Развитие методологии использования субкритической воды для получения физиологически активных субстанций на основе растительных метаболитов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Па права.

»орисенко Николай Иванович

РАЗВИТИЕ МЕТОДОЛОГИИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СУККРИТИЧЕСКОН ВОДЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУБСТАНЦИЙ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

02.00.04 - физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

5 2014

005549638

Ростон-на-Дону — 2014

005549638

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физическом н органическом химии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» (г. 1'остов-па-Доиу).

Научный консультант: Официальные оппоненты:

Мннкнн Владимир Исаакович, академик РАН

Салахутдннов Нариман Фаридовнч, доктор химических наук, профессор, зав. отделом медицинской химии, Новосибирский институт органической химии СО РАН, (г. Новосибирск)

К'алабнн Геннадии Александрович, доктор химических наук, профессор, профессор кафедры системной экологии, Российским университет дружбы пародов (г. Москва)

Коган Виктор Александрович, доктор химических наук, профессор, зап. кафедрой физической химии Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону)

Ведущая организация:

Московский государственный М.В. Ломоносова, г. Москва

университет

Защита диссертации состоится 19 нюня 20Ы сода « 14.00 часов па заседании диссертационного совета Д 212.208.14 при Южном федеральном университете по адресу: 344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/2,111111 физическом п органической химии ЮФУ, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научном библиотеке Южного федерального университета по адресу: 344000, г. Росгов-па-Допу, ул. Зорге 21 Ж.

Ваш отзыв и двух экземплярах, скрепленным гербовой печатью, мроспм направить по адресу: 344090, г. Ростов-па-Дону, пр. Стачки, 194/2, НИИ физической и органическом химии ЮФУ, ученому секретарю диссертационного совета (e-mail: asmork2@ipoc.rsn.rn).

Автореферат разослан мая 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

А.С. Морковник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие методологии использования экологически безопасных методов экстракции н химической модификации растительных метаболитов для получения физиологически активных субстанций из источников растительного происхождения является одним из приоритетных и бурно развивающихся направлений современной медицинской химии. Замена дорогостоящих и токсичных органических растворителей па экологически чистые суперкритические флюиды и субкритические жидкости, такие как С02 или вода, представляется одним из наиболее перспективных подходов к решению таких задач и соответствует основным принципам «Зеленой химии». В последнее десятилетие для экстракции и химической модификации физиологически активных соединений активно используется субкритическая вода (вода в жидком состоянии под давлением при температурах от 100°С до 374°С). Для России, с ее богатейшими растительными ресурсами, применение экологически чистой, доступной и недорогой субкритической воды в технологических процессах взамен дорогостоящих и, зачастую, токсичных органических растворителей, открывает широчайшие перспективы применения в промышленности. Поэтому, исследования, направленные на разработку экологически чистых методов экстракции и химической модификации физиологически активных соединений в среде субкрнтической воды, актуальны и имеют огромный практический и инновационный потенциал.

Цели работы: Развитие и изучение методов экстракции и химической модификации в среде субкрнтической воды растительных метаболитов, имеющих фармацевтический и коммерческий потенциал, установление состава и свойств полученных продуктов с использованием масс-спектрометрин с ионизацией электрораспылснпем и других современных физико-химических методов (спектроскопии ЯМР, ПК и т.д.).

Задачи исследовании:

1) Разработка и изучение экологически чистых методов (без использования органических растворителей) экстракции и химической модификации в среде субкрнтической воды растительных метаболитов, имеющих фармацевтический и коммерческий потенциал.

2) Разработка методов определения состава и свойств растительных экстрактов с использованием комплекса физико-химических методов.

3) Теоретическое моделирование строения и устойчивости супрамолекулярпых комплексов тритерпсиовых растительных метаболитов и модельных фпрмаконов при помощи методов квантовой химии.

4) Разработка методов использования масс-спсктромстрпи с ионизацией электрораспылснпем для изучения строения и свойств супрамолекулярпых комплексов па базе модельных фармаконов.

Научная новизна.

Впервые среда субкрнтической воды систематически использована для экстракции и химической модификации ряда полнфенольных, алкалоидных и трнтерпеиовых растительных метаболитов:

а) впервые разработаны методики для извлечения ряда тритерпсиовых сапонинов растительного происхождения: глпцпрризиновой кислоты из корня солодки; аралозндоп из аралии маньчжурской и сапонинов плюща - физиологически активных растительных метаболитов, имеющих значительным фармацевтический потенциал;

б) впервые среда субкрнтической воды использована для синтеза глицпрретиновой кислоты - физиологически активного соединения, которое широко используется в медицинском практике;

в) впервые среда субкрнтической воды использована для получения из шелухи лука «спроектированных» смесей биофлавоноидов, имеющих значительный фармацевтический потенциал.

Впервые в среде субкритической воды осуществлена реакция изомеризации природного алкалоида апорфннового ряда глауцпна в феиантреповый алкалоид дес-глауцип, имеющий значительный потенциал для создания противокашлевых субстанций, не вызывающих наркотического эффекта.

Впервые в среде субкритической воды реализована реакция синтеза макроцнклических соединений ннклотрнвератрилена и циклотетравератрилена - потенциальных «курьеров» при получении фармацевтически приемлемых ннзкодозных субстанций.

Впервые с использованием масс-спектрометрни с ионизацией электрораспылением зарегистрировано образование самоассоциатов глицирризиновой кислоты, строение которых предсказано при помощи методов квантовой химии. Предложенные методики масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением использованы для изучения строения супрамолекулярных комплексов тритерпеновых сапонинов (глицирризиновой кислоты солодки и хедерагенинов плюща) с модельными фармакопамн.

Практическая ценность работы. Реализованы принципиальные преимущества использования среды субкритической воды для извлечения физиологически активных растительных.метаболитов из группы биофлавоноидов и тритерпеновых сапонинов.

Разработаны методы изучения строения продуктов н анализа состава смесей, полученных как в результате экстракции из природных объектов, так и в ходе химических реакций в среде субкритической воды, с использованием жидкостной хроматомасс-спектрометрин с ионизацией электроспреем.

Предложены экологически безопасные методы получения физиологически активных биофлавоноидов в среде субкритической воды, обладающих широким спектром терапевтического действия (антпоксидантное, капилляроукрепляющее действие и Др.), присущего как индивидуальным веществам из группы флавоноидов, так и их смесям, что позволяет создавать на их основе большое число лекарственных форм. Предлагаемые методы экстракции и синтеза в среде субкритической воды, как правило, более эффективны и экологически безопасны по сравнению с традиционными подходами, основанными на использовании дорогостоящих и, зачастую, токсичных органических растворителей. Предлагаемые подходы открывают возможности получения перспективных с фармакологической точки зрения соединений в экологически чистых реакционных средах.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на III Международной научно-практической конференции "Сверхкритическне флюидные технологии: инновационный потенциал России", (Ростов-на-Дону; 11-12 октября 2006); IX Международном Семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография, экология) 15-20 сентября 2008 год; V Международной научно-технической конференции "Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии. БФФХ-2009", (Севастополь, 21-25 апреля 2009); IV, V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов (Ростов-на-Дону, 18-22 сентября 2007, 1 - 5 июня 2009), V Международной научно-практической конференции «Сверхкритическне флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации» (Суздаль, 15-18 сентября 2009); III Всероссийской конференции «Аналитика России» (г. Краснодар, 27 сентября - 2 октября 2009 г.), X Международном Семинаре по Магнитному Резонансу г. Ростов-на-Дону, 2 - 7 марта 2010, VI Международной научно-техническая конференция "Актуальные вопросы теоретической н прикладной биофизики, физики и химии", Украина, г. Севастополь, 26 - 30 апреля 2010, I международной конференции серии ChemWasteChem: "Химия и полная переработка биомассы леса", Санкт-Петербург (Репино), 14-18 июня 2010 г, IV Всеросс. конференции-школы: "Фундамент, вопросы масс-спектрометрии и её аналитические применения" Звенигород, 10-14 октября 2010, 12th International Symposium MATERIALS, METHODS & TECHNOLOGIES (MMT), Sunny Beach, Bulgaria June 11-15, 2010, VII Международной научно-технической конференции "Актуальные вопросы биологической физики и химии". Севастополь. Украина. 26 - 30 апреля 2011, Всероссийской научной конференции (с международным участием) "Успехи синтеза и Комплексообразовапия", г. Москва, 18 по 22 апреля 2011, International Conference "Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine". Санкт-Петербург, 21-24 нюня 2011, VI Научно-практической конференции «Сверхкритическне флюиды (СКФ): фундаментальные основы, технологии, инновации». Иркутск, 4-7 июля 201 Ir, VI Международная конференции но новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов, Ростов-на-Дону, 31 августа - 4 сентября 2011, VIII Международная конференция "Спектроскопия координационных соединений" г.

Туапсе, Краснодарский край, Россия 19-23 сентября 2011, VIII Международной научно-техническом конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ -2012», 23 - 27 апреля 2012, IX Всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия координационных соединений», 13 - 19 сентября 2012.

Работа выполнена при поддержке грантов президента РФ ведущих научных школ (IILU-363.2008.3, ЫШ-3233.2010.3, ПШ-927.2012.3), фантов Министерства образования и науки РФ (РНП 2.2.2.23915 и 2.1.1.4939), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF США) по Российско-американской программе "Фундаментальные исследования и высшее образование" (гранты CRDF ВРЗС04, ВР4М04) и грантов РФФИ (11-03-12141-офи-м-2011).

Полученные в работе результаты частично использовались при реализации ряда проектов по программе Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере СТАРТ-06 (г/к 4366р/6813).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 работ, включая 27 статей в рецензируемых российских (список ВАК) и зарубежных журналах, 22 работы опубликованы в материалах и тезисах докладов международных и всероссийских конференций. Получено 6 патентов РФ.

Личное участие аптора. Автору принадлежат замысел, формулировка задач исследования, обоснование выбора объектов, необходимых для решения поставленной задачи. Автор разрабатывал направление научного поиска, руководил постановкой экспериментов, принимал личное участие в работе по экстракции и модификации растительных метаболитов в среде субкритнчсскои воды и проведению масс-спектрометрического эксперимента.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из Введения, 4 глав, выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы (301 наименование).

Работа изложена на 284 страницах, содержит 114 рисунков и 32 таблицы.

Во введении обосновывается актуальность диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследования.

Глава 1 диссертации содержит обзор литературы, где рассмотрены исторические аспекты развития теоретических представлений и экспериментальные данные о суб- и супсркритнческих флюидных средах и их приложению к экстракции п модификации различных классов соединении. Показано, что вода, находящаяся в жидком субкритнческом состоянии (при температурах выше 100 С и ниже 374 С и давлении, обеспечивающем нахождение в жидкой фазе), может являться эффективной и экологически чистой средой для экстракции и химической модификации биологически активных соединений, за счет изменения ее важнейших физико-химических свойств (диэлектрической проницаемости, ионного произведения, диффузионных свойств и плотности) при увеличении давления и температуры.

Основное содержание работы.

Основное содержание работы отражено в главах диссертации 2-4. Реализованный в диссертационной работе подход (Рис.1) базируется на использовании среды субкритической воды при экстракции и химической модификации растительных метаболитов для получения физиологически активных субстанций без использования дорогостоящих и, зачастую, токсичных растворителей.

Исследование полученных веществ методами ВЭЖХ/МС, И К. ЯМР- спектроскопии

Разработка методов

экстракции и получение "спроектированных" смесей биологически активных

соединении

Разработка методов

гидролитической модификации растительных метаболитов

Квантовохимическое

моделирование структуры супрамолекулярных комплексов

Рисунок 1.

Глава 2. Субкритичсская вода как среда дли экстракции биологически активных растительных метаболитов и получении их «спроектированных» смесей.

2.1. Разработка экологически чистых методов (без использования органических растворителей) экстракции и химической модификации в среде субкритической воды растительных метаболитов, имеющих фармацевтический и коммерческий потенциал.

В качестве целевых объектов экстракции выбраны:

1) кверцетин и дигидрокверцетин - классические представители биофлавоноидов, наиболее часто используемые в нутрицевтике, естественные антиоксиданты;

2) фенилкарбоновые кислоты, широко используемые в фармацевтических субстанциях в качестве иммункомодуляторов;

3) тритерпеновые растительные метаболиты - сапонины корня солодки (глицнрризиновая кислота и ее агликон - глицнрретиновая кислоты), аралознды корня аралии и хедерагепины плюща.

2.1.1 Экстракция биофлавоноидов из растительного сырья.

Экстракцию в среде субкритической воды в проточном режиме проводили с помощью специально разработанной и изготовленной оригинальной установки. Изучена возможность экологически чистого способа выделения флавоноидов из растительного сырья на примере естественных антиоксидантов - кверцетина и дигидрокверцетина.

Кверцетин I

Дигндроквсрцетин II

В качестве сырья пспользовали горец перечный (Polygonum hydropiper L.). Экстракцию проводили субкритической водой при температуре от 100 С до 250 С и давлении до 120 атм в течение 30 минут. Хроматограмма смеси представлена на рисунке 2.

300 250 200 150

100 so

Рисунок 2. Хроматограмма экстракта, полученного в среде субкритической воды из травы горца перечного (Polygonum hydropiper L.)

Для оценки эффективности экстракции кверцетина (KB) в среде субкритической воды (СБВ) проведено сравнение с результатами извлечения флавоноидов с использованием метанола. Установлено, что экстракция субкритической водой позволяет извлечь кверцетина в 7.6 раз больше по сравнению с традиционным способом. При этом сумма флавоноидов, регистрируемая в экстракте, полученном в субкритической воде, оказывается меньше, чем при традиционной метанольной экстракции. Для изучения причин такого поведения экстракция в среде субкритической воды осуществлена в нескольких температурных интервалах. Результаты исследований показали, что при температурах ниже 100 С кверцетина извлекается столько же, сколько извлекается традиционной метанольной экстракцией (44.0 мкг/г). При увеличении температуры воды от 100 °С до 150 "С извлекается 61,3 мкг/г, а в интервале от 150 С до 250 С извлекается дополнительно 222.7 мкг/г. Таким образом, повышение температуры воды способствует высвобождению кверцетина из растительной матрицы в результате реакции гидролиза присутствующих в растительной матрице гликозидов биофлавапондов, таких, как рутин и других гликозидов кверцетина. Этот вопрос более подробно рассмотрен при обсуждении гидролитических процессов деструкции растительных метаболитов в среде субкритической воды.

