Кинетика и механизм бисубстратных пероксидазных реакций тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 од

г о сен доз

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ Институт (Зиоорганической химии

На правах рукописи

ЛИТВИНЧУК Александра Васильевна

УДК 577.152.193:57.037.

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ БИСУБСТРАТНЫХ ПЕРОКСВДАЗНЫХ РЕАКЦИИ

02. СО. 10 - <5иоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Минск - 1993

Работа выполнена в лаборатории прикладной энзимологии 1Ьститута биеюрганической хинии АН Беларуси

Научный руководитель -

Официальные оппонента -

доктор химических наук, профессор Д.И. Метелица

доктор химических наук ПА. Киселев

кандидат биологических наук В. П. Курченко

Ведущая организация - Химический факультет Московского государственного Университета иы. К.В. Ломоносова, кафедра химической энзимологии

Защита диссертации состоится "30" д 993 года на

заседании специализированного совета Д оое.22.01 при

Институте биоорганической химии АН Беларуси по адресу: 220141.. г.Шнек, ул. Жэдинская, 5/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии АН Беларуси

Автореферат разослан "Ос&ьус^О: 1ээз года.

Ученый секретарь специализированного совета, __

кандидат химических наук Н.М. Литвинко

- з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Исследования кинетики и механизма действия пероксидаз обусловлены прикладными цепями их использования в иммуноферментном анализе (ИФА) и фундаментальными проблемами катализа окислительно-восстановительных реакций гем-со-держащими белками. Пероксидаза хрена (ИХ) наиболее широко используется в качестве маркера в методах ИФА.

ИФА представляет собой одну из важнейших областей биотехнологии. Особенно актуальное задачей является создание гомогенных методов ИФА. В 1985 году японскими исследователями разработан гомогенный ИФА сАфетопротеина с использованием перокси-дазного окисления пары субстратов - 4-аминоантипирина и фенола

- в условиях избытка перекиси водорода, когда антитела против анализируемого антигена снимают ингибирование пероксидазного конъюгата избытком окислителя. Реакции совместного каталитического окисления 4-аминоантипирина (ААГО и 4-диметиламиноан-типирина (ДМААП) с фенолом мало изучены, хотя давно используются в аналитической химии.

В этой связи актуальной задачей является изучение кинетики и механизма сопряженного окисления аминов и фенолов, катализируемого ПХ и ее иммунными комплексами, при разных концентрациях окислителя - перекиси водорода.

Расширение круга субстратов ПХ позволит выбрать наиболее приемлемые для анализа пары, так как важным для практики является создание чувствительных гомогенных ИФА и других аналитических методов.

Весьма актуальной является такав проблема модуляции белками реакционной способности гема. В связи с этим особый интерес представляет исследование влияния антител на пероксидазу в катализированных ею реакциях.

Цели исследования состояли в следующем:

- изучить кинетику и механизм пероксидазного деметилирования третичных аминов;

- изучить кинетику и механизм пероксидазного сопряженного окисления фенолов с 4-аминоантипирином и п-йодфенола с люмино-лом в широком диапазоне концентраций перекиси водорода;

- исследовать влияние специфичных антител к пероксидазе на процессы сопряженного пероксидазного окисления аминов и

фенолов при разных концентрациях перекиси водорода;

- разработать с использованием бисубстратных реакций пероксидазы гомогенный имыуноферыентный анализ иммуноглобулинов О человека.

Положения выносимые на защиту:

- проведение сравнительного пероксидазного демэтилирования третичных аминов <4-аминоантипирина, 4-диметиламиноантипирина и диметиланилкна <ДМА>);

- исследование кинетики и механизма совместного окисления пероксидазой аминов (МП, ДМААП и ломинола) с галоидзамещенны-ки фенолами;

- изучение влияния специфических к пероксидазе поликлональных и моноклональкьа антител на реакции совместного пероксидазного окисления пар "ААП - фенолы" и "ломинол - п-йодфенол" в широком интервале концентраций перекиси водорода;

- изучение влияния избытка перекиси водорода на константу диссоциации пероксидазы на гем и апобелок;

- разработка гомогенного хемилвминесцентного ИФА иммуноглобулинов О человека с использованием пары "люминол - п-йодфенол".

Научная новизна. Методом остановленной струи измерены константы скорости элементарных стадий окисления 4-аминоантипири-на с участием пероксидазы и ее иммунного комплекса.

Предложен механизм совместного пероксидазного окисления 4-аминоантипирина и фенолов, в котором главная роль принадлежит неферментативным реакциям регенерации фенолят-ионов аминами.

Доказано, что константа диссоциации пероксидазы на гем и апобелок с увеличением концентрации перекиси водорода сильно возрастает, а образование иммунных комплексов пероксидазы с поликлональныыи антителами предотвращает диссоциацию фермента и сохраняет его каталитическую активность в реакции сопряженного окисления пар "ААП - фенолы" и "лвминол - п-йодфенол".

