного для практически полного превращения 2-хлорэтиламиногруппы в активную промежуточную частицу -

этилениммониевый катион (Гринева и др., 1977).

Остаток C1RCH2NH2,

присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду олигомера, сшивается, как правило, либо с основанием в РНК, которое образует с ним комплементарную пару, либо с соседним основанием, не участвующим в образовании дуплекса (Zenkova et al., 1995, Bulygin et al., 1998). Сшивка может происходить с любым основанием, занимающим эти положения в РНК, за исключением урацила (см., Карпова, 1987).

1. CACCCTATCAGGCAGTA (287-30.1)

2. СЛЛССССТТТССССЛССС (266-283) —

3. ССЛАСАСТЛСТССССТЛСС (249-267) -

4. СЛОССЛСТЛССЛСАЛСССС (277-295) -

5. ТТГССССЛСССААСАСТЛ (259-276) — 7. CATCGCTACACCCTTTC (71-87)-

Рис. 1. Вторичная структура IRES-элемента РНК ВГС согласно (Honda et al., 1999, Zhao et al., 2001). Приведены последовательности

олигодезоксирибонуклеотидов, использованных в работе. Номера на рисунке соответствуют обозначению олигонуклеотидов и их производных в тексте. В скобках указаны районы IRES ВГС, которым комплементарны выбранные

олигонуклеотиды. Эти олигонуклеотиды схематически показаны разноцветными линиями, концевая алкилирующая группа обозначена кружочком.

Для повышения эффективности модификации IRES ВГС производными IV и V (рис. 1) применяли вспомогательные олигонуклеотиды 5 и 4 соответственно. Одна из реакционных смесей содержала производные II и III одновременно, что приводило к образованию аддуктов, содержащих олигонуклеотид 2 или 3, либо сразу оба олигонуклеотида. Ковалентные аддукты, отделяли от немодифицированной РНК электрофорезом в денатурирующем ПААГ. Как видно из данных, представленных на рис. 2, все производные были способны ковалентно присоединяться к РНК-транскрипту, образуя продукт с меньшей электрофоретической подвижностью, чем исходная РНК. Степень алкилирования IRES ВГС данными производными составляла 0.25-0.6 моль остатков реагента на моль РНК.

Рис. 2. Анализ продуктов

алкилирования IRES ВГС

производными олигонуклеотидов в 6%-ном ПААГ. Дорожки 1-5 и 7 соответствуют ковалентным аддуктам IRES с производными I-V и VII (аддукты I-V и VII соответственно), а дорожка "2+3" - аддуктам, образующимся при алкилировании производными II и III одновременно, при этом продукт, содержащий два олигонуклеотидных остатка, обозначен как аддукт VI. Дорожка "К" - РНК, инкубированная в условиях алкилирования в отсутствие производного олигонуклеотида. Стрелки указывают положение IRES ВГС и его аддуктов.

Для доказательства того, что в аддуктах "сшитый" олигодезоксирибонуклеотид комплементарно связан с РНК, их обрабатывали РНКазой Н, и продукты гидролиза разделяли электрофорезом (рис. 3).

Рис. 3. Анализ районов модификации IRES ВГС в составе ковалентных аддуктов с помощью РНКазы Н. Представлен радиоавтограф 6%-ного ПААГ после электрофоретического разделения продуктов гидролиза. Дорожки 1-5 и 7 соответствуют ковалентным аддуктам I-V и VII, а дорожка "2+3" - адцукту VI (см. рис. 2). Инкубирование аддуктов проводили в присутствии (+) и в отсутствие (-) РНказы Н. Стрелки указывают положение аддуктов и их фрагментов.

Поскольку используемый в работе РНК-транскрипт представляет собой фрагмент РНК ВГС с 40 по 372 нуклеотид, то в присутствии производных I-V и VII РНКаза Н должна гидролизовать его с образованием пар фрагментов длиной

5

ковалентным ^/аддукт VI ковалентные

аддукты ■IRES ВГС

JL i, i- 1 i- Л

Г+ . г~+ Т+. + . + .+

•♦-аддукты |—фрагменты

-фрагменты

приблизительно 247 и 69, 226 и 89, 209 и 105, 237 и 77, 219 и 96, 31 и 285 нт соответственно (см. рис. 1). В случае модификации производными II и III одновременно ожидаемая длина фрагментов составляет 209 и 89 нт. Как можно видеть из рис. 3, в каждом случае наблюдали образование двух продуктов ожидаемой длины, за исключением фрагмента длиной 31 нуклеотид, который, по-видимому, «вышел» из геля в данных условиях электрофореза. Поскольку никаких других (кроме заданных) участков связывания олигонуклеотидов в РНК не обнаружено, можно полагать, что в результате комплементарно-адресованной модификации в структуре РНК возникают лишь локальные изменения, которые происходят в районах "сшивки" с комплементарными олигонуклеотидами. Следовательно, в аддуктах И, III, V и VI должна быть нарушена структура субдомена Hid, в аддукте I - структура субдомена Ше, в аддукте IV должна быть изменена структура обоих этих субдоменов и в аддукте VII - структура субдомена IIb (рис. 1).

I.3. Анализ связывания аддуктов IRES ВГС с 40Sрибосомными субчастицами

Связывание 40S субчастиц рибосом человека с IRES ВГС и его аддуктами проводили в буфере с pH 7.5, содержащем ионы магния (2.5 мМ) и спермидин. Известно, что в этих условиях мРНК, несодержащие IRES-элементов, не связываются с 40S субчастицами в отсутствие факторов инициации трансляции. Как видно из данных, представленных на рис. 4, предельный уровень связывания IRES с 40S субчастицами составляет примерно 25% от общего количества IRES ВГС и практически не отличается от такового для РНК, прошедшей все стадии обработки в отсутствие алкилирующих производных (рис. 4). Кажущаяся константа ассоциации (Ка) составляла примерно (0.6±0.2)х10"7 М"1. В контрольном опыте, где использовали фрагмент мРНК рибосомного белка S26 человека (не содержащей IRES-элемента), связывания с 40S субчастицами практически не наблюдали. В случае ковалентных адцуктов I-VI Ка была гораздо ниже, чем Ка нативного транскрипта (рис. 4). В случае аддукта VII Ка практически не отличалась от Ка немодифицированного транскрипта.

Полученные данные свидетельствуют о том, что субдомен Hid играет важную роль в связывании IRES ВГС с 40S субчастицей. Ковалентные аддукты

II, III и V, в которых структура этого субдомена разрушена "пришитыми" олигонуклеотидами (рис. 1), проявляют очень низкое сродство к 40S субчастице (рис. 4). Степень связывания с 40S субчастицами аддукта I, в котором разрушена структура субдомена Ше, хотя и ниже, чем у немодифицированного IRES ВГС, но заметно выше, чем у аддуктов II, III и V.

Ковалентный аддукт IV обладает наиболее низким сродством к 40S субчастице. Это связано, по-видимому, с тем, что "пришитый" олигонуклеотид разрушает структуру обоих субдоменов, Hid и Ше, и тем самым практически полностью подавляет связывание IRES ВГС с субчастицами. Почти такой же эффект наблюдали в случае аддукта VI, т.е. при одновременном "пришивании" к IRES олигонуклеотидов 2 и 3 , комплементарных субдомену Hid (рис. 1). По-видимому, "сшивание" с двумя олигонуклеотидами изменяло структуру IRES ВГС не только в участке образования гетеродуплекса, но и за его пределами.

Сродство к 40S субчастице аддукта VII, в котором нарушена структура субдомена IIb, практически не отличалось от сродства немодифицированного транскрипта (рис. 4), что в целом согласуется с литературными данными.

Рис. 4. Изотермы связывания IRES ВГС и его ковалентных аддуктов (I—VII) с 40S субчастицами. По оси ординат отложена доля (в %) РНК, связавшейся с субчастицами, а по оси абсцисс - отношение концентраций субчастиц и РНК. Черная линия - изотерма связывания IRES, прошедшего все стадии обработки, синяя -аддукта VII, желтая - аддукта I, зеленая - V, оранжевая - III , коричневая - II, красная -IV, пунктирная - VI. Изотерма связывания IRES, не подвергавшегося какой-либо обработке, обозначена точками в виде крестиков.

Таким образом, как и ожидалось, субдомен IIb не вносит заметного вклада в связывание IRES ВГС с 40S субчастицами, а субдомены Hid и Ше играют ключевую роль в этом связывании. Кроме того, наши результаты указывают на более высокий вклад оснований шпильки Hid по сравнению с вкладом шпильки Ше в связывание IRES ВГС с 40S субчастицами и на то, что наиболее критичным для связывания является нарушение структуры стебля III, которое, по-видимому, влечет изменение структуры основания домена III в целом.

2. Получение и характеризация производных IRES ВГС

2.1. Введение фотоактивируемых групп в определенные положения IRES ВГС

На основании полученных результатов для алкилирования IRES ВГС с последующим введением в него фотоактивируемых групп были использованы 4-[(¡Ч-2-хлорэтил-1М-метш1амино)бензил]-5'-фосфамиды олигонуклеотидов,

комплементарных последовательностям 249-267, 277-295 и 259-276 в субдоменах Ше и Hid, играющих ключевую роль в связывании IRES с 40S субчастицей (производные III, IV и V соответственно), а также последовательностям 71-87 и 61-81 в субдомене IIb (производные VII и VIII соответственно), который не вносит заметного вклада в сродство IRES ВГС к 40S субчастице, но своей апикальной петлей контактирует с ней по данным крио-ЭМ (Spahn et al., 2001) (рис. 5). Как уже упоминалось в разделе 1.2, в некоторых случаях для повышения степени модификации IRES ВГС использовали вспомогательные олигонуклеотиды: в случае производного IV - олигомер, комплементарный последовательности 259-276 (олигонуклеотид 5), а в случае производных V и VIII - олигомеры, комплементарные соответственно последовательностям 277-295 (олигонуклеотид 4) и 84-102 (рис. 5). Для введения фотоактивируемых групп по модифицированным остаткам РНК

%

фосфамидную связь в ковалентных аддуктах, выделенных гель-электрофорезом в денатурирующем ПААГ, гидролизовали в мягких кислотных условиях (при рН 4.1). Это приводило к высвобождению алифатической аминогруппы -КСН2НН2, присоединенной к РНК, при этом алкилированная РНК приобретала такую же подвижность в геле, как и у исходного немодифицированного транскрипта. Алкилированную РНК, выделенную с помощью гель-электрофореза, обрабатывали И-оксисукцинимидным эфиром «-азидотетрафторбензойной кислоты, что приводило к селективному введению фотоактивируемой арилазидогруппы по алифатической аминогруппе (рис. 6).

