Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

004616507

московский государственный университет имени м. в. ломоносова

Химический факультет

О № правах рукописи

КРЮЧКОВА ПОЛИНА НИКОЛАЕВНА

РАСПОЗНАВАНИЕ СТОП-КОДОНОВ ФАКТОРАМИ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ ЭУКАРИОТ

02.00.10 - биоорганическая химия

автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2010

- 9 дек 2010

004616507

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова и в лаборатории структурно-функциональной геномики Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,

академик РАН [Л. Л. Киселёв|

кандидат биологических наук Е.З.Алкадаева

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

И.Н. Шатский

кандидат физ.-мат. наук К.С. Василенко

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится « 21 » декабря 2010 г. в 17.00 на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 19 ноября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тсрминация трансляции у эукариот и прокариот изучена значительно хуже, чем предшествующие стадии белкового синтеза - инициация и элонгация. В значительной степени это было связано с отсутствием адекватного метода определения активности факторов терминации траплсяции. Однако ситуация принципиально изменилась с разработкой новой тест-системы, которая позволяет анализировать отдельно каждую из 3-х основных стадий трансляции, получать претерминационпый и терминационный комплексы и изучать роль каждого из компонентов системы отдельно и в любом сочетании.

Терминация трансляции у эукариот осуществляется факторами терминации еКР 1 и еКРЗ. еКР1 распознает стоп-кодоны иАА, 11АО и 1ГОА и индуцирует гидролиз пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы. Про функцию еМ^ известно, что этот белок содержит ГТФ/ГДФ-связывающий домен и взаимодействует с С-концевым доменом еЫЧ, а также является еЫЧ- и рибосомозависимой ГТФазой. еКЛ человека состоит из трех доменов (К, М и С), что коррелирует с тремя различными функциями этого белка - распознавание стоп-кодона (И домен), индукция гидролиза пептидил-тРНК (М домен) и связывание с сКРЗ (М и С домены). До сих пор не определены точно структурные элементы доменов еШЧ, которые отвечают за выполнение той или иной функции белка, хотя некоторые предварительные гипотезы в литературе были высказаны. В течение последних десяти лет различные группы исследователей пытаются решить проблему декодирования стоп-сигналов в рибосоме, однако для эукариот это до сих пор не удалось. Опубликованные недавно кристаллические структуры бактериальных рибосом в комплексе с факторами терминации ЯП/2 позволили идентифицировать аминокислотные остатки в бактериальных факторах терминации 1-ого класса, сближенные со стоп-кодонами, и, таким образом, выявить сайты их узнавания. Поскольку у эукариот всего один фактор терминации 1-ого класса, который узнает все три стоп-кодона, то, вероятно, механизмы распознавания стоп-кодонов в рибосоме у про- и эукариот различны. Так как до сих пор не получено кристаллической структуры эукариотической рибосомы, не говоря уже о терминационных комплексах, лучшим из возможных подходов для решения проблемы декодирования стоп-сигналов у эукариот является сайт-направленный мутагенез фактора еМЧ с последующим тестированием функциональной активности полученных мутантов.

Цель и задачи исследования

Целью работы стала идентификация участков фактора терминации трансляции eRFl человека, ответственных за узнавание стоп-кодонов. Сформулированы следующие задачи исследования:

1) Выявить аминокислотные остатки в N домене eRFl человека, ответственные за узнавание стоп-кодонов

2) Выяснить роль С домена eRFl человека в узнавании стоп-кодонов

3) Выяснить роль eRF3 человека в дискриминации стоп-кодонов

4) Определить влияние З'-контекста стоп-кодонов на эффективность терминации трансляции.

Научная новизна и практическая значимость работы

Узнавание стоп-кодонов фактором eRFl эукариот - один ключевых процессов, понимание механизма которого чрезвычайно важно для создания теоретической и экспериментальной базы данных РНК-белковых взаимодействий и изучения работы трансляционного аппарата клетки. В работе была использована полностью реконструированная in vitro система трансляции эукариот. Применение этой максимально приближенной к природной системы позволяет избежать ряда ограничений, накладываемых другими методами исследования.

Методом сайт-направленного мутагенеза получен широкий спектр точечных мутаций N-концевого домена eRFl человека. В ходе работы проанализировано около ста мутантяых факторов более чем по 40 положениям в N домене eRFl человека и выявлены ключевые аминокислотные остатки, ответственные за узнавание каждого из нуклеотидов в стоп-кодонах. На основе этого предложена модель узнавания стоп-кодонов фактором терминации трансляции эукариот eRFl. Исследована также роль фактора eRF3 человека в узнавании стоп-кодонов. Показано, что eRF3 стимулирует работу eRFl и обладает корректирующей активностью в отношении его мутактных форм.

Кроме того на основании полученной нашими коллегами ЯМР-структуры С домена eRFl человека, в нем были выбраны позиции для сайт-направленного мутагенеза и подтверждена гипотеза о влиянии петли 357-367 eRFl человека на узнавание стоп-кодонов. Поскольку высказывалось предположение о том, что эта петля взаимодействует с З'-контекстом стоп-кодонов, был получен набор мРНК, содержащих наиболее и наименее распространенные в геноме человека контексты стоп-кодонов. На этих мРНК были собраны претерминационные комплексы и показано влияние GC-состава З'-контекста стоп-кодона на эффективность терминации трансляции.

Результаты данной работы существенно углубляют понимание молекулярных механизмов термииации белкового синтеза у эукариот. Кроме того, изучение структурных и функциональных особенностей eRFl позволит в будущем разрабатывать новые методы коррекции наследственных дефектов и лечения различных заболеваний, связанных с преждевременной терминацией синтеза белка в клетке, которые вызваны появлением нонсенс-мутаций в кодирующей части мРНК. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались па следующих конференциях: международной конференции «Ломоносов 2009», Москва, Россия, 1318 апреля 2009 г.; международной конференции «Химическая биология -фундаментальные проблемы бионанотехнологии», Новосибирск, Россия 10-14 июня, 2009 г.; международной конференции «Protein Synthesis and Translational Control», Хайдельберг, Германия, 9-13 сентября 2010 г., международном форуме по нанотехиологиям, Москва, Россия, 6-8 октября 2010 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 117 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, материалы и методы, и выводы. Материал иллюстрирован 31 рисунком и 7 таблицами. Библиографический указатель включает 158 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ранее стоп-кодон-зависимую терминационную активность eRFI оценивали двумя методами: измерением уровня сквозного прочтения стоп-кодонов и в in vitro тесте на RF-активность. Достоинством этих методов является их относительная простота, однако оба они имеют существенные ограничения. В первом методе - это присутствие эндогенных eRFl/cRF3 в клеточных культурах, а также малая разница между фоновым и индуцируемым мутантными факторами уровнями сквозного прочтения, а в in vitro системе - отсутствие природной мРНК и eRF3-FT<î>. Следует отметить, что приемлемый для регистрирования уровень сквозного прочтения наблюдается только в случае использования определенных контекстов стоп-кодонов, которые, в свою очередь, также могут накладывать отпечаток на паттерн распознавания стоп-кодонов факторами термииации трансляции.

Во избежание методологических ограничений в настоящем исследовании мы использовали полностью реконструированную in vitro систему трансляции эукариот, состоящую из набора индивидуальных компонентов трансляционного аппарата,

5

который может варьироваться в зависимости от требований эксперимента. Эта система максимально приближена к природной благодаря присутствию протяженной мРНК с 5'- и З'-нетранслируемыми областями и всех необходимых компонентов трансляции. На мРНК, содержащих разные стоп-кодоны, собирали инициаторные и элонгационные комплексы с последующей очисткой в линейном градиенте сахарозы. Полученные таким образом претерминационные комплексы использовали для определения эффективности терминации трансляции, индуцируемой факторами eRFl±eRF3, а также мутантными eRFl. Оценку качества сборки комплексов проводили с помощью тое-принт анализа с флюоресцентным праймером.

1. Роль отдельных аминокислотных остатков N домена eRFl в узнавании стоп-кодонов

1.1. Аминокислотный остаток в положении 70 - переключатель специфичности факторов eRFl Euplotes и человека

Для выявления аминокислотных остатков в eRFl, ответственных за узнавание стоп-кодонов, можно использовать несколько методов. Одним из возможных подходов для решения этой проблемы является создание химерных белков, которые содержат различные части eRFl из организмов с универсальным и вариантным генетическими кодами. Ранее была подтверждена важность N доменов eRFl Euplotes aediculatus и Euplotes octocarinatus в определении UAR-специфичности факторов терминации этих организмов. Последовательности eRFl человека и Euplotes имеют высокую степень гомологии, однако некоторые отличия в их аминокислотных последовательностях могут отвечать за разную стоп-кодон специфичность факторов. Ранее в нашей лаборатории были созданы гибридные конструкции, содержащие N домен eRFl Euplotes aediculatus и MC домен eRFl человека, и было показано, что соответствующий белок (Еи(1-145)) сохраняет UAR-специфичность полноразмерного eRFl инфузории. Далее путем создания химерных белков и их тестирования в реконструированной системе трансляции эукариот область, ответственная за запрет узнавания UGA стоп-кодона, была сужена до района 70-80 (конструкция Еи(70-80), где в аминокислотной последовательности eRFl человека область 70-80 была заменена на гомологичный участок eRFl Е. aediculatus (Рис. 1)).

Rprtifl, teg

Рис. 1. Гидролиз пептидил-тРНК различными еШ'"1. Показана доля 318-мсчеиного тетрапептида (МУНЬ), отщепляющегося из терминационных комплексов, собранных на мРПК с иАЛ (А), Шв (Б), М7Л (В) стоп-кодонами как функция времени в присутствии еЧР1 человека (черные круги) и химерных (или мутантных) еКРЬ: Еи(1-145) (белые круги), Еи(70-80) (черные треугольники), 570А (белые треугольники). Фон в отсутствие еЛР] составляет 3-5% от максимального значения для еЯР1 человека. Значение, равное единиц, соответствует максимальному значению гидролиза пептидил-тРНК, индуцируемого е/У*7 человека

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей указывает на то, что факторы cRFl человека и Е. aediculatus отличаются в районе 7080 пятью аминокислотными остатками. Чтобы исследовать влияние каждого из этих остатков на терминационную активность фактора на разных стоп-кодонах, мы путем сайт-направленного мутагенеза получили мутантные формы eRFl человека с заменами S70A, G73S, V78A, Q79K и Q80E. Их активность была проверена in vitro в реконструированной системе трансляции эукариот. Для всех мутантных белков были построены кинетические кривые и вычислены средние значения эффективности терминации в % от активности eRFl дикого Tima (Рис. 2).

