Физико-химические закономерности инактивации системы мембранно-связанных опиоидных рецепторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

БЕЛОКОНЕВА Ольга Станиславовна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИНАКТИВАЦИИ СИСТЕМЫ МЕМБРАННО-СВЯЗАННЫХ ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

02.00.15 химическая кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1991

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета и в секторе Оиокинетики Межфакультетской проблемной НИЛ им. А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук С.В.Зайцев

Официальные оппоненты: доктор химических наук Е.С.Чухрай кандидат химических наук С.О.Бачурин

Ведущая организация: Институт Биохимии им. А.Н.Баха АН СССР

Защита состоится "__"_ 1991 года

в 16 часов на заседании специализированного совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_ 1991 года

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук

О.А.Кост

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из способов выяснения особенностей строения и функционирования белков явялется изучение закономерностей их термоинактивации. Данные по стабильности мембранно-связанных белков и, в частности рецепторов гормонов и нейромедиаторов практически отсутствуют в литературе.

Изучение закономерностей спонтанной инактивации специфического связывания селективных лигандов с мембранными опиоидными рецепторами представляет существенный теоретический интерес с точки зрения установления механизма этого процесса и наряду с этим - особенностей регуляции связывающей активности этих рецепторов в мембране. Кроме того, нахождение способов стабилизации мембранно-связанных рецепторов in vitro открывает новые возможности для практического использования таких систем в биотехнологии.

Все это делает актуальным проведение комплексного исследования процесса инактивации связывания лигандов с опиоидными рецепторами с применением широкого спектра физико-химических методов, позволяющих установить закономерности потери связывающей активности опиоидными рецепторами.

Цель работы: Целью настоящего исследования явилось установление физико-химических закономерностей инактивации системы ц- и б-опиоидных рецепторов мембран головного мозга крыс при 37°С, а также поиск условий их стабилизации.

Научная новизна: Впервые проведено комплексное изучение спонтанной инактивации мембранно-связанного белка - опиоидного рецептора. Определены кинетические параметры этого процесса. Установлено, что инактивация в основном обусловлена уменьшением концентрации высокоаффинных центров связывания опиоидных лигандов. Изучены рН- и температурная зависимости. Показано, что потеря связывающей активности опиоидним рецептором вызвана изменениями, происходящими в липидном бислое мембраны. Обнаружено стабилизирующее действие ненасыщенных липидных соединений, а также ингибиторов фосфолипаз, липид-растворимого антиоксиданта и аргона на связывание опиоидных лигандов различной селективности с

мембранными препаратами. Предложен механизм их действия. Показана роль ненасыщенных липидных компонентов в модуляции активности мембранных опиоидных рецепторов. Обнаружена взаимосвязь перекисного окисления липидов (ПОЛ) и инактивации связывания опиоидных лигандов с мембранным препаратом. Показано наличие корреляции между константами скорости инактивации опиоидных рецепторов и константами скорости уменьшения вязкости липидного бислоя в присутствии различных реагентов. Выявлены отличия в скоростях инактивации и закономерностях стабилизации связывания лигандов с рецепторами свежевыделеншх и лиофилизованных мембран головного мозга крыс. Впервые предложен механизм инактивации мембранно-связанных рецепторов - рецепторов опиоидов.

Практическая ценность работа: Предложенный в работе механизм инактивации мембранно-связанных опиоидных рецепторов определяет пути поиска закономерностей инактивации других рецепторных систем. Кроме того, найденые стабилизаторы, а также установленные закономерности липид-зависимости связывания опиоидных лигандов могут найти применение в биотехнологии при создании на основе мембранно-связанных рецепторов стабильных биосенсоров для количественного и качественного определения опиатов и опиоидных пептидов в растворах и физиологических жидкостях.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Международном Симпозиуме "Фосфолипиды и передача сигнала" (Вейсбаден, ФРГ, 1991г.) и на Всесоюзном Симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллинн, 1990г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части и 4-х глав, в которых представлены результаты исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы (172 наименования). Работа изложена на страницах, включает 13 таблиц и 27 рисунков.

Методика эксперимента. Изучение комплексообразования меченых

тритием лигандов: ц-агониста [[3H]Tyr,D Ala2,N-Me-Phe4,Glycol]-эикефалина ([3h]dago), ц-антагониста (3н]налоксона и ö-агониста [[3H]Tyr,D Ala2,Gly,J>he,D Leu5]-ЭНКефЭЛИНа ( [3HJDADLE) С опио-идными рецепторами свежевыделенных и лиофилизованных мембран головного мозга крыс проводили методом вакуумного фильтрования через стекловолоконные фильтры gf/b, неспецифическое связывание определяли при добавлении Ю-6М немеченого лиганда. Количество связавшегося лиганда оценивали по уровню радиоактивности фильтров, используя диоксановый и толуол-феноксольный сцинтилляторы. Содержание гидроперекисей диеновых соединений в мембранных липидах определяли спектрофотометрически по отношению величин оптических плотностей при 230 и 205 нм. Концентрацию ТВА-активных продуктов окисления в трихлоруксусном экстракте измеряли спектрофотометрически по величине оптической плотности при 535 нм после добавления в экстракт тиобарбитуровой кислоты (ТВА). Микровязкость липидов синаптосом изучали методом спинового зонда с использованием 2-х стабильных зондов с нитроксильными радикалами: 5,6-бензо-2,2,4,4~тетраметил-1,2,3,4,-тетрагидро-7-карболин-3-оксила (зонд I) и 2,2,6,6-тетраме-тил-4-каприлоилоксипиперидин-1-оксила (зонд 2), преимущественно локализующихся вблизи поверхности липидного бислоя мембраны в аннулярных слоях липидов и в не связашшх с белками липидах, соответственно. Из полученных спектров определяли времена вращательной корреляции (т:с) зондов I и 2 по формуле для быстровращакщихся зондов:

