Применение спектральных методов для структурных исследований некоторых вторичных матаболитов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

,, v 5 с л

российская академия наук

2 ^ р,(-Дальневосточное отделение

тихоокеанский институт биоорганической химии

На правах рукописи

ДМИТРЕНОК АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

УДК 547.925

ПРИМЕНЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОЙ ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НЕКОТОРЫХ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ.

)2.00.10 - бноорганнческая химия, химия природных н физиологически активных

вещее 1В

АВТОРЕ Ф Г, Р А Т диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 199Я

Работа выполнена » Тихоокеанском институте Оиоорганическон химии Дальневосточного отделения Российской Академии наук.

Научный руководитель: доктор химических наук Т. Н. Макарьсва. Научный консультант: член-корреспондент РАН В. Л. Стппик.

Официальные оппоненты:, доктор химических наук, профессор В. И. Высоцкий.

кандиднт химических наук Л. Б. Имбс.

Ведущее предприятие: Институт химии СО РАН, г. Иркутск.

Защита состоится "18" декабря 1998 1". и_час. на •заседании специализированного

совета К.002.06.01 по присуждению ученой степени кандидата химических наук в Президиуме ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159.ТИБОХ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДВО РАН (г. Владивосток, 22, проспект 100-летия Владивостока, 159, ДВГИ)

Автореферат разослан "_"_ 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических паук

Г. И. Прокопенко.

Актуальность проблемы. Интенсивное развитие к последнее десятилетие спектральных методов, и особенно методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения, значительно расширило возможности структурных исследовании, изучения стереохимии п конформационного анализа природных соединении. Это позволило, кроме ioio, установить строение многих минорных вторичных метаболитов, исследовать взаимосвязь физиологической активности и структуры, предположить пути биосинтеза н функции этих соединений.

Среди многих природных соединений, изучаемых в Тихоокеанском институте биоорганпческоп химии ДВО РАН, важное месю занимают соединения, выделяемые из морских беспозвоночных, таких как губки, аецпднн, голотурии и др. Эти животные привлекают внимание наличием большого количества необычных вторичных метаболитов, особенно нзоирепопдов, обладающих уникальной структурой, высокой биологической активностью н пенными фармакологическими свойствами. В лаборатории химии морских природных соединении ТИБОХ было выделено более двухсот новых морских природных метаболитов. Изучению спектральных свойств п установлению строения некоторых из этих соединений и поспящсиа данная работа.

Цслыо настоящей работы являлось исследование строения и стереохимии ряда новых физиологически активных веществ (ФЛВ) из морских беспозвоночных, методами масс-спектроскопнн (МС), газожндкостпон хроматографии - масс-спектроскоипн (ГЖХ-МС) и ЯМР спектроскопии высокого разрешения, изучение особенностей ЯМР и масс-спектров новых соединении, установление некоторых корреляций между структурой н параметрами спектров ЯМР исследуемых соединений, а также изучение с помощью спектроскопии ЯМР некоторых особенностей химических превращений этих соединении. Кроме того, в работе было проведено выделение, исследование строения и стереохимии днтернспопдов из мягкого коралла Sarcophyton sp. и некоторых лнгпаиоп нз эндемичного для Дальнего Востока лекарственного растения - элеутерококка (lih'utherococcus senticosns). Научная иоиизна ч практическая ценное п.. На основе анализа 'Н ЯМР спектров более 150 природных, главным образом, морских сгерппов изучено влияние дополнительных алкильпых групп и положения двойных связен в тетраннклпческом ядре н в боковой цепи на химический сдвиг метнльпых групп.

Изучены ЯМР и масс-спсктры природных сульфатнроваппых стероидных трнолов нз губок Trachvopsis hatihondroides и Cyinbnstela coralliophila, и первого природного 3/?()-сульфатированного диода jpi осгаповот ряда - 24-метилхолеста-5,24(28)-днен-ЗД7/?-дпол-3/?-натрнпсульфат-7/?-аце тага (аинастернн сульфата) нз

глубоководной губки Poecillastra laminaris. Установлены особенности этих спектров, включая влияние сульфатных групп.

Установленные зависимости были применены для анализа с номощыо масс-спектрометрин, газожндкостнои хроматографии н ЯМР спектроскопии стернновых фракций из полухордового Pirosoma giganteum, голотурии Eupentacta fraudatrix и губки Baicalospongia bacilífera. В результате в этих фракциях найдено более 70 известных стерннов. Во фракциях сульфатнрованных стерннов и /?-кснлозндов из голотурии Eupentacta fraudatrix найдено и структурно идентифицировано более 60 соединений, из них 12 стериновых конъюгатов ранее известны не были. Изучены некоторые особенности масс-спектров электронного удара для Д9(и>- и Д22-25<!6>-стерннов.

Установлены структуры новых природных терпенондов из горгонарии Paragorgia arbórea и мягкого коралла Sarcophylon sp.

С помощью метода 'Н ЯМР спектроскопии изучена реакция обратимого равновесия природных три- и пентасульфпдов в присутствии молекулярной серы в различных условиях.

В результате химическою изучения экстрактов корней элеутерококка впервые был выделен и идентифицирован с применением спектральных методов ряд природных соединений, установлена их структура и особенности стереохимии. Апробация полученных результатов. Отдельные части работы докладывались на конференции ТИБОХ ДВО РАН (декабрь 1997). По теме диссертации опубликовано 8 научных статей.

Структура диссертяиии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, .обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит таблиц, схемы, рисунков и литературных ссылок.

1. Методы изучении структуры природных соединений, использованные н работе.

Фракции стероидных соединений (как полярных, так н пенолярпых), которые изучались в работе, представляют собой весьма сложные но составу многокомпонентные смесн родственных соединений, имеющих часто весьма незначительные структурные различия.

Полное разделение этих смесей в настоящее время невозможно. Исследование суммарных фракции хромато-масс-спектрометрней затруднено из-за перекрывания пиков даже при использовании высокоэМхжтнвноп ГЖХ па капиллярных колонках. Кроме того, данных ГЖХ-МС анализа суммарной фракции часто оказывается недостаточно для определения структуры соединений. Поэтому после дополнительного разделения суммарной фракции с помощью ВЭЖХВД мы

проводили анализ подфракцнй методами ЯМР спектроскопии н ГЖХ-МС. ЯМР спектроскопия на этом этапе позволяет вести контроль за эффективностью разделения и в ряде случаев определять основные компоненты подфракций н соотношение этих компонентов.

Идентификацию уже известных стеринов и стернновых коныогатов проводили, главным образом, по временам удерживания при капиллярной ГЖХ и по данным масс-спектрометрин. Всего было идентифицировано сто двадцать восемь таких природных соединений.

Для установления структуры индивидуальных соединений, которые были предоставлены сотрудниками лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ или получены самим автором (днтерпеионды из мягкого коралла, лигнаны из элеутерококка), использовались данные масс-спектроскопии электронного удара и бомбардировки быстрыми атомами, инфракрасной и ультрафиолетовой спектроскоппн, спектроскопии ЯМР, в том числе ЯМР эксперименты: разностный межъядерный двойной резонанс (ИНДОР), селективный декаплннг, внутримолекулярный разностный ядерный эф()>ект Оверхаузера (ЯЭО). Для структурного исследования некоторых соединений, выделенных из элеутерококка, применялись методы двумерной спектроскопии ЯМР. В случае, когда соединения были выделены в достаточном количестве, использовались возможности спектроскопии 13С ЯМР.

2. Исследование морских стернпов и родо псиных соединений с применением спектральных и инструментальных методов.

2.1 Использование химических сдвигов метальных протонов в 'Н ЯМР спектрах при анализе смесей природных стероидных соединений и для установления строения и стерсохимических особенностей индивидуальных с п рипои.