Замены двух аминокислотных остатков, G73S и V78A в cRFl человека, не влияют на эффективность терминации мутантных белков (Рис. 2). Замена глютамина в позиции 79 на положительно заряженный лизин приводит к двукратному увеличению эффективности гидролиза пептидил-тРНК в ответ на все три стоп-кодона. Напротив, мутация Q80E, вносящая отрицательный заряд, приводит к

значительному снижению значений эффективности гидролиза на всех стоп-кодонах (Рис. 2). Последние эффекты, возможно, имеют место из-за изменения связывания мутантных eRFl с отрицательно заряженной рРНК рибосомы. Таким образом, замены G73S, V78A, Q79K и Q80E в eRFl человека не влияют на дискриминацию стоп-кодонов.

Рис. 2. Терминационная активность мутантных и химерных eRFl in vitro в реконструированной системе трансляции эукариот. Данные на гистограмме представлены в % от активности eRFl человека. Нумерация

аминокислотных остатков соответствует eRFl человека.

Единственным мутантным eRFl человека, для которого наблюдалось снижение эффективности терминации по сравнению с диким типом eRFl человека в присутствии UGA кодона (более чем двукратное), был S70A (Рис. 2). Следовательно, аланин в позиции 70 играет ключевую роль в запрете узнавания UGA кодона фактором eRFl Euplotes. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы ввели мутацию A70S в химерную конструкцию Еи(70-80). Этот белок, названный Еи(71-80), узнает все три стоп-кодона практически как eRFl человека (Рис. 2). Тот факт, что обратная мутация A70S в Еи(70-80) восстанавливает омнипотентную специфичность фактора, указывает на важную роль, которую играет аминокислотный остаток S70 в eRFl человека в узнавании UGA стоп-кодона. Чтобы подтвердить это предположение, мы заменили аланин на серии в положении 70 в Еи(1-145). К сожалению, нам не удалось выделить полноразмерный рекомбинантный белок, содержащий соответствующую мутацию, видимо, в связи с появлением протеазного сайта в последовательности фактора £. aediculatus. Ближайший к А70 аминокислотный остаток в последовательности eRFl Е. aediculatus В, отличающийся от остатка в последовательности eRFl человека, -S73, замена которого в eRFl человека не влияла на узнавание стоп-кодонов. Для того чтобы нарушить возможный протеазный сайт, был сконструирован новый химерный белок с двойной A70S/S73G мутацией в Еи(1 -145). Эффективность терминации такого белка (EuA70S/S73G) была почти идентична eRFl человека на всех трех стоп-кодонах

(Рис. 2), в то время как мутантный eRFl человека с двойной обратной заменой S70A/G73S узнавал только UAR стоп-кодоны, указывая на важнейшее значение позиции 70 для переключения специфичности фактора.

Ранее было показано, что некоторые мутации в химерном eRFl, состоящем из N домена Е. octocarinalus и МС доменов S. cerevisiae, могут переключать бипотентную специфичность на омнипотентную. Одной из критических мутаций была замена C124S (нумерация соответствует eRFl S. cerevisiae, С127 в eRFl человека), которая восстанавливала узнавание UGA стоп-кодона без существенного влияния на узнавание UAA и UAG кодонов. Однако этот аминокислотный остаток инвариантен в факторах термипации 1-ого класса Euplotes и человека и, следовательно, пе может принимать участие в переключении паттерна узнавания стоп-кодонов. Чтобы проверить влияние С127 (нумерация соответствует eRFl человека) на UAR-специфичность Euplotes, две точечные мутации, C127S и С127А, были введены в химерный белок Еи(1-145), и их функциональная активность была протестирована в реконструированной системе трансляции эукариот. Оба мутантных eRFl показали значительное снижение активности на всех трех стоп-кодонах, и её значения составили для C127S - 10%, 11% и 26%, для С127Л - 21%, 13%, 16% на UAA, UAG и UGA стоп-кодонах соответственно. Кроме того, нами были получены мутантные eRFl человека с заменами С127А и C127S. Оба мутантных фактора показали почти равное снижение (~ 40%) эффективности терминации на всех стоп-кодонах, поэтому мы предполагаем, что С127 в eRFl, вероятно, необходим для поддержания общей структуры N домена, а не для прямой дискриминации стоп-кодопов.

Таким образом, сайт-направленный мутагенез аминокислотных остатков из области 70-80 eRFl человека показал, что замена в позиции 70 в eRFl Е. aediculatus является не только необходимым, но и достаточным условием для перехода от бипотентной к омнипотентной специфичности фактора. Вероятно, гидроксильная группа S70 eRFl человека принимает участие в UGA-декодировании.

1.2. Аминокислотные остатки в N домене eRFl человека, ответственные за узнавание стоп-кодонов

В настоящей работе проанализировано более 100 мутантных белков с заменами аминокислотных остатков более чем по 40 положениям в N домене eRFl человека. Позиции для мутагенеза выбирали на основе литературных данных, множественного выравнивания аминокислотных последовательностей факторов терминации 1-ого класса различных эукариот, а также пространственной структуры eRFl.

9

Распознавание первого уридина в стоп-кодонах

Существует множество свидетельств, что мотив NIKS (положения 61-64 eRFl человека) важен для узнавания стоп-кодонов. Большинство из них указывают на то, что он сближен с первым нуклеотидом в стоп-кодоне (уридин, U1). Мы определили эффективность терминации факторов eRFl человека с точечными мутациями в консервативной петле 59-68 (за исключением вариантной позиции 66) в реконструированной системе трансляции эукариот (Рис. 3).

Рис. 3. Терминационная активность мутантных eRFl in vitro в реконструированной системе трансляции эукариот. Данные на гистограмме представлены в % от активности eRFl дикого типа. Нумерация аминокислотных остатков соответствует eRFl человека.

Мутации S60V, N61А и S64A не оказывают существенного влияния терминационную активность фактора (Рис. 3). Так как замененные аминокислотные остатки по своей природе существенно отличаются от исходных, мы предполагаем что, позиции 60, 61 и 64 в eRFl человека не участвуют в распознавании первого нуклеотида стоп-кодонов. Замены в позиции 59 приводят к существенному снижению терминационной активности фактора по всем стоп-кодонам, однако, не вызывают его полной инактивации. Вероятно, А59 либо принимает опосредованное участие в узнавании стоп-кодонов, либо является структурным элементом белка.

Напротив, мутации в положениях 62, 63, 65-68 приводят к значительному уменьшению эффективности терминации на всех трех стоп-кодонах (Рис. 3). Замены на похожие аминокислотные остатки (I62V, K63R, K63Q), как и следовало ожидать, менее критичны, чем замены на аминокислотные остатки с другим зарядом (К63Е, N67D) или имеющие другой размер (I62A), а также сочетающие в себе оба параметра

ю

(К63Л, R65A, R68A). Эффективность терминации на всех стоп-кодонах мутантов Г62А, К63Е, N67D и R68A близка к нулевым значениям.

Для того чтобы выяснить, не вызвана ли наблюдаемое падение активности мутантных факторов изменением структуры eRFl и, как следствие, эффективностью связывания eRF] с рибосомой, был проведен анализ на ГТФазную активность. При связывании eRF3 с eRFl и рибосомой в присутствии ионов магния и ГТФ фактор терминации 2-ого класса гидролизует нуклеозидтрифосфат. Степень гидролиза ГТФ таким тройным комплексом может быть использована как мера эффективности взаимодействия компонентов тройного комплекса (eRFl-eRF3-pn6ocoMa). Все мутантные eRFl за исключением I62A (60%), R65A (70%), N67D (50%), R68A (50%) стимулировали ГТФазную активность eRF3 почти так же, как и белок дикого типа, следовательно, в большинстве полученных мутантов ие нарушена общая структура eRFl. Поскольку для мутантных eRFl R65A, N67D и R68A наблюдались сниженные значения ГТФазной активности, мы предполагаем, что они участвуют во взаимодействии фактора с рРНК или меняют общую структуру фактора, не взаимодействуя напрямую с U1. Факторы, несущие мутации в положении 62, по-разному стимулируют ГТФазную активность eRF3 (I62A - 60%, I62V - 100%), таким образом, замена разветвленного изолейцина на менее объемный аланин не только влияет на правильное распознавание нуклеотидов стоп-кодонов, но и частично нарушает взаимодействие фактора с рибосомой.

Принимая во внимание данные о сшивках мотива NIKS с первым нуклеотидом в стоп-кодонах, и полученные нами экспериментальные данные, можно заключить, что аминокислотные остатки 162, К63, участвуют в узнавании U1 фактором eRFl человека.

Распознавание второго гуанознна в стоп-кодоие UGA

Нами показано, что аминокислотный остаток А70 в eRFl Euplotes aediculaíus важна для UAR специфичности фактора. В факторе терминации человека это положение занято серином. Кроме S70A в eRFl человека нами также была протестирована активность на различных стоп-кодонах мутантного фактора S70T (замена на подобный аминокислотный остаток) (Рис. 4). Как и в случае S70A RF-активность этого мутанта на UGA снижена более чем в 2 раза, по сравнению с двумя другими стоп-кодопами, однако, общий уровень гидролиза пептидил-тРНК был существенно меньше. Следовательно, не только природа боковой цепи, но и размер аминокислотного остатка в этом положении играет важную роль в UGA-узнавании.

В кристаллической структуре eRFl человека, S70 сближен с высококонсервативным аминокислотным остатком S33. Чтобы проверить, как влияет S33 на декодирование стоп-сигналов, два мутантных фактора, S33A и S33T, были протестированы в in vitro системе. Для них получен результат, схожий с S70A и S70T - падение активности в ответ на UGA стоп-кодон (Рис. 4). Тест на ГТФазную активность eRF3 показал, что мутантные eRF! по положениям 33 и 70 связываются с рибосомой с такой же эффективностью что и eRFl дикого типа, и введенные мутации затрагивают только район, распознающий стоп-кодоны. Таким образом, мы можем констатировать, что два серина (33 и 70) в N домене eRFl человека участвуют в UGA-узнавании, а, следовательно, взаимодействуют со вторым гуанозином (G2) в стоп-кодоне.

aRF1 Ш S33A

Рис. 4. Терминационная активность мутантных eRFl in vitro в реконструированной системе

трансляции эукариот. Данные на гистограмме представлены в % от активности eRFl дикого типа. Нумерация аминокислотных

остатков соответствует eRFl человека.

Распознавание второго аденозина в стоп-кодонах иАА и ШАв

В реконструированной системе трансляции эукариот нами были проанализированы ранее описанные мутантные факторы - Р131 А, Р131 У, для которых была показана важность позиции 131 для распознавания иАА и илв стоп-кодонов. Замена БША приводит к резкому снижению количества отщепляющегося пептида на всех стоп-кодонах, однако 1ГСА распознается фактором в два раза лучше, чем 1]АА и иАй (Рис. 5). В свою очередь, замена Б131У (сохраняющая ароматическое кольцо) показывает равномерное двукратное уменьшение ИР-активности на всех стоп-кодонах (Рис. 5). Таким образом, присутствие ароматического кольца в позиции 131 очень важно для иАА и ЫАО декодирования, а появление дополнительной гидроксильной группы, вероятно, частично нарушает функциональную конформацию фактора. Несмотря на то, что мутации Р131А и Р131У меняют локальную конформацию eRFl, они не нарушают общей структуры белка и его способности связываться с рибосомой,

12

поскольку они стимулируют ГТФазную активность с той же эффективностью, как еКР! дикого типа.