Рис. 5. Вторичная структура IRES ВГС согласно работам (Honda еу al., 1999, Zhao et al., 2001) (дана общепринятая нумерация шпилек и оснований). Линиями отмечены

последовательности РНК, комплементарные алкилирующим производным

олигодезоксирибонуклеотидов, использованным для комплементарно-адресованной модификации IRES ВГС с последующим введением фотоактивируемых групп. Последовательности,

вспомогательным обозначены точечными Стрелками указаны 5'-концы олигонуклеотидов, к которым присоединены алкилирующие группы. Нуклеотиды РНК, модифицируемые производными

олигонуклеотидов, затемнены.

комплементарные олигонуклеотидам линиями.

GCCUT5. GGAGGGCCCC ^О^и^^б ,G С,

UA^UAMCCUCAAAGAAAAA-3

cAUS

caa

G С

G С ""i

олишнуклсо! пд rq олшхшуклеотнд „ NfjpLI D I I I I I I I м M F : у_ TT7TTTT7TTTP

РНК

РНК

олишнуклсотид

+ RCH,NH,

I

РНК

О Рис. 6. Схема введения фотоактивируемой группы в заданные

положения РНК, основанная на комплементарно-адресованном алкилировании РНК [4-(1Ч-2-хлорэтил-М-

Н)С-Н-СН2СН2- метиламино)бензил]фоефамидными производными

олигодезоксирибонуклеотидов.

2.2. Определение модифицированных нуклеотидов IRES ВГС

Алкилированные нуклеотиды в ковалентных аддуктах IRES ВГС определяли с помощью метода обратной транскрипции. Данные приведены на рис. 7. Метод основан на том, что удлинение меченого праймера на модифицированной РНК прерывается или замедляется, как только растущая цепь кДНК достигает модифицированного нуклеотида. Принято считать, что модифицированный нуклеотид находится с 5'-стороны от нуклеотида, на котором происходит остановка обратной транскрипции. Если так, то остановки обратной транскрипции на нуклеотидах U297 (рис. 7а, дорожка 4), А276 (рис. 7в, дорожка 5), U264 (рис. 7в, дорожка 3), G87 (рис. 76, дорожка 7) и С84 (рис. 7г, дорожка 8) свидетельствуют о том, что модифицированными в IRES ВГС являются нуклеотиды А296, А275, G263, С83 и U86 соответственно (см. также рис. 5). Однако в последнем случае, поскольку урацил не способен алкилироваться в данных условиях (см. выше), модифицированным считали G87, на котором происходила, по-видимому, не остановка, а пауза обратной транскрипции, так как атом N7 гуанина, к которому присоединялся остаток реагента, не участвует в образовании Уотсон-криковских водородных связей . Аналогично дополнительный сигнал на нуклеотиде G263 в случае производного III также отнесен к паузе обратной транскрипции на этом нуклеотиде. В случае этого производного можно было ожидать, что при образовании гетеродуплекса алкилирующая группа будет сближена с остатками G в положениях 265-267, но не с G263, поскольку его олигонуклеотидная часть комплементарна последовательности 249-267 IRES ВГС (рис. 5). Необычное направление модификации в этом случае могло быть связано с особенностями пространственной структуры субдомена IHd IRES ВГС и с тем, что гуанин в составе олигогуаниловых последовательностей РНК может иметь значительно

пониженную реакционную способность по отношению к ароматическим 2-хлорэтиламипам (Власов и др., 1978). ci f)

Рис. 7, Установление нуклеотидов UGCA к 4 UGCA К 7 IRES ВГС, алкилированных

производными олигонуклеотидов. и • ~ Ц S Анализ продуктов обратной

. —— __ - транскрипции ковалентных аддуктов

" - ■ ^ IRES ВГС в присутствии 5'-32Р~

-U297

меченого праимера, комплементарного последовательности 331-350 (а, в) или 103-120 (б, г), с помощью -G87 электрофореза в 8%-ом ПААГ в денатурирующих условиях.

Представлены радиоавтографы гелей. Дорожки U, G, С, А - продукты б 2 секвенирования. Дорожки 3-5 и 7-8 -

UGCA к 5 3 К8 UGCA продукты удлинения праймера на

mm IRES, модифицированном

т^_С'263 * производными III-V и VII—VIII

— ^ соответственно, а дорожка К - на

' _ контрольном РНК-транскрипте,

-А276 _ ~ - прошедшем все стадии обработки в

- отсутствие производного

С84 * • олигонуклеотида. Стрелками указаны

остановки обратной транскрипции на •** основаниях IRES ВГС.

Полученные таким образом производные меченого IRES ВГС, несущие перфторфенилазидогруппы на остатках G263, А296, А275, G87 и С83 (в дальнейшем обозначаемые как РНК III, IV, V, VII и VIII соответственно), использовали в экспериментах по сшивкам с 40S субчастицами рибосом человека. В качестве контроля служила РНК, прошедшая все стадии получения фотоактивируемых производных в отсутствие алкилирующих производных олигодезоксирибонуклеотидов.

2.3. Связывание фотоактивируемых производных IRES ВГС с 40S

субчастицами

Связывание [32Р]-меченых РНК III-V, VII и VIII с 40S рибосомными субчастицами анализировали с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры. Результаты экспериментов по связыванию показали, что введение фотоактивируемых групп в субдомены Ше, Hid и IIb практически не изменяет сродства IRES ВГС к 40S субчастицам (рис. 8, кривые 3-5, 7 и 8) по сравнению со сродством немодифицированной РНК (рис. 8, кривые К). Это означает, что фотоактивируемые производные IRES ВГС являются функционально активным и могут быть использованы для структурно-функциональных исследований рибосом человека.

2 4

[40S],/[PHK]„ [40S],/[PHK],

Рис. 8. Изотермы связывания РНК III—V, VII и VIII (3-5, 7 и 8 соответственно) и РНК К (К) с 40S субчастицами. Относительная ошибка определения не превышала 10%. Исходные концентрации 1RES ВГС и его производных составляла 1.0 х 10"7 М.

3. Определение компонентов 40S субчастицы, сшивающихся с производными 1RES ВГС

3.1. Сшивка производных 1RES BrCc40S субчастицей и анализ модификации

18S рРНК

Для образования сшивок бинарные комплексы РНК III—V, VII и VIII с 40S субчастицами облучали мягким УФ-светом (длина волны >290 нм). Распределение радиоактивной метки между рибосомной РНК и белками анализировали с помощью центрифугирования облученных комплексов в градиенте плотности сахарозы, содержащем SDS и EDTA. Кроме того, для РНК III, V и VIII анализ сшивки с 18S рРНК проводили с помощью электрофореза в агарозном геле, который позволяет разделить такие протяженные РНК, как 18S и 28S рРНК. Оказалось, что ни одно из производных 1RES ВГС не сшивалось с 18S рРНК, о чем судили по отсутствию радиоактивной метки во фракции 18S рРНК после центрифугирования в сахарозном градиенте и в полосе, соответствующей 18S рРНКв агарозном геле (соответствующий радиоавтограф геля и профиль седиментации не приведены).

3.2. Определение белков, сшитых с производными 1RES ВГС в бинарном

комплексе

3.2.1. Особенности идентификации сшитых белков

Белки, сшитые с производными 1RES ВГС, разделяли с помощью одномерного гель-электрофореза в присутствии SDS и двумерного электрофореза в системе, где разделение в первом направлении происходит при рН 8,3, а во втором - при рН 6.75 в присутствии SDS. Остатки 1RES ВГС, ковалентно связанные с белками, предварительно гидролизовали РНКазми А и Т1. При использовании меченых производных модифицированные белки после гидролиза 1RES ВГС РНКазами отделяли от нуклеотидного материала гель-фильтрацией в денатурирующих условиях (6М гуанидин). При идентификации

модифицированных белков радиоавтограф геля накладывали на соответствующий окрашенный гель и определяли положения радиоактивных полос или пятен относительно полос или пятен, соответствующих немодифицированным белкам, положения которых известны (Madjar et al., 1979, Malygin et al., 2000). При сопоставлении радиоавтографов и окрашенных гелей принимали во внимание, что остаток РНК, сшитый с белком, меняет его электрофоретическую подвижность, причем в большей степени он влияет на подвижность белков с меньшей молекулярной массой. В случае одномерного гель-электрофореза это проявляется в том, что на электрофореграмме радиоактивные полосы модифицированных белков оказываются смещенными к старту относительно полос, соответствующих немодифицированным белкам в окрашенном геле. На двумерных электрофореграммах при разделении рибосомных белков в указанной системе (см. выше) пятна модифицированных белков смещены относительно пятен соответствующих немодифицированных белков в основном по горизонтали (влево и чуть вверх). При определении кандидатов на роль модифицированных белков принимали во внимание данные работ (Graifer et al., 2004, Молотков и др., 2007), позволяющие оценить влияние сшитого с белками олигомера на их электрофоретическую подвижность в зависимости от размера сшитого олигонуклеотида, оставшегося после обработки РНКазой. В отдельных случаях идентификацию белков, сшитых с производными IRES ВГС, подтверждали с помощью иммунопреципитации.

3.2.2. Определение белков 40S субчастицы, сшитых с РНК IV и VII

Для идентификации рибосомных белков, сшивающихся с РНК IV и РНК VII, содержащими фотоактивируемую группу на нуклеотидах в субдоменах Ше и IIb соответственно (см. рис. 5), использовано несколько различных подходов. Первый из них основан на применении слабомеченого биотинилированного РНК транскрипта. После облучения комплексов РНК IV, РНК VII или РНК К с 40S субчастицами белки, сшитые с этими РНК, выделяли аффинной хроматографией на авидинагарозе. Для снятия белков с авидинагарозы проводили исчерпывающий гидролиз РНКазой А, и затем белки разделяли одномерным гель-электрофорезом в присутствии SDS с последующим окрашиванием серебром. Результаты приведены на рис. 9. В случае РНК IV видны три полосы, относящиеся к белкам, сшитым с этим производным (дорожка А296, рис. 9), которые были идентифицированы с учетом сказанного в разделе 3.2.1 как белки р40, S2/S3a и S5; соотношение интенсивностей полос, соответствующих сшитым белкам, составляло 1:2:3 (за единицу принимали интенсивность верхней полосы). В случае РНК VII с фотоактивируемой группой в субдомене IIb сшивок с белками не наблюдали. Сшивание РНК IV специфично, поскольку его не наблюдали в контрольном эксперименте (дорожка К). Вместе с тем на рис. 9 можно видеть интенсивно окрашенные полосы в нижней части геля, соответствующие РНКазе А, которая могла маскировать полосы других сшитых белков, таких как S16, S19, S26 или, менее вероятно, S20, S14, S15a и S23.

