Исследование глутаматактивированной проводности изолированных нейронов гиппокампа крыс с помощью структурных аналогов глутамата и короткотерминовой аппаликации агонистов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ОД АКАДЕМШ НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ БЮ0РГАН1ЧН01 XIMIÏ ТА НАФТОХ1МИ

На правах рукопису

РИБАЛЬЧЕНКО Володимир Васильевич

ДОСЛЩЖЕННЯ ГЛУТАМАТАКТИВОВАНСН ПРОВ1ДНОСТ1 130ЛБ0ВАНИХ НЕЙРОН1В Г1 ПО KAM ПА ЩУР1В ЗА ДОПОМОГОЮ СТРУКТУРНИХ АНАЛОГ1В ГЛУТАМАТУ ТА KOPOTKOTEPMIHOBOÏ АПЛ1КАЦИ АГОН1СТ1В

02.00.10 — Бюоргашчна xímía, xímía природних i фЫолопчно активних речовин

АВТОРЕФЕРАТ дисертацД ка здобуття наукового ступени кандидата б!олог1чннх наук

КиТв — 1994

АКАДЕМ1Я НАУК УКРАГНИ •ШСТИТУТ Б100РГАН1ЧН01 Х1М11 ТА НАФТОХШИ

ва правах рукогшсу

РИБАЛЬЧЕНКО ВОЛОДИШР ВАСИЛЬОВИЧ

ДОСЛ1ДЖЕННЯ ГЛУТАМАТАКТИВ0ВАН01 ПРОВ1ДНОСТ1 130ЛЬ0ВАНИХ НЕИРОШВ ГШОКАМПА ЩУР1В ЗА ДОПОМОГОЮ СТРУКТУИШХ АНАЛОГ1В ГЛУТАМА1/ ТА КОРОТКОТЕРМШОВО! АПЛШАЩ1 АГОН1СТ1В

. 02.00.10 - Б1оорган1чна х1ы1я, х1м1я природних 1 ф1э1олог1чво актившх речовин

■ Автореферат

дисертацИ ва здоСуття ваукового ступе ня кандидата . б!олог1чних наук

Ки1в - 1994

Ди.сертац1вю з рукописи. .

Робота виконана в 1нститут1 <51оорган1чно1 х1мИ та нафтох1м11 АН Укра1ни,.

Науков! кер1вники:

доктор медачних йаук, професор • 0.1.ЛуЯг .

0ф1ц1йн'1' опоненти:

Кандидат С1олог1чних наук Р.М.Скрима

доктор медичних наук .Л.Ы.Зайцев

кандидат. 61олог1чних наук ¿.Я. Циндренко

Пров!дна установа:

Ф1зико-х1м1чшй. 1нститут 1м.О.В.Богатського АН УкраКни, м.Одеса.'

Захист в1дбудеться

26

С1ЧНЯ

1994

р- на.

засцданн! спец1ал1зовано1 вчено! ради Д 016.65.01 в Iпетитут1 С1оорган1чно1 Х1м11 • та нафтохШ! АН УкраНш (253660, м.КШв, вул.Мурманська, 1)'. ?

3 дасерт8ц1ею мокна ознайоштись в 01бл1отец1 1нституту Шоорган1чно1 х1м11 та нафтох1мП АН Укра1ни (25366Ь, м.КШв, вул.Мурманська, 1).

Автореферат роз! сланий "28 « 1993'Р-.

Вчепий свкре^ар . . спец1а1зовано1 ачвно! ради

Я.М.Федоряк.

1'. ЗАГАЛЬНА, ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

"Актуальн! сть проблеми. Елементарн! процеси передач! збудження м1ж нейронами .мозку, як\ лежать в основ! навчання 1 лам'ят1, эумов-лен! функц!онуванням р!зних тип!в глутаматактивованих рецептор]в (ГР) - нейрональних мембран. Патолог!чн! зм!ни нормального режиму роботи ГР започатковують виникнення'захворюваяь Парк1неона 1 Альц-геймера, е^ЛлепсП, тяжких порушень'обм!ну речовия та координацН.

Для ц!лэспрямованого попуку перспективних мед. чних блокатор!в 1 агон1с!в ГР вэжливэ докор!нне вивчення особливостей будови рецептор^ 1 !х конформац!йшс: перетворень.'0собливо1 ваги в зв'язку з цим кабувають досл!дження взаемодН ГР з структурниш аналогами глу'чмата, в результат! яких отримуються в!домост! про зв'яэок м!ж • Судовою цих молекул 1 1х фармаколог1чною'активн!стю. Одночасно може бути уточнена 1снуюч.а класиф!кац!я ГР.

В сучасн!й класиф1кац!1 ГР, окр!м основних тип!в - Н-метил-О-аспартатних (Ш)А) ! не-ШВА рецептор!в, мало досл1дона роль ро-цептор!в 2-ам1но-4-фосфономасляно1 кислоти (АР4). В1дом1 блокуюч! властивост! АР4 щодо синаптично1 передач! в р1зних д!лянках мозку .1 сИчатки, ■ зле пресинаптична чи постсинаптична локал1зац1я ц1 в! д11 эдеб1льшого лишаеться доскус!йною. На онов1 проведения; досл!джень фармаколог!чно! д! 1 АР4 1 деяких 11 структурних аналог1в на ГР перфузованих нейрон1в г!покампу щур1в, в подан!й робот1 робиться висновок про нездатн1сть ЛР4 блокувати иостсинаптичн1 рецептори не-ШБА^тшу, як1 опосередкують швидку передачу сигналу в синапсах.