Рис. 5. Терминационная активность мутантных eRFl in vitro в реконструированной системе трансляции

эукариот. Данные на гистограмме представлены в % от активности eRFl дикого типа. Нумерация аминокислотных остатков соответствует eRFl

человека.

В кристаллической структуре eRFl человека высококонсервативный аминокислотный остаток S36 сближен с F131. Замена серина на более объемный изолейцин приводит к практически нулевым значениям терминадионной активности фактора в ответ на UAA и UAG кодоны и оставляет примерно четверть RF-активности eRFl дикого типа в ответ на стоп-сигнал UGA (Рис. 5). Замена серина в этом положении на сходный с ним полярный треонин не влияет на узнавание UAG и UGA с несколько увеличенным (~ на 20%) значением на UAA стоп-кодоне. Полученные экспериментальные данные указывают на то, что гидроксильная группа S36, вероятно, взаимодействует со вторым аденозином (А2) в стоп-кодонах UAA и UAG. ГТФазный тест мутантных белков по положению 36 показал практически 100% активность для S36T и 70% для S361, то есть при этой мутации общая структура белка частично нарушалась. Исходя из этих данных мы предполагаем, что в этом положении важна не только гидроксильная группа, но и размер аминокислотного остатка.

Ранее было показано, что мутация в позиции 32 (Т32А) приводит к более высокому уровню сквозного прочтения на UAA и UAG по сравнению с UGA стоп-кодоном. Наши данные согласуются с этим результатом: в реконструированной системе трансляции эукариот мы наблюдаем в два раза более низкие значения эффективности терминации на UAA и UAG стоп-сигналах, чем на UGA (Рис. 5). Кроме того, мы проверили T32S мутант (замена на подобный полярный аминокислотный остаток) и обнаружили гораздо меньшее снижение RF-активности

на иАА и илв кодонах по сравнению с Т32А (Рис. 5). Проанализированные мутантные факторы Т32А и Т328 стимулируют ГТФазную активность еЮРЗ с той же эффективностью, что и белок дикого типа, следовательно, их способность связываться с рибосомой не меняется, Мы предполагаем, что треонин в положении 32 взаимодействует своим гидроксильным остатком с А2.

Суммируя полученные результаты можно заключить, что для декодирования второго аденозина в стоп-кодонах иАА и иАй необходимо взаимодействие нуклеотида с боковыми радикалами аминокислотных остатков Б131, БЗб и Т32.

Распознавание третьего гуанозина в стоп-кодоне ТГАС

Ранее различными методами было показано, что позиции 55, 125, и 129 еМ-Ч человека важны для иАО-декодирования. Мы протестировали активность мутантных по этим положениям факторов в реконструированной системе трансляции эукариот. Все мутантные факторы по положению 55 показывают значительное снижение иАй узнавания (Рис. 6). Интересно, что мутация Е55Я приводит к бипотентному фенотипу еМЧ, в то время как в предыдущей работе эта замена не оказывала практически никакого влияния на активность фактора. Так как мы наблюдаем аналогичный характер узнавания стоп-кодонов в случаях всех замен, то считаем, что именно остаток глутамата в положении 55 важен для декодирования иАв.

eRF1 WT B5R E55Q ES5D Е55А Y125A Y125F N129A N129D N129P

Рис. 6. Терминационная активность мутантных eRFl in vitro в реконструированной системе трансляции эукариот. Данные на гистограмме представлены в % от активности eRFl дикого типа. Нумерация аминокислотных остатков соответствует eRFl человека.

Удаление ароматического кольца в положении 125, сближенного в пространстве с остатком Е55, приводит к полной потере терминационной активности

14

фактора на всех стоп-кодонах, в то время как при замене Y125F происходит лишь некоторое снижение эффективности терминации на UAG стоп-кодоне (Рис. 6). Это означает, что ароматическое кольцо в этом положении очень важно для функционально активной структуры белка.

Среди мутантных eRFl по положению 129 наиболее значительное влияние на эффективность терминации наблюдается для N129P (Рис. 6). Эта замена приводит к повышению (до 110% на UAA и 140% на UGA) эффективности гидролиза пептидил-тРНК на UAA и UGA кодонах и снижению до 80% на UAG. Известно, что появление пролина в белке значительно изменяет его локальную структуру. В случае замены N129P это может приводить к смещению Y125 относительно Е55, при котором могут возникать стерические затруднения в сайте распознавания третьего нуклеотида, за счет чего нарушается узнавание UAG стоп-кодона. Это подтверждают две другие мутации (N129А и N129D), которые оказывают только небольшое влияние на UAG-декодирование (Рис. 6). Все протестированные мутантные факторы по положениям 55, 125 и 129 стимулируют ГТФазную активность так же, как eRFl дикого типа. То есть внесенные изменения в белок не затрагивают его общую структуру, а влияют только на его способность узнавать стоп-кодоны. Таким образом, позиции 55 и 125 играют ключевую роль в узнавании UAG стоп-кодона, а позиция 129 является важным структурным элементом белка.

Распознавание третьего аденозина в стоп-кодонах UAA и UGA

Недавно разрешенные кристаллические структуры комплекса eRFl-eRF3 в присутствии АТФ показывают, что аминокислотный остаток V71 фактора eRFl контактирует с сокристаллизованным нуклеотидом. Мы получили мутантные eRFl человека V71A и V71F, которые узнают UAG стоп-кодон лучше, чем UAA и UGA от vitro (Рис. 7).

Рис. 7. Терминационная активность мутантных eRFl in vitro в реконструированной системе трансляции эукариот. Данные на гистограмме представлены в % от активности eRFl дикого типа. Нумерация аминокислотных остатков соответствует eRFl человека.

Это согласуется с данными, полученными ранее in vivo, согласно которым уровень сквозного прочтения для мутантных eRFl V71A и V71F был понижен на UAG по сравнению с двумя другими стоп-кодонами. Результаты проведенного нами ГТФазного теста свидетельствуют о том, что данные мутации не влияют на способность фактора связываться с рибосомой и eRF3. Вероятно, точный размер и объем валина в позиции 71 очень важен для правильного узнавания третьего нуклеотида (общего аденозина) в стоп-кодонах UAA и UGA.

2. Влияние фактора терминиции eRF3 на узнавание стоп-кодонов

2.1. Влияние фактора терминации eRF3 на эффективность терминации

трансляции

До сих пор неизвестно, на каком этапе процесса терминации трансляции участвует фактор терминации 2-ого класса eRF3. В настоящей работе мы изучили влияние eRF3 на эффективность терминации трансляции.

В ходе экспериментов были сняты кинетические кривые гидролиза пептидил-тРНК фактором терминации eRFl человека в отсутствие (Рис. 8А) или в присутствии (Рис. 8Б) eRF3-rT<I>. Здесь следует подчеркнуть, что для эксперимента в присутствии cRF3 количество eRFl было в 20 раз меньше, чем в опыте без eRF3. Кроме того, наличие в системе ейРЗ-ГТФ приводит к тому, что кривые выходят на плато уже на третьей минуте инкубации реакционной смеси (Рис. 8Б), в то время как без cRF3 максимальное значение достигается лишь на 15 минуте (Рис. 8А).

eRF1 WT- eRF3

f 4000

----- _ •

о

// У^

/ у

у /

Г и

f • им I

о UAG |

/ ▼ UGA

I нооо

| 12000

| 10000

g 0000

| SOOD

I 4000

g 2000

Рис. 8. Кинетические кривые гидролиза пептидип-тРНК фактором терминации еШ71 в отсутствие (А) и в присутствии (Б) еКРЗ-ГТФ. Значение фона не превышает 500 срт.

На основе полученных данных вычислены значения эффективностей терминации трансляции (кса/Км) в присутствии и в отсутствие eR-РЗ-ГТФ на всех стоп-кодонах (Табл. 1).

kcai^Mi s"'M"' Табл. 1. Значения эффективностей

UAA UAG UGA терминации трансляции eRFl

eRFl 2,88 х 104 2.52 х 104 2,88 х 104" ЧеМ&ет 8 "Р"0""ствии и в

~eRFl+eRF3 4,13x10" 5,85 х 10е 4,80 x10й отсУ™твие eRFm ™ -^---—2- кодонах UAA, UAG и UGA.

Как видно из таблицы 1, eRF3 увеличивает эффективность работы фактора eRFl примерно на 2 порядка. Стоит отметить, что добавление RF'3-ГТФ к прокариотическим терминационным комплексам не влияет на эффективность терминации, что говорит о разной функциональной роли факторов терминации 2-ого класса эукариот и прокариот. Известно, что прокариотический RF3 участвует в освобождении факторов терминации 1-ого класса из терминационных комплексов после гидролиза пептидил-тРНК. Мы предполагаем, что у эукариот eRF3 стимулирует терминацию трансляции, либо усиливая связывание eRFl с претерминационным комплексом, либо ускоряя гидролиз пептидил-тРНК.

2.2. Корректирующая активность eRF3 в процессе узнавания стоп-кодонов

Поскольку в естественных условиях в клетке присутствуют оба терминационных фактора - eRFl и eRF3, было решено изучить влияние фактора терминации 2-ого класса на активность ряда мутантных eRFl, не распознающих те или иные стоп-кодоны. Из гистограммы видно (Рис. 9), что для мутантных eRFl Т32А, К63А и, отчасти, К63Е в присутствии еКРЗ-ГТФ восстанавливается омнипотентная активность фактора. С другой стороны, для I62A, S36I, S33A, Y125F, E55Q, E55R, N129P и V71F наблюдается паттерн узнавания, сходный с тем, что был в отсутствие eRF3. Таким образом, фактор eRF3 способен корректировать стоп-кодон распознающую функцию фактора терминации 1-ого класса при некоторых заменах в eRFl. Скорее всего, такие мутации не меняют размер полостей в eRFl, взаимодействующих со стоп-кодонами, и, поскольку нуклеотид в стоп-кодоне узнается несколькими аминокислотными остатками, удаление одной из детерминатив критично при повышении эффективности терминации, вызванном eRF3. В тех же случаях, когда мутации нарушают позиционирование стоп-кодонов в соответствующих «карманах» белка, такой корректировки не происходит, и, даже при

кс«/Км, S 'M '

UAA 1 UAG UGA

eRFl 2,88 x 104 2,52 x 104 2,88 x 104

eRFl+eRF3 4,13 x 106 5,85 x 10е 4,80 x 106

повышении эффективности терминации фактором cRF3, взаимодействие нуклеотида стоп-кодона с eRFl невозможно.