Для проверки этой возможности белки, сшитые с высокомечеными производными IRES ВГС, анализировали одномерным гель-электрофорезом в

i присутствии SDS с последующим радиоавтографированием. В результате на радиоавтографе геля в случае РНК IV наблюдали четыре основные полосы. Положения трех верхних полос совпадают с таковыми в предыдущем эксперименте (см. выше) и соответствуют сшитым белкам р40, S2/S3a и S5. Нижняя, наиболее интенсивная полоса находится на месте РНКазы А. Кроме того, можно видеть несколько минорных полос, которые не были обнаружены в J экспериментах с биотинилированной РНК, их происхождение до конца неясно. В опытах с РНК VII и контрольной РНК специфических радиоактивных полос, которые можно было бы отнести к модифицированным рибосомным белкам, не

j наблюдали (соответствующие радиоавтографы не приведены).

[

[ К G87 А296 ТР40 ТР40 А296 Рис. 9. Анализ

одномерным гель-

электрофорезом в

присутствии SDS

рибосомных белков 40S субчастицы, сшивающихся с РНК IV и VII. Левая панель соответствует

окрашенному гелю,

полученному в

экспериментах с

биотинилированной РНК: дорожка ТР40 - белки 40S рибосомной субчастицы, дорожки А296, G87 и К - белки, выделенные из облученных комплексов с РНК IV, РНК VII и контрольной РНК соответственно. Правая панель представляет результаты эксперимента с высокомеченой РНК IV: радиоавтограф геля (дорожка А296) и соответствующий окрашенный гель (дорожка ТР40).

Однозначную идентификацию белков, сшитых с РНК IV, которые оказались экранированными РНКазой А при анализе белков, сшитых с биотинилированным производным IRES (рис. 9, левая панель), и белков, соответствующих группе S2/S3a, которые не могут быть разделены с помощью одномерного электрофореза (рис. 9, дорожки ТР40), проводили с помощью двумерного гель-электрофореза (см. разд. 3.2.1). Следует отметить, что использованная система двумерного гель-электрофореза позволяет различить такие белки, как S14, S15a, S16, S19, S20, S23 и S26, которые являются кандидатами в белки, сшивающиеся с РНК IV (см. рис. 9), а также разделить белки S2 и S3a. В то же время идентифицированные с помощью одномерного электрофореза модифицированные белки р 40 и S5 (рис. 9) не могут быть детектированы в этой системе, так как они не входят в гель в первом направлении. Результаты разделения белков 40S субчастиц, сшитых с РНК IV, приведены на рис. 10. Оказалось, что примерно на одном уровне с основным радиоактивным пятном, но немного правее от него, находится единственное окрашенное пятно, соответствующее белкам S13/S16. Пятно белка S25 также находится справа от соответствующего радиоактивного пятна, но расположено

13

р40

заметно ниже. Следовательно, более вероятно, что сшитыми белками являются белки 813/816, а не 825. Кроме того, белок 825 может быть исключен из рассмотрения, так как он не относился к кандидатам, которые могли быть экранированными РНКазой А по данным одномерного гель-электрофореза. По той же причине может быть так же исключен белок 813. Таким образом, основное радиоактивное пятно на радиоавтографе двумерного гель-электрофореза соответствует сшитому белку 816. Минорное радиоактивное пятно в верхней части электрофореграммы, очевидно, соответствует сшитым белкам 83/83а.

Рис. 10. Анализ белков 40S субчастицы, сшитых с РНК IV с помощью 2D гель-электрофореза. (а) Радиоавтограф, (б) Окрашенный гель, положения белков указано в соответствии (Madjar et al., 1979). Положение радиоактивных пятен, соответствующих сшитым белкам, отмечено на окрашенном геле пунктирными контурами. Сшивающиеся белки отмечены звездочкой.

Таким образом, принимая во внимание данные одномерного гель-электрофореза (согласно которым с РНК IV сшиваются белки р40, S2/S3a и S5) и данные двумерного гель-электрофореза (свидетельствующие о модификации белков S3/S3a и S16), было сделано заключение, что РНК IV с перфторарилазидогруппой на А 296 в субдомене lile сшивается с белками р40, S3a, S5 и S16, причем в большей степени с белками S5 и S16.

3.2.3. Определение белков, сшитых с РНК III, V и VIII

Рибосомные белки, модифицированные мечеными РНК III, V и VIII, анализировали одномерным гель-электрофорезом (см. раздел 3.2.1). Результаты анализа приведены на рис. 11. Видно, что РНК III, V и VIII сшиваются в основном с двумя группами белков, которым соответствуют полосы в верхней и средней частях геля. Распределение сшивок между этими группами белков зависело от положения фотоактивируемой группы в IRES ВГС. В случае РНК V сшивка в большей степени происходила с белками, соответствующими верхней полосе, а в случае РНК III и VIII, напротив, с белками, соответствующими нижней полосе. При этом, выход сшивки для РНК VIII был существенно ниже, чем для РНК III и V. Следует отметить, что в дорожке К, соответствующей контролю с немодифицированной РНК, также заметны слабые диффузные радиоактивные полосы, сходные по положению с полосами, наблюдаемыми в

I

S13/16*

т

а

А296

случае производных IRES ВГС. Очевидно, что эти полосы соответствуют неспецифическим комплексам рибосомных белков с мечеными олигорибонуклеотидами - продуктами гидролиза IRES ВГС, оставшимися в ] небольшом количестве во фракции белков после гель-фильтрации (см. выше) и не отделившимися от них даже в условиях гель-электрофореза в присутствии SDS.

Видно, что для РНК III, V и VIII кандидатами на роль модифицированных белков являются одни и те же рибосомные белки. Верхней полосе могут соответствовать модифицированные белки S2, S3a и, менее вероятно, - S6, а ' нижней полосе - белки S14, S16, S19, S23 и S26. Следует отметить, что для РНК III и V наблюдали также слабую полосу в центральной части геля, положение которой относительно белков S9, S7 и S5 в окрашенном геле было точно таким же, как положение полосы, соответствующей модифицированному белку S5 в аналогичных экспериментах с РНК IV (см. раздел 3.2.2). В случае РНК III можно видеть еще одну слабую полосу в верхней части геля, однозначно соответствующую модифицированному белку р 40, сшивку с которым также наблюдали для РНК IV (см. раздел 3.2.2).

Рис. 11. Анализ белков 40S субчастиц, сшитых с ~,2Р- меченым производными IRES ВГС, гель-электрофорезом в присутствии SDS. Дорожки G263, А275, С83 и К - белки, выделенные из облученных комплексов 40S субчастиц с РНК III, РНК V, РНК VII и контрольной РНК соответственно. Радиоавтограф. Дорожка ТР40 - окрашенная Кумасси электрофореграмма суммарного белка 40S субчастиц, на которой указаны положения рибосомных белков.

S16.ST9,S26'C^

Для более точной идентификации белки, сшитые с РНК III, V и VIII, I анализировали двумерным гель-электрофорезом (рис. 12). С учетом всего сказанного в разделе 3.2.1 можно сделать вывод, что с РНК III и РНК V сшивались одни и те же группы белков: S3/S3a (маловероятно - S2), S10/S15/S14 и S13/S16/S25, но распределение сшивок между этими группами для РНК III и V было разным. С РНК VIII сшивались только две группы белков: S10/S15/S14 и S13/S16. В случае контрольной РНК пятен, соответствующих рибосомным белкам, на радиоавтографе не наблюдали.

Сопоставление результатов одномерного и двумерного разделения белков позволило сделать заключение, что сшивка РНК III и V происходила с белками S14, S16 и S3a (см. рис. 12г, где в качестве примера приведена электрофореграмма, полученная в опыте с РНК III, на которой отмечены

о «л т

® « гч

о. <ч «ч х

н < О О

S17.S18.S25,

положения радиоактивных пятен относительно пятен белков в окрашенном геле), а сшивка РНК VIII - с белками S14 и S16.

] -е направление

(а)

А275 S3a*

(б)

S3a* /

Ф

G263

<L> S X

<и

1

аз гз С-

S16*

X

и

ГЧ

S14*

(г)

С83

S3a* S2

\

S14*

/ \ S14/ / \ \ S20 S14* 519 s/5 S13/16 S26

Рис. 12. Анализ белков, сшитых с 32Р- мечеными производными IRES ВГС, с помощью двумерного гель-электрофореза. Панели а, б и в - радиоавтографы гелей после разделения белков, выделенных из 40S субчастиц, модифицированных РНК V (а) и РНК III (б) и РНК VIII (в). Панель (г) - окрашенная электрофореграмма, соответствующая радиоавтографу, представленному на панели (б); положения белков на электрофореграмме указаны в соответствии с (Madjar et al., 1979, Malygin et al., 2000); положения радиоактивных пятен, соответствующих модифицированным белкам, обозначены пунктиром.

Модификацию белков S3a, S14 и S16 подтверждали с помощью иммунопреципитации с использованием антител, специфичных к соответствующим рибосомным белкам млекопитающих. Для этого облученные бинарные комплексы производных IRES ВГС с 40S субчастицами разрушали инкубацией в буфере, содержащем SDS и EDTA, и затем проводили иммунопреципитацию рибосомных белков с помощью протеин-О-сефарозы с иммобилизованными на ней антителами против соответствующих белков. Параллельно в качестве контроля проводили иммунопреципитацию с помощью антител против белков S2 и S3, сшивку с которыми исключили по данным гель-электрофореза. Результаты анализа, представленные на рис. 13, коррелируют с данными одно- и двумерного гель-электрофореза, свидетельствуя о том, что РНК III и V действительно сшивались с белками S3a, S14 и S16, а РНК VIII - с белками S14 и S16.

Рис. 13. Определение белков, сшитых с 12 Р-мечеными РНК III, V или VIII, с помощью иммунопреципитации с использованием антител, специфичных к

определенным рибосомным белкам млекопитающих (указаны на рисунке).

4. Рибосомные компоненты, окружающие IRES ВГС на 40S субчастице

Данные по сшивкам производных IRES ВГС с фотоактивируемыми группами в определенных положениях суммированы в таблице. Эти данные позволяют заключить, что в составе бинарного комплекса IRES ВГС с 40S субчастицами апикальная петля субдомена Ule сближена с белками р40, S3a, S5 и S16; белки S3a и S16 сближены также со стеблем субдомена Hid, расположенным по данным сшивок вблизи белка S14, при этом нуклеотид А275 в субдомене Illd соседствует в большей степени с белками S3a и S14, a G263 - с S14 и S16. Апикальная часть субдомена lib, в частности нуклеотид G82, также сближена с рибосомными белками S14 и S16. Можно видеть, что результаты сшивок с субдоменом lib, который не вносит вклада во взаимодействие IRES ВГС с 40S субчастицей, строго зависят от расположения сшивающей группы в этом субдомене. По всей вероятности, только апикальная петля субдомена lib расположена близко к 40S субчастице в бинарном комплексе.