Химические сдвиги (ХС) ангулярных мегпльных групп СНз-18 и СНз-19 стеринов в протонном спектре давно используются для определения структуры этих соединении. ХС сигналов других метнльных групп в этих спектрах часто позволяют установить особенности структуры соединения: определить либо подтвердить конфигурацию хнральных центров и положение двойных связей в боковой цепи (БЦ). В последнее время было найдено много новых морских стеринов с необычным положением двойных связей или алкнльнымп группами как в ядре, так и в боковой цепи. Однако систематический анализ данных 'Н ЯМР спектроскопии этих веществ не проводился.

Мы проанализировали литературные данные о ХС мегпльных групп в спектрах ряда природных, главным образом, морских стернпов, а также результаты,

полученные памп в процессе изучения стериновых фракций нз морских беспозвоночных. Мы рассчитали аддитивные коэффициенты, равные разнице между ХС соответствующих метильных групп в соединениях, имеющих дополнительные алкнльные группы (двойные связи) и не имеющих таких структурных особенностей. Всего были изучены спектры более 150 соединении. Величины аддитивных коэффициентов приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Влияние положения двойной связи в боковой цепи на химический сдвиг метильных групп в 'Н ЯМР спектрах стернпов.

№ Дв. Связь СНз-18 CHj-19 CHj-21 СН-,-26 СНз-27

1 Д--транс 0,01-0,02 0,0-0,01 0,09-0,10 0,0-0,02 -

2 &22-цис 0,05-0,07 0,01 0,04-0,06 0,04 0,03

3 А2>-транс 0,01 - -0,08-0,03 0,11-0,16 0,11-0,19

4 &2!-1111С 0,01 0,01 - 0,0-0,07 0,07-0,18

5 A2i-mpcmc - - 0,04-0,06 - -

6 Ди-цис - - 0,09 - -

7 д25(26) -0,01 - 0,01-0,03 - -

8 д22(28)* 0,03 - 0,13 - -

9 д2ц28)** 0,03 - -0,01 - -

10 д24(28) 0,00-0,01 - 0,04 0,06-0,19 0,06

*- 22-мет1шен-сгер1шы, **- 23-метилсн-сгерпны

ХС метильнои группы СНз-19 (среднее значение 1,007 м. д. для Д'-стерннов) наименее подвержен влиянию изменений строения БЦ. Наличие в соединении 22(23)-циг-двойной связи вызывает сдвиг сигнала до 1,02 м. д. Введение метального заместителя в положение 22 либо в 23 сдвигает сигнал в слабое поле примерно на 0,01 м. д.

ХС метнлыюй группы СНэ-18 зависит от строения БЦ гораздо сильнее и находится в соединениях Д5-ряда в диапазоне 0,620-0,742 м. д. 22(23)-7/)я/1с-двойная связь вызывает дезэкранированне сигнала в среднем па 0,015 м. д. Особенно сильно влияние 22(23)-1/»с-двойпон связи - сдвиг в слабое поле на 0,07-0,05 м. д. 23(24)-Двойная связь вызывает меньшее дезэкранированне: (в среднем 0,01 м. д.). 25(26)-Двойная связь сдвигает сигнал в сильное поле па 0,01 м. д. Наличие мегнленового звена в БЦ приводит к деээкраннрованшо сигнала: 23(28)- и 22(28)-двойпая связь вызывают сдвиг в слабое поле на 0,03 м. д., а 24(28)-метнлен на 0,01 м. д. Ллкнлирование БЦ в различных положениях также нызынает сдвиг сигналов СНэ-18

в слабое поле: метил в положеипп 23 - на 0,02-0,01 м.д., в положении 22- на 0,005-0,01 м. д. Алкплированне в положении 24 не изменяет ХС СНз-18. Подобное влияние испытывает и ХС метальной группы СНз-19.

Наибольшие изменения ХС концевых мегпльнмх групп 26 и 27 вызывает алкплированне в положении 24 - сдвиг в сильное поле на 0,02-0,05 м. д., и 23(24)-двоГшая связь - сдвиг в слабое поле на 0,11 -0,19 м. д.

Дополнительные метальные группы в ядре практически не изменяют ХС метальных групп в БЦ за исключением 4а-мегнла (дезокраннрование СНз-21 на 0,02 м.д.). Сигналы метильных групп 18 и 19, как правило, также сдвигаются в слабое поле, кроме случая алкнлпровапня в положении 14а, которое вызывает сдвиг СНз-19 в сильное поле на 0,1 м. д.

Таблица 2. Влияние алкшшролатгя на химический сдвиг метальных групп в 'Н ЯМР спектрах стеринов.

№ Положение заместителя СНз-18 СНз-19 СНз-21 СНз-26 СНз-27

1 22а-Ме 0,01 0,01 - - -

2 22/?-Ме 0,01 0,01 - - -

3 23-Мс 0,01-0,02 0,01 0,03-0,06 - -

4 24а-Ме - - -0,01 -0,02 -

5 24/Ше - - 0,0-0,01 - -0,04

6 24а-Этпл - - 0,01 -0,03 -0,05

7 24/?-Эгнл 0,0-0,01 - 0,01 -0,02 -

8 4а-Метнл 0,0-0,03 0,02-0,10 0,02 - -

9 4,4-Дпметт1л 0,08 0,02 - - -

10 14а-Метнл 0,09 -0,10 - - -

11 4а, 14а-Днметнл 0,08 0,05

Влияние строения стероидного ядра на ХС метила в 21 положеппн определили при рассмотрении спектров двадцати двух соединении с разным стероидным ядром, но одинаковой БЦ. Сигнал последовательно сдвигается в слабое ноле в ряду Д°, Д°-3/ЮН, ДММе-З/ЮН, А-нор, Д|4-3/ЮН, З-оп-4-ен, Д'-З/ЮАс, Д5-3/ЮН, Д'-З/ЮН, ДЧ'О-З/З-ОАс, ДХ'О-З/ЮН-сосдинеинй в пределах от 0,900 м. д. до 0,931 м. д. в 245-серип п от 0,891 м. д. до 0,925 м. д. в 24/<-серии. Эти же данные показывают, что для

соединений с 24Л-мстнлыюн группой в боковой цепи ХС СНз-21 сдвинут в слабое поле примерно на 0,008 м. д. по сравнению с соответствующим снгпалом в соединениях 245-серни. Наличие 22(23)-ш/шмс-двойиой связи вызывает заметное дезэкраннрованне рассматриваемого сигнала: (+0.09-0,10 м. д.); 22-уыодвопная связь влияет слабее, сдвигая сигнал в слабое поле на 0,04-0,06 м. д. Обратный эффект оказывает введение 23(24)-двониой связи - экранирование на 0,03-0,08 м. д.

Полученные закономерности мы использовали при изучении стерпнового состава морских беспозвоночных и, в частности, при анализе подфракций, полученных после хроматографии низкого давления. Это позволяло определить тип ядра основных компонентов подфракций, предположить наличие дополнительных метальных групп в ядре п боковой цепи.

2.2 Исследование стеринового состава полухордоиого Pirosoma giganteum.

Из фракции свободных стеринов пз полухордового Pirosoma giganteum (кл. Thaliacea, подкласс Pyrosoma, семейство Pyrosomidac) после ее ацетнлпрования и разделения с помощью препаративной тонкослойной хроматографии на снлнкагеле, нмпрегнированном азотнокислым серебром, были получены подфракцип, которые анализировали методом ЯМР, ГЖХ и ГЖХ-МС. Стероидные компоненты идентифицировали по их масс-спектрам и по относительным временам удерживания (ОВУ) в условиях хроматографии на капиллярной колонке (фаза OV-lOl). Всего в Pirosoma giganteum обнаружен 21 стериновый компонент, в том числе идентифицировано 19 ранее известных стерниов.

2.3 Изучение стеринового состава пресноводной губки Baicalospongia baciUfera.