Дальнейшее развитие предложенная экспериментальная процедура получила при извлечении дигидрокверцетнпа из отходов древесины лиственнцы. Днгидрокверцетнн (ДКВ) 3,3',4',5,7 -пентагидроксифлаваноп (И) обладает широким спектром биологической активности: антиоксидантными, капилляропротскторпыми свойствами в сочетании с противовоспалительным, гастро- и гепатопротекторным, гиполипидемичеекпм и диуретическим действием и входит в ГР РФ. ДКВ является действующим веществом успешно продаваемого в РФ препарата «Капилар».

В настоящее время известно множество способов извлечения дигидрокверцетнпа из растительного сырья, основанных на использовании полярных органических растворителей (водно-ацетоновый раствор, мстилтретбутиловый эфир, водно-спиртовый раствор, этилацетат) с

последующей очисткой на сорбентах и перекристаллизацией. Предложена и изучена методика экстракции дигидрокверцетина субкритической водой в проточном режиме. По окончании процесса полученный водный экстракт подвергали анализу на содержание ДКВ. Типичная хроматограмма экстракта, полученного из древесины лиственницы субкритической водой,

10.79 мин.)

Определены оптимальные условия экстракции ДКВ субкритической водой в проточном режиме: температура 160-180°С и давление 80.5-87.5 атм (выделение 2.73 г ДКВ из 1 кг опилок). Установлено, что экстракция субкритической водой в проточном режиме позволяет извлечь в 1.4 раза больше дигидрокверцетина, чем традиционным методом, тогда как экстракция сверхкритическим СОт оказалась малоэффективна.

2.1.2.Экстракция фенилкарбоновых кислот в среде субкритической коды. Методика и экспериментальная установка, разработанные для экстракции биофлавоноидов, адаптированы для выделения других растительных метаболитов. В частности, изучены возможности экстракции в среде субкритической воды растительных метаболитов фенилкарбоновых кислот из эхинацеи пурпурной и сабельника болотного.

Эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea L.) и препараты на ее основе (настои, настойки и капсулы) используются, как правило, для повышения иммунитета. Их иммунно-стимулиругащие свойства связаны с такими биологически активными компонентами как производные кофеиновой кислоты, алкамидами, полисахаридами и гликопротеидами. Производные кофеиновой кислоты, входящие в состав экстрактов эхинацеи, такие как цикориевая Ш и кафтаровая кислота IV, проявляют широкий спектр физиологической активности. Они обеспечивают защиту коллагена от действия свободных радикалов, противовирусную активность, а также угнетение вируса иммунодефицита человека 1 типа, способствуя фагоцитарной активности.

°НО О .......он но Т

о

Цикориевая кислота 111 Кафтаровая кислота IV

В качестве элюента для экстракции целевых соединений из эхинацеи в субкритических условиях использованы: дистиллированная вода и водные растворы этилового спирта (в качестве

сорастворителя) различной концентрации (5, 10 и 40% об.). Результаты количественного анализа экстрактов эхинацеи в среде субкритической воды в статическом варианте представлены на рисунках 4 и 5.

■0 б ШЦ20 »5% Eton "lOV.F.tOH «МОУ.ЕЮИ

« я

Ii4

>52 ~ у

" a.

S о

80 120 140 160 180 200

t,°C

Рисунок 4. Количество экстрагируемой кафтаровой кислоты IV в зависимости от вида элгоснта и температуры экстракции в СБВ (статический вариант).

SO 120 140 160 180 200 _______________________________t,°C

Рисунок 5. Количество экстрагируемой цикориевой кислоты III в зависимости от вида элшента и температуры экстракции в СБВ (статический вариант).

Количество извлеченных целевых продуктов зависит от температуры (рис. 4, 5). Максимальные значения концентрации целевых соединений III и IV соответствуют области температур 140 "С, а наилучшей средой для экстракции является водный раствор этилового спирта с концентрацией 5% об.. Для определения оптимального времени экстракции выполнены эксперименты во временном диапазоне 30-90 минут. На основе полученных данных установлены оптимальные условия экстракции в субкритической воде в статическом варианте: температура 140°С: время экстракции 60 минут.

Следующим шагом стало получение экстракта целевых соединений III и IV из эхинацеи в субкритических условиях в проточном режиме. Изучено влияние состава экстрагента, температуры и длительности экстракции в проточных системах на выход целевых продуктов. Содержание IV и III в экстрактах, полученных в среде субкритической воды при различных температурах, представлено на рис.6 и 7._

■ШО "•-"-ПОИ »Jff&fctOlt

(21 Ш! ШО 200

Рисунок 6 Количество экстрагируемой кафтаровой кислоты IV в зависимости от состава элюента и температуры процесса экстракции в СБВ (проточный вариант).

Рисунок 7. Количество экстрагируемой цикориевой кислоты III в зависимости от состава элюеита и температуры процесса экстракции в СЕВ (проточный вариант).

Полученные результаты определяют оптимальные условия экстракции травы эхинацеи в проточном варианте водой в субкритических условиях: температура 180 "С, растворитель: 10% водный раствор этанола, время экстракции: 30 минут, скорость потока: 0.5 мл/мин, давление: 80-1Ü0 атм. Значения концентраций целевых кислот Ш и IV, извлекаемых из эхинацеи пурпурной различными методами, представлены на рисунке 8.

_ЕлшЬхшншш___Х'цмковиеми

•tmm кисши.

10,00

2 8,00 М

С 6,00 i

■

£-ÜJ0 ■

= е V;

я 2,00 HS

3 •

Рисунок 8. Количество целевых кислот извлекаемых из эхинацеи пурпурной различными методами экстракции: 1) Традиционный метод (70% ЕЮН, 60°С); 2) СЕВ, статика (Н20, 140°С); 3) СЕВ, статика (5% ЕЮН, 140°С ); 4) СЕВ, динамика (10% ЕЮН, 180°С); 5) СЕВ, динамика (НЮ, 180°С). Все результат

приведены к 1г сухого сырья.

Из рисунка 8 следует, что эффективность экстракции фенилпропаноидов из эхинацеи пурпурной в статическом и динамическом режимах субкритической водой без сорастворителя сопоставима с традиционным методом. При этом экстракты, извлекаемые из эхинацеи пурпурной субкритической водой с 10% добавкой этанола, содержат иа 20% больше кафтаровой и цикориевой кислот, чем традиционные экстракты, полученные с использованием органических растворителей.

Другим растительным метаболитом, обладающим широким спектром биологической активности, для экстракции которого использована среда субкритической воды, является хлорогеиовая кислота (V). Хлорогеновые кислоты (ХК) представляют собой сложные эфиры кофейной (3,4-диоксикорнчной) кислоты с одним из стереоизомеров хинной кислоты.

он н

Хлорогеиовая кислота V

В этой части разработан н изучен метод извлечения ХК из сабельника болотного в среде субкритической воды для получения гепатопротекторных и иммуномодулирующих препаратов экологически чистым методом. Получена зависимость выхода целевых продуктов в экстракте из корневищ сабельника болотного в диапазоне температур от 120 до 150 °С. В качестве экстрагентов изучены вода и этиловый спирт с различными соотношениями разбавления (5, 10 и 30%). Результаты представлены на рисунке 9.

Кол-во ХК. farfr сырья

1 -f 0,8 -j 0,6 j 0,4 {

0.2 -j

(J -!

i H20

□ 5% EtOH

010% EtOH

□ 30% EtOH

120

1.30

140 .150

Температура, "С

Рисунок 9. Количество хлорогеновых кислот, извлекаемых из сабельника болотног о в зависимости

от температуры и сорастворителя.

Из рисунка 9 следует, что наилучшим экстрагептом для извлечения хлорогеновых кпелог является субкритичсская вода без добавок спирта, а значение оптимальной температуры - 140 °С. Применение 5% этанола при 130 °С приводит к выходу хлорогеновой кислоты, соизмеримому с выходом ХК в условиях чистой воды при 140 °С . На рисунке 10 приведена типичная хроматограмма экстракта из корневищ сабельника болотного, полученного в условиях субкритической воды в статическом варианте. Масс-спектр этой пробы представлен на рисунке 11.

Рисунок 10. Хроматограмма экстракта корневшц сабельника болотного, полученного в субкритческой воде в статическом режиме (11Тхк=4.93 мин.).

-сС -М5 2 »¡ГУЛ »174 ю | ■ ,070 503 <523 -11 .. А.,1 . 1 ......1 .

18. 23-» М5 3 Шг»#225 шлт

1 И... 55». гзез МЗ 6 »гйп »403 «14

Рисунок 11. Масс-спектр отрицательных ионов экстракта корневищ сабельника, полученного в субкритической воде в статическом режиме

Масс-спектр экстракта корневищ сабельника, полученного в субкритической воде в статическом режиме (рис. 12 ), демонстрирует наличие хлорогеиовой кислоты в форме пика депротонированного иона с т/г 353.14 (пик со временем выхода 4.93 минуты па хроматограмме рис.10). Масс-спектр демонстрирует наличие в экстракте кофейной кислоты т/х 179.06 (пик со временем выхода 3.12 минуты) и хинной кислоты т/г 191.03 (пик со временем выхода 3.82 минуты). Зависимость количества извлекаемой ХК от состава экстрагента и температур экстракции субкритической водой в проточном варанте представлена на рисунке 12.

Содержание ХК._ЙЩО___ШОК ИОН »40ХЕШН

ЛЁН®"'

150 170

I ^мпературэ.'С

Рисунок 12. Количество извлекаемой ХК в зависимости от состава экстрагента и температуры экстракции субкритической водой в проточном варианте.

11а следующем этапе выполнена экстракция корневищ сабельника болотного субкритической водой в проточном режиме (при прохождении через образец воды при повышенной температуре и давлении). Для определения оптимальных условий экстракции субкритической водой в проточном режиме изучена зависимость выхода ХК от температуры воды и добавки сорастворителя (спирта). Также изучен выход ХК в зависимости от скорости потока элюента. Результаты представлены на рисунке 13.

Содержание ХК. мг/г сырьз 0,8 1 '

0,4 Т

0,2 -('

О >:'

Скорость потока, мл/мин

Рисунок 13. Количество извлекаемой ХК в зависимости от скорости потока элюента при проточной схеме экстракции.

Полученные данные определяют оптимальные условия экстракции ХК субкритпческой водой в проточном варианте (без добавки этилового спирта): температура: 170 °С; время экстракции: 30 минут; скорость потока ПФ: 0.6 мл/мин; давление: 80 атм. Состав экстрактов изучен методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии. На рисунке 14 приведена типичная хроматограмма экстракта из сабельника, полученная в условиях субкритпческой воды в проточном варианте. Соответствующий масс-спектр представлен на рисунке 15.

XnoporenoR.ifl ккслога

k-j.

Рисунок 14. Хроматограмма экстракта корневищ сабельника болотного, полученного в субкритпческой воде в проточном режиме (К.Тхк=4.73 мин.)

Рисунок 15. Масс-спектр отрицательных ионов экстракта корневищ сабельника болотного, полученного в субкритпческой воде в проточном режиме (ХК соответствует пик с m/z 353.15)

Для сравнения эффективности разрабатываемых методов проведена экстракция корневищ сабельника болотного традиционным методом: в среде 30% этанола экстрагировали на магнитной мешалке с подогревом при 60±5ПС в течение 1.5 часа. После охлаждения экстракт фильтровали. Стадию экстракции 30% спиртом повторяли еще два раза. Этанольные вытяжки объединяли и упаривали. Количество хлорогеновой кислоты, экстрагируемое из сабельника болотного различными методами, представлено на рисунке 16.

Субкр. динам. 1120, 170*С

Субкр. динам 10% ЕЮН, 150'С

Рисунок 16. Количество хлорогеновой кислоты, экстрагируемое из сабельника болотного

различными методами

Как следует из данных, приведенных на рисунке 16, разработанный метод экстракции хлорогеновой кислоты из сабельника болотного в среде субкрнтической воды (без добавок этанола) в статическом и проточном варианте демонстрирует в 1.4 и 1.1 раза, соответственно, более высокое значение выхода по хлорогеновой кислоте, чем количество хлорогеновой кислоты, извлекаемое традиционным методом. Относительно невысокие значения температуры и давления, используемые в эксперименте, позволяют, в перспективе, применить предлагаемый подход для создания экологически чистых и недорогих промышленных технологий производства фармсубстанций и пищевых добавок, обогащенных фенилпропаноидами.

2.1.3.Экстракция тритерпеновых растительных метаболитов.

Пентациклические тритерпеновые сапонины обладают значительным фармацевтическим потенциалом и используются для дизайна низкодозных супрамолекулярных субстанций фармацевтических препаратов, обеспечивающих уменьшение эффективных доз лекарственных препаратов в 100 - 200 раз *.

Общая схема исследования процессов экстракции растительных метаболитов и модификации сапонинов в среде субкрнтической воды приведена на рисунке 17.

Рисунок 17. Общая схема исследования процессов экстракции и модификации сапонинов в среде субкритической воды.

Толстиков Г.А. и др. "На пути к низкодозным лекарствам" //Вестник Российской академии наук. - 2007. - Т. 77. - № 10. С. 867 - 874]

Для развития методов экстракции тритерпеновых растительных метаболитов решались следующие задачи:

1) Апробирование традиционных способов получения экстрактов из растительной матрицы (корень солодки, корень аралии и листья плюща);

2) Разработка методик количественного определения суммы сапонинов в растительных экстрактах методами ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-УФ-МС: подбор оптимальных условий хроматографического разделения (выбор колонки, температура колонки, скорость элюента, состав подвижной фазы, длина волны на УФ-детекторе, время хроматографирования);

3) Разработка метода экстракции сапонинов в среде субкритической воды в статических условиях: выбор оптимального соотношения сырье/экстрагент, подбор оптимальной температуры, подбор оптимального времени экстрагирования, выбор сорастворителей;

4) Сравнение традиционного метода экстракции сапонинов и экстракции субкритической водой в статических условиях и оценка эффективности методов экстракции по времени экстрагирования, температуре процесса экстракции, процента извлечения сапонинов и экологичности процесса.

В соответствии со схемой исследований (рисунок 17) на первом этапе получали традиционный экстракт сапонинов и агликонов. Полученные в среде субкритической воды экстракты сравнивались с экстрактами, полученными традиционными способами. Оценивали общий выход экстракта (в пересчете на сухой вес), выход целевых сапонинов, агликонов и балластных веществ. Примененная схема позволила оценить возможности дегликозилирования сапонинов и полного их гидролиза до агликонов в среде субкритической воды, а также оптимизировать методики экстракции в условиях субкритической воды по показателям «сырье/реагент», «температура экстракции», «время экстракции».