Рис. 9. Терминационная активность мутантных eRFI человека in vitro в реконструированной системе трансляции зукариот в присутствии eRF3-FT0. Данные на гистограмме представлены в%от активности eRFl дикого типа.

2.3. Модель взаимодействия стоп-кодонов с аминокислотными остатками N домена eRFl человека

На основе полученных данных нами предложена модель взаимодействия стоп-кодонов с аминокислотными остатками N домена eRFl человека. Мы считаем, что К63 положительным зарядом ЫНг-группы, вероятно, взаимодействует с одним из кето-кислородов в U1. Однако активность мутантного eRFl К63А восстанавливается под действием eRF3, следовательно, имеются другие аминокислотные остатки необходимые для узнавания этого нуклеотида. 162 выполняет, главным образом, структурную роль и образует полость нужного размера для правильного позиционирования уридина стоп-кодонов. Дополнительно он может взаимодействовать с U1 атомами своей основной цепи.

Аминокислотный остаток S33 взаимодействует с G2, при этом важен как его размер (так как eRF3 не восстанавливает активность мутантного фактора S3 ЗА), так и наличие гидроксильной группы. Вероятно, он взаимодействует с NHrrpynnoH второго гуанозина стоп-кодона. Также для дискриминации G2 необходима ОН-группа и точный размер S70. Мы предполагаем, что этот остаток взаимодействует с атомом кислорода в положении 6.

Мы предполагаем, что S36 и F131 смешаются к Т32 в результате конформационных перестроек, происходящих при связывании eRFl с А-сайтом рибосомы, так как Т32 находится примерно на таком же расстоянии от U1, как и S33 и S70. F131, по-видимому, несет структурную функцию, то есть поддерживает

18

гидрофобное ядро, и одновременно вступает в стекинг-взаимодействия с А2. S36 также участвует в образовании полости, о чем свидетельствуют результаты ГТФазного теста. Помимо этого S36 и Т32 взаимодействуют с атомами N1 и N7 и ЫН2-группой в шестом положении второго аденозина стоп-кодонов своими гидроксильными группами, а также создают полость для позиционирования А2, в которую стерически не помещается G2.

Вопреки ожиданиям, аминокислотные остатки Е55 и V71, определяющие узнавание третьих нуклеотидов стоп-кодонов, расположены не на одной прямой с остатками, узнающими первый и вторые нуклеотиды. Можно допустить, что они оказываются в нужной позиции в результате изменения конформации белка при связывании с рибосомой, но так как Е55 и V71 соседствуют с детерминантами, распознающими первый нуклеотид в первичной структуре (62-68), это невозможно. Мы предполагаем, что после узнавания первого и второго нуклеотидов стоп-кодона происходит значительная конформационная перестройка претерминационного комплекса, в результате которой происходит взаимное перемещение фактора и стоп-кодона друг относительно друга с последующим узнаванием третьего нуклеотида.

Перестройка претерминационного комплекса была продемонстрирована ранее. Было показано, что во время терминащш трансляции в эукариотической in vitro системе происходит сдвиг бэнда, соответствующего рибосомальному комплексу с UAA стоп-кодоном на два нуклеотида в З'-область мРНК. Мы наблюдаем такую же картину на всех трёх стоп-кодонах как в присутствии, так и в отсутствие eRF3. Мы считаем, что этот сдвиг происходит после узнавания первых двух букв стоп-кодона UA или UG фактором терминации eRFl, после чего нарушается взаимодействие стоп-кодона с аминокислотными детерминантами. В случае UGA стоп-кодона третий нуклеотид смещается в область позиций 71 и 32, которые распознают только аденозин (именно этим можно объяснить некоторое понижение уровня гидролиза пептидил-тРНК на UGA стоп-кодоне для Т32А) и, таким образом, не происходит распознавание UGG. В случае UAA/UAG стоп-кодонов третий нуклеотид сначала попадает в область позиций 55 и 125, где происходит распознавание гуанозина. При этом Е55 взаимодействует с NH2-rpynnofi G3 своей отрицательно заряженной СОО -группой, a Y125, помимо координации структуры ароматическим кольцом, может дополнительно взаимодействовать своей гидроксильной группой с атомом кислорода в шестом положении G3. Так происходит распознавание UAG стоп-кодона. В случае UAA стоп-кодона аминокислотный остаток Е55 не способен взаимодействовать с нуклеотидом A3, позиционированным в кармане из прилегающих аминокислотных остатков. Поэтому A3 в UAA стоп-кодоне не фиксируется в этой области и смещается

19

в район позиций 71 и 32, где распознается так же, как третий аденозин 1ЮА. Мы предполагаем что, такое двустадийное узнавание стоп-кодонов фактором еЫП, во-первых, обусловлено необходимостью узнавать все три стоп-кодона, а, во-вторых, является способом передачи сигнала в пептидилтрансферазный центр рибосомы, запускающего гидролиз пептидил-тРНК.

2. Участие аминокислотных остатков С домена сШ71 в узнавании стоп-кодонов

Существует ряд работ, указывающих на пространственную сближенность С и N доменов еЕД. Стоит отметить, что в имеющейся кристаллической структуре еКЕ1 человека С домен разрешен гораздо хуже, чем N и М домены. Нашими коллегами из Центра магнитной томографии и спектроскопии МГУ им. М.В.Ломоносова получена ЯМР-структура С домена еИЛ человека, и показано, что он существует в 2-х конформациях - открытой и закрытой. При этом меняется конформация минидомена 329-372, который обращен к N домену. В связи с этим нами исследовано влияние мутаций в петле 357-367, отвечающей за стабилизацию двух конформеров белка, па декодирование стоп кодонов.

Мы получили серию мутантных форм еИГ1 с заменами аминокислотных остатков У331, Н334, Н356, Р357, 0359, С.363; Е365, Н366 и Е370 на аланин. Эти мутантные белки были проанализированы в реконструированной системе трансляции эукариот. Обнаружено, что мутации У331Л, Н356А, Р357А, 0359А, 0363А и Е365А увеличивают эффективность терминации на 11АО стоп-кодоне, в то время как она не изменяется на иАА и ИОА стоп-кодонах (Рис. 10). Остальные полученные мутанты не изменяют терминационную активность фактора. Максимальное воздействие на гидролиз пептидил-тРНК наблюдалось в случае Е365А и 0359А мутантов, в которых

Рис. 10. Термипационная активность мутантных eRFl человека in vitro в реконструированной системе трансляции эукариот. Данные на гистограмме

представлены в % от активности eRFl дикого типа.

отрицательно заряженные остатки заменены на аланин.

eRPJWT Y331A H35SA F357A D35SA G363A E36SA

Недавно идентифицированы аминокислотные остатки в С домене eRFl человека, отвечающие за взаимодействие с eRF3: F291, 1294, Y301, F303, и F406. Минидомен 329-372 расположен на противоположной стороне С домена, поэтому внесенные мутации в петлю 357-367 не должны менять эффективность связывания eRFl и eRF3. Чтобы подтвердить это предположение и проверить, меняют ли мутации в этом районе способность фактора связываться с рибосомой, был проведен анализ на ГТФазную активность eRF3 в присутствии мутантных факторов и рибосом. Все мутантные eRF 1 стимулировали ГТФазную активность eRF3 практически так же, как eRFl дикого типа. Таким образом, все исследованные мутантные белки эффективно связываются с рибосомой.

Следует отметить, что петля 357-367 является одним из самых вариабельных участков в аминокислотных последовательностях эукариотических факторов терминации первого класса. Большинство эукариот использует все три стоп-кодона. Тем не менее, частоты встречаемости UAA, UAG и UGA в кодирующих последовательностях мРНК отличаются между видами. Возможно, вариабельные остатки в петле 357-367 вносят вклад в сродство eRFl к различным стоп-кодонам в соответствии с распространенностью стоп-сигнала в транскриптоме. Действительно, UAG является редким стоп-кодоном в транскриптоме человека, и, следовательно, сравнительно слабым сигналом для eRFl человека, а мутации в петле 357-367 увеличили сродство eRFl человека к этому стоп-кодону.

3. Влияние 3'-контекста на узнавание стоп-кодоное

Существует ряд гипотез о влиянии как 5'-, так и З'-контекста стоп-кодона на эффективность терминации трансляции, и, как следствие, либо на повышение уровня сквозного прочтения на различных стоп-кодонах, либо на сдвиг рамки считывания кодирующей последовательности белка. Опубликованные ранее данные указывают на преимущественную роль З'-контекста стоп-кодонов в этих процессах, а полученные нами результаты по мутагенезу петли 357-367 в С домене eRFl указывают на ее взаимодействие с мРНК, предположительно, с З'-контекстом стоп-кодонов. Для проверки этой гипотезы был проведен биоинформатический анализ З'-контекстов стоп кодонов в геноме человека и определено влияние наиболее и наименее распространенных из них на эффективность терминации трансляции.

3.1. Биоинформатический анализ 3 '-контекстов стоп-кодонов в генах человека

Обработка геномных данных проводилась П.К. Власовым из группы эволюционной

геномики (The Centre for Genomic Regulation, Barcelona, Spain) с помощью скрипта,

21

написанного па интерпретируемом языке Perl. В качестве источника данных был взят релиз генома человека версии 37 с сайта NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализу подвергались все гены, кодирующие последовательности которых представлены в аннотации (раздел CDS), находящиеся на прямой цепи всех 24 хромосом (включая половые хромосомы X и Y). Гены обратной цепи не рассматривались, но образованная выборка из 12646 генов является, безусловно, репрезентативной. В работе рассматривались первые шесть нуклеотидов, следующих за стоп-кодоном (обозначим их условно abcdef). Однако нам не удалось выявить какой-либо закономерности во встречаемости гексануклеотидов, так как они были представлены примерно равновероятно. Поэтому каждая шестёрка нуклеотидов была разделена на две последовательные тройки (abc и def), на три последовательные двойки (ab, cd, ef) и шесть отдельных букв. Таким образом, была собрана статистика встречаемости моно- , ди-, три- и гекса-нуклеотидов в З'-области стоп-кодонов, причём данные по всем трём возможным стоп-кодонам были проанализированы отдельно. На основании полученных данных о встречаемости нуклеотидов в З'-области стоп-кодонов были выбраны следующие контексты для экспериментальной проверки их влияния на эффективность терминации трансляции: в качестве «хороших» для UAA - AAACTG, для UAG и UGA - GGGCTG, в качестве «плохого» для всех стоп-кодонов был выбран гексануклеотид TCGTCG. Следует отметить, что последовательности выбранных нами контекстов отличаются от предсказанных ранее на основе менее репрезентативных выборок генов.