Стериновый состав байкальской губки Baicalospongia baciUfera определялся с помощью ГЖХ-МС анализа и спектроскопии 'Н ЯМР подфракций свободных стеринов, полученных после разделения их суммарной фракции с помощью колоночной ВЭЖХВД на обращенной фазе. Основными стерлнамн являлись: холестерин (39,2%), 24£-метилхолесга-5,22-ен-3/?-ол (10,8 %), (245)-мстнлхолест-5-еи-3/?-ол (10,1 %). Для выделения минорных компонентов часть смеси была ацетнлнрована п разделена на колонке с сплпкагелем, имнрегннрованпым азотнокислым серебром, в результате чего был получен новый природный стерпи, названный байкалостсрнном (1), имеющий редкую 22(23),25(26)-диеиовую систему н необычную боковую цепь, в которой отсутствовала СНэ-27 группа. Структуру боковой цепн банкалостернна устанавливали спнн-декаплннг экспериментами, включая двойной резонанс.

Облучение протона Н-25 (5,72 м. л.) выявило положенно сигналов соседних олефиновых протонов метиленового звена (Н-27, Н-27') 4,93 - 5,01 м. д. и сигнал

аллнльного протона Н-24 (мультиплет при 2,49 м. д.). Облучение этого мультпплета упрощало мультиплеты при 5,21 м. д. (Н-22, Н-23) и 1,37 м. д. (Н-28). Последний сигнал также изменялся при облучении триплета при 0,86 м. д. (СНз-29). Наконец сигнал протона Н-20 (мульишлет, 1,95 м. д.) выявлялся при облучении сигналов при 1,02 м. д. (СНз-21) либо 5,21 м. д. (Н-22). Константа снпн-спннового взаимодействия впннльных протонов (15,0 Гц) была определена спнн-деканлингом и

соответствовала транс стереохимии двойной связи.

Исследование масс-спектра ацетата 1 (OoHieOi) показало отсутствие в нем М+ пика, что типично для ацетатов стерпнов Д'-ряда. Интенсивные пики в этом спектре при m/z 378 (М+-АсОН) (100%), m/z 255 (43%), m/z 213 (10%) указывали па присутствие в стернне обычного ?р-ОН-Д5-ядра. В то же время заметный пик при m/z 349 ( M * - С 2 H 5 - А с О H ) был связан, очевидно, с аллшп.ным разрывом связи С24-С28. Пик при m/z 282 (С20-С22-разрыв-АсОН)4 характерен для 22(23)-двопнон связи.

Подобные закономерности характерны и для масс-спектрометрнческон фрагментации других стерннов, имеющих двойные связи в положениях 22(23) и 25(26). В спектрах этих соединений наблюдаются как сигналы, связанные с отщеплением заместителей из дналлнльного положения, так и типичные для ацетатов Д22-сосдпнеппп пики с m/z 282.

2.4 Исследование стероидных метаболитов голотурии Eupcntacta framlatrix.

Исследование состава стероидных фракции голотурии проводилось сотрудниками лаборатории морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН в рамках совместной работы с группой проф. Джерассн (Стэнфордскнн университет, США) по изучению биосинтеза стероидных и трнтериеиоидных метаболитов. Ранее стероиды этой голотурии были изучены недостаточно.

Фракцию свободных стерннов, включающую кроме 4-десметнл- также и 4-моно и 4-диметнлетернны, разделяли па подфракцнп методами ВЭЖХВД на колонках с силнкагслем. Полученные подфракцнп анализировали методами 'Н ЯМР, ГЖХ и ГЖХ-МС. Затем их разделяли па компоненты с помощью ВЭЖХВД на колонках с обращенной фазой или в виде анепиов методом жидкостной хроматографии

НО

1

низкого давления на колонках с силикателсм, нмпрегннрованным нитратом серебра. Полученные вещества повторно анализировали ЯМР, ПКХ и ГЖХ-МС методами. Было идентифгашрованно 20 соединении, включая 14а -мети л- 5 а-хо лест-9( 11)-ен-Зу9-ол н 4а,14сг-днметил-5а-холест-9(11)-ен-3/?-ол, которые были основными компонентами.

ЫзвОз!

ЫаЭОз!

10

11

После кислотного гидролиза сульфатов стернпов было идентифицировано 32 соединения. Главным компонентом оказался сульфат холестерина (23%), сульфаты Д9<ч)-стерннов были минорными компонентами. Три новых сульфатированных стероида были идентифицированы при анализе данной фракции: 4а,14а-днметнл-5а-холест-9(1 |)-ен-3/?-ол сульфат (2), лапостанол сульфат (3) и 24(25)-днгндроипклоартенол сульфат (4).

После кислотного гидролиза фракнни кснлозидов идентифицировали 31 стериновын компонент. Найденные нами производные станолов (8, 9), Д'-стерннов (10, 11, 12, 13), Д9("|-стершшв (6, 7) и /?-ксплознд 24(25)-дегндроциклоаргенола (5) рапсе не были известны.

Стероидный состав голотурии весьма с-тожен и включает 85 различных стероидов, среди которых нами идентифицировано 12 ранее неизвестных природных соединений.

На основе анализа литературных данных и спектров, полученных в ходе выполнения данной работы, мы напшн несколько характеристических пиков и направлений фрагментации для ¿'""-соединении. Наиболее интенсивными в масс-спектрах ацетатов таких стернпов оказались пики, связанные с отщеплением метильноп группы (по-внднмому, СНз-19 из аллнльного положения).

2.5 Применение спектральных мегодн» при исследовании стероидного состава губок Тгас/1упр.Ч1<; 1шШют1го1Лс5, СутЬаь1с1а согаШорЫЫ и РоссШ<ии-(1 /аттагк.

В процессе химического исследования ФАВ из тропических губок Тгаскуорз/з 1тШгот1го1(1е5 и СутЬси1е1а согаШорНИа, проявлявших высокую антимикробную и ци го токсическую активности, нами были изучены ЯМР н масс-спектры трпсульфатнровапных трнгидроксистерондов нч тгнх губок. Соединения этого типа все чаще и чаще находят в последнее время в губках. Мы сравнили их спектры со спектрами стернпов, имеющих такие же БЦ, как и и них полярных стероидах.

Анализ спектров ЯМР полученных веществ показал, что все компоненты фракции имеют одинаковое стероидное ядро с заместителями в положении 2ДЗа,6а. В этих спектрах наблюдались характеристические сигналы СН-2, СН-3 (74,6 м. д., 4,76 м. д.) и СН-б (77,1 м. д., 4,20 м. д., д. т., .1=10,6 Гц, 3,7 Гц). В 'Н ЯМР спектрах соответствующих трнацетатов присутствовали сигналы при 4,91 м.д. (Н-2, Н-3) и 4,81 м. д., д. т., .1 = 10,5 Гц, 4,0 Гц, (Н-6). Стероиды, таким образом, отличались друг от друга только строением боковой цепи. При установлении строения зтих боковых ценен использовали ЯМР эксперименты и масс-снек трометрию электронного удара.

В целом, в масс-спектрах изученных трнацетатов обнаруживаются некоторые закономерности, харак1ерные для соответствующих станолов и их моноацегатов.

Так, пик с m/z 211 (М+-ЗАсОН-БЦ-42), образующийся в результате отрыва боковой цепи, уксусной кислоты и части кольца D, соответствует подобному пику с ml/. 215, характерному для станолов. Наличие 22(23)-ненасыщенности в соединении 206 приводит к появлению в его масс-спектре пиков, связанных с разрывом связи С20-С22, и соответствующих пиков, образующихся затем при отрыве ацетатных групп: 460(14), 400(16), 340(16), 280(32). Наличие алкнлыюго заместителя в 24-положешш облегчает отрыв терминальной изоироннлыюй группы. В масс-спектрах триацетатов с 22(23)-двойной связью, кроме того, наблюдаются и заметные пики в результате отрыва боковой цепи с переносом 2 атомов водорода.