В качестве основного метода анализа состава и свойств экстрактов использована высокоэффективная жидкостная хроматография с двумя независимыми детекторами (УФ и МС).

В качестве моделей для исследования процессов экстракции в субкритической воде были выбраны три вида тритерпеновых сапонинов, растительные источники которых произрастают в РФ: глицнрризиновая кислота VI, извлекаемая из корня солодки, аралозиды VII, извлекаемые из корпя аралии маньчжурской и сапонины VIII, извлекаемые из плюша.

COOR

СН

Глицнрризиновая кислота

Аралозиды: A (R| = L-арабиноза, R2= Н), В (R, = L-арабиноза, R2 = L-арабиноза) и С (Ri = D-галактоза, R2 = D-ксилоза)

Сапонины плюща VIII

VI

VII

Н.С^-СН,

H.C. /СН,

-соон

■соон

но-

СН, СН,

он

но-

сн, сн,

Агликон сапонина плюща а-хедерагенин

Агликон сапонина плюща олеаноловая кислота X

Тритерпеноиды по структуре близки к стероидным гормонам, поэтому являются объектом многочисленных исследований химиков-синтетиков и фармакологов. Наиболее широко изучаемым объектом является глицирризиновая кислота (ГК) - глнкозид, относящийся к ряду р-амирина, агликоном которого является глицирретиновая кислота (ГЛК), обладающая широким спектром фармакологической активности.

Цель данной части работы состояла в разработке экологически чистого метода экстракции гликозида ГК из корня солодки субкритической водой с максимальным выходом ГК как основного активного компонента и сравнении эффективности разработанного метода с традиционным способом извлечения ГК. Для получения ГК из корня солодки предложено использовать среду субкритической воды. При разработке метода экстракции корня солодки субкритической водой изучены следующие параметры, влияющие на выход ГК: температура (100-180 °С), соотношение сырье: экстрагент (от 1: 1 до 1:7), состав экстрагента (добавки различной концентрации ЫаОН, ЫТ^ОН), время экстракции (от 30 до 90 мин). Оптимальными оказались следующие условия экстрагирования: температура: 120 °С; соотношение сырье: экстрагент 1:7; экстрагент: 1% МН^ОН; время экстракции: 60 минут. Установлено, что температура ниже 120 °С оказывается недостаточной для полноценного процесса экстрагирования. Увеличение же температуры выше (20 °С приводит к уменьшению количества ГК в экстракте вследствие частичного разложения ГК за счет гидролиза. Добавление небольшого количества аммиака позволило перевести смесь глицирризина (имеющего разную растворимость в воде) в водорастворимую аммонийную соль глицирризиновой кислоты. Количество аммонийной соли приведено в пересчете на ГК. Хроматограмма экстракта корня солодки, полученного в субкритических условиях, представлена на рисунке 18.

О 2-1 (, « ¡0 12 14

Рисунок 18. Хроматограмма экстракта корня солодки, полученного в субкритической воде (ГК -пик со временем удерживания 10.83 мин)

Показано, что экстракция субкритической водой в статическом режиме позволяет извлечь в 2.7 раза больше глицирризиновой кислоты, чем традиционный метод с использованием органических растворителей. Полученные результаты открывают возможности для реализации предлагаемого метода экстракции в промышленных масштабах.

Другим набором модельных растительных метаболитов, для извлечения которых использован метод экстракции в среде субкритической воды, стали аралозиды - биологически активные вещества из корней аралии маньчжурской АгаНа тапсккипса. Аралозиды А, В и С являются гликозидами олеаноловой кислоты. Смеси этих аралозидов являются действующими веществами лекарственных средств «Настойка аралии» и «Сапарал», применяемых в качестве

тонизирующего и иммунномодулирующего средства и близких по лечебному действию к препаратам женьшеня. Исходным продуктом для лекарственных средств из аралии является концентрат «Сапарал» (ФС 42-1924-82), представляющий собой аморфный порошок кремового цвета без запаха с содержанием смеси аралозидов А, В и С не менее 80 %. Агликон этих аралозидов - олеаиоловая кислота является мощным аитиоксидантом и проявляет противоопухолевую активность.

Традиционная схема экстракции смеси аралозидов включает применение в качестве экстрагентов метанола, этилацетата, н-бутанола, активированного угля, соляной кислоты и гидроксида аммония, что приводит к необходимости регенерации и утилизации значительного количества растворителей и адсорбентов. В этой части работы решалась задача разработки экологически чистого метода экстракции смесей аралозидов в среде субкритнческой воды и эффективных методов установления состава полученных продуктов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

Экстракция аралозидов из корней аралии в среде субкритической воды проведена в статическом режиме. Традиционный экстракт аралозидов, используемый для сравнения результатов, получен по литературной методике экстракцией метанолом. Так как выделение аралозидов проведено в форме солей аммония, то хроматограмма экстракта аралозидов содержит характерные изохронные группы пиков однозарядных катионов: М+Н', M+NlV , M+Na' и М-НС1. Соединения с катионами, имеющими m/z 927, 944, и 949 идентифицированы как аралознд А (молекулярная масса (MW = 926), с m/z 1059 и 1097 - как аралозид В (MW = 1058), с m/z 1089, 1106 и 1111- как аралознд С (MW = 1088) (Рис. 19). Относительное содержание аралозидов А, В и С определено методом нормировки и составило: А: В : С = 57 : 27 : 16.

944.0 |MVIU+NH4f

927.3 [MviI д + "Г

i 912 В 910.6

949.1 |MVIU + Naf

w?e

____...1 ...

."ц......ЯИ.0 ms "" зр

ftin 1 ' Г ^Пе ' Г Т ' Л. ~ ' 1

Рисунок!9. Масс-спектр положительных ионов арапозида VIIA

С использованием разработанных методик идентификации хроматографических пиков изучен и оптимизирован процесс экстракции аралозидов из корня аралии маньчжурской в среде субкритическон воды. В качестве параметров, влияющих на эффективность предложенного метода получения смеси аралозидов, изучено влияние добавок аммиака, температуры, продолжительности экстракции и соотношения количеств сырья и экстрагента.

Показано, что экстракция субкритической водой с добавлением аммиака в статическом режиме позволяет извлечь в 1.9 раза больше аралозидов А, В и С, чем традиционно используемый метод экстракции метанолом. При этом следует отметить, что и чистая вода без добавок аммиака в субкритических условиях позволяет извлечь большее количество аралозидов по сравнению с традиционным методом. Кроме преимуществ в степени извлечения, в субкритических условиях процесс экстракции аралозидов идет в 3 раза быстрее, к тому же с использованием экологически безопасного раствори теля - воды.

2.2. Исследование состава «спроектированных» в среде субкритической воды смесей растительных метаболитов.

В качестве исходного объекта для экстракции «спроектированных» смесей фармацевтически значимых растительных метаболитов выбрана шелуха лука. Важнейшими функционально значимыми соединениями, присутствующими в луке и его отходах, являются флавоноиды. Выращивание и использование лука приводит к появлению многотонных отходов в виде шелухи. Использование отходов сельхозпронзводства в качестве сырьевых источников биофлавоноидов и поиск экологически приемлемых технологий их извлечения является актуальной задачей фитохимии и имеет социально значимый характер в плане разработки эффективных и нетоксичных импортозамещающих препаратов с антиоксидантной активностью.

В связи с этим цель данного раздела работы состояла в разработке экологически чистого способа получения экстрактов, содержащих смеси биофлавоноидов из шелухи лука в среде субкритической воды и изучении данного способа извлечения для оптимизации параметров процесса. В качестве объекта исследования выбрана шелуха красного лука сорта Яес1 Вагон. Предложено проводить экстракцию смеси флавоноидов из шелухи красного лука в среде субкрнтической воды. Полученные и статическом и проточном режиме водные экстракты использованы для количественного определения содержания кверцетина и его гликозидов методами ВЭЖХ.

г i КЗ^"'

if^Vir' «V» 1 у

XI

Рутин. C2jHM016 (MW—610.53)

JC

ХУХХ

tfYT Vs-

XII

XIII

Диг.тнко'иш: кверцетнн-З-О-галакто111Л-7-0-и11око'1НД, С^ИдоОп (MW=626.52)

Моногликозид: кверцетни-З-О-гапактозпд, СЧ|1Ь((012 (MW=464.38)

XIV

И зорям I lenin, Ci бИ 120? (MW=316,262)

Мирицитии, CIJHJ(,Os (MW -318.24)

Хроматографические исследования выполнены в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Agilent 1200» со спектрофотометрическим детектором, работающим в диапазоне длин волн от 195 до 950 нм. Для анализа качественного состава полученных экстрактов (при отсутствии стандартов) использовали масс-спектрометр «Bruker Daltonics micrOTOF-Q» с

ионизацией электрораспылением (программное обеспечение micrOTOFcontrol™2.2., калибровочный раствор для электрораспыления (Elcctrospray Calibrant Solution) фирмы Fluka). Детектирование отрицательных и положительных ионов выполнено в интервале m/z от 50 до 3000. Напряжение на капилляре распылителя ±400 В, параметры газа-осушителя (азот «осч», 5 л мин-1, 200 °С).

Для определения количественного и качественного состава целевых продуктов экстракции из шелухи лука получены экстракты при различных схемах экстракции. Типичные хроматограммы экстрактов из шелухи красного лука, полученного по традиционной схеме и в среде субкритической воды (130 °С, 60 минут, статическая схема), представлены на рисунках 20а и 206, соответственно. На рисунке 20в приведены масс-спектры экстракта, полученного традиционным методом.

о.а 0.6

ci

<и 04 X

о 0.2

ХМ

а)

а

XII

200 150 100 50

0 500

J3

1 о

g 125

Ï "»

X 75

^ 50 25

О 150

100 50

УФ - Хромзтог'ра»

ßo Время, мин

XII

Кверцетин-З-О-галактозид-7-Оглюкозид

4v1S, 5.1 мин 627.0584

465.0409

L - ■

.Л' il».

в)

+MS, 22.1 мин

465.0330 ХШ

Кверцетин-З-О-галактозид 0

303.0056 (

+MS. 29 4 мин

XIV Т ] 317.0221 Изорамнетин ™479.0465

lÎLu

Ii ...л .....Í.Í,.,/:. .а;..... i.¡ À d:. il. il

УМ.....L

M.Ul.I :

+MS, 70.4 мин

303.0023 I „у

.ext.. ....

Рисунок 20. а) Хроматограммы экстракта шелухи красного лука, полученного традиционным методом в водно-спиртовой среде. Сплошная линия па рисунке соответствует УФ -хроматограмме, штриховой пунктир_на рисунке соответствует общему ионному току при детектировании в условиях ионизации электрораспылением; б) хроматограммы экстракта шелухи красного лука, полученного в субкритической воде в статическом режиме при 130 °С; в) масс-спектры экстракта шелухи красного лука, полученного традиционным методом.

Разработанная методика проведения обращенно-фазового ВЭЖХ анализа позволила добиться разделения всех целевых компонентов: от пиков диглпкозидов кверцетнна XII (RT= 6.1 мин) до пика аглнкона рутина - кверцетнна I (при RT =71.0 мин). Как видно из хроматограмм на рис. 20а и 206, помимо пиков стандартных компонентов, на хроматограммах имеются не идентифицированные пики, определение которых затруднено из-за отсутствия стандартных веществ. В частности, не идентифицированные по пикам стандартов, хроматографические пики с RT=22.2 минут и с RT =29.5 минут имеют площади пиков, сопоставимые или превышающие площадь пика стандарта кверцетнна при RT=71.0 минут.

Для установления природы ранее не идентифицированных компонентов экстрактов использовалась хроматомасс-спектрометрия с ионизацией электрораспыленнем. Кроме хроматограмм экстрактов с УФ - детектированием (сплошная линия на рпс.20а и рис.206), были получены хроматограммы по общему ионному току (штриховой пунктир па рис.20а и 206) и масс-спектры этих экстрактов в условиях ионизации электрораспыленнем (Рпс.20в).

Хроматографпческий пик с RT =5.1 мин представлен в масс-спектрах положительно заряженных ионов пиком m/z 627.0. Это значение заряда протонированного иона дигликознда кверцетнна, отличающегося от ругина и имеющего в основе своего скелета галактозндный мопоглп кознд кверцетнна (quercetin-3-O-galactoside). Этот положительно заряженный ион фрагментрируется до протонированного попа с m/z 465.0, за счет потери галактозидного остатка с массой 162. Соответственно, хроматографпческий пик, со временем удерживания RT=5.1 минуты, отвечает дигликознду кверцетнна XII (Л/Ц- 626.51, С27Н311О17). Пик с m/z 465.0, наблюдаемый на хроматограмме при RT =22.2 минуты, в свою очередь, отвечает галактозндлому мопоглпкозпду кверцетнна XIII (МП -464.37; CiiHjoOn) и, в условиях ионизации электрораспыленнем, фрагментнруегся до положительно заряженного нона с m/z 303.0 — протонированного нона кверцетнна. Хроматографпческий пик с RT =29.4 минут (m/z 479.0) соответствует протонированному нону моноглнкознда изорамиетпна XIV, который может присутствовать в матрице как индивидуальное соединение, или образовываться в результате гидролиза дигликознда изорамиетпна. Хроматографпческий пик с RT =70.4 минут (m/z 303.0) соответствует протонированному иону кверцетнна I, что, в свою очередь, подтверждается значением времени удерживания стандарта кверцетнна (RT=70.4 минут).

Таким образом, использование хроматомасс-спектрометрнн позволило доказать наличие в полученных экстрактах следующих бпофлавоноидов: диглпкозидов кверцетнна рутин XI и XII, моноглнкознда кверцетнна XIII, моноглнкознда изорамиетпна XIV и кверцетнна II.

Идентификация инков хроматограмм экстрактов (рис.20), па основе данных масс-сиектрометрни, использована для характеристики качественного и количественного состава экстрактов, полученных различными способами. На рисунке 21 представлены хроматограммы стандартного раствора рутина, кверцетнна и экстрактов, полученные в условиях хроматографического анализа, указанных на рисунке 21.

