Ферментативное определение фенолов и ртути (II) с использованием пероксидазы арахиса тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

< "I

РП5 од

БАГИРОВА Наиля Арифовна 2 2 МАЙ ?(Щ0

ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОЛОВ И РТУТИ(П) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЕРОКСИДАЗЫ АРАХИСА

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Шеховцова Т.Н.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Угарова H.H. кандидат химических наук, научный сотрудник Кучеряева В.В.

Ведущая организация:

Казанский государственный университет

Защита состоится &1 мая 2000 года в 16 ч 10 мин в аудитории 337 на заседании диссертационного совета Д.053.05.60 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Отзывы и замечания просьба отправлять по адресу:

119899, ГСП-3, Москва В-234, Ленинские горы, МГУ, химический факультет, кафедра аналитической химии, ученому секретарю диссертационного совета

Ученый секретарь диссертационного совета,

Автореферат разослан 24 апреля 2000 года.

'чв О

"2.52.„4-М - Sp

кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

7

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Охрана окружающей среды остается одной из основных проблем эвременной науки, в том числе аналитической химии. Перспективным направлением ^логического мониторинга является разработка и применение ферментативных етодов анализа. Использование ферментативных методов целесообразно и ерспективно для высокочувствительного, селективного, экономичного определения изиологически активных веществ.

Наиболее изучена и широко применяется в биохимическом анализе пероксидаза, уделенная из корней хрена. В последние годы появилось довольно много работ, освященных изучению строения и свойств пероксидаз, выделенных из других астений. Отметим, что только для двух растительных пероксидаз - арахиса и хрена, ¡¡тановлена и изучена кристаллическая структура. Известно, что это наиболее близкие о аминокислотному составу растительные пероксидазы, отличающиеся однако по изико-химическим свойствам.

До настоящего времени систематического изучения субстратов и эффекторов шгибиторов и активаторов) пероксидазы арахиса не проводилось, и этот фермент рактически не использовали в аналитических целях. В то же время выявление /бстратов и эффекторов пероксидазы арахиса и разработка методов их определения 1жны как с теоретической, так и с практической точек зрения, поскольку данные, олученные в результате такого исследования, могут внести весомый вклад в изучение /бстратной специфичности, механизма действия пероксидазы арахиса, и позволят ценить перспективы ее использования в химическом анализе.

Выбор объектов исследования - фенолов разного строения и ртути(П), бусловлен тем, что указанные соединения высоко токсичны, относятся к риоритетным загрязнителям окружающей среды, и разработка высокочувствительных етодов их определения - актуальная задача аналитической химии. Кроме того, в итературе имеются сведения о влиянии этих токсикантов на другие растительные ероксидазы, в первую очередь пероксидазу хрена. Сравнение данных о характере и гепени воздействия одних и тех же соединений на ферменты разного происхождения елесообразно для уточнения структуры и свойств биологических катализаторов, ыявления среди них наиболее чувствительного к воздействию эффекторов и, недовательно, наиболее перспективного для использования в химическом анализе.

Цель настоящей работы - изучение характера влияния на каталитическую стивность пероксидазы арахиса в реакциях окисления различных ароматических иаминов фенола и его производных, а также ртути(П), разработка методик их пределения и выяснение целесообразности применения пероксидазы арахиса в 'ерментативных методах анализа.

Научная новизна заключается в том, что в результате изучения влияния ртути(И) и фенольных соединений на скорость катализируемых пероксидазой арахиса реакций окисления ароматических диаминов

и разработки высокочувствительных методик их определения обоснована целесообразность использования этого фермента в аналитических целях;

- на основании данных сравнительного изучения действия ртути(И) на каталитическую активность пероксидаз, выделенных из клеток арахиса и корней хрена, в реакции окисления о-дианизидина установлено, что степень ингибирующего влияния ртути(И) на пероксидазы, выделенные из разных источников, различна, и в отличие от пероксидазы хрена для ингибирования пероксидазы арахиса ртутью(П) не требуется предварительная обработка фермента серосодержащим ингибитором -тиомочевиной;

- установлено, что по характеру влияния на скорость катализируемого пероксидазой арахиса окисления ароматических диаминов изученные фенольные соединения делятся на две группы - ингибиторы и вторые субстраты фермента;

- показано, что характер влияния фенола и его производных на кинетику индикаторного процесса определяется, в первую очередь, соотношением окислительно-восстановительных потенциалов фенольных соединений и основного субстрата пероксидазы арахиса - бензидина, о-дианизидина или 3,3',5,5'-тетраметилбензидина;

- выяснено, что основные субстраты пероксидазы арахиса (бензидин и его производные) активируют окисление вторых субстратов - фенолов, то есть в индикаторной системе наблюдается явление субстрат-субстратной активации;

- обоснована целесообразность использования для регулирования чувствительности и селективности определения фенольных соединений

различных субстратов-восстановителей пероксидазы арахиса (бензидина и его производных);

разных аналитических сигналов - скорости индикаторного процесса или продолжительности индукционного периода.

Практическую значимость имеют разработанные с использованием реакций

пероксидазного окисления ароматических диаминов ферментативные методики

определения:

- ртути(Н) по ее ингибирующему действию на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина (с„ = 0,2 нг/мл);

- ряда фенольных соединений в диапазоне концентраций 0,05 - 50 мкМ (0,00550 мкг/мл) на основании различного характера их влияния на скорость пероксидазного окисления ароматических диаминов - о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина или бензидина;

- ряда изомеров фенолов - ингибиторов и вторых субстратов, при их совместном присутствии с использованием разных аналитических сигналов - скорости индикаторного процесса и продолжительности индукционного периода, соответственно;

определения ртути(И) и ряда фенольных соединений (аминофенолов и нафтолов) в природных водах.

Автор выносит на защиту:

. Результаты сравнительного изучения влияния ртути(Н) на скорость окисления о-дианизидина, катализируемого пероксидазой арахиса, а также нативной и рекомбинантной пероксидазами хрена; данные исследования возможных причин различного по характеру и степени влияния ртути(И) на каталитическую активность пероксидаз арахиса и хрена. !. Результаты изучения характера влияния широкого круга фенольных соединений с различной природой и положением заместителей в бензольном кольце, различными кислотно-основными и окислительно-восстановительными свойствами на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления ароматических диаминов - о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, бензидина и о-фенилендиамина, а также обоснование выявленных при этом закономерностей. !. Ферментативные методики определения

- ртути(И) по ее ингибирующему действию на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина (с„ = 0,2 нг/мл);

- фенолов на основании различного характера их влияния на скорость пероксидазного окисления ароматических диаминов - о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина или бензидина с нижними границами определяемых содержаний 0,05 - 5 мкМ (0,005 - 5 мкг/мл);

- ряда изомеров фенолов (резорцина и гидрохинона, 2- и 3-аминофенолов; 1- и 2-нафтолов), относящихся к разным группам - ингибиторам и вторым субстратам, в смеси с использованием разных аналитических сигналов - скорости индикаторного процесса и продолжительности индукционного периода, соответственно;

- ртути(И) на уровне концентраций 10 - 50 нг/мл в природной воде по реакции пероксидазного окисления о-дианизидина;

- ряда фенольных соединений (2- и 3-аминофенолов; 1- и 2-нафтолов) на уровне концентраций 3-100 мкМ (0,3 - 15 мкг/мл) при индивидуальном и совместном присутствии в природной воде по реакции пероксидазного окисления о-дианизидина.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийских «жференциях по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-96» и :<Экоаналитика-98» (Краснодар, 1996, 1998); Международном конгрессе по шалитической химии (Москва, 1997); Международной конференции "International Workshop on Peroxidase Biotechnology and Application" (Пушкино, 1997); Международном симпозиуме «Kinetics in Analytical Chemistry» (Греция, Халкидики, 1998); Международной конференции «Biocatalysis-98: Fundamentals and Applications»

(Пущино, 1998); VII Всероссийской конференции «Органические реагенты в аналитической химии» (Саратов, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 7 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на ^стр. машинописного текста, состоит из введения, литературного обзора (Главы I и II), экспериментальной части (Главы III - V), заключения, выводов и списка литературы, включающего 188 наименований; содержит 87 рисунков, 36 таблиц.

Экспериментальная часть

В работе использовали твердые препараты катионной пероксидазы арахиса, выделенной из отработанной среды культуральных клеток арахиса Arachis Hypogea, предоставленные профессором Р.Б. ван Хьюсти (University of Western Ontario, Canada) (RZ = 2,0;) и пероксидазы из корней хрена ("Sigma", США) (RZ = 2,2). Удельная активность пероксидаз по отношению к о-дианизидину составляла 700 ед/мг.

Оптическую плотность растворов во времени измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-2, спектрофотометрах СФ-46 и Shimadzu UV-160A. Спектры поглощения в УФ и видимой области регистрировали на спектрофотометре "Specord".

Скорость индикаторной реакции контролировали спектрофотометрически вследствие образования окрашенных продуктов и характеризовали величиной тангенса угла наклона (tga) начальных линейных участков кинетических кривых в координатах оптическая плотность - время (t, сек).

Влияние ртути(П) на каталитическую активность пероксидазы арахиса

Обзор литературы о структуре пероксидаз свидетельствует о том, что при одинаковом строении активного центра, консервативности ключевых каталитических аминокислотных остатков элементы вторичной структуры пероксидаз, их взаимное расположение, степень гликозилирования ферментов, выделенных из различных источников, отличаются. Это приводит к различиям в каталитических свойствах пероксидаз и, возможно, к разной чувствительности к воздействию одних и тех же эффекторов.

Для сопоставления характера и степени влияния одних и тех же веществ, особенно биологически активных, на каталитическую активность ферментов различного происхождения: пероксидазы хрена - давно и хорошо зарекомендовавшей себя в химическом анализе, и пероксидазы арахиса, не изученной с точки зрения использования в аналитических целях, нам представлялось целесообразным изучить влияние на каталитическую активность последней прежде всего наиболее эффективного ингибитора пероксидазы хрена - ртути(П).

В качестве индикаторной использовали реакцию окисления о-дианизидина пероксидом водорода. Выбор данной реакции обусловлен тем, что наиболее подробно и детально влияние ртути(И) на активность пероксидазы хрена изучено именно в этой индикаторной реакции.

Установлено, что ртуть(П) является достаточно эффективным ингибитором пероксидазы арахиса и в выбранных оптимальных условиях (концентрации: пероксидазы арахиса - 0,1 нМ, о-дианизидина - 60 мкМ, пероксида водорода - 0,15 мМ, рН 4,8-5,2, фталатный буферный раствор) понижает скорость индикаторной реакции в интервале концентраций 0,01-1 нг/мл.

Падение активности пероксидазы арахиса во времени при инкубировании со ртутью(И) свидетельствует о необратимом связывании ингибитора с ферментом, что было подтверждено нами методом разбавления и диализом. Для пероксидазы хрена в той же индикаторной реакции ртуть(Н) является обратимым конкурентным ингибитором.

Сравнение характера и степени воздействия ртути(Н) на активность двух растительных пероксидаз в одном и том же индикаторном процессе показало, что индивидуальное ингибирующее действие ртути(И) на пероксидазу арахиса проявляется при в 250 раз меньших ее концентрациях. В отличие же от системы, катализируемой пероксидазой хрена, в которой добавление тиомочевины повышает чувствительность определения ртути(П) более, чем на четыре порядка, тиомочевина в индикаторной реакции, катализируемой пероксидазой арахиса, относительно мало влияет на ингибирующую способность ртути(Н) (и, следовательно, не дает заметного аналитического эффекта). Вероятно, взаимодействие ртути(П) с пероксидазами арахиса и хрена осуществляется по разным механизмам, что, по-видимому, связано с некоторым различием в их строении.

Для выяснения причин различного характера влияния ртути(П) на пероксидазы арахиса и хрена была изучена связь этого влияния с различиями в строении этих ферментов: разным количеством углеводных цепей в молекулах пероксидаз (на примере нативных пероксидаз арахиса и хрена, имеющих три и восемь углеводных цепей, соответственно, а также негликозилированной рекомбинантной пероксидазы хрена, полученной экспрессией в E.coli), возможным наличием сульфгидрильных групп в пероксидазе арахиса (путем изучения влияния на каталитическую активность пероксидазы арахиса ряда ионов металлов, обладающих сродством к сере, а также метилртути, принадлежащей к числу наиболее специфических реагентов на SH-группы белков; титрованием пероксидазы арахиса реактивом Элмана - 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой; воздействием ртути(Н) на пероксидазу арахиса, предварительно обработанную окисленной формой глутатиона, окисляющим сульфгидрильные группы).