RiO

RiO

ORi

14 R=

15 R=

18 R=

17 R=

18 R=

19 R=

14-24 R ,=S03Na 14a-24a R ,=II 146-246 R !=ОЛс

20 R=

21 R=

22 R=

23 R=

24 R=

Во всех спектрах имеются заметные пики, связанные с последовательным отрывом всех трех ацетатных групп (М'-бО, М'-120, М'-180) н ник (М*-2АсОН-42), соответствующий потере двух молекул уксусной кислоты н молекулы кетспа. Этот

инк имеет наибольшую относительную ни [сиснвносгь и спектрах трпацетатов с насыщенной боковой цепью (100%), однако он менее интенсивен (70%) в соединении 186 с 25(26)-двопной связью, а его интенсивность уменьшается еще значительнее (до 15-20%) в случае Д"-трнацетатов. Данные масс-спектров приведены в таблице 3.

Таблица 3. Масс-спектры электронного удара трпацетатов 166-246.

Фрагмент Основные пнкн в масс-спектрах, m/z, относит, интенсивность

166 176 186 195 205 215 226 236 246

М* " " 530 (1,0) 532 (0,1) 544 (2,1) 558 (2,0) 558 (2,0) 588 (0,2)

М*-БЦ-2Н 431 (0,8) 431 (0,2) 431 (5,0) 431 (0,9) 431 (37,0) 431 (29,0) 421 (29,0)

М+-ДсОН 402 (0,6) 416 (1,4) 470 (4,6) 472 (2,4) 484 (12,0) 486 (1,0) 498 (6,0) 498 (6,0) 528 (2,0)

М«-АсОН-43 " 455 (3,0) 455 (3,0) 485 (1,0)

М*-2АсОП 342 (26.0) 356 (40,0) 410 (39,0) 412 (42,0) 424 (18,0) 426 (29,0) 438 (14,0) 438 (14,0) 468 (39,0)

М*-2АсОИ -42 300 (100) 314 (100) 368 (69,0) 370 (100) 382 (19,0) 384 (71,0) 396 (14,0) 396 (14,0) 426 (97,0)

М+-2АсОИ-43 - " ' 395 (13,0) 395 (13,0) '

М*-2АсОН-БЦ; 3 313 (44,0) 313 (3,0) 313 (31,0) 313 (31,0) 313 (4,0)

М+-ЗАсО!1 282 (39,0) 296 (60,0) 350 (100) 352 (72,0) 364 (26,0) 366 (100) 378 (17,0) 378 (17,0) 408 (100)

M+-3AcOH-43 " 335 (43,0) 335 (43,0) 365 (6,0)

М--С20-С22 разрыв 460 (14.0)

*13о и сох масс-спектрлх присутствуют пнгснсинпыс пики при т/г 271 (М+-2ЛсОН-БЦ-42); 253 (М'-ЗЛеОН-БЦ) и 211 (М*-ЗЛсОП-БЦ-42).

'Н ЯМР спектры полученных триалеi л гов мы сравнили со спектрами стсрппов, имеющих такие же боковые цени, и оиепшш влияние дополнительных ацетатных групп на химические сдвиги сш палок апгуляриых мегильных групп н метилов в боковой цепн. Под влиянием трех ацетатных групп в положении 2ß,ia,6a сигнал СН.1-19 дезэкраннруется н сдвигается в слабое ноле на 0,15-0,17 м. д. (до 0,97 м. д.). Сигналы метнльпых групп боковой цеии имеют практически такие же химедвиги, как н соответствующие метши,пые 1 руины стаполов с аналогичной

боковой цепью. Сигнал СНз-18 испытывает незначительный сдвиг в сильное ноле (на 0,02 м. д.). Сигнал метальной группы СНз-21 значительно меньше реагирует на изменения в строении боковой цепи. Например, при введении 22(23)-двошюи связи дезэкраннрующнн эффект составляет всего лншь 0,03 м. д., в то время как для стеринов это значение составляет примерно 0,09 м. д.

Из глубоководной губки РоесШаз1ю 1апипаг1$, был выделен представитель нового структурного типа сульфатированных стероидов эргостанового ряда - аннастерпн сульфат (25). При установлении его структуры использовали данные ЯМР, ИК- и масс-спектров 25 и его производных.

25 (^ЭС^а (Ч^Ас 25а (*=Н Я|=Ас 25Ь Я=Н Я^Н

Положение заместителей и структура БЦ определялись с помощью экспериментов по ядерному эффекту Оверхаузера (ЯЭО) и разностному двойному резонансу (схема 1).

ОН

.........- ЯЭО

-- ИНДОР

Схема 1. ЯМР эксперименты по,установлению структуры соединения 256.

Масс-спектры и протонные ЯМР спектры указывали па наличие в соединении 25 мононенасыщенного стероидного ядра с двумя функциональными заместителями: О-сульфатнон и ацетатной группой, н на боковую пень с одной двойной связью С? Положение заместителей и структура БЦ устанавливались с помощью экспериментов по ядерному эффекту Оверхаузера и разностному двойному ре зонансу. В протонном спектре соединения 256 сигнал Н-6 проявлялся в виде триплета с константами 2,0 Гц, 2,0 Гц. Одна из этих констант - внщшальная с прогоном Н-7, находящимся,

очевидно, в а-положешш. Значение аллнлмюн константы J (Н-4е-Н-6) = 2.0 Гц соответствует двугранному углу величиной порядка 90°. Протон Н-7 проявлялся в виде дублета триплетов с константами 8,5 Гц; 2,0 Гц; 2,0 Гц Наличие скалярной константы Н-4-Н-7 было подтверждено экспериментами по разностному двойному резонансу. Этим методом определены также ХС протона Н-8 (1,67 м. д.) и Н-25 (2,22 м. д.). В экспериментах по разностному ЯЭО, как н следовало ожидать, воздействие на сигналы метпльных протонов СНз-18 н СНз-19 давало примерно одинаковый отклик сигнала при 1,67 м. д. (Н-8). Воздействие на метильные группы СНз-27, СНз-28 давало отклик сигнала метнлепового протона Н-28. Положение 24(28) двойной связи подтверждалось также сдвигом сигнала Н-25 в слабое поле (2,22 м. д.) и наличием спин-спинового взаимодействия с консташ ом 1,5 Гц между протонами Н-25 - Н-28.

Сравнение спектров 25 и его производных со спектрами соответствующих стерпнов показало, что присутствие в ядре стерпна дополнительных полярных групп сдвигает сигналы ангулярных метильных групп в слабое поле. Так, 7уЗ-гндроксильиая группа сдвигает сигнал СНз-18 на 0,035 м. д., СНз-19 - па 0,050 м. д., и СНз-21 - на 0,030 м. д., 7/?-ацетатиая группа соответственно на 0,016 м. д. и 0,079 м. д., а сигнал СНз-21 проявляется в более слабом иоле, сдвигаясь на 0,010 м. д. Замена гндрокенльной группы в положении 3/? на сульфатную вызывает также сдвиг в слабое поле СНз-18 на 0,020 м. д., СНз-19 на 0,010 м. д., н СНз-21 на 0,040 м. д.

Таким образом, методы ЯМР п масс-спектрометрнн были успешно использованы при анализе новых стероидных соединений из губок Trachyopsis halihondroides, Cymbastela coralHophiki и PoeciHastra /nniinriris; были исследованы особенности 'Н ЯМР и масс-спектров этих соединений.

3. Установление структуры терпепоидов hj морских беспозвоночных.

3.1 Установление структуры терпенондов из мягкою коралла Sarcophyton sp.

Мы исследовали фракцию соединений, выделенную индийскими учеными под руководством проф. Анджапеулу из экстрактов мяткого коралла Sarcophyton sp. После разделения этой фракции с помощью ВЭЖХВД на колонке Zorbax Sil было получено три компонента (26-28), различающихся между собой наличием и положением двойной связи.

Масс-спектр основного соединения (26) п данные "С ЯМР спектра соответствовали молекулярной формуле С211bsOv Анализ протонного н углеродного спектров ЯМР показал присутствие сигналов карбонильной группы, полукеталыюго углерода, четвертичного углерода, связанного с кислородом, двух тризамещенных

двойных связей, четвертичной метнльиой группы, нзопроннльной группы, метальной группы при двойной связи и карбоксиметцлыгон группы.

