Механизм реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой пероксидазами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА

ПЕРОКСИДАЗ РАСТЕНИЙ.

1.1. Классификация и общая характеристика пероксидаз из различных источников.

1.2. Структура цитохром с пероксидазы как исходной модели для изучения пероксидаз растений.

1.3. Структура изофермента С пероксидазы хрена.

1.4. Структура изофермента Е5 пероксидазы хрена.

1.5. Структура пероксидаз грибов.

ГЛАВА 2. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ

ХРЕНА.

2.1. Каталитический цикл пероксидазной реакции.

2.2. Функциональная важность отдельных компонентов пероксидазы для катализа.

2.3. Механизм инактивации пероксидазы в ходе реакции.

ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ ЛЮМИНОЛА ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА,

КАТАЛИЗИРУЕМОЙ ПЕРОКСИДАЗОЙ.

3.1. Предстационарная и стационарная кинетика окисления люминола пероксидазои.:>

3.2. Механизм радикальных реакций фталгидразидов.

Реакция усиленной хемилюминесценции, катализируемая пероксидазами, широко используется в качестве детектирующей системы в аналитической биотехнологии. Реакция была открыта Крикой (Кпска) [1] и позволила увеличить предел чувствительности анализов с использованием пероксидазы до 10-13 м. В качестве усилителей может выступать широкий круг соединений, включающий производные 6-гидроксибензотиазолов, замещенные фенолы, нафтолы и амины. Механизм усиления до сих пор детально не изучен. Он может базироваться на субстрат-субстратной активации, окислении усилителя и передаче окислительного эквивалента с радикала усилителя на люминол или усилении на пост-ферментативных радикальных реакциях производных люминола.

Нижний предел определения пероксидазы в качестве метки зависит от каталитических свойств пероксидазы в реакции окисления усилителя и люминола перекисью водорода. На сегодняшний день в качестве основного источника пероксидаз для промышленного применения предлагаются корни хрена. Однако в последнее время появляются новые перспективные источники, такие как табак [2], арахис [3], люцерна [4], грибы Апкготусея гатохш [5].

Целью данной работы является изучение механизма реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой различными пероксидазами в присутствии различных усилителей. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать каталитические свойства различных пероксидаз в реакции окисления усилителя и люминола перекисью водорода.

2. Изучить предстационарную и стационарную кинетику этой реакции для разных усилителей.

3. Определить продукты реакции усиленной хемилюминесценции.

4. Сформулировать критерии для поиска новых усилителей и пероксидаз с целью увеличения чувствительности анализа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА ПЕРОКСИДАЗ РАСТЕНИЙ.

выводы

1. Впервые изучены биохимические и каталитические свойства кислых изоферментов пероксидазы хрена, пероксидазы люцерны и грибов АмИготусея гатозиз. Показано, что изученные пероксидазы имеют близкие биохимические свойства, однако пероксидаза грибов менее термостабильная. Изучена предстационарная кинетика окисления люминола перекисью водорода, катализируемая пероксидазами из перечисленных источников. Показаны преимущества использования пероксидазы грибов АгЛготусез гатозт в качестве метки в иммуноферментном анализе.

2. Изучена предстационарная кинетика окисления различных производных фенолов («субстрат-усилитель») перекисью водорода, катализируемая кислыми и щелочными изоферментами пероксидазы хрена, пероксидазой люцерны и грибов АгЛготусез гатохш. Изучена стационарная кинетика индивидуального и совместного окисления люминола и различных производных фенолов перекисью водорода, катализируемая щелочными изоферментами пероксидазы хрена. Показано, что необходимым условием для появления эффекта усиления при совместном окислении являются более высокие константы окисления промежуточными формами пероксидазы субстрата-усилителя по сравнению с люминолом.

3. Методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии исследовано расходование субстратов в ходе реакции индивидуального и совместного окисления перекисью водорода люминола и различных производных фенолов, катализируемая щелочными изоферментами пероксидазы хрена. На основании полученных данных и данных по стационарной кинетике, сформулированы требования к субстрату усилителю и критерии поиска новых усилителей.

4. Определено соотношение общей светосуммы и расхода люминола (квантовый выход по люминолу) в реакции индивидуального и совместного окисления люминола и п-йодфенола перекисью водорода, катализируемой щелочными изоферментами пероксидазы хрена. Показано, что квантовый выход по люминолу в реакции совместного окисления с п-йодфенолом в 3 раза выше, чем при индивидуальном окислении.

5. Методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии изучены продукты реакции окисления люминола и его производного - N,>1-диметиламинолюминола перекисью водорода, катализируемой щелочными изоферментами пероксидазы хрена. Исследованы также продукты указанной реакции в случае совместного окисления с п-йодфенолом. Показано, что для М,>1-диметиламинолюминола продукты окисления одинаковые для индивидуального и совместного окисления, однако количественное соотношение продуктов различное: в случае совместного окисления уменьшается относительное количество «темновых» продуктов - 5-диметил-аминоформилбензойной кислоты и 4-диметил-аминоформилбензойной кислоты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленный обзор показывает, что реакция усиленной хемилюминесценции является многокомпонентной сложной реакционной системой, в которой происходят разнообразные радикальные процессы, ведущие к образованию широкого спектра различных соединений. Механизм усиления не понятен до конца, он может базироваться на субстрат-субстратной активации, окислении усилителя и передаче окислительного эквивалента с радикала усилителя на люминол или усилении на пост-ферментативных радикальных реакциях производных люминола.