Таблица. Рибосомные белки, сшивающиеся с производными IRES ВГС в составе

бинарного комплекса.

Нуклеотиды производных IRES ВГС, несущие фотоактивируемую группу (в скобках указаны субдомены, содержащие эти нуклеотиды). Белки 40S субчастицы, сшивающиеся с данными производными*

С83 (IIb) S14 и S16

G87 (IIb) нет

G263 (Illd) S3a, S14 и S16

А275 (Hid) S3a, S14 и S16

A296 (Ше) р40, S3a, S5 и S16

*Примечание. Жирным шрифтом выделены главные мишени сшивки

А275

G263

S2 S3j SM S3 SI 3 16

s: S3a su S3 S]3 1<>

С 83

S2 S3a SM S3 SU l(i

5. Соотнесение полученных данных с данными крио-электронной

микроскопии

Проведено сопоставление результатов по сшивкам производных IRES ВГС, полученных в настоящей работе, с данными крио-ЭМ 40S субчастиц рибосом млекопитающих (Chandramouli et al., 2008) и бинарного комплекса 40S субчастиц с IRES ВГС (Spahn et al, 2001) (рис. 14).

Рис. 14. Структурные модели 40S субчастицы рибосомы млекопитающих и бинарного комплекса 1RES Bn>40S субчастица, полученные с помощью крио-ЭМ, вид с внешней стороны, (а) Структурная модель 40S субчастицы по данным (Chandramouli et al., 2008). 18S рРНК показана синим, а ее сегменты экспансии выделены красным. Консервативные рибосомные белки обозначены зеленым, эукариот-специфичные белки и их предполагаемые a-спирали показаны оранжевыми сферами и цилиндрами. Указано предполагаемое расположение белка S3a, а также нуклеотиды 1RES ВГС, соседствующие с ним по данным настоящей работы, (б) Модель 40S субчастицы (Chandramouli et al., 2008) (номер доступа в PDB 2ZKQ), модифицированная в соответствии с полученными данными. Показано расположение рибосомных белков, сшивающихся с нуклеотидами в субдоменах IHd и Ше и с апикальной частью субдомена IIb (р40 обозначен оранжевым, S5 - фиолетовым, S14 - синим, S16 - красным). Все другие белки, имеющие прокариотические гомологи, выделены зеленым. Белки, специфичные для эукариот, не представлены. Серыми сферами показана 18S рРНК. (в) Модель бинарного комплекса 1RES ВГС с 40S субчастицей, полученная с помощью крио-ЭМ (Spahn et al., 2001). Плотность, соответствующая 40S субчастице, показана желтым, дополнительная плотность, соответствующая 1RES ВГС, - сиреневым. Предположительное расположение субдоменов IIIe/d выделено квадратной рамкой.

Можно видеть, что все сшивающиеся белки расположены с внешней стороны головы 408 субчастицы в ее части, противоположной клюву, вокруг углубления между головой и телом. Соответствующий район 308 субчастицы рибосомы Ткегтш ЛегторкИия перекрывается с Е-участком и расположен вблизи участка выхода мРНК из рибосомы (Уияироуа е1 а1., 2001). Действительно

в набор белков, сшивающихся с производными IRES ВГС, входят белки S5 и S14, которые, как известно, в рибосоме человека контактируют с кодоном мРНК в Е-участкеис фрагментом мРНКс 5'-стороны от этого кодона (Grifer et al., 2004, Pisarev et al., 2008).

Можно отметить только одно существенное расхождение между данными по сшивкам и результатами крио-ЭМ. Так, согласно данным настоящей работы, белок S5 соседствует с доменом Ше, тогда как по данным крио-ЭМ этот белок сближен скорее с доменом II (Spahn et al., 2001). Следует отметить, что отсутствие сшивок не всегда говорит об отсутствии взаимодействия. Вполне возможно, что в участке белка S5, который был сближен с фотоактивируемой группой на нуклеотидах G87 и С 83 в субдомене lib, отсутствовали подходящие для сшивки мишени. Кроме того, сшивающая группа на этих нуклеотидах могла быть ориентированна «в раствор» (т. е. в сторону от белка S5). Следовательно, результаты настоящей работы не исключают возможного взаимодействия белка S5 с доменом II IRES ВГС.

Один из белков, окружающих IRES ВГС в бинарном комплексе с 40S субчастицами по данным сшивок, а именно, белок S3a, не имеет гомологов среди белков малой субчастицы прокариот и поэтому не картирован на крио-ЭМ структуре 40S субчастицы. Разумно предположить, что этот белок расположен в том же районе 40S субчастицы, что и белки р40, S5, S14 и S16. Так, на карте крио-ЭМ реконструкции 40S субчастицы млекопитающих вблизи белков S14, S5 и р40 можно видеть плотность, соответствующую эукариот-специфичным белкам (Chandramouli et al., 2008) (рис. 14а). Действительно, по данным иммуноэлектронной микроскопии (Lutch et al., 1990) белок S3a находится вблизи белка S14 на выступе платформы 40S субчастицы преимущественно с внешней стороны.

Таким образом, результаты настоящей работы дают новое представление о молекулярном окружении субдоменов Hid и Ше, главных детерминант связывания IRES ВГС с 40S субчастицей, и апикальной петли субдомена ПЬ, который не вносит существенного вклада в это связывание, показывая, что ключевую роль в организации участка связывания IRES ВГС на 40S субчастице играют рибосомные белки р40, S3a, S5, S14 и S16.

ВЫВОДЫ

1. Получены ковалентные аддукты фрагмента РНК вируса гепатита С (ВГС), соответствующего ее внутреннему сайту посадки рибосомы (IRES, от англ. Internal Ribosomal Entry Site), с олигодезоксирибонуклеотидами, комплементарными его различным последовательностям в доменах II и III, и определена их активность в связывании с 40S субчастицами рибосомы человека. Показано, что субдомены Hid и Ше ответственны за связывание IRES ВГС с 40S субчастицами, но наиболее высокий вклад в это связывание вносит стебель домена III, поддерживающий структуру основания домена в целом. Субдомен ПЬ, напротив, не вносит заметного вклада в связывание IRES ВГС с 40S субчастицей.

2. Получены фотоактивируемые производные IRES ВГС, несущие перфторарилазидогруппу на нуклеотидных остатках G87 или С83 в субдомене IIb, G263 или А275 в стебле субдомена Hid или А296 в петле субдомена Ше, и определена их активность в связывании с 40S субчастицами. Показано, что введение перфторарилазидогруппы в какое-либо из указанных положений не влияет на способность IRES ВГС связываться с 40S субчастицей.

3. Проведена аффинная модификация 40S субчастиц фотоактивируемыми производными IRES ВГС в составе бинарных комплексов, и определены рибосомные компоненты, сшивающиеся с этими производными. Установлена ключевая роль рибосомных белков в организации участка связывания IRES ВГС на 40S субчастице. Показано, что стебель субдомена Hid соседствует с рибосомными белками S3a, S14 и S16, петля субдомена Ше - с р40, S3a, S5 и S16, а апикальная петля субдомена IIb - с S14 и S16.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Малыгин А. А., Грайфер Д. М„ Лалетина Е. С., Шатский И. Н., Карпова Г. Г. Подход к выявлению функционально важных участков РНК, основанный на комплементарно-адресованной модификации // Молекуляр. биология. -2003. -Т. 37. -С. 1027-1034.

2. Лалетина Е. С.. Грайфер Д. М., Малыгин А. А., Шатский И. Н., Карпова Г. Г. Молекулярное окружение петли субдомена Ше IRES-элемента РНК вируса гепатита С на 40S субчастице рибосомы человека // Биоорган, химия. -2006. -Т. 32.-С. 311-319.

3. Laietina Е„ Graifer D., Malygin A., Ivanov A., Shatsky I., Karpova G. Proteins surrounding hairpin lile of the hepatitis С virus internal ribosome entry site on the human 40S ribosomal subunit // Nucleic Acids Res. -2006. -V. 34. -P. 2027-2036.

4. Бабайлова E. С., Грайфер Д. M., Малыгин A. А., Шатский И. H„ Шталь И., Карпова Г. Г. Молекулярное окружение субдомена Hid IRES-элемента РНК вируса гепатита С на 40S субчастице рибосомы человека И Биоорган, химия. -2009.-Т. 35.-С. 103-112.

5. Babaylova Е„ Graifer D„ Malygin A., Stahl J., Shatsky I., Karpova G. Positioning of subdomain Hid and apical loop of domain II of the hepatitis С IRES on the human 40S ribosome // Nucleic Acids Res. -2009. -V. 37. -P. 1141-1151.

Подписано к печати «10» марта 2009 г. Формат бумаги 60x84, 1/16. Тираж 100 экз. Заказ № 0310 Отпечатано ООО «Нонпарель», 630090, Новосибирск, ул. Институтская 4/1, тел 330-26-98

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ПРИНЯТЫЕ

СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Молекулярные основы взаимодействий, обеспечивающих инициацию трансляции РНК вируса гепатита С (Обзор литературы).

1.1. Структура IRES.

1.1.1. Структура домена II.

1.1.2. Структура домена III.

1.1.3. Структура соединения Illabc.

1.2. Стадии IRES-зависимой инициации трансляции РНК ВГС и факторы необходимые для этого процесса.

1.2.1. Образование бинарного комплекса.

1.2.2. Образование 48S инициаторного комплекса.

1.2.3. Образование 80S инициаторного комплекса.

1.3. Альтернативный способ IRES зависимой инициации трансляции у ВГС.

1.4. Функциональная роль доменов IRES ВГС в инициации трансляции.

1.4.1. Функциональная роль домена III.

1.4.1.1. Влияние мутаций в IRES ВГС на эффективность ингщиации трансляции.

1.4.1.2. Участие домена III в связывании IRES ВГС с 40S субчастицей.

1.4.1.3. Участие домена III IRES ВГС в его связывании с eIF3.

1.4.1.4. Участие домена III IRES в формировании 48S и 80S комплексов инициаци.

1.4.2. Функциональная роль домена II.

1.4.2.1. Участие домена II в высвобождении фактора eIF

1.4.2.2. Влияние структуры домена II на функционирование IRES ВГС.

1.4.2.3. Взаимосвязь домена II ирибосомного белка S5.

1.4.3. Функциональная роль других районов.

1.5. Структура комплексов инициации IRES ВГС по данным крио-ЭМ и сшивок.

1.5.¡.Взаимодействие IRES с 40S субчастицей рибосомы.

1.5.2.Комплекс IRES ВГС с фактором инициации eIF3.