тс= 6,65ДН+1[/а+1/1_.,)- 1] Ю-10 (с),

где 1+1, i ^ - интенсивности низко- и высокополыюй компонент спектра поглощетя радикала, ДН+1 - расстояние между экстремумами низкопольной компоненты. Математическая обработка результатов измерений проводилась на пэвм "ibm pc/at". Были использованы программы "Sigma Plot", "Statgraphics" и программа "Delta", разработанная в секторе биокинетики Межфакультетской проблемной НИЛ им.А.Н.Белозерского.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Изучение кинетики инактивации системы д- и 6-опиоидных рецепторов свежевыделенных и лиофилизованных мембран головного мозга крыс радиолигандным методом

Излечение паралетров связывания опиоидниг лигандов с лелбранныли препарашли в процессе иг инкубации при 37°С В первую очередь необходимо было выяснить, как влияет длительность инкубации препарата свежевыделенных и лиофилизованных мембран головного мозга крыс при 37°С на параметры связывания (Kd,Qo) опиоидных лигандов различной селективности. Эти параметры определяли по изотерме специфического связывания, представленной в координатах Скэтчарда. Все изотермы связывания лигандов с мембранными препаратами, инкубированными различное время при 37°С, в координатах Скэтчарда имели гиперболический вид. Обработка экспериментальных данных на ЭВМ с помощью программы "Delta" показала, что для их описания модель с двумя типами независимых центров связывания, характеризующихся различными параметрами Kd и Q0, является достаточной. Именно она и положена в основу интерпретации полученных результатов.

Во всех проведенных экспериментах было показано, что в течение 3-х часов инкубации значительно уменьшается концентрация высокоаффинных центров связывания опиоидных лигандов. Другие параметры модели связывания при этом практически не меняются.

Уровень специфического связывания изучаемых лигандов уменьшается при увеличении длительности инкубации суспензии мембран, и этот процесс можно описать уравнением:

Bt= B0exp(-kint), (I)

где Bt, BQ - уровень специфического связывания лиганда при длительности инкубации мембранной суспензии - t и в начальный момент инкубации, соответственно; kj - константа скорости инактивации связывания опиоидных лигандов.

kin является константой скорости уменьшения концентрации высокоаффинных центров связывания лигандов с опиоидным рецептором и мерой стабильности специфического связывания лигандов. Поэтому, задачей данной работы стало изучение влияния различных факторов, ме-

някхцих условия инкубации мембранного препарата: температуры, рН, а также различных мембраннотропных веществ и модификаторов связывающей активности опиоидного рецептора на к1п опиоидных лигандов различной селективности.

Нами было показано, что во время инкубации не происходит слипания мембран, не меняется концентрация белка - т.е. не происходит сорбции препарата на стенках сосуда, не меняется рН инкубационной среды, скорость инактивации не зависит от свойств материала, из которого изготовлена инкубационная емкость. Это свидетельствует о том, что потеря активности не является экспериментальным артефактом.

Центрифугирование мембранного препарата с последующим ресус-пендированием в первоначальном объеме среды инкубации не меняет скорость инактивации опиоидных рецепторов. Также не происходит существенного изменения константы скорости инактивации при варьировании концентрации мембранного препарата в пробе. Эти экспериментальные факты свидетельствуют о том, что инактивация рецепторов в процессе инкубации не обусловливается дестабилизирующим действием каких-либо веществ, вымывающихся из мембраны, и не вызвана расщеплением рецепторного белка на субъединицы.

Следует отметить, что значения опиоидных лигандов

различной селективности существенно различаются: скорость уменьшения уровня связывания р-агониста ЭАСО-наибольшая, а специфическое связывание ц-антагониста налоксона максимально стабильно (табл.1). Кроме того, для всех указанных в таблице I лигандов, скорость уменьшения связывающей активности рецепторов' свежевыделенных мембран ниже, чем лиофилизованных (к^п меньше в 2-3 раза).

Таблица 1

Константы скорости инактивации высокоаффинных р- и е-

опиоидных рецепторов лиофилизованных мембран головного мозга крыс, определяемые по связыванию лигандов различной селективности.

лиганд шоо ОАБЬЕ налоксон

кт 0,8 НМ 0,5 НМ 0,7 нм

к1п* 103мин~1 10 ± 1,4 7.1 ± 1,1 5,2 ± 1,0

Стабилизация сбязи^ияцей активности опиоидних рецепторов в присутствии опиоиОнъix лигандов. Кинетическая лоделъ инактивации рецептора, определение параметров лодеии Было показано, что прединкубация мембранных препаратов с dago, dadle и налоксоном приводит к уменьшению скорости инактивации опиоидных рецепторов, причем стабильность связывания возрастает при увеличении концентрации немеченого лиганда. Кривые инактивации связывания меченого налоксона (0,8 нм) для препаратов лиофилизованных мембран, прединкубированных в присутствии различных концентраций немеченого налоксона (10 -1000 нм) приведены на рис I в полулогарифмических координатах.