Наиболее вероятной причиной более эффективного ингибирования пероксидазы арахиса ртутью(Н) является большая подвижность ионов кальция в этом ферменте. Роль

ионов кальция заключается в поддержании конформации белковой глобулы вокруг акгивного центра фермента, необходимой для проявления каталитической активности пероксидазы. Малейшие сдвиги в расположении этих ионов (например, в присутствии ртути(П)) могут привести к изменению скорости пероксидазной реакции. Однако при этом все же нельзя исключать возможности взаимодействия ртути(И) с карбоксильными группами аспарагиновой и глутаминовой кислот фермента.

На основании ингибирующего действия ртути(И) на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина разработана методика ее определения с нижней границей определяемых содержаний - 0,2 нг/мл (sr=0,10, п=3).

С использованием разработанной методики возможно определение ртути(Н) в природных водах на уровне ее ПДК. Определению 0,5 нг/мл ртути(И) мешают ионы свинца(Н) и кадмия(Н) при их 100 и 50-кратных избытках, соответственно.

' Разработанная методика была использована для определения ртути(И) в подземной воде, отобранной в Одинцовском районе Московской области, методом «введено-найдено». Были получены следующие результаты: введено - 15, 30 и 45 нг/мл ртути(Н), найдено - (12 ± 5), (28 ± 6) и (43 ± 3) нг/мл; sr составляет 0,24; 0,05 и 0,12, соответственно (п = 3, Р = 0,95).

Разработанная методика уступает по чувствительности и селективности методике определения ртути(П) с использованием пероксидазы хрена в присутствии тиомочевины (сн = 0,01 нг/мл, sr=0,03, п=3). Однако отсутствие необходимости введения в индикаторную реакцию, катализируемую пероксидазой арахиса, дополнительного ингибитора - тиомочевины, инкубирования сначала ее с ферментом, а затем тройной смеси - тиомочевины и ртути(И) с ферментом позволяет значительно упростить методику и на час сократить время анализа.

Влияние фенола и его производных на кинетику пероксидазного окисления о-дианизидина

Ранее на кафедре аналитической химии химического факультета МГУ было проведено сравнительное изучение действия ряда фенольных соединений на каталитическую активность пероксидаз различного происхождения - пероксидазы хрена, люцерны Medicago Sativa, ксилотрофного гриба Phellinus Igniarius, в реакции окисления о-дианизидина. В целях продолжения и углубления начатого исследования влияния соединений одного класса - фенолов, на каталитическую активность пероксидаз, выделенных из различных источников, на примере пероксидазы арахиса и для выяснения того, какие факторы определяют характер этого действия, нами было проведено систематическое изучение влияния широкого круга фенольных соединений (табл. 1) на кинетику того же индикаторного процесса окисления о-дианизидина, катализируемого пероксидазой арахиса.

Изученные фенольные соединения

Фенольное соединение Структурная формула Фенольное соединение Структурная формула

Фенол Пирокатехин Резорцин Гидрохинон Пирогаллол О-™ ГГ' Ч^ОН <3 .ДОН но—/ \—он _/ОН О-О». ^011 4-Метилфенол 2,6-Диметилфенол 3,4-Диметилфенол 2,б-Ди-«)реш-бутил-4-метилфенол Нзс—^ ^—он НзС—? у—он 4=' /(гй-Ви \lret-В и

2-Метоксифенол 4-Метоксифенол Н3СО-^ ^-011

2-Аминофенол 3-Аминофенол 4-Аминофенол от ,_/он н21Ч—у—ок

4-Хлорфенол 2-Бромфенол 4-Бромфенол Пентабромфенол ОС ВГО0" 9"

2-Нитрофенол 4-Нитрофенол 2,4-Нитрофенол 2,6-Нитрофенол СТ сО», хт п°н

1-Нафтол 2-Нафтол он 00 00"

При этом в качестве объектов исследования были выбраны фенолы с разным! заместителями (с гидрокси-, амино-, нитро-, алкил-, метокси-, галоид-группами), с разным положением их в бензольном кольце и, вследствие этого, с различными кислотно-основными и окислительно-восстановительными свойствами.

Изучение химизма и кинетики окисления о-дианизидина, катализируемого пероксидазой арахиса, показало, что реакция протекает согласно схеме, описанной в литературе для реакции окисления о-дианизидина, катализируемого пероксидазой хрена.

1ЬСО ОСШ-1

х-455 нм Схема 1.

При изучении влияния фенола и его гидроксипроизводных установлено, что скорость индикаторной реакции ^а), катализируемой пероксидазой арахиса, понижается в присутствии собственно фенола и в большей степени резорцина (рис. 1, кривые 1-3) по мере увеличения их концентрации (табл. 2), то есть данные соединения являются ингибиторами пероксидазы. Введение же гидрохинона, пирокатехина и пирогаллола приводит к возникновению на кинетических кривых индукционного периода (тшщ) (рис. 1, кривые 4-6), продолжительность которого прямо пропорциональна концентрации фенольного соединения. Соединения, которые оказывают такое влияние на кинетику индикаторного процесса, называют вторыми субстратами ферментов. При этом наклон второго, восходящего, участка кинетической кривой практически не изменяется в присутствии различных концентраций фенольного соединения в реакционной смеси.

Таблица 2.

Влияние резорцина и гидрохинона на кинетику окисления о-диашшщнна, катализируемого пероксидазой арахиса (п=3, Р=0,95)

Фенольное соединение Сфенола, МКМ Тика» ССК

В отсутствие фенола — 11,6 ±0,2 —

2 9,2 ±0,1 ...

Резорцин 5 8,3 ±0,1 ...

10 6,4 ± 0,2 ...

2 11,3 ±0,2 55 ±3

Гидрохинон 5 11,4 ±0,1 75 ± 1

10 11,1 ±0,3 115 ± 5

А440

0.3 г

0.05

0.25

0.15

0.1

0.2

4

5

6

0

0

30

60

90

120

150

I, сек

зс. 1. Кинетические кривые окисления о-дианизидина, катализируемого пероксидазой арахиса, отсутствие фенолов (1) и в присутствии фенола (2), резорцина (3), пирокатехина (4), щрохинона (5) и пирогаллола (6). Концентрации: пероксидазы арахиса - 0,1 нМ, о-дианизидина 0,12 мМ, пероксида водорода - 0,15 мМ, фенола - 10 мкМ, резорцина, пирокатехина, [дрохинона и пирогаллола - 3 мкМ; фталатный буферный раствор (рН 5,0).

Все остальные изученные нами фенольные соединения по характеру их влияния на лнетику индикаторной реакции также делятся на две группы:

I - фенолы, замедляющие пероксидазное окисление о-дианизидина, то есть нгибиторы фермента (табл. 3);

II - фенолы, в присутствии которых на кинетической кривой возникает ндукционный период, то есть вторые субстраты пероксидазы арахиса (табл. 4).

Анализ данных проведенного нами исследования показал, что характер действия енолов на фермент не зависит от их кислотно-основных свойств (табл. 3, 4).

Установлено, что характер влияния фенолов на скорость индикаторного процесса пределяется, главным образом, их окислительно-восстановительными свойствами: а менно, соотношением окислительно-восстановительных потенциалов этих эединенин и основного субстрата - о-дианизидина (табл. 3,4).

В то же время, как видно из данных табл. 3 и 4, степень влияния фенольных □единений на кинетику индикаторного процесса не коррелирует с величиной их кислительно-восстановительных потенциалов, возможно, вследствие того, что вклад в гепень воздействия фенолов вносят и другие факторы - размер, положение заместителя, оступность гидроксильной группы фенола.

Характеристики фенолов - ингибиторов пероксидазы арахиса в реакции окисления о-днанизидина

Фенольное соединение рКа Eox/Red, В Сфен, МкМ, при которой I = 20%

Литературы. Экспримент.5 (п-3, Р-0,95)

Фенол 10,00 1,089 0,330 ± 0,002 20

Резорцин 9,44 1,043 0,320 ± 0,004 2

2-Нафтол 9,63 1,017 0,310 ±0,002 3

4-Бромфенол 9,36 _а 0,310 ±0,003 70»

2,6-Диметилфенол 10,66 — 0,305 ± 0,002 5

З-Аминофенол 9,87 0,894 0,300 ± 0,001 0,08

4-Хлорфенол 9,38 - 0,300 ± 0,001 90°

2-Метоксифенол 9,98 0,868 0,295 ± 0,002 0,5

3,4-Диметилфенол 10,38 - 0,295 ±0,002 25

4-Метоксифенол 10,21 0,848 0,290 ± 0,002 2

Пентабромфенол 4,43 - - 35

Е?ом (о-Диапизидина) = 0,809 В 0,280 ± 0,003 В

Таблица 4.

Характеристики фенолов - вторых субстратов пероксидазы арахиса в реакции окисления о-днаннзпдина

Фенольное соединение рКа Eox/Red, В Сфе„, МКМ, при которой ^инд 45сек

Литературы. Экспримент.6 (п=3, Р=0,95)

1-Нафтол 9,85 0,797 0,270 ± 0,002 0,8

Пирокатехин 9,45 0,740 0,265 ± 0,003 1,8

4-Аминофенол 10,30 0,733 0,255 ± 0,002 1,7

2-Аминофенол 9,71 0,730 0,255 ± 0,002 0,8

Гидрохинон 9,96 0,715 0,240 ± 0,004 1,5

Пирогаллол 9,12 0,609 0,225 ± 0,004 0,7

а - данные по окислительно-восстановительным потенциалам фенольного соединения в

литературе не найдены;

5 - значения потенциалов, измеренных нами в одинаковых условиях с использованием

платинового и хлоридсеребряного электродов; " - концентрация фенольного соединения, при которой I = 10%.

Так, ингибирующее действие пеитабромфенола очень слабо: скорость индикаторной реакции замедляется в его присутствии при концентрации не менее 15 мкМ, и степень ингибирующего действия мало изменяется при увеличении концентрации. 2,6-Ди-трет-бутил-4-метилфенол при концентрации <0,1 мМ вообще не влияет на кинетику пероксидазного окисления о-дианизидина, что, по-видимому, объясняется наличием двух объемных заместителей в непосредственной близости к гидроксильной группе, вызывающих стерические затруднения для связывания фенола с молекулой фермента. С другой стороны, конденсированные фенолы -1-й 2-нафтолы, размер молекул которых достаточно велик, но гидроксильные группы ничем не экранированы, начинают оказывать влияние на скорость индикаторного процесса при значительно более низких концентрациях - 0,5 и 0,75 мкМ, соответственно.

На основании полученных данных сформулирована гипотеза о зависимости характера влияния фенолов на кинетику индикаторного процесса главным образом от соотношения окислительно-восстановительных потенциалов фенольных соединений и основного субстрата пероксидазы арахиса - о-дианизидина.

Для подтверждения этой гипотезы было изучено влияние тех же фенольных соединений на кинетику пероксидазного окисления других субстратов, обладающих отличными от о-дианизидина потенциалами - 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ), бензидина и о-фенилендиамина (о-ФДА).

Влияние ряда фепольных соединений на кинетику пероксидазного окисления 3,3',5,5'-тетраметилбепзидина

Результаты сравнительного спектрофотометрического изучения химизма и кинетики окисления ТМБ, катализируемого пероксидазой арахиса и хрена, позволили предположить, что окисление ТМБ в присутствии обеих пероксидаз протекает по схеме:

Схема 2.

>.=375; 655 нм

и

Выяснено также, что при использовании этой реакции в аналитических целях в качестве индикаторной ее скорость можно контролировать как по накоплению промежуточного соединения (7^=375 нм), так и конечного продукта (Х=465 нм).

Установлено, что как и в случае окисления о-дианизидина фенольные соединения (фенол, резорцин и 4-метоксифенол) с большими, чем у ТМБ, окислительно-восстановительными потенциалами, понижают скорость его окисления, в большей степени замедляя образование конечного продукта.