1.5.3. Структурная модель IRES*40S*eIF3 комплекса.

1.5.4. SOS-инициаторный комплекс.

1.5.4.1. Конформационные перестройки 40S субчастиц, вызванные связыванием IRES ВГС с 80S рибосомой.

1.5.4.2. Структура IRES ВГС в SOS-комплексе.

1.5.4.3. Контакты IRES ВГС в SOS-комплексе.

1.6. Дополнительные факторы, влияющие на эффективность трансляции мРНК вируса гепатита С.

Вирус гепатита С является одним из опаснейших патогенов, которым по данным Всемирной Организации Здравоохранения инфицировано более 180 миллионов человек в мире [1]. Инфекция, вызванная вирусом гепатита С, в клинически выраженных случаях характеризуется симптомами острого поражения печени, которое в большинстве случаев заканчивается развитием хронического гепатита с возможным переходом в цирроз и первичный рак печени.

Вирус гепатита С (ВГС) относится к РНК-содержащим вирусам (род Гепацивирусы семейства флавивирусов). Его геном представлен линейной одноцепочечной РНК (плюс-цепью) длиной около 9600 нуклеотидов. Одной из ключевых стадий жизненного цикла вируса гепатита С в клетках является инициация трансляция геномной РНК, которая происходит по альтернативному кэп-независимому механизму благодаря наличию в ее 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) высокоструктурированного элемента с уникальной вторичной и третичной структурой, так называемого «внутреннего сайта посадки рибосомы» (1RES, от англ. Internal Ribosomal Entry Site) [2, 3].

Последовательность событий, происходящих при инициации трансляции РНК ВГС, известна. Функциональная роль отдельных субдоменов 1RES ВГС также хорошо изучена (см., например, [4]). В соответствии с общепринятой гипотезой 1RES ВГС, связываясь с 40S субчастицей рибосомы, на первой стадии инициации трансляции образует 40S инициаторный комплекс, обеспечивая при этом правильное расположение инициаторного кодона на 40S субчастице в отсутствие каких-либо факторов инициации трансляции. Известно, что для формирования этого комплекса критичными элементами в 1RES ВГС являются субдомены Hid и Ше и соединение ШаЬс. Однако структурная организация участка связывания 1RES ВГС на 40S субчастице изучена меньше, чем функциональная роль его доменов. Работы по прямым УФ-индуцируемым сшивкам показали, что в составе комплекса с 40S субчастицей 1RES ВГС сшивается с единственным рибосомным белком, который был идентифицирован вначале как S9 [3, 5], а в последствии - как S5. При использовании 1RES ВГС со статистически распределенными остатками тиоуридина наблюдали сшивки с белками S2, S3, S10, S15, S16/SI8 и S27 [6]. Таким образом, результаты этих работ позволяют судить об окружении на 40S субчастице 5'-концевого участка РНК ВГС в целом, но не обеспечивают информацией, касающейся окружения отдельных структурных элементов 1RES ВГС. Основываясь на данных по сшивкам и принимая во внимание тот факт, что 40S субчастицы низших эукариот не способны связывать 1RES ВГС, авторы [6] выдвинули гипотезу о том, что в формирование участка связывания 1RES ВГС на 40S субчастице вовлечены специфичные для высших эукариот фрагменты рибосомных белков, а не 18S рРНК. В последнее время для изучения комплексов рибосом эукариот с различными лигандами интенсивно используют метод криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) [7-9]. Однако разрешения, которого пока удается достичь, недостаточно, чтобы выйти на уровень отдельных нуклеотидов РНК, поэтому работы по визуализации 1RES ВГС в комплексах с рибосомами с помощью крио-ЭМ дают лишь общее представление о расположении 1RES на рибосоме. Таким образом, данные об окружении отдельных структурных элементов 1RES ВГС на 40S субчастице рибосомы, которые необходимы для понимания молекулярных основ взаимодействий, обеспечивающих формирование бинарного комплекса на первой стадии инициации трансляции вирусной РНК, до последнего времени отсутствовали.

Целью настоящей работы являлось изучение структурной организации области связывания 1RES ВГС на 40S субчастице рибосомы человека в составе бинарного комплекса, имитирующего начальную стадию инициации трансляции вирусной РНК, с помощью метода аффинной модификации. Для этой цели использованы производные 1RES ВГС, несущие фотоактивируемую перфторарилазидогруппу на определенных нуклеотидах, полученные е помощью комплементарно-адресованной модификации соответствующих РНК-транскриптов алкилирующими производными олигодезоксирибонуклеотидов.

Основными задачами являлись:

• получение ковалентных аддуктов 1RES ВГС с олигодезоксирибонуклеотидами, комплементарными его различным последовательностям в доменах II и III, и определение их активности в связывании с 40S субчастицами рибосомы человека;

• получение фотоактивируемых производных 1RES ВГС, несущих перфторарилазидогруппу на различных нуклеотидных остатках в составе доменов II и III, и определение их активности в связывании с 40S субчастицами.

• аффинная модификация 40S субчастиц фотоактивируемыми производными 1RES ВГС в составе бинарных комплексов и определение рибосомных компонентов, сшивающихся с этими производными.

выводы

1. Получены ковалентные аддукты фрагмента РНК вируса гепатита С (ВГС), соответствующего ее внутреннему сайту посадки рибосомы (IRES, от англ. Internal Ribosomal Entry Site), с олигодезоксирибонуклеотидами, комплементарными его различным последовательностям в доменах II и III, и определена их активность в связывании с 40S субчастицами рибосомы человека. Показано, что субдомены Illd и Ше ответственны за связывание IRES ВГС с 40S субчастицами, но наиболее высокий вклад в это связывание вносит стебель домена III, поддерживающий структуру основания домена в целом. Субдомен IIb, напротив, не вносит заметного вклада в связывание IRES ВГС с 40S субчастицей.

2. Получены фотоактивируемые производные IRES ВГС, несущие перфторарилазидогруппу на нуклеотидных остатках G87 или С83 в субдомене IIb, G263 или А275 в стебле субдомена Illd или А296 в петле субдомена Ше, и определена их активность в связывании с 40S субчастицами. Показано, что введение перфторарилазидогруппы в какое-либо из указанных положений не влияет на способность IRES ВГС связываться с 40S субчастицей.

3. Проведена аффинная модификация 40S субчастиц фотоактивируемыми производными IRES ВГС в составе бинарных комплексов, и определены рибосомные компоненты, сшивающиеся с этими производными. Установлена ключевая роль рибосомных белков в организации участка связывания IRES ВГС на 40S субчастице. Показано, что стебель субдомена Illd соседствует с рибосомными белками S3a, S14 и S16, петля субдомена Ше - с р40, S3a, S5 и S16, а апикальная петля субдомена IIb - с S14 и S16.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты настоящей работы позволяют заключить, что субдомены Ше и Hid 1RES ВГС играют критическую роль в его связывании с 40S субчастицей на первой стадии инициации трансляции вирусной РНК, при этом вклад субдомена Hid в это связывание заметно выше, чем субдомена Ше. Подход, использованный для анализа функциональной роли доменов 1RES, может служить альтернативой методу делеционного анализа. Однако в отличие от этого метода, он позволяет получать также информацию о доступности заданных районов РНК для связывания с комплементарными олигонуклеотидами. Это является особенно важным для поиска in vitro антисмысловых олигонуклеотидов, специфически подавляющих биологическую активность каких-либо РНК.

Полученные в настоящей работе данные дают новое существенно детализированное представление об организации участка связывания 1RES ВГС на 40S субчастице в составе бинарного комплекса, образующегося на начальной стадии инициации трансляции вирусной РНК, показывая ключевую роль рибосомных белков S3a, S5, S15, S16 и р40 в организации этого участка. Участки связывания различных IRES-элементов на 40S субчастице могут существенно различаться. Например, в отличие от 1RES ВГС, 1RES вируса паралича сверчка (CrPV) расположен полностью в мРНК-связывающем канале, простираясь в А- и Р-участки [193]. Тем не менее, участки связывания обоих 1RES содержат одинаковые элементы. Так, и 1RES ВГС, и 1RES CrPV соседствует с белком S5 и, кроме того, 1RES CrPV расположен близко к белку S16, как можно видеть из моделей представленных в работах [7, 8, 193]. Разумно было бы предположить, что эти белки играют ключевую роль в формировании участка связывания на 40S субчастице не только для 1RES ВГС, но также и для других типов IRES-элементов. Однако это утверждение пока нельзя распространить на последующие стадии инициации трансляции вирусных РНК, так как, например, в работе [9] показано близкое соседство 1RES ВГС со спиралями 18S рРНК.

1. http://www.who.int/immunization/topics/hepatitisc/en/index.html

2. Tsukiyama-Kohara K., Iizuka N., Kohara M., Nomoto A. Internal ribosome entry site withinhepatitis C virus RNA // J. Virol. 1992. Vol. 66. P. 1476-1483.

3. Fraser C.S., Doudna J.A. Structural and mechanistic insight into hepatitis C viral translationinitiation // Nat. Rev. Microbiol. 2006. Vol. 5. P. 29-38.

4. Fukushi S., Okada M., Stahl J., Kageyama T., Hoshino F.B., Katayama K. Ribosomal protein

5. S5 interacts with the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus //J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 20824-20826.

6. Otto G.A., Lukavsky P.J., Lancaster A.M., Sarnow P., Puglisi J.D. Ribosomal proteins mediatethe hepatitis C virus IRES-HeLa 40S interaction // RNA. 2002. Vol. 8. P. 913-923.

7. Chandramouli P., TopfM., Menetret J. F., Eswar N., Cannone J.J., Gutell R.R., SaliA., Akey,o

8. C.W. Structure of the mammalian 80S ribosome at 8.7 A resolution // Structure. 2008. Vol. 16. P. 535-548.

9. Spahn C.M.T., Kieft J.S., Grassucci R.A., Penczek P.A., Zhou K., Doudna J.A. Frank J.

10. Hepatitis C virus IRES RNA-induced changes in the conformation of the 40S ribosomal subunit//Science. 2001. Vol. 291. P. 1959-1962.

11. Boehringer D., Thermann R., Ostareck-Lederer A., Lewis J.D., Stark H. Structure of thehepatitis C virus IRES bound to the human 80S ribosome: remodeling of the HCV IRES // Structure. 2005. Vol. 13. P. 1695-1706.

12. Kozak M. The scanning model for translation: an updaate // J. Cell Biol. 1989. Vol. 18. P. 3078-3093.

13. Merrick W.C. Cap-dependent and cap-independent translation in eukaryotic systems // Gene. 2004. Vol.332. P. 1-11.

14. Pelletier J., Sonenberg N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA // Nature. 1988. Vol. 334. P. 320-325.