Нами была предложена следующая кинетическая схема инактивации двух независимых центров связывания опиоидного лиганда:

КсЦ Kd^

гц + l r1l r2 + l ¿ r^l (2)

_l k4 l ki"2_I кЦ

| инактивированная форма I

В схеме (2): R,, R0 - центры связывания, L - лиганд, k- , к. , i t— 1 11*2

k'in * k'in _ константы скорости инактивации высоко- и низкоаффинных центров связывания и соответствующих им лиганд-рецепторных комплексов.

Рис. I. Зависимости уровня специфического связывания налоксона (0,8 нМ) с лиофилизованными мембранами головного мозга крыс от времени их инкубации в присутствии немеченого налоксона в различных концентрациях: (•) - без налоксона, (■) - 10

нМ, (А) - 100 нМ, (о) - 1000 нМ, представленные в полулогарифмическом масштабе.

Если считать процессы инактивации и связывания на 2-х центрах независимыми, то зависимость суммарного связывания (Вс„м) от

времени Ъ будет выглядеть следующим образом: Всум<1) = В1<*> + В2(4) =

= ехр (. кАп1кЛЛ*Ап1[ъ± ъ ) +

К^ + Гь*] ксц + 1Ъ1 (3)

♦ ехр 4>.

К(12+(Ь ] К^ + [1]

где ^-концентрация меченого лиганда, ь-концентрация немеченого лиганда, р10.р2о ~ концентрация высоко- и низкоаф&шных центров

связывания. Мы оценили величины и к*^ из этих зависимостей,

считая, что [Ь*] = о,8 нМ; [01 = 0,0616 нМ; [к20) = 0,52 нМ;

Чп1= 4,8 10~3МИН~1; к1п2= 1 >02 Ю-3МШГ1; {{(1,= 0,5 нМ; К4,= 35 нМ, а [Ь] принимает значения 10, 100 и 1000 нМ.

Обработка эксперименталышх данных (рис I) на ЭВМ показала, что во всех рассмотренных нами экспериментальных зависимостях можно принять равным нулю, так как вклад этого параметра мал и его изменения практически не влияют на ход теоретической кривой. Значения К'. при [Ь] = 10, 100 и 1000 нМ равны 2,5 10~3мин~1, 2,3 10 -"мин и 1,8 Ю мин , соответственно. Близость значений параметра, найденного по различным экспериментальным кривым указывает на правильность предложенной кинетической модели.

Представляет интерес сравнение экспериментальной и теоретической кривых ассоциации лиганда с рецептором с учетом найденных параметров инактивации рецептора и лиганд-рецепторного комплекса. Нами было выведено уравнение, описывающее кинетику связывания меченого лиганда согласно схеме (2), учитывая процесс установления равновесия лиганд-рецептор. В случае связывания лиганда с одним центром можно записать:

Ш^к., [Ъ]

[КЫШ =-------(ехр[ (а+рп] - ехр[ (а-рн]), (4)

(к. +к [Ь] + + к )

где а =----¿"—1--------±у----1___ (5)

2

р -V - к'ш+ к1п к-1+кЧп (6>

к

- кинетические

Рис. 2. Кинетика специфического связывания налоксона (1,1 нМ) с лиофшшзованными мембранами головного мозга крыс при 37°С. Кривая теоретическая, точки экспериментальные .

' -1

константы скоростей ассоциации и диссоциации комплекса лиганд - рецептор. В случае 2-х независимых центров связывания выражение [1?Ысум(и будет представлять собой сумму соответствующих выражений (4).

Теоретическая кривая, соответствующая выражению (4), с учетом гетерогенности рецепторов при экспериментально полученных значениях:

к1= 1,2 нМ I,02 мин'1; НАГ'мгоГ1 ,

мин

-1,

к-1 =

к2=0,0078

-1

kin1

к_0= 0,168 мин-1, kin1 = 4,8 10~3мшГ1; к-

1,02 Ю'^мшГ1, к' 4 0= 0 приведена на рис 2 для Nal* = 1,1 нМ. Также на этом рисунке приведена экспериментальная зависимость связывания Nal* (1,1 нМ). Видно, что теоретическая кривая хорошо описывает полученные нами экспериментальные данные. Это указывает на правильность предложенной модели.

ini

= 2,5 !О Змин~

kin2

Реагенты, не влияющие на стабильность сбязыбаня опиоидных лигандов с лелОраншли препаратали Нами было изучено влияние реагентов широкого спектра действия на скорость инактивации связывания опиоидных лигандов с мембранными препаратами. Полученные экспериментальные данные обобщены в таблице 2. .Из них можно сделать вывод о том, что процесс инактивации связывания опиоидных лигандов не обусловливается изменением состояния функциональных групп рецептора, протеолитическим расщеплением рецепторного бежа, изменением активности сопряженных с рецептором ферментных систем.