МЫ VMH.FM SmMJ КиГКГ«!1<ие

Гегсян ♦ этанол

Р

40 94 13 Trni.J

я а »

4 25 хин ЛИ OnAÜ

xiy

17 99 ми«. *4.2nMJ

15 ffl И

41 ЭЭ мич. 151.4ггЛи

JL

Рисунок 21. а) хроматограмма смссн стандартов кверцстпна и рутина 0.025 мг/мл; б) хроматограмма экстракта шелухи красного лука, полученного традиционным методом; в) хроматограмма экстракта шелухи красного лука, полученного в субкрптической воде в статическом режиме при 130 °С; г) хроматограмма экстракта шелухи красного лука, полученного в субкритпческон воде в статическом режиме при 230 °С Из рисунка 21 видно, что в хроматограммах экстрактов, полученных с использованием органических растворителей (гексапа и этанола), и хроматограммах экстрактов, получаемых в среде субкрптической воды, наблюдаются существенные различия. В хроматограмме экстракта, полученного в среде субкритпческон воды (в статическом режиме) при 130 "С (рис. 21в), и в хроматограмме экстракта, полученного в субкритпческон воде при 230 °С (рис. 21г) отсутствуют пики дпглнкозида квернетина XII, моноглнкозидов кверцетина XIII и изорамнетина XIV.

Отсутствие хроматографичеекпх пиков, соответствующих глпкозидам, и возрастание интенсивности пиков аглнкопов связано с процессами кислотного гидролиза мопо- и дигликозидов кверцстпна н изорамнетина, протекающими в среде субкритпческон воды. Возможности для такого кислотного гидролиза вытекают из известного свойства субкритпческон воды, состоящего в существенном (на три порядка) увеличении константы диссоциации воды в области температур 200-270 °С. При таких условиях субкритическая вода демонстрирует свойства кислотного катализатора.

Полученные результаты открывают перспективу разработки технологии селективной экстракции бнофлавоноидов, путем управления качественным составом экстракта посредством изменения параметров среды субкрптической воды (температура, время и давление), с целыо получения смеси с заданным соотношением количества гликозидов и аглнконов бнофлавоноидов. Изменение соотношения количества гликозидов и аглнконов приводит к изменению биологически активных свойств экстрактов, полученных в среде субкрптической воды.

Для определения оптимальных условий экстракции бпофлавопоидов в среде субкритнческой воды из шелухи лука изучена зависимость выхода гликозндов бпофлавопоидов, в пересчете на рутин (РУ), от значений температуры экстракции и времени экстрагирования.

Для подбора оптимальной температуры экстракции в статическом режиме изучена зависимость выхода целевых веществ от температуры субкритнческой воды. Результаты эффективности извлечения кверцетнпа (КВ) и рутинозидов (РУ) из шелухи лука в зависимости от температуры представлены на рисунке 22.

I К13

п ру

ш

ГЬ ЕЬ

1КО 71Ю 2,0

Рисунок 22. Зависимость выхода кверцетнпа (КВ) п рутина (РУ) от температуры экстракции субкритнческой водой в статическом режиме

Как видно из диаграммы (рисунок 22), оптимальной температурой экстракции субкритнческой водой в статическом режиме является температура 130 "С.

Температура меньше 130 °С оказывается недостаточной для полноценного процесса экстрагирования, а повышение температуры приводит к изменению нативного состава получаемого экстракта за счет частичного разложения исходных компонентов, в том числе за счет гидролиза в субкритнческой воде.

Количество извлекаемых целевых продуктов (кверцетнпа и его гликозндов) в среде субкритнческой воды сопоставимо с традиционными методами экстракции по количеству извлекаемых бпофлавопоидов, но в 3 - 4 раза быстрее по времени и исключает использование дорогостоящих и, зачастую, токсичных органических растворителей.

Показано, что с увеличением температуры субкритической воды количественный и качественный состав экстрактов изменяется в сторону возрастания количества агликопов руппюзидов за счет процессов кислотного гидролиза. Это позволяет реализовать, в перспективе, технологию селективной экстракции с целью получения экстрактов, имеющих заданное соотношение гликозндов и агликопов. Таким образом, предложенный метод является экологически чистым и эффективным способом извлечения в среде субкритнческой воды «спроектированных» смесей бпофлавопоидов из шелухи лука.

Глава 3 Гидролитические трансформации модельных растительных метаболитов

3.1. Гидролиз растительных метаболитов в среде субкритнческой воды

3.1.1. Разработка метода гидролиза рутина в кверцетип « среде субкритической е.оды

Для изучения процесса гидролиза рутина XI (диглнкозида, образованного квернетнном и восстанавливающими сахарами: глюкозой XVII и рамнозой XVIII) до кверцетнпа I в среде субкритнческой воды использована разработанная и описанная ранее в главе 2 установка. Схема реакции гидролиза рутина в среде СЕВ приведена на рисунке 23.

ЛИ Oll , (,>11

Ol

I XVII XVIII

Рисунок 23. Схема получения кверцетипа I из ругипа XI в субкрптичсской воде

Результаты хроматографии стандартного раствора рутина и экстракта, полученного на установке через 30 мин, приведены па рис. 24а и 246 соответственно.

и

• 00 КЯ 17.» МОС

а) С)

Рисунок 24. а) Хроматограмма рутина; б) хроматограмма смеси, полученной из рутина в среде

субкрптичсской воды

В отличие от хроматограммы стандартного раствора рутина XI, которая содержала один пик с временем выхода 7.77 мин. (рис. 24), в смеси, полученной пз рутина XI в среде субкритнческой воды, наблюдаются хроматографнческие инки с временами выхода от б. 18 до 7.75 и 9.32 mihi., что соответствует смссн двух и более соединении (пик 6.18 - 7.75 мни. уширен). Для определения качественного состава смссн с использованием масс-спсктромстрип с ионизацией элсктрораспылснпем исследованы компонентные составы соответствующих хроматографичсских пиков. Для пика (6.18 - 7.75 мин) при регистрации положительных ионов обнаружены: протонированный молекулярный пои кверцетипа (m/z 303.2); протежированный молекулярный нон фрагментации рутина (m/z 465.3); протонированный молекулярный нон рутина (m/z 611.4) (рнс.25). Аналогично, в масс-спектре отрицательно заряженных попов идентифицирован пик m/z 609.3, соответствующий депротонированному молекулярному иону рутина.

л

303.2 [М,.пГ

465.3 [Mv,,<tlf

611.4 [Мх,+П]'

У г*'*

зи<з

L

7«? ""Т «и» ¡787 <156 МЛ.4*

Б

609.3 [Mv,-lir

3785 OS« Н«3 т* К93

' ™......150 "«>........310 «О 4И ко . КО ИЗ....._.6S0......КО 750_____60Q____850_____SGO 860 lobo

Рисунок 25. Масс-спектры положительных (а) и отрицательных ионов (б), полученные для хроматографнческого пика с временем выхода 7.22 мин

Для хроматографнческого пика 9.32 мин в масс-спектре отрицательных ионов наблюдаются только ионы с т/г 301.2, соответствующие депротонированному молекулярному иону кверцетина. Последнее доказывает эффективность процессов гидролиза рутина в условия субкритической воды с образованием кверцетина, без применения кислотного катализатора, обычно используемого в таких случаях. Данный механизм может осуществляться и при экстракции кверцетина из растительного материала, что является причиной увеличения его выхода по сравнению с традиционной методикой. При этом ыасс-спектрометрия с ионизацией электроспреем позволяет установить наличие кверцетина в продукте. Известно, что интервал температур 230 -270 °С в области до критической точки соответствует максимальному значению ионного произведения воды, которое выше на три порядка по сравнению с обычными условиями (температура 25°С и давление 1 атм.). Субкритнческая вода при таких температурах демонстрирует свойства кислотного катализатора, как описано ранее В.В. Луниным и др.

3.1.2 Разработка и изучение метода гидролиза экстракта корня солодки в среде субкритической воды.

Цель данной части работы - развитие предложенного выше подхода для получения глицирретпновой кислоты путем гидролиза промышленно производимого экстракта корня солодки в среде субкрнтической воды за счет использования каталитических свойств субкрнтической воды в интервале температур 200-270 °С [6].

о

Для точной оценки количества глицирретнновон XIX и глицнрризиновой кислот VI в экстракте корня солодки и продуктах гидролиза разработаны методики их качественного и количественного определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Исследование выполнено на жидкостном хроматографе «Thermo Separation Products» в обращепо-фазпом варианте, оснащенном УФ-детектором, работающем в диапазоне длин волн от 190 до 380 им. Хроматограмма продукта, полученного традиционным гидролизом экстракта корня солодки, представлена па рисунке 26.

s00

400

6 300 8

га

too

о

о г 4 е 8 10 12 14 18

Рисунок 26. Хроматограмма продукта традиционного гидролиза экстракта солодки (ГЛК - пик со

временем удерживания 13.12)

Получение ГЛК пугем гидролиза экстракта солодки в субкритической воде проводили в герметичном цилиндрическом реакторе из нержавеющей стали, емкостью 10 см3, в сушильном шкафу при определенной температуре. Постоянство температуры поддерживалось с точностью ± 2°С. Методика гидролиза экстракта солодки: иавеску 1 г сухого измельченного экстракта солодки и 7 мл воды помещали в реактор, который герметично закрывали и устанавливали в сушильный шкаф с постоянной температурой на 1 час. Затем реактор охлаждали, количественно переносили содержимое па бумажный фильтр и фильтровали с помощью водоструйного насоса. Далее отфильтрованный гидролизат сушили и анализировали методом ВЭЖХ. Филырат проверяли па

наличие непрореагировавшей ГК. После очистки получили продукт с содержанием ГЛК 45% от теоретически возможного значения. Процесс гидролиза экстракта корня солодки в среде субкрнтической воды изучен в интервале температур 190 - 270 °С с варьированием продолжительности экстракции и кислотности среды с целью получения глпциррстнновой кислоты. Полученная глицирретиновая кислота имеет р - конфигурацию при углероде С|8, что подтверждено спектром ЯМР С13. Высказано предположение, что агликон (целевая ГЛК) при повышенных температурах подвергается некоторому превращению, изучение которого требует отдельного исследования. Для проверки этого предположения изучено поведение 95% глицирретиновой кислоты в субкритических условиях при различных температурах. 100 мг глнцирретиновой кислоты с водой помещали в реактор на одни час при различных температурах и определяли количество ГЛК в реакционных смесях.

Обнаружено, что при температуре 200 °С до 15 % глицирретиновой кислоты разрушается, а при 230 °С теряется уже не менее 40% глицирретиновой кислоты. Поскольку при температуре 200 °С в субкритической воде гидролиз, обусловленный диссоциацией воды, практически не протекает, то был изучен гидролиз экстракта корня солодки до агликона (ГЛК) в субкритической воде с добавлением катализатора. В качестве катализатора использованы слабые растворы серной, азотной и соляной кислот.

Рисунок 27. Хроматограмма продуктов гидролиза экстракта солодки в среде субкрнтической воды с добавкой 2% Н2304 (ГЛК - пик со временем удерживания 13.208 мпн)

Определены оптимальные условия гидролиза экстракта солодки до агликона (ГЛК) в субкритической воде: температура 200 °С, масса экстракта корня солодки 1 г, объем воды 7мл, катализатор 2% НгЗО.), время гидролиза 60 минут. Хроматограмма представлена на рисунке 27.

Предложенный метод гидролиза экстракта корня солодки в среде субкрнтической воды имеет ряд преимуществ перед традиционным гидролизом: 1) время гидролиза в субкритических средах в 4 раза меньше по сравнению с традиционным методом гидролиза; 2) количество образующейся в субкритической воде (с 2% Н^БО,!) глицирретиновой кислоты в 1.5 раза больше по сравнению с традиционным гидролизом и гидролизом в субкрнтической воде без добавки.

3.2. Изомеризация модельных растительных метаболитов в среде субкритической воды. Изучена изомеризация нерацемнческой смеси энантиомеров природного апорфинового алкалоида глауцина в фенаптреновый алкалоид дес-глауцин в среде субкрнтической воды при

температуре 200-300 °С в герметических условиях. В результате получен дес-глауцин (seco-glaucine) с выходом 53%.

МеО

-CI Г,

subll.O

МеО

CII,

ОМе

Дес-глауцин XXI

Природный апорфиновый алкалоид (+)-глауцин ((S)-N-MeTim-l ',2',7,8-тетраметоксидпбензо[с1е^]октагидрохинолин), выделяемый из мачка желтого (Glaucinum flavum), является противокашлевым препаратом центрального действия. В растениях глауцин присутствует в двух формах: (+)-глауцин-основной алкалоид и (-)-глауцнн-мннорпый. Наличие у глауцина побочного действия (гипотензивного эффекта) связывают с присутствием именно (-)-глауцина.

При расщеплении связи C-N между хнральиым атомом углерода и атомом азота глауцин превращается в дес-глауцин, представляющий собой производное фенантрена. Целевое производное глауцина - дес-глауцин, также обладает выраженным противокашлевым действием. При этом у дес-глауцппа не обнаружено побочного гипотензивного эффекта и дес-глауцин в 1,5 раза менее токсичен, чем глауцин (LD5U=82,5). Кроме того, производные глауцина не являются хпральными соединениями, поэтому оба энантиомера глауцина в условиях нашей реакции дают одни и тот же продукт, как следствие, увеличивая выход целевого продукта. Распространение дес-глауцииа в качестве лекарственного препарата ограничивается, прежде всего, экономическими соображениями из-за отсутствия эффективных методов его получения из самого глауцина. Таким образом, поиск эффективных способов получения дес-глауцина и его производных представляется перспективным направлением. Показано, что в среде субкритической воды при температуре 200-300 С происходит изомеризация нераце.мнческой смеси (+)- и (-)-глауцнна в дес-глауцин, что доказано данными 5IMP — и масс-спектрометрии.

При прямом вводе раствора препаративно выделенного из субкрнтпческой воды дес-глауцина в масс-спектрах положительных ионов обнаружены ионы с однотипными значениями ионов m/z, которые приписаны адцуктам дес-глауцина XXI с молекулярной массой 355 с катионом Н+, Na+ (m/z 356 и 378, соответственно). Спектр ЯМР 'Н также подтверждает структуру дес-глауцина XXI.

Использование предлагаемой методики получения дес-глауципа открывает ряд перспектив. Экстракция алкалоида или суммы алкалоидов субкритической водой из мачка желтого может обеспечить получение дес-глауцппа в одну стадию с хорошим выходом и создает возможность его дальнейшей модификации в субкрптпческих условиях как по фенантреновому ядру, так и по вторичной аминогруппе. Наличие у дес-глауцина желтой люминесценции может сделать его также перспективным недорогим материалом для использования в синтезе соединений для молекулярной электроники и биомедицины.