В случае пирокатехина, гидрохинона, пирогаллола и 1-нафтола с меньшими, чем у ТМБ, потенциалами, при концентрациях 0,5 - 5 мкМ на кинетической кривой накопления промежуточного и конечного продуктов окисления ТМБ наблюдаются два участка. Продолжительность первого (пологого) участка - индукционного периода -пропорциональна концентрации соответствующего фенола в индикаторной системе. Наклон второго (восходящего) участка практически не. меняется в присутствии разных содержаний гидрохинона и пирокатехина, и несколько падает при увеличении концентрации пирогаллола и 1-нафтола в реакционной смеси.

Для более детального изучения природы различного характера влияния фенолов на скорость индикаторных реакций проведено спектрофотометрическое исследование процессов пероксидазного окисления о-дианизидина и ТМБ в присутствии типичных представителей фенолов первой и второй групп резорцина и гидрохинона.

Анализ изменения во времени спектров поглощения гидрохинона и продукта его индивидуального пероксидазного окисления в ультрафиолетовой области показал, что скорость этого процесса очень мала. При совместном присутствии гидрохинона и о-дианизидина (или ТМБ) на первом этапе (в течение 5 мин) окисляется только гидрохинон, что характеризуется значительным ростом полосы поглощения хинона (245 нм), и лишь через 5 мин начинается окисление о-дианизидина (или ТМБ) (кривые 57). Следовательно, гидрохинон (и аналогично другие фенольные соединения этой группы) являются субстратами пероксидазы наряду с о-дианизидином (или ТМБ). При этом пероксидазное окисление гидрохинона в присутствии основного субстрата фермента происходит в первую очередь и протекает значительно быстрее (кривые 5-7), чем его индивидуальное окисление (кривые 3,4).

Таким образом, в рассматриваемых индикаторных системах имеет место эффект субстрат-субстратной активации окисления фенолов второй группы в присутствии арилдиаминов. Вследствие этого на кинетических кривых их совместного пероксидазного окисления наблюдается индукционный период. В течение индукционного периода окисляется фенольное соединения и лишь, а затем начинает окисляться о-дианизидин (или ТМБ); при этом возрастает оптическая плотность раствора, поскольку скорость индикаторной реакции контролируют по накоплению продукта окисления основного субстрата (рис. 1, кривые 4-б).Таким образом, для описания процесса совместного окисления фенолов второй группы и о-дианизидина (или ТМБ), катализируемого пероксидазой арахиса, мы можем использовать схему 3.

А

Рис. 2. Изменение во времени спектра поглощения продуктов индивидуального (1-4) и совместного (5-7) окисления о-дианизидина (1-2) и гидрохинона (3-4), катализируемого пероксидазой арахиса (время после смешения компонентов реакции, мин: 1, 3, 5 -2; 2, 6 - 5; 4, 7 - 10). Концентрации: пероксидазы арахиса - 0,1 нМ, о-дианизидина - 20 мкМ, гидрохинона -0,4 мкМ, пероксида водорода - 1,2 мМ.

А

240 270 300 330 X, НМ

Рис. 3. Изменение во времени спектра поглощения продуктов индивидуального (1-3) и совместного (4-6) окисления о-дианизидина (1-2) и резорцина (3), катализируемого пероксидазой арахиса (время после смешения компонентов реакции, мин: 3, 4 - 2; 2, 5 - 5; 6 - 15; 3 - 120). Концентрации: пероксидазы арахиса - 0,1 нМ, о-дианизидина - 20 мкМ, резорцина - 0,4 мкМ, пероксида водорода - 1,2 мМ.

е + н202 —>-е]

к1

Е,+ВН2

егбн2

е2-он* —е + р,

У

к\ | [Б]

егбн2 + р2

где Е - нативная пероксидаза; Е] и Ег - промежуточные формы фермента, содержащие, соответственно два (Е[) и один (Е2) окислительных эквивалента; БН; - о-дианизидин; ЕрБНг - комплекс Соединения I с о-дианизидином; Е^БН» - комплекс Соединения II с полуокисленным о-дианизидином (ОН«), зарегистрированный спектральным методом.; Б - фенольное соединение второй группы, Р| и Р2 -продукты индивидуального окисления о-дианизидина и фенолыюго соединения, соответственно.

В отличие от фенолов второй группы фенолы-ингибиторы, в частности резорцин, не окисляются ни в отсутствие (рис. 3, кривая 3), ни в присутствии арилдиаминов (кривые 4-6). Эти фенольные соединения замедляют пероксидазное окисление основного субстрата. Изучение типа ингибирования пероксидазы арахиса фенолами первой группы показало, что оно протекает, в основном, по конкурентному типу, то есть фенольное соединение и основной субстрат - ароматический диамин конкурируют за места связывания вблизи активного центра фермента.

Таким образом, нами показано, что характер влияния изученных фенольных соединений на кинетику пероксидазного окисления о-дианизидина и ТМБ одинаков и определяется, в основном, соотношением окислительно-восстановительных потенциалов их и основного субстрата фермента.

Для дальнейшего изучения влияния фенолов и подтверждения высказанной гипотезы, выбрали бензидин, поскольку его окислительно-восстановительный потенциал значительно выше, чем у о-дианизидина и ТМБ. При изучении химизма окисления бензидина, катализируемого пероксидазой арахиса, нами показано, что единственным продуктом реакции так же, как и в присутствии пероксидазы хрена, является мерихиноидный комплекс:

Влияние ряда фенольных соединений на кинетику пероксидазного окисления бензидина

^гаах 410,595 нм

Схема 4.

Для изучения влияния на кинетику пероксидазного окисления бензидина были выбраны следующие соединения: резорцин, с большим, чем у бензидина потенциалом; 3-аминофенол, 2- и 4-метоксифенолы и пирогаллол - с меньшими, чем у бензидина потенциалами.

Установлено, что резорцин понижает скорость окисления бензидина при концентрациях >0,1 мкМ, то есть является ингибитором пероксидазы арахиса, а в присутствии пирогаллола на кинетической кривой пероксидазного окисления бензидина при концентрациях > 1 мкМ наблюдается индукционный период, продолжительность которого увеличивается пропорционально его содержанию в индикаторной системе, то есть он является вторым субстратом фермента.

Наиболее убедительное подтверждение выдвинутой гипотезы мы получили при изучении влияния 3-аминофенола, 2- и 4-метоксифенолов, которые в реакции окисления о-дианизидина являются ингибиторами пероксидазы арахиса (табл. 5). Характер влияния этих соединений на кинетику пероксидазного окисления бензидина меняется: кинетические кривые накопления продукта реакции имеют два участка.

Таблица 5.

Характер влияния фенольных соединений на кипетику пероксидазного окисления о-дианизидина (I), ТМБ (II), бензидина (III), о-ФДА (IV)

Определяемое соединение Eox/Rcd, В Эксперим. I II III IV

Резорцин 0,320 Ингибитор Ингибитор Ингибитор Слабый ингибитор

Бензидин 0,310

З-Аминофенол 0,300 Ингибитор _* II Субстрат -

2-Метоксифенол 0,295 Ингибитор Ингибитор II Субстрат -

4-Метоксифенол 0,290 Ингибитор Ингибитор II Субстрат

о-Днанизндин 0,280

Тетраметилбепзндин 0,270

1-Нафтол 0,270 II Субстрат II Субстрат - Не влияет

Пирокатехин 0,265 II Субстрат II Субстрат ■- Не влияет

о-Фенплендиамин 0,260

Гидрохинон 0,240 II Субстрат II Субстрат - Слабый ингибитор

Пирогаллол 0,225 II Субстрат II Субстрат II Субстрат Слабый ингибитор

* - влияние не изучено.

С увеличением концентрации 2-метоксифенола и 3-аминофенола наклоны первого и второго участков понижаются, а продолжительность первого остается неизменной и составляет (120 + 5) и (60 ± 5) сек, соответственно. В случае 4-метоксифенола от его концентрации зависит продолжительность первого и наклон второго участков.

Такой характер кинетических кривых, по-видимому, свидетельствует о том, что в индикаторной системе на первом этапе протекает преимущественно окисление фенолов, то есть они играют роль вторых субстратов пероксидазы арахиса. Причем, чем ближе значение окислительно-восстановительного потенциала фенольного соединения к потенциалу основного субстрата - бензидина (табл. 5), тем менее выражены два участка кинетической кривой, и тем в большей степени характер действия фенола приближается к ингибирующему.

Помимо уже изученных субстратов пероксидазы арахиса - бензидина и его производных, для дальнейшего исследования был выбран о-фенилендиамин (о-ФДА) -известный субстрат пероксидаз, который обладает меньшим окислительно-восстановительным потенциалом, чем упомянутые выше субстраты, и относится к другому классу органических соединений. Изучение химизма и кинетики окисления о-ФДА, катализируемого пероксидазой арахиса, показало, что реакция протекает по описанной в литературе схеме:

При исследовании влияния фенольных соединений с большими и меньшими, чем у о-ФДА, окислительно-восстановительными потенциалами на кинетику пероксидазного окисления этого ароматического диамина показало, что характер влияния фенолов определяется не только соотношением окислительно-восстановительных потенциалов фенольных соединений и основного субстрата.

Было выяснено, что пирокатехин и 1-нафтол, имеющие больший, чем у о-ФДА, потенциал, не влияют на скорость окисления, а резорцин оказывает лишь слабое ингибирующее действие при содержании его в реакционной смеси > 50 мкМ. Гидрохинон и пирогаллол так же, как и резорцин, оказались слабыми ингибиторами фермента (при концентрациях >: 50 мкМ) (табл. 5).

Для объяснения такого действия фенольных соединений, не подчиняющегося выдвинутой ранее гипотезе, были изучены спектры поглощения в УФ-области продуктов индивидуального и совместного пероксидазного окисления о-ФДА и гидрохинона. Установлено, что скорость окисления гидрохинона не увеличивается в присутствии о-

Влняннс ряда фенольных соединений на кинетику пероксидазного окисления о-фенилендиамина

Схема 5.

Х=450нм

ФДА (рис. 4), как это имело место при совместном пероксидазном окислении гидрохинона и других субстратов - о-дианизидина (рис. 2) и ТМБ. При этом скорость нарастания оптической плотности в области поглощения хинонов (240-250 нм) практически аддитивна скоростям нарастания поглощения продуктов индивидуального пероксидазного окисления о-ФДА и гидрохинона. Это свидетельствует о том, что гидрохинон и о-ФДА окисляются пероксидом водорода одновременно, что приводит к замедлению скорости накопления конечного продукта окисления о-ФДА. Субстрат-субстратная активация в этой системе не происходит.

По-видимому, такое «аномальное» (табл. 5) поведение фенолов в указанной индикаторной системе связано с тем, что пероксидазное окисление о-ФДА протекает по механизму, отличному от механизмов окисления бензидина и его производных. Кроме того, из литературы известно, что связывание и превращение о-ФДА происходит в наибольшей близости к активному центру пероксидазы арахиса по сравнению с более объемными соединениями бензидинового ряда. Таким образом, фенолы, близкие к о-ФДА по размеру, в меньшей степени мешают его связыванию и превращению по сравнению с другими субстратами, являясь при этом либо слабыми ингибиторами при достаточно больших концентрациях, либо, как в случае с объемным I-нафтолом, вообще не влияют на скорость окисления о-ФДА.

Изучение индикаторного процесса пероксидазного окисления о-ФДА в присутствии фенолов показало, что характер их влияния зависит не только от соотношения окислительно-восстановительных потенциалов их и основного субстрата, но и от размера молекулы и механизма окисления последнего.

Рис. 4. Изменение во времени спектра поглощения продуктов индивидуального (1-4) и совместного (5-7) пероксидазного окисления о-фенилендиамина (1-2) и гидрохинона (3-4) (время после смешения компонентов реакции, мин: 1, 3, 5 - 0,5; 2, 4, 6 - 5; 7 - 10). Концентрации: пероксидазы арахиса - 0,15 нМ, о-ФДА - 0,04 мМ, гидрохинона - 0,04 мкМ, Н202 - 0,08 мМ.

Определение фенолов с использованием пероксидазы арахиса

Нами разработаны методики определения ряда фенольных соединений с использованием катализируемых пероксидазой арахиса индикаторных реакций окисления о-дианизидина, ТМБ и бензидина. Показано, что для определения фенолов -ингибиторов и фенолов - вторых субстратов следует использовать разные аналитические сигналы - скорость индикаторной реакции и продолжительность индукционного периода, соответственно.

