Структурно-функциональное исследование транспортно-матричной РНК Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ИВАНОВ ПАВЕЛ ВАЛЕРЬЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСПОРТНО-МАТРИЧНОЙ РНК Escherichia coli

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2003 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М В. Ломоносова, в Институте молекулярной генетики им М. Планка, Берлин, Германия.

Научные руководители: Д.х.н, проф. Донцова Ольга Анатольевна

к.х.н., с.н.с. Шпанченко Ольга Валерьевна

Научный консультант: проф. Кнуд Ниерхаус

Официальные оппоненты: д х н , проф. Готтих Борис Павлович

д.б.н. Аграновский Алексей Анатольевич

Ведущая организация: Институт Биологии Гена РАН

Защита состоится 23 декабря 2003 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. M В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 ноября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

2.12<f о

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Важнейшие клеточные процессы, такие как трансляция, транскрипция, процессинг и т.д., основаны на функционировании РНК и РНК-белковых комплексов, что вызывает повышенный интерес к изучению функции РНК и рибонуклеопротеидов. В последнее время появилась информация о важной роли так называемых малых РНК в различных процессах, таких как регуляция экспрессии генов, поддержание клеточного гомеостаза и т.д.

Одним из примеров малых стабильных РНК является транспортно-матричная РНК (тмРНК). Эта уникальная молекула РНК выполняет- в клетках эубактерий целый ряд функций. В частности, в ходе процесса транс-трансляции тмРНК освобождает рибосомы, „арестованные" на З'-конце матричной РНК, лишенной стоп-кодона, добавляет на С-конец недосинтезированных белков сигнальную последовательность (тагирует белки) и тем самым направляет их на деградацию с помощью специфических лротеаз клетки.

В настоящее время детальной информации о молекулярном механизме транстрансляции и о механизме взаимодействия тмРНК с рибосомой не существует. Для получения такой информации необходимо исследовать комплексы тмРНК с рибосомой на определенных стадиях транотрансляции.

Настоящая работа посвящена изучению структуры и функции транспортно-матричной РНК Escherichia coli.

Цель работы. В ходе выполнения данной работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучение роли З'-ССА конца тмРНК в формировании комплекса с фактором элонгации трансляции Tu в GDP форме;

2. Изучение структуры тмРНК в растворе и построение модели движения тмРНК в рибосоме;

3. Поиск структурных элементов тмРНК, необходимых для взаимодействия с рибосомой;

4. Изучение роли некоторых высококонсервативных нуклеотидов в функционировании тмРНК;

5. Разработка метода выделения комплекса тмРНК, взаимодействующей с рибосомой на определенных этапах транс-трансляции.

Научная новизна и практическая значимость. Методом фотоаффинного химического

сшивания определено, что универсальный З'-ССА конец транспортно-матричной РНК

не участвует в формировании необычного функционального комплекса tmPHK-EF-

Tu'GDP. Показано, что тмРНК без З'-ССА конца, ['¡j^ ^ОД^ШЖИЯвЙая и

аминоацилированная формы тмРНК, способна! фо| вЦВЛНОТИКЙмплем; с

I СПемрбург « »

элонгационным фактором Tu в GDP форме, что позволяет говорить о различной природе взаимодействия фактора элонгации Tu с тРНК и тмРНК.

Методами фотоаффинного химического сшивания с последующим анализом продуктов сшивания была получена информация о структуре тмРНК в растворе. В частности, показана двудоменная организация молекулы тмРНК и предложена модель прохождения тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции.

С помощью сайт-специфического мутагенеза и случайного мутагенеза in vivo с последующим определением функциональной активности тмРНК in vivo осуществлен поиск структурного элемента тмРНК, мимикрирующего кодон-антикодоновый дуплекс мРНК и тРНК, необходимый для взаимодействия с декодирующим центром рибосомы. Показано, что область тмРНК, соответствующая антикодоновой петле тРНК, не взаимодействует с декодирующим центром рибосомы и не участвует в формировании такого структурного элемента.

Показано, что высококонсервативные нуклеотиды 85-86UA и 300-301UA тмРНК важны для функциональной активности тмРНК.

Разработан метод выделения комплексов тмРНК с рибосомой, соответствующих разным этапам транс-трансляции. Выделены комплексы тмРНК с рибосомой для изучения структуры комплексов методом криоэлектронной микроскопии. Апробация работы Материалы работы были представлены на Международной Конференции "Trends in nucleic acid chemistry" (Москва, Россия, 2000), Международной Конференции в честь А.С. Спирина "Protein Synthesis" (Пущино, Россия, 2001), Пятом Международном Форуме "Récognition Studies in Nucleic Acids" (Шеффилд, Англия, 2001), Пятой Международной Конференции памяти В.А. Энгельгардта (Москва, Россия, 2001), Международной Конференции "The dynamics of Ribosome structure and Function" (Квинстаун, Новая Зеландия, 2002), Восьмой Ежегодной Конференции "RNA 2003" (Вена, Австрия, 2003), Шестой Международной Конференции "Ribosome Synthesis 2003' (Аркашон, Франция, 2003), а также доложены и обсуждены на семинарах лаборатории химии нуклеопротеидов, кафедры Химии Природных соединений, Института молекулярной генетики им. М. Планка (Берлин, Германия), Группы трансляционного контроля Европейской Молекулярно-Биологической Лаборатории (Гейдельберг, Германия) и Группы криоэлектронной микросколии Impérial College (Лондон, Англия)

Структура и объем диссертационной работы Диссертационная работа изложена на

_ страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение,

обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал

иллюстрирован _ рисунками и _ таблицами. Библиографический указатель

включае^ Цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Неканонический комплекс между тмРНК и ЕР-Ти

Ранее в нашей лаборатории в рамках проекта, посвященного изучению транстрансляции, методами фотоаффинного химического сшивания было показано, что элонгационный фактор Ти является одним из белков, взаимодействующих с транспортно-матричной РНК. Из литературных данных известно, что главная функция элонгационного фактора Ти - формирование комлекса с аминоацилированной тРНК и СТР, в котором ЕР-Ти взаимодействует с аминоакцепторным стеблем и Т-петлей аа-тРНК, а также защищает сложноэфирную связь от спонтанного гидролиза. Это позволило предположить, что во взаимодействии аминоацилированной тмРНК с ЕР-Ти также принимает участие З'-конец акцепторного стебля.

Анализ нукпеотидных остатков тмРНК, участвующих в формировании обнаруженного в нашей лаборатории комплекса деацилированной тмРНК с фактором элонгации Ти<ЗОР, показал, что, по крайней мере, часть из них расположена вне тРНК-подобного района тмРНК, а именно в спирали 2 и псевдоузле 4 тмРНК (рис. 1). Однако, данный анализ не позволял детектировать участие собственно З'-концевой части молекулы тмРНК в формировании сшивки. Посколько одной из задач данной работы было выяснение необходимости ССА-конца тмРНК для формирования ее комплекса с ЕР-Ти'СОР, мы решили использовать тмРНК, лишенную этого участка.

с'

с

Рисунок 1. Модель вторичной структуры транспортно-матричной РНК Есо//.

При этом для детектирования образования комплекса использовался метод фотоаффинного химического сшивания. В качестве фотоаффинного реагента был выбран 4-тиоуридин. Включение остатков тиоуридина в РНК не влияет на биологическую функцию и на структуру данной РНК. Активация 4-тиоуридина происходит при облучении мягким ультрафиолетовым светом в условиях, не приводящих к деградации РНК и белков.

if

-jit.

Рисунок 2. А. Анализ продуктов фотоаффинного химического сшивания с помощью ПААГ в денатурирующих условиях. Дорожка 1 - тмРНК без З'-СА после облучения УФ светом в присутствии S100; Дорожка 2 - тмРНК без З'-АССА после облучения УФ светом в присутствии S100, Дорожка 3 - тмРНК дикого типа после облучения УФ светом в присутствии S100; Дорожка 4 - тмРНК дикого типа после облучения УФ светом в присутствии EF-Tu-GDP; Дорожка 5 - тмРНК дикого типа после облучения УФ светом в присутствии S100 и последующей обработки протеиназой К; Дорожка 6 - тмРНК дикого типа после облучения УФ светом в отсутствие EF-Tu или S100; Б. Анализ белкового компонента сшивки (дорожки 1-3 рисунка 2А) с помощью ПААГ в денатурирующих условиях после обработки РНКазой Ti.

Для получения молекул тмРНК, лишенных З'-ССА-конца, были созданы две конструкции, позволяющие в ходе in vitro транскрипции синтезировать молекулы тмРНК без двух (СА) или четырех (АССА) терминальных нуклеотидов. Реакцию Т7 транскрипции проводили в присутствии 4-тиоуридина и радиоактивного a-[32P]-UTP. Уровень включения 4-тиоуридина составлял 2-5 остатков на молекулу тмРНК.