Пероксидазы составляют группу ферментов, катализирующих окисление различных субстратов перекисью водорода, и играют важную роль в физиологии растений. Они широко используются в аналитической биотехнологии. На сегодняшний день пероксидазы из некоторых источников хорошо изучены. Однако постоянно появляются новые пероксидазы, которые требуют изучения их каталитических свойств.

Целью данной работы является изучение механизма реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой различными пероксидазами в присутствии различных усилителей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Материалы

В работе были использованы следующие реактивы: п-йодфенол, п-гидроксикоричная кислота, п-фенилфенол ("Aldrich", США).

Люминол был очищен по оригинальной методике и любезно предоставлен А. Лексиным (Институт энергетических проблем химической физики РАН). Маркеры для определения молекулярного веса и изоэлектрических точек ("Pharmacia" и "Bio-Rad"), реактивы для проведения электорофореза ("Bio-Rad").

96-луночные планшеты для иммуноферментного анализа фирмы Nunc (Дания).

Пероксидаза из Aríhromyces ramosus была любезно предоставлена д-ром Teruo Amachi (Suntory Ltd, Япония).

Кислые и щелочные изоферменты пероксидазы из корней хрена -ЦНТТМ «Агротехника», Львов.

Пероксидаза люцерны любезно предоставлена д.х.н., в.н.с МГУ Газарян

И.Г.

Периодат натрия, о-фенилендиамин, Твин-20, Тритон Х-100 были получены от "Merck", ФРГ. Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) был получен от "Serva", ФРГ. Остальные реагенты, кислоты, щелочи, соли ("Реахим") были марок "х.ч." и "ч.д.а.", их использовали без дополнительной очистки.

4.2. Методы

Приготовление растворов

Все растворы были готовили с использованием деионизованной воды. Концентрацию пероксидазы измеряли спектрофотометрически с использованием коэффициента экстинции: е4оз=1.02х105 М'^см"^ [20]. Растворы люминола, АБТС, ТМБ, производных фенола (п-йодфенола, п-гидроксикоричной кислота, п-фенилфенола) были приготовлены по точной навеске. Концентрированные растворы люминола и усилителей готовили в диметилсульфоксиде (ДМСО). Перекись водорода растворяли в деионизованной воде. Концентрацию Н2О2 определяли методом перманганатометрии [116].

Хемилюминесцентные измерения.

Хемилюминесцентные измерения проводили на люминометре LKB 1251002 (Wallac (Швеция)). Обычный объем образца составлял 1мл. Реакцию проводили при температуре 25°С. Инициирование производилось автоматическим добавлением 10 мкл 0.1 М раствора перекиси водорода. Субстратная смесь усиленной хемилюминесценции состояла из Н2О2 (1мМ), люминола (1мМ) и усилителя (ОЛмМ) в 0.05М Трис-HCl буфере, содержащим 0.1М NaCl, pH 8.5. Концентрация пероксидазы в реакционной смеси варьировалась в пределах от 0.5 до 100 нМ в зависимости от целей эксперимента.

Спектрофотометрические измерения

Спектрофотометрические измерения оптической плотности проводили на кинетическом микропланшетном анализаторе Vmax ("Molecular Devices", США) и спектрофотометрах DU8B (Beckman (США)), 150-20 Spectrophotometer фирмы Hitachi (Япония).

Методика измерения констант элементарных стадий реакции методом "остановленной струи"

В работе использовали установку "остановленной струи" модели RA-401 ("Union Giken", Япония). Спектрофотометрические измерения проводили в изобестической точке форм Е и El Хтах=426 нм . Длина оптического пути в кювете измерения установки составляла 10 мм. В работе использовали такие концентрации реагентов, которые обеспечивали псевдопервый порядок реакции по субстрату-восстановителю ([S]»[E]o). Концентрация раствора пероксидазы составляла около 10"6М. В случае изучения кинетики реакции восстановления Е1 до Е2 выбирали концентрацию перекиси водорода намного большую концентрации фермента (обычно 10"3М), а в случае изучения кинетики восстановления Е1 до Е концентрация раствора перекиси водорода выбиралась равной начальной концентрации фермента. Концентрации растворов изучаемых субстратов-восстановителей (люминола, п-иодфенола, п-фенилфенола, п-гидроксикоричной кислоты) варьировали в фиксированном диапазоне концентраций, нижняя граница которого определялась необходимостью выполнения условия псевдопервого порядка реакции по субстрату , а верхняя -невозможностью регистрации быстрых процессов, выходящих за "мертвое время" установки.

Растворы подавали по двум каналам. В экспериментах по изучению кинетики восстановления Е1 до Е2 в одном из них содержался раствор фермента, в другом - смесь субстрата-восстановителя и перекиси водорода. В экспериментах по изучению кинетики реакции восстановления Е2 до Е в одном из каналов содержался раствор смешанных непосредственно перед измерением растворов перекиси водорода и пероксидазы, в другом раствор субстрата-восстановителя. Измерения проводили при термостатировании (температура +25°С). Кинетику роста и спада концентрации Е2 описывали уравнением кинетики первого порядка. Найденные при помощи программных средств управляющего установкой компьютера значения констант псевдопервого порядка использовались в дальнейшем для вычисления истинных констант элементарных стадий ферментативного процесса. Для расчета применяли алгоритм линейного регрессионного анализа.

Синтез и очистка конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой.

Конъюгаты иммуноглобулинов (IgG) с пероксидазой получали по методу Накане [117] , очистку проводили методом гель-фильтрации на носителе Toyopearl HW 55 ("Toyo Soda", Япония).