В выясненных оптимальных условиях проявления наибольшего действия фенолов во всех указанных индикаторных реакциях были установлены интервалы концентраций, в которых возможно их определение, и построены градуировочные графики в координатах: скорость индикаторной реакций ^а) - концентрация фенола-ингибитора или продолжительность индукционного периода (хШ1Д, с) - концентрация фенола-второго субстрата

При разработке методик определения фенолов с использованием катализируемых пероксидазой арахиса реакций окисления о-дианизидина и бензидина скорость контролировали по накоплению конечных продуктов окисления (Х,фф = 440 нм и Х3фф = 400 нм, соответственно). При использовании реакции окисления ТМБ скорость индикаторного процесса контролировали по накоплению промежуточного (Я3фф = 364 нм) и конечного (Я.Эфф = 440 нм) продуктов реакции. Показано, что чувствительность определения фенолов - ингибиторов выше при контроле скорости реакции по конечному продукту, а фенолов - вторых субстратов по промежуточному продукту окисления ТМБ.

Сопоставление метрологических характеристик разработанных методик (табл. 6) показывает, что наибольшая чувствительность определения большинства фенолов достигается при использовании о-дианизидина в качестве основного субстрата пероксидазы арахиса.

Так как характер действия фенолов на скорость индикаторного процесса различен, и при их определении использованы разные аналитические сигналы, целесообразно было изучить возможность совместного определения фенолов, и прежде всего - изомеров, относящихся по характеру влияния к различным группам.

На примере трех пар изомеров: резорцина и гидрохинона, 2-аминофенола и 3-аминофенола, а также 1-нафтола и 2-нафтола, было изучено их совместное влияние на скорость окисления о-дианизидина, катализируемого пероксидазой арахиса, при различных соотношениях концентраций фенольных соединений. Установлено, что индивидуальное определение резорцина и гидрохинона при одновременном присутствии возможно при соотношении их концентраций 2:1-6:1 (табл. 7); 2- и 3-аминофенолов -при соотношении их концентраций - 10:1 - 15:1, а при одновременном присутствии нафтолов - при соотношении их концентраций 1:1-1:10.

Метрологические характеристики определения фенолов с использованием пероксидазы арахиса в реакциях оклсления ароматических диаминов

Фенольное соединение о-Дианизидин ЗЗ'^^'-Тетраметнлбензидин Бензидин

440 им ^э64>= 364 им ^э<ЬФ= 440 нм ХэбФ3 400 нм

Сн, мкМ Бг С„, мкМ вг Сн, мкМ С„, мкМ Эг

Резорцин 1 0,19 5 0,09 0,25 0,03 0,1 0,04

З-Аминофенол 0,05 0,01 _а 0,5 0,05

2-Метоксифенол 0,27 0,12 0,75 0,01 _б 0,8 0,03

4-Метоксифенол 1 0,04 _б 2 0,04 0,7 0,04

1 -Нафтол 0,5 0,20 _б 1 0,03 _а

Пирокатехин 3 0,20 2,5 0,06 4,5 0,11 _а

Гидрохинон 1 0,22 2,5 0,15 5 0,16 _а

Пирогаллол 0,5 0,15 0,5 0,01 1 0,04 0,8 0,03

а - влияние не изучали; 6 -методики определения не разрабатывали.

При изучении возможности определения суммарного содержания фенолов -ингибиторов на примере смеси фенола и резорцина (ингибиругощее действие которых наблюдается при концентрациях больших 10 и 1 мкМ, соответственно) показано, что при их совместном присутствии при соотношении их концентраций 10:1 скорость индикаторного процесса снижается. Однако наблюдаемое понижение не является результатом аддитивного ингибиругощего действия этих фенолов при тех же концентрациях, что не позволяет определять суммарное содержание фенолов первой группы. По-видимому, это объясняется конкурированием фенола и резорцина за связывание с одними и теми же функциональными группами белковой глобулы фермента вблизи активного центра.

Аддитивность действия наблюдается при совместном присутствии фенолов -вторых субстратов (гидрохинона, пирокатехина и пирогаллола) при соотношении их концентраций 1:1:1. Индукционный период при их одновременном присутствии равен по продолжительности сумме индукционных периодов при индивидуальном присутствии этих фенольных соединений, что свидетельствует о возможности определения суммарного содержания фенолов - вторых субстратов.

Результаты определения ряда фенольных соединений при их совместном присутствии (п=3, Р=0,95)

Фенольное соединение с, мкМ tga•102

... 10,8 ±0,4 —

Резорцин Гидрохинон 4 12 2 8,1 ± 0,1 5,7 ± 0,2 9,5 ±0,2 42 ± 3

Резорцин + Гидрохинон 4 (2 :1) 2 8,0 ± 0,2 40 ±1

Резорцин + Гидрохинон 12 (6 :1) 2 5,9 ±0,1 38 ±2

2-Аминофенол 3-Аминофенол 1,5 0,1 10,1 ±0,3 8,6 ± 0,2 28 ±3

2-Аминофенол - + 3-Аминофенол 1,5 (15:1) 0,1 8,2 ± 0,4 31 + 1

1-Нафтол 2-Нафтол 1 2 10 10,5 ±0,2 8,3 ± 0,2 5,1 ± 0,2 51 ±4

1-Нафатол + 2-Нафтол 1 (1 :2) 2 8,6 ± 03 48 ±2

1-Нафтол + 2-Нафтол 1 (1: 10) 10 4,8 ± 0,2 46 ±2

Фенол Резорцин 60 6 8,1 ±0,3 8,0 ±0,1 —

Фенол + Резорцин 60 6 6,8 ±0,1 (аддитив. 5,3) ...

Гидрохинон Пирокатехин Пирогаллол 2 2 2 9,7 ±0,1 10.3 + 0,1 10.4 ±0,2 32 ±2 28 ±1 42 ±1

■ Гидрохинон • • + Пирокатехин + Пирогаллол 2

2 10,5 ±0,3 100 ±2

2

Возможность индивидуального определения фенольных соединений при ювместном присутствии в подземной воде, отобранной в Раменском районе Московской >бласти, показана на примере определения 2- и 3-аминофенолов и 1- и 2-нафтолов методом «введено - найдено». Полученные результаты определения фенолов в фиродной воде представлены в табл. 8.

Таблица 8.

Результаты определения фенолов в природной воде методом «введено-найдено» (п=3, Р=0,95)

Фенольное соединение Введено, М Найдено, М

2-Аминофенол 4,2-10"5 1,4-Ю-4 (4,2 ± 0,4)-10"5 (1,4 ±0,1)-10"4 0,05 0,03

З-Аминофенол 2,8-10"6 1,4-10"5 (2,5 ±0,8)-10~6 (1,4 ± 0,1)-10"5 0,05 0,02

2-Аминофенол + 3-Аминофенол 4,2-10"5 (4,2 ± 0,6)-10"5 0,06

2,8-Ю'6 (2,5 ± 1,0)-10"6 0,15

2-Аминофенол + 3-Аминофенол 1,4-Ю"4 (1,4 ± 0,2)-10"5 0,02

1,4-Ю-5 (1,2 ± 0,6)-1 О*5 0,10 .

1-Нафтол 2,1-Ю"5 5,7-10"! (2,1 ± 0,4)-10"5 (5,6 ± 0,5)-10"5 0,09 0,04

2-Нафтол 4,2-10"5 11,4-Ю-5 (3,8 ± 0,6)-10"5 (11,1 ±0,5)-10"5 0,02 0,02

1-Нафтол + 2-Нафтол 2,МО"5 (2,2 ± 0,4)-10"5 0,03

4,2-10"5 (6,0 ± 0,2)-10"5 0,07

1 -Нафтол + 2-Нафтол 5,7-10"5 (5,6 +0,3)-10"5 0,09

11,4-10'5 (12,3 ± 0,6)-10'5 0,02

Сопоставление метрологических характеристик методик определения фенолов по индикаторной реакции окисления о-дианизидина, катализируемой пероксидазой арахиса, з также пероксидазами, выделенными из корней хрена, клеток люцерны и ксилотрофного гриба, показывает, что применение пероксидазы арахиса позволяет достичь более высокой чувствительности определения фенолов и только пероксидаза гриба более (или в той же степени) чувствительна к действию гидрохинона (или пирогаллола) (табл. 9).

Сопоставление метрологических характеристик определения фенолов с использованием перокеидаз различного происхождения

Фенольное соединение Пероксидазы

Резорцин с„, мкМ Арахиса Гриба Хрена Люцерны 1,1 < 3,2 < 5,4 < 13

Гидрохинон с„, мкМ Гриба Арахиса Хрена Люцерны 0,8 < 1,2 < 4,5 < 7,2

Пирогаллол сн, мкМ Арахиса Гриба Хрена Люцерны 0,5 = 0,5 < 0,6 < 0,8

ВЫВОДЫ

1. Обоснована целесообразность использования пероксидазы арахиса в химическом анализе, в частности, для определения ртути(Н) и фенольных соединений по реакциям пероксидазного окисления ароматических диаминов.

2. Обнаруженное различие в степени и характере ингибирующего влияния ртути(И) на каталитическую активность перокеидаз, выделенных из клеток арахиса и корней хрена, в сочетании с данными изучения возможных причин этого отличия свидетельствует о возможном наличии (помимо установленных и описанных в литературе) еще невыясненных, либо недоказанных различий в структурах этих ферментов.

3. Установлено, что соотношение окислительно-восстановительных потенциалов фенольных соединений и основного субстрата пероксидазы арахиса - бензвдина, о-дианизидина или 3,3',5,5'-тетраметилбензидина - является основным фактором, определяющим характер влияния изученных фенольных соединений (их действия как ингибиторов или вторых субстратов) на скорость катализируемого пероксидазой арахиса окисления ароматических диаминов. Характер влияния фенолов зависит, кроме того, от размера и структуры их молекул, а также механизма окисления основного субстрата-восстановителя пероксидазы арахиса.

4. Показано, что причиной появления на кинетической кривой индукционного периода служит активация основным субстратом (бензидином, о-дианизидином или 3,3',5,5'-тетраметилбензидином) пероксидазного окисления фенолов с меньшими, чем у этих ароматических диаминов окислительно-восстановительными потенциалами (явление субстрат-субстратной активации).

5. Установлено, что использование различных ароматических диаминов в качестве основных субстратов-восстановителей пероксидазы арахиса, а также разных аналитических сигналов - скорости индикаторного процесса и продолжительности индукционного периода, позволяет регулировать чувствительность и селективность определения фенольных соединений.

5. С использованием реакций пероксидазного окисления ароматических диаминов разработаны ферментативные методики определения:

ртути(П) по ее ингибирующему действию на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина (с„ = 0,2 нг/мл); ряда фенольных соединений в диапазоне концентраций 0,05 - 50 мкМ (0,005 -50 мкг/мл) на основании различного характера их влияния на кинетику пероксидазного окисления ароматических диаминов - бензидина, о-дианизидина или 3,3',5,5'-тетраметилбензидина;

ряда изомеров фенолов (резорцина и гидрохинона, 2- и 3-аминофенолов; 1- и 2-нафтолов), относящихся к разным группам - ингибиторам и вторым субстратам, при их совместном присутствии с использованием разных аналитических сигналов - скорости индикаторного процесса и продолжительности индукционного периода; ртути(П) на уровне концентраций 10 - 50 нг/мл в природной воде по реакции пероксидазного окисления о-дианизидина;

ряда фенольных соединений (2- и 3-аминофенолов; 1- и 2-нафтолов) на уровне концентраций 3-100 мкМ (0,3 - 15 мкг/мл) при их индивидуальном и совместном присутствии в природной воде по реакции пероксидазного окисления о-дианизидина.

Автор выражает глубокую благодарность д.х.н. вед. сотр. кафедры химической этимологии химического факультета МГУ И.Г. Газарян за участие з постановке работы и обсуждении результатов.

Публикации:

1.Шеховцова Т.Н., Чернецкая (Мугинова) С.В., Багирова Н.А., Долманова И.Ф. Использование пероксидаз в анализе объектов окружающей среды. / Тез. Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-96». Краснодар. 1996 (29 сентября - 4 октября). С. 185.

2. Shekhovtsova T.N., Muginova S.V., Bagirova N.A. Determination of organomercury compounds using immobilized peroxidase. //Anal. Chim. Acta. 1997. V. 344. P. 145-151.

3. Shekhovtsova T.N., Bagirova N.A., Gazaryan I.G. Application of different peroxidases for the determination of phenols. / International Congress on Analytical Chemistry. Moscow. 1997 (June 15 - 21). P. 16.

