Структуры некоторых мутантных генов rpoB, кодирующих бета-субъединицу РНК-полимеразы Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ВВВДЕНИЕ.

ГЛАВА I. СТРУКТУРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).

I. Структурно-генетический подход.Краткие

П. Структурно-генетические исследования гроВС оперона Escherichia coli. 10

A. Локализация и исследование организации гроВС оперона. 10

B. Исследование взаимодействия РНК-поли-меразы 'E.coli с антибиотиками и вирусными белками, инактивирующими фермент. 15

1. Взаимодействие с рифампицином. 15

2. Взаимодействие со стрептолидигином. 20

3. Взаимодействие с липиармицином и тиолутином. 22

4. Взаимодействие с белком гена 2 бактериофага Т7. 24

C. Структурно-генетические исследования взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с компонентами реакции транскрипции на разных этапах процесса in vitro. 25

1. Основные этапы процесса транскрипции. Краткие сведения. 25

2. Исследование взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами. 27

3. Структурно-генетические исследования процессов инициации и элонгации транскрипции. 29

4. Структурно-генетические 'исследования процесса терминации транскрипции. 31

5. Структурно-генетические исследования механизмов регуляции транскрипции. 31

A. Взаимодействие РНК-полимеразы с белками-регуляторами . 31

B. Координация процессов транскрипции и трансляции. 35

C. Координация процессов транскрипции и репликации. 39

ГЛАВА П. СТРУКТУРА НЕКОТОРЫХ МУТАНТШХ ГЕНОВ гроВ, ESCHERICHIA COLI, КОДМРУЩИХ J3 -СУБЪВДИ-НЩУ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ). 41

A. Получение и селекция мутаций устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотикам риф-ампицину и стрептолидигину в составе гена гроВ. 43

B. Препаративное выделение фрагментов гена гроВ мутантного типа. 46

C. Установление первичной структуры фрагментов гена гроВ мутантного типа. 48

1) Определение первичной структуры EcoRl-C фрагментов гена гроВ, несущих мутации гроВ1001, гроВ1016 и гроБ1017. 49

2) Установление первичной структуры EcoRI-G фрагмента, несущего мутацию гроВ1019. 53

3) Определение первичной структуры .EcoRl-c фрагмента гена гроВ, несущего stl-r мутацию гроВЮ18. 57

Д. Локализация мутаций. Анализ характера локализованных замен. 60

1) Локализация и анализ расположения и характера мутаций рифампицин-устойчивости.60

2) Локализация мутации устойчивости РНК-по-лимеразы к антибиотику стрептолидигину.70

Е. Локализация функционально важных участков в составе р -субъединицы РНК-полимеразы

E.coli.71

ГЛАВА Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.79

I. Материалы.79

A. Реактивы.79

B. Ферменты.79

C. Генетические материалы.80

Д. Растворы.80

1. Буферные растворы.80

2. Среды и сопутствующие растворы.81

3. Растворы для выделения плазмид.82

4. Растворы с красителями.82

5. Растворы для проведения химической модификации.83

6. Растворы для метода терминирующих аналогов трифосфатов.83

7. Смеси для приготовления ПААГ.84

8. Фотографические растворы и материалы.85

П. Оборудование.86

Ш. Методы.86

I) Приготовление гелей. Электрофорез.86

A. Заливка ПААГ. Условия электрофореза в ПААГ.86

B. Приготовление агарозных гелей. Условия электрофореза.87

2) Выращивание клеток рекомбинантных штаммов. 88

3) Выделение плазмидной ДНК.88

4) Выделение фрагментов ДНК из рекомбинантных плазмид.90

5) Обработка ДНК по методу Максама-Гилберта. 91

A. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.91

B. Введение концевой радиоактивной метки.92

C. Выделение меченых фрагментов ДНК.93

Д. Получение полинуклеотидов, меченных по одному концу.94

Е. Специфическая химическая деградация ДНК.95

Р. Электрофорез в структурных ПМГ.96

6) Определение первичной структуры ДНК методом терминирующих аналогов трифосфатов.97

A. Приготовление вектора.97

B. Приготовление гидролизата ДНК.97

C. Лигирование.98

Д. Трансфекция компетентных клеток.99

Е. Идентификация рекомбинантных клонов.100

Р. Наращивание фага и выделение фаговой

ДНК.100

G. Идентификация клонированных фрагментов ДНК.101

H. Проведение реакций.101

ВЫВОДЫ.103

Список сокращений.104

Литература.105

ВВЕДЕНИЕ

Глубокое понимание молекулярных основ жизнедеятельности клетки невозможно без всестороннего структурно-функционального исследования процесса транскрипции, осуществляемого ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Настоящая работа является частью структурно-функциональных исследований ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. coli, проводимых на протяжении ряда лет в лабораториях химии белка и биотехнологии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина совместно с лабораторией молекулярных основ генетики Института молекулярной генетики АН СССР. Эти исследования привели к определению полной первичной структуры кор-фер-мента /1,2,3/, идентификации субъединиц, контактирующих с РНК-продуктом в активном транскрипционном комплексе /4/, и локализации ряда мутаций рифампицин-устойчивости в гене гроВ, кодирующем J5 -субъединицу фермента /5,6/.

Локализация мутаций устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотикам (а в общем случае и другим ингибиторам активности фермента) является одним из редких подходов, позволяющим изучать механизмы, приводящие к нарушению работы активного центра.Целью данной работы являлось установление первичной структуры гена гроВ, кодирующего р-субъединицу пяти мутантных полимераз, устойчивых к действию антибиотиков рифампицина или стрептолидиги-на. Метод локализации мутаций включал определение первичной структуры EcoRl-c или EcoRi-G фрагментов гена гроВ мутантного типа (по методике Максама-Гилберта) и выявление аминокислотных замен путем сравнения со структурами фрагментов гена дикого типа.

Работа осуществлялась совместно с лабораторией молекулярных основ генетики ИМГ АН СССР, где были получены штаммы бактерий, несущих указанные мутации. Полученные результаты позволяют еделать предположения, касающиеся третичной структуры р -субъединицы РНК-полимеразы и взаимного расположения в ней функционально важных участков фермента.

Автор выражает сердечную благодарность ст.н.сотр. Г.С. Монастырской и к.х.н. С.О. Гурьеву за помощь, оказанную в процессе работы.

выводы

1. Определены нуклеотидные последовательности пяти мутант-ных фрагментов гена гроВ, кодирующего jg -субъединицу РНК-поли-меразы, выделенных из четырех независимо полученных штаммов Escherichia coli, устойчивых к антибиотику рифампицину, и одного штамма, обладавшего устойчивостью к стрептолидигину (в сумме около 9 ^тыс. п.о.).

2. Сравнением полученных последовательностей со структурой гена дикого типа локализованы три rif-r мутации в центральной части гроВ гена, две из которых оказались идентичными заменами

516 526

Asp —»-Asn, а третья - заменой His-' —»-Туг, а также необычная rif-r мутация в и-концевой части в -субъединицы, представляю

1 4.6 щая собой замену Vai ^ —Локализована также мутация стреп

544 толидигин устойчивости, оказавшаяся двойной заменой Gly ■—•-Asp, Phe5^5—»-Ser в районе расположения большей части известных rif-r мутаций.

3. Полученные результаты позволяют высказать предположения о локализации функционально важных участков в составе j3 -субъединицы РНК-полимеразы E.coli и постулировать пространственную близость центрального района j3 -полипептида с его N- и С-кон-цевыми участками.