Влияние синтетитческих полиэлектролитов на катализируемую пероксидазой хрена реакцию совместного окисления люминола и п-иодфенола перекисью водорода тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Московский орлсиа Ленина, орлена Октябрьской Революции и орлепа Трулопого Красного Знамени государственный университет имени М.В. Ломоносова

Химический факультет

па правах рукописи УДК 57бЛЛ77^43.42б

ГОРОВИЦ Елена Львовна

ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ НА Б^ТАЛИЗИРУЕМУЮ ПЕРОКСИЛАЗОЙ ХРЕНА РЕАКЦИЮ СОВМЕСТНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛЮМИНОЛА И П-ИОДФЕНОАА ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА

(02.00.15 - химическая кинетика я катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва • 1991

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ

Научный руководитель: доктор биологических паук Егоров A.M.,

Научные консультанты:

доктор химических наук Изумрудов В .А., кандидат ,биологических наук Гаврилова ЕМ.

Официальные оппоненты : доктор химических наук

Кирш Ю.Э.,

доктор химических наук Метелица Л.И.

Ведущая организация : Институт энергетических проблем

химической физики АН СССР.

Зашита диссертации состоится 2.Цдекаде с 1991 г.

зР.

- —"ч»» ^ •» Аяъчър 1 *км«п ^иъ а. V»» IV»» — - у ~ — ж-

в /\Р час, на заседании специализированного совета Д 053.05.76 в Московском Государственном университете им. МЛ. Ломоносова

по адресу: 119899, ГСП, г.Москва, Ленинские горы МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд.202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан _ 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

О.А.Кост

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТА-'

Актуальность проблемы. Хорошо известна фундаментальная роль кооперативных электростатических взаимодействий в биолг.нчсских системах. Комплексы глобулярных белков с противоположно заряженными линейными природными полиэлсктролитами, главным образом, нуклеиновыми кислотами выполняют важные функции в живой приролс. Это определяет актуальность исследовахшя молельных систем, в том числе» растворов комплексов глобулярных белков с синтетическими полиэлектролитами. Изученная в работе реакция усиленной хемилюминесценции в растворах синтетических полиэлсктролитов является удобным инструментом для выявлепкя закономерностей образования и кзучепия свойств таких комплексов. Использование в работе интенсивности хемилюминесценции в качестве легко детектируемого сигнала позволило провести систематическое изучение влияния синтетических полиэлектролитов разного знака заряда на отдельные стадии сложной многостадийпой реакции усиленной хемилюминесценции.

Системы детекцйн, основанные па данной реакции, являются весьма перспективными для использования в методах ИФА, поэтому поиск путей регуляции этого процесса представляет песомненный интерес. Проведенное в работе подробное изучение особенностей реакции уенлепной хемилюминесценции в растворах синтетических полиионов актуально для разработки новых подходов и вариантов гомогенного люминесцентного анализа..

Целью работы является изучение влияния синтетических полиэлектролитов на реакцию усиленной хемилюминесценции и анализ перспектив использования таких систем в методах иммуноферментного анализа (ИФА) физиологически активных веществ.

Н а учи а я ту ови зн а р а б о ты. Впервые проведено систематическое исследование реакции усиленной хемилюминесцепции в растворах синтетических полиэлектролитов различной химической природы. Обнаружено, что введение в реакционную систему синтетических полиионов сопровождается изменением интенсивности результирующего свечения. Измерены величины кинетических констант скорости элементарных стадий окисления субстратов-восстановителей. Установлено, что действие всех полиэлсктролитов на ферментативный цикл окисления лгомииола и п-иодфеиола может быть объяснено влиянием электростатического поля заряженной полимер-

ион молекулы на активность фермента.

Обнаружен эффект специфического иигибирующего действия поли-1Ч-этил-4-винилпиридииий бромида на реакцию усиленной хемилюми-несценцни. Показано, что этот эффект обусловлен взаимодействием пирилиниевых звеньев поликатиона с промежуточными продуктами окисления люминола. Продемонстрировано принципиальное значение близости звеньев полнкатиона-тушителя к активному центру фермента для осуществления акта тушения.

На основапяи выявлепных закономерностей протекания реакции усиленной хемилюмипесцепции в растворах синтетических полиэлектролитов разработан подход к созданию метода гомогенного люминесцентного нммуноферментного анализа ипсулина и антител к инсулину. Предложено использование реакции усиленной хемилюми-несценции в качестве системы детекции в методе псевдогомогенного иммуноанализа тестостерона с использованием полиэлектролитных комплексов.

Научная и практическая значимость. Летально проанализированы механизмы влияпия различных полиэлехтролитов и полиэлектролитных комплексов на отдельные стадии изучаемого процесса. Выявленные закономерности позволили разработать рекомендации для использования реакции усиленной хемилюмипесцепции в методе псевдогомогенного иммуноанализа с использованием полиэлектролитов.

Предложен новый вариант гомогенного люминесцентного нммуноферментного анализа инсулина и антител к инсулину, позволяющий быстро и с высокой чувствительностью (2.10"11 М для инсулина и 1.10"10 м для антител) определять указанные вещества.