4. Shekhovtsova T.N., Bagirova N.A., Tabatchikova N.V., van Huystee R.B. Application of peanut peroxidase for the determination of phenols and mercury (II). / International Workshop on Peroxidase Biotechnology and Application. Pushkino. Russia. 1997 (June 25 -28). P. 13.

5. Bagirova N.A., Shekhovtsova T.N., Shopova E.A., van Huystee R.B. Enzymatic determination of a- and р-naphthols using peanut peroxidase. // Mendel. Commun. 1998. N4. P. 157-159.

6. Shekhovtsova T.N., Muginova S.V., Bagirova N.A., Veselova I.A. Application of some enzymes in environmental analysis. / Proceedings of the International Conference "Biocatalysis 98: Fundamentals and Applications". Puschino. Russia. 1998 (June 13 - 18). P. 54.

7. Шеховцова Т.Н., Багирова H.A., Веселова И.А. Ферментативный метод определения фенолов. / Тез. Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-98». Краснодар. 1998. (20 - 25 сентября). С. 192.

8. Bagirova N.A., Shekhovtsova T.N., van Huystee R.B. The effect of phenols redox properties on kinetics of the reaction catalyzed by peroxidases. / 6-th International Symposium on Kinetics in Analytical Chemistry. Kassandra. Chalkidiki. Greece. 1998 (September 16-19). P. 108.

9. Багирова H.A., Шеховцова Т.Н.. Кинетика и химизм катализируемых пероксидазами арахиса и хрена реакций окисления ортио-дианизидина и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина пероксидом водорода. // Кинетика и катализ. 1999. Т. 40. № 1.

10. Багирова H.A., Табатчикова Н.В., Шеховцова Т.Н. Фенол и его производные как ингибиторы и субстраты пероксидазы арахиса. / VII Всероссийская конференция «Органические реагенты в аналитической химии». Саратов. 1999. (20 - 25 сентября).

11. Багирова Н.А., Табатчикова Н.В., Шеховцова Т.Н., ван Хыости Р.Б. Ферментативный метод определения фенолов с использованием пероксидазы арахиса. // Журн. аналит. химии. 2000. Т. 55. № 1. С. 93 - 101.

С. 265-272.

С. 71.

ВВЕДЕНИЕ 5 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава

Строение и свойства пероксидазы арахиса

1.1. Классификация пероксидаз

1.2. Строение пероксидазы арахиса и других пероксидаз

1.2.1. Общая характеристика структур пероксидаз

1.2.2. Окружение тема в молекуле пероксидаз

1.2.3. Роль ионов кальция в структуре пероксидаз

1.2.4. Углеводная структура пероксидаз

1.2.5. Изоферменты пероксидазы арахиса

1.3. Механизм действия и субстратная специфичность пероксидаз

Глава

Ферментативные методы определения фенола и его производных 41 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава

Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика эксперимента, обработка результатов измерений •

3.1. Исходные вещества

3.2. Посуда и аппаратура

3.3. Методика эксперимента

3.4. Обработка результатов измерений

Глава

Влияние ртути(П) на каталитическую активность пероксидазы арахиса

4.1. Выбор оптимальных условий окисления о-дианизидина, катализируемого пероксидазой арахиса

4.2. Влияние ртути(И) на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина

4.3. Выяснение возможных причин различного ингибирующего действия ртути(П) на растительные пероксидазы из разных источников

4.3.1. Сравнительное изучение влияние ртути(П) на каталитическую активность пероксидазы арахиса, нативной и рекомбинантной пероксидаз хрена

4.3.2. Влияние ртути(П) в присутствии тиомочевины на каталитическую активность различных пероксидаз

4.3.3. Возможные причины различного ингибирующего действия ртути(П) на растительные пероксидазы из разных источников

4.4. Определение ртути(П) с использованием реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, катализируемого пероксидазой арахиса

Глава

Влияние фенольных соединений на каталитическую активность пероксидазы арахиса

5.1. Влияние фенола и его производных на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления о-дианизидина

5.1.1. Кинетика и химизм реакции пероксидазного окисления о-дианизидина

5.1.2. Влияние фенольных соединений на кинетику индикаторного процесса

5.1.3. Причины различного характера влияния фенолов на кинетику пероксидазного окисления о-дианизидина

5.1.4. Изучение типа ингибирования пероксидазы арахиса фенолами

5.1.5. Спектрофотометрическое изучение пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии ряда фенольных соединений

5.2. Влияние фенольных соединений на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления

3,3',5,5'-тетраметилбензидина

5.2.1. Кинетика и химизм пероксидазного окисления

3,3',5,5'-тетраметилбензидина

5.2.2. Влияние ряда фенольных соединений на кинетику индикаторного процесса

5.2.3. Спектрофотометрическое изучение совместного пероксидазногоокисления 3,3',5,5'-тетраметилбензидина и ряда фенольных соединений

5.3. Влияние фенольных соединений на кинетику на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления бензидина

5.3.1. Химизм пероксидазного окисления бензидина

5.3.2. Влияние ряда фенольных соединений на кинетику индикаторного процесса

5.4. Влияние фенольных соединений на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления о-фенилендиамина

5.4.1. Кинетика и химизм пероксидазного окисления о- фенилендиамина

5.4.2. Влияние ряда фенольных соединений на кинетику индикаторного процесса

5.4.3. Спектрофотометрическое изучение системы о- фенилендиамина - гидрохинон - пероксидаза арахиса -пероксид водорода

5.5. Определение фенольных соединений с использованием пероксидазы арахиса

5.5.1. Определение фенолов по реакции пероксидазного окисления о-дианизидина

5.5.2. Определение фенолов по реакции пероксидазного окисления 3,35,5' -тетрамети л б ею и дина

5.5.3. Определение фенолов по реакции пероксидазного окисления бензидина

5.5.4. Сопоставление результатов определения фенолов с использованием различных индикаторных реакций и пероксидаз, выделенных из разных источников

5.5.5. Определение фенолов при совместном присутствии с использованием пероксидазы арахиса

5.5.6. Определение фенолов в природной воде ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Актуальность. Охрана окружающей среды остается одной из основных проблем современной науки, в том числе аналитической химии. Перспективным направлением экологического мониторинга является разработка и применение ферментативных методов анализа. Использование ферментативных методов целесообразно и перспективно для высокочувствительного, селективного, экономичного определения физиологически активных веществ.

Наиболее изучена и широко применяется в биохимическом анализе пероксидаза, выделенная из корней хрена. В последние годы появилось довольно много работ, посвященных изучению строения и свойств пероксидаз, выделенных из других растений. Отметим, что только для двух растительных пероксидаз - арахиса и хрена, установлена и изучена кристаллическая структура. Известно, что это наиболее близкие по аминокислотному составу растительные пероксидазы, отличающиеся однако по физико-химическим свойствам.

До настоящего времени систематического изучения субстратов и эффекторов (ингибиторов и активаторов) пероксидазы арахиса не проводилось, и этот фермент практически не использовали в аналитических целях. В то же время выявление субстратов и эффекторов пероксидазы арахиса и разработка методов их определения важны как с теоретической, так и с практической точек зрения, поскольку данные, полученные в результате такого исследования, могут внести весомый вклад в изучение субстратной специфичности, механизма действия пероксидазы арахиса, и позволят оценить перспективы ее использования в химическом анализе.

Выбор объектов исследования - фенолов разного строения и ртути(П), обусловлен тем, что указанные соединения высоко токсичны, относятся к приоритетным загрязнителям окружающей среды, и разработка высокочувствительных методов их определения - актуальная задача аналитической химии. Кроме того, в литературе имеются сведения о влиянии этих токсикантов на другие растительные пероксидазы, в первую очередь пероксидазу хрена. Сравнение данных о характере и степени воздействия одних и тех же соединений на ферменты разного происхождения целесообразно для уточнения структуры и свойств биологических катализаторов, выявления среди них наиболее чувствительного к воздействию эффекторов и, следовательно, наиболее перспективного для использования в химическом анализе.

Цель настоящей работы - изучение характера влияния на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакциях окисления различных ароматических диаминов фенола и его производных, а также ртути(П), разработка методик их определения и выяснение целесообразности применения пероксидазы арахиса в ферментативных методах анализа.

Научная новизна заключается в том, что

- в результате изучения влияния ртути(П) и фенольных соединений на скорость катализируемых пероксидазой арахиса реакций окисления ароматических диаминов и разработки высокочувствительных методик их определения обоснована целесообразность использования этого фермента в аналитических целях;

- на основании данных сравнительного изучения действия ртути(П) на каталитическую активность пероксидаз, выделенных из клеток арахиса и корней хрена, в реакции окисления о-дианизидина установлено, что степень ингибирующего влияния ртути(П) на пероксидазы, выделенные из разных источников, различна, и в отличие от пероксидазы хрена для ингибирования пероксидазы арахиса ртутью(П) не требуется предварительная обработка фермента серосодержащим ингибитором - тиомочевиной;

- установлено, что по характеру влияния на скорость катализируемого пероксидазой арахиса окисления ароматических диаминов изученные фенольные соединения делятся на две группы - ингибиторы и вторые субстраты фермента;

- показано, что характер влияния фенола и его производных на кинетику индикаторного процесса определяется, в первую очередь, соотношением окислительно-восстановительных потенциалов фенольных соединений и основного субстрата пероксидазы арахиса - бензидина, о-дианизидина или 3,3' ,5,5'-тетраметилбензидина;

- выяснено, что основные субстраты пероксидазы арахиса (бензидин и его производные) активируют окисление вторых субстратов - фенолов, то есть в индикаторной системе наблюдается явление субстрат-субстратной активации;

- обоснована целесообразность использования для регулирования чувствительности и селективности определения фенольных соединений различных субстратов-восстановителей пероксидазы арахиса (бензидина и его производных); разных аналитических сигналов - скорости индикаторного процесса или продолжительности индукционного периода.

Практическую значимость имеют разработанные с использованием реакций пероксидазного окисления ароматических диаминов ферментативные методики определения:

- ртути(П) по ее ингибирующему действию на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина (с„ = 0,2 нг/мл);

- ряда фенольных соединений в диапазоне концентраций 0,05 - 50 мкМ (0,005 - 50 мкг/мл) на основании различного характера их влияния на скорость пероксидазного окисления ароматических диаминов - о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина или бензидина;

- ряда изомеров фенолов - ингибиторов и вторых субстратов, при их совместном присутствии с использованием разных аналитических сигналов I

- скорости индикаторного процесса и продолжительности индукционного периода, соответственно;

- определения ртути(П) и ряда фенольных соединений (аминофенолов и нафтолов) в природных водах.

Автор выносит на защиту:

1. Результаты сравнительного изучения влияния ртути(П) на скорость окисления о-дианизидина, катализируемого пероксидазой арахиса, а также нативной и рекомбинантной пероксидазами хрена; данные исследования возможных причин различного по характеру и степени влияния ртути(П) на каталитическую активность пероксидаз арахиса и хрена.

2. Результаты изучения характера влияния широкого круга фенольных соединений с различной природой и положением заместителей в бензольном кольце, различными кислотно-основными и окислительно-восстановительными свойствами на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления ароматических диаминов - о-дианизидина, 3,3 \ 5,5' -тетраметилбензидина, бензидина и о-фенилендиамина, а также обоснование выявленных при этом закономерностей.

3. Ферментативные методики определения

- ртути(П) по ее ингибирующему действию на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина (сн = 0,2 нг/мл);

- фенолов на основании различного характера их влияния на скорость пероксидазного окисления ароматических диаминов - о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина или бензидина с нижними границами определяемых содержаний 0,05 - 5 мкМ (0,005 - 5 мкг/мл);

- ряда изомеров фенолов (резорцина и гидрохинона, 2- и 3-аминофенолов; 1-й 2-нафтолов), относящихся к разным группам - ингибиторам и вторым субстратам, в смеси с использованием разных аналитических сигналов -скорости индикаторного процесса и продолжительности индукционного периода, соответственно;

- ртути(П) на уровне концентраций 10-50 нг/мл в природной воде по реакции пероксидазного окисления о-дианизидина;

- ряда фенольных соединений (2- и 3-аминофенолов; 1- и 2-нафтолов) на уровне концентраций 3-100 мкМ (0,3 - 15 мкг/мл) при индивидуальном и совместном присутствии в природной воде по реакции пероксидазного окисления о-дианизидина.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Глава 1. Строение и свойства пероксидазы арахиса

Обсуждение строения и свойств пероксидазы арахиса - фермента, являющегося основным объектом нашего исследования, невозможно без определения ее места в ряду растительных пероксидаз, сопоставления имеющихся о ней сведений с данными о других пероксидазах, поэтому именно так, сравнивая пероксидазу арахиса с ее «собратьями», выделенными из других источников, анализируя их сходные черты и отличия, мы постараемся изложить обнаруженные нами литературные данные.