15. Hellen C.U., Sarnow P. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules // Genes Dev. 2001. Vol.15. P. 1593-1612.

16. Скулачев M.B. Внутренняя инициация трансляции разнообразие механизмов и возможная роль в жизнедеятельности клетки // Усп. биол. химии. 2005. Т. 45. С. 123172.

17. Pisarev А.V., Shirokikh N.E., Hellen C.U.T. Translation initiation by factor-independent binding of eukaryotic ribosomes to internal ribosomal entry sites // Biologies. 2005. Vol. 328. P. 589-605.

18. Rosenberg S. Recent advances in the molecular biology of hepatitis С virus // J. Mol. Biol. 2001. Vol. 313. P. 451-464.

19. Rijnbrand R., Bredenbeek P., Straaten Т., Whetter L„ Inchausp G., Lemon S., Spaan W. Almost the entire 5' non-translated region of hepatitis С virus is required for cap-independent translation //FEBS Letters. 1995. Vol. 365. P. 115-119.

20. Reynolds J.E., Kaminski A., Kettinen H.J., Grace K., Clarke B.E., Carroll A.R., Rowlands D.J., Jackson R.J. Unique features of internal initiation of hepatitis С virus RNA translation // EMBO J. 1995. Vol.14. P. 6010-6020.

21. Fukushi S., Katayama K., Kurihara C., Ishiyama N., Hoshiono F.B., Ando Т., Oya A. Complete 5' noncoding region is necessary for the efficient internal initiation of hepatitis С virus RNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol. 199. P. 425-432.

22. Honda M., Ping L.H., Rijnbrand R.C., Amphlett E., Clarke В., Rowlands D., Lemon S.M. Structural requirements for initiation of translation by internal ribosome entry within genome-length hepatitis С virus RNA // Virology. 1996. Vol. 222. P. 31-42.

23. Pawlotsky J.-M. Hepatitis С virus genetic variability: pathogenic and clinical implications // Clin. Liver Dis. 2003. Vol. 7. P. 45-66.

24. Simmonds P. Variability of hepatitis C virus // Hepatology. 1995. Vol. 21. P. 570-583.

25. Rijnbrand R., Abell G., Lemon S., Spaan W. Mutational analysis of the GB virus B internal ribosome entry site // J. Virol. 2000. Vol. 74 P. 773-783.

26. Brown E.A., Zhang H., Ping L.-H., Lemon S.M. Secondary structure of the 5' nontranslated regions of hepatitis C virus and pestivirus genomic RNAs // Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. P. 5041-5045.

27. Wang C., Le S.-Y., Ali N., Siddiqui A. An RNA pseudoknot is an essential structural element of the internal ribosome entry site located within the hepatitis C virus 5' noncoding region // RNA. 1995. Vol. 1. P. 526-537.

28. Wang C., Sarnow P., Siddiqui A. A Conserved helical element is essential for internal initiation of translation of hepatitis C virus RNA //J. Virol. 1994. Vol. 68. P. 7301-7307.

29. Zhao W.D., Wimmer E. Genetic analysis of a poliovirus/hepatitis C virus chimera: new structure for domain II of the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus // J. Virol. 2001. Vol. 75. P. 3719-3730.

30. Kieft J.S., Kaihong K, Jubin R., Murray M.G., Lau J.Y.N., Doudna J.A. The hepatitis C virus internal ribosome entry site adopts an ion-dependent tertiary fold // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 292. P. 513-529.

31. Hellen C.U., Pestova T.V. Translation of hepatitis C virus RNA // J. Viral Hepat. 1999. Vol. 6. P. 79-87.

32. Beales L.P., Rowlands D.J., Holzenburg A. The internal ribosome entry site (IRES) of hepatitis C virus visualized by electron microscopy // RNA. 2001. Vol. 7. P. 661-670.

33. Kim /., Lukavsky P.J., Puglisi J.D. NMR Study of 100 kDa HCV IRES RNA using segmental isotope labeling // J. Am. Chem. Soc. 2002. Vol. 124. P. 9338-9339.

34. Lukavsky P. J., Kim I., Otto G.A., Puglisi J.D. Structure of HCV IRES domain II determined by NMR // Nat. Struct. Biol. 2003. Vol. 10. P. 1033-1038.

35. Zhao O., Han Q., Kissinger C.R., Hermanna T., Thompson P.A. Structure of hepatitis C virus IRES subdomain Ila // Acta Cryst. 2008. Vol. 64. P. 436-443.

36. Dibrov S.M., Johnston-Cox II., Weng Y.-H., Hermann T. Functional architecture of HCV IRES domain II stabilized by divalent metal ions in the crystal and in solution // Angew. Chem. Int. Ed. 2007. Vol. 46. P. 226-229.

37. Wadley L.M., Pyle A.M. The identification of novel RNA structural motifs using COMPADRES: an automated approach to structural discovery // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32. P. 6650-6659.

38. Lyons A.J., Lytle J.R., Gomez J., Robertson H.D. Hepatitis C virus internal ribosome entry site RNA contains a tertiary structural element in a functional domain of stem-loop II // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29. P. 2535-2541.

39. Draper D.E. A guide to ions and RNA structure // RNA. 2004. Vol. 10 P. 335-43.

40. Correll C.C., Munishkin A., Chan Y.L., Ren Z, Wool I.G., Steitz T.A. Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 13436-13441.

41. Leontis N.B., WesthofE. A common motif organizes the structure of multi-helix loops in 16 S and 23 S ribosomal RNAs // J. Mol. Biol. 1998. Vol. 283. P. 571-583.

42. Szewczak A.A., Moore P.B., Chan Y.-L., Wool I.G. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 9581-9585.

43. Lukavsky P. J., Otto G.A., Lancaster A.M., Sarnow P., Puglisi J.D. Structures of two RNA domains essential for hepatitis C virus internal ribosome entry site function // Nat. Struct. Biol. 2000. Vol. 7. P. 1105-1110.

44. Heus H.A., Pardi A. Structural features that give rise to the unusual stability of RNA hairpins containing GNRA loops // Science. 1991.Vol. 253. P. 191-194.

45. Puglisi E.V., Puglisi J.D. HIV-1 A-rich RNA loop mimics the tRNA anticodon structure // Nat Struct Biol. 1998. Vol. 5. P. 1033-1036.

46. KlinckR., WesthofE., Walker S., Afshar M„ Collier A., Aboul-Ela F. A potential RNA drug target in the hepatitis C virus internal ribosomal entry site // RNA. 2000. Vol. 6. P. 423-431.

47. Dallas A., Moore P.B. The loop E-loop D region of Escherichia coli 5S rRNA: the solution structure reveals an unusual loop that may be important for binding ribosomal proteins II Structure. 1997. Vol. 5. P. 1639-1653.

48. Moore P.B. Structural motifs in RNA // Annu. Rev. Biochem. 1999. Vol. 68. P. 287-300.

49. Collier A.J., Gallego Klinck R., Cole P.T., Harris S.J., Harrison G.P., Aboul-Ela F., Varani G., Walker S. A conserved RNA structure within the HCV IRES eIF3-binding site // Nat. Struct. Biol. 2002. Vol. 9. P. 375-380.

50. Rijnbrand R., Thiviyanathan V., Kaluarachchi K., Lemon S.M., Gorenstein D.G. Mutational and structural analysis of stem-loop IIIC of the hepatitis C virus and GB virus B internal ribosome entry sites // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 343. P. 805-817.

51. Duckett D.R., Murchie A.I., Lilley DM. The global folding of four-way helical junctions in RNA, including that in U1 snRNA // Cell. 1995. Vol. 83. P. 1027-1036.

52. Wilson T.J., Nahas M„ Araki L., Harusawa S., Ha T., Lilley D.M. RNA folding and the origins of catalytic activity in the hairpin ribozyme // Blood Cells Mol. Dis. 2007. Vol. 38. P. 8-14.

53. Kieft J.S., Zhou K., Grech A., Jubin R., Doudna J.A. Crystal structure of an RNA tertiary domain essential to HCV IRES-mediated translation initiation // Nat. Struct. Biol. 2002.Vol. 9. P. 370-374.

54. Andreev D., Hauryliuk V., Terenin I., Dmitriev S., Ehrenberg M., Shatsky I. The bacterial toxin RelE induces specific mRNA cleavage in the A site of the eukaryote ribosome // RNA. 2008. Vol. 14. P. 233-239.

55. Reynolds J.E., Kaminski A., Carroll A.R., Clarke B.E., Rowlands D.J., Jackson R.J. Internal initiation of translation of hepatitis C virus RNA: the ribosome entry site is at the authentic initiation codon // RNA. 1996. Vol. 2. P. 867-878.

56. Rijnbrand R.C., Abbink T.E., Haasnoot P.C., Spaan W.J., Bredenbeek P.J. The influence of AUG codons in the hepatitis C virus 5' nontranslated region on translation and mapping of the translation initiation window // Virology. 1996. Vol. 226. P. 47-56.

57. Wang C., Sarnow P., Siddiqui A. Translation of human hepatitis C virus RNA in cultured cells is mediated by an internal ribosome-binding mechanism // J. Virol. 1993. Vol. 67. P. 3338-3344.

58. Honda M., Brown E.A., Lemon S.M. Stability of a stem-loop involving the initiator AUG controls the efficiency of internal initiation of translation on hepatitis C virus RNA // RNA. 1996. Vol. 2. P. 955-968.

59. Rijnbrand R., Bredenbeek P.J., Haasnoot P.C., Kieft J.S., Spaan W.J., Lemon S.M. The influence of downstream protein-coding sequence on internal ribosome entry on hepatitis C virus and other flavivirus RNAs // RNA. 2001. Vol. 7. P. 585-597.

60. Otto G.A., Puglisi J.D. The pathway of HCV IRES-mediated translation initiation // Cell. 2004. Vol. 119. P. 369-380.

61. Goss D.J., Rounds D.J. A kinetic light-scattering study of the binding of wheat germ protein synthesis initiation factor 3 to 40S ribosomal subunits and 80S ribosomes // Biochemistry. 1988. Vol. 27. P. 3610-3613.

62. Sundkvist I.C., Staehelin T. Structure and function of free 40 S ribosome subunits: Characterization of initiation factors // J. Mol. Biol. 1975. Vol. 99. P. 401-418.

63. Kolupaeva V.G., Unbehaun A., Lomakin I.B., Hellen C.U., Pestova T.V. Binding of eukaryotic initiation factor 3 to ribosomal 40S subunits and its role in ribosomal dissociation and anti-association // RNA. 2005. Vol. 11. P. 470-486.

64. Pestova T.V., Borukhov S.I., Hellen C.U. Eukaryotic ribosomes require initiation factors 1 and 1A to locate initiation codons //Nature. 1998. Vol. 394. P. 854-859.

