Генетический и биохимический анализ сборки РНК-полимеразы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ДНК-ЗАВИСИМЫЕ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ: СТРУКТУРА И МЕЖСУБЪЕДИНИЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Общие сведения о транскрипционном цикле.

1.1.1. Инициация транскрипции.

1.1.2. Элонгация транскрипции.

1.1.3. Терминация транскрипции.

1.2. Кристаллические структуры многосубъединичных

РНК-пол имераз.

1.2.1. Кристаллическая структура РНК-полимеразы II Saccharomyces cerevisiae.

1.2.2. Кристаллическая структура РНК-полимеразы Thermus aquaticus.

1.2.3. Кристаллическая структура РНК-полимеразы E.coli.

1.3. Сравнение кристаллических структур многосубъединичных РНК-полимераз.

1.4. Взаимодействия между а- и ß-субъединицами

РНК-полимеразы E.coli.

1.4.1. Структура, доменная организация и функции а-субъединицы РНК-полимеразы E.coli.

1.4.2. Структура, доменная организация и функции ß-субъединицы РНК-полимеразы E.coli.

1.5. Краткое описание метода двухгибридного анализа.

2. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СБОРКИ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ).

2.1. Определение взаимодействий между а- и ß-субъединицами РНК-полимеразы E.coli двухгибридным методом.

2.2. Определение минимального фрагмента ß-субъединицы РНК-полимеразы E.coli, взаимодействующего с а-субъединицей.

2.3. Определение консервативных районов ß-субъединицы РНК-полимеразы E.coli, взаимодействующих друг с другом, двухгибридным методом анализа.

2.4. Структурный анализ результатов двухгибридного метода по a-ß и ß-ß взаимодействиям.

2.5. Точечные мутации в консервативных районах Н и I ß-субъединицы РНК-полимеразы E.coli, влияющие на связывание с a-субъединицей in vivo и in vitro.

2.6. Эволюционный консерватизм взаимодействия между гомологами а- и ß-субъединиц РНК-полимераз.

2.7. Определение минимального субкомплекса РНК-полимеразы E.coli, содержащего функционально активный сайт связывания инициирующего нуклеотида.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ВЫВОДЫ.

Актуальность темы. Одним из главных направлений исследований в современной молекулярной биологии является изучение механизмов генетической экспрессии в клетке. Транскрипция—синтез РНК на ДНК-матрице—первый и самый важный этап генетической экспрессии. Именно на этапе транскрипции происходит до 80% всех регуляторных событий, контролирующих экспрессию клеточного генома. Транскрипция осуществляется особым классом ферментов—ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. Установление механизмов действия и регуляции РНК-полимеразы является ключевой задачей молекулярных биологов с момента открытия фермента С.Вайсом в 1959 году.

РНК-полимеразы всех живых организмов—от бактерий до человека— многосубъединичные белки, имеющие эволюционно консервативную аминокислотную последовательность и гомологичную пространственную организацию [1-6]. Прокариоты и археи (архебактерии) имеют только один вид РНК-полимеразы, тогда как в эукариотических организмах содержатся три различных фермента: РНК-полимеразы I, II и III. В каждой многосубъединичной РНК-полимеразе можно выделить субьединицы, составляющие транскрипционно компетентный кор-фермент, и субьединицы, модулирующие действие кор-фермента. Кор-фермент прокариотических РНК-полимераз содержит одну ß'-субьединицу, одну ß-субьединицу, две а-субьединицы и одну со-субьединицу. Кор РНК-полимеразы архей и эукариот содержат субьединицы, гомологичные вышеперечисленным, в таком же соотношении плюс дополнительные субьединицы.

Относительная простота организации транскрипционного аппарата и лёгкость выделения прокариотических РНК-полимераз определили их роль модельных систем при изучении транскрипции. Бактериальная РНК-полимераза собирается из отдельных субъединиц in vivo и in vitro в соответствии со следующей схемой [7, 8]: ß> а+а-► а2 ► a2ß a2ßß'co кор-фермент

Индивидуальные субъединицы РНК-полимеразы не обладают парциальными функциями целого фермента [9]. Следовательно, функциональные сайты фермента формируются либо аллостерически при сборке белка, либо в районах контактов нескольких субъединиц. По этой причине установление взаимодействий, которые происходят внутри самих субъединиц, на экспонированных поверхностях отдельных субъединиц и в районах контакта нескольких субъединиц, важно для познания механизмов действия и регуляции РНК-полимеразы.

Настоящая работа посвящена изучению взаимодействий между а- и (3-субъединицами РНК-полимеразы Escherichia coli и РНК-полимераз I и III дрожжей Saccharomyces cerevisiae с применением молекулярно-генетических и биохимических методов.