выводы

1. Обоснована целесообразность использования пероксидазы арахиса в химическом анализе, в частности, для определения ртути(П) и фенольных соединений по реакциям пероксидазного окисления ароматических диаминов.

2. Обнаруженное различие в степени и характере ингибирующего влияния ртути(П) на каталитическую активность пероксидаз, выделенных из клеток арахиса и корней хрена, в сочетании с данными изучения возможных причин этого отличия свидетельствует о возможном наличии (помимо установленных и описанных в литературе) еще невыясненных, либо недоказанных различий в структурах этих ферментов.

3. Установлено, что соотношение окислительно-восстановительных потенциалов фенольных соединений и основного субстрата пероксидазы арахиса - бензидина, о-дианизидина или 3,3',5,5'-тетраметилбензидина -является основным фактором, определяющим характер влияния изученных фенольных соединений (их действия как ингибиторов или вторых субстратов) на скорость катализируемого пероксидазой арахиса окисления ароматических диаминов. Характер влияния фенолов зависит, кроме того, от размера и структуры их молекул, а также механизма окисления основного субстрата-восстановителя пероксидазы арахиса.

4. Показано, что причиной появления на кинетической кривой индукционного периода служит активация основным субстратом (бензидином, о-дианизидином или 3,3',5,5'-тетраметилбензидином) пероксидазного окисления фенолов с меньшими, чем у этих ароматических диаминов окислительно-восстановительными потенциалами (явление субстрат-субстратной активации).

5. Установлено, что использование различных ароматических диаминов в качестве основных субстратов-восстановителей пероксидазы арахиса, а также разных аналитических сигналов - скорости индикаторного процесса и продолжительности индукционного периода, позволяет регулировать чувствительность и селективность определения фенольных соединений.

6. С использованием реакций пероксидазного окисления ароматических диаминов разработаны ферментативные методики определения:

- ртути(П) по ее ингибирующему действию на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина (сн = 0,2 нг/мл);

- ряда фенольных соединений в диапазоне концентраций 0,05 - 50 мкМ (0,005 - 50 мкг/мл) на основании различного характера их влияния на кинетику пероксидазного окисления ароматических диаминов - бензидина, о-дианизидина или 3,3',5,5'-тетраметилбензидина;

- ряда изомеров фенолов (резорцина и гидрохинона, 2- и 3-аминофенолов; 1-и 2-нафтолов), относящихся к разным группам - ингибиторам и вторым субстратам, при их совместном присутствии с использованием разных аналитических сигналов - скорости индикаторного процесса и продолжительности индукционного периода;

- ртути(П) на уровне концентраций 10-50 нг/мл в природной воде по реакции пероксидазного окисления о-дианизидина;

- ряда фенольных соединений (2- и 3-аминофенолов; 1-й 2-нафтолов) на уровне концентраций 3-100 мкМ (0,3 - 15 мкг/мл) при их индивидуальном и совместном присутствии в природной воде по реакции пероксидазного окисления о-дианизидина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования нами обоснована целесообразность использования одной из малоизученных растительных пероксидаз - пероксидазы арахиса, в химическом анализе, в частности, для высокочувствительного определения ртути(П) и широкого круга фенольных соединений.

Установлено, что ртуть(П) оказывает значительное ингибирующее действие на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина. Результаты сравнительного изучения влияния ртути(П) на скорость этой индикаторной реакции, катализируемой пероксидазой арахиса, а также нативной и рекомбинантной пероксидазами хрена, показали, что степень ингибирующего действия ртути(П) на пероксидазы, выделенные из разных источников, различна и не зависит от количества олигосахаридных цепей в молекуле пероксидазы; она не связана, по-видимому, и с возможным наличием 8Н-групп в молекуле пероксидазы арахиса. Причиной различной степени влияния ртути(П) на пероксидазы арахиса и хрена, по-видимому, является большая лабильность дистального иона кальция в молекуле пероксидазы арахиса, приводящая к некоторому его смещению при воздействии ионов ртути(П).

На основании ингибирующего действия ртути(П) на каталитическую активность пероксидазы арахиса в реакции окисления о-дианизидина разработана высокочувствительная экспрессная методика ее определения, не требующая дополнительного введения второго ингибитора пероксидазы -тиомочевины, необходимого для усиления ингибирующего действия ртути(П) на пероксидазу хрена.

В результате изучения влияния широкого круга фенольных соединений на кинетику пероксидазного окисления бензидина, о-дианизидина и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина показано, что по характеру влияния фенолы делятся на две группы: ингибиторы и вторые субстраты пероксидазы арахиса.

АМ

Установлено, что при одновременном присутствии двух субстратов в индикаторной системе наблюдается эффект субстрат-субстратной активации: бензидин, о-дианизидин и 3,3',5,5'- тетраметилбензидин активируют пероксидазное окисление фенолов с меньшими, чем у них окислительно-восстановительными потенциалами, что приводит к появлению на кинетической кривой индукционного периода.

Указанный характер влияния фенольных соединений не зависит от кислотно-основных свойств фенолов, а определяется, в основном, соотношением величин окислительно-восстановительных потенциалов фенольных соединений и основного субстрата - бензидина или его производных. Кроме того, установлено, что характер влияния фенолов зависит также от размера и структуры молекулы и механизма окисления основного субстрата пероксидазы арахиса.

При разработке методик определения фенолов-ингибиторов и фенолов-вторых субстратов использованы разные аналитические сигналы - скорость индикаторного процесса, либо продолжительность индукционного периода, соответственно, а также реакции окисления различных субстратов пероксидазы арахиса - бензидина и его производных, что позволило регулировать чувствительность и селективность определения одних фенолов в присутствии других.

Важным итогом проведенного исследования явилась выявленная возможность индивидуального определения органических соединений одного класса - фенолов, и, что особенно важно, их изомеров, оказывающих различное влияние на кинетику индикаторного процесса, при совместном присутствии с использованием разных аналитических сигналов.

Разработанный подход можно рекомендовать к использованию при ферментативном определении органических соединений других классов с различными окислительно-восстановительными потенциалами с применением катализируемых пероксидазами окислительно-восстановительных индикаторных процессов.

1. Welinder K.G. Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1992. V. 2. P. 388-393.

2. Газарян И.Г. Пероксидазы растений. Итоги науки и техники. Биотехнология. М.: ВИНИТИ. 1992. Т. 36. С. 4-28.

3. Finzel B.C., Poulos T.L., Kraut J. Crystal structure of yeast cytochrome С peroxidase refined at 1.7 A resolution. // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 13027-13036.

4. Patterson W.R., Poulos T.L. Crystal structure of recombinant pea cytosolic ascorbate peroxidase. // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 4331-4341.

5. Poulos T.L., Edwards S.L., Wariishi H., Gold M.H. Crystallographic refinement of lignin peroxidase at 2 A. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 4429-4440.

6. Sundaramoorthy M., Kishi K., Gold M.H., Poulos T.L. The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete crysosporium at 2.06 A. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 32759-32767.

7. Petersen J.F.W., Kadziola A., Larsen S. Three-dimensional structure of a recombinant peroxidase from Coprinus cinereus at 2.6 A resolution. // FEBS Lett. 1994. V. 339. P.291-296.

8. Schuller D.J., BanN., van Huystee R.B., McPherson A., Poulos T.L. The crystal structure of peanut peroxidase. // Structure. 1996. V. 4. N 3. P. 311-321.

9. Gajhede M., Schuller D.J., Henriksen A., Smith A.T., Poulos T.L. Crystal structure of horseradish peroxidase С at 2.15 A resolution. // Nature Struct. Biol. 1997. V. 4. N 12. P. 1032-1038.

10. Buffard D., Breda C., van Huystee R.B., Asemoto O., Piere M., Dang Ha D.B., Esnault R. Molecular cloning of complementary DNAs encoding two cationic peroxidases from cultivated peanut cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 8874-8878.

11. Rodriguez-Maranon M.J., Hoy A.R., van Huystee R.B. Evidence for the presence of Mn(II) in a peanut peroxidase. An EPR study. // Cell. Mol. Biol. 1994. V. 40. N 7. P. 871-879.

12. Rodriguez-Maranon M.J., van Huystee R.B. Plant peroxidases: interaction between their prosthetic groups. //Phytochemistry. 1994. V. 37. N 5. P. 1217-1225.

13. Lambeir A.M., Dunford H.B., van Huystee R.B., Lobarzewski J. Spectral and kinetic properties of a cationic peroxidase secreted by cultured peanut cells. // Can. J. Biochem. Cell Biol. 1985. V. 63. P. 1086-1092.

14. Chibbar R.N., Cella R., van Huystee R.B. The heme moiety in peanut peroxidase. // Can. J. Biochem. Cell Biol. 1984. V. 62. P. 1046-1050.

15. Dunford H.B. Peroxidases. // Adv. Inorg. Biochem. 1982. V. 2. P. 41-68.

16. Smulevich G., English A.M., Martitni A., Marzocchi M.P. Resonanse Raman investigation of ferric ion in horseradish peroxidase and its aromatic donor complexes at room and low temperature. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 772-779.

17. Poulos T.L., Kraut J. The stereochemistry of peroxidase catalysis. // J. Biol. Chem. 1980. V. 225. P. 8199-8205.j I

18. Hu C., Lee D., Chibbar R.N., van Huystee R.B. Ca and peroxidase derived from cultured peanut cells. // Physiol. Plant. 1987. V. 70. P. 99-102.

19. Rodriguez-Maranon M.J., Stillman M.J., van Huystee R.B. Co-dependency of calcium and porphyrin for an integrated molecular structure of peanut peroxidase: A circular dichroism analysis. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 194. N 1. P. 326-332.

20. Shiro Y., Kurono M., Morishima I. Presence of endogenous calcium ion and its functional and structural regulation in horseradish peroxidase. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 9382-9390.

21. Ogawa S., Shiro Y., Morishima I. Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme environmental structure. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. V. 90. P. 674-678.

22. Barber K.R., Rodriguez-Maranon M.J., Shaw G.S., van Huystee R.B. Structural influence of calcium on the heme cavity of cationic peanut peroxidase as determined by 'H-NMR spectroscopy. // Eur. J. Biochem. 1995. V. 232. P. 825-833.

23. McManus M.T., Ashford D.A. Glycosilation of plant peroxidases. // Plant Peroxidase Newsletter. 1997. N 10. P. 15-23.

24. Wan L., van Huystee R.B. A study on glycosilation of cationic peanut peroxidase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 194. P. 1398-1405.

25. Welinder K.G. Aminoacid sequence studies of horseradish peroxidase. // Eur. J. Biochem. 1979. V. 96. P. 483-502.

26. Wan L., Gijzen M., van Huystee R.B. Heterogeneous glycosilation of cationic peanut peroxidase. // Biochem. Cell. Biol. 1994. V. 72. P. 411-417.

27. Welinder K.G. Covalent structure of the glycoprotein horseradish peroxidase. // FEBS Lett. 1976. V. 72. P. 19-23.

28. Tieger H.A. Quesada M.A. Heredia A., Valpuesta V. Partial deglycosilation of an anionic isoperoxidase from peach seeds on enzyme activity, stability and antigenicity. //Physiol. Plant. 1991. V. 83. P. 144-148.

29. Sanchez-Romero C., Garcia-Gomez M.L., Pliego-Alfaro F., Heredia A. Effect of partial deglycosilation on catalytic characteristics and stability of an avocado peroxidase. // Physiol. Plant. 1994. V. 92. P. 97-101.

30. Xu Y., van Huystee R.B. Identification of an antigenic determinant on anionic peanut peroxidase by monoclonal antibodies. // J. Exp. Bot. 1991. V. 42. P. 935-945.

31. Stephan D., van Huystee R.B. Some aspects of peroxidase synthesis by cultured peanut cells. //Z. Pflanzenphysiol. 1980. V. 10. P. 313-321.