3.3. Реакция конденсации в среде субкритической воды: синтез циклотривератрилеиа

Наряду с поиском эффективных методик модификации биологически активных соединений изучена возможность получения макроциклическнх соединении со свойствами молекулы «хозяина» в супрамолекулярных комплексах типа «гость» - «хозяин». В качестве целевого соединения выбран циклотривератрилен и изучено взаимодействие вератрола и параформа в среде субкритической воды. При взаимодействии вератрола и параформа в субкритической воде без добавления катализатора в нашей работе впервые получена смесь продуктов, из которой хроматографичеекп (методом ТСХ) выделен ЦТВ XXIV с выходом 11%. Масс-

27

спектрометрический анализ, соответствующей хроматографнческой (ТСХ) фракции показал, что она на 94% состоит из ЦТВ XXIV и на 6% нз циклотетраператрплена XXV.

МеО. МсО'

Вератрол, XXII

МеО МеО XXIII

IX он

Циклотрнвератрплен XXIV

\J

мсо оме

циклотетравератрилен XXV

В масс-спектрах регистрировали положительно заряженные ионы с однотипными значениями m/z, которые приписаны аддуктам ЦТВ XXIV с катионами N114', Na+, Kf в соотношении 1:1 (m/z 468, 473 и 489), 2:1 (m/z 918, 923 и 939) и 3:1 (m/z 1368, 1375 и 1389) соответственно (рис.28).

* 0,8 (4

s 0,6

5

i 0,4 g

1 0,2

I 0,0 ■

461,1596

473 +

I г ')■ I I 450 455

456,2049 Ч '' N Ч

468,2017

I I' | I I 11 [ I I

1576

IM +Na]

+

IM +К|

+

xxiv

489 1322

460

'г ' I ' I Г"'"" 475 480

' I 1

435

> .......

465 470 475 480 435 490 Рисунок 28. Масс-спектр положительно заряженных ионов со значениями m/z от 448 до 497

495 m/z

Масс-спектрометрия с ионизацией электроспреем, в отличие от метода ЯМР 'н, кроме макроцнкла ЦТВ XXIV показала наличие в полученном образце макроцикла цнклотетравсратрилена XXV с молекулярной массой 600. Последний регистрируется в масс-спектрах положительных ионов в виде аддуктов циклотетравератрилена XXV с катионами NH4t, Na+ К+ в соотношении 1:1 (m/z 618, 623 и 639 соответственно). Масс-спектрометрия регистрирует также образование смешанных аддуктов с m/z 1068, 1073 и 1089, соответственно (рис. 29).

S ^:

t 0,8 -Я

* :

I 0,4 -

S -

I 0,2 -

я -

s 0,0 -

1060 1065 1070 1075 1080 1085 1090 m/i

Рисунок 29. Масс-спектр положительно заряженных ионов со значениями m/z от 1058 до 1095

Соотношение тример XXIV /тетрамер XXV для полученного в субкрптической воде образца определено с учетом площади пиков m/z методом внутреннего нормирования и составило 94% для тримера и 6% для тетрамера.

Глава 4. Изучение комплексообразованпн трнтерпеновых растительных метаболитов при помощи методов масс-спсктрометрнн.

4.1. Самоассоциация и комплексообразовапие глицирнзиновой кислоты

4.1.1. Процессы самоассоциации молекул глицнризипокой кислоты: квантовохимическое и масс-снектрометрическое исследование

Четкие представления о механизмах связывания лекарства с рецептором и дальнейшей трансформации комплекса па активном центре рецептора, ведущей к его диссоциации, является необходимым условием рационального дизайна лекарственных веществ. Одним из классов биологически активных веществ, широко используемых в качестве адыовантных средств (adjuvants), являются сапонины, характеризующиеся способностью к образованию ассоцнатов. Это свойство сапонинов применяется в настоящее время при направленном поиске новых лекарственных субстанций с заданными характеристиками на основе комплексов типа «хозяин-гость».

В настоящее время активно создаются лекарственные субстанции на основе известных базовых физиологически активных компонентов (фармакопов) и глициррпзиновой кислоты VI (ГК). Группой российских ученых под руководством академика Г.А.Толстикова обнаружено значительное усиление действия ряда фармакопов в комплексах с ГК, что позволяет уменьшить эффективные дозы лекарственных препаратов в 100- 200 раз.

В процессах получения таких комплексов молекулы глицирризнновой кислоты выступают в роли полидентантных лигандов, образующих с базовыми фармаконами комплексы различной стехиометрии, которые и используются как низкодозные лекарственные субстанции.

При достаточной многочисленности примеров использования такого подхода, детали механизма формирования низколозных лекарственных комплексов глицирризнновой кислоты с фармаконами в различных соотношениях (1:1, 1:2 и 1:4) до сих пор изучены не достаточно. Практически не известны данные по геометрии и свойствам самоассоциатов глицирризнновой кислоты, которые и определяют возможность образования полости внутри самоассоциатов глицирризнновой кислоты, необходимой для размещения молекулы базового фармакона.

В этой связи, целью данной части работы стало проведение квантово-химнческих расчётов для определения геометрии и свойств автоассоциатов глицирризнновой кислоты (VI) и последующего доказательства формирования автоассоциатов (а затем и комплексов трнтерпеновых сапонинов с фармаконами) методами масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением.

Ввиду большого размера ассоцнатов расчеты выполнены при помощи полуэмгшрического метода РМЗ с использованием пакета программ Gaussian-03. Все обсуждаемые далее структуры соответствуют минимумам на соответствующих поверхностях потенциальной энергии. Графические изображения молекулярных структур, представленные на рисунках, получены с

IM^ + M^+NIIJ*

1061,3978 ш

—I | l'I1 I' I | I—г

58 4443

\'i I . .и

[м + м + кГ

1 WCIV XXV 1

livr-r

1 I I I I I I

1089,3692

использованием программы Cliemcraft, где в качестве исходных данных использовались расчетные данные.

На начальном этапе выполнены квантово-хнмические расчеты кластеров ГК общего вида Хп (п=1...6). Как показывают расчеты бимолекулярная система (п=2) образует устойчивые структуры XXVI, которые стабилизируются системой водородных мостиковых О-Н-О связей. Характеристики данных структур приведены на рисунке 30, показаны наименьшие длины связи между молекулами ГК. Комплекс XXVI относится к типу «голова-голова», а комплексы XXVII-XVIII имеют структуру «голова-хвост». Расчеты показывают, что наибольшей устойчивостью обладают ассоциаты VIII XXVII-XVIII, энергии комплексообразования которых составляют 15-16 ккал/моль, что согласуется с моделью стабилизации димерньгх ассоциатов VI по типу «голова к хвосту», предложенной на основании данных спектроскопии ЯМР. При этом, наиболее энергетически устойчивый бимолекулярный ассоцнат XXVIII имеет внутреннюю полость, достаточную для включения соразмерных молекул-гостей.

XXVI XXVII

ДЕ(сотр1)= 9.5 кса|/то! дЕ(сотр!)= 15.1 ксгИ/то!

г К < г1 ................'

У'^Ч-чА

"Ч-Ч^ '

XXVIII

ЛЕ(сотр1)= 16.2 кса!/то1

Рисунок 30. Геометрическое строение бимолекулярных комплексов глицирризиновон кислоты (структуры XXVI - XXVIII) по данным полуэмпирических РМЗ расчетов. Также приведены энергии комплексообразования и расстояния в ангстремах. Для оценки влияния растворителя на стабилизацию димеров ГК изучен ассоцнат, включающий структуру XXVIII и шесть молекул воды (рисунок 31).

Рисунок 31. Геометрическое строение ассоцпата, включающего структуру XXIX и шесть молекул воды (по данным полуэмпирическпх РМЗ расчетов, расстояния в ангстремах).

Как видно из рисунка 31, соответствующая ему структура XXIX характеризуется другим размером внутренней полости. Ее энергия стабилизации составляет 42.3 ккал/моль, при этом, как показывают расчеты, на каждую молекулу воды приходится 4.4 ккал/моль вклада в общую стабилизацию кластера XXIX.

Данные расчетов подтверждают предположение о возможности образования супрамолекулярных самоассоциатов глицирризиновой кислоты с предпочтительной стабилизацией структур тина «голова-хвост». Исходя из динамики роста энергии комгшексообразовання при увеличении числа молекул, а также, учитывая, что возможность образования крупных кластеров кинетически маловероятна, можно предположить, что с наибольшей вероятностью в реальной системе будут существовать ассоцлаты с п=2-4. При этом устойчивые ассоциаты имеют полости, достаточные для внедрения в них молекулы - «гостя», а присутствие воды в системе значительно стабилизирует комплексы XXIX, обеспечивая наилучшее связывание молекул в системе.

Для экспериментальной проверки заключений, основанных на результатах расчетов, получены масс-спектры моноаммонийной ЫН^солн глицирризиновой кислоты. Молекулярная масса глицирризиновой кислоты С42Н62О16 составляет 822.370 Да. Масс-спектры автоассоциатов глицирризиновой кислоты VI получены для 0.2 %-ного раствора моноаммонневой соли глицирризиновой кислоты при рН= 5.5 и рН= 2 (добавка муравьиной кислоты). В масс-спектрах моноаммонийнон КН^-солн глицирризиновой кислоты при рН = 2 (рнс.32) зарегистрированы пики, соответствующие молекулярному иону и самоассоцнатам глицирризиновой кислоты.

V/-—v'X /V Д \

1 "-> lr4 1 t'e 1*8 litne[rrinj

1.25

1.00

О 75

O.SO

0.2S

ООО

Рисунок 32. Масс-спектр отрицательных ионов моноаммонийной ЫН4-соли глицирризиновой

кислоты при рН = 2.

[-------- J 1С .АН MS ........ fcIC S22 Э7*О.ОЬ -All MS

лю 1 79 Х71 V.2 -MS. 1.0-I.Smin f(60-108)

271 1|>Л |

. Ill LL M....L L, 1 ГМЗ 1SA3 723 i.

500 lOOO 1500 2000 2SOO т/г

Так, например, регистрируемый пик т/г 821.36 (интенсивность 67%) соответствует мономерному аниону [М-Н]" кислоты (VI) (рис.32). В данном масс-спектре днмсрному (содержащему две молекулы глицирризиновой кислоты с массой 1643.723 Да) однозарядному моноаниону [2М-Н]" соответствует пик с интенсивностью 3%. На этом же спектре пик с т/г 1232,54 (12%) соответствует двухзарядному нону тримерного автоассоциата кислоты VI. Такой тример может иметь строение сэндвича [(М-Н)+М+(М-Н)]2" или [М+(М-2Н)+М]2".

Таким образом, данные масс-спектрометрни с ионизацией электрораспылением хорошо согласуются с результатами квантово-хнмнческнх расчетов: глицирризиновая кислота VI образует димерные автоассоциаты за счет свободных карбоксильных групп в углеводной цепи и при атоме С-28 агликона.

4.1.2. Квантово-химическое и масс-спектралыюе исследование тримолекулярных комплексов молек)]л модельного производного бензимидазола и глицирризиновой кислоты.

При помощи квантово-химических расчетов полуэмпирическим методом РМЗ, ah initio методом HF/STO-3G*, а также методом теории функционала электронной плотности B3LYP/Lanl2DZ исследованы наиболее важные участки поверхности потенциальной энергии (ППЭ) основного So состояния отдельных молекул 9-диэтиламиноэтил - 2,3 - дигидроимидазо [1, 2 - а] бензимидазола (XXX) и глицирризиновой кислоты (ГК) и возможность образования их тримолекулярных комплексов (соотношение 1:2). Гипотетическая структура представлена парне. 33.

s п

XXX (Г>МЗ)

9-диэтиламиноэтнл - 2,3 - дигидронмидазо [1, 2 - а] бензимидазола XXX

Рисунок 33. Гипотетическая структура тримолекулярпых комплексов 9-диэтпламиноэтил — 2,3 — дигпдроимидазо [1, 2 - а] беизимидазола (БМЗ) и глицирризиновой кислоты (ГК)

Исследуемые объекты являются удобными модельными структурами низкодозных лекарственных субстанций нового поколения. Как показали расчеты, все комплексы, образованные молекулами БМЗ и глицирризиновой кислоты ГК (Рис. 34), а также димериые комплексы молекул глицирризиновой кислоты стабилизируются достаточно прочными водородными мостиками, длина которых не превышает сумм ван-дер-ваальсовых радиусов соответствующих элементов. Ввиду достаточно больших размеров молекулы глицирризиновой кислоты, а также благодаря большому количеству кислородсодержащих групп ОН и СООН в ее структуре, возможно существование множества изомерных вариантов комплексов XXXI молекул производного бензимидазола БМЗ и глицирризиновой кислоты ГК.

Как показывают расчеты, в процессе образования комплекса XXXII (рис.35) происходит межмолекулярный перенос протона с СООН группы одной из двух молекул XXXIII на азотный центр молекулы производного бензимидазола XXX и, таким образом, межмолекулярное взаимодействие в комплексе усиливается за счет кулоновскнх сил. В системе реализуется ЫН+'"" ООС контакт, в котором протон находясь в максимальной близости от азотного центра взаимодействует с двумя кислородными центрами молекулы кислоты.

В то же время, изомерный комплекс XXXII (рис.35) формируется тремя нейтральными молекуамп, и тем не менее оказывается более стабильным по сравнению с комплексом XXXI на ППЭ па ~1ккал/моль.

11 г г V*

г>! V;!

1

/

ч 11

г ^ а

¡с

\ г Г

• \

Г 1.М4

V-

Д л» \ *

-ет

\ Р /

* / Л

х \к

Г1

/: /1 ____к ^-—¡ь

К тНч—*' * /

XXXI

Рисунок 34. Рассчитанная геометрическая структура комплекса XXXI молекул бензимндазола БМЗ и глнциррнзиновой кислоты ГК (вид сверху и вид сбоку). Результаты расчета методом РМЗ.

.....Ь

¥ 1

-12и1 .С _ -/

ч

\

Ч \ ч '

¿4

'<&—х

/

л Чв

-л-

У

С- !

>

У

\ \

кг- ^ 1.7.П

2.63« 1;

Х г

\ ^

1 --К^с ^

•О - V Тх

•:АС

XXXII

Рисунок 35. Геометрическая структура комплекса XXXII, в котором реализуется межмолекулярпый перепое протона с СООН группы одной из двух молекул глицирризииовоп кислоты на азотный центр молекулы бензнмпдазола БМЗ (вид сверху и вид сбоку). Результаты

расчета методом РМЗ.