65. Pestova T.V., de Breyne S., Pisarev A.V., Abaeva I.S., Hellen C.U. eIF2-dependent and eIF2-independent modes of initiation on the CSFV IRES: a common role of domain II // EMBO J. 2008. Vol. 27. P. 1060-1072.

66. Locker N„ Easton L.E., Lukavsky P.J. HCV and CSFV IRES domain II mediate eEF2 release during 80S ribosome assembly //EMBO J. 2007. Vol. 26. P. 795-805.

67. Rivas-Estilla A.M., Svitkin Y., Lopez Lastra M., Hatzoglou M., Sherker A., Koromilas A.E. PKR-dependent mechanisms of gene expression from a subgenomic hepatitis C virus clone //J. Virol. 2002. Vol. 76. P. 10637-10653.

68. Terenin I.M., Dmitriev S.E., Andreev D.E., Shatsky I.N. Eukaryotic translation initiation machinery can operate in a bacterial-like mode without eIF2 I I Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. Vol. 5. P. 836-841.

69. Lancaster A.M., Jan E., Sarnow P. Initiation factor-independent translation mediated by the hepatitis C virus internal ribosome entry site // RNA. 2006. Vol. 12. P. 894-902.

70. Lytle J.R., Wu L., Robertson H.D. Domains on the hepatitis C virus internal ribosome entry site for 40s subunit binding // RNA. 2002. Vol. 8. P. 1045-1055.

71. Lytle J.R., Wu L., Robertson H.D. The ribosome binding site of hepatitis C virus mRNA // J. Virol. 2001. Vol. 75. P. 7629-7636.

72. Kieft J.S., Zhou K., Jubin R., Doudna J.A. Mechanism of ribosome recruitment by hepatitis C IRES RNA // RNA. 2001. Vol. 7. P. 194-206.

73. Kolupaeva V.G., Pestova T.V., Hellen C.U. An enzymatic footprinting analysis of the interaction of 40S ribosomal subunits with the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus //J. Virol. 2000. Vol. 74. P. 6242-6250.

74. Ji H., Fraser C.S., Yu Y., Leary J., Doudna J.A. Coordinated assembly of human translation initiation complexes by the hepatitis C virus internal ribosome entry site RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 16990-16995.

75. Odreman-Macchioli F., Baralle F.E., Buratti E. Mutational analysis of the different bulge regions of hepatitis C virus domain II and their influence on internal ribosome entry site translational ability //J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 41648-41655.

76. Buratti E., Tisminetzky S., Zolti M., Baralle F.E. Functional analysis of the interaction between HCV 5'UTR and putative subunits of eukaryotic translation initiation factor eIF3 // Nucleic Acids Res. 1998. Vol. 26. P. 3179-3187.

77. Fletcher S.P., Jackson R.J. Pestivirus internal ribosome entry site (IRES) structure and function: elements in the 5' untranslated region important for IRES function // J. Virol. 2002. Vol. 76. P. 5024-5033.

78. Kolupaeva V.G., Pestova T.V., Hellen C.U. Ribosomal binding to the internal ribosomal entry site of classical swine fever virus // RNA. 2000. Vol. 6. P. 1791-1807.

79. Kalliampakou K.I., Psaridi-Linardaki L., Mavromara P. Mutational analysis of the apical region of domain II of the HCV IRES //FEBS Lett. 2002. Vol. 511. P. 79-84.

80. Pisarev A.V., Kolupaeva V.G., Yusupov M.M., Hellen C.U., Pestova T.V. Ribosomal position and contacts of mRNA in eukaryotic translation initiation complexes // EMBO J. 2008. Vol. 27. P. 1609-1621.

81. Simon P.F., Richard J.J. Pestivirus Internal Ribosome Entry Site (IRES) Structure and Function: Elements in the 5' Untranslated Region Important for IRES Function // J. Virol. 2002. Vol. 76. P. 5024-5033.

82. Deng R., Brock V. 5' and 3' untranslated regions of pestivirus genome: primary and secondary structure analysis //Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 21. P. 1949-1957.

83. Varaklioti A., Georgopoulou U., Kakkanas A., Psaridi L., Serwe M., Caselmann W.H., Mavromara P. Mutational analysis of two unstructured domains of the 5' untranslated region of HCV RNA //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 253. P. 678-685.

84. Waga S., Stillman B. The DNA replication fork in eukaryotic cells // Annu. Rev. Biochem. 1998. Vol. 67. P. 721-751.

85. Lu H., Li W., Noble W.S., Payan D., Anderson D.C. Riboproteomics of the hepatitis C virus internal ribosomal entry site // J. Proteome Res. 2004. Vol. 3. P. 949-957.

86. Siridechadilok B., Fraser C.S., Hall R.J., Doudna J.A., Nogales E. Structural roles for human translation factor eIF3 in initiation of protein synthesis // Science. 2005. Vol. 310. P. 15131515.

87. Merrick W.C. Purification of protein synthesis initiation factors from rabbit reticulocytes // Methods Enzymol. 1979. Vol. 60. P. 101-108.

88. Spahn C.M., Beckmann R., Eswar N., Penczek P.A., Sali A., Blobel G., Frank J. Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae—tRNA-ribosome and subunit-subunit interactions // Cell. 2001. Vol. 107. P. 373-386.

89. Sengupta J., Nilsson J., Gursky R., Spahn C.M., Nissen P., Frank J. Identification of the versatile scaffold protein RACK1 on the eukaryotic ribosome by cryo-EM // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11. P. 957-962.

90. Nilsson J., Sengupta J., Frank J., Nissen P. Regulation of eukaryotic translation by the RACK1 protein: a platform for signalling molecules on the ribosome // EMBO Rep. 2004. Vol. 5. P. 1137-1141.

91. Scheper G.C., van Kollenburg B., Hu J., Luo Y., Goss D.J., Proud C.G. Phosphorylation of eukaryotic initiation factor 4E markedly reduces its affinity for capped mRNA // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 3303-3309.

92. Melcher S.E., Wilson T.J., Lilley D.M. The dynamic nature of the four-way junction of the hepatitis C virus IRES // RNA. 2003. Vol. 9. P. 809-820.

93. Lilley D.M. Structures of helical junctions in nucleic acids // Q. Rev. Biophys. 2000. Vol. 33. P. 109-159.

94. Honda M., Kaneko S., Matsushita E., Kobayashi K, Abell G.A., Lemon S.M. Cell cycle regulation of hepatitis C virus internal ribosomal entry site-directed translation // Gastroenterology. 2000. Vol. 118. P. 152-162.

95. Venkatesan A., Sharma R., Dasgupta A. Cell cycle regulation of hepatitis C and encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site-mediated translation in human embryonic kidney 293 cells // Virus Res. 2003. Vol. 94. P. 85-95.

96. Ali N., Pruijn G.J., Kenan D.J., Keene J.D., Siddiqui A. Human La antigen is required for the hepatitis C virus internal ribosome entry site-mediated translation // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 27531-27540.

97. Costa-Mattioli M., Svitkin Y., Sonenberg N. La autoantigen is necessary for optimal function of the poliovirus and hepatitis C virus internal ribosome entry site in vivo and in vitro // Mol. Cell Biol. 2004. Vol. 24. P. 6861-6870.

98. Tan EM. Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology // Adv. Immunol. 1989. Vol. 44. P. 93-151.

99. Gottlieb E., Steitz J.A. Function of the mammalian La protein: evidence for its action in transcription termination by RNA polymerase III // EMBO J. 1989. Vol. 8. P. 851-861.

100. Hiihn P., Pruijn G.J., van Venrooij W.J., Bachmann M. Characterization of the autoantigen La (SS-B) as a dsRNA unwinding enzyme // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25. P. 410-416.

101. Duncan R.C., Nakhasi H.L. La autoantigen binding to a 5' cis-eiement of rubella virus RNA correlates with element function in vivo // Gene. 1997. Vol. 201. P. 137-149.

102. Park Y.W., Katze M.G. Translational control by influenza virus. Identification of cis-acting sequences and trans-acting factors which may regulate selective viral mRNA translation // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 28433-28439.

103. Pardigon N., Strauss J.H. Mosquito homolog of the La autoantigen binds to Sindbis virus // RNA. J. Virol. 1996. Vol. 70. P. 1173-1181.

104. Chang Y.N., Kenan D.J., Keene J.D., Gatignol A., Jeang K.T. Direct interactions between autoantigen La and human immunodeficiency virus leader RNA // J. Virol. 1994. Vol. 68. P. 7008-7020.

105. Cordes S., Kusov Y., Heise T., Gauss-Miiller V. La autoantigen suppresses IRES-dependent translation of the hepatitis A virus // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 368. P. 1014-1019.

106. Ford L.P., Shay J.W., Wright W.E. The La antigen associates with the human telomerase ribonucleoprotein and influences telomere length in vivo // RNA. 2001. Vol. 7. P. 10681075.

107. Madore S.J., Wieben E.D., Pederson T. Eukaryotic small ribonucleoproteins. Anti-La human autoantibodies react with U1 RNA-protein complexes // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 1929-1933.

108. Kim Y.K, Back S.H., Rho J., Lee S.H., Jang S.K La autoantigen enhances translation of BiP mRNA //Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29. P. 5009-5016.

109. Holcik M., Korneluk R.G. Functional characterization of the X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) internal ribosome entry site element: role of La autoantigen in XIAP translation // Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20. P. 4648-5467.

110. Gottlieb E., Steitz J.A. The RNA binding protein La influences both the accuracy and the efficiency of RNA polymerase III transcription in vitro // EMBO J. 1989. Vol. 8. P. 841850.

111. Peek R., Pruijn G.J., Van Venrooij W.J. Interaction of the La (SS-B) autoantigen with small ribosomal subunits // Eur. J. Biochem. 1996. Vol. 236. P. 649-655.

112. Pudi R., Abhiman S., Srinivasan N., Das S. Hepatitis C virus internal ribosome entry sitemediated translation is stimulated by specific interaction of independent regions of human La autoantigen //J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 12231-12240.

113. Shimazaki T., Honda M., Kaneko S., Kobayashi K. Inhibition of internal ribosomal entry site-directed translation of HCV by recombinant IFN-alpha correlates with a reduced La protein II Hepatology. 2002. Vol. 35. P. 199-208.

114. Hahrn B., Kim Y.K., Kim J.H., Kim T.Y., Jang S.K. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L interacts with the 3' border of the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus // J. Virol. 1998. Vol. 72. P. 8782-8788.

115. Spangberg K., Schwartz S. Poly(C)-binding protein interacts with the hepatitis C virus 5' untranslated region//J. Gen. Virol. 1999. Vol. 80. P. 1371-1376.