Таблица 2

Эффекторы, не влияющие на стабильность связывания опиоидных лиган-дов при инкубации препаратов мембран головного мозга крыс при 37°С. ЮТ-дитиотроит, пкм-ы-этилмалеиимид, омБ-диметилсуберимидат, рмбр-фенилметилсульфанилфторид, Срр (Ш)р-гуанозин-5 • - ({3-имидо )трифосфат

Способ воздействия Реагенты Период полуинактивации % от контроля

ингибиторы бактериального заражения и протеаз NaN3(0,02%) бацитрацин (0,05%) PMSP(I0~4-I0~3M) . лейпептин (10"3-10"4М) 103±9 101 ±7 99± 10 9G±8

модификаторы функциональных групп рецептора DTT(I0"4-I0"2M) NEM(I0~4M) DMS(I0"4M) I-этил-3-(3'-диметилами-нопропил )карбодиимид 90± 12 91 ± 10 94±7 Ю4±8

Na+(125мМ) 99+6

Са2+(10мМ) 96±8

К+(1мМ) Ш3±7

регуляторные ионы Mg2+(IОмМ > Мп2+(10МКМ) 106±8 95± 11

Zn2+(IОмкМ) Ю6±9

Fe2+(I0MKM) 97±10

Со2+(10мкМ) 103±7

ингибиторы фосфо-липаз и фосфатаз МоО42"(10мМ) ЕВТА (10~4-10^2М) 108±9 103±5

регуляторы активности с-Оелков Gpp (NH )р (Ю"10-Ю"4М) NaF ПООмМ) 94±9 97±5

Температурная зависимость инактивации связывания ц,-селективных

опиоидных лигандов Процесс потери активности рецептором являлется температурно-зависимым. Нами была изучена температурная зависимость инактивации связывания налоксона и dago с мембранами головного мозга крыс. На рис 3 представлены экспериментальные данные зависимости (в диапазоне температур 23--4I°C) k^n от температуры в координатах уравнения Аррениуса. Данные достоверно линеаризуются , что свидетельствует о том, что механизм инактивации рецепторов в этой температурной области не меняется. Значе1шя энергий активации (Еа) равны 82,5±4 и 25,6±3,2 КДж/моль для инактивации связывания налоксона и dago, соответственно. Такие низкие активационные энергии (обычно для белков эта величина превышает 150170 кДж/моль) могут свидетельствовать об определяющей роли изменений физико-химических характеристик липидного бислоя в термоинактивации рецепторного белка. Известно, что в зависимости от температуры многие свойства липидного бислоя ( жидкостность, проницаемость ) могут быть описаны уравнением Аррениуса с кажущейся вели-

-и, №

S.5

50

4.5

40

45

Рис.

V 3.2 \S 3.4

!. Температурные

VT мо1,К"'

мости kin I,

ависи-нМ налоксона (•), 0,9 нМ dago (А) на лиофилизо-ванных мембранах головного мозга крыс, представленные в коор-

динатах Аррениуса.

чиной Еа = 30-80 кДж/моль, что хорошо согласуется с полученными нами экспериментальными значениями Ед исследуемого процесса.

рН-зависимость к1п опиоидных лигандов различной селективности На рис 4 представлена рН-зависимость инактивации связывания опиоидных лигандов различной селективности Видно, что для всех изучаемых лигандов наблюдается выраженное уменьшение стабильности связывания в кислой области: (рН 7,0 - 5,9). Смещение рН в щелочную область (до 9,0) практически не меняет скорость инактивации связывания (1-антагониста налоксона, незначительно увеличивает к1п по

сравнению с ее значением при физиологических рН (7,2 - 7,4) для связывания dago и сильно повышает ее в случае инактивации связывания dadle. Видно, что в области физиологических значений рН все опиоидные рецепторы максимально стабильны.

Для количественного описания уменьшения стабильности опиоидных рецепторов в кислой области нами была предложена следующая простейшая кинетическая схема:

к

RH

kin"

инактивированная форма, Rin

(7)

В схеме (7): R - рецептор; к - константа ионизации группы, контролирующей инактивацию; kin, kin"- константы скорости инактивации непротонированной и протонированной форм рецептора, соответственно.

Решением системы алгебраических и дифференциальных уравнений, описывающих данную схему, является следующая зависимость концентрации более стабильной непротонированной формы рецептора (R] от времени инкубации мембранного препарата - t:

kin Ка + kiA [H+1 [R]=[RJ ехр( ln а--t) (8)

° ка + [Н+]

Из полученных экспериментальных данных (рис 4) в рамках предложенной схемы нами были оценены неизвестные параметры рКа и kin'* котоРые приведены в таблице 3.

Из приведенных в таблице результатов можно заключить, что процесс инактивации связывания опиоидных лигандов ускоряется при ионизации группы с рКд 5,7-6,3, входящей в состав рецептора или его специфического мембранного окружения.

Таблица 3

Параметры pH-зависимости инактивации связывания опиоидных лигандов.

Лиганд Nal DAGO DADLE

к'. 102мин"1 in 5,7 5,6 6,2

еКа 6,17 6,3 5,81

«ю|мин<

Рис. 4. pH-зависимости k-n 0,8 нМ налоксона - (•), 1,6 HM DAGO - (■) И 1,4 НМ DADLE - (А) на лиофилизованных мембранах головного мозга крыс.

БО

го

&о

Стабилизация связывания опиоидньи: лигандов в присутствии ненасыщенных липидных соединений, ингибиторов тгерекисного окисления лилидов (ПОЛ) и ингибиторов фосфолипаз Из предыдущих экспериментальных данных можно сделать вывод о том, что потеря связывающей активности опиоидным рецептором вызвана какими-либо изменениями свойств липидной матрицы мембраны в процессе инкубации препарата при 37°С.