Разработан хемилюминесцентный иммуноферментный анализ иммуноглобулинов О человека на основе сохранения пороксидазной активности иммунного комплекса конъюгата ПХ-1дО с антителами, специфичными к 1^0, при высоких концентрациях перекиси водорода в реакции сопряженного окисления люминола с п-йодфенолом.

Практическая значимость. Доказано, что образование продукта

при сопряженном пероксидаэнсм окислении 4-аминоантштрина и фенола лимитируется скоростью окисления фенола и эта реакция может быть успешно использована для количественного определения фенолов в аналитических методах.

Применение 4-диметиламиноантипирина в качестве аминной компоненты в реакции совместного пероксидазкого окисления аминов и фенолов для аналитических целей нецелесообразно в связи с малой скоростью деметилирования этого амина.

Реакция совместного пероксидазного окисления 4-аминоантипи-рина и п-йодфенола успешно применена в твердофазном иммунофер-ментном анализе кортизола с использованием набора реактивов "ИФА - КОРТИЗОЛ-АС", разработанного в лаборатории прикладной энзимологии Института биоорганической химии АН Беларуси,

Пероксидазное окисление пары субстратов "люминол - п-йодфе-нол" при избытке перекиси водорода использовано в гомогенном хемилюминесцентном иммуноферментном анализе иммуноглобулинов О человека.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и представлены на VII Международной конференции молодых ученых по органической и биологической химии, (Варна, Болгария,1390); VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимслогия" (Москва, 1991); Международном симпозиуме по биотехнологии "Новое поколение моноклональных антител в диагностике и терапии" (Генуя, Италия, 19323; VIII Международном симпозиуме по гомогенному катализу САмстердам, Голландия, 199^>.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 1 статей и тезисы 4-х докладов.

Структура и обгем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы С1 глава), экспериментальной части С4 главы), выводов, списка опубликованных работ и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 195 страницах, содержит 29 рисунков и 13 таблиц. Библиография - 185 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Объект исследования -, пероксидаза грена, ее иммунные комплексы с поликлональными и моноклональными антителами, конъю-гат пероксидазы с иммуноглобулинами О человека.

- & -

В работе использозали пероксидазу хрена CBZ=2.7) производства "Биолар" СОлайне, Латвия). Поликлональнув антисьгворотку к пероксидазе и IgG получали иммунизацией кроликов, смесью 1 мл ПХ или IgO в 0.5 мл физиологического раствора и 0.5 мл полного адъюванта фрейнда. Моноклональные антитела, специфичные к пероксидазе (ZC.3E.S&), были предоставлены канд. хим. наук Т. В. Чередниковой СИнститут биохимии им. А. Н. Баха, РАН). Иммуноглобулины О человека получены из сыворотки крови путем осаждения насыщенным раствором сульфата аммония, хроматографирова-яы на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой и тестированы по Уохтерлони. Конызгат пероксидазы хрена с IgC человека синтезирован мета-перйодатным способом, очищен гелъфильтрацией на колонке с се-фадексоы в-ISO.

Реакции окислительного деметилирования третичных аминов проводили в термостате. Какцентрацис образующегося формальдегида определяли по методу Наша,

Сопряженное окисление А АЛ и ДМААЛ с фенолами проводили в термостатированной кювете прибора "Sptkcl-211", образующиеся антипирилхинонимины определяли спектрофотометрически, используя коэффициенты молярной экстинкции, определенные экспериментально в данной работе.

. Сопряженное окисление люминола и фенола проводили в термостатированной ксвете флуориметра марки ФМ-Ц-2, который использовали в режиме лолшометра для регистрации хемилюминесценции с помощьс двухкоординатного самописца, выражая интенсивность хемилюминесценции CI) в условных единицах, соответствующих показанию рекордера в вольтах.

Для определения констант скорости элементарных стадий перок-сидазного процесса в работе использовали установку "остановленной струи" КД-401 СUnion Giken, Япония). Спектрофотометри-ческие измерения проводили в изосбестической точке форм ПХ Е и

Е, CV,„=426hm). Б работе испльзовали такие концентрации pea-х макс

гентов, которые обеспечивали псевдопервый порядок реакции по субстрату - восстановителю. Концентрация пероксидазы составля-

е

ла 10 М. В случае изучения кинетики реакции восстановления Е^ и Е^ выбирали концентрацию перекиси водорода, намного большую концентрации фермента С10"3Ю, а в случае изучения кинетики восстановления Е, до Е концентрация раствора перекиси водорода

выбиралась равной начальной концентрации фермента. Концентрации ААП варьировали в диапазоне,- ограниченном необходимостью выполнения условия псевдопервого порядка реакции по субстрату и невозможность» регистрации быстрых процессов, выходящих за "мертвое время" установки.