Для формирования РНК-белкового комплекса мутантные формы тмРНК и тмРНК дикого типа, которую использовали в качестве контроля, инкубировали в присутствии S100 экстракта (фракция растворимых белков клетки). После облучения УФ светом с длиной волны более 300 нм продукты фотоаффинного химического сшивания анализировали с помощью ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 2А). Видно, что эффективность сшивки для тмРНК дикого типа (рис. 2А, дор.З) и мутантных вариантов, лишенных З'-СА- и З'-АССА-концов (рис. 2А, дор.1 и 2, соответственно), примерно одинакова. Выход сшивки составляет около 20%. Белковый компонент сшивки (дорожки 1-3) экстрагировали из геля в присутствии РНКазыТ, и анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 2Б). Во всех

случаях в формировании сшивки с тмРНК принимает участие один белок, и его подвижность в геле совпадает с подвижностью фактора элонгации Ти. Природа основного и более подвижных компонентов была установлена с помощью масс-спекгрометрии. Это был элонгационный фактор Ти или его фрагменты. Это позволяет заключить, что универсальный З'-ССА-конец транспортно-матричной РНК не участвует в формировании комплекса с фактором элонгации Ти в GDP форме.

В условиях проведения эксперимента, описанного выше, в формировании комплекса с EF-Tu«GDP принимает участие деацилированная тмРНК. Однако известно, что активной в транс-трансляции является Ala-тмРНК. Возможность формирования комплекса Ala-TMPHK»EF-Tu»GDP была проверена также методом фотоаффинного химического сшивания. Радиоактивномеченая [32Р]-тмРНК, содержащая около 5 остатков 4-тиоуридина на молекулу, была аминоацилирована с использованием [14С]-аланина и использована в экспериментах по фотоаффинному химическому сшиванию с EF-Tu*GDP. Продукты сшивания анализировали электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях. В полосах, соответствующих продукту фотоаффинного химического сшивания и тмРНК, не принявшей участие в формировании сшивки, определяли соотношение [32F>]/[140] (табл. 1). Видно, что содержание аминоацилированной тмРНК примерно одинаково в обоих образцах, следовательно, Ala-тмРНК участвует в комплексообразовании с EF-Tu»GDP столь же эффективно, как и деацилированная.

Таблица 1. Результаты эксперимента по фотоаффинному химическому сшиванию между EF-Tu»GDP и ["С] Ala-t^PJ-TMPHK

образец соотношение fP]/ f 4С] соотношение

сшивка 1268/467 2.7:1

Ala-тмРНК 786/323 2.4:1

2. Модель взаимодействия тмРНК с рибосомой

Центральным вопросом в понимании механизма транс-трансляции является вопрос о том, как молекула тмРНК взаимодействует и движется в рибосоме.

Мы предполагаем, что тмРНК состоит из двух компактно свернутых доменов (включающих псевдоузлы), которые взаимодействуют со специфическими участками рибосомы и сохраняют эти контакты во время трансляции кодирующей части тмРНК (рис. ЗА). Домен 1 сформирован тРНК-подобной областью, спиралью 2 и псевдоузлом 1. Он, возможно, необходим для вхождения тмРНК в рибосому и содержит в себе аминоацилированную тРНК-подобную часть, взаимодействующую с элонгационным

фактором Ти и ЭшрВ с одной стороны, и элемент, который структурно мимикрирует кодон-антикодоновый комплекс мРНК и тРНК, узнающийся А участком рибосомы, с другой стороны. Оставшиеся элементы данного домена, возможно, необходимы для модулирования формы комплекса тРНК и мРНК. Домен 2, мы полагаем, состоит из спирали 5 и псевдоузлов 2 и 4.

Домен 1

Домен 1

Домен 2

рК?

/ъЗ3] ч

ЪаУг*:

Домен 2

Рисунок 3. Модель пространственной структуры тмРНК. Показаны А, Р и Е участки рибосомы. Номера спиралей и псевдоузлов соответствуют рис. 1.

2

-4X5 -4X4

-4X3

Рисунок 4. Гель-электрофоретический анализ продуктов фотоаффинного химического сшивания, содержащего 2-5 остатков 4-тиоуридина на молекулу тмРНК, после облучения УФ светом Дорожка 1, тмРНК без облучения УФ, дорожка 2. тмРНК. облученная УФ светом Х1-5 - продукты фотоаффинного химического сшивания

Для проверки нашей гипотезы о двудоменной организации молекулы тмРНК мы применили метод фотоаффинного химического сшивания тмРНК со случайно распределенными по молекуле остатками 4-тиоуридина была облучена ультрафиолетовым светом с длиной волны более 300 нм. Облученный образец анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рис 4). Было обнаружено, по крайнем мере, 5 продуктов фотоаффинного химического сшивания. Данные продукты сшивки элюировали из геля. Для определения нуклеотидных остатков, принимающих участие в формировании сшивок, использовали стандартные подходы анализа продуктов фотоаффинного химического сшивания (анализ с помощью РНКазы Н и метод обратной транскрипции), ранее неоднократно и успешно использованные в нашей лаборатории Пример такого анализа приведен на рис 5

Продукт фотоаффинного химического сшивания Х5 локализован в тРНК-подобной части тмРНК и связывает уридины 15-16 с последовательностью нуклеотидов 325-345 тмРНК Продукты Х1-ХЗ содержат уридин в позиции 182 из петли псевдоузла 2 (рис 5Б), связанный с тремя различными нуклеотидами из области второго и третьего псевдоузла Продукт Х4 состоит из комбинации двух продуктов сшивания продукта Х5 и одного из продуктов Х1-3 К сожалению, нам не удалось определить места сшивок с точностью до нуклеотида, поскольку тмРНК обладает очень компактной структурой, и после ее облучения ультрафиолетовым светом отжиг праймеров затруднен. Тем не менее, данные по фотоаффинному химическому сшиванию, полученные в нашей работе (рис 6), подтверждают существование двух компактно свернутых доменов в молекуле тмРНК

1 г * « « * т » « »»ж

Рисунок 5. Примеры анализа продуктов фотоаффинного химического сшивания. А. Анализ продуктов Х2 и Х4 (рис. 4) в ПААГ в денатурирующих условиях после разрезания РНК РНКазой Н в присутствии олигодезоксирибонуклеотидов. Дорожки 1-3 - без олигонуклеотида Дорожки 4-6 - в присутствии олигонуклеотида, комплементарного последовательности 200-217 тмРНК. Дорожки 7-9 - в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательности 200-217 и 336-363 тмРНК. Дорожки 10-12 - в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательности 200-217 и 312-325 тмРНК. Дорожки 13-15 - в присутствии олигонуклеотидов. комплементарных последовательности 200-217 и 274-291 тмРНК. Дорожки 16-18 - в присутствии олигонуклеотидов. комплементарных последовательности 200-217 и 243-260 тмРНК. Дорожки 19-21 - в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательности 200-217 и 128-145 тмРНК. Дорожки 22-24 - в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательности 200-217 и 56-73 тмРНК. Дорожки 1, 4, 7, 10, 13, 18, 19, 22 -гидролиз контрольного образца (1, рис 4). Дорожки 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 - гидролиз образца Х2. Дорожки 3,6,9,12,15,18,21, 24 - гидролиз образца Х4. Позиции продуктов фотоаффинного химического сшивания указаны стрелками. Б. Анализ продуктов фотоаффинного химического сшивания методом обратной транскрипции А.в.С.и - сиквенс ™РНК Дорожки Х1-Х5, анализ соответствующих продуктов фотоаффинного химического сшивания (рис. 4). Позиция сигнала остановки обратной транскрипции в позиции С183, соответствующая сшивке нуклеотида 1)182, показана стрелкой.

Рисунок 6. Двудоменная организация пространственной структуры тмРНК

Согласно нашей модели домены 1 и 2 связаны между собой кодирующей частью и псевдоузлом 4 (рис. 3). Мы предполагаем, что в растворе домены 1 и 2 располагаются близко друг к другу, формируя очень компактную структуру, которая, возможно, стабилизирована взаимодействием с белками (например, белком SmpB, рибосомным белком S1 или фактором элонгации Tu). В такой третичной структуре мРНК-подобная часть тмРНК спрятана между двумя структурно-функциональными доменами 1 и 2 тмРНК (рис. ЗА).

Мы предполагаем, что такая компактно свернутая аминоацилированная форма тмРНК входит в А участок рибосомы в комплексе с элонгационным фактором Tu в GTP форме и белком SmpB. Таким образом, этот комплекс может быть похож на канонический комплекс, сформированный аа-тРНК и фактором элонгации Tu. Когда домен 1 тмРНК взаимодействует с А участком рибосомы, в рибосоме происходит конформационное изменение, которое вызывает гидролиз GTP до GDP. Это ведет к конформационным изменениям в EF-Tu и, возможно, также в ттиРНК. Аминоацилированный ССА-конец тмРНК перемещается в пептидилтрансферазный центр рибосомы, и элонгационный фактор Tu покидает рибосому. На этой стадии домен 2 должен занять свой участок связывания на рибосоме на внешней стороне 30S субчастицы.