Нами было показано, что присутствие линолевой кислоты( 18:2 ) до Ю~4М и арахидоноЕой кислоты( 20:4 ) до Ю ^М существенно не меняет уровень специфического связывания опиоидных лигандов, но повышает стабильность рецепторов свежевыделенных и лиофилизованных мембран головного мозга крыс ( рис 5 ). Эффекты обеих кислот сходны. Линолевая и арахидоновая кислоты стабилизируют связывание в

диапазоне концентраций от 10~8до 10'4М. Добавление ненасыщенных жирных кислот в инактивированный препарат активность не восстанав-

ливает, что свидетельствует о необратимости инактивационного процесса. Насыщенная жирная кислота ( 16:0 )( пальмитиновая ) практически не оказывает влияния на скорость инактивации рецептора.

4%)

Рис. 5. Зависимости уровня специфического связывания налоксона (1,07 нМ) с лиофи-лизованными мембранами головного мозга крыс от времени их инкубации в присутствии жирных кислот (Ю~5М): (•(-контроль, (т)-линоле-вая кислота, (о)-

арахидоновая кислота, (■)-пальмитиновая кислота, представленные в полулогарифмическом масштабе.

Практически все ненасыщенные жирные кислоты в мембране входят в состав мембранных фосфолипидов. Добавление в мембранную суспензию таких кислых липидных компонентов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты, как кардиолипин и фосфатидилинозит в концентрациях от до 10~4М вызывает повышение стабильности связывания лиган-дов (рис 6). Присутствие катионного фосфолипида - фосфатидилхолина (яичный лецитин) в концентрации 10~4М не меняет уровень связывания опиоидных лигандов и не влияет на скорость инактивации связывания. Инкубация мембранного препарата в присутствии холестерина (Ю~4М) вызывает повышение уровня связывания опиоидных лигандов на 30%, но не меняет к1п.

Приведешше нами данные позволяют высказать предположение о том, что стабилизирующее действие использованных липидных компонентов определяется наличием у них двойных связей. Стабилизирующий эффект этих соединений может быть обусловлен как непосредственной активацией рецептора при их добавлении, так и протекающим во времени неферментативным перекисным окислением этих веществ в процессе инкубации мембранной суспензии.

05

Рис. 6. Зависимости уровня специфического связывания надоксона (1.3 нМ) с лиофилизованными мембранами головного мозга крыс от времени их инкубации в присутствии различных эффекторов: (•) - контроль, (■) -фосфатидилинозит (5 Ю~5М), (▲) -кардиолипин (4 10 М), представленные в полулогарифмическом масштабе.

,-5,

во 15сГ 160 мин

Для того, чтобы выяснить вносит ли ПОЛ вклад в потерю связывающей активности опиоидным рецептором, нами было изучено влияние двух воздействий, ингибирующих ПОЛ на различных стадиях цепной реакции: аргона, инкубация под которым останавливает окисление на стадии образования активных форм кислорода и перекисных радикалов, и лшшдрастворимого антиоксиданта - ионола, взаимодействующего с уже образовавшимися перекисными радикалами, переводя их в неактивное состяние, и таким образом предотвращающего реакцию разветвления цепи.

Нами было показано, что инкубация мембранной суспензии под аргоном существенно снижает скорость инактивации связывания опи-оидных лигандов (рис 7). Это означает, что в присутствии кислорода (при инкубации препарата на воздухе) потеря связывающей активности опиоидным рецептором обусловлена окислением компонетов липидного бислоя мембраны. Стабилизирующий эффект.ионола на связывание лигандов по сравнению с действием аргона незначителен (рис 7). Вероятно, различное действие этих эффекторов в изучаемой системе связано с тем, что образовавшиеся активные радикалы гидроперекисей липидов на начальной стадии ПОЛ оказывают инактивируицее действие на связывание лигандов с опиоидными рецепторами. Поэтому полное предотвращение реакции окисления липидов (в присутствии аргона) приводит к значительной стабилизации связывающей активности рецептора. Можно сделать вывод, что ПОЛ, развивающееся в процессе инкубации - одна из главных причин, вызывающих инактивацию связывания опиоидных лигандов.

Рис. 7. Зависимости уровня специфическо-.го связывания налоксона (0,92 нМ) с лио-филизованными мембранами головного мозга крыс от времени их инкубации в присутствии различных эффекторов: (в) -контроль, (■) - ионол (Ю М), (А) - аргон, представленные в полулогарифмическом масштабе.

-Щ 2о йГ „ин

Добавление в мембранный препарат таких реагентов, как ингибитор фософяипазы А2 - бромофенацилбромид (10~5М) и фосфолипазы С-неомищш (10"4М), стабилизирует связывание опиоидных лигандов (рис 8). Вероятно, ферментативный гидролиз мембранных липидов играет существенную роль в инактивации мембранно-связанных опиоидных

¿ецепторов. (ВИУ

15

as

Рис. 8. Зависимости уровня специфического связывания налоксона (0.9 нМ) со свежевыделенными мембранами головного мозга крыс от времени их инкубации при 37°с в присутствии ингибиторов фосфоли-паз: (•)-контроль, (И)-4-бромофенацил-бромид (10~5М), (А)-неомищш (10-4М),

представленные масштабе.