30 6(7)-дегидро,

Эксперименты по разностному двойному резонанасу, синн-деканлингу и разностному ЯЭО для соединения 26 проводили в различных растворителях, чтобы выявить отклики перекрывающихся сигналов. На основании полученных данных мы предположили для основного компонента фракции две альтернативные структуры: 26 и 30.

Анализ КССВ и данных разностного ЯЭО позволил установи п. некоторые стереохимическне особенности этого соединения. КССВ .Ь.з=13,0 Гц и 12.у=5,4 Гц указывали на то, что протоны Н-2 и Н-За являются аксиальным, Н-ЗД соответственно, экваториальными, а нзонроиильная группа является экваториальным заместителем. Наличие ЯЭО между протоном Н-10а и метальной группой СНз-14, а также между протонами Н-За и Н-10а и между протоном Н-Зл и метнлыюй группой СНз-14 говорило о том, что все они находятся по одну сторону плоскости молекулы, что соответствует 1(нс-с0члеиенню колец А и В. Однако данных ЯМР спектроскопии оказалось недостаточно, чтобы сделать окончательный выбор между альтернативными структурами 26 и 30, хотя в пользу структуры 26 говорило наличие ЯЭО между протонами Н-3 - Н-10. Этот эффект был бы возможен в

структуре 30, только если бы кольцо Л n neií нахолилось в энергетически менее выгодной конформацни "ванна".

Схема 2. ЯМР эксперименты по установлению структуры соединения 26.

Окончательный выбор между двумя алыерпа швпымп структурами в пользу 26 был сделан с помощью рептгеиострукгурпого анализа.

В 'Н ЯМР спектре минорного соединения 27 отсутствовал сигнал впшшыюго протона, а вместо сшнала метнлыюй группы при двойной связи наблюдался дублетный сигнал метнлыюй группы (1,02 м. д., .1=6.5 Гц). Ппк молекулярного нона и некоторые другие инки в масс-спектре электронного удара были сдвинуты на 2 miz по сравнению со спектром терпеноида 26. Это указывало на то, что 27 является дегндриропроизводиым 26. Соединение 27, названное саркофнтнном, было в 1997 году описано индийскими и американскими химиками. Они установили его структуру с помощью спектральных методов, включая рентгеноструктурнын анализ.

Масс-спектр другого минорного соединения (28) был подобен масс-спектру 26, по в 'Н ЯМР спектре наблюдались сигналы экзомети.теповой группы при 4,9 м. д., а сигналы протона и метнлыюй группы при двойной связи отсутствовали. Поскольку другие сигналы в спектре изменились слабо, то, очевидно, что этот новый днтерпепонд является изомером 26 и имеет экэометнленоиую группу при С-7.

ИНДОР яэо

3.2 Установление структуры териенонда из горгонарии Paragurgia arbórea.

Из горгонарии Paragorgia arbórea был выделен ранее неизвестный днтерненонд. Наличие в структуре териенонда шсстнчлеиного лактопа (ИК-сисктр: 1736 см1) и характерные сигналы Н-1аг и l\-\fi в 'Н ЯМР спектре в виде дублетов дублетов при 4,03 м. д. и 4,17 м. д. позволили отнести "по соединение к кссниановому ряду.

Строение боковой цепи подтверждал 'Н ЯМР спектр, в котором все сигналы метальных групп наблюдались при 1,64-1,69 м. д. Следовательно, СНэ-16 и СНз-17 расположены у двойной связи. На основании этих данных, а также спектров ЯМР 13С и масс-спектров была предложена ст руктура 31.

4. Изучение реакций обратимого равновесия природных цента- и трнеульфидов из асцидии Ро1усНог ер в присутствии молекулярной серы.

Из колониальной асцидии Ро!усИог эр. в лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ были выделены биологически активные соединения: ранее известный варацнн 32 и смесь новых нолпеульфпдов, в том числе 33а.

Известно, что некоторые ароматические циклические бензотнепнпы в растворах способны трансформироваться в бензотрптнолы с выделением молекулярной серы. Исследование соединений 32 и 33 методом 'Н ЯМР и масс-спектромстрин показало, что 32 способен аналогичным образом трансформироваться в 33, причем эта реакция обратима. В 'Н ЯМР спектре образующейся смеси регистрируются два сигнала ароматических протонов (5 6,96 м. д. и 5 6,82 м. д. для соединений 32 и 33 соответственно). Измерение интегральной интенсивности этих сигналов позволяет установить процентное содержание соединений в растворе и проследить за особенностями этого равновесия.

MeO

32 R=H 32a R=COCH3 32b R=COCF3

+ s}

NHR

33 R=H 33a R=COCH3 33b R=COCF3

Реакции 32<-»33+88. 32а<-»ЗЗа+$8 и 325<->3?о+8а наблюдались в хлороформе, метаноле н пиридине в различных условиях непосредственно в ампуле для снятия ЯМР спектров. Некоторые нз полученных прн этом данных приведены в таб. 4, 5.

Таблица 4. Изменение относительной концентрации пента- н трисульфндов в различных растворителях при температуре 1СРС.

Соединение Растворитель Относительная концентрация цента- н трисульфндов, %

Время реакции, час.

0 3 • 70 90 150 400

32 CDjOD 17 22 21 24 23 25

32а CDjOD 3 6 6 10 16 20

CDCb 3 2 3 4 5 10

32Ь CDCh 2 15 22 29 25 30

Наиболее быстро превращение в бензотритнол варацнна 32 происходит в дснтсрометаноле, а трифторпронзводпою 32С - в дейтерохлороформе. В результате к моменту установления равновесия количество фнсульфидов достигает 25% н 30% соответственно. Для ацетата варацнна 32а реакция идет заметно быстрее в дейгсрометаиоле, чем в дейтерохлороформе, при этом в состоянии установившегося равновесия в растворе содержится в два раза больше трнсульфида.

При добавлении в смесь полисульфидов 32а н 33а молекулярной серы прн нормальной температуре равновесие не сдвигается в дейтерохлороформе, а в дейтерометаноле продолжается образование трнсульфида. В случае варацниов 32 н 33 избыток серы вызывает смещение реакции в сторону образования 32 на 15%.

Примерно 45% ацетата варацнна 32а превращалось в 33а прн нагревании в пиридине в течении 20 минут. Добавление избытка серы Ss в смесь 32а и 33а в тех же

условиях приводило к смещению равновесия, и содержание 33а уменьшалось на 20 % в течении 15 минут.

Таблица 5. Изменение относительной концентрации иепта- и трнсульфндов в различных растворителях при добавлении в раствор избытка свободной серы.

Соединение Растворитель Время реакции, час.

0 1 1,5 2 24 48 100 200

Относительная концентрация цента- и трнсульфндов, %

32 CD3OD 30 19* 14 14 14 14

32а CDjOD 19 25* 24 24 25

CsDsN 2 40** 10* 12

*после добавления в раствор избытка молекулярной серы, •"нагревание при 100° С.

Таким образом, была показана прннцшшпальная возможность использования 'Н ЯМР спектроскопии для изучения этой интересной химической реакции и исследованы некоторые ее особенности.

5. Химическое изучение экстракта Eleutherococcus senticosus.

В ходе сист ематического поиска новых ФА В из различных природных источников мы исследовали спиртовые экстракты из Е. senlicosus.

Спиртовый экстракт растения распределялся между различными растворителями. Полученные фракции разделяли хроматографией низкого давления на колонках с сшшкагелем, тефлоновым порошком (нолпхром-1), сефадексом LH-20 и ВЭЖХВД на колонке с прямой и обращенной фазой.

Мы обнаружили значительное содержание (0,13 % ог сухой массы корней) этилового эфира умбелнферона (34), идентифицированного 'Н и |3С ЯМР спектроскопией. Умбелиферои хорошо известен как составляющая часть многих лекарственных растений.