Глутаматрецептивний комплекс (ГРК) являв собою 0!лкове утво-рення, яке складаеться з поверхневого рецептора 1 керованого ним' трансмембранного Юнного каналу. Формування адекеватного уявления про мэхан1зми фармаколог!чно! д11 препарат1в неможливе без поперед-нього вивчення шлях1в передач! сигналу в1д рецептора до Юнного каналу. В представленШ робот! динам!ка Конформац1йних стан!в ГРК вивчалась методом анал!зу трансмембранних !онних струм!в", як! вини-кають п1д час агоИкяцН агон!ст!в ГР на 1зольован! нейро!ш. В межах виконання роботи була удосконалена методика апл!кац!1 розч1ш!в на ■нейрон. Не дозволило скоротити одноразову експозидю глутамяту /,о М1л1секукдних пггорвал^в, »що в!дпов!дае ф1з!олог1чному часу реал!- 1 -

з&ц11 синаптично! передач! в хивому орган1зиов1. Завдяки цьому' вдалося !м!тувати викликану ритм!чну активность нейрона 1 детальнее о'характеризувати конформац1йн1 перехода - м1ж активованим 1 двсе^ситизованим станами рецептор!в.

Мета робота; ривчення конформац!йних перех1дних 'процес!в' в глутаматактивованих рецепторних комплексах; 1 • досл!дження Фармаколог1чно1 д!1 2-ам1но-4-ф>сфономасляно1 кислота та П синтетичних структурних аналог!в на глутаматн! рецейтори

Основн! задач! досл!даення: '

1).розробита методику короткочасно! нетравматично1 апл!кац11 агон!ст1в на !зольований кл!тишшй нейронний препарат;

2)оц1нити фармаколог!чну д!ю 2-ам!но-4-фэсфонома'сляро1 кислота та 1! структурних аналог!в на глутаматни! рецептори мембрана 1з.ольованих нейрон!в г!покампу;

3) за допомогою методики короткотривало! ашИкацН гдутамат" отримати в!домост! про динам!ку конформац!йних процес1в в глутаматрецептавних комплексах Шд час збудження нейрон! в глутаматом;

4) на баз1 отриманих результат!в побудувати априорну схему р!зних конформац!йшес стан!в глутаматрецептивного^комплексу;

5) оц!нити вплив десенситизац!1 глутаматрецептавних комщюкс1в на ампл!туду активованих глутаматом струм1в при !м!тацН ритм1чного збудження нейрона.

. Наукова новизна. В робот! вперше наведен1 результата анал!зу фармаколог!чно! д!1 блокатора синаптично! передач! 2-ам!но-4~фосфо- : номасляно! кислота (АР4) на ГР хзольованих нейрон!в. Вони св!дчать про в1дсутн!сть блокуючо! дП АР4 щодо ГР на р!вн! постсинаптачно! мембрани. Впершя показано, що апл1кац!я АР4 здатна активувата ГР за припущенням переважно ШМ типу. Зроблено висновок про в!дсутн!сть • будь-якого впливу АР4 на рецептори не-ГООА типу.

Створена ориг!нальна . методика досл!дження. хемоактивовано! пров1дност1 нейрон1в умохливила скорочення пер!оду аол!кац!1 аго-н1ст1в на мембрану до одиниць м1л1 секунд. Це дозволило досл!даувати к1нетичн! 1 релаксац!йн! характеристики глутаматактивованих струма в, на За?! яких проанал!зовано данам!ку конформац!йних перетво-рень ГРК. Отриман! результата-дозволили детал!зувати умови, необ-х!дн! для вихсту ГР не-№ША типу з десенситизованого стану.

?

Шд час апл1кац11 глутамату сер1ями !мпульс!в досл1джв1п характерн! !нтервали .'частот, за яких десивсеткззшя ГР iстот.;' впливэе на амплитуду ^труг.ив ритм!чп'о збудоуваного нейрона. ПодЮ'ш оксперименти ранше не проводились. '

Теоретично та практична значения робот;'.-. Отркман!. результати дозволяють трактувати мехашзм блокуючо! д11 АР4 на piBHi пресинап-тично!, на в!дм!ну в!д постсинаптично! мембрани. Б1льы детально охарактеризовано стан десенситизац1'1 ГР. Створення методики, корот-котривало! апл!кац!1 дозволяв працювати з 1зольованим нейроном • в реальному темп! проведения синаптично! передач!, що дае змо'гу вивчати фармаколог!чн1 властивост! препарат!в в умовах, максимально наближених до робота нейрона ín ucvo. В1домост1 про д1ю структурних аналог!в АР4 на ГР можуть бути використат для анал1зу 1сн'уючо! клаоиф!кацП рецептор!в i синтезу нових агон1сг!в 1 блокатор1в.

Матер!али роботи допов!дались на Всесоюзн1й нарад! "Актуальн! питания кл1тинно1 б!олог11" (Лен1нград, 1989); на Всесоюзному симпоз!ум! "IohhI канали в б!олог!члих мембранах" (Кара-Даг, 1990); КонференцП АН УкраНш по Програм1 автоматизац!1 наукових досл1дхень (Ки!в, 1993). .

По матер! алах дисертац1'1 опубл!ковано 7 роб!т, 'Робота складаеться 1з'вступу, л!тературного огляду (I розд1л), розгляду методики (II розд1л), експериментально! частини (III роз-д1л), обговорення результат!в (IV розд!л), bhchobkíb 1 списку цито-вано! л!тератури.

. 2. АНАЛ1ТИЧНШ оглад

. В першому роздШ дисертацП зроблено огляд л!тератури сто-совно ф!з1олог1чно1 рол! глутамата, сучасних метод!в досл!дкення ГР, класиф!кац11 1 загального уявлення про функц1онування ГР. 'Роз-глянуто особливост! будови рецептор!в. Наведено перелГк основних властивостей, притаманних л1гандам ГР, серед яких обов'язкова наяв -н!сть двох кислих! одно! основно! груп. Основна-трупа повинна, знаходетись в о.-полокенн! до неодм!нно npncyrml карбокскльног груш. Наявн!сть фосфоноЕо! групи надае молекулам властивостi блокатора ГР. Серед .тр'адиц!йних блокатор!в ГР особливо

' в1дзначаеться АР4, яка вважаеться специф1чним л1гаидом,- окремего ' типу ГР. • Рецептори цього типу знайден1 як. на пре- , так 1 постсинаптичних мембранах нейрон1в. Про мехгш!зм блокуючо! д11 АР4 на оинаптичну передачу отриман1 лише попередн1 в!домост1.