3.2. Влияние 3 '-контекста на узнавание стоп-кодонов

Чтобы проверить влияние выбранных З'-контекстов стоп-кодонов на эффективность терминации, в реконструированной системе трансляции эукариот in vitro были собраны претермииационные комплексы на мРНК с тремя видами контекстов для каждого стоп-кодона: «стандартным», использованным в описанных выше экспериментах контекстом мРНК TGTGTG, «хорошими» и «плохими» контекстами. Далее оцененивалась эффективность терминации трансляции фактором eRFl в отсутствие и в присутствии eRF3-FT® на разных контекстах. (Рис. 11).

А

Б

о

Рис. 11. Эффективности терминации трансляции, вызываемой фактором еНП человека в комплексах, собранных на мРНК с различными 3 '-контекстами стоп-кодонов в отсутствие (А) и в присутствии (Б) еКРЗ-ГТФ.

Как видно из гистограмм, ощутимая разница в эффективностях на различных контекстах наблюдается только в случае 11АА стоп-кодона в присутствии еКРЗ-ГТФ (Рис. 11Б). Следует отметить, что «хороший» контекст для 11АА (АААСТО) является АТ-богатым в отличие от «стандартного» (ТОТОТС) и «плохого» (ТССТСв) контекстов, по-видимому, именно этот факт определяет повышенную эффективность терминации на иАА кодоне, в котором в отличие от двух других отсутствует в. Возможно, влияние контекста определяется не точной последовательностью нуклеотидов, а предпочтением АТ-богатого контекста для иАА и ОС-богатого для иАО и иОА стоп-кодонов, что в целом подтверждается частотами встречаемости различных нуклеотидов в 3'-области стоп-кодонов. Это объясняет незначительную разницу в эффективностях терминации на 1МО и ивА стоп-кодонах с использованием всех трех контекстов (Рис. 11).

Существенное изменение эффективности терминации трансляции в зависимости от контекста (почти в 3 раза) наблюдается лишь в присутствии фактора терминации 2-ого класса еЮРЗ, то есть влияние контекста проявляется только в результате совместного действия обоих факторов терминации эукариот. В отсутствие еКРЗ разница в эффективности терминации в комплексах с разными контекстами составляла не более 30%. Мы предполагаем, что такой эффект связан с изменением конформации фактора еШЧ (уменьшение угла между С и N доменами) при взаимодействии с е№3, которое приводит к сближению С домена с З'-областью стоп-кодонов. Действительно, удаление С домена из е№1 (еИР! ММ) не меняет чувствительности фактора к контексту в отсутствие еЯРЗ (Рис. 12).

|«eRF1 WT

4 |DeRF1 NM

г

£ »

J

1 о

НАД U AG UGA UAA UAG UGA

"хороший" "хороший" "хороший" "плохой" "плохой" "плохой"

Рис. 12. Эффективности терминации трансляции, вызываемой фактором eRFl дикого типа и NM домена eRFl в комплексах, собранных на мРИК с различными 3 '-контекстами стоп-кодонов.

ВЫВОДЫ

1) Определяющую роль в переключении специфичности узнавания стоп-кодонов факторами eRFl Euplotes и человека играет аминокислотный остаток в положении 70.

2) Идентифицированы аминокислотные остатки N домена eRFl человека, важные для узнавания нуклеотидов в стоп-кодонах. За узнавание первого пуклеотида (U1) отвечают остатки 162, К63; за узнавание второго аденозина (А2) - S36, Т32 и F131; за узнавание второго гуанозина (G2) - S33 и S70; за узнавание третьего аденозина (A3) - V7I и Т32; за узнавание третьего гуанозина (G3) - Е55 и Y125.

3) Фактор терминации человека 2-ого класса eRF3 в присутствии ГТФ стимулирует активность фактора eRFl, повышая эффективность терминации трансляции на два порядка, и обладает корректирующей активностью в отношении точечных мутантов eRFl.

4) Мутации в подвижной петле С домена eRFl человека Y331A, Н356А, F357A, D359A, G363A и Е365А повышают эффективность распознавания UAG стоп-кодона и не влияют на способность eRFl связываться с рибосомой и eRF3.

5) Для эффективной терминации трансляции в присутствии факторов eRFl и eRF3 человека необходимо сходство нуклеотидного состава стоп-кодона и его 3'-контекста (АТ-богатый контекст для UAA и GC-богатый для UAG и UGA).

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Mantsyzov А.В., Ivanova E.V., Birdsall В., Alkalaeva E.Z., Kryuchkova P.N.. Kelly G., Frolova L.Y., Polshakov V.I. NMR solution structure and function of the C-terminal domain of eukaryotic class 1 polypeptide chain release factor. (2010). FEBS J. 277(12); 2611-27.

2. Boris Eliseev, Polina Kryuchkova. Elena Alkalaeva and Ludmila Frolova. A single amino acid change of translation termination factor eRFl switches between bipotent and omnipotent stop-codon specificity. (2010). Nucleic Acids Res., doi: 10.1093/nar/gkq759.

3. Крючкова П.Н. Идентификация элементов N-домена фактора терминации трансляции eRFI, ответственных за узнавание стоп-кодонов. (2009). Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2009»

4. Крючкова П.Н.. Алкалаева Е.З. Механизм узнавания стоп кодонов фактором терминации трансляции эукариот. (2009). Сборник трудов научной конференции «Химическая биология — фундаментальные проблемы бионанотехнологии», стр.81

5. Крючкова П.Н.. Алкалаева Е.З. Механизм узнавания стоп кодонов фактором терминации трансляции eRFl. (2009). Сборник тезисов докладов участников Второго международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий в рамках международного форума по нанотехнологиям, стр.934

6. Polina Kriuchkova. Elena Alkalaeva, Ludmila Frolova. Stop codon recognition sites in eRFl. (2009). EMBO Conference Series on Protein Synthesis and Translational Control Partnered with Cold Spring Harbor Laboratories (CSHL), Abstract book, p. 160

Подписано в печать:

17.11.2010

Заказ № 4566 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorefcrat.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая схема терминации трансляции.

1.2. Факторы терминации трансляции 1-го класса.

1.3. Факторы терминации трансляции 2-го класса.

1.4. Взаимодействие еКР1 и сИБЭ.

1.5. Распознавание стоп-кодонов.

1.5.1 Распознавание сгоп-кодонов у прокариот.

1.5.2 Распознавание стоп-кодонов у эукариот.

1.6. Влияние контекста мРНК и пептидил-тРНК на терминацию трансляции.

Механизм термынации трансляции, заключительной стадии синтеза полипептидной цепи, остается, во многом, не изученным. Ключевую роль в этом процессе играют белковые факторы терминации трансляции, которые согласно своим функциям подразделяются на два класса [1,2].

Перед исследователями стоит несколько ключевых вопросов применительно к терминации трансляции. Каким образом распознаются стоп-кодоны? Каков механизм гидролиза пептидил-тРНК? Как связаны эти два процесса, то есть, как передается сигнал от декодирующего центра в гидролитический? Каким образом у эукариот осуществляется кооперативное действие двух факторов терминации, приводящее к эффективному отщеплению петпда?

Совсем недавно были получены кристаллические структуры высокого разрешения рибосомалышх комплексов с RF1 и RF2 [3-5], что позволило существенно расширить наши представления о механизме терминации трансляции у прокариот. Хотя опубликованы структуры факторов терминации eRFl, eRF3, и их комплекса [6-8], а также имеется большое количество генетических и биохимических данных, несомненно, улучшающих наше понимание терминации трансляции у эукариот, механизм ее остается неизвестным.

Согласно данным структурного анализа фактор терминации eRF 1 состоит из трех доменов. N-концевой домен ответствен за узнавание стоп-кодонов, М домен вовлечен в процесс гидролиза пептидил-тРНК в петидилтрансферазном центре рибосомы, а С-концевой домен вместе с М доменом взаимодействует с фактором терминации 2-го класса, eRF3. В настоящее время существует ряд подходов для изучения процессов, осуществляемых факторами терминации трансляции эукариот. Во-первых, для поиска функционально важных аминокислотных остатков стали широко использовать точечный мутагенез eRFl с последующим тестированием в системах in vivo и in vitro. Во-вторых, для локализации центров узнавания стоп-кодонов стали создавать химерные белки, содержащие различные участки факторов из организмов с универсальным и вариантным генетическими кодами. Несмотря на это, проблема распознавания стоп-кодонов у эукариот остается нерешенной, в значительной степени из-за отсутствия адекватной тест-системы для исследования этого процесса. Однако ситуация принципиально изменилась, когда недавно была разработана новая полностью реконструированная in vitro система трансляции эукариот, которая позволяет анализировать отдельно каждую из трёх основных стадий трансляции, получать претерминационный и терминационный комплексы и изучать роль каждого компонента системы отдельно и в любом сочетании [9].

Известно, что eRFl и eRF3 кооперативно участвуют в высвобождении полипептидной цепи из рибосомы. Точный механизм того, как eRF3 содействует терминации трансляции, пока неизвестен. Одно из предположений сводится к тому, что eRF3 стимулирует связывание eRFl с прегерминационным комплексом подобно EF-Tu. увеличивающему сродство аминоацил-тРНК к А-сайту рибосомы с находящимся в нем смысловым ко доном [10].

В настоящей работе мы попытались идентифицировать аминокислотные остатки в N домене eRFl человека, ответственные за узнавание стоп-кодонов, выяснить роль С домена eRFl человека в узнавании стоп-кодонов, определить влияние 3'-контекста стоп-кодонов на эффективность терминации трансляции, а также выяснить роль eRF3 человека в дискриминации стоп-кодонов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Определяющую роль в переключении специфичности узнавания стоп-кодонов факторами еМ71 ЕирШез и человека играет аминокислотный остаток в положении 70.

2. Идентифицированы аминокислотные остатки N домена eR.Fl человека, важные для узнавания нуклеотидов в стоп-кодонах. За узнавание первого нуклеотида (Ш) отвечают остатки 162, К63; за узнавание второго аденозина (А2) - 836, Т32 и Р131; за узнавание второго гуанозина (в2) - 833 и 870; за узнавание третьего аденозина (АЗ) - У71 и Т32; за узнавание третьего гуанозина(вЗ) -Е55 и У125.

3. Фактор терминации человека II класса еЫРЗ в присутствии ГТФ стимулирует активность фактора eRFl, повышая эффективность терминации трансляции на два порядка, и обладает корректирующей активностью в отношении точечных мутантов 1.

4. Мутации в подвижной петле С домена еРР 1 человека УЗЗ1 А, Н356А, Р357А, Б359А, вЗбЗА и Е365А повышают эффективность распознавания 11АО стоп-кодона и не влияют на способность еШ7! связываться с рибосомой и eRFЗ.