Ферментативную активность характеризовали начальными скоростями реакций в М/с, а кинетические характеристики получали из трансформации зависимостей начальных скоростей реакции от начальных концентраций субстратов по методу Лайнуивёра-Берка.

КИНЕТИКА ПЕРОКСИДАЭНОГО ОКИСЛЕНИЯ ПАР СУБСТРАТОВ Пероксидазное деметилирование третичных аминов Сдиметиланилин, 4-аминоантипирян, 4-диметиламиноантипирин) Окислительное деметилирование третичных аминов происходит при воздействии на них перекиси водорода или органических гидроперекисей в сочетании с различными гемопротеидами. Деметилирование ДМААП представляет интерес в связи с широким применением этого анальгетика.

Главной задачей исследования было получение количественных характеристик пероксидазного деметилирования ДМА, ДМААП и ААП, различающихся окружением третичного азота.

СН.

Й2н

==/ СН,

СН,

СНо

С6Н3

ДМА

к=н : ААП и=сн, : ДМААП

Таблица 1. Кинетические параметры пероксидазного деметюгеро-вания ДМА С0.1 ыкМ ПК) и ЛМААП СО. 02 мхМ ПХ) при 25°и рН 7.0

Субстрат (8) У107, М/с 1о3'КН' « | *кат< С_1

по 8 по И202 . по 8 по Н202 по в по Н202

ДМА ДМААП 3.70 0.28 10.00 1.25 0.20 16.6 2.50 0.43 3.70 1.43 10.00 6.25

Для превращения обоих субстратов характерно ингибирование большими концентрациями окислителя: в случае ДМА при Н^О^ > .1.0 мМ и в случае ДМААП при Н^ > 0.4 мМ. В аналогичных условиях ДМА деметилируется в 2.6 раза быстрее, чем ДМААП.

. Изучение деметилирования ААП при 25°С и начальных концентрациях реагентов ПХ - 0.1 мкМ, Н£02 - 1.0 мМ и ААП - 0.05 М показало, что этот цроцеср мало зависит от рН Св интервале 5. 0 -7.0), сильно самотормозится и происходит до небольших глубин превращения субстрата, составлявших 0.37/, т.е. деметилирова-ние третичного азота в положении 2 .молекулы ААП сильно затруднено в условиях пероксидазной трансформации этого субстрата.

На примере ДМА изучено влияние температуры в интервале 11 -40°С на скорость деметилирования при окислении этого субстрата. Линейному участку на Аррениусовской зависимости каталитических констант соответствует энергия активации, равная С15.4± 2.0) ккал/моль.

Возможные пути окислительного деметилирования третичных аминов представлены в виде схемы ПК см. стр.9).

По этой схеме первый электрон получает сильный окислитель -соединение I, образующееся по реакции ПХ с перекисью водорода: £КеОН233* + Н202?=г £Ге013+ + 2Н20 С1> <ЕХ>

ГТе013+ ♦ е~—»[Ге0]2+ С2)

<*2>

Е^ отрывает атом Н от аминиум катион-радикала XI по реакции 3: £й»03г+ ♦ Н + Н+—* 1Гв3*3 + К20 (3)

исходный фермент

Схема 1.

. +

В - И"

8 - И

СН».

аминиум катион-радикал -

СН,

СН,

нейтральный радикал

иминиум-(IV) катион

Е - Н (V)

2

\

К - N

♦ Я - С

СН

3

карбиноламин

СНз

\и

Соединение Е^ является намного более сильным .окислителем, чем Е^, поэтому лимитирующей стадией всего процесса может быть отрыв атома водорода от аминиум катион-радикала II, Это подтверждается значениями внутримолекулярных изотопных зффектов при окислении ДМА разными формами пероксидазы С8.72-10.0), т. е. в лимитирующей стадии происходит отрыв атома водорода. Второй путь процесса с отрывом Н на первой стадии менее вероятен из-за больших прочноотей С-Н - связей в метильных группах третичного амина I, Мы считаем более вероятным первый путь реакции с переносом электрона от амина I на Е^ и образование аминиум катион-радикала II.. В этом случае более высокая реакционная способность ДМА в сравнении с ДМААП -объясняется более высокой основностью ДМА. Причин низкой реакционной способности ААП в процессе пер'оксидазной трансформации может быть две: во-первых, основность третичного азота в положении 2 по- нижена, во-вторых, с Е^ может легко реагировать' свободная НН2 - группа в молекуле ААП, чем объясняется сильное торможение окислительного деметшшрования ААП в процессе перо-ксидазной трансформации.

Особый интерес представляет совместное окисление третичных аминов с легкоокисляемыми субстратами ПХ - фенолами.

- 11» -

Кинетика сопряженного пероксидазного окисления фенола с 4-аминоантипиринами СДАП, ДМААГО Параметры совместного окисления ЛАП и фенола пероксидазой представлены в таблице 2.