До тепер1шього часу не 1снуе остаточного уявления щоАо динэм1ки конформац!?*чих перетворень ГР п!сля взаемодП з л1гандом. Добре в1дома здатн!сть рецептора переходами в десенситизований стан • гасля тривало! взаемодП з. молекулою л! ганда, але детальна характеристика, як 1 ф1з!олог!чнв значений цього стану знаходяться в процес! вивчення.

'3. МАТЕР1АЛИ I ЫЕТОДИ .

В другому розд1л1 викладено осбливост1 використаних 1 роз-роблених п1д час виконання роботи методик; склада розчишв 1 пароле використаних матёр!ал1в.

Досл1дженнЯ ГР йроводи лись не 1зольованих перфузованих нейро-. нах г1покампа щур1в% Для випробування фармаколог1чних вла'стивостей АР4 та II структурних аналог!в була Ейкористона удосконалдена методика швидао! апл!кацИ розчин1в (нетодика "ф!ксацП концентрац1I"). •Автоматизац1 я задания режим! в проведения експеркмент1в 1 прото^олю-вання результат! в забезпечувалася за допомогою спец! ально розробло-'ного програмного забезпечення ! змонтованого . електронного обладнання на баз! 1БМ АТ/286 комп'ютера (малЛ).

. Для вивчення дкнаьики конформац!йних поре Судов ГР була розроблена методика короткотрвдзало! ашИкацН агон!ст1в (мал.2). Експлуатац!йний д!эпазон.тривалост! агап кац!1 випробуваних розчин!в на нейрон .-'в1д 6-8 мШсец до 300 м!л!сек. Для повно1 зм!ни розчин!в навколо нейрона витрачалось до 10 мШсек. За допомогою методики . короткотравало! апл1кацП було реал!зовано можлив!сть ЭШ11к8ЦП глутамату на'нейрон парними !мпульсаими з м!ж!мпульсними !нтервалами в!д 60-до 200 м!л!сек 1 ритм!чно! аш^кацП з частотою до 15 Гц.

Використан! при проведенн1 роботи ДР4 ! II структурн! аналоги були синтезован!.у в1дд!л1 тонкого орган!чного синтезу 1нституту б!оорган1чно1 х!м! 1 та нафгох!м11 АН Укра1ш.

- А -

.ПйИрЫи! КМЛ0Н4

Мал..1 Будова кэрованого комп'ютером електромехан1чного вузла автоматично! ' зм1ни ванночок з випробуваними розчинами установки для ступ1нчато!.апл1кац1Х.

Мал.2 Блок-схема система короткотривало! апл1кац11 глутамату на 1зольсв8ний перфузований нейрон.,

А - прухний елемент для створення зтиснення 1 заштовхугання глута-матного розчину в область розташувэння нейрона. В -. прухний элемент для перепускания в!дмивного розчину п1д час апл1кац11. С - регулятор режиму стац1онарного протоку розчин1в. К - двосторонн1й клапан, рухомий за допомпгою електромагн1ту. Суц1львдми стр!лками позначено стац1онарн1 протока глутаматного 1 в1дмивного розчин1в; уривчастики - шремШення клапана 1 у в1 дпов1дност1 з цим стовбчшив розчтпв п!д час апл1кац11 1 в1дмивання.

аппли

"I, А С'г^-а

Ч.

. 3. РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСУПДЖЕНЬ

3.1. Вивчення ГР за допомогою АР4 та структурних аналог!в.

АР4 мае под1бну будову до молвкули природного медиатора синап-тично! передач! - Ь-глутамата. Але на в1дм!ну. в1д нього, застосу-вавня АР4 призводи-Ь до блокування синаптичт,о1 передач1 м1к нейронами г1токампа. Проведения експеримент1в на -!зольованому нейрон1

в^03р-св^-сн2-св-с0ш

(АР4)

2-ам1ю-4-фосфономасляна к-та '

фактично означае досл1даення лише постсинаптично! мембрани що суттево уточнюе локал1зац1ю фармаколог!чно! д11 АР4.

В першу чергу було проведено експерименти по перев!рц! блокунн чо! д!1 АР4. 3' ц1ею метою п!сля попереднього контрольного Запису, глутаматактивованого струму, нейрон оброблявся розчином, який вм1-щував 1 ммоль/л АР4. Повторна апл1кад1я глутамату проводилась на фон! п!дтримувансЦ на цьому .к р1вн1 концентрацН АР4. Отркман! результата засв!дчили, що ампл1туда повторних запис1в глутвмат-активованих'струм!в на 20-30 % меньше, н1ж контрольних. Чи означав це насправд1 прояв блокування молекулами АР4 ГР постсянаптично! мембрани ?• Для перев!рки цього. питания було проведено тестувашя наявност1 у молекул АР4 властивостой активатора рецептор!в. 3 ц!ею метою запис струму проводився в момент ашикацП АР4. З'ясувалося, що в момент апл!кац! I' на нейрон АР4 розвиваеться струм, под!бний за формою до глутаматактивованого з пом1тною тенденцию до десенсити-зацП (мал.З). Амш11туда струм1в, активованих АР4 складала до 30 % ампл1туди струм1в , активованих Ь-глутаматом. Таким чином, молвкули АР4 сл1д розглядати як частков1 активатори ГР постсинаптичноТ мембрани. Результата к попередньо! серп експеримент!в пояснюються десбнситизац!ею значно! частини' ГР, як! провзаемод!яли з молекуле^® АР4, що призводало до зменшення амшИтуди глутаматактивованого струму при повтори!й апл!кац!1 глутамату.