Цель работы и задачи исследования. Целью данной работы явилось установление структурных детерминант а- и (3-субъединиц РНК-полимеразы Е. coli, взаимодействующих в процессе образования агР-комплекса; а также установление парциальных биохимических функций интермедиата агр. В работе ставились следующие задачи: (1) определение наименьшего фрагмента Р-субъединицы, взаимодействующего с а-субъединицей в составе агР-комплекса; (2) получение точечных мутаций в а- и в Р-субъединицах, нарушающих а-р взаимодействие; (3) определение участков внутри Р-субъединицы, которые взаимодействуют друг с другом и имеют важное значение при сборке интермедиата агР; (4) установление эволюционного консерватизма во взаимодействиях а- и Р-субъединиц прокариотических и эукариотических РНК-полимераз; (5) изучение взаимодействия индивидуальной Р-субъединицы и агР-комплекса РНК-полимеразы E.coli с инициирующим пуриновым нуклеотидом методом аффинного мечения. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что наименьшим фрагментом Р-субъединицы РНК-полимеразы E.coli, взаимодействующим с а-субъединицей в процессе образования интермедиата агР, является фрагмент, содержащий аминокислотные остатки с положения 800 по 1231. Установлено, что существует необходимое для связывания с а-субъединицей взаимодействие между консервативными районами F и I Р-субъединицы РНК-полимеразы E.coli. Определены детерминанты в Р-субъединице РНК-полимеразы E.coli, ответственные за связывание с а-субъединицей при образовании агР-комплекса. Впервые показан эволюционный консерватизм взаимодействия между гомологами а и Р-субъединиц эукариотических и прокариотических РНК-полимераз. Установлено, что пурин-специфичный инициаторный сайт фермента (сайт инициации транскрипции) полностью сформирован в индивидуальной р-субъединице и в агР-комплексе РНК-полимеразы E.coli.

Практическая ценность настоящей работы заключается в разработке экспериментальной системы для изучения взаимодействий между субъединицами

РНК-полимераз с использованием метода двухгибридного анализа. Полученные в работе данные важны для понимания структурного и эволюционного аспектов белок-белковых взаимодействий в составе многосубъединичных ферментов. Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения полученных результатов и их обсуждения, материалов и методов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 104 страницах машинописного текста и содержит 37 рисунков и 6 таблиц. Библиография содержит 195 публикаций.

выводы

1. Показано, что наименьшим фрагментом ß-субъединицы РНК-полимеразы E.coli, взаимодействующим с ос-субъединицей, является фрагмент, содержащий аминокислотные остатки с положения 800 по 1231.

2. Установлено взаимодействие между консервативными районами F и I ß-субъединицы РНК-полимеразы E.coli, являющееся необходимым для связывания с а-субъединицей в процессе образования с^-комплекса. Взаимодействие между консервативными районами F и I ß-субъединицы может вносить стабилизационный вклад в образование ß-структуры.

3. Определены одиночные аминокислотные замены в первичной структуре фрагмента 800-1231 ß-субъединицы, приводящие к нарушению взаимодействия между а- и ß-субъединицами РНК-полимеразы E.coli. Такими аминокислотными остатками являются Aspl084 и Glyl215.

4. Установлено, что мутации в ß-субъединице РНК-полимеразы E.coli (Aspl084Ala и Glyl215Asp), нарушающие взаимодействие с а-субъединицей, являются летальными. Структурно-гомологичная мутация во второй большой субъединице дрожжей (Asp935Arg в AI35 субъединице) не нарушает важных функций дрожжевой РНК-полимеразы I.

5. Установлен эволюционный консерватизм взаимодействия между гомологами а- и ß-субъединиц эукариотических и прокариотических РНК-полимераз. В дрожжевой РНК-полимеразе I AI35 субъединица (аналог ß-субъединицы РНК-полимеразы E.coli) взаимодействует с субъединицей АС40 в составе гетеродимера АС40/АС19 (аналога димера а-субъединицы РНК-полимеразы E.coli).

6. Показано, что Asp935 А135 субъединицы дрожжевой РНК-полимеразы I, являющийся гомологом Aspl084 ß-субъединицы РНК-полимеразы E.coli, напрямую участвует в связывании с гетеродимером АС40/АС19.

7. Показано, что сайт связывания инициирующего пуринового нуклеотида сформирован и функционален в составе как индивидуальной (3-субъединицы, так и в аг|3-комплексе РНК-полимеразы Е.соН.

1. Archambault, J. and Friesen, J.D. Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III. (1993) Microbiol Rev, 57, pp. 703-724.

2. Allison, L.A., Moyle, M., Shales, M., and Ingles, C,J. Extensive homology among the largest subunits of eukaryotic and prokaryotic RNA polymerases. (1985) Cell, 42, pp. 599-610.

3. Biggs, J., Searles, L.L., and Greenleaf, A.L. Structure of the eukaryotic transcription apparatus: features of the gene for the largest subunit of Drosophila RNA polymerase II. (1985) Cell, 42, pp. 611-621.

4. Sweetser, D., Nonet, M., and Young, R.A. Prokaryotic and eukaryotic RNA polymerases have homologous core subunits. (1987) Proc Natl Acad Sci USA, 84, pp. 1192-1196.

5. Zillig, W., Mailhammer, R., Skorko, R., and Rohrer, H. Covalent structural modification of DNA-dependent RNA polymerase as a means for transcriptional control. (1977) Curr Top Cell Regul, 12, pp. 263-271.

6. Kumar, S.A. and Krakow, J.S. Studies on the product binding sites of the Azotobacter vinelandii ribonucleic acid polymerase. (1975) J Biol Chem, 250, pp. 2878-2884.