5. Для эффективной терминации трансляции в присутствии факторов eRFl и eRFЗ человека необходимо сходство нуклеотидного состава стоп-кодона и его 3'-контекста (АТ-богатый контекст для 11АА и ОС-богатый для иЛО и ША).

Заключение

Узнавание стоп-кодонов фактором eRFl эукариот - один из ключевых процессов, понимание механизма которого чрезвычайно важно для изучения работы трансляционного аппарата клетки. Целью настоящей работы был поиск участков eRFl человека, ответственных за узнавание сгоп-кодонов. В работе была использована полностью реконструированная in vitro система трансляции эукариот. Применение этой максимально приближенной к природной системы позволяет избежать ряда ограничений, накладываемых другими методами исследования.

В ходе работы было проанализировано более ста мутантных факторов более чем по 40 положениям в N домене eRFl человека и найдены аминокислотные остатки, взаимодействующие с нуклеотидами в стоп-кодонах. На основе эгого была предложена модель узнавания стоп-кодонов фактором терминации трансляции эукариот eRFl. Кроме этого была исследована роль фактора eRF3 в декодировании стоп-сигналов. Показано, что eRF3 стимулирует работу eRFl и обладает корректирующей активностью по отношению к его мутантам.

Кроме этого на основе полученной нашими коллегами ЯМР-структуры С домена eRFl человека, были выбраны позиции для сайт-направленного мутагенеза и подтверждена гипотеза о влиянии петли 357-367 на узнавание стоп-кодонов. Поскольку высказывалось предположение, чго эта петля взаимодействует с 3'-контекстом стоп-кодонов, был получен набор мРНК, содержащих наиболее и наименее распространенные в геноме человека контексты стоп-кодонов, и на них были собраны претерминационные комплексы. Для комплексов с UAA-стоп-кодоном наблюдалась трехкратная разница в эффективности терминации трансляции, индуцируемые фактором eRFl в присутствии еКРЗ-ГТФ. в условиях «хорошего» и «плохого» контекстов. Было высказано предположение о важности сходства нуклеотидного состава З'-контекст и стоп-кодопа для эффективной терминации трансляции.

Таким образом, нами выявлены позиции в eRFl человека, принимающие участие в процессе декодирования стоп-сигналов, однако для того, чтобы окончательно понять механизм терминации трансляции эукариот необходимо получение кристаллической структуры эукариотической рибосомы и различных терминационных комплексов высокого разрешения.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Материалы

3.1.1. Реактивы

В работе использовали реактивы следующих фирм: триитон, дрожжевой экстракт, агар - «Difco» (США); агароза, ß-меркаптоэтанол - «Sigma» (США); Triton Х-100 -«MP Biomedicals» (США), акриламид и метиленбисакриламид, бромистый этидий, IPTG, ЭДТА. SDS. ДТТ- «Serva» (Германия); дезоксинуклеозидтрифосфаты, набор флуоресцентных иолинуклеотидов для капиллярного электрофореза CXR (Promega), наборы полинуклеотидов - стандартов молекулярных весов для электрофореза ДНК, наборы полипептидов - стандартов молекулярных весов для электрофореза белков, гликоген - «Fermentas» (Литва); трис, ацетаты калия, аммония и натрия, имидазол - «Merck» (Германия); персульфат аммония и TEMED «Bio-Rad» (США); глицерин - «ICN» (США); смола для металл-аффинной хроматографии - «Ni-NTA Superflow» фирмы «Sigma» (США). Все остальные использованные в работе реактивы были отечественного производства квалификации о.с.ч. Радиоактивные соединения: у- PJdGTP синтезирован

Ю.С.Скобловым (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва), L S]-L

-метионин фирмы "PerkinElmer" (США). Лизат из ретикулоцитов кролика был получен сотрудниками лаборатории Л.П. Овчинникова (Институт Белка, Пущино).

3.1.2. Ферменты

В работе использовали следующие ферменты: эндонуклеазы рестрикции - Bst98l, Ndel, Xhol, BgñI, Ncol фирм «Fermentas», «Promega»; ДНК-полимеразы: Taq -«Fermentas», HiFi - «Sileks» (Россия), Pfii Turbo - «Stratagene» (США). ДНК-лигаза фага T4 и РНКаза А, ингибитор рибонуклеаз фирмы «Fermentas». AMV обратная транскриптаза «Promega».

3.1.3. Штаммы бактерий и плазм иды

Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе, представлены в Табл. 3.1.

1. Kisselev, L., Ehrenberg, M. and Frolova, L. (2003). Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? The EMBO Journal 33, 175-182.

2. Nakamura, Y. and Ito, K. (2003). Making sense of mimic in translation termination. Trends Biochem. Sci 28, 99-105.

3. Korostelev, A., Zhu, J., Asahara, H. and Noller, H.F. (2010). Recognition of the amber UAG stop codon by release factor RF1. EMBO J 29, 2577-85.

4. Laurberg, M., Asahara, H., Korostelev, A., Zhu. J., Trakhanov, S. and Noller, H.F. (2008). Structural basis for translation termination on the 70S ribosome. Nature 454, 852-7.

5. Weixlbaumer, A., Jin, H., Neubauer, C., Voorhees, R.M., Petry, S., Kelley, A.C. and Ramakrishnan, V. (2008). Insights into translational termination from the structure of RF2 bound to the ribosome. Science 322, 953-6.

6. Kong. C. et al. (2004). Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. Molecular Cell 14, 233-245.

7. Cheng, Z. et al. (2009). Structural insights into eRF3 and stop codon recognition by eRFl. Genes Dev 23, 1106-18.

8. Alkalaeva, E.Z., Pisarev, A.V., L.Y.F., Kisselev, L.L. and Pestova, T.V. (2006). In Vitro Reconstitution of Eukaryotic Translation Reveals Cooperativity between Release Factors eRFl and eRF3. Cell 125, 1125-1136.

9. Nakamura, Y., Ito, K. and L.A., I. (1996). Emerging understanding of translation termination. Cell 87, 147-150.

10. Pisarev, A.V., Hellen, C.U. and Pestova. T.V. (2007). Recycling of eukaryotic posttermination ribosomal complexes. Cell 13 1, 286-99.

11. Pisarev, A.V., Skabkin, M.A., Pisareva, V.P., Skabkina, O.V., Rakotondrafara, A.M., Hentze, M.W., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. The role of ABCE1 in eukaryotic posttermination ribosomal recycling. Mol Cell 37, 196-210.

12. Petry, S., Weixlbaumer, A. and Ramakrishnan, V. (2008). The termination' of translation. Curr Opin Struct Biol 18, 70-7.

13. Liang, A., Brunen-Nieweler, C., Muramatsu, T., Kuchino, Y., Beier. H. and Heckmann, K. (2001). The ciliate Euplotes octocarinatus expresses two polypeptide release factors of the type eRFl. Gene 262, 161-8.

14. Inagaki, Y. and Doolittle, W.F. (2001). Class I release factors in ciliates with variant genetic codes. Nucl Acids Res 29. 921-7.

15. Chapman, B. and Brown, C. (2004). Translation termination in Arabidopsis thaliana: characterisation of three versions of release factor 1. Gene 341, 219-25.

16. Guenet, L. et al. (1999). Human release factor eRFl: structural organisation of the unique functional gene on chromosome 5 and of the three processed pseudogenes. FEBSLett 454, 131-6

17. Caron, F. and Meyer, E. (1985). Does Paramecium primaurelia use a different genetic code in its macronucleus? Nature 314. 185-8.

18. Preer, J.R, Jr., Preer, L.B., Rudman, B.M. and Barnett, A J. (1985). Deviation from the universal code shown by the gene for surface protein 51A in Paramecium. Nature 314, 188-90.

19. Meyer, F., Schmidt, PI.J., Plumper. E., Hasilik, A., Mersmann, G., Meyer, H.E., Engstrom, A. and Heckmann, K. (1991). UGA is translated as cysteine in pheromone 3 of Euplotes octocarinatus. ProcNatl Acad Sci USA. 88, 3758-61.

20. Lozupone, C.A, Knight, R.D. and Landweber, L.F. (2001). The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates. Curr Biol 11, 65-74.

21. Osawa, S. and Jukes, T.H. (1989). Codon reassignment (codon capture) in evolution. J Mol Evol 28, 271-8.

22. Frolova, L. et al. (1994). A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties of polypeptide chain release factor. Nature 372, 701-3.

23. Seit-Nebi,-A., Frolova, L., Justesen. J. and Kisselev, L. (2001). Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for stop codon recognition. Nucl Acids Res 29, 3982-7.

24. Zavialov, A.V. Mora, L., Buckingham, R.H. and Ehrenberg, M. (2002). Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol Cell 10, 789-98.

25. Mora, L., Zavialov, A., Ehrenberg, M. and Buckingham, R.H. (2003). Stop codon recognition and interactions with peptide release factor RF3 of truncated and chimeric RF1 and RF2 from Escherichia coli. Mol Microbiol 50, 1467-76.

26. Shaw, J.J. and Green, R. (2007). Two distinct components of release factor function uncovered by nucleophile partitioning analysis. Mol Cell 28, 458-67.

27. Nissen, P., Kjeldgaard, M. and Nyborg, J. (2000). Macromolecular mimicry. EMBO J 19,489-95.

28. Nakamura, Y., Ito, K. and Ehrenberg, M. (2000). Mimicry grasps reality in translation termination. Cell 101, 349-352.

29. Nakamura, Y., Ito, K. and Isaksson, L.A. (1996). Emerging understanding of translation termination. Cell 87, 147-150.

30. Le Goff, X., Philippe, M. and Jean-Jean, O. (1997). Overexpression of human release factor 1 alone has an antisuppressor effect in human cells. Mol Cell Biol 17, 3164-72.

31. Vestergaard, В., Van, L.B., Andersen, G.R., Nyborg, J., Buckingham, R.H. and Kjeldgaard, M. (2001). Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl. Mol Cell 8, 1375-82.

32. Schmitt, E., Panvert, M., Blanquet, S. andMechulam, Y. (1998). Crystal structure of methionyl-tRNAiMet transformylase complexed with the initiator formyl-methiony 1 -tRNAfMet. EMBO J 17. 6819-26.

33. Dincbas-Renqvist, V., Engstrom, A., Mora, L., Heurgue-Hamard, V., Buckingham, R. and Ehrenberg, M. (2000). A post-translational modification in the GGQ motif of RF2 from Escherichia coli stimulates termination of translation. EMBO J 19, 69007.

34. Figaro, S., Scrima, N., Buckingham. R.H. and Heurgue-Hamard, V. (2008). HemK2 protein, encoded on human chromosome 21, methylates translation termination factor eRFl. FEBS Lett 582, 2352-6.

35. Seit-Nebi, A., Frolova, L., Justesen. J. and Kisselev, L. (2001). Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for stop codon recognition. Nucleic Acids Res 29, 3982-7.