32. Chance B. The kinetics of the enzyme-substrate compound of peroxidase. // J. Biol. Chem. 1943. V. 151. P. 553-577.

33. Sivaraja M., Goodin D.B., Smith M., Hoffinan B.M. Identification of Thrl91 as the free-radical site in CCP compound ES. // Science. 1989. V. 245. P. 738-740.

34. Dolman D., Newell G.A., Thurlow M.D., Dunford H.B. A kinetic study of the reaction of horseradish peroxidase with hydrogen peroxide. // Can. J. Biochem. 1975. V. 53. P. 495-501.

35. Newmyer S.L. Ortiz de Montellano R.P. Horseradish peroxidase His42—>Ala, His42—>Val and Phe41 —>Ala mutants. Histidine catalysis and control of substrate access to the heme iron. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 19430-19438.

36. Nagano S., Tanaka M., Ishimori K., Watanabe Y., Morishima I. Catalytic roles of the distal site asparagin histidin couple in peroxidases. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 14251-14258.

37. Газарян И.Г. Пероксидазы растений механизм действия и белковая инженерия. Дисс. д.х.н. М.: МГУ. 1996. 305 с.

38. Vitello L.B., Erman J.E., Miller M.A., Mauro J.M., Kraut J. Effect of Asp235-+Asn substitution on the absorption spectrum and hydrogen peroxide reactivity of cytochrome С peroxidase. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 11524-11535.

39. Veitch N.C. Aromatic molecule binding site of haem peroxidases. // Biochem. Soc. Trans. 1995. V. 23. P. 232-240.

40. Коренман Я.И. Ароматические соединения экоаналитические проблемы. // Соросовский Образовательный Журнал. 1999. №12. С. 35-39.

41. Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. 1985. Л.:Химия. 528 с.

42. Finger S., Tkalcevic В., Frobe Z., Drevencar V. Analysis of polychlorinated biphenyls, organochlorine pesticides and chlorophenols in rain and snow. // Analyst. 1994. V. 119. №6. P. 1135-1140.

43. Gremand E., Turesky R.J. Rapid analytical methods to measure pentachlorophenol in wood. // J. Agric. Food Chem. 1997. V. 45. №4. P. 1229-1233.

44. Chriswell C.D., Chang R.C., Fritz J.S. Chromatographic determination of phenols in water. //Anal. Chem. 1995. V. 47. №8. P. 1325-1329.

45. Коренман Я.И., Алымова A.T., Каменкина С.П. Газохроматографическое определение летучих фенолов в воде с пробоотбором на импрегнированный твердый сорбент. // Заводская лаборатория. 1995. Т. 61. № 3. С. 1-4.

46. Louter A.J.H., Jones Р.А., Jorritsma J.D., Vreuls J.J., Brinkman U.A.T. Automated derivatization for on-line solid-phase extraction gas chromatography phenolic compounds. // J. High Resoul. Chromatogr. 1997. V. 20. №7. P. 363-368.

47. Turnes I., Rodriguez I., Garcia C.M., Cela R. Determination of chlorophenols in drinking water with high resolution gas chromatography tandem mass-spectrometry. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 743. №2. P. 283-292.

48. Thomas J.B. Identification and quantification of mono-, di-, and trihydroxibenzenes (phenols) at trace concentration in sea water by aqueous acetylation and GC/MS analysis. // J. Chromatogr. A. 1994. V. 662. №2. P. 281-292.

49. Jaoregui О., Galceran М.Т. Determination of phenols in water by on-line solid-phase disk extraction and liquid chromatography with electrochemical detection. // Anal. Chim. Acta. 1997. V. 340. №1-3. P. 191-199.

50. Puig D., Barcelo D. Determination of polar priority phenols at parts per trillion levels in water using on-line liquid-solid extraction followed by liquid chromatography with coulonometric detection. //J. Chromatogr. A. 1997. V. 778. №1-2. P. 313-319.

51. Хрящевский A.B., Подловченко М.Б., Нестеренко П.Н., Шпигун О.А. Применение сверхсшитого макросетчатого полистирола для концентрирования фенолов. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1998. Т. 39. №3. С. 196-200.

52. Penner N.A., Nesterenko P.N., Khryaschevsky A.V., Stranadko T.N., Shpigun O.A. A novel stationary phase for the high liquid chromatographic separation and determination of phenols. // Mendeleev Commun. 1998. №1. P. 24-27.

53. Pocurull E., Marce R.M., Borrull F. Determination of phenolic compounds in natural waters by liquid chromatography with ultraviolet and electrochemical detection after on-line trace enrichment. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 738. №1. P. 1-9.

54. Tsuryupa V.P., Ilyin M.M., Andreeva A.I., Davankov Y.A. Use of the hyper-crosslinked polysterene sorbents "Styrosorb" for solid phase extraction of phenols from water. // Fresenius J. Anal. Chem. 1995. V. 352. №7-8. P. 672-675.

55. Cliffe S., Fawer M.S., Maier G., Takata K., Ritter G. Enzyme assays for the phenolic content of natural juices. // J. Agric. Food Chem. 1994. V. 42. №8. P. 1824-1828.

56. Galceran M.T., Jauregui O. Determination of phenols in sea water by liquid chromatography with electrochemical detection after enrichment by using solid-phase extraction cartridge and discs. //Anal. Chim. Acta. 1995. V. 304. №1. P. 75-84.

57. Cruz I., Wells D.E. Determination of pentachlorophenol by exhaustive methylation and capillary gas chromatography in sewage sludge, contaminated water. // Int. J. Environ. Anal. Chem. 1992. V. 48. №2. P. 101-114.

58. Brown F.R., Draper W.M. Separation of phenols and their glucuronide and sulfate conjugates by anion-exchange liquid chromatography. // J. Chromatogr. 1989. V. 479. P. 441-444.

59. Fischer W., Bund O., Hauck H.E. Thin-layer chromatographic analysis of phenols on TLC-aluminium sheets RP-18 F2545. // Fresenius J. Anal. Chem. 1996. V. 354. №7-8. P.889-891.

60. Sherma J., Boldnieks J. Determination of pentachlorophenol residues in tallow by quantitative TLC. // J. Liquid Chromatogr. 1990. V. 13. №20. P. 3971-3947.

61. Korenmann Ya.I., Yermolaeva T.N. Potentiometric titration of phenols in non-aqueous polar extract. // Analyst. 1995. V. 120. №9. P. 2387-2391.

62. Гурьев И.А., Гущина E.A., Митина E.H. Двухфазное потенциометрическое титрование фенолов с ионселективным электродом. // Журн. аналит. химии. 1979. Т. 34. №6. С. 1184-1188.

63. Barek J., Berka A., Divoca D. Colourimetric determination of hydroquinone, 4-aminophenol and methol with trivalent manganese fluoride complex. // Collect. Czechoslov. Chem. Commun. 1985. V. 50. №3. P. 600-610.

64. Chico Guijarro E., Yanez-Sedeno P., Pingarron Carrazon J.M., Polo Diez L.M. Voltametric determination of 4-chloro-3-methylphenol at a glassy carbon electrode. // Fresenius J. Anal. Chem. 1991. V. 339. №3. P. 193-196.

65. Ignjatovic J.M., Markovic D.A., Vukelic N.S. The polarographic determination of phenol. // J. Serb. Chem. Soc. 1993. V. 58. №9. P. 705-710.

66. Christophersen M.J., Cardwell T.J. Determination total phenols in waters and wastewaters by flow-injection with electrochemical detection, the alternative to the standard colourimetric procedure. // Anal. Chim. Acta. 1996. V. 323. №1-3. P. 39-46.

67. Bosh F., Font G., Manes J. Ultraviolet spectrophotometric determination of phenols in natural and waste waters with iodine monobromide. // Analyst. 1987. V. 112. №9. P. 1135-1137.

68. Liu K., Chen Y. Extraction-spectrophotometric determination of volatile phenol in water with 4-aminoantipyrine. // Huaxue Yu Nianhe. 1997. №2. P. 118-120. U,ht. no Chem. Abstr. 1997. № 289527.

69. Chen Y., Wang S., Zhou T. Spectrophotometric determination of trace phenol in water after preconcentration on an organic solvent-soluble membrane filter. // Anal. Lett. 1998. V. 31. №7. P. 1233-1245.

70. Li M., Yuan C., Feng Ch. Spectrophotometric determination of phenol using 4-aminoantipyrine. // Huanjing Kexue. 1997. V. 18. №5. P. 78-80. IJht. no Chem. Abstr. 1997. №140360.

71. Dmitrienko S.G., Myshak E.N., Zhigulev A.V., Runov V.K., Zolotov Yu.A. Sorption-photometric determination of 1-naphthol with polyurethane foams. // Anal. Lett. 1997. V. 30. №14. P. 2527-2540.

72. Chernysh V.V., Proskurnin M.A., Kuznetsova V.Y., Pakhomova S.V. Determination of microamounts of phenols by thermal lens spectrometry // Anal. Commun. 1997. V. 37. №10. P. 291-294.

73. Lopez-Cueto G., Maspoch S., Rodriguez-Medina I.F., Ubide C. Simultaneous kinetic spectrophotometric determination of o-, m- and />-aminophenols using patial least squares calibration. //Analyst. 1996. V. 121. №4. P. 407-412.

74. Li J., Zhang Y., Wei X. Kinetic spectrophotometric determination of trace phenol using surfactant as sensitazing reagent. // Fenxi Huaxue. 1998. V. 26. №5. P. 586-589 IJht. no Chem. Abstr. 1998. №326092.

75. Li L., Lu M. Determination of pyrogallol using a novel chemiluminescence reaction. // Anal. Lett. 1998. V. 31. №2. P. 343-353.

76. J. Wang, Q. Chen. Remote electrochemical biosensor for field monitoring of phenolic compounds. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 312. №1. P. 39-44.

77. Skladal P. Mushroom tyrosinase-modified carbon paste electrode as an amperometric biosensor for phenols. // Collect. Czechoslov. Chem. Commun. 1991. V. 56. №7. P. 1600-1610.

78. Dantoni P., Serrano S.H.P., Brett A.M.O., Gutz I.G.R. Flow-injection determination of catechol with a new tyrosinase / DNA biosensor. // Anal. Chim. Acta. 1998. V. 366. №1-3. P. 137-145.

79. Hall G.F., Best D.J., Turner A.P.F. The determination of /?-cresol in chloroform with an enzyme electrode used in the organic phase. // Anal. Chim. Acta. 1988. V. 213. №1 2. P. 113-120.

80. Deng Q., Yizhu G., Dong S. Cyro-hydrogel for the construction of the tyrosinase-based biosensor. //Anal. Chim. Acta. 1996. V. 319. №1-2. P. 71-77.

81. Li J., Chia L.S., Goh N.K., Tan S.N. Silica sol-gel immobilised amperometric biosensor for the determination of phenolic compounds. // Anal. Chim. Acta. 1998. V. 362. №2-3. P. 203-211.

82. Schillu J.G., Chen A.K., Liu C.C. Determination of phenols concentrations by an electrochemical system with immobilised tyrosinase. // Anal. Biochem. 1978. V. 85. №1. P.25-33.

83. Kotte H., Grudig B., Vorlop K.D, Strehlitz B., Stottmeister U. Methylphenazonium-modified enzyme sensor based on polymer thick films for subnanomolar detection of phenols. // Anal. Chem. 1995. V.67. №1. P. 65-70.

84. Onnerfjord P., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L., Ortega F., Dominguez E. Tyrosinase graphite-epoxy based composite electrodes for detection of phenols. // Biosens. Bioelectron. 1995. V. 10. №6-7. P. 607-619.

85. Parellada A., Narvaez A., Lopez M.A., Dominguez E., Fernandez J.J., Pavlov V., Katakis I. Amperometric immunosensors and enzyme electrodes for environmental application. // Anal. Chim. Acta. 1998. V. 362. №1. P. 47-57.

86. Bonakdar M., Vilchez I.L., Mottola H.A. Bioamperometric sensors for phenol based on carbon paste electrode. // J. Electroanal. Chem. 1989. V. 266. №1. P. 47-55.

87. Wang J., Lu F., Lopez D. Tyrosinase-based ruthenium dispersed carbon paste biosensor for phenols. // Biosens. Bioelectron. 1994. V. 9. №1. P. 9-15.

88. Wang J., Lin Y. On-line organic phase enzyme detector. // Anal. Chim. Acta. 1993. V. 271. №1. P. 53-58.

89. Dennison M.J., Hall J.M., Turner A.P.F. Gas-phase microbiosensor for monitoring phenol vapor at ppb levels // Anal. Chem. 1995. V. 67. №21. P. 3922-3927.