7. McClure, W.R. Rate-limiting steps in RNA chain initiation. (1980) Proc Natl Acad Sci USA, 77, pp. 5634-5638.

8. Metzger, W., Schickor, P., and Heumann, H. A cinematographic view of Escherichia coli RNA polymerase translocation. (1989) Embo J, 8, pp. 2745-2754.

9. Steitz, T.A. Structural studies of protein-nucleic acid interaction: the sources of sequence-specific binding. (1990) QRev Biophys, 23, pp. 205-280.

10. Uptain, S., M., Kane, C., M. and Chamberlin, M., J. Basic mechanisms of transcript elongation and its regulation. (1997) Annu. Rev. Biochem., 66, pp. 117-172.

11. Steitz, T.A. A mechanism for all polymerases news; comment., (1998) Nature, 391, pp. 231-232.

12. Nudler, E. Transcription elongation: structural basis and mechanisms. (1999)JMol Biol, 288, pp. 1-12.

13. Schickor, P., Metzger, W., Werel, W., Lederer, H., and Heumann, H. Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli. (1990) Embo J, 9, pp. 22152220.

14. Mecsas, J., Cowing, D.W., and Gross, C.A. Development of RNA polymerase-promoter contacts during open complex formation. (1991) J Mol Biol, 220, pp. 585597.

15. Zaychikov, E., Denissova, L., Meier, T., Gotte, M., and Heumann, H. Influence of Mg2+ and temperature on formation of the transcription bubble. (1997) J Biol Chem, 272, pp. 2259-2267.

16. Suh, W.C., Ross, W., and Record, M.T., Jr. Two open complexes and a requirement for Mg2+ to open the lambda PR transcription start site. (1993) Science, 259, pp. 358-361.

17. Keene, R.G. and Luse, D.S. Initially transcribed sequences strongly affect the extent of abortive initiation by RNA polymerase II. (1999) J Biol Chem, 274, pp. 11526-11534.

18. Holstege, F.C., Fiedler, U., and Timmers, H.T. Three transitions in the RNA polymerase II transcription complex during initiation. (1997) Embo J, 16, pp. 74687480.

19. Hansen, U.M. and McClure, W.R. Role of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase in initiation. II. Release of sigma from ternary complexes. (1980) J Biol Chem, 255, pp. 9564-9570.

20. Krummel, B. and Chamberlin, M.J. RNA chain initiation by Escherichia col RNA polymerase. Structural transitions of the enzyme in early ternary complexes. (1989) Biochemistry, 28, pp. 7829-7842.

21. Gelles, J. and Landick, R. RNA polymerase as a molecular motor. (1998)Ce//, 93, pp.13-16.

22. Rhodes, G. and Chamberlin, M.J. Ribonucleic acid chain elongation by Escherichia coli ribonucleic acid polymerase. I. Isolation of ternary complexes and the kinetics of elongation. (1974) J Biol Chem, 249, pp. 6675-6683.

23. Mooney, R.A., Artsimovitch, I., and Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. (1998) JBacteriol, 180, pp. 3265-3275.

24. Nudler, E., Avetissova, E., Markovtsov, V., and Goldfarb, A. Transcription processivity: protein-DNA interactions holding together the elongation complex see comments. (1996) Science, 273, pp. 211-217.

25. Nudler, E., Mustaev, A., Lukhtanov, E., and Goldfarb, A. The RNADNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase. (1997) Cell, 89, pp. 33-41.

26. Komissarova, N. and Kashlev, M. RNA polymerase switches between inactivated and activated states By translocating back and forth along the DNA and the RNA. (1997) J Biol Chem, 272, pp. 15329-15338.

27. Komissarova, N. and Kashlev, M. Functional topography of nascent RNA in elongation intermediates of RNA polymerase. (1998) Proc Natl Acad Sci USA, 95, pp. 14699-14704.

28. Sidorenkov, I., Komissarova, N., and Kashlev, M. Crucial role of the RNA:DNA hybrid in the processivity of transcription. (1998) Mol Cell, 2, pp. 55-64.

29. Nudler, E., Gusarov, I., Avetissova, E., Kozlov, M., and Goldfarb, A. Spatial organization of transcription elongation complex in Escherichia coli. (1998) Science, 281, pp. 424-428.

30. Kainz, M. and Roberts, J. Structure of transcription elongation complexes in vivo. (1992) Science, 255, pp. 838-841.

31. Lee, D.N. and Landick, R. Structure of RNA and DNA chains in paused transcription complexes containing Escherichia coli RNA polymerase. (1992) J Mol Biol, 228, pp. 759-777.

32. Yager, T.D.a.v.H., P. H., Transcript elongation and termination in Escherichia coli. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium. 1987, Washington, DC: American Society for Microbiology. 1241-1275.

33. Heumann, H., Zaychikov, E., Denissova, L. and Hermann, T. Translocation of DNA-dependent E. coli RNA polymerase during RNA synthesis. (1997) Nucleic Asid and Molecular Biology, 11.

34. Nudler, E., Kashlev, M., Nikiforov, V., and Goldfarb, A. Coupling between transcription termination and RNA polymerase inchworming. (1995) Cell, 81, pp. 351-357.

35. Wang, D., Meier, T.I., Chan, C.L., Feng, G., Lee, D.N., and Landick, R. Discontinuous movements of DNA and RNA in RNA polymerase accompany formation of a paused transcription complex. (1995) Cell, 81, pp. 341-350.