Таблица 2. 'Кинетические параметры сопряженного пероксидазного окисления фенола с :4-аминоантипиринами при 25°С в среде 0.1 М фосфатного буфера с рН 7.0: СО. 10-10.00 мМ фенола, 0.43 мМ перекиси водорода, ПХ - 1.0 кМ в реакции с ААП и 20.0 нМ в реакции с ЛМААП.

Амин и его концентрация мкМ Ю7 V, М/с 103 ки, N к с"1 кат' с

ААП 100.0 г.оо 2. SO 200

500.0 4.00 4.00 400

1009.0 4.00 . 4.00 400

ДМААП 0.01 1.« 0.80 7.35

1.00 1.43 0.80 7.35

100.0 3,70 г. 92 10.50

ДМААП в ходе пероксидазного процесса деметилируется: ДМААП ♦ га^ ■ ^ > ААП + ШгО + 2Н2С0 .

Образовавшиеся при пероксидазком окислении фенола радикалы РЛО' реагируют с амином и даст регистрируемый спектрально ан-типирилхинонимин САХЮ. В случае пары "фенол - ДМААП" накопление АХИ лимитируется окислительным деметилированием ДМААП с образованием ААП, а не окислением самого фенола. При сопряженном окислении ААП и фенола скорость накопления АХИ не зависит от содержания амина, а определяется только концентрацией фенола и ПХ и спектральная регистрация АХИ отражает скорость окисления фенола, поэтому для дальнейших исследований был выбран ААП.

Кинетика сопряженного пероксидазного окисления 4-аминоантипирина и гадоидзамещенных фенолов.

Исследовано сопряженное окисление ААП с фенолами Сфенол, п-крезол, п-хлорфенол, п-бромфекол, п-йодфенол, 2,4-дихлорфе-нол и пирокатехин}. Предложена схема сопряженного пероксидазного окисления ААП и фенолов:

- 11 -

Е + Е^ ♦ Н20 (1)

Ех + Р1»0Н —' % * РЬО" <2)

+ РЪОН -»■ Е + РЬО' (3)

Ех —^ + АиНН' <2*>

Е^ ♦ АпИН^—' Е + АяНН' (3*)

ДпМН2 + РТ10'^=» АгаНН" + РЬОН С4)

АтИН' + РЪО*—► АтНН-ОРЪ С5>

АпИН-ОРЪ + Н202~А^Н< ^ЬО (6)

РЬО' + РЫ>'- Р4 (7)

АпМН' + АгаКН'-» Р2 <7*>,

где - Е пероксидаза, Е^ и Е^ ее активные.формы I и II, РЬОН - фенолы, АиМН2 - 4-аминоантипирин, Р^ и Р2 - продукты рекомбинации феноксильных и аминильных радикалов, соответственно. Роль реакции (4) очень важна,так как она обеспечивает регенерацию фенола. Оценены константы скорости всех реакций кроме реакции 4.

Можно считать, что в присутствии ААП большая часть 'фенокси-лов превращается последовательно по реакциям 4, 5 и 6 в анти-пири7.хинонимин, который в определенных условиях можно считать единственным продуктом реакции.

В таблице 3 представлены значения V, К^ по фенолу, ккат для 8 пар субстратов.

Таблица 3. Кинетические характеристики процесса образования антипирилхинониминов при пероксидазном окислении фенолов и 4-аминоантипирина С25°С, 0,1 П фосфатный буфер, рН57.0).

Фенол

10' V, К/с

10 «V

кат'

-1

фенол п-крезол п-С1-фенол п-Вг-фенол п-1-фенол о-1-фенол 2"'4-С1-фенол пирокатехин

5.44 4.08 9.59 9.58 13.84

о.гг

35.30 11.70

0.54 3.20 1.08 0.68 0.10 4. 00 2.83 1.40

544 407 959 958 1384 22 3528 1170

N

Не измерив константу скорости реакции 4 в прямом и обратном, направлениях^нельзя сделать окончательное заключение о природе лимитирующей стадии процесса, поэтому полученные нами ката-

- и -

липгческие константы не, могут' быть выражены через константы скорости элементарных стадий. Учитывая эффективный характер ккат для реакций галоидз амеаенвых фенолов с ААП, мы условно сопоставили их с (/-константами Гаммета, отражающими влияние пара-заместителей на реакционную способность фенолов. Из уравнения Галшета Ходк*, /к^-грв; где - К - заместитель в папа-лат кат ^ ^ ■

ложении, получено значение равное С+1.15^0.20). Электро-фильный характер и известен и поэтому можно было ожидать отрицательных значений ^, если процесс лимитируется образованием феноксильных радикалов или их реакцией с ААП. Мы считаем, что полученное положительное значение объясняет аномально высокую реакционную способность галоидфенолов в сопряженном пероксидазном окислении их с ААП. Это явление аналогично роли фенолов в процессе усиленной хемштминесценции при их севме-стном окислении с люмиволом.