Далее, элонгационный фактор G взаимодействует с рибосомой и способствует прохождению транслокации, после которой тРНК-подобная часть домена 1 тмРНК и структурно-функциональный аналог кодон-антикодонового дуплекса перемещаются в Р участок рибосомы, а первый кодон мРНК-подобной части, кодирующий аланин, входит в А участок рибосомы благодаря раскрытию данной области (рис. ЗБ). В то же время домен 2 остается связанным со своим участком на рибосоме. На следующих стадиях домен 1 движется из Р участка рибосомы в Е участок и, возможно, затем выходит из рибосомы. Домен 2 остается связанным со своим участком до терминации трансляции мРНК-подобной часта тмРНК. Транслокация кодирующей части тмРНК осуществляется обычным путем. В тот момент, когда стоп-кодон матричной части тмРНК появляется в А участке рибосомы, происходит каноническая терминация трансляции, и тмРНК покидает рибосому после диссоциации последней на субчастицы. Таким образом, в ходе транс-трансляции домены 1 и 2 не подвергаются значительным структурным перестройкам, происходит лишь разворачивание мРНК-подобной части и поворот псевдоузла 1 транспортно-матричной РНК (рис. ЗБ и ЗВ).

3. Поиск элемента тмРНК, обеспечивающего узнавание А участком рибосомы

Для осуществления транс-трансляции, аминоацилированная тмРНК узнает рибосомы, арестованные на мРНК, утративших стоп-кодон. В этом случае в А участке рибосомы невозможно образование классического кодон-антикодонового дуплекса. Как

уже упоминалось выше, мы полагаем, что домен 1 тмРНК содержит некий элемент, который структурно мимикрирует кодон-антикодоновый дуплекс между тРНК и мРНК, узнающийся А участком рибосомы. Для поиска нуклеотидных остатков, формирующих такой структурный элемент, мы применили метод сайт-направленного мутагенеза.

Первым кандидатом на роль участников „кодона" были нуклеотиды 87-89GUC, предшествующие кодону, кодирующему первую аминокислоту сигнального пептида.

В роли потенциального „антикодона" для нуклеотидов 87-89GUC мы рассматривали частично комплементарный к последовательности 87-89GUC триплет нуклеотидов 318-320GAU (имея в виду, что взаимодействие между G и U является достаточно распространенным в мире РНК). Данный триплет располагается в тРНК-подобной части тмРНК рядом с областью, образующей антикодоновую петлю в канонической тРНК Кроме того, по сообщению ряда исследователей именно данная область тРНК-подобной части тмРНК, возможно, взаимодействует с декодирующим центром рибосомы.

Для проведения сайт-направленного мутагенеза на базе вектора pGEM-T мы создали конструкцию pGEM-tmRNA, которая содержала ген ssrA, кодирующий тмРНК, под контролем собственного конституитивного промотора и заканчивающийся своим терминатором транскрипции Этот вектор позволяет экспрессировать ген тмРНК in vivo. Все мутантные варианты тмРНК созданы в дальнейшем на базе данной плазмиды.

Для проверки функциональной активности тмРНК мы применили два метода. Первый метод основан на использовании гибридного фага AimmP22, требующего для своего роста присутствия в клетке функционально активных молекул тмРНК. Разница между титром фага, выросшего на клетках, содержащих ген тмРНК, и на штаммах с делецией ssrA, составляет примерно 10000 раз, что позволяет достоверно оценить функциональную активность молекул тмРНК. Введение плазмиды pGEM-tmRNA, экспрессирующей тмРНК, в клетки штамма Х90 (AssrA) восстанавливает титр гибридного фага AimmP22 до уровня дикого типа, который существенно отличается от титра фага на штамме с делецией гена ssrA.

Другой метод позволяет проводить прямую оценку функциональной активности тмРНК (т.н. „генетическая система"). В клетки штамма с делетированным геном ssrA вводили две плазмиды, одна из которых позволяла конститутивно экспрессировать исследуемую тмРНК, а другая содержала модуль, дающий возможность отслеживать функциональную активность тмРНК. Данный модуль состоит из двух генов. Первый ген, находящийся под контролем индуцибельного lac промотора и кодирующий укороченый вариант фагового репрессора Arc, непосредственно заканчивается терминатором транскрипции, в котором все стоп-кодоны в открытой рамке считывания удалены. Второй ген дает устойчивость к антибиотику канамицину и находится под

контролем фагового промотора Pant. Этот промотор является мишенью для penpeccopa Arc. При добавлении индуктора в среду образуется мРНК фагового репрессора Arc, не содержащая стоп-кодона. Рибосомы, транслирующие такую мРНК, будут „арестованы" на 3'-конце матрицы, и образующийся комплекс является естественной мишенью для тмРНК. В клетках с активной тмРНК Arc репрессор будет подвергаться тагированию и деградации под действием клеточных протеаз. Такие клетки будут устойчивы к канамицину. Если в клетках тмРНК отсутствует или функционально неактивна, то не произойдет деградация Arc репрессора, и он репрессирует экспрессию гена, дающего устойчивость к канамицину, связавшись с промотором Pant. Такие клетки чувствительны к присутствию канамицина.

В табл. 2 суммированы данные о мутациях, введенных нами в последовательность потенциальных „кодона" (87-89) и „антикодона" (318-320) для частичного или полного нарушения их гипотетического взаимодействия.

Оказалось, что ни одна из мутаций в данных районах не сказывается ни на аминоацилировании, ни на функциональной активности тмРНК, что было подтверждено как в фаговой системе проверки активности, так и в „генетической системе".

Следовательно, представляется маловероятным непосредственное участие нукпеотидов 87-89 и 318-320 в формировании структурного элемента, который узнает А участок рибосомы.

Таблица 2 Влияние мутаций в области 87-89 и 318-320 на функциональную активность тмРНК

Мутант Рост Аминоацилирование

GAG (87-89) +++ +++

GAC (87-89) +++ +++

UAC (87-89) +++ +++

GAG (318-320) +++ +++

AAG (318-320) +++ +++

АСА (318-320) +++ +++

Интересно отметить, что было высказано предположение о том, что область 85-87, представляющая собой триплет UAR (R-пуриновое основание), возможно, узнается фактором терминации RF1, и данный фактор участвует в позиционировании первого кодона кодирующей части тмРНК в А участке рибосомы. Согласно нашим данным, замена UAG на UAU (мутант 87-89 UAC) не затрагивала функциональную активность тмРНК. Кроме того, участвуя в транс-трансляции, данный фактор терминации не должен проявлять свою пептидил-тРНК гидролазную функцию.

Вероятно, в узнавании А участком рибосомы молекулы тмРНК задействованы какие-то более сложные механизмы Так, согласно литературным данным, петля тмРНК, соответствующая антикодоновой петле канонической тРНК, возможно, взаимодействует с декодирующим центром рибосомы. Для проверки того, насколько этот структурный элемент важен для протекания процесса транс-трансляции, мы изменили методом сайт-направленного мутагенеза нуклеотиды, образующие данную петлю, таким образом, чтобы стало возможным формирование спирального участка в этом районе.

Однако, согласно нашему анализу функциональной активности in vivo данный мутант имел сходный с тмРНК дикого типа фенотип, и эта мутация не затрагивала функции тмРНК. Это свидетельствует против того, что данная петля выполняет функцию, аналогичную канонической антикодоновой петле тРНК. Возможно, что другие части тмРНК образуют структурный элемент, узнающийся декодирующим центром рибосомы, или данное взаимодействие определяется какими-либо транс-факторами.

Согласно полученной недавно кристаллической структуре комплекса белка SmpB и тРНК-подобной части тмРНК и последующему моделированию позиции данного комплекса в А участке рибосомы петля, соответствующая антикодоновой петле канонической тРНК, и белок SmpB находятся в непосредственной близости от декодирующего центра рибосомы Известно, что белок SmpB абсолютно необходим для транс-трансляции, в частности, показана его необходимость для начального связывания тмРНК с А участком рибосомы, а также влияние на аминоацилирование тмРНК как in vitro, так и in vivo. Таким образом, возможно, что именно белок SmpB играет главную роль в узнавании тмРНК декодирующим центром рибосомы.