36. Richardson, L.V. and Richardson, J.P. Rho-dependent termination of transcription is governed primarily by the upstream Rho utilization (rut) sequences of a terminator. (1996) J Biol Chem, 271, pp. 21597-21603.

37. Kashlev, M., Nudler, E., Goldfarb, A., White, T., and Kutter, E. Bacteriophage T4 Ale protein: a transcription termination factor sensing local modification of DNA. (1993) Cell, 75, pp. 147-154.

38. Xie, Z. and Price, D.H. Purification of an RNA polymerase II transcript release factor from Drosophila. (1996) J Biol Chem, 271, pp. 11043-11046.

39. Lang, W.H., Morrow, B.E., Ju, Q., Warner, J.R., and Reeder, R.H. A model for transcription termination by RNA polymerase I. (1994) Cell, 79, pp. 527-534.

40. Maraia, R.J. Transcription termination factor La is also an initiation factor for RNA polymerase III. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93, pp. 3383-3387.

41. Zhang, G., Campbell, E.A., Minakhin, L., Richter, C., Severinov, K., and Darst, S.A. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution see comments. (1999) Cell, 98, pp. 811-824.

42. Fu, J., Gnatt, A.L., Bushnell, D.A., Jensen, G.J., Thompson, N.E., Burgess, R.R., David, P.R., and Romberg, R.D. Yeast RNA polymerase II at 5 A resolution see comments., (1999) Cell, 98, pp. 799-810.

43. Mooney, R.A. and Landick, R. RNA polymerase unveiled comment. (1999)Ce//, 98, pp. 687-690.

44. Young, R., A. RNA polymerase II. (\99l)Annu. Rev. Biochem., 60, pp. 689-715.

45. Lalo, D., Carles, C., Sentenac, A., and Thuriaux, P. Interactions between three common subunits of yeast RNA polymerases I and III. (1993) Proc Natl Acad Sci USA, 90, pp. 5524-5528.

46. Svetlov, V., Nolan, K., and Burgess, R.R. Rpb3, stoichiometry and sequence determinants of the assembly into yeast RNA polymerase II in vivo. (1998) J Biol Chem, 273, pp. 10827-10830.

47. Miyao, T., Yasui, K., Sakurai, H., Yamagishi, M., and Ishihama, A. Molecular assembly of RNA polymerase II from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe: subunit-subunit contact network involving Rpb5. (1996) Genes Cells, 1, pp. 843-854.

48. Acker, J., de Graaff, M., Cheynel, I., Khazak, V., Kedinger, C., and Vigneron, M. Interactions between the human RNA polymerase II subunits. (1997)/Biol Chem, 272, pp.16815-16821.

49. Ishiguro, A., Kimura, M., Yasui, K., Iwata, A., Ueda, S., and Ishihama,A. Two large subunits of the fission yeast RNA polymerase II provide platforms for the assembly of small subunits. (1998) JMolBiol, 279, pp. 703-712.

50. Yasui, K., Ishiguro, A., and Ishihama, A. Location of subunit-subunit contact sites on RNA polymerase II subunit 3 from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. (1998) Biochemistry, 37, pp. 5542-5548.

51. Kimura, M., Ishiguro, A., and Ishihama, A. RNA polymerase II subunits 2, 3, and 11 form a core subassembly with DNA binding activity. (1997) J Biol Chem, 272, pp. 25851-25855.

52. Miyao, T., Honda, A., Qu, Z., and Ishihama, A. Mapping of Rpb3 and Rpb5 contact sites on two large subunits, Rpbl and Rpb2, of the RNA polymerase II from fission yeast. (1998) Mol Gen Genet, 259, pp. 123-129.

53. Edwards, A.M., Darst, S.A., Feaver, W.J., Thompson, N.E., Burgess, R.R., and Kornberg, R.D. Purification and lipid-layer crystallization of yeast RNA polymerase II. (1990) Proc Natl Acad Sci US A,SI, pp. 2122-2126.

54. McKune, K., Richards, K.L., Edwards, A.M., Young, R.A., and Woychik, N.A. RPB7, one of two dissociable subunits of yeast RNA polymerase II, is essential for cell viability. (1993) Yeast, 9, pp. 295-299.

55. Woychik, N.A. and Young, R.A. RNA polymerase II subunit RPB4 is essential for high- and low- temperature yeast cell growth. (1989) Mol Cell Biol, 9, pp. 28542859.

56. Darst, S.A., Kubalek, E.W., Edwards, A.M., and Kornberg, R.D. Two-dimensional and epitaxial crystallization of a mutant form of yeast RNA polymerase II. (1991)«/ Mol Biol, 221, pp. 347-357.

57. Darst, S.A., Edwards, A.M., Kubalek, E.W., and Kornberg, R.D. Three dimensional structure of yeast RNA polymerase II at 16 A resolution. (1991) Cell, 66, pp. 121-128.

58. Polyakov, A., Severinova, E., and Darst, S.A. Three-dimensional structure of E. coli core RNA polymerase: promoter binding and elongation conformations of the enzyme. (1995) Cell, 83, pp. 365-373.

59. Asturias, F.J., Meredith, G.D., Poglitsch, C.L., and Kornberg, R.D. Two conformations of RNA polymerase II revealed by electron crystallography. (1997) J Mol Biol, 272, pp. 536-540.