XXXIII

Рисунок 36. Геометрическая структура комплекса XXXIII, формируемого тремя нейтральными молекулами, в окружении шести молекул воды. Результаты расчета методом РМЗ

Многообразие изомерных комплексов увеличивается при учете в явной форме молекул растворителя - воды. Влияние растворителя продемонстрировано на примере системы XXXIII, представляющей собой комплекс XXXII с включением шести молекул воды. Как показывают расчеты, включение молекул растворителя дополнительно стабилизирует его, увеличивая энергию комплексообразования до 38.12 ккал/моль.

Для подтверждения теоретически полученных результатов масс-спектрометрня с ионизацией элетрораспылением применена к изучению комплексов глицирризиновой кислоты и фармакона -производного бензимидазола БМЗ (C15H22N4*2HC1), Mw(d)=258.3622).

Формирование комплексов глицирризиновой кислоты с производным бензимидазола XXX изучено в образцах синтезированных при разном соотношении хозяинхость (1:1, 2:1, 3:1, и 4:1)".

В масс-спектрах исследованных образцов регистрируются пики, принадлежащие протежированным молекулам бензимидазола БМЗ, протонированным и катионизированным молекулам ГК и пики придадлежащие соответствующим комплексам ГК и фармакона БМЗ, состоящим из мономеров, днмеров , тримеров и тетрамеров глицирризиновой кислоты с включением 1, 2-х и 4-х молекул производного бензимидазола БМЗ.

На рисунках 37 и 38 представлены масс-спектры положительных ионов образцов с соотношением хозяинхость 1:1 и 4:1. Из рис. 37 видно, что при одинаковом наборе пиков соотношение их интенсивностей изменилось. Так, в образце с соотношением (1:1) основной пик в масс-спектре положительных ионов принадлежит протоинрованной молекуле производного бензимидазола БМЗ с m/z 259.2. Интенсивность пика для протоинрованной молекулы глицирризиновой кислоты на порядок меньше (m/z 823.41 (10.7 %)), в то время как интенсивности

" Комплексы глицирризиновой кислоты с производным бензимидазола XXX синтезированы В.А. Анисимовой (НИИФОХ ЮФУ).

пиков для комплексов глицирризииовая кислота- производное бензимидазола БМЗ не превышали 0.2%.

L .

Рисунок 37. Масс-спектр положительных ионов глпцирризиновой кислоты VI и производного бензимидазола БМЗ в соотношении 1:1.

П образце с соотношением хозяинтость (4:1) с увеличением концентрации глпцирризиновой кислоты увеличилась относительная интенивность пиков, при этом интенсивность инков для свободного КМЗ существенно снизилась (до 0.5 %), что обусловлено увеличением веоятностн включения БМЗ в комплекс глпцирризиновой кислоты.

Имеете с тем в масс-спектрах наблюдается увеличение интенсивности пика комплекса глпцирризиновой кислоты с БМЗ, так в образце с соотношение хозяинтость (4:1) интенсивность инка для двузарядпого комплекса [2М^А+М ^+2Н]2+ с m/z 952.50 увеличилась до 24%.

-4-

2000 21TÖ 2400 2500 2300 Г!. 1

Рисунок 38. Масс-спектр положительных ионов глпцирризиновой кислоты и производного бензимидазола XXX в соотношении 4:1.

В масс-спектрах исследованных образцов идентифицированы комплексы с участием мономеров, днмеров, тримеров и тетрамеров глициррпзиновои кислоты ГК с включением 1, 2-х и 4-х молекул производного бензимидазола БМЗ.

Таким образом, данные масс-спектрометрин подтверждают выводы квантово-химических расчетов: глициррнзиновая кислота ГК формирует разнообразные по составу комплексы с молекулами производного бензимидазола БМЗ.

Результаты исследований позволили перейти к систематическому применению масс-спектрометрин для изучения супрамолекулярных комплексов модельных фармаконов и сапонинов плюща в качестве перспективных комплексообразователей в технологии производства низкодозных лекарственных средств.

4.2. Самоассоц1Ш111{Я и комплексообразование тритерпеновых сапонинов плкпца ***

4.2.1. Масс-снектрометрия самоассоциации и комнлексообразования тритерпеновых сапонинов nnoiija и холестерина.

В качестве перспективных комплексообразователей методами масс-спектрометрии изучены одни из самых распространенных тритерпеновых гликозндов растений семейства аралиевых (Araliaceae Juss.) - тритерпеновые гликознды а-хедерин (гликозпд XXXIV) и хедеракозид С (гликозид XXXV). Глнкозид XXXIV представляет собой 3-0-сс-£-рамнопнранозил-(1->2)-0-а-Л-арабинопнранозид хедерагенина, а XXXV - 3-0-а-£-рамнопиранозил-(1-»2)-0-а-/,-арабинопиранозил-28-0-а-/.-рамнопиранозил-( 1 ->4)-0-р-£>-глюкопирапозил-( 1 ->6)-0-[5-D-глюкопнранознд хедерагенина. Гликознды XXXIV и XXXV входят в состав известных препаратов для лечения кашля геделикса® [17, 18] и проспана® [17, 19], созданных на основе листьев Hederá helix.

Тритерпеновые гликознды плюща Глнкозид XXXIV: R=H;

гликозид XXXV: R=<-[)Glc/7-(6<-1 )-f!Glc/;-(4<-1 )-a.Rha/)

Холестерин XXXVI

В соответствии с подходом, использованным для исследования самоассоциации глицирризнновой кислоты, масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением применена для

"' Комплексы сапонинов плюща синтезированы ji.a. Яковишиным (Севастопольский технический университет, г. Севастополь)

изучения возможностей самоассоциацин гликозидов плюща XXXIV, XXXV и холестерина XXXVI, а также проверки возможности их молекулярного комплексообразования друг с другом.

В режиме положительных ионов масс-спектр содержит пик димерного ассоииата гликозида XXXIV и катиона натрия [2M(XXXIV)+Na]\ а также инк димерного комплекса гликозида XXXIV, холестерина и протона [2М(ХХХ1У)+Н+2М(холестерин)]\ имеющего m/z 2274.44. Другие ассоциаты XXXIV, холестерина XXXVI и катионов натрия или водорода отсутствуют, что свидетельствует о требуемой стехиометрии и размере катиона. Интенсивность пика комплекса [2M(XXXI V)+Na]' в 20.4 раза больше, чем интенсивность комплекса [2M(XXXIV)+H+2M(XXXVI)]\ Таким образом, концентрация комплекса гликозида XXXIV н липофильного холестерина на порядок уступает комплексам с ион-днпольным связыванием.

В режиме отрицательных ионов гликозид XXXV и холестерин также не образуют совместных комплексов. В масс-спектре найден пик днгидрата аниона гликозида XXXV [(M(XXXV)-II)+2II20]~ " п»к соответствующего дианиона [(M(XXXV)-2II)+4H20]:". Очевидно, холестерин связывается с монодесмозидными тритерпеновыми гликозидами, у которых гликознлнрован атом С-3 агликона и свободна карбоксильная группа у С-17.

Таким образом, данные масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем показывают, что а-хедерин образует самоассоциаты, регистрируемые в масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, а хедеракозид С и холестерин - нет. Холестерин формирует молекулярный комплекс с а-хедернном, в то время как образование комплексов холестерина с бисдесмозидным хедеракозндом не обнаружено.

4.2.2 Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением супрамолекулярных комплексов модельных фармаконов и тритерпеновых сапонинов тюща.

Изучено формирование комплексов широкого набора модельных фармаконов (XXXVII -XLIII) и сапонинов плюща XXXIV и XXXV (предоставлены Л.А.Яковишиным) супрамолекулярных комплексов модельных фармаконов и тритерпеновых сапонинов плюща.

ПН

fi \

1

у ' NH ■ <j'< Н,

N4; О

Левомицетин XXXVII Стрептоцид XXXVIII Парацетамол XXXIX

а о, "

ч, 1 /Нз :с-Ф-«:

-V си, н

CHJ н

Кофеин XL L-гистидин XLI

г

NH,

L-фенилаланпн XL1I

ОсГС

Триптофан XLIII

Тирозин XLIV

Па основании данных масс-спектрометрии по наличию пиков соответствующих комплексов сделаны заключения о формировании супрамолекулярных комплексов модельных фармаконов и тритерпеновых сапонинов плюща. Типичная картина масс-спектров (на примере смеси гликозидов XXXIV и XXXV с левомицетином) приведена на рисунке 39.

хо

кп

Рисунок 39. Масс-спектры отрицательных ионов смеси гликознда XXXIV и левомпцетина

Полученные с использованием масс-спектрометрин с ионизацией электрораспылением данные по формированию комплексов модельных фармаконов (XXXVII - ХИН) и сапонинов плюща XXX и XXXI, а также результаты по регистрации самоассоциацни и супрамолекулярных комплексов глпцнрризнновой кислоты и 9-диэтиламиноэтил-2,3-днгидроимидазо[1,2-а]бензимидазола показывают возможность и надежность установления структуры комплексов глицирризнновой кислоты и 9-диэтиламнноэтил-2,3-д11гидронмидазо[1,2-а]бензимидазола. Они свидетельствуют о том, что масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением является падежным индикатором комплексообразования и других подобных соединений.

¡MLl7.II]. 32102

[Ш-Н> 7*М

[М1*1.П.!Т.В> 1071«

выводы

1) Показано, что среда субкрнтической воды может быть эффективно применена для получения физиологически активных субстанций на основе растительных метаболитов. Среда субкрнтической воды использована для экстракции и химической модификации ряда полифенольных (кверцетин и дигндрокверцетин, цикорневая, кафтаровая и хлорогеновая кислоты), алкалоидных (глауцин) и тритерпеновых растительных метаболитов (глицирризиновая кислота, гликозиды аралии, глнкозиды плюща).

2) Среда субкрнтической воды использована для дизайна «спроектированных» смесей биофлавоноидов, имеющих фармацевтическое значение. Показано, что варьирование температуры и давлений позволяет получить в среде субкрнтической воды смеси биофлавоноидов, имеющие соотношение гликозидов и агликонов, отличное от натпвного состава растительной матрицы. Предлагаемый подход имеет значительный технологический потенциал и обеспечивает развитие экологически чистых методов глубокой переработки отходов сельскохозяйственного растительного сырья.

3) Впервые среда субкрнтической воды использована для экологически чистого синтеза глицирретиновон кислоты (агликона глицирризнновой кислоты) - соединения, обладающего широким спектром физиологической активности. Предлагаемый подход открывает широкие возможности для развития экологически чистых методов «полусннтетической» трансформации растительных метаболитов.

4) Впервые в среде субкрнтической воды осуществлена реакция изомеризации природного алкалоида апорфпнового ряда глауцина в фенантреновый алкалоид дес-глауцип, который имеет значительный потенциал для создания противокашлевых субстанции, не обладающих наркотическим эффектом. Также в среде субкритической воды реализована реакция синтеза макроциклнческпх соединений циклотрнвератрилена и циклотетравератрнлена -потенциальных «курьеров» при получении фармацевтически приемлемых низкодозных субстанций.

5) Разработаны методики изучения строения продуктов и анализа состава смесей, полученных как в результате экстракции из природных объектов, так и в ходе химических реакций в среде субкрнтической воды с использованием жидкостной хроматомасс-спектрометрии с ионизацией электроспреем.

6) С использованием квантово-химических расчетов и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением определено строение супрамолекулярных комплексов глицпрризпповой кислоты с модельным производным бензнмидазола и ее самоассоциатов.

7) Предложенный подход использован при изучении широкого набора супрамолекулярных комплексов тритерпеновых сапонинов плюща с модельными фармаконами. Показано, что масс-спектрометрня с ионизацией электрораспыленнем является надежным индикатором комплексообразоваиия этих и других подобных соединений.

Список основных публикаций по теме диссертации

Статьи в журналах списка ВАК н индексируемых в WoS и Scopus

1. Yakovishin L.A., Grishkovets V.I., Schroeder G. and Borisenko N.I. Molecular Complexation of Ivy Saponins with Some Drugs and Biologically Active Substances // Functionalized molecules -synthesis, properties and application. Edited by V. I. Rybachenko Donetsk 2010. Schidnyj Wydawnyczyj Dim. ISBN 978-966-317-076.

2. Borisenko S.N., Lekar' A.V., Vetrova E.V., Borisenko N.I. Mass spectrometry of supramolecular complexes of glycyrrhizic acid and benzimidazole derivatives И Chemistry of Natural Compounds. 2013. Vol. 49. Iss. 5. P. 969-971.

3. Lekar A.V., Borisenko S.N., Vetrova E.V., Sushkova S.N., Borisenko N.I. Extraction of quercetin from Polygonum liydropiper L. by subcritical water // American Journal of Agricultural and Biological Science. 2013. Vol. 9. Iss. 1. P. 1-5.

4. Лекарь А.В., Борисенко С.H., Филонова O.B., Ветрова Е.В., Максименко Е.В., Борисенко II.И., Минкин В.И. Экстракция кафтаровой и цикорисвон кислоты из эхинацеи пурпурной в среде субкритической воды // Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика. Т. 8. №> 1. 2013. С. 69-79.

5. Лекарь А.В., Милов А.А., Борисенко С.Н., Ветрова Е.В., Борисенко Н.И. Процессы самоассоцнации молекул глицирризнновой кислоты: масс-спектралыюе и квантовохимическое исследование II Вестник Южного научного центра. 2012. Т. 8. № 2. С. 18-26.

6. Yakovishin L.A., Lekar A.V., Vetrova E.V., Borisenko N.I., Borisenko S.N., Grishkovets V.I. Molecular complexes of the triterpene glycosides with ¿-tyrosine and their biological activity II Biopolymers and Cell. 2012. Vol. 28. № 1. P. 62-67.

7. Лекарь A.B., Филонова O.B., Борисенко C.H., Казьмина М.А., Ветрова Е.В., Борисенко Н.И., Минкин В.И. Извлечение биофлавопоидов из шелухи лука в среде субкритнческой воды // Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика. 2012. Т. 7. № 4. С. 5-14.

8. Яковншин Л.А., Гришковец В.И., Лекарь А.В., Ветрова Е.В., Борисенко Н.И., Борисенко С.Н. Молекулярное комплексообразование альфа-хсдерина с хедерасапоиииом С // Химия растительного сырья. 2012. № 3. С. 73-79.

9. Борисенко С.Н., Лекарь А.В., Филонова О.В., Ветрова Е.В., Борисенко Н.И. Масс-спектрометрия смесей биофлавопоидов, извлеченных из шелухи лука в среде субкритнческой воды // Масс-спектрометрия. 2012. Т. 9. № 2. С. 103-109.