4. Исследование роли некоторых консервативных нукпеотидов тмРНК

Методом сайт-специфического мутагенеза мы проверили функциональную важность некоторых высококонсервативных нукпеотидов тмРНК

Первыми проанализированными нуклеотидами были 307-308GU. Ранее в нашей лаборатории при изучении необычного комплекса между элонгационным фактором Tu в GDP форме и деацилированной тмРНК методом обратной транскрипции было показано, что нуклеотид U308 непосредственно участвует в образовании сшивки с элонгационным фактором. Хотя эти результаты не позволяют однозначно заявить о доминирующей роли данного нукпеотида в образовании комплекса, они указывают на важность региона тмРНК, окружающего данный нуклеотид, для взаимодействия с элонгационным фактором Tu в GDP форме. Интересно отметить, что следующий за U308 нуклеотид G307 инвариантен во всех известных на данный момент генах тмРНК (более 150 эубактерий с известной последовательностью генома)

Следующими кандидатами для анализа были высококонсервативные нуклеотиды 85-86UA, отстоящие на один триплет от первого кодона мРНК-подобной части тмРНК и нуклеотиды 300-301UA (консервативность более 95%), комплементарные друг другу. Они, возможно, являются частью структурного элемента, узнаваемого А участком рибосомы.

Данные о мутациях, введенных по описанным выше сайтам, и их влиянии на функционирование тмРНК суммированы в таблице 3. В то время, как мутации нуклеотидов 307-308 вызывают лишь замедление роста клеток в системе проверки активности in vivo и, следовательно, незначительно сказываются на функционировании тмРНК, мутации 300-301 UA-*CC и 85-86UA-»CC приводят к гибели клеток, и, таким образом, полностью инактивируют тмРНК. Молекулы тмРНК, мутантные по положениям 85-86, аминоацилировались in vitro с той же эффективностью, что тмРНК дикого типа (выход аминоацилирования составлял 40%), следовательно, эти мутации затрагивают именно способность тмРНК осуществлять транс-трансляцию.

Таблица 3 Влияние мутаций высококонсервативных нуклеотидов на функциональную активность тмРНК Nd- не было определено.

Мутант Рост Аминоацилирование

• UC (85-86) ± +++

СА (85-86) ++ +++

СС (85-86) - +++

СС (300-301) - Nd

U308C ++ Nd

U307A + +++

Из литературных данных известно, что делеции этих нуклеотидов приводят к сдвигу рамки считывания сигнального-пептида, а мутация и85С приводила к снижению выхода тагированного продукта. В экспериментах по "рандомизации" нуклеотидной последовательности области, прилегающей к кодирующей части тмРНК, была продемонстрирована важность нуклеотидов 85-86 для функционирования тмРНК. Можно предположить, что дистапьные элементы домена 1 обеспечивают позиционирование области 85-89 и первого кодона ССА, кодирующего аланин, а нуклеотиды 1)А в позициях 85-86 являются локальными детерминантами такого позиционирования.

5. Поиск интрамолекулярных супрессоров для летальных мутаций 85-86СС и

300-301СС

Для проверки существования в тмРНК взаимодействия нуклеотидов, мутации которых приводят к летальному фенотипу, между собой или с другими нукпеотидами тмРНК, мы провели поиск супрессоров летального эффекта этих мутаций.

В нашей работе мы использовали клетки £ coli штамма SL185, несущего мутации в гене тиЮ, для получения случайных мутаций в плазмидах, содержащих тмРНК с летальными мутациями 85-86СС или 300-301 СС. Полученный набор плазмид со случайными мутациями тестировали в системе т vivo для отбора только тех тмРНК, которые обладают функциональной активностью Была определена нуклеотидная последовательность мутантов, обладающих функциональной активностью

Интересно отметить, что все мутации, восстанавливающие функциональную активность тмРНК с летальной мутацией 300-301 СС, являются реверсиями этих нуклеотидов к дикому типу UA (9 вариантов из 9 секвенированных) В случае тмРНК с летальными мутациями в положении 85-86СС во всех вариантах в положении 86 появлялся нуклеотид А (14 из 14), что соответствует дикому типу Вариантов тмРНК, восстановивших свою функциональную активность, не изменив нуклеотиды в позициях 86 или 300-301, обнаружено не было

Таким образом, результаты даннного эксперимента указывают на важность нуклеотидов 85-86UA и 300-301UA для функциональной активности тмРНК, но интрамолекулярных взаимодействий между этими нукпеотидами обнаружено не было Не выявлены и другие потенциальные партнеры этих функционально важных нуклеотидов, мутации в которых могли бы компенсировать летальный фенотип

Ответ на вопрос о роли этих нуклеотидов в транс-трансляции, а также многие другие вопросы о функционировании тмРНК может дать изучение структуры комплексов тмРНК с рибосомой методом криоэлектронной микроскопии Для этого необходимо выделить комплексы тмРНК с рибосомой, соответствующие определенным этапам транс-трансляции

6. Разработка метода выделения комплекса транспортно-матричной РНК с

рибосомой

Мы применили метод аффинной хроматографии для выделения комплексов, взаимодействующих тмРНК с рибосомой В качестве аффинной группы мы выбрали РНК-аптамер к стрептавидину, эффективность использования которого была убедительно продемонстрирована

РНК-аптамер к стрептавидину мы вводили в молекулу тмРНК вместо псевдоузла 3. Из литературных данных было известно, что в молекуле тмРНК Е coli псевдоузлы 2, 3

и 4 взаимозаменяемы. Более того, их замещение одноцепочечными участками не сказывается на аминоацилировании тмРНК и на функциональной активности тмРНК в бесклеточной системе транс-трансляции. Кроме того, согласно нашей модели пространственной организации тмРНК в рибосоме псевдоузел 3 находится на внешней стороне комплекса и должен быть доступен для взаимодействия на всех этапах транстрансляции (рис. 3).

Для замещения псевдоузла 3 на РНК-аптамер к стрептавидину на первом этапе с помощью метода ПЦР последовательность нуклеотидов, кодирующих псевдоузел, была удалена. Вместо нее были введены сайты разрезания эндонуклеаз рестрикции, и на втором этапе по этим сайтам была вставлена последовательность, кодирующая РНК-аптамер. Полученный мутант, содержащий РНК-аптамер к стрептавидину, сохраняет свою функциональную активность, как было показано в системе in vivo, описанной выше.

Для получения гомогенной популяции комплекса тмРНК-рибосома транстрансляцию необходимо остановить на строго определенной стадии. Для этого в нашей работе мы использовали штамм Escherichia coli SKZ1, в котором ген ssrA, кодирующий тмРНК, был заменен на ген, кодирующий хлорамфеникол-ацетилтрансферазу, обеспечивающую устойчивость к хпорамфениколу. Кроме того данный штамм кодирует термочувствительный фактор терминации RF2. В молекуле тмРНК терминация синтеза сигнального пептада происходит на стоп-кодоне UAA, находящегося в положении 11 кодирующей области, его могут узнавать оба фактора терминации. Для эффективного использования термочувствительности RF2 для остановки транс-трансляции было необходимо заменить стоп-кодон UAA на UGA, который используется только фактором RF2. Кроме того, из литературных данных известно, что эффективность терминации трансляции зависит не только от природы стоп-кодона и активности фактора терминации, но также и от нуклеотидов, окружающих стоп-кодон. Для терминации трансляции на стоп-кодоне UGA наиболее неблагоприятным является контекст GAC CCA UGA А. Мы создали такой мутантный вариант тмРНК, используя описанную выше конструкцию, в которой псевдоузел 3 был заменен на аптамер к стрептавидину. Полученная тмРНК сохраняла функциональную активность в тесте in vivo. Клетки, содержащие данную мутантную тмРНК, росли лишь незначительно медленнее по сравнению с клетками дикого типа, что может быть объяснено снижением эффективности терминации трансляции.

Клетки штамма SKZ1 трансформировали плазмидой, несущей такую мутантную тмРНК, и растили до оптической плотности 0,3 при температуре 37'С в присутствии необходимых антибиотиков. Затем повышали температуру до 42'С. В этих условиях эффективность терминации резко снижалась из-за термочувствительности RF2 и

неблагоприятного контекста вокруг стоп-кодона в тмРНК, что позволяло блокировать комплекс на стадии терминации.

Клетки осаждали центрифугированием, получали S30 экстракт и выделяли фракцию рибосом с помощью ультрацентрифугирования. Фракцию рибосом, содержащих тмРНК, выделяли с помощью аффинной хроматографии на стрептавидин-сефарозе. Элюцию рибосом, содержащих тмРНК, проводили с помощью биотина. Состав комплекса анализировали электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 7).

Перемещение стоп-кодона и окружающего его контекста GAC CCA UGA А по матричной области тмРНК позволяет остановить процесс дарэ/ус-трансляции на более ранних этапах. Для этого мы создали конструкции, несущие стоп-кодон в окружении соответствующего контекста в положениях 4 и 5 мРНК-подобной части тмРНК. Данные плазмиды трансформировали в клетки штамма SKZ1; выделение и очистку комплекса проводили, как описано выше.