36. Knight, R.D. and Landweber, L.F. (2000). The early evolution of the genetic code. Cell 101,569-72.

37. Merkulova, T.I., Frolova, L.Y., Lazar, M., Camonis, J. and Kisselev, L.L. (1999). C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett 443, 41-7.

38. Eurwilaichitr, L., Graves, F.M., Stansfield, I. and Tuite, M.F. (1999). The C-terminus of eRFl defines a functionally important domain for translation termination in Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol 32, 485-96.

39. Wang, W., Czaplinski, K., Rao, Y. and Peltz, S.W. (2001). The role of Up f proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts. EMBO J 20, 880-90.

40. Czaplinski, K., Majlesi, N., Banerjee, T. and Peltz, S.W. (2000). Mttl is a Upfl-like helicase that interacts with the translation termination < factors and whose overexpression can modulate termination efficiency. RNA 6, 730-43.

41. Urakov, V.N., Valouev, I.A., Lewitin, E.I., Paushkin, S.V., Kosorukov, V.S., Kushnirov, V.V., Smirnov, V.N. and Ter-Avanesyan, M.D. (2001). Ittlp, a novel protein inhibiting translation termination in Saccharomyces cerevisiae. BMC Mol Biol 2, 9.

42. Кононенко A.B., Дембо K.A. Киселев JI.JT., Волков В.В. (2004). Молекулярная морфология фактора терминации трансляции 1-ого класса эукариот eRFl в растворе. Молекуляр. биология. 38. 303—311.

43. Chavatte, L. Seit-Nebi, A., Dubovaya, V. and Favre, A. (2002). The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome. EMBO J 21, 5302-11.

44. Rawat U.B., Zavialov A.V., Sengupta J., Valle M., Grassucci R.A., Linde J., Vestergaard В., Ehrenberg M., Frank J. (2003). A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factor RF2. Nature 421, 87-90.

45. Klaholz, B.P., Pape, Т., Zavialov, A.V., Myasnikov, A.G., Orlova, E.V., Vestergaard, В., Ehrenberg, M. and van Heel, M. (2003). Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2. Nature 421, 90-4.

46. Frolova, L.Y., Merkulova. T.I. and Kisselev, L.L. (2000). Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains. RNA 6, 381-90.

47. Молотков, M.B., Грайфер, Д.М., Демешкина, H.A., Репкова, М.Н., Веньяминова, А.Г., Карпова, Г.Г. (2005). Расположение матрицы с З'-стороныот кодона в А-участке на 80S рибосоме человека. Молекуляр. биология. 39 (6), 999-1007

48. Воробьев, Ю.Н., Киселев, JI.JI. (2007). Модель структуры эукариотического рибосомного комплекса терминации трансляции. Молекуляр. биология. 41, 103-111.

49. Shin, D.H., Brandsen, J., Jancarik, J. Yokota, H., Kim, R. and Kim, S.H. (2004). Structural analyses of peptide release factor 1 from Thermotoga maritima reveal domain flexibility required for its interaction with the ribosome. J Mol Biol 341, 227-39.

50. Rawat, U., Gao, H., Zavialov, A. Gursky, R. Ehrenberg, M. and Frank, J. (2006). Interactions of the release factor RF1 with the ribosome as revealed by cryo-EM. J Mol Biol 357, 1144-53.

51. Vestergaard, B. et al. (2005). The SAXS solution structure of RF1 differs from its crystal structure and is similar to its ribosome bound cryo-EM structure. Mol Cell 20, 929-38.

52. Graille, M., Heurgue-Hamard, V., Champ. S., Mora, L., Scrima, N., Ulryck, N., van Tilbeurgh, H. and Buckingham, R.H. (2005). Molecular basis for bacterial class I release factor methylation by PrmC. Mol Cell 20, 917-27.

53. Ma, B. and Nussinov, R. (2004). Release factors eRFl and RF2: a universal mechanism controls the large conformational changes. J Biol Chem 279. 53875-85.

54. Milman, G., Goldstein, J., Scolnick, E. and Caskey, T. (1969). Peptide chain termination. 3. Stimulation of in vitro termination. Proc Natl Acad Sci U S A 63, 183-90.

55. Mikuni, O., Ito, K. Moffat, J., Matsumura, K. McCaughan, K., Nobukuni, Т., Tate, W. and Nakamura, Y. (1994). Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 5798-802.

56. Zavialov, A.V., Buckingham, R.H. and Ehrenberg, M. (2001). A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell 107, 115-24.

57. Mortensen, K.K., Hansen, H.F., Grentzmann, G., Buckingham. R.H. and Sperling-Petersen, H.U. (1995). Osmo-exprcssion and fast two-step purification of Escherichia coli translation termination factor RF-3. Eur J Biochem 234, 732-6.

58. Gao, H. et al. (2007). RF3 induces ribosomal conformational changes responsible for dissociation of class I release factors. Cell 129, 929-41.

59. Beaudet, A.L. and Caskey, C.T. (1970). Release factor translation of RNA phage terminator codons. Nature 227,38-40

60. Freistroffer, D.V., Kwiatkowski, M , Buckingham, R.IT. and Ehrenberg, M. (2000). The accuracy of codon recognition by polypeptide release factors. Proc Natl Acad SciUS A 97, 2046-51.

61. Frolova, L. Goff, X.L., Zhouravleva, G., Davydova, E., Philippe, M. and Kisselev, L. (1996). Eucaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is a eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA 2. 334-341.

62. Stansfield, I. et al. (1995). The products of the SUP45 (eRFl) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 14,4365-73.

63. Frolova, L.Y. et al. (1998). Functional expression of eukaryotic polypeptide chain release factors 1 and 3 by means of baculovirus/insect cells and complex formation between the factors. Eur J Biochem 256, 36-44.

64. Salas-Marco, J. and Bedwell, D.M. (2004). GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination. Mol Cell Biol 24, 776978.

65. Инге-Вечтомов, С.Г., Миронова, JI.H., Тер-Аванесян, М.Д. (1994). Неоднозначность трансляции: Версия эукариот? Генетика, 30 (8), 1022-35.

66. Inge-Vechtomov, S., Zhouravleva, G. and Philippe, M. (2003). Eukaryotic release factors (eRFs) history. Biol Cell 95, 195-209.

67. Volkov, K., Osipov, K., Valouev, I., Inge-Vechtomov. S. and Mironova, L. (2007). N-terminal extension of Saccharomyces cerevisiae translation termination factor eRF3 influences the suppression efficiency of sup35 mutations. FEMS Yeast Res 7, 357-65.

68. Song, L., Wang, Y., Chai, В. Wang. W. and Liang, A. (2007). C-terminal 76 amino acids of eRF3 are not required for the binding of release factor eRFla from Euplotes octocarinatus. J Genet Genomics 34. 486-90.

69. Якобсен, Ш.Г., Сегаард, T.M.M., Жан-Жан, О., Фролова, JL, и Юстесен, Ю. Идентификация нового фактора терминации трансляции eRF3b, обладающего in vitro и in vivo активностью eRF3. (2001). Молекулярная биология 35, 672681

70. Chauvin, С., Salhi, S. and Jean-Jean, О. (2007). Human eukaryotic release factor 3a depletion causes cell cycle arrest at G1 phase through inhibition of the mTOR pathway. Mol Cell Biol 27, 5619-29.

71. Chauvin, C., Salhi, S., Le Goff, C., Viranaicken, W., Diop, D. and Jean-Jean, O. (2005). Involvement of human release factors eRF3a and eRF3b in translation termination and regulation of the termination complex formation. Mol Cell, Biol 25, 5801-11.

72. Chai, B., Wang, W. and Liang, A. (2008). Nuclear localization of eukaryotic class II release factor (eRF3): Implication for the multifunction of eRF3 in ciliates Euplotes cell. Cell. Biol. Int. 32, 353-357.

73. Funakoshi, Y. et al. (2007). Mechanism of mRNA deadenylation: evidence for, a molecular- interplay between translation termination factor eRF3 and mRNA deadenylases. Genes Dev 21, 3135-48.

74. Ivanov, P.V., Gehring, N.H., Kunz. J.B., Hentze, M.W. and Kulozik, A.E. (2008). Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal, 1-12.

75. Hauryliuk, V., Zavialov, A., Kisselev, L. and Ehrenberg, M. (2006). Class-1 release factor eRFl promotes GTP binding by class-2 release factor eRF3. Biochimie 88, 747-57.

76. Pisareva, V.P., Pisarev, A.V., Hellen, C.U., Rodnina, M.V. and Pestova, T.V. (2006). Kinetic analysis of interaction of eukaryotic release factor 3 with guanine nucleotides. J Biol Chem

77. Kononenko. A.V., Mitkevich, V.A. Dubovaya, V.I., Kolosov, P.M., Makarov, A.A. and Kisselev, L.L. (2007). Role of the individual domains of translation termination factor eRFl in GTP binding to eRF3. Proteins, In press.

78. Ito, K., Uno, M. and Nakamura, Y. (1998). Single amino acid substitution in prokaryote polypeptide release factor 2 permits it to terminate translation at all three stop codons. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 8165-9.

79. Ebihara, K. and Nakamura, Y. (1999). C-terminal interaction of translational release factors eRFl and eRF3 of fission yeast: G-domain uncoupled binding and the role of conserved amino acids. RNA 5, 739-50.

80. Merkulova, T.I., Frolova, L.Y., Lazarc, M., Camonis, J. and Kisselev, L.L. (1999). C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Letters 443, 41-47.

81. Hauryliuk, V., Zavialov, A., Kisselev, L. and Ehrenberg, M. (2006). Class-1 release factor eRFl promotes GTP binding by class-2 release factor eRF3. Biochimie 88, 747-757.

82. Pisareva, V.P., Pisarev, A.V., Hellen, C.U.T., Rodnina, M.V. and Pestova, T.V. (2006). Kinetic Analysis of Interaction of Eukaryotic Release Factor 3 with Guanine Nucleotides. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 281, 40224-40235

83. Kononenko, A.V., Mitkevich, V.A. Dubova) a. V.I., Kolosov, P.M., Makarov, A.A. and Kisselev, L.L. (2008). Role of the individual domains of translation termination factor eRF 1 in GTP binding to eRF3. Proteins 70, 388-393.

84. Andjelkovic, N., Zolnierowicz, S., Van Hoof, C., Goris, J. and Hemmings, B.A. (1996). The catalytic subunit of protein phosphatase 2A associates with the translation termination factor eRFl. EMBO J 15, 7156-67.

85. Nissen. P., Kjeldgaard, M., Thirup, S„ Polekhina, G., Reshetnikova, L., Clark, B.F. and Nyborg, J. (1995). Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270, 1464-72.