10. Lekar' A.V., Yakovishin L.A., Vetrova E.V., Rudnev M.I., and Borisenko N.I. Mass Spectrometry of the Self-Association and Complexation of Triterpene Saponins and Cholesterol II Journal of Analytical Chemistr. 2011. Vol. 66. № 13. P. 44-48.

11. Lekar A.V., Vetrova E.V., Borisenko N.I., Yakovishin L.A., Grishkovets V.I., Borisenko S.N. Electrospray ionization mass spectrometry of mixtures of triterpene glycosides with L-phcnylalaninc // Journal of Applied Spectroscopy. 2011. Vol. 78. Iss. 4. P. 501 -505.

12. Яковпшин Л.А., Лекарь А.В., Борисенко С.H., Ветрова Е.В., Борисенко Н.И., Грншковсц В.И. Молекулярное комплексообразование сапонинов плюща с L-триптофапом // Химия растительного сырья. 2011. № 4. С. 65-70.

13. Лекарь А.В., Яковпшин Л.А., Борисенко С.Н., Ветрова Е.В., Борисенко Н.И. Комплексообразование антибиотика левомицетина (хлорамфепикола) с хедерипом и хедерасапоннном С в условиях ионизации олектрораспылением II Масс-спектрометрия. 2011. Т. 8. №2. С. 111-114.

14. Лекарь А.В., Ветрова Е.В., Борисенко И.И., Яковншин Л.А., Гришковец В.И. Масс-спектрометрия молекулярного комплексообразования трнтерпеновых глнкозидов с пуриновымн основаниями нуклеиновых кислот // Биоорганическая химия. 2011. Т. 37. № 5. С. 679-684.

15. Яковишин Jl.А., Лекарь A.B., Ветрова Е.В., Бориеенко H.H., Грншковец В.И. Молекулярные комплексы тритерпеновых гликозидов с ¿-гистидином и их биологическая активность II Biopolymers and Cell. 2011. Vol. 27. № 4. P. 300-305.

16. Лекарь A.B., Ветрова Е.В., Бориеенко Н.И., Яковишин Л.А., Грншковец В.И. Масс-спектрометрическое исследование молекулярного комплексообразования растительных гликозидов со стрептоцидом (сульфаниламидом) II Химия растительного сырья. 2011. № 2. С. 103-106.

17. Тихомирова К.С., Лекарь A.B., Бориеенко С.Н., Ветрова Е.В., Бориеенко Н.И., Минкин В.И. Получение глицирретиновой кислоты гидролизом экстракта корня солодки в среде субкритической воды // Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика. 2010. Т. 5. № 2. С. 21-27.

18. Yakovishin L.A., Borisenko N.I., Ruilnev M.I., Vetrova E.V., Grishkovets V.l. Self-association and complexation oftriterpene glycosides and cholesterol // Chemistry of Natural Compounds. 2010. Vol. 46. Iss. 1. P. 49-52.

19. Lekar A.V., Vetrova E.V., Borisenko N.I., Yakovishin L.A., Grishkovets V.l. F.lectrospray ionization mass spectrometry of mixtures triterpene glycosides with paracetamol // Journal of applied spectroscopy. Vol. 77. Iss. 5. P. 615-618.

20. Лекарь A.B., Яковишин Л.А., Ветрова E.B., Руднев МИ., Бориеенко II.И. Масс-спектрометрия самоассоциации н ко.чллексообразования тритерпеновых сапонинов и холестерина //Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7. № 3. С. 213-216.

21. Яковишин Л.А., Бориеенко H.H., Руднев М.И., Ветрова Е.В., Грншковец В.И. Масс-снектромегрпческое исследование самоассоциации кофеина и возможности его комплексообразования с тритерпеновыми глнкозидами II Химия растительного сырья. 2010. № 3. С. 67-70.

22. Бори сенко С.Н., Руднев М.П., Бориеенко Р.Н., Тихомирова К.С., Бориеенко Н.И., Ветрова Е.В., Зимаков Д.В. Масс-спектрометрия аралозидов, извлеченных в среде субкритической воды из корня аралии маньчжурской //Масс-спектрометрия. 2009. Т. 6. № 3. С. 187-190.

23. Бориеенко С.Н., Руднев М.И., Бичеров A.B., Рябцова О.В., Бориеенко Н.И., Ветрова Е.В., Минкин В.Н., Лекарь A.B. Продукты взаимодействия вератрола и параформа в среде субкритической воды // Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика. 2009. Т. 4. № 2. С. 65-70.

24. Бориеенко С.Н., Бичеров A.B., Павлюк О.В., Харабаев H.H., Бориеенко Н.И., Ветрова Е.В., Минкин В.И., Бориеенко Р.Н., Лекарь A.B. Разработка метода получения дес-глауцниа в среде субкритической воды // Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика. 2009. Т. 4. № 3. С. 3-6.

25. Бориеенко С.Н., Руднев М.П., Бориеенко Р.Н., Тихомирова К.С., Бориеенко Н.И., Ветрова Е.В., Макснмеико Е.В., Зимаков Д.В. Масс-спектроскопия экстрактов корня аралии маньчжурской в среде субкритической воды // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Серия: Естественные пауки. 2009. № 4. С. 51-54.

26. Филонова О.В., Бориеенко С.Н., Максименко Е.В., Бориеенко Р.Н., Лекарь A.B. Бориеенко H.H., Минкин В.И. Разработка методики экстракции дпгидрокверцетнна из древесины лиственницы в среде субкритической воды // Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика. 2008. Т. 3. № 2. С. 37-42.

27. Тихомирова К.С., Бориеенко Р.Н., Ветрова Е.В., Бориеенко С.Н., Максименко Е.В., Бориеенко H.H., Минкин В.И. Экстракция глицирризнновой кислоты из корня солодки в среде субкритической воды // Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика. 2008. Т. 3. № 3. С. 71-74.

Патенты РФ

28. Патент РФ на изобретение №2395484 "Способ получения циклотривератрилена", авторы Бичеров A.B., Ветрова Е.В., Борисенко Н.И., Борисенко С.Н.

29. Патент РФ на изобретение №2395488 "Способ получения фармацевтически приемлемых солей дес-глауцина", авторы Бичеров A.B., Борисенко Н.И., Борисенко С.Н., Ветрова Е.В.

30. Патент РФ на изобретение №2395516 "Способ получения сапонинов плюща", авторы Борисенко С.Н., Тихомирова К.С., Борисенко Н.И., Ветрова Е.В.

31. Патент РФ на изобретение №2395515 "Способ получения аралозидов аралии", авторы Борисенко С.Н., Максименко Е.В., Борисенко Н.И., Ветрова Е.В.

32. Патент РФ на изобретение №2385734 "Способ получения глицирретиновой кислоты", авторы Манджнева С.С., Борисенко С.Н., Тихомирова К.С., Борисенко Н.И., Ветрова Е.В.

33. Патент РФ на изобретение № 2333207 "Способ получения кверцетина", авторы Борисенко Н.И, Борисенко Р.Н.

Материалы Всероссийских и Международных конференции

34. Борисенко С.Н., Ветрова Е.В., Лекарь А.В., Сушкова С.Н., Яковишин Л.А., Борисенко Н.И. Исследование комплексообразования фармаконов различными сапонинами семейства аралиевых // Тезисы докладов Первой международной конференции серии ChemWasteChem: «Химия и полная переработка биомассы леса». Санкт-Петербург (Репино). 14-18 июня 2010. С. 143-144.

35. Borisenko S.N., Lekar A.V., Sushkova S.N., Vetrova E.V., Kazmina M.A., Mandzhiyeva S.S., N.I. Borisenko Investigation and extraction of saponins from the creepingivy in the subcritical water environment // In Abstracts: International Conference «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine». Saint-Petersburg. Russia. 21-24 June 2011. P. 31.

36. Borisenko S.N., Lekar A.V., Sushkova S.N., Vetrova E.V., Kazmina M.A., Mandzhiyeva S.S., Borisenko N.I. Mass-spectrometric research of the process of complexation of hederogenins with amino acids // In Abstracts: International Conference «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine». Saint-Petersburg. Russia. 21-24 June 2011. P. 32-33.

37. Lekar A.V., Borisenko S.N., Yakovishin L.A., Grishkovets V.I., Borisenko N.I., Mandzhieva S.S., Sushkova S.N., Kazmina M.A. Molecular complexation of paracetamol with triterpene glycosides // In Abstracts: International Conference «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine». Saint-Petersburg. Russia. 21-24 June 2011. P. 269.

38. Lekar A.V., Sushkova S.N., Borisenko S.N., Mandzhieva S.S., Borisenko N.I., Vetrova E.V. Identification of aralosides in aralia mandshurica extract obtained in subcritical water environmentby high performance liquid chromatography and mass spectrometry // In Abstracts: International Conference «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine». Saint-Petersburg. Russia. 21 -24 June 2011. P. 286 - 287.

39. Борисенко Н.И., Лекарь A.B., Ветрова E.B., Борисенко С.Н., Минкин В.И. Развитие методологии использования субкритическон воды для получения физиологически активных субстанций // Сборник тезисов VI Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов. Ростов-на-Дону. 31 августа-4 сентября 2011. С. 26-27.

40. Лекарь А.В., Сушкова С.Н., Борисенко С.Н., Манджнева С.С., Борисенко Н.П., Ветрова Е.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрня растительных экстрактов, полученных в среде субкритической воды // Сборник тезисов VI Международной конференции по

новым технологиям н приложениям современных физико-химических методов. Ростов-на-До/iy. 31 августа-4 сентября 2011. С.60.

41. Лекарь A.B., Борпсенко Н.И., Ветрова Е.В., Борпсенко С.Н. Масс-спектрометрия с электроспрей ионизацией в развитие методологии использования субкритической воды и суперкритических флюидов для получения низкодозных фармсубстаций // Сборник тезисов VI Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов. Ростов-на-Дону. 31 августа-4 сентября 2011. С. 113 - 114.

42. Яковишин Л.А., Гришковец В.И., Лекарь A.B., Ветрова Е.В., Борисенко Н.И., Борисенко С.Н., Яровой И.Р., Белаш Д.Ю. Молекулярное комплексообразованне а-хедерина с хедерасапонином С // Сборник тезисов VI Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов. Ростов-на-Дону. 31 августа-4 сентября 2011.С. 127-128.

43. Филонова О.В., Лекарь A.B., Максименко Е.В., Борисенко Н.И., Казьмина М.А., Гусакова М.Ю. Разработка методики выделения биофлавоноида кверцетина из шелухи лука в среде субкритнческой воды // Сборник тезисов VI Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов. Ростов-па-Дону. 31 августа-4 сентября 2011.С. 142.

44. Лекарь A.B., Борисенко H.H., Ветрова Е.В., Яковишин Л.А., Борисенко С.Н., Гришковец В Н. Масс-спектрометрия молекулярного комнлексообразования парацетамола с тритерпеновыми гликозидамп // Сборник тезисов VI Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов. Ростов-на-Дону. 31 августа-4 сентября 2011. С. 189.

45. Борисенко С.Н., Лекарь A.B., Милов A.A., Бнчеров A.A., Ботова О.Ю., Борисенко H.H. Масс-спектрометрия и квантовохпмическое исследование процессов самоассоцнации молекул глицирризиновой кислоты // Сборник тезисов IX всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия координационных соединений». Туапсе. 13-19 сентября 2012. С. 39-40.

46. Филонова О.В., Лекарь A.B., Борисенко С.Н., Максименко Е.В., Борисенко H.H. Масс-спектрометрпя молекулярного комплексообразованпя глицирризиновой кислоты с антибиотиком левомицетнном // Сборник тезисов IX всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия координационных соединений». Туапсе. 13-19 сентября 2012. С. 148-149.

47. Сушкова С.Н., Лекарь A.B., Филонова A.B., Борисенко С.Н., Максименко Е.В., Борпсенко H.H. Масс-спектрометрия молекулярного комплексообразованпя глицирризиновой кислоты и снмвастатина // Сборник тезисов IX всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия координационных соединений» Туапсе. 13-19 сентября 2012. С.150-151.

48. Лекарь A.B., Борисенко С.Н., Казьмина М.А., Бнчеров A.A., Филонова О.В., Сушкова С.Н., Борисенко H.H. Субкрнтическая вода как среда экстракции хлорогеновой кислоты из зерен зеленого кофе // Материалы Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Сверхкритические флюидные технологии в решении экологических проблем. Экстракция растительного сырья». Архангельск. 25 - 27 нюня 2012. С. 87-89.

49. Лекарь A.B., Борисенко С.Н., Казьмина М.А., Филонова О.В., Борисенко II.II. Разработка методики экстракции хлорогеновой кислоты в среде субкритической воды из сабельника болотного // Материалы «VIII Международной конференции Актуальные вопросы биологической физики и химии БФФХ-2012». Севастополь. 23-27 апреля 2012. С. 275-276.

50. Борисенко C.II., Тихомирова К.С., Руднев М.И., Борисенко Н.И., Рыбаченко В.И., Шредер Г. Масс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия экстрактов корня аралии маньчжурской, полученного в среде субкритической воды // Материалы V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов. Ростов-на-Дону. 15 нюня 2009. С. 104.

51. Борисенко С.П., Тихомирова К.С., Руднев М.И., Борисенко H.H., Рыбаченко B.II. Разработка методов определения аралозпдов в экстракте корня аралии маньчжурской, полученного в среде субкритнческой воды // Материалы V Международной научно-практической конференции «Сверхкритнческие флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации». Суздаль. 15-18 сентября 2009. С.62.

52. Борисенко С.Н., Бнчеров Л.В., Павлгак О.В., Борисемко Н.И., Ветрова Е.В., Минкии В.И. Синтез дее-глауцина в еубкритической воде // Материалы IX Международного Семинара по магнитному резонансу. Ростов-на-Дону. 15-20 сентября 2008. С. 83.

53. Борисенко С.Н., Рябцова О.В., Бнчеров A.B., Руднев М.И., Борисенко Н.И., Ветрова В.В., Блохина В.Г., Миикнн В.И. Синтез циклотривератрилена в субкритической воде // Материалы IX Международного Семинара по магнитному резонансу. Ростов-на-Дону. 15-20 сентября 2008 С. 84.

54. Борисенко Н.И. Немазанная H.A., Рябцова О.В., Бнчеров A.B., Борисенко С.Н., Блохнна В.Г., Борисенко Р.Н., Шредер Г., Рыбаченко В.И. Изучение взаимодействия вератрола с параформом в среде субкритической воды // Материалы IV Международной Конференция по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов. Ростов-на-Дону. 18-22 сентября 2007. С. 167.