В изученном нами пероксидазном процессе сопряженного окисления фенолов с ААП наблюдается ингибирующее действие избытка перекиси водорода. Известно, что в этих условиях образуется неактивное соединение Ед пероксидазы: ♦ Н^ Ед, к=46 И_1с_1.

Эта реакция может конкурировать с реакцией 3, Сем. схему процесса) при использованных нами концентрациях фенола и Н^О^.

Влияние антител, специфичных к пероксидазе, на пероисидазное окисление пар субстратов.

Изучено влияние поликлональней антисыворотки и монокле-нальных антител 2С, ЗЕ, ЗФ и их бинарных и тройных смесей на начальные скорости окисления фенолов с ААП и люминола с п-йод-фенолом. Антитела предварительно инкубировали с пероксидазой в 0.1 М фосфатном буфере с рН 7.0 в течение 1.5 часов до достижения равновесия-при образовании иммунокомплексов. При пероксидазном окислении ААП и галоидфенолов образование иммунного комплекса ПХ снимает ингибированиэ реакции избытком Н^О^. увеличивая максимально достижимую скорость образования АХИ: для пары ААП с п-хлорфенолом в 5 раз Срис. 1), п-бромфенодоы - в 3 раза, п-йодфенолом - в 2 раза, для пары ААП - фенол - в 3.7 раза. Для пари "ААП - презол" наблюдается снижение образования АХИ в 1.5 раза. Все типы ионоАТ ингибируют окисление пары "ААП

- л-йодфеноя" при оптимальной концентрации Н^О^ С1 мЮ и при ее избытке СХО.В мЮ.

Смеси моноАТ в широком интервале концентраций Н^О^ <1. 0 -1®.в мЮ . активируют окисление пары "ААП - фенолы".

Изучено влияние жшоАТ, а также их смесей и поликлональной антисыворотки на окисление пары "лгминол - п-йодфенол", которая широко используется в ХИФА методах. Бри высоких концентрациях Н202 СО.01 - 0.10 Я) в отсутствие анти-ПХ наблюдается интенсивное снижение хемилюминесценции. Иммунный комплекс 1ПХ + анти-ПХЗ сохраняет каталитическую активность ПХ при избытке перекиси водорода.

Исследовано влияние рН, концентрации АТ, природы амина и фенола на их совместное окисление. Активация ПХ антисывороткой против нее наблюдается только при высоких концентрациях Н^О^, при низких концентрациях окислителя анти-ПХ ингибирует фермент. рН реакционной смеси в сильной степени определяет активирующее действие анти-ПХ на пероксидазу.

Большие концентрации анти-ПХ в одних случаях ингибируют процесс окисления, а в других активируют. Активирующее действие анти-ПХ ярче выражено для пар ААП с разными фенолами в сравнении с парами "люминол - фенолы".

Зависимости Начальных скоростей образования АХИ от начальной концентрации И.О. при

сопряженном окислении п-С1-фенола и ААП СО.'5 мЮ перекисью водорода: ПХ С1 нм) (I)

и ПХ с полиАТ (2)

_4

С4.8'10 мг белка/мЮ.

■X-

0 С.2 С.й С.6 С

1С2, в^ъ

Рис.1

При сопряженном окислении ААП с фенолами активирующее действие анти-ПХ зависит от фенола и существенно усиливается в ряду: РЬОН < п-С1-РТтОН < п-Вг-РМЙ < п-1-РМЖ.

- 14 -

МоноАТ активирует процесс усиленной хемилюминесценции в возраставших концентрациях, бинарные и тройные смеси моноАТ ингибируст окисление этой пары субстратов, в то время как поли АТ активируют окисление люминола и п-йодфенола при концентрациях Н^О^ .больше 5.0 мМ.

Таблица 4. Влияние антител на окисление пар субстратов.

Антитела ААП - п-1-фенол люминол - п-1-фенол

1мМ Н£02 ЮмМ Н202 5мМ Н202 ЮмМ Н202

без АТ 14.60 2. 70 5.20 2.60

2С+ЗЕ 22.15 3.80 2.20 3.40

9&+2С 16.78 3.47 3.10 1.96

ЗЕ+ЭО 29.00 4. 31 4.00 1.66

2С+ЗЕ+9С 30.80 4. 71 4.00 2. 50

полиАТ 53.60 36.50 3.80 3.24

V • 10 7 И/с I „

о макс

Результаты исследования влияния специфичных к ПХ антител представлены в таблице 4.