Апробаттия работы. Материалы работы были представлены на VI Всесоюзном симпозиуме по инженерной энэимологии (Вильнюс, 1988), XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Ташкент, 1989), II Всесоюзной конференции по интерполиэлектролитпым комплексам (Рига, 1989), IV Международном симпозиуме по количественной люминеспептиой спектроскопии в биолюминесцентных науках (Гснт, 1991), VII Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Москва, 1991).

Публикапии. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Об-ьсм работы. Диссертация состоит из введения, збзора литературы (3 главы), экспериментальной части, описыааютей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), выводов, списков цитируемой литературы и сокращений. Работа изложена на "¿^страницах, содержит 21 рисунок и 5 таблиц. Список литературы включает из ссылок.

РЕЗУЛЬТАТ Ь> РАБОТЫ

1. ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКОГО ПОЛЯ ПОЛИЭЛККТРОЛНТОВ НА РЕАКЦИЮ УСИЛЕННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

Реакция усиленной хемилюминесценции протекает по сложному многостадийному механизму, включающему как стадии, протекающие с участием фермепта, так н пеферментативные превращения радикальных промежуточных продуктов. Ниже приведена схема реакции, включающая основные стадии процесса (схема I): Ферментативные стадии:

(1) Е + Н202 -> Ет

окисление лгоминола:

(2) Ег + ЫГ —> Ез + ' ЬН" 12

(3) Ез + ЬН" ~> Е + ЬН' к3 (I) окисление п-иодфенола:

(4) Е^ + 3 ' — > В2 + Б- 1с4

(5) Е2 + в —> Е + У к5 неферментативные стадии:

(6) АН' + Б; ->ГР —> Ьг

Наличие большого количества стадий, протекающих в ряде случаев с участием заряженных частиц, определяет возможность регуляции хемилюминесценции введением в реакционные смеси заряженных полимерных молекул. Оказалось, что синтетические полиэлектролиты оказывают существенное влияние на главный регистрируемый параметр реакции - интенсивность свечения 1хл.

Мы изучили влияние на реакцию усиленпой хемилюминесценции синтетических полиэлектролитов различной химической природы и знака заряда. 5 качестве полианиона использовали полиметак-рилат натрия (ГТМЛЫа), а в качестве полигатиопон поли-К-этил-4-витшлпиридиний бромид (ПЭВП), полиднметилдкаллиламмопий хлорид (ПЛМ) и 5,6-ионен бромид (5,6-ионсн). Структурные формулы со-^псикй приведены на схеме II:

сн3

-1-СИ2-С"]в-

СОО" Иа + (ПМАЬа)

сн3

-[-(сн2)6-^+чсн2)б-]п

Вг' С1Г3 с (5,6-ионеи)

Данные ло влиянию рН на активность фермента представлены на рис.1. Как видно из рисунка (кривая 1), зависимость 1хл от рН для натявной пероксидазы имеет вид колокола с максимумом при рН 8.45. Добавление в систему ПМАМа не приводило к каким-либо изменениям вида этой зависимости. В случае катализа реакции конъюгатом ПМАИа-ПХ (кривая 4), рН-оптимум каталитической активности перокендазы смешен в щелочную область па 0.3 единицы рН по сравнению с дативным ферментом. При добавлении в реакционную смесь ПДМ к ПЭВГХ значение рН, при котором достигается максимум активности фермента, ниже на 0,2 единицы по сравнению с этой величиной 'для натнвного фермента (кривые 2 и 3, соответственно). Эти результаты могут быть объяснены в рамках классической электростатической теории действия полнэлсктролитов. Молекула фермента в условиях эксперимента имеет на своей поверхности слабый отрицательный заряд (р!=8.4). Поэтому, введения молекулы фермента в сферу действия электростатического поля отрицательно заряженного ПМАИа' удается достичь лишь при его ковалентной иммобилизации на полианионе. Поликатионы, напротив, образуют нековалентный комплекс с ферментом. Создаваемое цепями синтетических полнионов с высокой линейной плотностью зарядов электростатическое поле вызывает неравномерное распределение ионов водорода и гидрокси л-нонов вблизи полимера и на значительном удалении от пего. За счет этого вблизи полианиона происходит понижение, а вблизи поликатиона - повышение локального значения рН. "

Однако, если значения 1хд в точках рН-оптимума для конъюгата ПМА№-ПХ и натнвного фермента практически совпадали, то при добавлении поликатионов мы наблюдали существенное изменение величины 1хд. Причем, в случае добавления ПДМ, наблюдалось увели-

-[СН сн-]п-

(ПДМ)

10

Рис.1. Зависимость максимальной интенсивности хсмиаюми-несцеицик (1ХА) от рК раствора для нативного фермснта(1), смеси ПХ и ПДМ (2), смеси ПХ и ПЭВП (3) и коныогата IlMANa ПХ (4).

ченне 1ХА, а при введении ПЭВП значение интенсивности свечения в точке рН-оптимума было существенно ниже.