НООС-С^-СЯ^-СН-СООН

Мг

глутам!нова к-та

{мМ АРк 1м/Л 1-Глу

{00 мс

Мал.З Записи струм1в нейрона, активованих Ь-гл'утаматом (1 ммоль/л), 1 АР4 (1 ммоль/л).

ноос-сн.

-СН-ССШ

ШС!Ц

(МША)

\

11-мбтил-1)-аспарвг1нова к-та Н00С-СН2-СН-С00Н

та,

аспараг!нова к-та

-{МЗНд-СВ-СООН

V*0 К

и

кв!сквалова к-та <КВК)

В сучасн1й класиф1кац11. ГР основний роэпод1л проводиться м!ж селективними до ИД)А, I рецепторами не-ГОЛ) А типу.' Природним активатором Ш)А-рецептор1в в орган1зм! . ввакаеться Ъ-аспартат (Ь-асп).Одним з найб!льш Селективних активатор!в не-Ш)А-рецептор1в 8 кв1сквалат (КВК). Ь-асп 1 КВК були вжит1 в наступлю^ експеримен-тах, метою яких було з'ясування типу рецептор!в, здатних активу-ватися АР4.

Схема експеримент!в включала: попередню контрольну апл!кац!ю на нейрон розчина КВК (!0,~д моль/л), або Ь-асп (1 ммоль/л) 1 запис

збудхуваноГо струму; короткочасну пре1нкубац!ю нейрона в розчин! ' АР4 (1 ммоль/л); повторну апл!кац!ю розчину з КВК / Ь-асп на фон! п!дгримувано! концентрацП АР4; в1дмивання нейрона 1 прик!нцевий контрольний запис КВК / Ь-асп -активованого. струму .для перев1рки в!новлюваност! функционального стану нейрона,

Анал1з результат!в засв1дчив, що в раз!, -коли з рол! агон!ста виступала КВК, присутн!сть в оточуючому розчиш. АР4 практично не вшшвала на ампл!туду кв!скввлатактивованих етруы!в. Це фзктично св1дчить про в!дсутьшсть ефектиЕно! взаемодП АР4 з не-ШВА рецепторами. Спостероження аспартатактивованих. струм!в нейрон!в, вщЦле-них за допомогоы фэрмонтативно! оОробки, бишш ускладнене через . негативная вплив протеол!тичних фермент!в ' на КЬША рецепторй. Кезвакаючи на це, сер! я результативних експеримент!в по вшсладен!й виде схем1 була. проведена з використанням Ь-асп' в рол! агон! ста. В б1льшост1 вксперимвнт!в' 1йшереда!я 1нкубац1я нейрона в розчин! . ?4 1 присутн!сть АР4 п!д час апл!кац!£ Ь-асп призводила до зникнёння аспартатактивовбних _ струм!в. Це мокна поясйити активац!бю ЫЮА рвцептор!в молекулами АР4 з подальшою 1х десенситизац!ею п1д: час •цре!нкубад!! нейрона в розчин! АР4. Апл!кац1я Ь-асп в.таких умовах неспроможня збудити аспартатактивований струм через повну десенси-тизац!ю ЮША рецептор1в.

ЗваЖаючи на вдявлен! фармаколог!чн! властивост! АР4,-ц!лком обгрунтованим повстало, питания досл!даення наявност! ан.алог!чних властивостей у структурних аналог! в АР4. Серед шх були випробуван! наступн1 сподуки: ' 2К-ам!но-33-г!дрокси-4-фосфономасляна к-та /(2Я,33)-АНР4/ ; 25-ам1но-ЗЙ-г!дрокси-4-фзсф01юмасляна к-Та /(23,ЗЙ)-АНР4/ 1 фосф!нотрицин. В перщу чергу була випробувана ¡х ' здатн!сть бути активаторами ГР. 3 щею метою апл1ка*ц!я розчин! в цих сполук, а також АР4, в копцентрац! I 1. ммоль/л, сунроводжувала.сь одночасним записом струм!в нейрона. Характерна записи подан! на мал.4. Виявилося, що здатн1сть збудк^вати струми, ,под!бн! тс АР4-активованих проявляють (25,ЗИ)-АНР4 1 фосф1нотрищш. Однак амп-л!туда цих струм!в в 2-3 рази меньше за ампл!туду АР4-активованих. Серед 1нщих спостережуваних особливостей сл!д в1дзначити. в!дсут-н!сть тенденц!! до десенситизац! 1 у (25,ЗН)-АНР4-активованих стру-

м1в 1 наявн1сть тако! струм!в.

твнденцН у фосф!нотрицин-активованих

^Н И ноос-^-са.-рОдИз

1« ¿н

/ОН

(2Н,ЗБ)-АНР4 2Н-ам1но-33-г1 дрокси-4-1*осфономасляна к-та

н ОН

ноос-Ь-^-ся^-ку^ поос-сн-ся^-снг-р(сн3

^ (гз.зю-днр' 23-а;..1Н0-ЗН-г1др0кси- фосф1нотрицин 4-фосфономасляна к-та

Мал.4. Записи струм1в одного з нёйрон1в при апл1кац11 розчин!в: 1 - 1Р4; .2 - (2Н,35)-АЯР4; 3 - (25,ЗН)-АНР4; 4 - фосф!нотридана в койцентрац!! 1 ммол/л.