Влияние инертных белков на пероксидазное окисление пар субстратов

При изучении влияния моноАТ и полиАТ против ПХ было обнаружено, что для сохранения пероксидазной активности необходимо образование иммунных комплексов. Нами изучено также влияние неспецифических белков на пероксидазу в реакциях окисления пар субстратов в широком интервале концентраций Н^О^ Стабл. 5). _ Для пары "ААП - п-1-фенол" активирующее действие на ПХ при избытке перекиси водорода оказывают БСА, ОБА, неспецифическая сыворотка, анти-ПХ*, смесь анти-ПХ + БСА (наибольший эффект), поликлональная сыворотка к БСА + БСА. Для пары "люминол -п-1-фенол" наблюдается обратная картина воздействия белков на активность ПХ. БСА, ОБА, 1д6чел, анти-ПХ* и анти-ПХ* + БСА, полиАТ к БСА оказывают ингибирующее действие на процесс окисления люминола и п-1-фенола.

- 4.5 -

Таблица 5. Влияние инертных белков, на окисление пар

субстратов "ААП - п--1-фенол" и "люминол - п-1-фенол".

Белок ААП - п-Т-фенол люминол - п-Х -фенол

1мМ Н202 ЮмМ «202 1мМ И202 18кМ И202

БСА ОВА 1В<5чел неспец, сыворотка ^чел* БСА ' анти-ПХ* поликлон, сыв.к БСА анти-ПХ** БСА поликлон, сыв.к БСА ♦ БСА юг 110 73 105 105 102 58 86 68 106 126 35 114 98 225 42 320 140 98 . 100 99 98 115 27 57 32 53 98 103 99 104 147 33 44 9 51

И-активности /-активности-

Примечание: активность указана в 7. к ее значению для ПХ без белков; анти-ПХ* - очищена на ДЭАЭ-целяюлоэе; белки добавляли в буферный раствор ПХ и выдерживали в течении 1.5 часов при комнатной температуре.

Влияние антител и других белковых молекул зависит от природы окисляемого амина и рН среды. Различие эффектов на окисление двух пар объясняется разными условиями реакции СрН и др.), которые способствуют или препятствуют диссоциации ПХ на апобелок и гем, катализирующий окисление люминола СрН 9.0), но лишенный каталитической активности в окислении ААП СрН 7.0). Максима-, льный эффект сохранения активности при избытке Н^О^ наблюдается, когда ПХ взаимодействует со специфическими 1дС, которые способны реагировать с большинством антигенных детерминант, БСА усиливает этот эффект.

При окислении пары "люминол - п-1-фенол" активирующее действие оказывает добавление к ПХ неспецифичеких ,1дОчел и БСА, которые взаимодействуют с апобелком. Можно предположить, что в данном случае возможен выход гема, который эффективно катализирует окисление люминола, что подтверждается влиянием специфических АТ к ПХ, оказывающих ингибирующее действие .в

этом случае.

Механизмы действия антител на пероксидазное окксление пар субстратов.

Проведены эксперименты по влиянию порядка внесения различных компонентов в реакционную среду, поволяющие определить важность образования иммунного комплекса ПХ с антителами. Если антитела вносятся в реакционную среду через 30 секунд после начала пероксидазной реакции, эффект зашиты ПХ от избытка перекиси водорода снижается. Таким образом, необходимо полное образование иммунного комплекса ПХ, которое приводит к активации фермента в 10 раз при ЕН^О^Д>2, 5 мМ.

Измерены константы скорости элементарных стадий Ск^ и кд) Сем,- стр.11)- окисления ААП, люминола.и п-1-фенола формами Е^ и пероксидазы и ее иммунных комплексов. ПалиАТ снижают константы скорости к^ и Кд' Сем. табл. 63.

Таблица В. Константы скорости к^ и к^ элементарных стадий пероксидазного окисления ААП, люминола и п-1-фенола в отсутствие и присутствии полиАТ к ПХ. _

Биокатализатор Субстрат Ю-6 к», ю-4 Ц, Условия реакции

ПХ ААП 0.85 2.75 рН 7.0

ГПХ*полиАТ! ААП . 0.81 2.40 -//-

ТОС люминол 2.30 7.20 рН 8.0

ПХ люминол 0.80 1.20 рН 8.5

С ПХ: полиАТД люминол 0.43 0.30 -//-

ПХ п-1-РИОН £8.10 341 рН 8.5

£ПХ: полиАТ! п-1-РЬ0Н 10.00 19

[ПХ+полиАТ] п-1-РЪОН 10. 00 - рН 7.0

Примечание: С ПХ: полиАТ] - пероксидаза связана ковалентно в комплекс с полиАТ; [ПХ+полиАТ! - иммунный комплекс, образованный в растворе,

Можно полагать, что именно, с ингибированием реакции 3 Сем. схему процесса, стр.113 связано влияние маноАТ на окисление ААП и п-1-фенола. Такой эффект наблюдается для смесей моноАТ при окислении люминола и п-1-фенола.