90. Kaisheva A., Iliev I., Christov S., Kazareva R. Electrochemical gas biosensor for phenol. // Sens. Actuators. 1997. V. 44. №1-3. P. 571-577.

91. Adeyoju O., Iwuoha E.I., Smyth M.R., Leech D. High-performance liquid chromatographic determination of phenols using a tyrosinase-based amperometric biosensor detection system. //Analyst. 1996. V. 121. №12. P. 1885-1889.

92. Connor M.P., Wang J., Kubiak W., Smyth M.R. Tissue- and microbe-based electrochemical detectors for liquid chromatography. // Anal. Chim. Acta. 1990. V. 229. №1. P. 139-143.

93. Ярополов А.И., Маловик В. Ферментный электрод на основе иммобилизованной лакказы для определения полифенолов и полиаминов. // Журн. аналит. химии. 1983. Т. 38. №3. С. 503-508.

94. Wang J., Lin Y., Eremenko A.V., Ghindilis A.L., Kurochkin I.N. A laccase electrode for organic-phase enzymatic assays. //Anal. Lett. 1993. V. 26. №2. P. 197-207.

95. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. Flow-injection analysis of phenols at a graphite electrode modified with co-immobilised laccase and tyrosinase. //Anal. Chim. Acta. 1995. V. 308. №1-3. P. 137-144.

96. Wollenberger U., Neumann B. Quinoprotein glucose degydrogenase-modified carbon paste electrode for the detection of phenolic compounds. // Electroanalysis. 1997. V. 9. №5. P. 366-371.

97. Eremenko A., Makower A., Jin W., Ruger P., Scheller F. Biosensor based on an enzyme modified electrode for highly-sensitive measurement of polyphenols. // Biosens. Bioelectron. 1995. V. 10. №8. P. 717-722.

98. Saby C., Male K.B., Luong J.H. Combined chemical and electrochemical approach using ¿zs-(trifluoroacetoxy)iodobenzene and glucose oxidase for the detection of chlorinated phenols. // Anal. Chem. 1997. V. 69. №21. P. 4324-4330.

99. Ghindilis A.L., Macower A., Bauer C.G., Bier F.F., Scheller F.W. Determination ofp-aminophenol and catecholamines at picomolar concentrations based on recycling enzyme amplification. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 304. №1. P. 25-32.

100. Kane S.A., Iwuoha E.I., Smyth M.R. Development of a sol-gel amperometric biosensorfor the determination of phenolics. // Analyst. 1998. V. 123. №8. P. 2001-2006.

101. Lindgren A., Emneus J., Ruzgas Т., Gorton L., Marko-Varga G. Amperometric detection of phenols using peroxidase-modified graphite electrode. // Anal. Chim. Acta. 1997. V. 347. №1. P. 51-62.

102. Cosnier S., Popescu I.G. Poly(amphiphilicpyrolle) tyrosinase-peroxidase electrode for amplified flow-injection amperometric detection of phenol. // Anal. Chim. Acta. 1996. V. 319. №1-2. P. 145-151.

103. Zachoriah K., Mottola H.A. Continuous-flow determination of phenol with chemicallyimmobilised polyphenol oxidase (tyrosinase). // Anal. Lett. 1989. V. 22. №5. P. 1145 1158.

104. Papkovsky D.V., Ghindilis A.L., Kurochkin I.N. Flow-cell fiber-optic enzyme sensor for phenols. //Anal. Lett. 1993. V. 26. №3. P. 1505-1518.

105. Шеховцова Т.Н., Лялюлин А.Л., Кондратьева Е.И., Газарян И.Г., Долманова И.Ф. Использование пероксидаз различного происхождения для определения фенолов. //Журн. аналит. химии. 1994. Т. 49. №12. С. 1317-1323.

106. Яцимирский К.Б. Кинетические методы анализа. М.: Химия. 1967. 200 с.

107. Shannon L.M., Kay Е., Lew J.Y. Peroxidase isozymes from horseradish roots. Isolation and physical properties. // J. Biol. Chem. 1966. V. 249. N 9. P. 2166-2172.

108. Сладков А.З. Таблицы буферных растворов. // Заводская лаборатория. 1969. Т. 35. №9. С. 1146-1148.

109. Кольтгофф И.М., Сендел Е.Б. Количественный анализ. М.: Госхимиздат. 1948. С. 822.

110. Пешкова В.М., Громова М.И. Практическое руководство по спектрофотометрии и колориметрии. М.: Изд-во Московского Университета. 1965. С. 218.

111. Доерфель К.М. Статистика в аналитической химии. М.: Мир. 1994. 267 с.

112. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Долманова И.Ф. Ферментативный метод определения микроколичеств железа(Ш) и ряда ингибиторов пероксидазы. // Журн. аналит. химии. 1993. Т. 48. №1. С. 129-136.

113. Shekhovtsova T.N., Muginova (Chernetskaya) S.V., Mizgunova U.M., Dolmanova I.F. Applications of oxidases in analysis. // Quimica Analitica. 1996. V. 15. P. 312-320.

114. Попова И.М. Ферментативные методы определения физиологически активных веществ с применением пероксидазы. Дисс. к.х.н. М.: МГУ. 1981. 232 с.

115. Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н., Стародумова Н.Н, Ферментативный метод определения ртути. // Журн. аналит. химии. 1987. Т. 42. №10. С. 1824-1828.

116. Чернецкая С.В. Методы определения ртути, кадмия, висмута с использованием пероксидазы хрена. Дисс. к.х.н. М.: МГУ. 1995. 255 с.л с~о

117. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена. // Биохимия. 1977. Т. 42. №8. С. 1372-1379.

118. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного анализа. М.: Наука. 1965. С. 83.

119. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: Фаир-Пресс. 1999. С. 197.

120. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. 1983. Т. 2. С. 238.

121. Долманова И.Ф., Ершова Е.В., Шеховцова Т.Н., Надь В.Ю. Кинетическое определение микроколичеств ртути с использованием фермента пероксидазы. // Журн. аналит. химии. 1979. Т. 34. №8. С. 1644-1657.

122. Бартон Д., Оллис УД. Общая органическая химия. М.: Химия. 1983. Т. 5. С. 622.

123. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука. 1977. 303 с.

124. Andrews A., Reithel F.J. The thiol groups of jack bean urease. // Arch. Biochem. Biophys. 1970. V. 141. P. 538-546.

125. Попов B.O., Егоров A.M. Исследование существенных SH-групп бактериальной формиатдегидрогеназы. //Биохимия. 1979. Т. 44. №2. С. 207-213.

126. Magonet Е., Hayen P., Delforge D., Delive Е., Remade J. Importance of the structural zinc atom for the stability of yeast alcohol dehydrogenase. // Biochem J. 1992. V. 287. N2. P. 361.

127. Евтюгин Г.А. Электрохимические биосенсоры на основе холинэстеразы для группового определения токсикантов и диагностики загрязнения объектов окружающей среды. Дисс. д.х.н. Казань: КГУ. 1999. 367 с.

128. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.:Химия. 1989. С. 15.

129. Bryce D.W., Luque de Castro M.D. Methods for the speciation of mercury and selenium based on continuous unsegmented flow system. // Quimica Analitica. 1995. V. 14. N.3. P. 152-157.

130. Esnault R., Chibbar R.N. Peroxidases: at the gene expression level. // Plant Peroxidase Newsletter. 1997. N 10. P. 7-15.

131. Газарян И.Г. Молекулярная и генетическая структура пероксидаз. Итоги науки и техники. Биотехнология. М.: ВИНИТИ. 1992. Т. 36. С. 28-54.

132. Moeller К.М., Ottolenghi P. Oxidation of o-dianisidine by H2O2 and peroxidase at neutral pH. // C.R. Traw. Lab. Carlsberg. 1966. V. 35. P.369-373.

133. Claiborne A., Fridovich J. Chemical and intermediates in peroxidation of o-dianisidine by horseradish peroxidase. 1. Spectral properties of the products of o-dianisidine oxidation. // Biochemistry. 1979. V. 18. N 11. P. 2324-2329.

134. Foster R. Organic charge-transfer complexes. New-York: Academic. 1969. P. 36.

135. Oldfried L.F., Bockric J.O.M. Reversible oxidation-reduction reactions of aromatic amines. // J. Phys. Coll. Chem. 1951. V. 55. P. 1255-1274.

136. Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н., Пешкова В.М. Кинетический метод определения хрома с использованием реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии активаторов. // Журн. аналит. химии. 1972. Т. 27. №10. С. 1981-1985.

137. Divi R.L., Doerge D.R. Mechanism-based inactivation of lactoperoxidase and thyroid peroxidase by resorcinol derivatives. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 9668-9674.

138. Лебедева O.B., Угарова H.H., Березин И.В. Совместное окисление ферроцианида калия и о-дианизидина перекисью водорода, катализируемое пероксидазой из хрена. Субстрат-субстратная активация. // Биохимия. 1981. Т. 46. №7. С. 1202 1209.

139. Gazaryan I.G., Loginov D.B., Lyalyulin A.L., Shekhovtsova T.N. Determination of phenols using various peroxidases. // Anal. Lett. 1994. V. 27. N 15. P. 2917-2930.

140. Справочник химика. M.: Наука. 1965. Т. 4. С. 375.

141. Fieser L.F. An indirect method for studying the oxidation reduction potentials of unstable systems including those from the phenols and amines. // J. Amer. Chem. Soc. 1930. V. 52. N 12. P. 5204-5241.

142. Job D., Dunford H.B. Substituent effect on the oxidation of phenols and aromatic amines by horseradish peroxidase Compound I. // Eur. J. Biochem. 1976. V. 66. P. 607-614.

143. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир. 1990. С. 234.

144. Hosoya Т. Turnip peroxidase. II. The reaction mechanism of turnip peroxidase Al, A2 and D. // J. Biochem. 1960. V. 47. P. 794-803.

145. Doerge D.R., Divi R.L. Identification of the colored guaiacol oxidation product produced by peroxidases. //Anal. Biochem. 1997. V. 250. P. 10-17.

146. Setti L., Scali S., Angeli I.D., Pifferi P.G. Horseradish peroxidase-catalyzed oxidative coupling of 3-methyl 2-benzothiazolinone hydrazone and methoxyphenols. // Enzyme and Microbial Techn. 1998. V. 22. N 8. P. 656-661.

147. PorstmannT., Porstmann В., Wietschke R., von Baehr R., Egger E. Stabilization of the substrate reaction of horseradish peroxidase with o-phenylenediamine in the enzyme immunoassay. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1985. V. 23. P. 41-44.

148. Childs R.E., Bardsley W.G. A steady-state kinetics of peroxidase with ABTS as chromogen. // Biochem. J. 1975. V. 145. P. 93-103.

149. Gallati H. Enzyme-immunological-test: determination of the activity of peroxidase with the aid of the Trinder reagent. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1977. V. 15.

150. Josephy P.D., Eling Т., Mason. R.P. The horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine. //J. Biol. Chem. 1982. V. 257. N 7. P. 3669-3675.

151. Marquez L.A., Dunford H.B. Mechanism of the oxidation of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine by myeloperoxidase determined by transient- and steady-state kinetics. // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 9349-9355.

152. Морозова Р.П., Яцимирский К.Б. Определение микроколичеств рутения по его каталитическому действию в реакции окисления бензидина перекисью водорода. //Журн. аналит. химии. 1969. Т. 24. № 8. С. 1183-1187.

153. Уотерс У. Механизм окисления органических соединений. М.: Мир. 1966. С. 175.

154. Крейнгольд С.У. Каталиметрический анализ высокочистых неорганических солей и оксидов металлов. Автореф. Дисс. д.х.н. Москва. 1988. С. 15.

155. Газарян И.Г., Решетникова И.А., Веревкин А.Н., Фечина В.А., Лялюлин А.Л., Шеховцова Т.Н. Пероксидаза гриба Phellinus Igniarius 71-31. II ДАН. 1993. Т. 329. №5. С. 663-665.

156. Газарян И.Г., Веревкин А.Н., Фечина В.А., Урманцева В.В., Скрипников А.Ю. Пероксидаза культивируемых клеток люцерны. // ДАН. 1992. Т. 326. №1.1. Р. 699-703.1. С. 198 201.