1 2 3 4 К 5 6

> ■'HI IT* «■;<,?! ,t-v"* , ' 5 i

-'ilr; .".„{'ИК&г hpitfo

ft-i * ".Jf

, 23S pPHK ■ 16S pPHK

тмРНК с РНК-аптамером ' к стрептавидину

- тмРНК

5S pPHK

tPHK

Рисунок 7. Анализ выделенных комплексов с помощью ПААГ в денатурирующих условиях. РНК, выделенная из комплексов с ™РНК, несущей стоп-кодон в положении 4 матричной области до (1) и после (2) диализа, в положении 5 до (3) и после (4) диализа; в положении 11 до (5) и после (в) диализа. К-контроль, тмРНК дикого типа, синтезированная ш у'Лю

Как видно из рис. 7, все фракции различных изолированных комплексов тмРНК-рибосома (дорожки 1-6) содержат зоны, соответствующие 23Э рРНК, 16Э рРНК, 5Б рРНК, тРНК и тмРНК с РНК-аптамером к стрептавидину. Подвижность тмРНК с

аптамером к стрептавидину (дорожки 1-6) не совпадает с подвижностью тмРНК дикого типа (дорожка К), что объясняется введением дополнительной последовательности нукпеотидов, кодирующих РНК-аптамер к стрептавидину. Для подтверждения природы РНК в данной полосе использовали дот-блоттинг. Видно, что варианты 4, 5 и 11 выделяются примерно с одинаковой эффективностью. Выход комплекса (согласно денситометрическому анализу) равен примерно 30-35%. Применение диализа для удаления биотина, необходимое для получения образцов, годных для структурного анализа, не сказывалось на стабильности комплексов (дорожки 2,4,6).

Таким образом, мы создали систему, позволяющую выделять комплексы тмРНК и рибосомы, соответствующие различным этапам трансляции мРНК-подобной части тмРНК.

С помощью электрофореза в ПМГ в денатурирующих условиях было обнаружено, что во всех комплексах присутствует полоса белка, соответствующая по молекулярной массе белку втрВ.

По предварительным данным, полученные разработанным в этой работе методом комплексы тмРНК с рибосомой, соответствующие различным этапам трансляции мРНК-подобной части тмРНК, оказались пригодными для структурного анализа с помощью криоэлектронной микроскопии.

1

ВЫВОДЫ

1. ССА-конец тмРНК не участвует в формировании неканонического комплекса с фактором элонгации Tu*GDP.

2. Результаты фотоаффинного внутримолекулярного сшивания свидетельствуют в пользу существования в молекуле тмРНК двух структурных доменов.

3. Предложена гипотетическая схема взаимодействия тмРНК с рибосомой в процессе транс-трансляции.

4. Методом сайт-направленного мутагенеза показана важность нуклеотидов 85-86UA и 300-301UA для функционирования тмРНК.

5. Разработана система селекции in vivo функционально активных молекул тмРНК.

6. Получены комплексы тмРНК с рибосомой на разных этапах трансляции мРНК-подобной части тмРНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ivanov P.V., Zvereva M.I., Shpanchenko O.V., Dontsova O.A., Bogdanov A A., Aglyamova G.V., Urn V.I., Teraoka Y., Nierhaus K.H. How does tmRNA move through the ribosome? FEBS Lett. 2002 Mar 6; 514{1):55-59.

2. Zvereva, M I., Ivanov P.V., Teraoka Y., Topilina N.I., Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Kalkum M , Nierhaus K.H., Shpanchenko O.V. Complex of transfer-messenger RNA and elongation factor Tu. Unexpected modes of interaction. J. Biol. Chem. 2001 Dec 14; 276(50): 47702-47708.

3. Wilson D.N., Blaha G„ Connell S.R., Ivanov P.V., Jenke H., Stelzl U., Teraoka Y„ Nierhaus K.H. Protein synthesis at atomic resolution: mechanistics of translation in the light of highly resolved structures for the ribosome. Curr. Protein Pept. Sci. 2002 Feb; 3(1): 1-53.

4. Zvereva M. I., Ivanov P. V., Topilina N. I., Dontsova O.A., Nierhaus К. H., Shpanchenko O.V. Internationa! conference: Trends in nucleic acid chemistry. November, 21-24, 2000, Moscow, Russia, p.40.

5. Zvereva M. I., Ivanov P. V., Teraoka Y., Topilina N. I., Dontsova O. A., Bogdanov A. A., Kalkum M., Nierhaus К. H. and Shpanchenko О. V. Complex of tmRNA and EF-Tu: unexpected mode of interaction. International Conference In honor of Alexander Spirin: Protein Synthesis. August 27- September 1,2001, Pushchino, Russia, p.68

6. Dontsova O. A., Sergiev P. V., Avdeeva O. N., Shpanchenko О. V., Zvereva M. I., Ivanov P. V., Topilina N. I., Aglyamova G., Bogdanov A A., Kalkum M., Teraoka Y., Nierhaus K. H. and Brimacombe R.. Interaction of RNP with the E coli Ribosome. International

Conference in honour of Alexander Spirin: Protein Synthesis. August 27- September 1, 2001, Pushchino, Russia, p. 12.

7. Ivanov P. V., Shpanchenko O. V., Dontsova O. A., Bogdanov A. A., Teraoka Y., Nierhaus K. H.. Mutational analysis of some conservative regions in tmRNA. International

. conference: The dynamics of Ribosome structure and Function. Queenstown, New Zealand, 27th January -1st February, 2002, p.147.

8. Ivanov P.V., Zvereva M.I., Teraoka V., Topilina N.I., Dontsova O.A., Bogdanov AA, Kalkum M„ Nierhaus K.H., Shpanchenko O.V. Complex of transfer-messenger RNA and elongation factor Tu. Unexpected modes of interaction. International conference: The dynamics of Ribosome Structure and Function. Queenstown, New Zealand, 27th January -1st February, 2002, p. 153.

9. Ivanov P.V., Zvereva M.I., Shpanchenko O.V., Bogdanov A.A., Nierhaus K.H., Dontsova O.A. How does tmRNA move through the ribosome? RNA Conference 2003, Vienna, 1№ July- 7" July 2003, p.700.

10. Shpanchenko O.V., Zvereva M.I., Ivanov P.V., Topilina N.I., Nierhaus K.H., Isaksson L.A., Bogdanov A.A., and Dontsova O.A. Model of tmRNA pathway through the ribosome. 6th International Conference on Ribosome Synthesis 2003, Arcachon, France, June 6-10, 2003, p.64.

11. Shpanchenko O. V., Zvereva M. I., Ivanov P. V.,. Topilina N. I, Nierhaus K. H., Dontsova O. A. and Bogdanov A.A.. Complex of tmRNA and EF-Tu: unexpected mode of interaction. 5th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids. April 8th-12th 2001, Sheffield, England, p.58. /)

*f>

Тираж 100. Зах. 114. ООП МГУ

1

»21290

2д29о

СОДЕРЖАНИЕ.

1. СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. Терминация трансляции и процессы, конкурирующие с ней /Обзор литературы/

3.1.Терминация трансляции.

3.1.1. Историческая справка.

3.1.2. Терминация трансляции. Общие сведения.

3.1.3. Декодирующие факторы терминации.

3.1.4. Концепция „молекулярной мимикрии".

3.1.4.1. Предполагаемая „антикодоновая мимикрия".

3.1.5. Освобождение синтезированного полипептида с помощью факторов терминации.

3.1.6. Диссоциация пост-терминационного комплекса.

3.1.7. Диссоциация рибосом на субчастицы для последующих раундов трансляции.

3.2.Процессы, конкурирующие с терминацией трансляции.

3.2.1. Рекодирование стоп-кодонов.

3.2.1.1. Программированный трансляционный сдвиг рамки считывания и программированное прочтение стоп-кодонов.

3.2.1.2. Рекодирование стоп-кодона гена 60 бактериофага Т4 (translational hopping).

3.2.1.3.Включение селеноцистеина на стоп-кодоне UGA.

3.2.2. Конкуренция между терминацией трансляции и тмРНК.

3.2.3.Конкуренция между терминацией трансляции и бактериальным токсином RelE.

3.2.4.Триптофан как эффективный ингибитор терминации трансляции.

3.2.5. Деградация мРНК, содержащих преждевременный стоп-кодон (nonsense-mediated decay) в клетках эукариот.

4. Результаты и Обсуждение.

4.1. Неканонический комплекс между тмРНК и EF-Tu.

4.2. Модель взаимодействия тмРНК с рибосомой.

4.3. Поиск элемента тмРНК, обеспечивающего узнавание А участком рибосомы

4.4. Исследование роли некоторых консервативных нуклеотидов тмРНК.

4.5. Поиск интрамолекулярных супрессоров для летальных мутаций 85-86UA-+CC и 300-301UA—CC.