\

3 кетою перев!рки здатност! (2Н,ЗБ)-АНР4, (23,ЗЙ)-АНР4 1 фос-ф1нотридияа десонситизувати ГР, була проведена сер!я експеримент1в з застосуванням поперодньо* пре!нкубац1! нейрона в розчинах цих сполук (1 ммоль/л). Основним контрольним агон!стом служив Ь-глутамат. Резу.л> тати експеримейт1в засв!дчили в!Дсутн!сь в!дчут-но! здатност! (2Б,ЗЙ)-АИР4 десенситизувата ГР 1 часи.ову наявн!сть тяко! здатност1 у фосф1нотрицина. Ц1 результата ц!лком узгодиуються з результатами попередньо! сер!I ёксперименив. Дещо в!дм!нн! результата отриман1 стосовно (2Н,Зй)-АНР4. Пре!нкубац1я нейрон!в в розчш! (2Л,33)-АНР4 не призводила до в!дчутних зм!н глутаматакта-вованого струму. п!ляя в!дмивання ("Н,33)-АНР4 спостер!галось деяке зменс'шення глутаматэктивованих струм!в, ампл!туда яких пов-н!стю в1Аяовлюва.-зсь лже на протяз! дек!лькох хвилин.

3.2. Досл1дження не-ЮШ. рет гор1в з використанням ^методики короткотривало! апл!кац!1 Ь-глутамата.

Чи не на£. ,агадков!шим явжцвм в повед!нц! ГР, як ! багатьох 1нших рецептор!в, е здатн1сть . десенситизуватися, тобто втрачати чутлив1сть при ганадто трчвал!.й кзаемод!1 з молекулами агон!ста. На запис! глутаматактивованого струму нейрона це проявляемся в наяв--ност! стад!1 експонекц!ального спаду струму п!сля досягнення максимально! ампл!туда, незвакаючи на п1дтримувану на пост!йному .р1вн! концентрац!ю глутамату. Кен; :анта часу цого процесу для р!зних нойрон1з складьз в!д 20 до 80 мс. Спад припиняеться при досягненн! ампл!1. ди струм., яка складае 5-30 % в!д максимального значения. 1 дал1 струм стаб!л1зувться на цьому р!вн! на протяз! всього часу д!1 глутамату. Деяк! фармаколог! чн1 препарата здатн! !стотно вшшвати на харак эр розвитку десенситизац1I, але механ!зм ц1в! д!! нев!до-мий. До тепер!шнього часу остаточно не з' ясована природа залишко-вого стаб!льного компоненту струму, як 1 не до к!нця охарактеризо-ваний конформац1йний стан ГРК, який обумовлюе явище десенситизацИ.

Згстосуваяня методики короткотривало! апл!кацП дозволяв здШ-сшвати швидке в1да лвання гг-тамату на р!зних етапах розвитку десенситазац11 .струму. Це дало змогу виччати перех1дн! процеси в ГРК шляхом анал!зу д!лянок релаксацП струм1в. ЕксплуатацПШ харак"эристики установки забезпечували в п' ять раз!в швидший темп'

в1даивання нейроаа, н1х розвиток релаксацП струм!в. Через це б!ль-ша частша д!лянки релаксацП струм!в була придатна для достоЕ1р-ного анал!зу. В ц!й частши. робота 1шлося лише про нэ-ШОА рецепто-ри, оск1льки вони е найб!льш швидкими, 1 встигають п!сля а..тивац11 досягнути значного ступеня десенситизац!I в !нтервал! 300 кс, що е робочим диапазоном установки. Роботу ШВА рецептор!в було заблско-вано стацдартними способами.

Одна.з дискус!йних сьогоденних питан? е: чк мають сп!лъну прчроду г эчатковий динам!чний ! к1н!,евий стаЩонарний компонента глутаматактивованого струму? Проблема полягае в можливост! накла-дання один на одного двох одночасно збудауваних стру...!в, обумов-' лэнйх роботов р1зних тип!в не-ГОША рецвптор!в. 3 метою досл1дження цього питания Оули проанал!зован! релаксаЩйн! крив! на р1зних д1лянкях, де можна припустити накладання двох стружв (мал.5). Отриман! результата однозначно ззсв!дчили наявн1сть лише одного експоненц!ального'компоненту в процес! спаду струму до нульового р1вня. п1сля в!дмивання глутамату (мал.5,Б). Заслуговув на увагу пом!тнв зб!лызення константа часу релаксацП о! зберекенням одно-експонешЦального характеру спаду струм!в в процес! переходу б!ль-шо! частини. рецептор!в в десенситизований стан. Характерним явищем сл1д в1дзначита (мал.5,А) сплеск струму. (о*Г-компонент), якиЛ виникав в момент в1дмивання глутамату. В результат! спец!ально проведеного досл!дження було з' ясоь.ло, що походаення оГГ-кошгоненту не пов'язанй з роботою додатково! груш. рецептор!в. Воно' мо*е бути пояснене або швидкою конформац!йною перебудовою 1онного каналу в момент дисоц1ацН молекул глутамвта з рецептор!в, або виникнвнняы !нструментального ефекту. Важливим .спостервконня?' виявилася сувора кореляц1я м!ж ступенем спаду струму внасл!док десенситиззцП рецвптор!в ! амшЦтудою оГГ-компоненту. Можли. !сть споствр!гати оГГ-компонент повн!стю 'зникала при досягненн! стац1онарного'р!вня глутаматактивованого струму, що ототожнюеться з досягненням ,стаб!льного р1вня десенситизац!I рец'птор1в. Це дозволило зробити ва*лив1 висновки' при охарактеризувашЛ десенсйтизованого ков$ормац!йного стану не-МША рецептора ньзалвхно в!д природа виникнення о1Г-компонента струга.

Мал.б Досл1дження характеристик релаксацП струм! в5 .до нульовоп р1щя п!сля в!дмивання Рлутамату при скороченн! часу його апл!кац11

А. Записи струм1в при р1зних'терм!нах апл1кац11 глутамату (1 —> 9; скорочення терину'апл1кац11).