60. Meredith, G.D., Chang, W.H., Li, Y., Bushnell, D.A., Darst, S.A., and Romberg, R.D. The C-terminal domain revealed in the structure of RNA polymerase II.1996) JMolBiol, 258, pp. 413-419.

61. Poglitsch, C.L., Meredith, G.D., Gnatt, A.L., Jensen, G.J., Chang, W.H., Fu, J., and Kornberg, R.D. Electron crystal structure of an RNA polymerase II transcription elongation complex see comments. (1999) Cell, 98, pp. 791-798.

62. Leuther, K.K., Bushnell, D.A., and Kornberg, R.D. Two-dimensional crystallography of TFIIB- and IIE-RNA polymerase II complexes: implications for start site selection and initiation complex formation. (1996) Cell, 85, pp. 773-779.

63. Asturias, F.J. and Kornberg, R.D. Protein crystallization on lipid layers and structure determination of the RNA polymerase II transcription initiation complex. (1999) J Biol Chem, 274, pp. 6813-6816.

64. Rice, G.A., Chamberlin, M.J., and Kane, C.M. Contacts between mammalian RNA polymerase II and the template DNA in a ternary elongation complex. (1993) Nucleic Acids Res, 21, pp. 113-118.

65. Fu, J., Gerstein, M., David, P.R., Gnatt, A.L., Bushnell, D.A., Edwards, A.M., and Kornberg, R.D. Repeated tertiary fold of RNA polymerase II and implications for DNA binding. (1998) JMolBiol, 280, pp. 317-322.

66. Reeder, T.C. and Hawley, D.K. Promoter proximal sequences modulate RNA polymerase II elongation by a novel mechanism. (1996) Cell, 87, pp. 767-777.

67. Zaychikov, E., Martin, E., Denissova, L., Kozlov, M., Markovtsov, V., Kashlev, M., Heumann, H., Nikiforov, V., Goldfarb, A., and Mustaev, A. Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. (1996) Science, 273, pp. 107-109.

68. Mustaev, A., Kozlov, M., Markovtsov, V., Zaychikov, E., Denissova, L., and Goldfarb, A. Modular organization of the catalytic center of RNA polymerase.1997) Proc Natl Acad Sci USA, 94, pp. 6641-6645.

69. Rees, W.A., Keller, R.W., Vesenka, J.P., Yang, G., and Bustamante, C. Evidence of DNA bending in transcription complexes imaged by scanning force microscopy. (1993) Science, 260, pp. 1646-1649.

70. Darst, S.A., Polyakov, A., Richter, C., and Zhang, G. Insights into Escherichia coli RNA polymerase structure from a combination of x-ray and electron crystallography. (1998) J Struct Biol, 124, pp. 115-122.

71. Naryshkin, N., Revyakin, A., Kim, Y., Mekler, V., and Ebright, R.H. Structural organization of the RNA polymerase-promoter open complex. (2000) Cell, 101, pp. 601-611.

72. Wang, Y., Severinov, K., Loizos, N., Fenyo, D., Heyduk, E., Heyduk, T., Chait, B.T., and Darst, S.A. Determinants for Escherichia coli RNA polymerase assembly within the beta subunit. (1997) J Mol Biol, 270, pp. 648-662.

73. Igarashi, K. and Ishihama, A. Bipartite functional map of the E. coli RNA polymerase alpha subunit: involvement of the C-terminal region in transcription activation by cAMP-CRP. (1991) Cell, 65, pp. 1015-1022.

74. Blatter, E.E., Ross, W., Tang, H., Gourse, R.L., and Ebright, R.H. Domain organization of RNA polymerase alpha subunit: C-terminal 85 amino acids constitute a domain capable of dimerization and DNA binding. (1994) Cell, 78, pp. 889-896.

75. Jeon, Y.H., Yamazaki, T., Otomo, T., Ishihama, A., and Kyogoku, Y. Flexible linker in the RNA polymerase alpha subunit facilitates the independent motion of the C-terminal activator contact domain. (1997) J Mol Biol, 267, pp. 953-962.

76. Zhang, G. and Darst, S.A. Structure of the Escherichia coli RNA polymerase alpha subunit amino- terminal domain. (1998) Science, 281, pp. 262-266.

77. Markov, D., Naryshkina, T., Mustaev, A., and Severinov, K. A zinc-binding site in the largest subunit of DNA-dependent RNA polymerase is involved in enzyme assembly. (1999) Genes Dev, 13, pp. 2439-2448.

78. Darst, S.A., Ribi, H.O., Pierce, D.W., and Kornberg, R.D. Twodimensional crystals of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme on positively charged lipid layers. (1988)JMol Biol, 203, pp. 269-273.

79. Darst, S.A., Kubalek, E.W., and Kornberg, R.D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. (1989) Nature, 340, pp. 730-732.

80. Darst, S.A., Polyakov, A., Richter, C., and Zhang, G. Structural studies of Escherichia coli RNA polymerase. (1998) Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 63, pp. 269-276.

81. Opalka, N., Mooney, R.A., Richter, C., Severinov, K., Landick, R., and Darst, S.A. Direct localization of a beta-subunit domain on the three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase. (2000) Proc Natl Acad Sei USA, 97, pp. 617622.