Определение молекулярной массы ферментов

Хроматографические разделения проводили на системе FPLC ("Pharmacia"). Для аналитической и полупрепаративной гель-фильтрации использовали колонки TSK G4000SW, TSK G3000SW и TSK G2000SW, (7.5x600 мм) ("Pharmacia"), для ионнообменной хроматографии использовали носители MonoQ, MonoS (колонки HR 5/5, "Pharmacia") и DEAE TSK ("Toyo Soda"). Скорость потока 1 мл/мин. Детекцию белков вели с помощью двух спектрофотометрических детекторов - 280 нм (неспецифическое поглощение белков) и 403 нм (максимум поглощения протопорфирина IX - простетической группы ПХ).

Определение изоэлектрических точек ферментов

Для изоэлектрофокусирования, электрофореза использовали установки и реактивы Bio-Rad по предлагаемым фирмой методикам. Для "проявления" ПХ по активности использовали диаминобензидин (Sigma). Результаты сканировали с помощью отражательного фотометра Shimadzu CS 9000.

Определение констант термоинактивации ферментов

Термоинактивацию фермента проводили в 0.05М Трис-HCl буфере, содержащим 0.1М NaCl, pH 8.5. Объем изучаемого образца составлял 1 мл. Концентрация фермента составляла 1*10'8М. Перед началом инкубирования отбиралась проба 10 мкл и измерялась ее ферментативная активность. Затем образец помещался в термоинкубатор при температуре +45°С. С периодичностью в пять минут отбирались пробы объемом 10 мкл и измерялась их ферментативная активность. Ферментативную активность пероксидазы определяли по начальной скорости окисления АБТС, используя раствор реагента, содержащий 2x10-3 М АБТС в 0.2 М цитрат-фосфатном буфере (рН=4.7) и Ю-3 М перекись водорода. Реакцию инициировали внесением 0.1 М раствора Н2О2 и регистрировали продукт при Х=414нм (£414=31 ЮОМ-^см'!). [69]). Полученные данные по ферментативной активности в разные периоды времени использовались в дальнейшем для вычисления константы инактивации. Для расчета применяли алгоритм линейного регрессионного анализа.

Исследование зависимости интенсивности хемилюминесценции от концентрации субстратов для реакции усиленной хемилюминесценции

Реакцию проводили в 0.05М Трис-HCl буфере, содержащим 0.1М NaCl, pH 8.5. Объем реакционной смеси - 1 мл. Концентрация фермента составляла 1*Ю"10М. Варьировали концентрацию п-йодфенола от 10 рМ до 700 ¡J.M, п-фенилфенола от 10 |iM до 420 цМ, п-гидроксикоричной кислоты от 10 цМ до 570 цМ. Одновременно варьировали концентрацию люминола от 10 jiM до 8 мМ. Реакцию инициировали добавлением 10 мкл 0,1 М раствора перекиси водорода. Эксперимент проводили в трех повторах.

В эксперименте по изучению влияния концентрации перекиси водорода использовали постоянную концентрацию усилителя. Для п-фенилфенола концентрация составляла О.ЗмМ, для п-гидроксикоричной кислоты 0.01мМ, для п-йодфенола 0.05мМ. Концентрацию перекиси водорода варьировали в интервале от 10 цМ до 2.5мМ. Концентрация фермента составляла 7-100нМ, люминола - 0.1 -1мМ. Процедура проведения эксперимента была аналогична описанной выше для исследования зависимости от концентрации усилителя и люминола.

Определение рН зависимости реакции усиленной хемилюминесценции Реакцию проводили в 0.05М Трис-НС1 буфере, содержащем 0.1М ЫаС1, рН 7-9 и 0.05М боратном, содержащем 0.1М ШС1, рН 9-10. Объем реакционной смеси - 1 мл. Концентрация фермента составляла 0.1-2.5 нМ. Концентрация п-йодфенола и люминола составляла 0.5мМ. Реакцию инициировали добавлением 10 мкл 0,1 М раствора перекиси водорода. Эксперимент проводили в трех повторах.

Измерение расхода субстратов в реакции усиленной хемилюминесценции Реакцию проводили в буфере 0.05М Трис-НС1, ИаС1 0.1М рН 8.5,. Объем реакционной смеси составлял 1 мл. Концентрация фермента составляла 12 нМ, концентрация п-йодфенола - 0.1мМ, люминола - ОЛмМ. Реакцию инициировали добавлением 10 мкл 0.1 М раствора перекиси водорода. До инициирования и периодически во время протекания реакции отбирали пробы по 100 мкл и добавляли к ним 10 мкл 1М фосфорной кислоты. Затем образцы хроматографировали методом обращенно-фазовой хроматографии высокого давления. Детекцию п-йодфенола и люминола вели с помощью спектрофотометрического детектора при Х=280 нм. Относительную концентрацию п-йодфенола и люминола определяли по площади соответствующего пика.

В случае п-фенилфенола концентрация фермента составляла 1 нМ. Концентрация п-фенилфенола - О.ЗмМ, люминола - 0.5мМ. Процедура проведения эксперимента бьша аналогична описанной выше для п-йодфенола.

В случае п-гидроксикоричной кислоты концентрация фермента составляла 1 нМ. Концентрация п-гидроксикоричной кислоты - 0.4мМ, люминола - 0.4мМ. Процедура проведения эксперимента была аналогична описанной выше для п-йодфенола.

Изучение продуктов совместного и индивидуального окисления диметиламинолюминола и п-йодфенола методом обращенно-фазовой хроматографии высокого давления.