Б. Спрямл1ння д!лянок ролаксацЦ срум1в 1а запис1в частини (А), Ампл!ауди струмхв, в!дм!рян1 на релаксац1йних кривих з 1нтервэлог 10 мс, подан! в нашвлогари$м!чних. координатах.' Прям! проведеш методом майменших квадрат!в. '

З'.З. Доол1даення десенситизацИ не-Ш)Арецептор!в . парнями апл1кац!ями 1 сер1ями апл1кац1й глутамату.

К1нетичн! процеси, вд>в'язан1 з переходом рецвптор1в в1; активованого до десенситизованого стану ц1лком зручно вивчати анал!зуючи . д1лянку переходу в1д динам1чного до стац1онарног< компонент!в глутаматактивованого струму. Набагато вакче вивчат] к1нетику виходу рецептор!в з десенситизованого стану-. Методик; корок отрйвало! апл!кац!1'надела мокливЮть провести ряд досл1д!в : цього питанн::. 3 ц!ею метою апл1кац!я глутамата на кейро!

проводилась парними' короткими 1мпульсами з! зм!ною п.тервалу м!к'вершим 1 другим 1мпульсами.' (мал.6,А). ДесенситизаЩя не-ШМ рецептор1в, збуджених 'першим 1 мяу ль сом, призводола до в!дчутного змекшешя' ампл1туди струму в1д настугиого Дмпульсу • якщо мШмйульсний 1нтервал не перевицував 100-130 мс. При розгляд! повернення рецептор!в з десенситкзовеного (Б)г недесёдсктизований (Н) стан як реакц!ю периого порядку В ¿Ыя.—> л , зменшення до„\1 десонситизованих рецептор1з в залежност! в1д часу в!даов1дав залож-НОСТ1 [1тах-1(г)]/1тел=е"''/'Т , Д9 Ьпах -аМ,л!туда' СТруму ПврШОГО 1шульсу алл1кацП, а 1(1) - ампл! гуда повторного струму м!х-1мпульсному. 1нтервал1 г.. Нап1влогари|£м1чне представления величини [ 1шах-1 (I)]/Ъпох для -запис1в струм!в мол.6,А. подзнэ на мал.6,Б.

1>п1тах-1 1т а*

■¡Г-Ммс

40 . 50 мс

I I I I I

Мал.бДосл1дження виходу рецептор!в з десенситизовакого стану.

А. Струми не..рона, збудауван1 парними 1мпульсами м!н!мально коротких аш1!кац!й глутамату- з1тзм!щшми м!»1мпульсними 1нтервалзми и). ,Б. Залекн!сть величин -1п т^Г^ ' в1д I для запис!р струм1в з частини (А). .

Отримана оц!нка константа часу конформац!йного переходу ремептор!в з стану В в стан Н дуке близька до середа!х величин константа часу прямого процесу И* —> Б.

/

Апл!кац!я г'лутамата на нейрон сер!ями коротка 1мпульс1в про-демонструвала в!дсутн!стъ внливу десенситизацП не-МША рецептор!в на омл1туди струм1в при частот! аал1кац11 5 Гц, невеликий вплив ири частот! 8 Гц 1 значций вплив при частот! б1льше 10-15 Гц.

4. ОбГОВОРЕННЯ. РЕЗУЛЬТАТ!В ШСПЕРШЕНТ1В

В першу чергу заслуговують на увагу результата досл1джень фармаколог! чних властивостей АР4 через те. що як ефективнй'блокатор синаптично! передач!, . ця ам!нокислота моке стати базою для , отворення нових ант жонгульсантних преш»рат!в. Важливим висновком / щодо фармаколог!чно1 д! 1 АР4 е фактично ц1лковита в!дсутн1сть взаемодП з не-ПОА рецепторами, як! обумовлюють швндку передачу сигаал1в в синапсах. Таким чином, блкуюч! властивост!' АР4 щодо синаптично! передач! м!ж нейронами в г!покамп! сл!д в!даести до не1дентиф1ковано! пресинаптично! д!1. Окр!м цього, вперше продемонстрована южлив!сть АР4 виступати в рол! активатор!в ГР.. Виходячи з в1ддосно повоьно! к!нетики АР4-активованих струм!в 1 здатност! АР4 десенситизувати рецептори-переносники Ь-Асп-активова-ного струму, найб!лып 1мгв!рною здавться моклив1сть АР4 збуджувати NMDA рэцептори.

Вперше були проведен! досл!дкення фармаколог!чно! д!1 стуктур-них.оналог!в АР4 на ГР нейрон!в. (2S,3R)-AHP4 ! фосф!нотрицин вия-вились здатними ефективно вз'^умод1яти з рецепторами, призводячи до збудження струму схожого на АР4-активований, однак пом!тно меньшо! ампл11уди. Засллговув на увагу дещо р1зний характер струм!в, акти-, вованих (2S,3R)-AHP4 1 фосф1нотрицином.. (2S,3R)-AHP4 активував струм, без homItho! тенденцП до десенситизацП. Цэ п!дтвердилось 1 в експер ментах з пре!нкубац!ею нейрона в розчин1 (2S.3RJ-AHP4,.якй не впливала на ампл!туду глутаматактивованих струм!в. В протилек-н1сть цьому, фосф!нотрицинактивований струм проявляв поы1тну тен-денц1ю до десенситизац1i. Окр1м того, прв1нкубац!я нейрона в роз-чин! фосф1нотрицина призводила • до- деякого зменшення глутаматактивованих струм!в, що ц!лком приг:устимо пояснити десенситизаЩею KMDA рецептор!в, "доля яких в сумарному струмор' мохе виявитися невеликою через зазначэн1 в III розд1л! обставини. Таким чином, можна зробити висно эк, що наявн!сть Пдроксильно! груш .у /э-вуглецю молекули

(23,ЗЙ)-АНР4 1стотно послаблюе 11 взаемод!ю з активним центром* в1дпов!дальним за.десенситизац!» рецептора. В1дсутн!стьтако1 групи у молекул-АР4 1 фосф1нотрищша забезпочуз 1х здзтн1сть десен^итизу-вати рецептори. В свор чергу, зам1на г1дроксильно! грутга в фосфоно-вому залишку молекули АР4 метильною призводить .о послабления взае-модН утворено! таким чином молекули фосф1нотрицина з рецептором, без зм!ни загального характеру ц1е! взабмодп.