Активирующее воздействие антител, как уже понятно, не связано о реакциями 2,2* и 3,3*, которые тормозятся антителами, а

- г? -

объясняется другими причинами.

Главной из них может быть диссоциация ПХ на гем и апобелок, которая сильно возрастает с увеличением концентрации Н^О^. При рН 7.0 константа диссоциации ПХ увеличивается в 22 раза с увеличением концентрации Н202 от 5.0 до 50 мМ, что вызывает потерю каталитической активности, -фермента.

Суммируем возможные факторы^ обуславливающие характер влияния антител на совместное окисление аминов и фенолов:

13 При оптимальных концентрациях Н^С^ антитела ингибируют процесс, что связано с их воздействием на константы скорости реакций к2 и к^, которые снижаются;

2) Активирующее действие антител наблюдается только при избыточных концентрациях Н202> когда образуется неактивное соединение Ед и усиливается диссоциация фермента на гем и апобелок;

33 Активирующему действию АТ благоприятствуют все. факторы, снижающие диссоциацию ПХ: рН, близкие к 7.0, завершение образования иммунного комплекса [ПХ+полиАП, природа субстратов -аминов и фенолов;

43 Воздействие АТ на окисление ААП и п-Г-фенола СрН 7.03 может быть противоположным их влиянию на окисление пары "лвми-нол - п-1-фенол", так как в последнем случае диссоциация ПХ благоприятна из-за высокой каталитической активности свободного гема в этом процессе;

53 Комплексы [ПХ+полиАТ] намного прочнее комплексов

о

[ПХ+моноАТЗ и отличаются по молекулярному составу, что обуславливает их различную способность к освобождению гема;

63 Антитела в большом избытке могут реагировать с активными радикалами, оказывая ингибирующее действие на процесс;

73 Добавление различных по своей природе белков в среду подтверждает выдвинутые выводы.

Гомогенный хемилюминесцентный ИФА иммуноглобулинов. О человека.

В гомогенном ИФА активность в растворе измеряется без разделения меченых и немеченых антигенов.

Найдено, что сопряженное пероксидазное окисление люминала и п-1-фенола ингибируется избытком Н^О^ (50 мМЗ. Ферментативная

- 18 -

активность конгвгата CITX-IgGJ при концентрации равна ZDX от его активности при оптимальной концентрации перекиси водорода С 5 мЮ. Антитела, специфичные к IgG4eJI1 восстанавливают пероксидазную активность до 90К от начального уровня. На основании этого явления был разработан гомогенный ИФА IgO человека.

Получена калибровочная зависимость, которая линейна для концентраций Хдв от 50 нМ до 1 мкМ. Предел определения - 50 нМ. Физиологическая концентрация IgG в крови человека - 70 мкМ. Коэффициенты вариации: intra - 5.ZX, interassay - 1.6И, С рис.2).

Рис. 2

Калибровочная зависимость гомогенного ХИФА 1д0 чело-, века: 0.5 нМ £ПХ-1д(й, анти-1д0 - (1:400).

В/В ,'/. - отношение интенсивности хемилюминесценции в присутствии модулятора к ее величине в отсутствии модулятора.

Принцип гомогенного ХИФА IgG,

чел

анализа других белковых антигенов.

[lgGj. f. может быть использован для

ВЫВОДЫ

1. Пероксидаэное деметилирование диметиланилина, 4-аминоан-типирина, 4-диметйламиноантипирина, различающихся окружением третичного азота, происходит с невысокими скоростями. Реакционная способность аминов уменьшается в ряду: диметиланилин > > 4-диметиламиноантипирин > -4-аминоантипирин.

2. Показано, что при сопряженном пероксидазном окислении пары "4-аминоантипирин - .фенол" процесс образования антипирил-

I

хинонимина определяется скоростью окисления фенола, в то время как при окислении пары "4-диметилаыиноантипирин - фенол" этот процесс лимитирутся деметилированием амина.

3. При сопряженном пероксидазном окислении 4-аминоантипирина и фенолов, катализируемом пероксидазой и ее иммунными комплек-

сами, важную роль в механизме реакций играет неферментативная регенерация феволят-ионов в реакции феноксилов с амином.

4. Методом остановленной струи измерены константы скорости к^ и к3 окисления 4-аминоантинирина соединениями Е^ и Е^ пероксидаэы и ее иммунного комплекса с поликлональными антителами. Показано, что поликлональние антитела снижают константы скорости элементарных стадий пероксидазного процесса - к2 и к3.

5. Показана корреляция каталитических констант окисления пе-роксидазой 4-аминоантипирина и галоидзамешенных фенолов с о-константами Гаммета. Полученное значение ^3=1.15-0.2 доказывает аномально высокую реакционную способность галоидфенолов в пероксидазном процессе.