4.6. Мутации нуклеотидов тРНК-подобной части, затрагивающие активность тмРНК.

4.7. Разработка метода выделения комплекса транспортно-матричной РНК с рибосомой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1. Реактивы, буферы и растворы.

5.2. Биопрепараты.

6.3.Трансформация клеток Escherichia coli.

5.3.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации с помощью теплового шока.

5.3.2. Приготовление компетентных клеток для электротрансформации.

5.4. Трансформация.

5.4.1. Электротрансформация клеток Е coli.

5.4.2. Трансформация с помощью теплового шока.

5.5. Клонирование гена, кодирующего тмРНК.

5.6. Создание генетической системы.

5.7. Конструирование плазмиды pStr.

5.8. Введение мутаций в ген, кодирующий тмРНК.

5.8.1. Сайт-направленный мутагенез.

5.8.2. Случайный мутагенез тмРНК in vivo и анализ мутантов.

5.9. Определение первичной структуры ДНК по Сэнгеру.

5.10. Анализ активности мутантных молекул тмРНК.

5.10.1. Анализ активности мутантных молекул тмРНК с помощью „генетической системы".

5.10.2. Определение активности молекул тмРНК с помощью гибридного фага МттР22.

5.10.3. Аминоацилирование тмРНК.

5.11. Получение S30 экстракта.

5.12. Выделение комплекса тмРНК, взаимодействующей с рибосомой.

5.12.1. Выделение комплекса тмРНК, взаимодействующей с рибосомой.

5.12.2. Выделение суммарной РНК комплекса.

5.12.3. Выделение суммарных белков комплекса.

5.13. Фотоаффинное химическое сшивание тмРНК.

5.13.1. Синтез тмРНК с помощью Т7-РНК-полимеразы.

5.13.2. Синтез 4-тиоуридин содержащей тмРНК с помощью Т7-РНК-полимеразы.

5.13.3. Фотоаффинное химическое сшивание тмРНК с фактором элонгации Ти или с S100 экстрактом.

5.13.4. Внутримолекулярное фотоаффинное химическое сшивание тмРНК .95 5.14. Анализ продуктов сшивания.

5.14.1. Анализ белкового компонента сшивки.95'

5.14.2. Анализ продуктов сшивания с помощью реакции обратной транскрипции

5.14.3. Гидролиз тмРНК с помощью РНКазы Н.

ВЫВОДЫ.

Разнообразные РНК и РНК-белковые комплексы необходимы для протекания большого числа клеточных процессов. Так, например, биосинтез белка происходит на рибосоме большом рибонуклеопротеидном комплексе. В этом процессе принимают участие также мРНК и тРНК, которые по ходу действия формируют функциональные комплексы с различными белковыми компонентами аминоацил-тРНК-синтетазами, факторами трансляции. В 1996 году было показано участие в трансляции тмРНК уникальной молекулы, сочетающей в себе активность как тРНК, так и мРНК. тмРНК основной участник процесса транс-трансляции, т.е. переключения синтеза белка с мРНК на мРНКподобную часть тмРНК. Первоначально считалось, что этот механизм позволяет освободить рибосомы, „арестованные" на З-конце матричной РНК, лишенной стопкодона, и внести на С-конец недосинтезированных белков сигнальную ферментами процессинга, последовательность (тагирование белков), тем самым направить их на деградацию с помощью специфических протеаз клетки. Однако дальнейшие исследования показали, что в клетках транс-трансляция может происходить и при возникновении паузы трансляции, например, при появлении в А участке рибосомы кодона, соответствующего антикодону редкой тРНК, или при низкой эффективности терминации. В настоящее время детальной информации о молекулярном механизме транстрансляции и о механизме взаимодействия тмРНК с рибосомой не существует. Данная работа посвящена структурно-функциональному исследованию транспортно- матричной РНК Escherichia соН. Поскольку собственно тмРНК посвящено несколько современных обзоров, мы решили включить в настоящую диссертацию обзор литературы, охватывающий различные аспекты терминации трансляции и конкурирующих с ней процессов.Терминация трансляции и процессы, конкурирующие с ней /Обзор литературы/ 3.1.Терминация трансляции Трансляция это один из фундаментальных процессов, протекающих в живой клетке. В ходе него рибосома переводит генетическую информацию, закодированную в последовательности нуклеотидов мРНК, в последовательность аминокислот. В трансляции принято выделять три стадии инициацию, элонгацию и терминацию, на каждой из которых рибосома взаимодействует с определенными белковыми факторами. Так терминация трансляции происходит благодаря совместной работе нескольких белковых факторов. Долгое время изучение именно стадии терминации трансляции было одной из наиболее трудных задач в молекулярной биологии. Недавние успехи в области кристаллографии, рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии макромолекул, участвующих в трансляции, смогли приоткрыть завесу в понимании механизма терминации трансляции и детальной роли факторов терминации. 3.1.1. Историческая справка Существование стоп- или нонсенс-кодонов как „носителей информации о границах генов" постулировал Крик в 1961 году [1]. Экспериментально нонсенс мутации (появление стоп-кодонов) и их супрессорные мутации впервые обнаружили в системе бактерия-фаг [2]. Позже все три нонсенс-кодона: UAA, UAG [3] и UGA [4] были идентифицированы. Данные кодоны не кодировали аминокислот [5], а их присутствие в мРНК служило сигналом для освобождения полипептида из рибосомы в системе трансляции in vitro [6]. Механизм узнавания стоп-кодонов и собственоо терминации трансляции долгое время оставался непонятным. Впервые в 1965 году было показано, что освобождение синтезированнного полипептида из рибосомы происходит не с помощью определенной терминирующей тРНК, а требует участия кодон-специфичных декодирующих белковых факторов, названных позднее факторами терминации. 8 бактериях стоп-кодоны узнаются специфическими белковыми факторами названными позднее факторами терминации трансляции I класса [7], один из которых имеет специфичность к UAA и UAG (RF1), а второй к UAA и UGA (RF2) [8]. Позднее был обнаружен третий фактор терминации RF3 [9,10], который не имел специфичности к какому-либо кодону, но стимулировал активность факторов RF1 и RF2 in vitro. 3.1.2. Терминация трансляции. Общие сведения. Терминация трансляции финальная стадия биосинтеза белка происходит в три этапа: (1) освобождение новосинтезированного белка в ответ на появление стопсигнала в А участке рибосомы, (2) диссоциация факторов терминации из посттерминационного комплекса, и (3) диссоциация рибосомы на субчастицы для последующего раунда трансляции. Эти три этапа терминации очень четко

выводы

1. ССА-конец тмРНК не участвует в формировании неканонического комплекса с EF-Tu-GDP.

2. Результаты фотоаффинного внутримолекулярного сшивания свидетельствуют в пользу существования в молекуле тмРНК двух структурных доменов.

3. Предложена гипотетическая схема взаимодействия тмРНК с рибосомой в процессе транс-трансляции.

4. Методом сайт-направленного мутагенеза показана важность нуклеотидов 85-86UA и 300-301UA для функционирования тмРНК.

5. Разработана система селекции /о vivo функционально активных молекул тмРНК.

6. Получены комплексы тмРНК с рибосомой на разных этапах трансляции мРНК-подобной части тмРНК.

1. Crick, F.H., Barnett, L., Brenner, S. & Watts-Tobin, R.J. General nature of the genetic code for proteins. Nauchni Tr. Vissh. Med. Inst. Sofiia. 192, 1227-1232 (1961).

2. Brenner, S., Stretton, A.O.W. & Kaplan, S. Genetic code: the 'nonsense' triplets for chain termination and their suppression. Nature 206, 994-998 (1965).

3. Weigert, M.G. & Garen, A. Base composition of non-sense codons in E.coli. Nature 206, 992(1965).

4. Brenner, S., Barnett, L., Katz, E.R. & Crick, F.H.C. UGA: A third nonsense triplet in the genetic code. Nature 213, 449-450 (1967).

5. Khorana, H.G. et al. Polynucleotide synthesis and the genetic code, in Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. XXXI 39-49 (Cold Spring Harbour Laboratory of Quantitative Biology, New York, 1966).

6. Takanami, M. & Yan, Y. The release of polypeptide chains from ribosomes in cell-free amino acid-incorporating systems by specific combinations of bases in synthetic polyribonucleotides. Proc. N.A.S. 54, 1450-1458 (1965).

7. Capecchi, M.R. Polypeptide chain termination in vitro: isolation of a release factor. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 58,1144-1151 (1967).

8. Scolnick, E., Tompkins, R., Caskey, T. & Nirenberg, M. Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc. Nat. Acad. Sci., USA. 61, 768-774 (1968).

9. Milman, G., Goldstein, J., Scolnick, E. & Caskey, T. Peptide chain termination. III. Stimulation of in vitro termination. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 63, 183-190 (1969).