55. Борисенко С.Н., Максименко Е.В., Борисенко Н.И., Шредер Г., Рыбаченко В.И., Борисенко Р.Н. Получение кверцетина гидролизом рутина в субкритической воде // Тезисы докладов III Международной научно-практической конференции «Сверхкритические флюидные технологии: инновационный потенциал России». Ростов-на-Дону. 11-12 октября 2006. С. 9.

Псм;пi. цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». <1>ормаг 60x84/16. Объем 2,0 уч.-пчд.-л. Заказ №3.493. Тираж 100 на. Отпечатано и КМЦ «КОП11ЦЕ1ПТ» 344006, г. 1'остоп-иа-Допу, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Научно-исследовательский институт физической и органической химии федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Южный федеральный

университет"

0520.l45 2.IbG

авах описи

Борисенко Николай Иванович

РАЗВИТИЕ МЕТОДОЛОГИИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СУБКРИТИЧЕСКОЙ ВОДЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУБСТАНЦИЙ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ

МЕТАБОЛИТОВ

02.00.04 - физическая химия

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

Научный консультант

академик РАН Минкин В.И.

Ростов-на-Дону - 2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................4

Глава 1 Теоретические и экспериментальные основы применения суб- и сперкритических флюидных сред для экстракции и модификации биологически активных соединений...............................................................11

1.1 Основные этапы развития химии и физики сверхкритических сред ..............................................................................................................................11

1.2 Суб- и суперкритические флюиды как среда для экстракции и модификации биологически активных соединений.................................18

1.2.1 Экологически чистые процессы экстракции растительных метаболитов, основанные на свойствах суперкритических флюидов и среды субкритической воды..........................................................................18

1.2.2 Экологически чистые процессы экстракции биологически активных соединений, основанные на свойствах субкритической воды..................30

1.2.3 Основные направления использования субкритической воды как среды и реагента для органических реакций...............................................42

Глава 2. Субкритическая вода как среда для экстракции биологически активных растительных метаболитов и получения их «спроектированных» смесей.............................................................................51

2.1 Разработка экологически чистых методов (без использования органических растворителей) экстракции и химической модификации в среде субкритической воды растительных метаболитов, имеющих фармацевтический и коммерческий потенциал.......................................51

2.1.1 Экстракция биофлавоноидов из растительного сырья......................51

2.1.2 Эстракция фенилкарбоновых кислот в среде субкритической воды

..........................................................................................................................72

2.1.3. Экстракция тритерпеновых растительных метаболитов.................98

2.2. Исследование состава «спроектированных» в среде субкритической воды смесей растительных метаболитов...................126

Глава 3 Гидролитические трансформации модельных растительных

метаболитов........................................................................................................142

3.1. Гидролиз растительных метаболитов в среде субкритической воды

............................................................................................................................142

3.1.1. Разработка метода гидролиза рутина в кверцетин в среде

субкритической воды...................................................................................142

3.1.2 Разработка и изучение метода гидролиза экстракта корня солодки в среде субкритической воды........................................................................147

3.2 Изомеризация модельных растительных метаболитов в среде субкритической воды....................................................................................157

3.3 Реакция конденсации в среде субкритической воды: синтез циклотривератрилена...................................................................................164

►

Глава 4. Изучение комплексообразования тритерпеновых растительных метаболитов при помощи методов масс-спектрометрии..........................171

4.1. Самоассоциация и комплексообразование глициризиновой кислоты............................................................................................................171

4.1.1 Процессы самоассоциации молекул глициризиновой кислоты: квантовохимическое и масс-спектрометрическое исследование............171

4.1.2 Квантово-химическое и масс-спектральное исследование тримолекулярных комплексов молекул модельного производного бензимидазола и глицирризиновой кислоты.............................................183

4.2. Самоассоциация и комплексообразование тритерпеновых сапонинов плюща..........................................................................................198

4.2.1. Масс-спектрометрия самоассоциации и комплексообразования

тритерпеновых сапонинов плюща и холестерина....................................198

4.2.2 Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением супрамолекулярных комплексов модельных фармаконов и тритерпеновых сапонинов плюща..............................................................209

ВЫВОДЫ............................................................................................................249

Список сокращений...............................

Список использованных источников

251 253

ВВЕДЕНИЕ

Развитие методологии использования экологически безопасных методов экстракции и химической модификации для получения физиологически активных субстанций из источников растительного происхождения - одно из приоритетных направлений современной химии. Замена токсичных органических растворителей на экологически чистые суб-и суперкритические жидкости и флюиды, такие как С02 или вода, соответствует основным принципам и перспективным подходам к решению задач Зеленой химии. В последнее десятилетие, для экстракции и химической модификации биологически активных соединений активно используется субкритическая вода (вода в жидком состоянии под давлением при температурах от 100°С до 374°С). По мнению академика РАН В.В.Лунина, «...в конце 20-го и начале этого века химия жидкостей в суб- и суперкритических состояниях - одна из самых бурно развивающихся областей химической науки» [1]. Это подтверждается динамикой патентования технологий процессов основанных на суб- и сверхкритических флюидах транснациональными корпорациями, такими, как BASF, DuPont, Exxon и др. [Supercritical Fluids and Applications - A Patent Review // Chem. Eng. Technol. 2007, 30, No. 6].

о 1SO

Суб- и сверхкритическая вода Незавершенная * Реакции (без воды) регистрация д

Экстракция #

Формирование частиц Импрегнация

4

* В

»

wC'"

1980

1990

Рисунок 1. Динамика патентования технологий процессов основанных на суб- и сверхкритических флюидах транснациональными корпорациями

Для России, с ее богатейшими растительными ресурсами, возможность использования субкритической воды в технологических процессах чрезвычайно актуально и имеет огромное практическое значение, особенно с учетом экологической чистоты, доступности и дешевизны воды (по сравнению с традиционными токсичными и дорогостоящими органическими растворителями). В связи с чем исследования, нацеленные на разработку экологически чистых методик экстракции и химической модификации биологически активных соединений в среде субкритической воды, имеют огромный практический и инновационный потенциал.

Особое место среди исследований последнего десятилетия занимают работы, основанные на использовании свойств субкритической воды для процессов экстракции и химической модификации, в которых вода выступает и как среда реакции, и/или как катализатор и/или как реагент. Это обусловлено такими уникальными свойствами субкритической воды как зависимость величин диэлектрической проницаемости и ионного произведения от температуры и давления. Разработка методик экстракции и химической модификации биологически активных соединений в среде субкритической воды весьма актуальна, особенно с учетом экологичности, доступности и дешевизны воды.

С другой стороны, современное состояние медицинской химии диктует необходимость развития как методов тонкого синтеза для получения новых синтетических лекарственных субстанций, так и более эффективного использования уже имеющихся в наличии фармацевтических субстанций, за счет увеличения их биодоступности и реализации различных методов доставки фармсубстанций. Одним из методов, обеспечивающих уменьшение эффективных доз лекарственных препаратов в 100 - 200 раз, направлен на дизайн низкодозных супрамолекулярных фармсубстанций на основе известных и хорошо зарекомендовавших себя фармацевтических препаратов.

Цели работы: Развитие и изучение методов экстракции и химической модификации в среде субкритической воды растительных метаболитов,

имеющих фармацевтический и коммерческий потенциал, установление состава и свойств полученных продуктов с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением и других современных физико-химических методов (спектроскопии ЯМР, ИК и т.д.).

Задачи исследований:

1) Разработка и изучение экологически чистых методов (без использования органических растворителей) экстракции и химической модификации в среде субкритической воды растительных метаболитов, имеющих фармацевтический и коммерческий потенциал.

2) Разработка методов определения состава и свойств растительных экстрактов с использованием комплекса физико-химических методов.

3) Изучение строения и устойчивости супрамолекулярных комплексов тритерпеновых растительных метаболитов и модельных фармаконов при помощи методов квантовой химии.

4) Разработка методов использования масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением для изучения строения и свойств супрамолекулярных комплексов на базе модельных фармаконов.

Научная новизна.

Впервые среда субкритической воды систематически использована для экстракции и химической модификации ряда полифенольных, алкалоидных и тритерпеновых растительных метаболитов:

а) впервые разработаны методики для извлечения ряда тритерпеновых сапонинов растительного происхождения: глицирризиновой кислоты из корня солодки; аралозидов из аралии манчжурской и сапонинов плюща -физиологически активных растительных метаболитов, имеющих значительный фармацевтический потенциал.

б) впервые среда субкритической воды использована для синтеза глицирретиновой кислоты - физиологически активного соединения, которое широко используется в медицинской практике;

в) впервые предложено среду субкритической воды использовать при получении из «спроектированных» смесей биофлавоноидов шелухи лука, имеющих значительный фармацевтический потенциал;

Впервые в среде субкритической воды реализована реакция изомеризации природного алкалоида апорфинового ряда глауцина в фенантреновый алкалоид дес-глауцин, имеющий значительный потенциал для создания противокашлевых субстанций, не вызывающих наркотического эффекта.

Впервые в среде субкритической воды реализована реакция синтеза макроциклических соединений циклотривератрилена и

циклотетравератрилена - потенциальных «курьеров» при получении фармацевтически приемлемых низкодозных субстанций.

Впервые с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением зарегистрировано образование самоассоциатов глицирризиновой кислоты, строение которых предсказано при помощи методов квантовой химии. Предложенные методики масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением использованы для изучения строения супрамолекулярных комплексов тритерпеновых сапонинов (глицирризиновой кислоты солодки и хедерагенинов плюща) с модельными фармаконами.

Практическая ценность работы. Реализованы принципиальные преимущества использования среды субкритической воды для извлечения физиологически активных растительных метаболитов из группы биофлавоноидов и тритерпеновых сапонинов.

Разработаны методы изучения строения продуктов и анализа состава смесей, полученных как в результате экстракции из природных объектов, так и в ходе химических реакций в среде субкритической воды, с использованием жидкостной хроматомасс-спектрометрии с ионизацией электроспреем.

Предложены экологически безопасные методы получения физиологически активных биофлавоноидов в среде субкритической воды, обладающих широким спектром терапевтического действия (антиоксидантное, капилляроукрепляющее действие и др.), присущего как индивидуальным веществам из группы флавоноидов, так и их смесям, что позволяет создавать на их основе большое число лекарственных форм. Предлагаемые методы экстракции и синтеза в среде субкритической воды, как правило, более эффективны и экологически безопасны по сравнению с традиционными подходами, основанными на использовании дорогостоящих и, зачастую, токсичных органических растворителей. Предлагаемые подходы открывают возможности получения перспективных с фармакологической точки зрения соединений в экологически чистых реакционных средах.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на III Международной научно-практической конференции "Сверхкритические флюидные технологии: инновационный потенциал России", (Ростов-на-Дону; 11-12 октября 2006); IX Международном Семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография, экология) 15-20 сентября 2008 год; V Международной научно-технической конференции "Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии. БФФХ-2009", (Севастополь, 21-25 апреля 2009); IV, V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов (Ростов-на-Дону, 18-22 сентября 2007, 1 - 5 июня 2009), V Международной научно-практической конференции «Сверхкритические флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации» (Суздаль, 15-18 сентября 2009); III Всероссийской конференции «Аналитика России» (г. Краснодар, 27 сентября - 2 октября 2009 г.), X Международном Семинаре по Магнитному Резонансу г. Ростов-на-Дону, 2-7 марта 2010, VI Международной научно-техническая конференция "Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии", Украина, г. Севастополь, 26 - 30 апреля 2010, I международной конференции серии

ChemWasteChem: "Химия и полная переработка биомассы леса", Санкт-Петербург (Репино), 14-18 июня 2010 г, IV всероссийской конференции-школы: "Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и её аналитические применения" Звенигород, 10-14 октября 2010, 12th International Symposium MATERIALS, METHODS & TECHNOLOGIES (MMT), Sunny Beach, Bulgaria June 11 - 15, 2010, VII Международной научно-технической конференции "Актуальные вопросы биологической физики и химии". Севастополь. Украина. 26 - 30 апреля 2011, Всероссийской научной конференции (с международным участием) "Успехи синтеза и Комплексообразования", г. Москва, 18 по 22 апреля 2011, International Conference "Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine". Санкт-Петербург, 21-24 июня 2011. VI Научно-практической конференции «Сверхкритические флюиды (СКФ): фундаментальные основы, технологии, инновации». Иркутск, 4-7 июля 2011 г, VI Международная конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов, Ростов-на-Дону, 31 августа - 4 сентября 2011, VIII и IX Всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия координационных соединений», г. Туапсе, Краснодарский край, Россия 19-23 сентября 2011, 13 - 19 сентября 2012, VIII Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ- 2012»,Севастополь, 23 - 27 апреля 2012.

Работа выполнена при поддержке грантов президента РФ ведущих научных школ (НШ-363.2008.3, НШ-3233.2010.3, НШ-927.2012.3), грантов Министерства образования и науки РФ (РНП 2.2.2.23915 и 2.1.1.4939), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF США) по Российско-американской программе "Фундаментальные исследования и высшее образование" (гранты CRDF ВРЗС04, ВР4М04) и грантов РФФИ (11-03-12141-офи-м-2011).

По материалам диссертации опубликовано 49 работ, включая 27 статей в рецензируемых российских (список ВАК) и зарубежных журналах, 22

работы опубликовано в материалах и тезисах докладов Международных и Всероссийских конференций. Получено 6 патентов РФ.

Личное участие автора. Автору принадлежат замысел, формулировка задач исследования, обоснование выбора объектов, необходимых для решения поставленной задачи; автор разрабатывал направление научного поиска, руководил постановкой экспериментов, принимал личное участие в работе по экстракции и модификации растительных метаболитов в среде субкритической воды и проведению масс-спектрометрического эксперимента.

Глава 1 Теоретические и экспериментальные основы применения суб- и сперкритических флюидных сред для экстракции и модификации биологически активных соединений

1.1 Основные этапы развития химии и физики сверхкритических сред

Известно, что температура кипения любой жидкости зависит от давления: чем больше давление, тем выше температура кипения. Например, для чистой воды температура кипения в обычных условиях (при атмосферном давлении) составляет 100°С, а при давлении 150 атм - 340 °С. При повышении давления свыше 225 атм процесс «кипения» воды уже не наблюдается. Пределом, к которому стремится температура кипения жидкости, и называется критической температурой; давление, которое соответствует данной температуре, называется критическим.

К примеру, значение критической температуры для воды равно 374°С, а значение критического давления составляет 218 атм. В указанных условиях исчезают различия между жидкой водой и паром, таким образом исчезает граница раздела фаз между жидкостью и паром. Данное явление открыто и