Окремо сл!д • розглян:-ги характер фармаколог!чно! д!1 (2к,58)-АНР4. Апл!кац!я (2Н,ЗБ)-АНР4 на нейрон не викликала истига-' ц!1 струму. Пре1нкубац!я нейрона в розчин! (2Н,3!3)-МГЧ пом!тно не вшшвала на амшИтуду глутаматактавованих струм!в, хоча зразу.теля в1даивання (2Н,33)-АНР4, ампл!туда цих струм!в ъз протяз! дек!лькох хвилин була зменьшона, Можливо, це зменыпвння мохна пояснити моду-люючим вплявом молекули (2Й,33)-АНР4 на регуляторн! центри ГР. 1снування таких цвнтр1в для деяких агент1в в!домо у Ш)А. рецептора." До того х 1Исонф!гурац1я а-вуглецю молекули (2Н,35)-АНР4 надае 1й спор1дненост1 з л!гаидами саме ШБА рецептор1в. Протилежна кон-ф!гурац1я мблекули (28,ЗН)-АНР4 б!льше спор!дюое И з молекулою природного активатора Ъ-асп, чим, мокливо, ! обумовлена здатн!сть (25,ЗЯ)-АНР4 актив!зувати рвцептори.

Проведен1 досл1дження фармаколог!чно1 д!1 АР4 та 11 структур-них аналог!в нисв1 тлили, що вс! випробуван! зразки в б!льш!Г чи меньш1й м!р! здатн! взаемод!яти з ГР, причому характер ц!в! взвемо-д11 р!зний. Це дозволяв спод!ватись, що отриман! результата межуть стати основою для наступного ц!леспрямо^аного вивчення в!дзначених особливостей- за допомогою цих 1 1нших синтезованих фармаколог!чних препарат1в.

Результата експеримент!в, проведених з застосуванням методики ' короткотривало! апл1кац11 глутамату,' моиуть прислухитися для 0!льш детального >явления про динам1ку конформац!Йних перетворень в не-ЮЮА ГРК при взаемодН його рецепторноГ частини з молекулою Ь-глу. Складний малюнок розвитку глутаматактивованого сгруму нейрона породку. чимало припущень щодо природа його походжёння. Чер!дко. наявн! сть стац1онарно! фази струму, яка лишаеться п1о.пя градуального зменыпвння динам!чного компоненту струм^ внасл!док десенситйза-ц!1 рвцептор1в, розглядають як насл!док встановлювано! р1вноваги м!ж десенситизованою 1 недесенситизованою формами рбцептор!в. Прий-

маичи до-убоги в1дноиення ампл!туди стац!онарного компоненту до максимально! величини струму, в деяких Еипэдках сл!д було б припустити, що недесэнсити'зованими лшаються до 30% рецептор1в при висо-к!й п1дтримуван*л концэнтрац!! ' Ь-глу. Результата представлено!. роботл запоречують ' правом! рн!с.ть подобного розглнду стосовно н<»-№Ф£ рецептор.б'. В першу чергу.сжд Е1дзначити, то спостерёжува-на одноекспоненц!альт сть кривих релаксацП струм!в на д1лянц! переходу в!д данам!чного до стац!онарного компонент1в струму п!д-тверджус припустим!сить розгляду складно! повед1нки струму як результат робота едино" пог'лнцИ не-Ш)А рьЦэптор1в. Дал1 - нагадати про су вору короляц1ю'темп!в-зменьшення ампл! туда' о!Г-компонент1 в струму ! д!лянки розвитку десенситизац! 1 струму. Це ознака прямого зь' язку м!5к недесенситизованим станом рецептора!в 1 спроможн!сттю 1х вноску в генерац1ю оГГ-компонопту при внесена! в систему збуд-женкя в момент в1дмивання глутамату. Неможлив1сть спостереження оП-комноненту яр!-, досягненн! стац!онарного р!вня залишкового стру-. му св!дчить про те, що на цьому етап! розвитку струму вс! рецептори знаходяться в однотипному конформацШюму стан!, який ототожнюеться з1 станом десенситизац!!. В такому.випадку ампл!туда стац!онарного залийкового компоненту не можо розглядатись м1рою к!лькост1 неде-■ сенситизованих рецептор!в. Нав!ть' якщо припустити, що генерац!я оП-компопенту виникзе внасл!док 1нструментального ефекту додатко-во! ашикацП глутамату, зг!,цло з закнонм Ле-Шательв, повинно спо-стер1гатись тимчасове зм1щення встановлено! р1вноЕаги. Таким чином, наявнК гь залиш^ово! фази струму може бути пояснена 1снуванням конформац1 Иного стану, в якому керований не-КМБА рецептором 1онний канал або в!дкриБаеться р!дше, або його елементарн1 струми досяга-ють мены: I ампл1туди, н!ж в початковий момент збудкення рецептора.' В цьому конформац1йному стан1 ошшяеться вся популяц!я не-ШБА ГРК при в1дносно тривал!! взаемодП з молекулами Ь-глу. Для виходу з цього стану обов' язково необх!дна стад!я в1дмиваш!я глутаматного розчину. Кксперименти з апл!кац!бю ь-глу парники !мпульсами засв!д-•чили, що темп виходу з1 стану ,~есенситизац11 практично сШвпадае з темпом його попёреднього розвитку. В резу-ьтат! динам!ку конформа-ц1й;шх перетЕорень. не-1ТША ГГК мэжиа подати узагольценою схемою:

•Я + А Й*А десенситйгТу Ш Б + А 'ресвн&. И + А

И1'_______ Си —? Оя . ..... СЬ Ор г "Со______

да Л, Н*А 1 БА в початковий, збуджений. 1 десенситизоваш:'* стани рецептора; А - молекула активатора (Ъ-глу);- Си. 1 Ои - закритий 1 в1дкритий стани !онногой каналу збудженого рецептора, й> 1 Шэ -закритий 1 в!дкритий стани 1онного каналу,' що в1дпов!дають нонфор-мац1йному стану НА.