10. Goldstein, J.L. & Caskey, C.T. Peptide chain termination: effect of protein S on ribosomal binding of RFs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67, 537-?. (1970).

11. Arkov, A.L., Mankin, A. & Murgola, E.J. An rRNA Fragment and Its Antisense Can Alter Decoding of Genetic Information. J. Bacteriol. 180, 2744-2748 (1998).

12. Arkov, A.L. & Murgola, E.J. Ribosomal RNAs in translation termination: facts and hypotheses. Biochemistry (Mosc) 64, 1354-9 (1999).

13. Green, R. & Noller, H.F. Ribosomes and translation. Annu. Rev. Biochem. 66, 679-716(1997).

14. Velichutina, I.V., Hong, J.Y., Mesecar, A.D., Chernoff, Y.O. & Liebman, S.W. Genetic interaction between yeast Saccharomyces cerevisiae release factors and the decoding region of 18 S rRNA. J. Mot. Biol. 305, 715-727 (2001).

15. Poole, E. & Tate, W. Release factors and their role as decoding proteins: specificity and fidelity for termination of protein synthesis. Biochim Biophys Acta 1493, 1 -11 (2000).

16. Chavatte, L., Frolova, L., Kisselev, L. & Favre, A. The polypeptide chain release factor eRF1 specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes. Eur. J. Biochem. 268, 2896-904 (2001).

17. Chavatte, L., Seit-Nebi, A., Dubovaya, V. & Favre, A. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRF1 in the ribosome. EMBO J 21, 5302-5311 (2002).

18. Ivanov V, Beniaminov A , Mikheyev A & E, M. Hypothesis A mechanism for stop codon recognition by the ribosome: A bioinformatic approach. RNA 7, 1683-1692 (2001).

19. Kisselev, L., Ehrenberg, M. & Frolova, L. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? EMBO J. 22, 175-182. (2003).

20. Moffat, J.G., Timms, K.M., Trotman, C.N.A. & Tate, W.P. Interaction of the Release Factors with the Escherichia co/i Ribosome Structurally and Functionally-Important Domains. Biochimie 73, 1113-1120 (1991).

21. Moffat, J.G., Donly, B.C., Mccaughan, K.K. & Tate, W.P. Functional Domains in the Escherichia coli Release Factors Activities of Hybrids Between RF-1 and RF-2. Eur. J. Biochem. 213, 749-756 (1993).

22. Moffat, J.G. & Tate, W.P. A single proteolytic cleavage in release factor 2 stabilizes ribosome binding and abolishes peptidyl-tRNA hydrolysis activity. J. Biol. Chem. 269, 18899-18903(1994).

23. Nakamura, Y., Ito, K. & Isaksson, L.A. Emerging understanding of translation termination. Cell 87, 147-150 (1996).

24. Bulygin, K.N. et al. Positioning of the mRNA stop signal with respect to polypeptide chain release factors and ribosomal proteins in 80S ribosomes. FEBS Lett. 514, 96101 (2002).

25. Nakamura, Y. & Ito, К. How protein reads the stop codon and terminates translation. Genes Cells 3, 265-278. (1998).

26. Bertram, G., Bell, H.A., Ritchie, D.W., Fullerton, G. & Stansfield, I. Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRF1 functions in stop codon recognition. RNA 6, 1236-47. (2000).

27. Frolova, L., Seit-Nebi, A. & Kisselev, L. Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRF1. RNA 8, 129136 (2002).

28. Seit-Nebi, A., Frolova, L. & Kisselev, L. Conversion of omnipotent translation termination factor eRF1 into ciliate-like UGA-only unipotent eRF1. EMBO Rep. 3, 881-886 (2002).

29. Ogle, J.M. et al. Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science 292, 897-902 (2001).

30. Velichutina, I.V. et al. Mutations in helix 27 of the yeast Saccharomyces cerevisiae 18S rRNA affect the function of the decoding center of the ribosome. RNA 6, 11741184 (2000).

31. Fraser, C.M. et al. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science 270, 397-403(1995).

32. Inamine, J.M., К. Ho, S. Loechel & Hu, P. Evidence that UGA is read as tryptophan rather than stop by Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma gallisepticum. J. Bacteriol. 172, 504-506 (1990).

33. Caskey, C.T., Forrester, W.C., Tate, W. & Ward, C.D. Cloning of the Escherichia coli release factor 2 gene. J. Bacteriol. 158, 365-168 (1984).

34. Weiss, R.B., Murphy, J.P. & Gallant, J.A. Genetic screen for cloned release factor genes. J. Bacteriol. 158, 362-364 (1984).

35. Frolova, L. et al. A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties of polypeptide chain release factor. Nature 372, 701-703 (1994).

36. Bult, C.J. et al. Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcusjannaschii. Science 273, 1058-1073 (1996).

37. Smith, D.R. et al. Complete genome sequence of Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH: functional analysis and comparative genomics. J. Bacteriol. 179, 7135-55. (1997).

38. Klenk, H.P. et al. The complete genome sequence of the hyperthermophilic, sulphate-reducing archaeon Archaeoglobus fulgidus. Nature 390, 364-370 (1997).

39. Dontsova, M. et al. Translation termination factor aRF1 from the archaeon Methanococcus jannaschii is active with eukaryotic ribosomes. FEBS Lett. 472, 213216. (2000).

40. Liu, D. et al. Solution structure of a TBP-TAF(11)230 complex: protein mimicry of the minor groove surface of the TATA box unwound by TBP. Cell 94, 573-583 (1998).

41. Savva, R. & Pearl, L.H. Nucleotide mimicry in the crystal structure of the uracil-DNA glycosylase-uracil glycosylase inhibitor protein complex. Nat. Struct. Biol. 2, 752-757 (1995).

42. Mol, C.D. et al. Crystal structure of human uracil-DNA glycosylase in complex with a protein inhibitor: protein mimicry of DNA. Cell 82, 701-708 (1995).

43. Nissen, P. et al. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, anda GTP analog. Science 270, 1464-1472 (1995).

44. Ito, K., Ebihara, K., Uno, M. & Nakamura, Y. Conserved motifs in prokaryotic and eukaryotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5443-5448 (1996).

45. Wilson, K.S. & Noller, H.F. Mapping the Position of Translational Elongation Factor EF-G in the Ribosome by Directed Hydroxyl Radical Probing. Cell 92, 131-139 (1998).

46. Agrawal, R., Penczek, P., Grassucci, R. & Frank, J. Visualization of elongation factor

47. G on The Escherichia coli 70S ribosome: The mechanism of translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6134 6138 (1998).

48. Selmer, M., Al-Karadaghi, S., Hirakawa, G., Kaji, A. & Liljas, A. Crystal structure of Thermotoga maritima ribosome recycling factor: A tRNA mimic. Science 286, 23492352 (1999).

49. Frolova, L. et al. Mutations in the highly conserved GGQ motif of class 1 polypeptide ^ release factors abolish the ability of human eRF1 to trigger peptidyl-tRNA hydrolysis.1. RNA 5, 1014-1020(1999).

50. Ito, K., Uno, M. & Nakamura, Y. A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA. Nature 403, 680-4. (2000).

51. Kervestin, S., Frolova, L., Kisselev, L. & Jean-Jean, O. Stop codon recognition in ciliates: Euplotes release factor does not respond to reassigned UGA codon. EMBO Rep. 2, 680-684 (2001).

52. Vestergaard, B. et al. Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRF1. Mol. Cell 8,1375-1382 (2001).

53. Rawat, U.B. et al. A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factor RF2. Nature 421, 87-90 (2003).

54. Caskey, C.T., Beaudet, A.L., Scolnick, E.M. & Rosman, M. Hydrolysis of f-Met-tRNA by peptidyl transferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 3163-3167. (1971).

55. Polacek, N. et al. The critical role of the universally conserved A2602 of 23S ribosomal RNA in the release of the nascent peptide during translation termination. Mol. Cell 11,103-112(2003).

56. Freistroffer, D.V., Pavlov, M.Y., MacDougall, J., Buckingham, R.H. & Ehrenberg, M. Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J. 16, 4126-4133 (1997).

57. Wilson, P.G. & Cuthbertson, M.R. SUF12 suppressor protein in yeast, a fusion protein related to the EF-1 family of elongation factors. J. Mol. Biol. 199, 559-573 (1988).

58. Zhouravleva, G. et al. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRF1 and eRF3. EMBO J14, 40654072 (1995).

59. Stansfield, I. et al. The products of the SUP45 (eRF1) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J14, 4365-4373 (1995).

60. Ito, K., Ebihara, K. & Nakamura, Y. The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRF1 is a primary binding site for eRF3 of fission yeast. RNA 4, 958-972 (1998).

61. Merkulova, T.I., Frolova, L.Y., Lazar, M., Camonis, J. & Kisselev, L.L. C-terminal domains of human translation termination factors eRF1 and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett. 443, 41-47. (1999).