Реакцию проводили в буфере 0.05М Трис-HCl, NaCl 0.1М,. рН=8.5, Объем реакционной смеси - 1 мл. Концентрация фермента составляла 100 нМ, концентрация п-йодфенола - 0.5 мМ, люминола - 0.5 мМ. Реакцию инициировали добавлением 10 мкл ОД М раствора перекиси водорода. Через 1 час в реакционную смесь добавляли 100 мкл 1М фосфорной кислоты. Затем отбирали образец в 100 мкл и хроматографировали методом обращенно-фазовой хроматографии высокого давления. Детекцию вели с помощью спектрофотометрического детектора сканирующего оптическую плотность в интервале X от 220 нм до 360 нм.

Высокоэффективная жидкостная хроматография на обратной фазе.

Высокоэффективная хроматография (ВЭЖХ) проводилась на установке фирмы «BioRad» (США). Хроматографическая система включала насос высокого давления , устройство для ввода проб типа «Реодайн» с размером петли 20мкл, сканирующий детектор UV-Vis 1790 «BioRad» и управляющую станцию «BioRad 800» на основе IBM/XT - совместимого компьютера. Использовали колонку силосорб-С16 (250x4 мм, размер частиц 8 мкм) производства фирмы БиоХимМак СТ. В качестве подвижной фазы использовали элюент ацетонитрил с различным соотношением компонентов в зависимости от целей эксперимента.

Условия хроматографирования: от 0 до 2.5 мин изократическое хроматогрофирование при содержании 0% подвижной фазы В, от 2.5 до 3.5 мин линейный градиент от 0 до 12%, от 3.5 до 10 мин изократическое хроматографирование при 12%, от 10 до 11 мин линейный градиент от 12% до 22%, от 11 до 15.5 мин изократическое хроматографирование при 22%, от 15.5 до 17 мин линейный градиент от 22% до 40%, от 17 до 19 мин изократическое хроматографирование при 40%, от 19 до 20 мин линейный градиент от 40% до 100%, от 20 до 25 мин изократическое хроматографирование при 100% (при условии, что А+В=100%). Подвижная фаза А - фосфатный буфер 0.05М рН 3.0, подвижная фаза В - ацетонитрил. Скорость элюции составляла 1 мл/мин.

Методика расчета квантовых выходов по диметил-аминолюминолу или люминолу в реакции индивидуального и совместного окисления.

Реакцию проводили в буфере 0.05М Трис-НС1, №С1 0.1М, рН=8.5. Объем реакционной смеси составлял 1 мл. Концентрация фермента составляла 100 нМ, концентрация люминола - 0.25 мМ. Перед инициацией реакции отбирали пробу объемом 100 мкл. Реакцию инициировали добавлением 10 мкл 0.1 М раствора перекиси водорода. Реакцию проводили при температуре 25°С. Определение общей выделяемой светосуммы проводили на люминометре ЬКВ 1251-002 (\Vallac (Швеция)) в интегральном режиме. Через 5 мин в реакционную смесь добавляли 100 мкл фосфорной кислоты 1М. Затем отбирали образец в 100 мкл и хроматографировали методом обращенно-фазовой хроматографии высокого давления. Кроме этого, проводили хроматографирование пробы, отобранной перед началом реакции. Детекцию люминола вели с помощью спектрофотометрического детектора при А,=280 нм. Расход люминола определяли по относительному уменьшению площади начального пика. Квантовый выход по люминолу определяли как соотношение общей светосуммы к количеству израсходованного люминола. Эксперимент проводили в восьми повторах.

В случае диметиламинолюминола, его концентрация составляла 0.1 мМ, концентрация фермента составляла 100 нМ. Процедура проведения эксперимента и расчет квантового выхода были аналогичны описанным выше для люминола.

В случае присутствия п-йодфенола, его концентрация составляла 0.1 мМ как для люминола, так и для диметиламинолюминола. Остальные условия, процедура проведения эксперимента и расчет квантового выхода были аналогичны описанным выше.

1. Whitehead, T. P.; Thorpe, G. H. G.; Carter, T. J. N.; Groucutt, C.; Kricka, L. J. //Enhanced Luminescence Procedure for Sensitive Determination of PeroxidaseLabelled Conjugates in Immunoassays. Nature 1983, 305, pp: 158-159.

2. Lagrimini L.M.; Burkhart W; Moyer M.; Rothstein S //Tabac Peroxidase. Proc Natl Acad Sci USA 1987,84, pp: 7542-7546.

3. Van Huystee, R. B.; Hu, C.; Sesto, P. A. //Comparisons Between Cationic and Anionic Peanut Peroxidase As Glycoproteins. In Isozymes: Structure, Function, and Use in Biology and Medicine; Wiley-Liss: 1990;pp:315-325.

4. Shinmen Y.; Asami S.; Amashi T.; Shimizu S.; Yamada H. //Novell Peroxidase From Arthromyces Ramosus. Agric. Biol. Chem. 1986, 241(4), pp: 247-249.

5. Welinder, K. G.; Gajhede, M. //Structure and Evolution of Peroxidases. In Plant Peroxidases Biochemistry and Physiology, Welinder, K. G., Rasmussen, S. K., Penel, C., Greppin, H., Eds.; University of Geneva: Geneva, 1993.

6. Fujiyama, K.; Takemura, H.; Shinmyo, A.; Okada, H.; Takano, M. //Genomic DNA Structure of Two New Horseradish-Peroxidase-Encoding Genes. Gene 1990,89(2), pp: 163-169.