Неолигнаи (35) был идентифицирован как 7ЛЛ,8Л5-днгндродегндродп-коннфериловын спирт. Небольшое преобладание (+)-формы в 35 было определено методом спектроскопии кругового дихроизма (КД). КД-сиектр показал небольшой отрицательный Э(1к]>ект Коттона при 275 им в отличие от положительного эффекта для эпимерного соединения, описанного в литературе. 'Н ЯМР спектр 35 в дейгероацетопе был идентичен спектру 75,8Л-дигпдродсгндроднкоппфернлового спирта, приведенному в литературе. 'Н ЯМР спектр соответствующего ацетата, полученного нами, отличался от спектра ацетата альтернативного цпс-нзомсра в основном химическим сдвигом Н-7 (5,52 м. д. вместо 5,82 м. д.).

Т/)(7»с-расположеш1е протопоп при С-7 и С-8 было подтверждено экспериментами по разностному ЯЭО. Облучение протона Н-7 давало отклик ароматических сигналов при 6,82-6,84 м. д., в то время как отклика для Н-8 (3,61 м.д.) не наблюдалось. Облучение последнего сигнала не давало отклика протона Н-7.

СНгСНгСНгОН

Спектры ЯЭО дегндродпконш]ернлового спирта (36) также показали отсутствие пространственного взаимодействия между Н-7 и Н-8. Эти данные доказали, что протоны при С-7 н С-8 в 36, также как в 35, находятся в транс-ноложсшш. Двойная связь в соединении 36 имеет /Г-копфнгурацпю, на что указывает величина КССВ между Н-7' и Н-8' (15.8 Гц). Структуры соединений 35 и 36 былн подтверждены также данными масс-спекгров п спектрами "С ЯМР.

Соединения 37 (уЗ-О-глюкозид дегпдроднкопн||>ерплового спирта), и 38 (мезо-секонзоларнснрезннол) былн идентифицированы сравнением ЯМР и масс-спектрометричсскпх данных с приведенными в литературе.

'Н ЯМР спектр 39 указывал, что тго соединение принадлежи г к ряду снрингарезинола. Дноксобнцнкло-[3.3.0]-октапы предпочтительно образуют i(несочлененную систему. Отнесение 'Н и "С сигналов проводили с помощью двумерной гезхфоядерпой корреляционной снскгроскоппп, экспериментов ИНДОР и DEPT.

Химические сдвиги атомов С-7, С-7', С-8, С-8', С-9, С-9' показали, что обе арильиые группы являются экваториальными, как описано в литературе. Присоединение остатка глюкозы к одному нз ароматических колец было установлено по присутствию соответствующих сигналов в 'Н и, особенно, 13С спектрах, где наблюдали несовпадение ХС сигналов атомов этих колец. Соответствующие пары сигналов наблюдались для ароматических атомов Н и СН в 'Н и IJC спектрах. Сигналы Н-7 и Н-7' были идентифицированы на основе разностных экспериментов по ЯЭО и сравнением с литературными данными. Облучение двухпротонного мультнплета прн 4,74 м. д. (Н-7, Н-7') давало отклик па ароматические сигналы (6,58 н 6,62 м. д.). Константа спин-спинового взаимодействия сигнала аномерного метннового протона (4,59 м. д., J=7,5 Гц) характерна для /J-глюкознднон связи. Структура 39 была установлена на основе эгнх данных и результатов масс-спектроскопического анализа как (-)-снрпнгарезпнол-4-0-/£-П-глюкопнра1юзнд.

Наши результаты значительно расширяют существующую ппформацшо о химических компонентах Е. senticosus. Были также получены более детальные данные ЯМР (в частности, впервые получены спектры 13С ЯМР) ц МС для соединений 37-39 по сравнению с описанными ранее.

ВЫВОДЫ

1. На основе анализа 'Н ЯМР спектров более 150 природных, главным образом, морских стеринов изучено влияние положения двойных связей н дополнительных алкнльиых групп в тетрацпклпческом ядре н в боковой цепи на химический сдвиг метальных групп.

2. Изучены 'Н ЯМР и масс-спектры ряда полярных морских стероидов. Установлено влияние дополнительных полярных групп в ядре стероидов на особенности масс-спектромстрнчсскои фрагментации и химический сдвиг метальных групп.

3. Определен состав стернповых фракции полухордоно] о Pirosoiim giganleum, пресноводной губки Baicaluspongia bacilífera, голотурии Eiipentacta fraudatrix, состав фракции сульфатов и кенлозидов стеринов нз голотурии Eupentacta fraudatrix. Прн этом методами масс-сиектромегрии, ЯМР спектроскопии и ГЖХ-МС идентифицировано более 70 известных природных соединений. Найдены и структурно идентифицированы 13 новых свободных и конъюгнровапных стеринов, изучены особенности их 'Н ЯМР и масс-спектров.

4. С помощью метода 'Н ЯМР спектроскопии изучена реакция обратимого равновесия природных три- и пентасульфпдов нз дальневосточной аецнднн Polycitor sp. в присутствии молекулярной серы в различных условиях.

5. Установлены структуры новых природных терпенопдоп из горгонарни Paragorgia arborea и мягкого коралла Sarcophvton sp.

6. В результате химического изучения экстрактов корней элеутерококка впервые были из этого растения выделены этиловый эфир умбелнферона, дпгидродегндроднконнфернловый спирт, дегндродиконнфернловый спирт, р-D-глюкознд дегндроднконш1)ернлового спирта, мезо-секонзоларисирезпнол, (-)-снрингарезннол 4-О-уЗ-глюкопиранознд.

Основные материалы диссертации опубликованы в работ ах:

1. Стоппк В. А., Макарьева Т. Н., Дмнгрепок А. С. Новый днтерпеноид ксеннанового ряда из горгонарни Paragorgia arborea. II Химия природ, соедин. 1990. № 1. С. 125-126.

2. Makarieva Т. N., Bondarenko I. A., Dmitrenok A. S., Boguslavskiy V. М., Stonik V. A., Chernin V. I., Efremova S. М. Natural products from the lake Baical organisms. I. Baicalosterol, a novel steroid with unusual side chain, and other metabolites from the sponge Baicalospongia bacilifera. II J. Natur. Prod. 1991. V. 54. №4. P. 953-958.

3. Макарьева Т. H., Гребпев Б. Б., Дмитренок А. С., Стоппк В. А. Стернновый состав Pyrosoma giganlheum. //Химия природ, сосдни. 1992. № 5. С. 589-590.

4. Makarieva Т. N., Stonik V. A., Kapustina I. 1.. Boguslavskiy V. М., Dmitrenok A. S., Kalinin V. I., Cordeiro M. L., Djerassi C. Biosyntnetic studies of marine lipids. 42. Biosynthesis of steroid and triterpenoid metabolites in the sea cucumber Eupentacta fraudatrix. //Steroids. 1993. V. 58. P. 508-517.

5. Makarieva T. N., Stonik V. A., Dmitrenok A. S., Krasokhin V. В., Svctashev V. I., Vysotskii M. V. New polar steroids from the sponges Trachynopsis halichonrodes and Cymbaslela coralliophila. II Steroids. 1995. V. 60. P. 316-320.

6. Makarieva T. N., Stonik V. A., Dmitrenok A. S., Grebnev В. B, Isakov V. V., Rebacluik N. M. Varacin and three new marine antimicrobial polysulfides from the Far Eastern ascidian Polycilor sp. // J. Natur. Prod. 1995. V. 58. № 2. P. 254-258.

7. Makarieva T. N., Stonik V. A., D'yachuk O. G., Dmitrenok A. S. Annaslerol sulfate, a novel marine sulfated steroid, inhibitor of glucanase activity from the deep water sponge Poeclllaslra Uuninaris. //Tetrahedron Lett. 1995. V. 36. № 1. P. 129-132.