82. Schultz, P., Celia, H., Riva, M., Sentenac, A., and Oudet, P. Three-dimensional model of yeast RNA polymerase I determined by electron microscopy of two-dimensional crystals. (1993) Embo J, 12, pp. 2601-2607.

83. Negishi, T., Fujita, N., and Ishihama, A. Structural map of the alpha subunit of Escherichia coli RNA polymerase: structural domains identified by proteolytic cleavage. (1995) J Mol Biol, 248, pp. 723-728.

84. Gaal, T., Ross, W., Blatter, E.E., Tang, H., Jia, X., Krishnan, V.V., AssaMunt, N. Ebright, R.H., and Gourse, R.L. DNA-binding determinants of the alpha subunit of RNA polymerase: novel DNA-binding domain architecture. (1996) Genes Dev, 10, pp.16-26.

85. Jeon, Y.H., Negishi, T., Shirakawa, M., Yamazaki, T., Fujita, N., Ishihama, A., and Kyogoku, Y. Solution structure of the activator contact domain of the RNA polymerase alpha subunit. (1995) Science, 270, pp. 1495-1497.

86. Ross, W., Gosink, K.K., Salomon, J., Igarashi, K., Zou, C., Ishihama, A., Severinov, K., and Gourse, R.L. A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase. (1993) Science, 262, pp. 1407-1413.

87. Zhou, Y., Merkel, T.J., and Ebright, R.H. Characterization of the activating region of Escherichia coli catabolite gene activator protein (CAP). II. Role at Class I and class II CAP-dependent promoters. (1994) J Mol Biol, 243, pp. 603-610.

88. Zhou, Y., Pendergrast, P.S., Bell, A., Williams, R., Busby, S., and Ebright, R.H. The functional subunit of a dimeric transcription activator protein depends on promoter architecture. (1994) Embo J, 13, pp. 4549-4557.

89. Ishihama, A. Protein-protein communication within the transcription apparatus. (1993) JBacteriol, 175, pp. 2483-2489.

90. Russo, F.D. and Silhavy, T.J. Alpha: the Cinderella subunit of RNA polymerase.1992) J Biol Chem, 267, pp. 14515-14518.

91. Chen, Y., Ebright, Y.W., and Ebright, R.H. Identification of the target of a transcription activator protein by protein-protein photocrosslinking. (1994) Science, 265, pp. 90-92.

92. Zou, C., Fujita, N., Igarashi, K., and Ishihama, A. Mapping the cAMP receptor protein contact site on the alpha subunit of Escherichia coli RNA polymerase. (1992) Mol Microbiol, 6, pp. 2599-2605.

93. Tang, H., Severinov, K., Goldfarb, A., Fenyo, D., Chait, B., and Ebright, R.H. Location, structure, and function of the target of a transcriptional activator protein.1994) Genes Dev, 8, pp. 3058-3067.

94. Ebright, R.H. and Busby, S. The Escherichia coli RNA polymerase alpha subunit: structure and function. (1995) Curr Opin Genet Dev, 5, pp. 197-203.

95. Igarashi, K., Fujita, N., and Ishihama, A. Identification of a subunit assembly domain in the alpha subunit of Escherichia coli RNA polymerase. (1991) J Mol Biol, 218, pp. 1-6.

96. Hayward, R.S., Igarashi, K., and Ishihama, A. Functional specializaion within the alpha-subunit of Escherichia coli RNA polymerase. (1991) J Mol Biol, 221, pp. 2329.

97. Kimura, M., Fujita, N., and Ishihama, A. Functional map of the alpha subunit of Escherichia coli RNA polymerase. Deletion analysis of the amino-terminal assembly domain. (1994) J Mol Biol, 242, pp. 107-115.

98. Kawakami, K. and Ishihama, A. Defective assembly of ribonucleic acid polymerase subunits in a temperature-sensitive alpha-subunit mutant of Escherichia coli. (1980) Biochemistry, 19, pp. 3491-3495.

99. Igarashi, K., Fujita, N., and Ishihama, A. Sequence analysis of two temperature-sensitive mutations in the alpha subunit gene (rpoA) of Escherichia coli RNA polymerase. (1990) Nucleic Acids Res, 18, pp. 5945-5948.

100. Kimura, M. and Ishihama, A. Functional map of the alpha subunit of Escherichia coli RNA polymerase: amino acid substitution within the amino-terminal assembly domain. (1995) J Mol Biol, 254, pp. 342-349.

101. Kimura, M. and Ishihama, A. Functional map of the alpha subunit of Escherichia coli RNA polymerase: insertion analysis of the amino-terminal assembly domain. (1995) J Mol Biol, 248, pp. 756-767.

102. Kimura, M. and Ishihama, A. Subunit assembly in vivo of Escherichia coli RNA polymerase: role of the amino-terminal assembly domain of alpha subunit. (1996) Genes Cells, 1, pp. 517-528.

103. Niu, W., Kim, Y., Tau, G., Heyduk, T., and Ebright, R.H. Transcription activation at class II CAP-dependent promoters: two interactions between CAP and RNA polymerase. (1996) Cell, 87, pp. 1123-1134.

104. Busby, S. and Ebright, R.H. Transcription activation at class II CAP-dependent promoters. (1997) Mol Microbiol, 23, pp. 853-859.