в полулогарифмическом

53 йо 1йо мин

Следует отметить, что действие всех приведенных выше

реагентов - стабилизаторов связывания зависит от используемого мембранного препарата (на свежевыделенных мембранах стабилизирующие эффекты проявляются сильнее), но практически не зависит от селективности опиоидного лиганда. Этот факт подтверждает высказанное ранее предположение об определяющей роли изменения свойств мембранн в процессе потери связывающей

*)

активности опиоидным г^цептором.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в мембране и стабильность мембранно-связанных опиоидных рецепторов

Одним из общепринятых тестов на интенсивность протекания ПОЛ в биомембранах является спектрофотометрическая детекция промежуточных продуктов ПОЛ - перекисей диеновых соединений (диеновых конъюгатов). На рис 9 приведены кривые накопления диеновых конъю-гатов (ДК) в контрольном образце мембран, а также при инкубации их с эффекторами - ионолом и линолевой кислотой в концентрациях 10~4М. Все приведенные зависимости имеют вид кривой с максимумом. В контрольном образце максимум концентрации ДК достигается при 20 мин инкубации. Линолевая кислота не влияет на время достижения максимума, но значительно повышает уровень ДК в процессе инкубации: максимальная концентрация ДК увеличивается и сохраняется почти в 2 раза выше контрольного уровня на изучаемом интервале времени инкубации (до 1,5 часов). Аналогичная зависимость наблюдается при до-

Рис. 9. Зависмости концентрации ДК в лиофилизованных мембранах головного мозга крыс от времени их инкубации при 37°С в присутствии различных эффекторов: (•)-контроль, (о)-ионол (И)-линолевая кислота

(Ю 4М),

(10 4М).

бавлении в суспензию арахидоновой кислоты. Ионол сникает уровень концентрации ДК на изучаемом временном интервале в 2,5-3 раза, максимум накопления ДК в его присутсвии соответствует 5-10 мин инкубации мембранного препарата.

Повышение уровня ДК в присутствии ненасыщенных жирных кислот вполне закономерно и вызвано тем, что они являются субстратами ПОЛ и их окисление в процессе инкубации увеличивает суммарное содержание перекисей в мембране. Ионол ингибирует образование ДК, то есть

действует в данной системе как антиоксидант.

Вторичными продуктами перекисного окисления липидов являются твА-активные продукта. Скорость и уровень накопления этих соединений в инкубационной среде являются характеристиками интенсивности ПОЛ в изучаемой биологической системе. Было показано, что ио-нол полностью ингибирует накопление ТВА-активних продуктов, линоле-вая кислота повышает их начальную концентрацию и сохраняет ее выше контрольного уровня почти в 2 раза в течете изучаемого времени инкубации (до I часа). Необходимо отметить, что качественная направленность действия изучаемых эффекторов на препарате свежевыделенных и лиофилизованных мембран на кинетику накопления ДК и твл-активных продуктов ПОЛ была-одинакова.

Возвращаясь к вопросу о взаимосвязи ПОЛ и инактивации связывания опиоидных лигандов с мембранными рецепторами, можно предположить, что интенсификация ПОЛ при инкубации мембранного препарата на воздухе при 37°С (рис 9) может играть существенную роль в изучаемом процессе. Наиболее вероятно,что ПОЛ приводит к постепенному обеднению специфического липидного микроокружения рецептора ненасыщенными функциональными мембранными компонентами. Разрушение липидного окружения вызывает нарушение специфичности взамодействия липидов с опиоидними лигандами при рецепторном связывании и меняет конформацию центра узнавания лиганда. Все это должно приводить к снижению связывающей активности рецептора.

Опиоидный рецептор имеет специфическое липидное окружение, состоящее в основном из анионных ненасыщенных соединений. Согласно вышеизложенным представлениям о механизме "инактивации опиоидного рецептора, стабилизирующее действие экзогенных анионных ненасыщенных липидных соединений можно объяснить как непосредственной активацией рецептора при их добавлении, так и уменьшением скорости окисления быстроокисляющихся эндогенных фосфолипидов специфического рецепторного окружения в их присутствии. Такое явление "ингибирования" окисления быстроокисляющихся субстратов ПОЛ при соокислении с другим субстратом описано в литературе. Другими словами, введение в мембранную суспензию таких сусбтратов ПОЛ, как ненасыщенные жирные кислоты и фосфолипиды, компенсирует потери функциональных ненасыщенных липидов специфического рецепторного окружения и предохраняет их от окисления, тем самым сохраняя структуру и

свойства лшшдов вблизи рецептора. Это должно приводить к повышению стабильности связывания лигандов с опиоидными рецепторами.

Изучение микровязкости синаптосом головного мозга крыс в процессе их инкубации методом спинового зонда. Поиск взаимосвязи с

инактивацией_и__стабилизацией мембранно-связанных опиоидных

рецепторов

Одной из характеристик состояния лигадного бислоя может служить его вязкость. Известно, что изменение вязкости мембранных липидов может модулировать активность опиоидных рецепторов. Поэтому нами была изучена микровязкость окружения спиновых зондов, локализующихся в поверхностных слоях липидов мембраны, в процессе инкубации препарата синаптосом головного мозга крыс при 37°С.

Оказалось, что инкубация препарата больше влияет на микровязкость окружения спинового зонда 2, локализующегося в липидах, несвязанных с белками, чем на микровязкость окружения зонда I, локализующегося в аннулярных слоях липидов. Действие изучаемых нами эффекторов на скорость изменения микровязкости зонда 2 также более значительно, однако качественная направленность влияния реагентов аналогична для обеих зондов.