7. Mazza, G.; Welinder, K. G. //Covalent Structure of Turnip Peroxidase 7. Cyanogen Bromide Fragments, Complete Structure and Comparison to Horseradish Peroxidase C. Eur. J. Biochem. 1980,108(2), pp: 481-489.

8. Buffard, D.; Breda, С.; Van Huystee, R. В.; Asemota, O.; Pierre, M.; Ha, D. B. D.; Esnault, R. //Molecular Cloning of Complementary DNAs Encoding Two Cationic Peroxidases From Cultivated Peanut Cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1990, 87, pp: 8874-8878.

9. Abeles, F. В.; Dunn, L. J.; Morgens, P.; Callahan, A.; Dinterman, R. E.; Schmidt, J. //Cucumber Peroxidase. Plant Physiol 1988, 87, pp: 609-615.

10. Roberts E; Kutchan T; Kolattukudy P.E. //Potato Peroxidase. Plant Mol Biol 1988,11, pp: 15-31.

11. Мухамеджанов Б.Г. //Новые Источники Пероксидаз. Изв. АНКазСС, Сер. Биол. 1983,48(4), рр: 14-17.

12. Blauer, G.; Sreerama, N.; Woody, R. W. //Optical Activity of Hemoproteins in the Soret Region Circular Dichroism of the Heme Undecapeptide of Cytochrome- с in Aqueous Solution. Biochemistry 1993, 32, pp: 6674-6679.

13. Frew, J. E.; Jones, P. L. //Structure and Functional Properties of Peroxidases and Catalases. Advances in Inorganic and Bioinorganic Mechanisms 1984, 3, pp: 175-212.

14. Welinder, K. G. //Amino Acid Sequence Studies of Horseradish Peroxidase. Eur. J. Biochem. 1979, 96, pp: 483-502.

15. Gajhede, M.; Schuller, D. J.; Henriksen, A.; Smith, A. T.; Poulos, T. L. //Crystal Structure of Horseradish Peroxidase C at 2.15 A Resolution. Nat. Struct. Biol. 1997, 4(12), pp: 1032-1038.

16. Piontek, K.; Glumoff, T.; Winterhalter, K. //Low PH Crystal Structure of Glycosylated Lignin Peroxidase From Phanerochaete-Chrysosporium at 2.5 A Resolution. FEBS Lett. 1993, 315, pp: 119-124.

17. Poulos, T. L.; Edwards, S. L.; Wariishi, H.; Gold, M. H. //Crystalographic Refinement of Lignin Peroxidase at 2 A. J. Biol. Chem. 1993, 268, pp: 44294440.

18. Alic, M.; Gold, M. H. //Genetics and Molecular Biology of the Lignin-Degrading Basidiomycete Phanerochaete Chrysosporium. In More Gene Manipulations in Fungi-, Academic Press Inc.: 1991; Chapter 15,pp:320-341.

19. Patersen, J. F. W.; Tams, J. W.; Vind, J.; Svensson, A.; Dalboge, H.; Welinder, K. G.; Larsen, S. //Crystallization and X-Ray Diffraction Analysis of Recombinant Coprinus Cinereus Peroxidase. J. Mol. Biol. 1993.

20. Patersen, J. W. F.; Kadziola, A.; Larsen, S. //A Preliminary Crystal Structure Analysis of Recombinant Coprinus Cinereus Peroxidase. In Plant Peroxidases

21. Biochemistry and Physiology, Welinder, K. G., Rasmussen, S. K., Penel, C., Greppin, H., Eds.; University of Geneva: Geneva, 1993.

22. Baunsgaard, L.; Vind, J.; Dalbge, H. //The Sequence of Coprinus Cinereus Peroxidase Gene Cipl. In Plant Peroxidases Biochemistry and Physiology, Welinder, K. G., Rasmussen, S. K., Penel, C., Greppin, H., Eds.; University of Geneva: Geneva, 1993.

23. Theorell, H. //The Preparation and Some Properties of Crystalline Horseradish Peroxidase. Ark. Kemi. Min. Geol. A 1942,16, pp: 1-11.

24. Jones, P. L.; Dunford, H. B. J. Theor. Biol. 1977, 69, pp: 457-461.

25. Chang, C. S.; Yamazaki, I.; Sinclair, R.; Khalid, S.; Powers, L. IIPH Dependence of the Active Site of Horseradish Peroxidase Compound-II. Biochemistry 1993, 32, pp: 923-928.

26. Andersen, M. B.; Hsuanyu, Y.; Welinder, K. G.; Schneider, P.; Dunford, H. B. //Kinetics and Equilibria of Cyanide Binding to Coprinus Cinereus Peroxidase. Acta Chem. Scand. 1991, 45, pp: 206-211.

27. Araiso, T.; Dunford, H. B. //Horseradish Peroxidase. XLI. Complex Formation With Nitrate and Its Effect Upon Compound I Formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980,94, pp: 1177-1182.

28. Dunford, H. B.; Araiso, T. //Complex Formation With Nitrate and Its Effect Upon Compound I Formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979, 89, pp: 764-775.

29. Sontum, S. F.; Case, D. A. //Electronic Structures of Active Site Models for Compounds I and II of Peroxidase. J. Am. Chem. Soc. 1985,107, pp: 4013-4015.

30. Sivaraja, M.; Goodin, D. B.; Smith, M.; Hoffman, B. M. //Identification by ENDOR of Trpl91 As the Free-Radical Site in Cytochrome c Peroxidase Compound ES. Science 1989, 245(4919), pp: 738-740.