62. Buckingham, R.H., Grentzmann, G. & Kisselev, L. Polypeptide chain release factors. Mol. Microbiol. 24, 449-456 (1997).

63. Kisselev, L.L. & Buckingham, R.H. Translational termination comes of age. Trends Biochem. Sci. 25, 561-566 (2000).

64. Zavialov, A.V., Buckingham, R.H. & Ehrenberg, M. A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell 107, 115-124 (2001).

65. Grentzmann, G., Brechemierbaey, D., Heurgue, V., Mora, L. & Buckingham, R.H. Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91, 5848-5852 (1994).

66. Mikuni, O. et al. Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad .Sci. USA 91, 5798-5802 (1994).

67. Kushnirov, V.V. et al. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene 66, 45-54 (1988).

68. Grentzmann, G. et al. Release factor RF-3 GTPase activity acts in disassembly of the ribosome termination complex. RNA 4, 973-983 (1998).

69. Frolova, L. et al. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRF1- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA 2, 334-341 (1996).

70. Hoshino, S. et al. Molecular cloning of a novel member of the eukaryotic polypeptide chain- releasing factors (eRF). Its identification as eRF3 interacting with eRF1. J. Biol. Chem. 273, 22254-22259. (1998).

71. Jakobsen, C.G., Segaard, T.M., Jean-Jean, O., Frolova, L. & Justesen, J. Identification of a novel termination release factor eRF3b expressing the eRF3 activity in vitro and in vivo. Mol Biol (Mosk) 35, 672-681 (2001).

72. Hoshino, S. et al. Novel function of the eukaryotic polypeptide-chain releasing factor 3 (eRF3/GSPT) in the mRNA degradation pathway. Biochemistry (Moscow) 64,136772. (1999).

73. Cosson, В. et al. Poly(A)-binding protein and eRF3 are associated in vivo in human and Xenopus cells. Biol. Cell. 94, 205-216 (2002).

74. Paulin, F.E., Campbell, L.E., O'Brien, K., Loughlin, J. & Proud, C.G. Eukaryotic translation initiation factor 5 (elF5) acts as a classical GTPase-activator protein. Curr. Biol. 11, 55-59 (2001).

75. Scheffzek, K„ Klebe, C., Fritzwolf, K., Kabsch, W. & Wittinghofer, A. Crystal structure of the nuclear Ras-related protein Ran in its GDP-bound form. Nature 374, 378-381 (1995).

76. Scheffzek, K. et al. Structural analysis of the GAP-related domain from neurofibroma and its implications. EMBO J17, 4313-4327 (1998).

77. Karimi, R., Pavlov, M., Buckingham, R. & Ehrenberg, M. Novel roles for classical factors at the interface between translation termination and initiation. Mol. Cell 3, 601-609(1999).

78. Ishino, T. et al. Interaction of ribosome recycling factor and elongation factor EF-G with E. coli ribosomes studied by the surface plasmon resonance technique. Genes to Cells 5, 953-963. (2000).

79. Schilling-Bartetzko, S., Franceschi, F., Sternbach, H. & Nierhaus, K.H. Apparent Association Constants of Transfer RNAs for the Ribosomal A-Site, P-Site, and E-Site. J. Biol. Chem. 267, 4693-4702 (1992).

80. Brierley, I. Ribosomal frameshifting on viral RNAs. J. Gen. Virol. 76, 1885-18921995).

81. Farabaugh, PJ. Programmed translational frameshifting. Microbiol. Rev. 60,103-1341996).

82. Fbtterer, J., Kisslaszlo, Z. & Hohn, T. Nonlinear Ribosome Migration on Cauliflower Mosaic Virus-35S RNA. Cell 73, 789-802 (1993).

83. Maia, I.G., Seron, K., Haenni, A.L. & Bernardi, F. Gene expression from viral RNA genomes. Plant Mol. Biol. 32, 367-391 (1996).

84. Chandler, M. & Fayet, O. Translational Frameshifting in the Control of Transposition in Bacteria. Mol. Microbiol. 7, 497-503 (1993).

85. Tsuchihashi, Z. Translational Frameshifting in the Escherichia-Coli dnaX Gene Invitro. Nucleic Acids Res 19, 2457-2462 (1991).-4:

86. Tsuchihashi, Z. & Brown, P.O. Sequence Requirements for Efficient Translational Frameshifting in the Escherichia co//-dnaX Gene and the Role of an Unstable Interaction Between transfer RNA(Lys) and an AAG Lysine Codon. Gene Develop. 6, 511-519(1992).

87. Jacks, T. & Varmus, H.E. Expression of the Rous Sarcoma virus pol gene by ribosomal frameshifting. Science 230,1237-1242. (1985).

88. Jacks, Т., Madhani, H.D., Masiarz, F.R. & Varmus, H.E. Signals for ribosomal frameshifting in the Rous Sarcoma virus gag pol region. Celi 55, 447-458. (1988).

89. Weiss, R.B., Dunn, D.M., Shuh, M., Atkins, J.F. & Gesteland, R.F. E. coli ribosomes Re-phase on retroviral frameshift signals at rates ranging from 2 to 50 percent. The New Biologist 1, 159-169 (1989).

90. Garcia, A., Vanduin, J. & Pleij, C.W.A. Differential Response to Frameshift Signals in Eukaryotic and Prokaryotic Translational Systems. Nucleic Acids Res 21, 401-406 (1993).

91. Jacks, Т., Townsley, K., Varmus, H.E. & Majors, J. Two efficient ribosomal frameshifting events are required for synthesis of mouse mammary tumor virus gag related polyproteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4298-4302. (1987).

92. Jacks, T. et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV 1 gag pol expression. Nature 331, 280-283. (1988).

93. Sekine, Y. & Ohtsubo, E. DNA sequences required for translational frameshifting in production of the transposase encoded by IS1. Mol Gen Genet 235, 325-32 (1992).

94. Parkin, N.T., Chamorro, M. & Varmus, H.E. Human Immunodeficiency Virus Type-1 gag-pol Frameshifting Is Dependent on Downstream messenger RNA Secondary Structure Demonstration by Expression in vivo. J. Virol. 66, 5147-5151 (1992).

95. Marczinke, В., Fisher, R., Vidakovic, M., Bloys, A.J. & Brierley, I. Secondary structure and mutational analysis of the ribosomal frameshift signal of rous sarcoma virus. J. Mol. Biol. 284, 205-225 (1998).

96. Tu, C.L., Tzeng, Т.Н. & Bruenn, J.A. Ribosomal Movement Impeded at a Pseudoknot Required for Frameshifting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 34-38 (1992).

97. Somogyi, P., Jenner, A.J., Brierley, I. & Inglis, S.C. Ribosomal Pausing During Translation of an RNA Pseudoknot. Mol. Cell. Biol. 13, 6931-6940 (1993).

98. Hatfield, D.L., Levin, J.G., Rein, A. & Oroszalan, S. Translational Suppression in Retroviral Gene Expression. Advances in Virus Research 41, 193-239 (1992).

99. Carlson, B.A. et al. Transfer RNA modification status influences retroviral ribosomal frameshifting. Virology 255, 2-8 (1999).

100. Brierley, I., Meredith, M.R., Bloys, A.J. & Hagervall, T.G. Expression of a coronavirus ribosomal frameshift signal in Escherichia colt Influence of tRNA anticodon modification on frameshifting. J. Mol. Biol. 270, 360-373 (1997).

101. Cassan, M., Delaunay, N., Vaquero, C. & Rousset, J.P. Translational Frameshifting at the GAG-Pol Junction of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Is Not Increased in Infected T-Lymphoid Cells. J Virol 68, 1501-1508 (1994).

102. Reil, H., Hoxter, M., Moosmayer, D., Pauli, G. & Hauser, H. CD4 expressing human 293 cells as a tool for studies in HIV-1 replication: The efficiency of translational frameshifting is not altered by HIV-1 infection. Virology 205, 371-375 (1994).

103. Craigen, W.J. & Caskey, T. Expression of peptide chain release factor 2 requires a high efficiency frameshift. Nature 322, 273-275. (1986).

104. Belcourt, M.F. & Farabaugh, P.J. Ribosomal Frameshifting in the Yeast Retrotransposon Ту Transfer-RNAs Induce Slippage on a 7-Nucleotide Minimal Site. Cell 62, 339-352 (1990).

105. Matsufuji, S. et al. Autoregulatory frameshifting in decoding mammalian ornithine decarboxylase antizyme. Cell 80, 51-60 (1995).

106. Ivanov, I.P., Matsufuji, S., Murakami, Y., Gesteland, R.F. & Atkins, J.F. Conservation of polyamine regulation by translational frameshifting from yeast to mammals. EMBO J19, 1907-1917(2000).