Зависимости времени вращательной корреляции (тс) зонда 2 от времени инкубации препарата синаптосом приведены на рис 10а. Видно, что вязкость в поверхностной области липидного бислоя в процессе инкубации уменьшается значительно - в течение 40 мин т снижается на

О

40%. Ионол существенно не влияет на ход кривой уменьшения микровязкости, однако зависимость времени корреляции от времени инкубации препарата в присутствии этого эффектора лежит выше контрольной кривой. Пальмитиновая кислота кислота немного предотвращает снижение микровязкости мембран синаптосом. Арахидоновая кислота оказывает более сильный стабилизирующий эффект, а линолевая стабилизирует микровязкость поверхностных слоев липидов практически полностью.

Кривые, представленные на рисунке 10а, линеаризуются в полулогарифмических координатах (рис 100). Уменьшение времени вращательной корреляции можно описать с помощью функции: т:° ехр(-где ку - константа скорости уменьшения вязкости, - время вращательной корреляции нитроксильного радикала спинового зонда в момент

Рис. !0.(а): Зависимости времени вращательной корреляции (т,) Ш1Т-роксильного радикала зонда 2 от времени инкубации синалтосом при 37°С в присутствии различных эффекторов (Ю_/5М): I (•)-контроль. 2 (И)-ионол, 3(А)-пальмитиновая кислота, 4(х)-арахидоновая кислота, 5 (ОЬлинолевая кислота; (0): преобразование этих зависимостей в полулогарифмических координатах.

Примечание: тс 0и т0 ^ - время вращательной корреляции зонда в начале инкубации и в момент времени I, соответвенно.

отбора пробы - и т° - в начальный момент времени. По рисунку 106 нами были определены для всех экспериментальных зависимостей.

Нами была проведена корреляция констант скоростей уменьшения микровязкости окружения зонда в присутствии различных эффекторов (рис 106) с константами скорости инактивации мест связывания опиоидных лигандов различной селективности с лиофилизованннми и све-жевыделенными мембранами в присутствии тех же реагентов. Эти корреляции представлены на рис II в логарифмических координатах. Возможно, уменьшение скорости падения вязкости при добавлении жирных кислот является достаточным условием их стабилизирующего действия на связывания лигандов с опиоидными рецепторами. Взаимосвязь этих параметров может быть описана эмпирическим линейным

уравнением: - = -а lg ку+ В. Значения корреляционных пара-

метров (рис II) приведены в таблице 4.

Таблица 4

Параметры корреляции к1п и ку связывания опиоидных лигандов, соответствующие уравнению к1п= -а ку + В

Препарат Свежевыделенные мембраны Лиофилизованные мембраны

лиганд параметр Nal DAGO DADLE Nal DAGO DADLE

А 0,50 0,61 0,62 0,82 0,86 0,87

В I ,74 1,3 1,2 0,73 0,38 0,39

г 0,84 0,79 0,87 0,93 0,98 0,93

Видно, что для различных лигандов параметр (А) (см. табл. 4) практически одинаков на одном и том же мембранном препарате. В то же время, для различных препаратов этот параметр сильно различается: для лиофилизованного образца он существенно больше, чем для свежевыделенного. Вообще, этот параметр, являющийся тангенсом угла наклона теоретических прямых, приведенных на рис II, является характеристикой того, насколько быстро увеличивается стабильность опиоидных рецепторов при уменьшении скорости падения вязкости поверхностного липидного бислоя. Величина этого параметра зависит от способа получения и вида мембранного препарата и может служить характеристикой лабильности рецепторов по отношению к добавлению стабилизаторов вязкости липидов. Таким образом, рецепторы лиофилизованных мембран легче стабилизируются при добавлении веществ, снижающих скорость падения микровязкости окружения зонда 2, чем рецепторы свежевыделенных мембран.

Параметр В, также приведенный в таблице 4, является характеристикой стабильности рецепторов. Их соотношение отражает уже отмеченные особенности изучаемого процесса инактивации: более высокую стабильность рецепторов свежевыделенных мембран по сравнению с рецепторами лиофилизованных мембран, а также меньшую скорость падения уровня связывания антагониста - налоксона по сравнению со скоростью уменьшения уровня связывания агонистов - dago и dadle.

То, что и уменьшение активности опиоидных рецепторов и снижение вязкости липидов описывается экспоненциальной функцией, а кон-

Рис. 11. Корреляции kin налоксона (a), dago (б), dadle (в) на све-жевыделенных (•) и лиофилизованных (а) мембранах и kv на синапто-сомах головного мозга крыс в присутствии различных эффекторов (1СГ4М), представленные в логарифмических координатах. Прямые теоретические, точки экспериментальные. I-контроль, 2-ионол, 3-пальми-тиновая кислота, 4-арахидоновая кислота, 5-линолевая кислота.

станты скоростей этих процессов близки, говорит о том, что инактивация мембранно-связапных опиоидных рецепторов обусловлена не только окислением функциональных липидных компонентов рецепторного окружения, но и уменьшением жидкостности липидного бислоя мембраны в процессе инкубации препарата.

Окисление жирных кислот приводит к повышению общего уровня перекисных соединений в мембране (рис 9), что, в свою очередь, должно повышать вязкость мембранных липидов. По-видимому, этот процесс дает большой вклад в скорость изменения вязкости липидов при инкубации препарата в присутствии этих реагентов.