31. Dunford, H. B.; Stillman, J. S. //On the Function and Mechanism of Action of Peroxidases. Coord. Chem. Rev. 1976,19, pp: 187-251.

32. Baneijee, R. K. //Mechanism of Horse-Radish Peroxidase Catalyzed Conversion of Iodine to Iodide in the Presence of H202 and EDTA. J. Biol. Chem. 1989, 264, pp: 9188-9194.

33. Du, P.; Axe, F. U.; Loew, G. H.; Canuto, S.; Zerner, M. C. //Theoretical Study on the Electronic Spectra of Model Compound II Complexes of Peroxidases. J. Am. Chem. Soc. 1991,113, w 8614-8621.

34. Dordick, J. S.; Klibanov, A. M.; Marietta, M. A. //Horseradish Peroxidase Catalyzed Hydroxylations; Mechanistic Studies. Biochemistry 1986,25, pp: 2946-2951.

35. Aguda, B. D.; Larter, R. //Periodic-Chaotic Sequences in a Detailed Mechanism of the Peroxidase-Oxidase Reaction. J. Am. Chem. Soc. 1991,113, pp: 79137916.

36. Gazaryan, I.; Doseeva, V.;.; Tishkov, V.;.; Galkin, A.;. //Production and Catalytic Properties of Phe41->His and Phel43->Glu Single-Point Mutants of Horseradish Peroxidase Expressed in E-Coli. Biochemistry Moscow 1995, 60(10), pp: 1187-1192.

37. Dunford, H. B. ¡¡Horseradish Peroxidase: Structure and Kinetic Properties. In Peroxidase in Chemistry and Biology, J.Everse, K. E. E. a. M. B. G., Ed.; CRC Press: Boca Raton, Florida: 1992;pp:l-24.

38. Nagano, S.; Tanaka, M.; Watanabe, Y.; Morishima, I. //Putative Hydrogen Bond Network in the Heme Distal Site of Horseradish Peroxidase. Biochemical and Biophysical Research Communications 1995, 207(1), pp: 417-423.

39. Nagano, S.; Tanaka, M.; Watanabe, Y.; Morishima, I. //Catalytic Roles of the Distal Site Asparagine-Histidine Couple in Peroxidases. Biochemistry 1996, 35(45), pp: 14251-14258.

40. Welinder, K. G.//Plant Peroxidases, Their Primary, Secondary and Tertiary Structures, and Relation to Cytochrome C Peroxidase. Eur. J. Biochem. 1985, 151, pp: 497-504.

41. Kremer, M. L. //Independent Activity of Catalase Haematins. J. Theor. Biol. 1970, 29, pp: 387-394.

42. Gochran, A. G.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1990,112, pp: 9414-9415.

43. Haschke, R. H.; Friedhof, J. M. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978, 80, pp: 1039-1042.

44. Maranon, M. J. R.; Stillman, M. J.; Vanhuystee, R. B. //Co-Dependency of Calcium and Porphyrin for an Integrated Molecular Structure of Peanut Peroxidase A Circular Dichroism Analysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993,194, pp: 326-326.

45. Chance, B. Arch. Biochem. Biophys. 1949, 21, pp: 416-430.

46. Keilin, D.; Hartree, E. F. //Purification of Horseradish Peroxidase and Comparison of Its Properties With Those of Catalase and Methaemoglobin. Biochem. J. 1951, 49, pp: 88-104.

47. Nakajima, R.; Yamazaki, I. J. Biol. Chem. 1980,255, pp: 2067-2072.

48. Arnao, M. B.; Acosta, M.; Del Rio, J. A.; Varon, R.; Garcia-Canovas, F. //A Kinetic Study on the Suicide Inactivation of Peroxidase by Peroxide. Biochim. Biophys. Acta 1990,1041, pp: 43-47.

49. Arnao, M. В.; Acosta, M.; Del Rio, J. A.; Garcia-Canovas, F. //Inactivation of Peroxidase by Hydrogen Peroxide and Its Protection by a Reductant Agent. Biochim. Biophys. Acta 1990,1038, pp: 85-89.

50. Ator, M. A.; David, S. K.; De Montellano, P. R. O. //Structure and Catalytic Mechanism of Horseradish Peroxidase. Regiospecific Meso Alkylation of the Prosthetic Heme Group by Alkylhydrazines. J. Biol. Chem. 1987,262, pp: 14954-14960.

51. Ator, M. A.; De Montellano, P. R. 0. //Protein Control of Prostetic Heme Reactivity. Reaction of Substrates. J. Biol. Chem. 1987,262, pp: 1542-1551.

52. Ator, M. A.; De Montellano, P. R. 0. //Mechanism-Based ( Suicide ) Enzyme Inactivation. In The Enzymes-, Sigman, D. S., Boyer, P. D., Eds.; Academic Press,Inc.: San Diego, 1990; Chapter 5,pp:213-282.

53. De Montellano, P. R. O. //Catalytic Sites of Hemoprotein Peroxidases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1992, 3289-107, pp: -107.

54. Kanemox, Ю. Jl. //Кинетика и Механизм Инактивации Пероксидазы в Хемилюминесцентной Реакции Окисления Люминола в Присутствии Производных Фенола. Диссетация На Соискание Ученой Степени Кандидата Химических Наук ; 1998.

55. Acosta, M.; Arnao, M. В.; Del Rio, J. A.; Garcia-Canovas, F. //Inactivation of Peroxidase. In Biochemical, Molecular, and Physiological Aspects of Plant Peroxidases-, J.Lobarzewski, e. al., Ed.; Imprimerie Nationale: Geneva, 1991.

