Изучение биоспецифических взаимодействий методом проточного хемилюминесцентного анализа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Проточно-инжекционные методы иммуноанализа

1.1. Конкурентные методы

1.2. Неконкурентные методы

1.3. Метод вытеснения

ГЛАВА 2. Иммунобиосенсоры

2.1. Электрохимические иммуносенсоры

2.1.1. Иммуноферментные сенсоры

2.1.2. Иммуносенсоры, основанные на детекции неферментативной 24 метки

2.1.3. Прямая детекция иммуновзаимодействия ( в отсутствии метки)

2.2. Пьезоэлектрические иммуносенсоры

2.3. Оптические методы изучения иммунореакций на поверхностях

ГЛАВА 3. Реакция усиленной хемилюминесценции

3.1. Механизм реакции

3.2. Использование реакции усиленной хемилюминесценции для 39 аналитических целей

ГЛАВА 4. Хемилюминесцентный иммуноанализ

4.1. Хемилюминесцентный иммуносубстратный анализ

4.2. Хемилюминесцентный иммуноферментный анализ

ГЛАВА 5. Материалы и методы

5.1. Материалы и оборудование

5.2. Методы исследования

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 6. Проточный анализ с использованием реакции усиленной 62 хемилюминесценции и пероксидазы хрена для мониторинга воды

ГЛАВА 7. Изучение физико-химических закономерностей 71 взаимодействия антиген-антитело в тонкослойной проточной системе

7.1. Изучение сорбции меченных пероксидазой антител на 73 полистирольной поверхности в статическом и проточном режимах

7.2. Определение кинетических и равновесных констант реакции 76 комплексообразования антиген-антитело

7.3. Определение кинетических параметров реакции 83 комплексообразования антиген-антитело в случае ковалентной фотоиммобилизации антител на поверхности мембраны

ГЛАВА 8. Разработка методов тонкослойного проточного 86 иммуноферментного анализа антигенов симазина и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты

8.1. Определение симазина

8.2. Определение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты

ГЛАВА 9. Разработка проточного иммуноферментного анализа в "режиме реального времени"

9.1. Общие принципы

9.2. Определение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и симазина в режиме реального времени

9.3. Изучение кинетических закономерностей процессов комплексообразования антиген-антитело в режиме реального времени

ВЫВОДЫ

В настоящее время методы иммуноферментного анализа являются мощным средством, позволяющим проводить определение различных веществ самой разнообразной структуры: от низкомолекулярных гаптенов до сложных образований, например, бактерий или клеточных элементов. Области, в которых широко используются иммунохймические методы включают в себя эпидемиологию и медицинскую диагностику, экологический мониторинг, контроль за загрязнением пищевых продуктов и биотехнологических производств и др. Классические твердофазные методы иммуноферментного анализа на микропланшетах позволяют определять содержание веществ в анализируемых пробах в очень низких концентрациях, однако существенным недостатком является относительно продолжительное время проведения анализа, составляющее, как правило, несколько часов, и трудность его автоматизации вследствие многостадийности схемы и необходимости точного многократного дозирования реагентов. Во многих же случаях время анализа является критическим фактором (например, при контроле непрерывных биотехнологических производств, случаях токсикации и необходимости быстрого определения качественного состава яда и т.п.). Поэтому остается актуальной разработка новых высокочувствительных автоматических экспресс-методов иммуноанализа, позволяющих получать ответ в течение минут.

Для сокращения времени проведения гетерогенных методов иммуноанализа принципиально возможным является использование двух подходов: первый основан на устранении внешнедиффузионных затруднений, характерных для реакций антиген-антитело, протекающих на границе раздела фаз, второй - перевод иммунохимических реакций из равновесного режима в кинетический. Оба эти подхода были реализованы * в настоящей работе путем использования проточно-инжекционной системы иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной детекцией пероксидазной метки в тонкослойной ячейке. Предложенный в настоящей работе проточно-инжекционный метод иммуноанализа позволяет создать полностью автоматические биосенсорные устройства для контроля за содержанием анализируемых веществ в режиме реального времени.

При проведении реакции антиген-антитело в кинетическом режиме ввиду значительного уменьшения количества ферментной метки, связанной в иммунохимический комплекс, необходимо применять быстрые и высокочувствительные методы детекции метки. При использовании пероксидазы хрена в качестве маркера в ИФА перспективной детектирующей системой является реакция усиленной хемилюминесценции, представляющая собой катализируемое пероксидазой хрена окисление люминола перекисью водорода при участии усилителя, например, я-йодофенола.

Высокая чувствительность реакции усиленной хемилюминесценции к различным ароматическим, полиароматическим соединениям, в том числе к ряду пестицидов, ионам тяжелых металлов и другим загрязнителям окружающей среды была положена в основу создания проточного хемилюминесцентного датчика для непрерывного контроля общего загрязнения окружающей среды. Создание такого рода датчиков становится особенно актуальным при решении задач непрерывного экологического мониторинга.

В последние годы особое внимание ученых привлекают методы, позволяющие осуществлять регистрацию биоспецифических взаимодействий в режиме реального времени. Среди оптических сенсоров такого рода наиболее известны три прибора: BIOS-1 (Artificial Sensor Instruments; Zurich, Switzerland); IAsys (Fisons Applied Sensor Technologies; Cambridge, U.K.); BIAcore (Biosensor; Uppsala, Sweden and Piscataway, USA). Однако, существенным моментом, сдерживающим в настоящее время широкое распространение таких приборов, является их высокая стоимость (100-200 тыс.долл.). Разработанный в настоящей работе простой проточно-инжекционный метод иммуноанализа в тонкослойной ячейке на основе реакции усиленной хемилюминесценции и портативный проточный люминометр позволяют в режиме реального времени следить за протеканием реакций биоспецифических взаимодействий на границе раздела твердая фаза - жидкость и производить оценку кинетических параметров реакции антиген-антитело. Знание этих параметров имеет важное значение как для установления взаимосвязи структура-функции биомолекул, так и для теоретической оценки влияния аффинности антител на рабочие характеристики методов иммуноанализа при использовании различных пар антиген-антитело.

В этой связи основными задачами настоящей работы явились следующие: разработка на основе реакции усиленной хемилюминесценции проточно-инжекционной системы, позволяющей в непрерывном режиме осуществлять контроль качества воды из реальных источников; разработка нового хемилюминесцентного иммуносенсора, позволяющего в режиме реального времени проводить изучение кинетических и равновесных параметров процессов комплексообразования антиген-антитело на границе твердая фаза - жидкость и осуществлять экспресс-определение содержания антигенов в анализируемых жидкостях.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