Механизм инактивации и стабилизации опиоидных рецепторов .мембран головного мозга крыс

Приведенные в предыдущих разделах экспериментальные данные и их обсуждение обобщены в схемах инактивации мембранно-связанных опиоидных рецепторов и стабилизирующего действия использованных нами реагентов, которые представлены ниже.

МЕХАНИЗМ ИНАКТИВАЦИИ МЕМБРАННО-СВЯЗАННЫХ ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Инкубация мембранной суспензии на воздухе в водной среде при 37иС

МЕХАНИЗМ СТАБИЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ЭФФЕКТОРОВ

Г аргон, ионол "1

ТГнгйбйроёание НиЖ^мёмсР ранных липидов

неомицин, 4-бромофенацилбромид

"ТТнгибирбвани

рментативного гидролиза липидов

"Повышение стабильности связывания лигандов с опиоидными рецепторами

Инициирование окисления ненасыщенных липидов специфического рецепторного окружения, соокисление

Повышение вязкости"липид-ного бислоя

[Повышение уровня перекис-|____них соединений

Компенсация потерь "кислых" ненасыщенных липидных компо-центов окружения рецептора

""Ненасыщенные" "гарные" "ШГлоты"; I кардиолипин, фосфатидилинозит [

выводы

1. Впервые изучены закономерности спонтанной инактивации ц- и С-опиоидных рецепторов мембран головного мозга крыс. Показано, что потеря связывающей активности определяется уменьшением концентрации высокоаффинных центров связывания лигандов различной селективности. Установлены отличия в стабильности связывания опиоидных лигандов различной природы (связывание ц-антагониста -максимально стабильно) и на различных мембранных препаратах (связывание лигандов с препаратом свежевыделенных мембран существенно стабильнее связывания с лиофилизованными мембранами) .

2. Обнаружен стабилизирующий эффект прединкубации мембранного препарата в присутствии различных опиоидных лигандов на связывающую активность рецептора. На основе экспериментальных данных предложена, кинетическая модель инактивации опиоидных рецепторов с учетом инактивации лиганд-рецепторного комплекса, определены параметры модели.

3. Показано, что инактивация связывания опиоидных лигандов различной селективности не обусловлена протеолитическим расщеплением рецепторного белка, распадом его на субъединицы, химической модификацией центра узнавания лиганда, изменением активности сопряженных с рецептором ферментных систем.

4. .Определены значения энергии активации процессов инактивации связывания ц-селективных лигандов. На основании этих данных сделан вывод об определяющей роли изменения физико-химических характеристик липидного бислоя в потере связывающей активности опи-оидным рецептором.

5. Изучена рН-зависимость инактивации связывания опиоидных лигандов различной селективности, предложена кинетическая модель достоверно описывающая полученные экспериментальные данные, определены параметры модели. Показано, что инактивация системы опиоидных рецепторов регулируется ионогенной группой с рКд 5,7-6,3.

6. Обнаружено стабилизирующее действие ненасыщенных жирных кислот, ненасыщенных анионных фосфолипидов, аргона, ионола, ингибиторов фосфолипаз на связывание опиоидных лигандов.

7. Изучена кинетика накопления продуктов перекисного окисления -ДК и ТВА-активных продуктов в мембранных препаратах. Установлено, что ПОЛ является одним из важнейших факторов, вызывающих потерю активности опиоидным рецептором.

8. Показано, что при инкубации мембранного препарата происходит уменьшение вязкости приповерхностной области липидного бислоя, что вызывает снижение связывающей активности рецептора. Найдена корреляция между стабилизирующим действием эффекторов на вязкость и уровень связывания опиоидных лигандов.

9. Предложен механизм инактивации мембранно-связанных опиоидных рецепторов. С точки зрения этого механизма предложена модель стабилизирующего действия использованных нами реагентов.

Основное содержание диссертационной работы О.С.Белоконевой отражено в 4-х статьях и 2-х тезисах докладов:

1. Белоконева О.С., Зайцев С.В., Варфоломеев С.Д. Кинетика инактивации связывания лигандов с опиоидными рецепторами мембран головного мозга крыс. // Биол.мембраны. 199!. Т.8. N7. С. 694-703.

2. Мальцева Е.Л., Белоконева О.С., Зайцев С.В., Варфоломеев С.Д. Роль изменеш1я микровязкости синаптических мембран в процессе инактивации связывания лигандов с опиоидными рецепторами мембран головного мозга крыс. // Биол.мембраны 1991. Т.8. N8.С. 830-836.

3. Белоконева О.С., Коломийцева Г.Я. О хемилюминисценции в толуол-феноксольной системе при радиорецепторном методе исследования биологических мембран. //Биол.науки. 1990. Т.319. С. 157-160.

4. Belokoneva O.S., Mal'tseva E.L., Zaitsev S.V., Pal'mina N.P. Phisico-chemical law-governed nature of inactivation of naloxone binding to rat brain membranes. // Journal of chemical and biochemical kinetics. 1992. V.1. N.1 (in press)

5. Belokoneva O.S., Zaitsev S.V. The role of membrane lipids in opioid receptor stability. // Abstracts of International Symposium and NATO Workshop "Phospholipids and Signal Transmission". Wiesbaden, Germany, 1991. P.82.

6. Белоконева O.c. Стабильность опиоидных рецепторов в растворах.// Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Биохимия рецепторных систем". Таллинн, 1990. С.4.

Подписано в печать 24.07.91 НИИТЭХИМ.

Заказ