105. Severinov, K., Mustaev, A., Severinova, E., Kozlov, M., Darst, S.A., and Goldfarb, A. The beta subunit Rif-cluster I is only angstroms away from the active center of Escherichia coli RNA polymerase. (1995) J Biol Chem, 270, pp. 29428-29432.

106. Severinov, K., Mooney, R., Darst, S.A., and Landick, R. Tethering of the large subunits of Escherichia coli RNA polymerase. (1997) J Biol Chem, 272, pp. 2413724140.

107. Falkenburg, D., Dworniczak, B., Faust, D.M., and Bautz, E.K. RNA polymerase II of Drosophila. Relation of its 140,000 Mr subunit to the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. (1987) J Mol Biol, 195, pp. 929-937.

108. Berghofer, B., Krockel, L., Kortner, C., Truss, M., Schallenberg, J., and Klein, A. Relatedness of archaebacterial RNA polymerase core subunits to their eubacterial and eukaryotic equivalents. (1988) Nucleic Acids Res, 16, pp. 8113-8128.

109. Severinov, K., Mustaev, A., Kashlev, M., Borukhov, S., Nikiforov, V., and Goldfarb, A. Dissection of the beta subunit in the Escherichia coli RNA polymerase into domains by proteolytic cleavage. (1992) J Biol Chem, 267, pp. 12813-12819.

110. Landick, R., Colwell, A., and Stewart, J. Insertional mutagenesis of a plasmid borne Escherichia coli rpoB gene reveals alterations that inhibit beta-subunit assembly into RNA polymerase. (1990) JBacteriol, 111, pp. 2844-2854.

111. Polyakov, A., Nikiforov, V., and Goldfarb, A. Disruption of substrate binding site in E. coli RNA polymerase by lethal alanine substitutions in carboxy terminal domain ofthe beta subunit. (1999) FEBS Lett, 444, pp. 189-194.

112. Glass, R.E., Jones, S.T., and Ishihama, A. Genetic studies on the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. VII. RNA polymerase is a target for ppGpp. (1986) Mol Gen Genet, 203, pp. 265-268.

113. Glass, R.E., Honda, A., and Ishihama, A. Genetic studies on the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. IX. The role of the carboxy-terminus in enzyme assembly. (1986) Mol Gen Genet, 203, pp. 492-495.

114. Glass, R.E., Ralphs, N.T., Fujita, N., and Ishihama, A. Assembly of amber fragments of the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase (1988) Eur J Biochem, 176, pp. 403-407.

115. Coggins, J.R., Lumsden, J., and Malcolm, A.D. A study of the quaternary structure of Escherichia coli RNA polymerase using bis(imido esters). (1977) Biochemistry, 16, pp.1111-1116.

116. Korzheva, N., Mustaev, A., Kozlov, M., Malhotra, A., Nikiforov, V., Goldfarb, A., and Darst, S.A. A structural model of transcription elongation. (2000) Science, 289, pp. 619-625.

117. McClure, W.R. and Cech, C.L. On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis. (1978) J Biol Chem, 253, pp. 8949-8956.

118. Wehrli, W. Kinetic studies of the interaction between rifampicin and DNA-dependent RNA polymerase of Escherichia coli. (1977) Eur J Biochem, 80, pp. 325-330.

119. Jin, D.J., Walter, W.A., and Gross, C.A. Characterisation of the termination phenotypes of rifampicin-resistant mutants. (1988)JMol Biol, 202, pp. 245-253.

120. Jin, D.J. and Gross, C.A. Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance. (1988) J Mol Biol, 202, pp. 45-58.

121. Jin, D.J. and Gross, C.A. RpoB8, a rifampicin-resistant termination-proficient RNA polymerase, has an increased Km for purine nucleotides during transcription elongation. (1991) J Biol Chem, 266, pp. 14478-14485.

122. Landick, R., Stewart, J., and Lee, D.N. Amino acid changes in conserved regions of the beta-subunit of Escherichia coli RNA polymerase alter transcription pausing and termination. (1990) Genes Dev, 4, pp. 1623-1636.

123. Simpson, R.B. The molecular topography of RNA polymerase-promoter interaction. (1979) Cell, 18, pp. 277-285.

124. Nakamura, Y., Kurihara, T., Saito, H., and Uchida, H. Sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase affects the function of lambda N gene. (1979) Proc Natl Acad Sei USA, 76, pp. 4593-4597.

125. Severinov, K. and Darst, S.A. A mutant RNA polymerase that forms unusual open promoter complexes. (1997) Proc Natl Acad Sei USA, 94, pp. 13481-13486.

126. Tavormina, P.L., Reznikoff, W.S., and Gross, C.A. Identifying interacting regions in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. (1996) J Mol Biol, 258, pp. 213-223.

127. Lee, J., Kashlev, M., Borukhov, S., and Goldfarb, A. A beta subunit mutation disrupting the catalytic function of Escherichia coli RNA polymerase. (1991) Proc Natl Acad Sei USA, 88, pp. 6018-6022.

128. Nomura, T., Fujita, N., and Ishihama, A. Mapping of subunitsubunit contact surfaces on the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. (1999) Biochemistry, 38, pp. 1346-1355.