86. Salas-Marco, J. and M., B.D. (2004). GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon secoding during eukaryotic translation termination. Molecular and Cellular Biology 24, 7769-7778.

87. Ito, K., Uno, M. and Nakamura, Y. (2000). A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA. Nature 403, 680-4.

88. Nakamura, Y. and Ito, K. (2002). A tripeptide discriminator for stop codon recognition. FEBS Letters 514, 30-33.

89. Moffat, J.G. and Tate, W.P. (1994). A single proteolytic cleavage in release factor 2 stabilizes ribosome binding and abolishes peptidyl-tRNA hydrolysis activity. J Biol Chem 269, 18899-903.

90. Poole, E. and Tate, W. (2000). Release factors and their role as decoding proteins: specificity and fidelity for termination of protein synthesis. Biochim Biophys Acta 1493, 1-11.

91. Chavatte, L., Frolova, L., Kisselev, L. and Favre, A. (2001). The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes. Eur J Biochem 268. 2896-904.

92. Bertram, G., Bell, H.A., Ritchie, D.W., Fullerton, G. and Stansfield, I. . (2000). Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop-codon recognition. RNA 6, 1236-1247.

93. Fan-Minogue, H. et al. (2008). Distinct eRF3 requirements suggest alternate eRFl conformations mediate peptide release during eukaryotic translation termination. Mol Cell 30, 599-609.

94. Frolova, L., Seit-Nebi, A. and Kisselev, L. (2002). Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRFl. RNA 8, 129-36.

95. Seit-Nebi, A., Frolova, L. and Kisselev, L. (2002). Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl. EMBORep 3, 881-6.

96. Kolosov, P., Frolova, L., Seit-Nebi, A., Dubovaya, V., Kononenko, A., Oparina, N., Justesen, J., Efimov, A., Kisselev, L. (2005). Invariant amino acids essential for decoding function of polypeptide release factor eRFl. Nucl. Acids Res. 33, 641825.

97. Bertram, G., Bell, H.A., Ritchie, D.W., Fullerton, G. and Stansfield, I. (2000). Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition. RNA 6, 1236-47.

98. Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.II. and Noller, H.F. (2001). Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 292, 883-96.

99. Nakamura, Y., Ito, K. and Ehrenberg, M. (2000). Mimicry grasps reality in translation termination. Cell 101, 349-52.

100. Muramatsu, Т., Heckmann, K., Kitanaka, C. and Kuchino, Y. (2001). Molecular mechanism of stop codon recognition by eRFl: a wobble hypothesis for peptide anticodons. FEBS Lett 488, 105-9.

101. Karamyshev, A.L., Ito. K. and Nakamura, Y. (1999). Polypeptide release factor eRFl from Tetrahymena thermophila: cDNA cloning, purification and complex formation with yeast eRF3. FEBS Lett 457, 483-8.

102. Журавалева, Г.А., Москаленко, C.E., Мурина, O.A., Инге-Вечтомов, С.Г. (2007). Жизнеспособные нонсенс-мутанты по гену SUP45 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae детальны при повышенной температуре. Генетика. 43 (10), 1363 1371.

103. Inagaki, Y., Blouin, С., Doolittle, W.F. and Roger, A.J. (2002). Convergence and constraint in eukaryotic release factor 1 (eRFl) domain 1: the evolution of stop codon specificity. Nucleic Acids Res 30, 532-44.

104. Chavatte, L., Kervestin, S., Favre, A. and Jean-Jean, O. (2003). Stop codon selection in eukaryotic translation termination: comparison of the discriminating potential between human and ciliatc eRFls. EMBO J 22. 1644-53.

105. Wang, Y., Chai, В., Wang, W. and Liang, A. Functional characterization of polypeptide release factor lb in the ciliate Euplotes. Biosci Rep 30, 425-31.

106. Lekomtsev, S., Kolosov, P., Bidou. L., Frolova, L., Rousset, J.P. and Kisselev, L. (2007). Different modes of stop codon restriction by the Stylonychia and Paramecium eRFl translation termination factors. Proc Natl Acad Sci USA 104, 10824-9.

107. Kolosov, P. et al. (2005). Invariant amino acids essential for decoding function of polypeptide release factor eRFl. Nucleic Acids Res 33, 6418-25.

108. Bulygin, K.N. et al. Three distinct peptides from the N domain of translation termination factor eRFl surround stop codon in the ribosome. RNA 16, 1902-14.

109. Liang, H., Wong, J.Y., Bao, Q., Cavalcanti, A.R. and Landweber, L.F. (2005). Decoding the decoding region: analysis of eukaryotic release factor (eRFl) stop codon-binding residues. J Mol Evol 60, 337-44.

110. Morris, D.K. andLundblad. V. (1997). Programmed translational frameshifting in a gene required for yeast telomere replication. Curr Biol 7, 969-76.

111. Bertram, G„ Innes, S., Minella, O., Richardson. J.P. and Stansfield, I. (2001). Endless possibilities: translation termination and stop codon recognition. Microbiology 147, 255-269.

112. Poole, E.S., Brown, C.M. and Tate, W.P. (1995). The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli. EMBO J 14, 151-8.

113. McCaughan, K.K., Brown, C.M. Dalphin, M.E., Berry, M.J. and Tate, W.P. (1995). Translational termination efficiency in mammals is influenced by the base following the stop codon. Proc Natl Acad Sci U S A 92. 5431-5.

114. Bonetti, B. Fu, L., Moon. J. and Bedwell, D.M. (1995). The efficiency of translation termination is determined by a synergistic inteiplay between upstream and downstream sequences in Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol 251, 334-45.

115. Li, G. and Rice, C.M. (1993). The signal for translational readthrough of a UGA codon in Sindbis virus RNA involves a single cytidine residue immediately downstream of the termination codon. J Virol 67, 5062-7.

116. Cassan, M. and Rousset, J.P. (2001). UAG readthrough in mammalian cells: effect of upstream and downstream stop codon contexts reveal different signals. BMC Mol Biol 2,3.

117. Namy, O., Duchateau-Nguyen, G., Hatin, I., Flermann-Le Denmat. S., Termier, M. and Rousset, J.P. (2003). Identification of stop codon readthrough genes in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 31, 2289-96.

118. Grundncr-Culemann, E., Martin, G.W., 3rd, Tujebajeva, R., Harney, J.W. and Berry, M.J. (2001). Interplay between termination and translation machinery in eukaryotic selenoprotein synthesis. J Mol Biol 310, 699-707.

119. Namy, O., Hatin, I. and Rousset, J.P. (2001). Impact of the six nucleotides downstream of the stop codon on translation termination. EMBO Rep 2, 787-93.

120. Pavlov. M.Y., Freistroffer, D.V., Dincbas, V., MacDougall, J., Buckingham, R.PI. and Ehrenberg, M. (1998). A direct estimation of the context effect on the efficiency of termination. J Mol Biol 284, 579-90.

121. Mottagui-Tabar, S., Bjornsson, A. and Isaksson, L.A. (1994). The second to last amino acid in the nascent peptide as a codon context determinant. EMBO J 13, 24957.

122. Doronina, V.A. and Brown, J.D. (2006). Non-canonical decoding events at stop codons in eukaryotes. Mol Biol (Mosk) 40. 731-41.

123. Mottagui-Tabar, S., Tuite, M.F. and Isaksson, L.A. (1998). The influence of 5' codon context on translation termination in Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem 257, 249-54.

124. Bjornsson, A., Mottagui-Tabar, S. and Isaksson. L.A. (1996). Structure of the C-terminal end of the nascent peptide influences translation termination. EMBO J 15, 1696-704.

125. Doronina, V.A., Wu, C., de Felipe. P., Sachs, M.S., Ryan, M.D. and Brown, J.D. (2008). Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol 28. 4227-39.

126. Arkov, A.L., Korolev, S.V. and Kisselev, L.L. (1993). Termination of translation in bacteria may be modulated via specific interaction between peptide chain release factor 2 and the last peptidyl-tRNA(Ser/Phe). Nucleic Acids Res 21, 2891-7.

127. Zhang. S., Ryden-Aulin, M. and Isaksson, L.A. (1996). Functional interaction between release factor one and P-site peptidyl-tRNA on the ribosome. J Mol Biol 261,98-107.

128. Zhang, S., Ryden-Aulin, M. and Isaksson, L.A. (1998). Functional interaction between tRNA2Gly2 at the ribosomal P-site and RF1 during termination at UAG. J Mol Biol 284, 1243-6.

129. Zhang, S., Ryden-Aulin. M. and Isaksson, L.A. (1999). Interaction between a mutant release factor one and P-site peptidyl-tRNA is influenced by the identity of the two bases downstream of the stop codon UAG. FEBS Lett 455, 355-8.

130. Salas-Marco, J., Fan-Minogue, H., Kallmeyer, A.K., Klobutcher, L.A., Farabaugh, P.J. and Bedwell, D.M. (2006). Distinct paths to stop codon reassignment by the variant-code organisms Tetrahymena and Euplotes. Mol Cell Biol 26, 438-47.

131. Лекомцев, С.А., Колосов, П.М., Фролова, Л.Ю., Виду, Л., Руссэ, Ж.-П., Киселев, Л.Л. 2007. Как фактор термииации трансляции eRFl ресничных рода Euplotes не узнает стоп кодон UGA. Молекуляр. биология. 41, 1014—1022.

132. Atkinson, G.C., Baldauf, S.L. and llauryliuk, V. (2008). Evolution of nonstop, no-go and nonsense-mediated mRNA decay and their termination factor-derived components. BMC Evol Biol 8, 290.

133. Jacobs, G.PL, Chen, A., Stevens, S.G., Stockwell, P.A., Black, M.A., Tate, W.P. and Brown, C.M. (2009). Transterm: a database to aid the analysis of regulatory sequences in mRNAs. Nucleic Acids Res 37, D72-6.

134. Studier, F.W. and Moffatt. В .A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113-30.

135. Brinkmann, U., Mattes, R.E. and Buckel, P. (1989). High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene 85. 109-14.

136. Sarkar, G. and Sommer, S.S. (1990). The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis. Biotechniques 8, 404-7.

137. Sambrook J., Fritsch E.F. and Т., a.M. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual., 2 edn (N.Y., Cold Spring Harbor)

138. Mandel, M. and Higa, A. (1970). Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J Mol Biol 53, 159-62.

139. Alkalaeva, E., Eliseev В., Ambrogclly, A., Vlasov, P., Kondrashov, F.A., Gundllapalli, S., Frolova, L., Soli, D. (2009). Translation termination in pyrrolysine-utilizing archaea. FEBS Lett 583, 3455-60.

140. Kabcenell, A.K., Goud, В., Northup, .Т.К. and Novick, P.J. (1990). Binding and hydrolysis of guanine nucleotides by Sec4p, a yeast protein involved in the regulation of vesicular traffic. J Biol Chem 265, 9366-72.