56. Chance, В. //The Kinetics and Stoichiometry of the Transition From the Primary to the Secondary Peroxidase-Peroxide Complexes. Arch. Biochem. Biophys. 1952, 41, pp: 416-424.

57. Adediran, S. A.; Lambeir, A.-M. //Kinetics of the Reaction of Compound II of Horseradish Peroxidase With Hydrogen Peroxide to Form Compound III. Eur. J. Biochem. 1989,186, pp: 571-576.

58. Cormier, M. J.; Prichard, P. M. //An Investigation of the Mechanism of the Luminescent Peroxidation of Luminol by Stopped Flow Techniques. J. Biol. Chem. 1968,243, pp: 4706-4714.

59. Akimoto, K.; Shinmen, Y.; Sumida, M.; Asami, S.; Amachi, T.; Yoshizumi, H.; Saeki, Y.; Shimizu, S.; Yamada, H. //Luminol Chemiluminescence Reaction Catalyzed by a Microbial Peroxidase. Anal. Biochem. 1990,189, pp: 182-185.

60. Tanaka, M.; Ishimori, К.; Morishima, I. //Luminol Activity of Horseradish Peroxidase Mutant Mimicking a Proposed Binding Site for Luminol in Arthromyces Ramosus Peroxidase. Biochemistry 1999,38(32), pp: 1046310473.

61. Thorpe, G. H. G.; Williams, L. A.; Kricka, L. J.; Whitehead, T. P.; Evans, H.; Stanworth, D. R. //A Rapid Luminescently Monitored Enzyme Immunoassay for IgE. J. Immunol. Method. 1985, 79, pp: 57-63.

62. Kricka, L. J.; Stott, R. A. W.; Thorpe, G. H. G. //Enhanced Chemiluminescence Enzyme Immunoassays. In Complementary Immunoassays', W.P.Collins, Ed.; Chichester, Willey: 1988.

63. Andersen, M. B. //Enhancement of Peroxidase Catalyzed Oxidations. In Plant Peroxidases Biochemistry and Physiology ; Welinder, K. G., Rasmussen, S. K., Penel, C., Greppin, H., Eds.; University of Geneva: Geneva, 1993.

64. Ohnishi, Т.; Jamasaki, I.; Jyanagi, Т.; Nakamura, T. //EPR Investigation of Cooxidation of Two Peroxidase Substrates. Biochim. Biophys. Acta 1969, 172(3), pp: 357-359.

65. Piette, L. H.; Jamasaki, I. //The Rapid Oxidation of Ascorbic

66. Acid by HRP-Containing System. Biochim. Biophys. Acta 1963, 77(1), pp: 4764.

67. Лебедева, О. В.; Угарова, Н. Н.; Березин, И. В. //Совместное Окисление Ферроцианида Калия и О-Дианизидина Перекисью Водорода, Катализируемое Пероксидазой Хрена. Субстрат-Субстратная Активация. Биохимия 1981, 46(7), рр: 1202-1209.

68. Nakamura, М.; Nakamura, S. //One- and Two-Electron Oxidation of Luminol by Peroxidase System. Free Radical Biology & Medicine 1998,24(4), pp: 537-544.

69. Merenyi, G.; Lind, J.; Eriksen, Т. E. //The Equilibrium Reaction of the Luminol Radical With Oxigen and the One-Electron-Reduction Potential of 5-Aminophtalazine-1,4-Dione. J. Phys. Chem. 1984,88(11), pp: 2320-2323.

70. Hodson, M.; Jones, P. L. //Enhanced Chemiluminescence in the Peroxidase-Luminol-H 2 0 2 System: Anomalous Reactivity of Enhancer Phenols With Enzyme Intermediates. J. Biolumines. Chemilumines. 1989, 3(1), pp: 21-25.

71. Кулис, Ю. Ю.; Казлаускайте, Ю. Д.; Виджюнайте, А.; Разумас, В. Й. Биохимия 1991, 56, рр: 78-84.

72. Власенко, С. Б. //Кинетика реакции окисления люминола, катализируемой пероксидазами и ее использование в люминесцентном иммуноанализе. Диссетация На Соискание Ученой Степени Кандидата Химических Наук; 1989.

73. Merenyi, G.; Lind, J.; Shen, X.; Eriksen, Т. E. //Oxidation Potential of Luminol. Is the Autoxidation of Singlet Organic Molecules an Oute-Sphere Electron Transfer? J. Phys. Chem. 1990, 94, pp: 748-758.

74. Jansen, E. H. J. M.; Van der Berg, R. H. //High-Performance Liquid Chromatographic Investigation of Product Formation in the Horseradish Peroxidase-Enhanced Chemiluminescence of Luminol With Different Enhancers. J. Chromatogr. 1991, 566, pp: 461-469.

75. Diaz.A.N.; Sanchez, F. G.; Garcia, J. A. G. //Enhancement and Inhibition of Luminol Chemiluminescence by Phenolic Acids. J. Biolumines. Chemilumines. 1995,10(3), pp: 175-184.

76. Sanchez, F. G.; Diaz, A. N.; Garcia, J. A. G. //P-Phenol Derivatives As Enhancers of the Chemiluminescent Luminol-Horseradish Peroxidase-H202 Reaction: Substituent Effects. Journal of Luminescence 1995, 65(1), pp: 33-39.

77. Candy, Т. E. G.; Hodgson, M.; Jones, P. L. //Kinetic and Mechanism of a Chemical Clock Reaction Based on the HRP Oxidation of Luminol. J. C. S. Perkin II1990, 8, pp: 1385-1388.