129. Li, B. and Fields, S. Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two-hybrid system. (1993) Faseb J, 7, pp. 957-963.

130. Van Aelst, L., Barr, M., Marcus, S., Polverino, A., and Wigler, M. Complex formation between RAS and RAF and other protein kinases. (1993) Proc Natl Acad Sei USA, 90, pp. 6213-6217.

131. Gross, C.A., Chan, C., Dombroski, A., Gruber, T., Sharp, M., Tupy J., and Young, B. The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. (1998) Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 63, pp. 141-155.

132. Dove, S.L. and Hochschild, A. Use of artificial activators to define a role for protein-protein and protein-DNA contacts in transcriptional activation. (1998) Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 63, pp. 173-180.

133. Hu, J.C., Kornacker, M.G., and Hochschild, A. Escherichia coli on© and two-hybrid systems for the analysis and identification of protein-protein interactions. (2000) Methods, 20, pp. 80-94.

134. Ma, J. and Ptashne, M. A new class of yeast transcriptional activators. (1987)CW/, 51, pp. 113-119.

135. Chien, C.T., Bartel, P.L., Sternglanz, R., and Fields, S. The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. (1991) Proc Natl Acad Sci USA, 88, pp. 9578-9582.

136. Fields, S. and Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. (1989) Nature, 340, pp. 245-246.

137. Fields, S. and Sternglanz, R. The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions. (1994) Trends Genet, 10, pp. 286-292.

138. Brent, R. and Ptashne, M. A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor. (1985) Cell, 43, pp. 729-736.

139. Hope, I.A. and Struhl, K. Functional dissection of a eukaryotic transcriptional activator protein, GCN4 of yeast. (1986) Cell, 46, pp. 885-894.

140. Keegan, L., Gill, G., and Ptashne, M. Separation of DNA binding fom the transcription-activating function of a eukaryotic regulatory protein. (1986) Science, 231, pp. 699-704.

141. Dang, C.V., Barrett, J., Villa-Garcia, M., Resar, L.M., Kato, G.J., and Fearon, E.R. Intracellular leucine zipper interactions suggest c-Myc hetero- oligomerization. (1991) Mol Cell Biol, 11, pp. 954-962.

142. Durfee, T., Becherer, K., Chen, P.L., Yeh, S.H., Yang, Y., Kilburn, A.E., Lee, W.H., and Elledge, S.J. The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit. (1993) Genes Dev, 7, pp. 555-569.

143. Vojtek, A.B., Hollenberg, S.M., and Cooper, J.A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. (1993) Cell, 74, pp. 205-214.

144. Dalton, S. and Treisman, R. Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. (1992) Cell, 68, pp. 597-612.

145. Zervos, A.S., Gyuris, J., and Brent, R. Mxil, a protein that specifically interacts with Max to bind Myc-Max recognition sites published erratum appears in Cell 1994 Oct 21 ;79(2):following 388. (1993) Cell, 72, pp. 223-232.

146. Chevray, P.M. and Nathans, D. Protein interaction cloning in yeast: identification of mammalian proteins that react with the leucine zipper of Jun. (1992) Proc Natl AcadSci USA, 89, pp. 5789-5793.

147. Sagitov, V., Nikiforov, V., and Goldfarb, A. Dominant lethal mutations near the 5' substrate binding site affect RNA polymerase propagation. (1993) J Biol Chem, 268, pp. 2195-2202.

148. Nedea, E.C., Markov, D., Naryshkina, T., and Severinov, K. Localization of Escherichia coli rpoC mutations that affect RNA polymerase assembly and activity at high temperature. (1999)JBacteriol, 181, pp. 2663-2665.

149. Severinov, K., Soushko, M., Goldfarb, A., and Nikiforov, V. Rifampicin region revisited. New rifampicin-resistant and streptolydigin-resistant mutants in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. (1993) J Biol Chem, 268, pp. 1482014825.

150. Ulmasov, T., Larkin, R.M., and Guilfoyle, T.J. Association between 36- and 13.6-kDa alpha-like subunits of Arabidopsis thaliana RNA polymerase II. (1996) J Biol Chem, 271, pp. 5085-5094.

151. Nogi, Y., Yano, R., and Nomura, M. Synthesis of large rRNAs by RNA polymerase II in mutants of Saccharomyces cerevisiae defective in RNA polymerase I. (1991) Proc Natl AcadSci USA, 88, pp. 3962-3966.

152. Wu, C.W. and Goldthwait, D.A. Studies of nucleotide binding to the ribonucleic acid polymerase by equilibrium dialysis. (1969)Biochemistry, 8, pp. 4458-4464.

153. Wu, C.W. and Goldthwait, D.A. Studies of nucleotide binding to the ribonucleic acid polymerase by a fluoresence technique. (1969) Biochemistry, 8, pp. 44504458.

154. Borukhov, S. and Goldfarb, A. Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly. (1993) Protein Expr Purif, 4, pp. 503-511.

155. Maniatis T., Fritch E.F., and R.S., H., Molecular cloning: a laboratory manual. 1984, Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Press.

156. Zhou, Y.H., Zhang, X.P., and Ebright, R.H. Random mutagenesis of gene-sized DNA molecules by use of PCR with Taq DNA polymerase. (1991) Nucleic Acids Res, 19, pp. 6052.