В. Изучено влияние поликлональных и моноклональных антител, специфичных к пероксидазе, на окисление пар субстратов "4-аминоантипирин - фенолы" и "люминол - пара-йодфенол". Показано активирующее действие антител на сопряженное окисление аминов и фенолов в условиях избытка перекиси водорода^ которое зависит от значения рН, концентрации антител, природы окисляемого амина и реакционной способности фенолов.

7. Доказано, что увеличение концентрации перекиси водорода сильно повышает константу диссоциации пероксидаэы на гем и апобелок в реакции совместного окисления 4-аминоантипирина и фенола.

8. При невысоких и оптимальных концентрациях перекиси водорода влияние антител на пероксидазу носит ингибируюдий характер, так :сак связано с уменьшением констант скорости элементарных стадий взаимодействия соединений Е^ и Е^ о субстратами.

9. Активирующее действие антител на пероксидазу наблюдается только при высоких концентрациях перекиси водорода, когда увеличивается константа диссоциации фермента на гем и апобелок и антитела препятствуют этому процессу.

Активирующему действию антител на пероксидазу благоприятствую-^ все факторы, снижающие диссоциацию пероксидаэы на апо-фермент и гем СрН, близкие к 7.0, завершение образования иммунных комплексов пероксидаэы с поликлональными антителами и природа субстратов - аминов и фенолов}.

10. Разработан гомогенный хемилюминесцентный иммуннофермент-

ный анализ иммуноглобулинов О человека на основе явления активации конъюгата "пероксидаза - *Я®чел" антителами, специфичными к IgO, в реакции окисления пары "люминал - napa-йодфенол" при избытке перекиси водорода. Чувствительность метода - 50 нМ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ .

1. Литвинчук A.B., Савенкова М. И., Метелица Д. И. Пероксидазное деметилирование некоторых третичных аминов. // Изв. АН БССР., сер хим. наук. -1990. -№&. -С. S0-5S.

2. Litvinchuk A.V. , Savenkova K.I. Peroxidase-catalyzed deaethylation of somt tertiary amines and their cooxidation with pfcenol. VXIth Inter, conferences of young scientists on org. and tool. chemistry. Vina, Bulgaria. -1990. -P. 145-147.

3. Литвинчук A.B., Савенкова M. И., Метелица Д. И. Кинетика сопряженного пероксидазного • окисления фенола с 4-аминоактипиринами. // Кинетика и катализ. -1991. -T.3Z. -№з. С. 535-540.

4. Метелица Д. И., Литвинчук А. В., Савенкова М. И. Катализированное пероксидазой сопряженное окисление, галоидзамещенных фенолов и 4-аминоантипирина. // Изв. АН БССР. -1Э91. -№2. -С. 75-82.

5. Retelitz« D.I., Litvinchuk А. V., Savenkova M.I. Peroxidase-catalyeed co-oxidation of halogen-substituted phenols and 4-aiu.noantipyrine. // J. Molecular Catalysis. -1991. -V.67. -P.401-411.

S. Литвинчук A.B., Савенкова M. И., Метелица Д. И. Влияние специфичных антител на пероксидазное окисление различных пар субстратов. Б сб. Материалов VII Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии. Москва, -1991. -С. 141.

7. Метелица Д. И,, Литвинчук А. В., Савенкова М. И. Сопряженное окисление галоидзамещенных фенолов и люминола, катализированное пероксидазой в присутствии антител против нее. /V Биохимия. -1982. -Т. 57. -№l. С. 103-113.

8. Литвинчук A.B., Метелица Д.И,, Савенкова М.И.» Чередникова

Т. В,, Ким Б. Б., Писарев В. В. Влияние моноклональных и поликлональных антител к пероксидазе на соопряженное пероксидазное окисление 4-йодфенола с люминолом и

- и -

4-аминоантипирином. ss Биохимия. -1992. -Т. 57. -№4. -С. 604-815.

9. Savcnkova М. I., Litvincbufc А. V., ftetelitsa D.I. The peroxidase-specific antibodies in the feeehanisa study of the excess HoOj, inhibition of the peroxidase-catalyzed . co-oxidation of p-I-phenol with 4-ani.noantipyrine (АЛР) or lueinol. Inter. Synp. "Biotech MA'92". Genua, Italy. -199Z.-P.88.

10. Save, nl:ova P. I., Litvinchufc Д. V., Meteiitra D. I. Peroxidase-catelyzed co-oxidation of halogen-substituted phenols with 4-artinoaTit ip/rine or luitinol in the presence of the peroxidase-specific antibodies. VIII Inter. Synp, on honogeneous catalysis. Ansterdan, The Netherlands. -1992. -P. 256.

J JJ^-

GAw*

//

Подписано в печать 6.08.93. Формат 60x84/16, 3бк.38. Тираж 100 экз.

Отпечатано на ротапринте Института геологии, геохимии и геофизики АН Бела пуск. 220141. .Минск, ул. Жодинская,7.