8. Makarieva T. N., Dmitrenok A. S., Stonik V. A., Patel A. V., Canfield L. M. Lignans from Eleulherococcus seiiticosus. II Pharm. Sci. 1997. № 3. p. 525-527.

Соискатель Дмитренок А.С.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ТИХООКЕАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

ДМИТРЕНСЖ АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

УДК 547.925

ПРИМЕНЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НЕКОТОРЫХ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ.

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных веществ

ДИССЕРТ. на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук Т. Н. Макарьева.

Научный консультант: член-корреспондент РАН, профессор В. А. Стоник.

Владивосток - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.

ооебееоовеоб9еоэебеве«оооеоо0ооеввооэоев<

2.

МЕТОДОВ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ И СТЕРЕОХИМИИ

I ^ В. овооаооеоовооооооооооаооооооаоаоовевооеввеоооаоооввавоевооеоовоооооооееовввооаоовввооооооооооеооовооввеооеооовов ^^

2.1 Спектроскопия ядерного магнитного резонанса......................................... 9

2.1.1 Применение одномерных и двумерных импульсных методов..................13

2.1.2 Применение методов ЯМР для конформационного анализа стероидов. 21

2.1.3 Ненасыщенные связи в стероидах..............................................................23

2.1.4 Химические сдвиги карбонильной группы..................................................24

2.1.5 Эффекты гликозилирования в стероидах.................................................25

2.1.6 Определение типа сочленения колец в стероидах....................................26

2.1.7 Строение боковых цепей стертое............................................................27

2.2 Газожидкостная хроматография стероидных соединений. .....................29

2.3 Масс-спектрометрия стероидных соединений. ..........................................36

2.4 Инфракрасная и ультрафиолетовая спектроскопия..................................42

Зо ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ, .......................................43

3.1 Методы исследования сложных смесей природных ФАВ,

использованные в работе.......................................................................................43

3.2 Исследование морских стеринов и родственных соединений с

применением спектральных и инструментальных методов...........................45

3.2.1 Исследование зависимости химических сдвигов протонов метальных групп в 'Н ЯМР спектрах стеринов от строения и стереохимических особенностей соединений.....................................................................................45

3.2.2 Применение масс-спектрометрии для идентификации стеринов и их производных и установления строения новых вариантов таких соединений. 72

3.2.3 Исследование стероидного состава полухордового Ругозота giganteum. 74

3.2.4 Изучение стеринового состава пресноводной губки Baicalospongia ЬасШ/ега.................................................................................................................76

3.2.5 Исследование стероидных метаболитов голотурии Eupentacta fraudatrix.................................................................................................................81

3.2.6 Применение спектральных методов при исследовании стероидного состава губок Trachyopsis halihondroides, Cymbastela coralliophila и Poecillastra laminaris.............................................................................................88

3.3 Установление структуры терпеноидов из морских беспозвоночных. .... 97

3.3.1 Установление структуры терпеноидов из мягкого коралла Sarcophyton sp.............................................................................................................................97

3.3.2 Установление структуры терпеноида из горгонарии Paragorgia arborea..................................................................................................................103

3.4 Изучение реакций обратимого равновесия природных пента- и трисульфидов из асцидии Polycitor sp в присутствии молекулярной серы. 105

3.5 Химическое изучение экстракта Eleutherococcus senticosus. ..............109

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ» 115

121

6. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...............................................122

1. ВВЕДЕНИЕ.

Одним из главных направлений химии природных соединений является установление строения и стереохимии исследуемых природных продуктов. Очевидно, что многие свойства сложных природных соединений существенным образом зависят от их пространственной структуры.

Интенсивное развитие в последнее десятилетие спектральных методов, и особенно методов спектроскопии ЯМР высокого разрешения, значительно расширило возможности структурных исследований, изучения стереохимии и конформационнош анализа природных соединений. Это позволило, кроме того, установить строение многих минорных вторичных метаболитов, исследовать взаимосвязь физиологической активности и структурных вариаций, предположить пути биосинтеза и функции этих соединений.

Среди многих природных соединений, изучаемых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН, важное место занимают соединения, выделяемые из морских беспозвоночных, таких как губки, асцидии, голотурии и др. Эти животные привлекают внимание наличием большого количества необычных вторичных метаболитов, особенно изопреноидов, обладающих уникальной структурой, высокой биологической активностью и ценными фармакологическими свойствами. В лаборатории химии морских природных соединений

ТИБОХ было выделено более двухсот новых морских природных метаболитов, для большинства из которых была установлена структура и стереохимия молекул. Спектральному изучению некоторых из этих соединений и посвящена данная работа.

Основной задачей настоящей работы являлось исследование строения и стереохимии ряда новых физиологически активных веществ (ФАВ), выделенных, главным образом, из морских беспозвоночных, методами масс-спектрометрии (MC), газожидкостной хроматографии -масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) и ЯМР спектроскопии высокого разрешения, изучение ЯМР и масс-спектров новых соединений, установления некоторых корреляций между параметрами ЯМР и масс-спектров и структурой исследуемых соединений, а также исследование с помощью ЯМР спектроскопии некоторых особенностей химических превращений этих соединений. Кроме того, в работе было проведено выделение и исследование строения и стереохимии некоторых лигнанов из эндемичного для Дальнего Востока лекарственного растения -элеутерококка (Eleutherococcus senticosus).

Диссертация состоит из шести глав. В литературном обзоре рассмотрено современное состояние физических методов, использовавшихся в данной работе при установлении структуры природных ФАВ. Они рассматриваются в приложении к соединениям стероидной природы, так как, с одной стороны, исследованию структуры таких соединений посвящена большая часть диссертации, а с другой стороны такое ограничение позволяет рассматривать обширный материал более конкретно. Следующая глава посвящена описанию и обсуждению результатов исследований. Она состоит из пяти разделов. В первом разделе рассматриваются вопросы установления строения стероидов в сложных стероидных фракциях, выделенных из морских беспозвоночных, а также особенности Щ ЯМР и масс-спектров этих соединений. В последующих разделах описано установление структуры некоторых терпеноидов из морских организмов, а также выделение и установление структуры лигнанов из эндемичного дальневосточного

лекарственного растения - элеутерококка. В экспериментальной части приведено описание методик экспериментов и некоторые характеристики полученных соединений. Завершают работу выводы и список цитированной литературы. Научная новизна работы состоит в следующем:

На основе анализа данных Ш ЯМР спектров более 150 природных стеринов установлены значения аддитивных сдвигов сигналов метальных групп стеринов в зависимости от положения двойных связей и дополнительных алкилильных групп в боковой цепи. Проанализировано также влияние дополнительных метальных групп в тетрациклическом ядре на химический сдвиг метальных групп в 18 и 19 положениях и в боковой цепи. Эти данные были использованы в процессе структурного анализа стероидных смесей и установления химической структуры и стереохимии выделенных индивидуальных соединений.

Изучены Ш ЯМР и масс-спектры природных сульфатированных стероидных триолов из губок Trachyopsis halihondroides и Cymbastela coralliophila, и первого природного 3/?-0-сульфатированного диола эргостанового ряда - 24-метилхолеста-5,24(28)-диен-ЗД7/?-диол-3/?-натрийсульфат-7/?-ацетата (аннастерин сульфата) из глубоководной губки Poecillastra laminaris. Установлены особенности этих спектров, включая влияние сульфатных групп.

Проанализированы с применением масс-спектрометрии, газожидкостной хроматографии и ЯМР спектроскопии стериновые фракции из полухордового Pyrosoma giganteum, голотурии Eupentacta fraudatrix и губки Baicalospongia bacilifera. В результате в этих фракциях найдено более 70 известных стеринов. Во фракциях сульфатированных стеринов и /7-ксилозидов из голотурии Eupentacta fraudatrix найдено и структурно идентифицировано более 60 соединений, из них 12 стериновых конъюгатов ранее известны не были. Изучены некоторые особенности масс-спектров электронного удара для Д9(п)- и д22,25(26). стеринов.