78. Easton, P.; Simmonds, A. C.; Rakishev, A.; Egorov, A. M.; Candeias, L. P. //Quantitative Model of the Enhancement of Peroxidase-Induced Luminol Luminescence. J. Am. Chem. Soc. 1996,118(28), pp: 6619-6624.

79. Diaz, A. N.; Sanchez, F. G.; Garcia, J. A. G. //Phenol Derivatives As Enchancers and Inhibitors of Luminol-H202-Horseradish Peroxidase Chemiluminscence. J. Biolumines. Chemilumines. 1998,13, pp: 75-84.

80. Wurzberg, E.; Haas, Y. //Chemiluminescence of Luminol and Relative Compounds Under E-Beam Exitation. Absolute Chemicaland Light Yields. Chem. Phys. Lett. 1978, 55(2), pp: 250-253.

81. Русин, Б. А.; Лексин, A. H. //Гидролиз и Хемилюминесценция Диазахинонов. Изв. АН СССР, сер. хим. 1982,12, рр: 2685-2692.

82. Калениченко, И. Е.; Пилипенко, А. Т.; Боровский, В. А. //Константы Ионизации Фталевого Гидразида и Некоторых Его Производных. Журнал общей химии 1978,48(2), рр: 334-338.

83. Русин, Б. А.//Хемилюминесценция Фталгидазидов. In Биохемилюминесценция; М., Наука: 1983;рр:69-117.

84. Baxendale, J. Н. //Precusors to the Chemiluminescence of Luminol, 6-Aminophtalazine-l,4(2H,3H)-Dione. J. Am. Chem. Soc., Chem. Commun. 1971, 22, pp: 1489-1490.

85. Baxendale, J. H. //Pulse Radiolysis Study of the Chemiluminescence From Luminol. J. Am. Chem. Soc.,Farad. Trans. 1973, 69(9), pp: 1665-1667.

86. Wurzberg, E.; Haas, Y. //A Pulse Radiolysis Study of the Chemiluminescence of Some Luminol-Like Molecules. J. Phys. Chem. 1979, 83(21), pp: 2687-2692.

87. Merenyi, G.; Lind, J. //Oxidation and Chemiluminescence of Cyclic Hydrazides. In Proc. of the Tihamy Symposium on Radiation Chemistry, Akademiai Kiado, Budapest: 1983; Vol. l,pp:103-109.

88. Merenyi, G.; Lind, J. //Role of Peroxide Intermediate in the Chemiluminescence of Luminol. A Mechanistic Study. J. Am, Chem. Soc. 1980,102(18), pp: 58305835.

89. Lind, J.; Merenyi, G.; Eriksen, Т. E. //Chemiluminescence Mechanism of Cyclic Hydrazides Such As Luminol in Aqueous Solutions. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105(26), pp: 7655-7661.

90. Eriksen, Т. E.; Lind, J.; Merenyi, G. //Chemiluminescence of 5-Aminophtalazine-l,4-Dione in the Presence of Hydrogen Peroxide. J. Am. Chem. Soc. 1987, 77(9), pp: 2137-2148.

91. Merenyi, G.; Lind, J.; Eriksen, Т. E. //Luminol Chemiluminescence: Chemistry, Excitation, Emitter. J. Biolumines. Chemilumines. 1990, 5, pp: 53-56.

92. Lind, J.; Merenyi, G. //Determination of the Chemiluminescence Quantum Yield of Luminol in Rapid Chemical Reactions. Chem. Phys. Lett. 1981, 82(2 ), pp: 331-334.

93. Лайтинен, Г. А.; Харис, В. E. Химический Анализ; Москва: Химия: 1979; рр 624.

94. Nakane, Р. К.; Kawaoi, A. //Peroxidase-Labeled Antibody a New Method of Conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974, 22, pp: 1084-1091.

95. Sakurada, J.; Sekiguchi, R.; Sato, K.; Hosoya, T. //Kinetic and Molecular Orbital Studies on the Rate of Oxidation of Monosubstituted Phenols and Anilines by Horseradish Peroxidase Compound II. Biochemistry 1990,29, pp: 4093-4098.

96. Patel, P. K.; Mondal, M. S.; Modi, S.; Behere, D. V. //Kinetic Studies on the Oxidation of Phenols by the Horseradish Peroxidase Compound II. Biochim. Biophys. Acta 1997,1339(1), pp: 79-87.

97. Rodriguez-Lopez, J. N.; Lagrimini, L. M.; Thorneley, N. F. //Luminol Oxidation by Hydrogen Peroxide Catalyzed by Tobacco Anionic Peroxidase: Steady-State Luminiscence and Transient Kinetic Studies. Photochem. Photobiol. 1998, 67(1), pp: 85-90.

98. Vlasenko, S. В.; Arefyev, A. A.; Klimov, A. D.; Kim, В. В.; Gorovits, E. L.; Osipov, A. P.; Gavrilova, E. M.; Yegorov, A. M. //Investigation of the Catalytic

99. Mechanism of Enhanced Chemiluminescence: Immunochemical Applications of This Reaction. J. Biolumines. Chemilumines. 1989, 4, pp: 164-176.

100. Kapeluich, Yu. L.; Rubtsova, M. Yu.; Egorov, A. M. //Enchanced

101. Chemiluminescence Reaction Applied to the Study of Horseradish Peroxidase Stability in the Course of P-Iodophenol Oxidation. J. Biolumines. Chemilumines. 1997,12, pp: 299-308.