5.ВИСН0ВКИ

1. Молекули блокатора•синаптично! передач1 2-ам1но-4-фосфоносм!но-. масляно! кислота (АР4)-здатн1 активувати один.з ткп1в збудкуючих

глутаматних рецептор1в мембран- нейрон!в- г1покампа.1 Збудасуван! молекулами АР4 рецецтори м'ембрани нейрон! в г!покампу не в1дносятся до не-ЮЮА типу глутаматних рецептор1в.

2. Структурн! аналоги АР4 - 23-ам1но-ЗК-г1дрокси-4-фосфойомвсляна . к-та та фоеф1нотрицин е слаб1 а1юн!ста АР4-акг/~зованих'рецептор!в.

Молекули 2Й-ам1но-ЗБ-г1дрокси-4-фэсфономаслшю!. к-ти не здатн1 актйвувати ц1 рецептори, а^/е: проявлять десенситизуючу активн!сть. ' 3. Стец1онарний компонент десенситазованого струму, збуджеког • глутаматними реиептсрами не-ШБА типу, не являв с^бою аддативний ■ вклад додатково! груш рецепт в, що не досвнситизуватиоЯ.

4.. В1дношення. стац1онарног складово* десенситазованого струму, збудхоного рецепторами не-ЩЗА типу, до почаТкового максималыгацо його значения не в1дцзеркалхв м!ру остановлено! р1вноваги м!к недвсенситезованОю ! десенситазованою формами рецептор!в. При. досягненн1 стац!онарного р!вня струму, вся гопулям1я рецептор1в ' знаходиться' в однотипному конформац1 йному; стан!..

5." Перех!д не-ЗМБА рецептор1в у стан десенситизац!! е незворотн!м. ^Дпя виходу-рэцептор1в' а. дього стану необх!даа стад!я дисоц1ац!1 - молекули агофста з рецептора. Вих!д 'не-Ш)А рецептор!в !з стану

десенситизац! I пов!льним в -т!й же м'1р1, що. ! розвйток десендитиз^цИ. Константа часу цього процесу складав.б1ля 41 мс.

6. -При збуджещ! "йэЯрона глутаматом з аастотов С1лыие 10 Гц, ^есенситазац1я, не^Щ0А-рецептор!в р^умовлге прогресивне цригн!чення

амшйтуди ритм5чно збуджуваних глутаматактивованих струм!в.

Список portiT, опубл!кованих за темою дисертацП.

1. Преварская Н.Б., Рыбальченко В.В., Скрыма Р.Н. Свя' • аспартатннх и глутаматных ^эцепторов с полифосфоинозитидной трансдуцирупцей системой в нейронах ташокампа '// Цитология, 1989, T.XXXI, N9, с.111 £ -1120. .

2. Рыбальченко В.В., Преварская Н.Б., Скрыма: Р.Н.,.Ыарткщенко Д.И. Возможная модель функционирования воротных". механизмов глутаматак'1йвируемых рецепторных комплексов нейронов гиппокампа // Ионные ' ;аналы в биологических мембранах. • Тезисы .неладов Ьоесоюзного Симпозиума. Кара-Даг, 1990, Тщг.ЗАСХКИЛ, с.76.

3. Рыбальченко В.В., Преварская Н.Б., Скрыма Р.Н., -Дуйк A.M. Механизм дифференцирования длительности воздействия L-глутамата на уровне одиночного нейрона гйппокампа // Ионные каналы в биологических мембранах, "езисы докладов Всесоюзного,Симпозиума. Кара-Даг, 1990, ТИП.ВАСХНШ1, C.77.

4.' Рыбальченко В.В., Преварская Н.Б.,, Скрыма Р.Н., Луйк А.И., Кухарь В.П. Современные представления о механизмах передачи сигнала в глутаматуправляемых рецепторных комплексах // В сб!рн. "Биохимия животных и человека", 1992, Вип.16, Ки1з,. Наукова думка, с.44-56.

5. Рыбальченко В.В., .Прева^ркая Н.Б., йфыма Р.Н., Луйк А.Й. Эффекты краткогременной аппликации глутаматсодвржащего раствора на изолированные нейроны гиппокампа крыс // Нейрофизиология, 1992, Т.24, N4, с.491-495.. . ;

6. Рыбальченко В.В., Преварская Н.Б., Скрыма Р.Н., Дуйк А.И. Исследование выхода не-NMDA-рецепторов нейронов гиппокампа из состояния десенситизации с использованием парной и ритмической аппликации глутамата // Нейрофизиология, 1992, Т.24,'.N6, с.713-716.

7. Кухарь B.II., Луйк А.И., Свистунова H.D., Скрыма Р.Н., Рыбальченко В.В., Белоконь Ю.Н., Кузьмина H.A. Асимметрический синтез и изучение сгэцифическо^ биоактивности (2R.3S)- и (2S.3R)-2-амико-3-гидрокси-4-фосфономасляных кислот // Хим.-фарм. журнал, 1993, с. Ц-Ц,

ПОШУКУВАЧ (^¡fp^^^ ,