116. Izumi R.E., Valdez B., Banerjee R., Srivastava M., Dasgupta A. Nucleolin stimulates viral internal ribosome entry site-mediated translation // Virus Res. 2001. Vol. 76. P. 17-29.

117. Komarova A.V., Brocard M., Kean KM. The case for mRNA 5' and 3' end cross talk during translation in a eukaryotic cell // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2006. Vol. 81. P. 331367.

118. Song Y., Friebe P., Tzima E., Jtinemann C., Bartenschlager R., Niepmann M. The hepatitis C virus RNA 3'-untranslated region strongly enhances translation directed by the internal ribosome entry site II J. Virol. 2006. Vol. 80. P. 11579-11588.

119. Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M. Identification of a highly conserved sequence element at the 3' terminus of hepatitis C virus genome RNA // J. Virol. 1996. Vol. 70. P. 3363-3371.

120. Ito T., Lai M.M. An internal polypyrimidine-tract-binding protein-binding site in the hepatitis C virus RNA attenuates translation, which is relieved by the 3'-untranslated sequence II Virology. 1999. Vol. 254. P. 288-296.

121. Ali N., Siddiqui A. Interaction of polypyrimidine tract-binding protein with the 5' noncoding region of the hepatitis C virus RNA genome and its functional requirement in internal initiation of translation //J. Virol. 1995. Vol. 69. P. 6367-6375.

122. Pérez /., Lin C.H., McAfee J.G., Patton J.G. Mutation of PTB binding sites causes misregulation of alternative 3' splice site selection in vivo // RNA. 1997. Vol. 3. P. 764-778.

123. Brocard M., Paulous S., Komarova A.V., Deveaux V., Kean K.M. Evidence that PTB does not stimulate HCV IRES-driven translation // Virus Genes. 2007. Vol. 35. P. 5-15.

124. McCaffrey A.P., O has hi K, Meuse L., Shen S., Lancaster A.M., Lukavsky P. J., Sarnow P., Kay M.A. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice // Mol. Ther. 2002. Vol. 5. P. 676-684.

125. Ito T., Tahara S.M., Lai M.M. The 3'-untranslated region of hepatitis C virus RNA enhances translation from an internal ribosomal entry site // J. Virol. 1998. Vol. 72. P. 8789-8796.

126. Fang J.W., Moyer R.W. The effects of the conserved extreme 3' end sequence of hepatitis C virus (HCV) RNA on the in vitro stabilization and translation of the HCV RNA genome // J. Hepatol. 2000. Vol. 33. P. 632-639.

127. Friebe P., Bartenschlager R. Genetic analysis of sequences in the 3' nontranslated region of hepatitis C virus that are important for RNA replication // J. Virol. 2002. Vol. 76. P. 53265338.

128. Kong L.K., Sarnow P. Cytoplasmic expression of mRNAs containing the internal ribosome entry site and 3' noncoding region of hepatitis C virus: effects of the 3' leader on mRNA translation and mRNA stability //J. Virol. 2002. Vol. 76. P. 12457-12462.

129. Murakami K, Abe M., Kageyama T., Kamoshita N., Nomoto A. Down-regulation of translation driven by hepatitis C virus internal ribosomal entry site by the 3' untranslated region of RNA // Arch. Virol. 2001. Vol. 146. P. 729-741.

130. Bradrick S.S., Walters R.W., Gromeier M. The hepatitis C virus 3'-untranslated region or a poly(A) tract promote efficient translation subsequent to the initiation phase // Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34. P. 1293-3103.

131. Buratti E., Gerotto M., Pontisso P., Alberti A., Tisminetzky S.G., Baralle F.E. In vivo translational efficiency of different hepatitis C virus 5'-UTRs //FEBS Lett. 1997. Vol. 411. P. 275-280.

132. Beguiristain N.: Robertson H.D., Gomez J. RNase III cleavage demonstrates a long range RNA: RNA duplex element flanking the hepatitis C virus internal ribosome entry site // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33. P. 5250-5261.

133. Kim Y.K., Lee S.H., Kim C.S., Seol S.K, Jang S.K. Long-range RNA-RNA interaction between the 5' nontranslated region and the core-coding sequences of hepatitis C virus modulates the IRES-dependent translation // RNA. 2003. Vol. 9. P. 599-606.

134. Hoofnagle J.H. Course and outcome of hepatitis C // Hepatology. 2002. Vol. 36. P. 21-29

135. Shimoike T., Mimori S., Tani H., Matsuura Y., Miyamura T. Interaction of hepatitis C virus core protein with viral sense RNA and suppression of its translation // J. Virol. 1999. Vol. 73. P. 9718-9725.

136. Kato J., Kato N., Yoshida H., Ono-Nita S.K., Shiratori Y., Omata M. Hepatitis C virus NS4A and NS4B proteins suppress translation in vivo // J. Med. Virol. 2002. Vol. 66. P. 187-199.

137. Takyar S.S., Gowans E.J., Lott W.B. Vitamin B12 stalls the 80 S ribosomal complex on the hepatitis C internal ribosome entry site // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 319. P. 1-8.

138. Lott W.B., Takyar S.S., Tuppen J., Crawford D.H., Harrison M., Sloots T.P., Gowans E.J. Vitamin B12 and hepatitis C: molecular biology and human pathology // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 4916-4921.

139. Li D., Lott W.B., Martyn J., Haqshenas G., Gowans E.J. Differential effects on the hepatitis C virus (HCV) internal ribosome entry site by vitamin B12 and the HCV core protein // J. Virol. 2004. Vol. 78. P. 12075-12081.

140. Molotkov M.V., Graifer D.M., Popugaeva E.A., Bulygin K.N., Meschaninova M.I., Ven'yaminova A.G., Karpova G.G. mRNA 3' of the A site bound codon is located close to protein S3 on the human 80S ribosome // RNA Biol. 2006. Vol. 3. P. 122-129.

141. Molotkov M., Graifer D., Demeshkna N., Repkova M., Ven'yaminova A., Karpova G. Arrangement of mRNA 3' of the A site codon on the human 80S ribosome // RNA Biol. 2005. Vol. 2. P. 63-69.

142. Pisarev A.V., Kolupaeva V.G., Yusupov M.M., Hellen C.U., Pestova T.V. Ribosomal position and contacts of mRNA in eukaryotic translation initiation complexes // EMBO J. 2008. Vol. 27. P. 1609-1621.

143. Bulygin K, Favre A., Baouz-Drahy S., Hountondji C., Vorobjev Y., Ven'yaminova A., Graifer D., Karpova G. Arrangement of З'-terminus of tRNA on the human ribosome as revealed from cross-linking data// Biochimie. 2008. Vol. 90. P. 1624-1636.

144. Semenkov Y.P., Kirillov S.V., Stahl J. 40 S subunits from rat liver ribosomes contain two codon-dependent sites for transfer RNA // FEBS Lett. 1985. Vol. 193. P. 105-108.

145. Sambrook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001.

146. Пшаутдинова О.К, Карпова Г.Г., Козырева Н.А. Аффинная модификация рибосом Е. coli 4-(№2-хлорэтил-1Ч-метил)амино.-бензил-5'-фосфамидами олироуридилатов разной длины //Молекуляр. биология. 1982. Т. 16. С. 752-762.

147. Kruse Т.А., Siboska G.E., Clark B.F. С Photosensitized cross-linking of tRNA to the P, A and R sites of Escherichia coli ribosomes // Biochimie. 1982. Vol. 64. P. 279-284.

148. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.

149. Madjar J.J., Arpin M., Buisson M., Reboud J.P. Spot position of rat liver ribosomal proteins by four different two-dimensional electrophoreses in polyacrylamide gel // Mol. Gen. Genet. 1979. Vol. 171. P. 121-134.

150. Malygin A., Karpova G., Westermann P. Hybridization of two oligodeoxynucleotides to both strands of an RNA hairpin structure increases the efficiency of RNA-DNA duplex formation //FEBS Lett. 1996. Vol. 392. P. 114-116.

151. Гринева Н.И., Ломакина T.C., Тигеева H.T., Чимитова Т.А. Кинетика ионизации С-С1 связи в 4-(№2-хлорэтил-№метиламино)бензил-5'-фосфамодах нуклеозидов и олигонуклеотидов // Биоорган, химия. 1977. Т. 3. С. 210-214.

152. Bulygin К., Malygin A., Karpova G., Westermann P. Site-specific modification of 4.5S RNA apical domain by complementary oligodeoxynucleotides carrying an alkylating group // Eur. J. Biochem. 1998. Vol. 251. P. 175-180.

153. Карпова Г.Г. Химические аспекты комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот // Изв. Сиб. Отд. Акад. Наук. 1987. Т. 12. С. 82-95.

154. Черноловская Е.Л., Черепанов ПЛ., Гороэюанкин А.В., Добриков М.И., Власов В.В., Кобец Н.Д. Взаимодействие фотоактивных производных олиготимидилата с хроматином клеток HeLa// Биоорган, химия. 1993. Т. 19. С. 889-896.

155. Repkova M.N., Venyaminova A.G., Zarytova V.F. New photoreactive RNA analogues // Nucleosides & Nucleotides. 1997. Vol. 16. P. 1797-1798.

156. Грайфер Д.М., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Расположение матрицы на рибосоме человека по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 725-744.

157. Власов В.В., Скобельцына JI.M. Изучение макроструктуры тРНКРЬе (Е. coli) методом химической модификации//Биоорган, химия. 1978. Т. 4. С. 550-561.

158. Malygin А.А., Shaulo D.D., Karpova G.G. Proteins S7, S10, S16 and S19 of the human 40S ribosomal subunit are most resistant to dissociation by salt // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1494. P. 213-216.

159. Молотков M.B., Грайфер Д.М., Попугаева E.A., Булыгин КН., Мещанинова М.И., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Белок S3 в 80S рибосоме человека соседствует с мРНК с З'-стороны от кодона в А-участке // Биоорган. Химия. 2007. Т. 33. С. 431-441.

160. Yusupova G.Z., Yusupov M.M., Cate J.H., Noller H.F. The path of messenger RNA through the ribosome // Cell. 2001. Vol. 106. P. 233-241.

161. Lutsch G., Stahl J., Kargel H.J., Noll F., Bielka H. Immunoelectron microscopic studies on the location of ribosomal proteins on the surface of the 40S ribosomal subunit from rat liver // Eur. J. Cell. Biol. 1990. Vol. 51. P. 140-150.

162. Spahn C.M., Jan E., Mulder A., Grassucci R.A., Sarnow P., Frank J. Cryo-EM visualization of a viral internal ribosome entry site bound to human ribosomes: the IRES functions as an RNA-based translation factor // Cell. 2004. Vol. 118. P. 465-475.