Установлены структуры новых природных терпеноидов из горгонарии Paragorgia arbórea и мягкого коралла Sarcophyton sp.

С помощью метода Ш ЯМР спектроскопии изучена реакция обратимого равновесия природных три- и пентасульфидов в присутствии молекулярной серы в различных условиях.

В результате химического изучения экстракта корней элеутерококка, впервые были выделены из этого лекарственного растения и из растений семейства Аралиевых следующие соединения: этиловый эфир умбелиферона, дигидродегидродиконифериловый спирт, дегидродиконифериловый спирт, /f-D-глюкозид

дегидродикониферилового спирта, мезо-секоизоларисирезинол, (-)-сирингарезинол 4-0-/?-глюкопиранозид, установлена их структура и особенности стереохимии.

В работе использованы следующие сокращения: ФАВ физиологически активные вещества:, МС - масс-спектрометрия; ГЖХ-МС - газожидкостная хроматография - масс-спектрометрия; ЯМР -ядерный магнитный резонанс; ХС - химический сдвиг, КССВ -константа спин-спинового взаимодействия, ББА - масс-спектрометрия с ионизацией быстрыми атомами; EIMS, - масс-спектрометрия с ионизацией электронным ударом; ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера; ЖХНД - жидкостная хроматография низкого давления, ВЭЖХВД -высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления.

2. Литературный обзор: Использование фмзютеекмх методов дом

установления структуры и стереохимии стероидов«,

Стероиды имеют важное биологическое значение, они являются структурными компонентами клеточных биомембран, влияющими на микровязкость и, следовательно, на процессы транспорта различных веществ через мембраны. Некоторые стероиды проявляют высокую физиологическую активность и, по-видимому, участвуют во взаимодействиях между различными видами. Морские организмы, особенно беспозвоночные, содержат сложные по составу стероидные и терпеноидные фракции. Нередко в этих фракциях идентифицируют по несколько десятков близких по свойствам компонентов с необычным химическим строением. Поэтому без применения самых современных методов разделения и структурного анализа невозможно установление химического строения этих веществ. Появление в лабораторной практике новых хроматографических или спектральных методов немедленно приводит к использованию этих методов в области химии морских изопреноидов. Особенно важно это для установления строения минорных компонентов, которые присутствуют в очень небольших количествах и часто весьма лабильны. Являясь активными метаболитами, они служат промежуточными звеньями в цепи биосинтетических превращений. Знание структуры таких соединений позволяет понять пути биосинтеза и метаболизма веществ в организме.

2.1 Спектроскопия ядерного магнитного резонанса.

В настоящее время спектроскопия ядерного магнитного резонанса стала одним из главных методов установления структуры новых соединений стероидной природы.

Простота углеродного спектра ЯМР с развязкой от протонов, в котором каждому атому соответствует одна линия, и наличие различных импульсных методов для разделения атомов с различным количеством присоединенных протонов значительно облегчают интерпретацию спектров. Более того, структурные эффекты и эффекты замещения для стероидов хорошо изучены [1, 2, 3], что позволяет предположить величины химических сдвигов отдельных атомов.

Спектры протонного магнитного резонанса, напротив, усложнены интенсивными межъядерными взаимодействиями, в результате чего лишь некоторые сигналы легко различаются, такие как сигналы ангулярных метальных групп (СНз-18, СНз-19), и дублеты вторичных метальных групп (СНз-21, СНз-27). Большинство сигналов метановых и метиленовых протонов проявляются как серия перекрывающихся мультиплетов в так называемом "метиленовом конверте". По этой причине большинство ранних публикаций [4] содержали, в основном, химические сдвиги протонов метальных групп и сигналов, проявляющихся в слабом (8>3 м. д.) поле, таких, как сигналы олефиновых протонов и групп СН-О, СН2-О. Эти данные, тем не менее, предоставляют важную информацию, часто позволяют предположить класс стероидов, строение боковой цепи. Так, химические сдвиги сигналов ангулярных метальных групп характерны для различных типов ненасыщенности в ядре [5, 6, 7]. В некоторых случаях оказывается возможным установить стереохимические особенности соединений. В работах [7, 8] устанавливали конфигурацию при С-24 путем сравнения величин химических сдвигов метальных групп СНз-21, СНз-26, СНз-27.

Кроме того, сигналы метальных групп могут давать информацию о строении и содержании стериновых компонентов в смесях. Более подробно вопрос об использовании ХС метальных протонов в структурной идентификации стероидных соединений будет рассмотрен во второй главе настоящей работы.

Полное отнесение сигналов в протонном спектре для стероидов с низкой степенью функционализации затруднено, так как обычно более 20 протонов имеют химический сдвиг в области 1-2 м. д. Разработка ЯМР спектрометров с высокой рабочей частотой и успехи в развитии методов двумерной спектроскопии позволяют решать эту задачу. Первые такие работы были выполнены в начале 80-х годов. В работе Холла и Сандерса [9] сообщалось о полном отнесении протонных сигналов для 1-дегидротестостерона. Для стероидов с меньшей степенью функционализации полное отнесение удалось выполнить гораздо позже. Так, полное отнесение сигналов для ацетата хологенина (3/?-ацетокси-25(/?)-5ог-спиростан- 12-ол) было сделано только в 1990 году [10] на спектрометре с рабочей частотой 500 МГц, а для диосгенина в 1993 году [11]. Полное отнесение сигналов в протонном спектре холестерина (1) и дигитонина сделано в 1996 году в работе Мухра [12].

В то время, как некоторые сигналы, например, СН-О-групп или атомов углерода могут быть идентифицированы и отнесены на основе характерных химических сдвигов, для расширенной интерпретации результатов ЯМР экспериментов необходимо полное отнесение всех сигналов. Такая информация в большинстве случаев не

может быть получена при помощи только одномерных спектров и 13С, а извлекается из двумерных экспериментов, которые упрощают анализ спектров распределением информации во второе частотное измерение, либо выявляют взаимодействия между ядрами. С другой стороны, при исследовании структуры стероидов часто встречается и3) другая ситуация. Химики имеют небольшое количество нового стероида, для которого необходимо получить определенную специфическую структурную информацию, но нет необходимости проводить полное отнесение сигналов в протонном спектре. Для решения структурных задач было разработано большое число различных двумерных ЯМР экспериментов, большинство из которых основано на наблюдении явления переноса когерентности от одного ядра к другому. В литературе, посвященной этому вопросу, рассматривается как возможность получения химической информации с помощью импульсных методов ЯМР [13, 14], так и теоретические основы и квантово-механическая теория, лежащая в основе современных методов двумерного ядерного магнитного резонанса [15, 16]. Хотя механизмы воздействия импульсных последовательностей на спиновую систему могут быть весьма сложны, интерпретация двумерных ЯМР спектров, как правило, сравнительно проста. Некоторые наиболее часто применяемые для установления структуры стероидов методы двумерного ЯМР приведены в таблице 1 [17].

Таблица 1. Методы двумерного ЯМР, наиболее часто применяемые при установлении структуры стероидных соединений.

ЯМР эксперимент Применение

1 2

APT (Attached Proton Test, тест на число присоединенных протонов) DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer, усиление переносом поляризации без искажений) INEPT(Insensitive Nuclei Enhancement by Polarization Transfer, усиление нечувствительных ядер переносом поляризации) Определение типов замещения атомов углерода Редактирование спектров ,3С Редактирование спектров 13С

Таблица 1. Продолжение.

1 2 I

Щ^н COSY (Correlation Spectroscopy) a) нормальная б) с задержкой b)DQF-COSY (Double-Quantum Filtered, с двух квантовой фильтрацией) r)E.COSY (exclusive) fl)GEM-COSY (geminal) e)TQF-COSY (Triple-Quantum Filtered) Корреляция гомоядерных сдвигов 1 Выявление прямых констант Определение малых констант Определение констант Точное измерение констант Идентификация гемин