Мы проанализировали зависимость 1хд от концентрации добавленного полиэлектролита. Добавление IlMANa в реакционную смесь, в которой катализатором является кативный фермент, не сопровождается изменением интенсивности хемилюминесцеиции. Ковалентная иммобилизация ПХ на полианноне приводит к некоторому снижению хемилюминесцентного сигнала.

Синтетические поликатионы оказывают существенное влияние на интенсивность свечения. Как видно из данпых, представленных на рис.2, введение в реакционную смесь ПЭВП вызывает пропорциональное снижение интенсивности свечения (рис.2, кривая 3). При достаточно высоких концентрациях звеньев полнкатиоиа в растворе М) наблюдается практически полное ингибирование хемилюминесцептного сигнала. По-другому ведет себя система в присутствии ПДМ и другого алифатического полнкатиоиа 5,6-ионена, которые, как видно из кривых 1 и 2 па рис.2, оказывают активирующее воздействие на интенсивность свечения. Введением в реакционную смесь данных поликатиопов удается добиться двух-трехкратного увеличения значения 1хд.

На рис.3 представлены данные по влиянию синтетических поли электр олитоп па кинетику резул ьтируюшего свечения.

Зс гчпгмссть I ог ерем спи имеет вид кривой с максимумом.

|хл*10-3, мВ

0.0 ' 0.2 0.4

[поликатнон]зв, мМ

6 4 2 0

О . 10 20 30

1,мин

I хл * 10-3, мВ

Рис.2 Зависимость максимальной интенсивности хемилюмипес-цеиции (1ХЛ) от концентрации ПДМ (1), 576-ионсна (2) и ПЭВП(3).Концентрации реагентов: [ПХ]=110"^М, [Н202]=210:3М, [ЬН2]=610"5 М, [Р1Р]-=610~5 М. Реакцию проводили в 0.005М Трис-НС1 буфере рН 8,45.

РисЛ Зависимость интенсивности хемилгаминесценции от времени для систем, катализируемых ПХ (1), ПХ в присутствия ПДМ (2), конъюга-том ПМ|Ша-ПХ (3). Условия реакции: см.рис.2. [ПДМ]3 =1.510"3 М.

Достижение максимального значения и последующий спад интенсивности свечения связаны, как предполагают, с инактивацией фермента радикальными промежуточными продуктами реакции. Как видно из рисунка (кривая 2), добавление в реакционную смесь ПДМ приводит к тому, что, наряду с возрастанием максимального значения 1ХА, увеличивается н время его достижения по сравнению с нативиым ферментом (кривая 1). В случае катализа реакции конъюгатом ПМАИа-ПХ (кривая 3) оба эти параметра уменьшаются. Очевидно, что если при использовании системы для аналитических целей регистрировать не максимальную интенсивность свечения, а общую светосумму, то при введении алифатических поликатионов мы получаем возможность существенно повысить чувствительность детекции фермента.

Таким образом, ряд полученных результатов нельзя объяснить только за счет изменения локальных концентраций низкомолскулярпых ионов вблизи молекулы полиэлектролита. Для более глубокого понимания роли синтетических полиионов в протекании реакции усиленной хемилюминесценции нами было предпринято кинетическое исследование отдельных ее стадий. Эти результаты изложены в последующих двух главах.

2.КИКЕТИЧЕСКОН ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СТАДИЙ РЕАКЦИИ УСИЛЕННОЙ ХЕМИЛКШИКЕСЦЕНЦИИ

Основным регистрируемым с помощью люмико метра параметром реакции усиленной хемилюминесцепции является максимальная

интенсивность результирующего свсчсиия (1ХА). Для исследования «

механизма реакции этот параметр мало пригоден, так как величина 1ХЛ является валовой и не позволяет разделить влияние полиэлектролитов па ферментативные и постферментатионые стадии процесса, протекающие с участием короткохивущих радикальных продуктов. Получение данных по влиянию полкэлектролитов отдельно как па ферментативные, так и на постферментативные - стадии процесса возможно лишь при использовании кинетических методов и специального оборудования. ^

2.1 Измерение кинетических констант Ферментативных стадий реакции усиленной хемилюминесиениии в присутствии полиэ^пектролитрв методом остановленной струи , Мы провели прямое измерение ккпетнческнх констант элементарных стадий окисления люмипола и п-иодфенола в растворах полиэлектролитов методом остановленной струи.

'Ферментативный цикл окисления люминола и п-иодфенола описывается реакциями 1-5 (см.схему I). Для форм пероксидазы Е, Е^, и Е2 спектры поглощения в области Соре разрешены. Это позволяет регистрировать кзмепенне концентраций одной из форм фермента в ходе реакции, выбрав за реперную изобестичсскую точку спектра двух других его форм. Наиболее информативным является изучение кииетики нарастания и расходования ферментативного комплекса (^и30бест им). Кинетические копстанты скорости этих реакций полностью описывают ферментативпый цикл окисления люминола и субстрата-усилителя.

Мы получили зависимости копстант скоростей реакции псевдо-допервого порядка окисления люминола и ку) и п-иодфенола

(к^ и ферментативными формами Е1 и Е2 от концентрации

субстратов. В диапазоне использованных в эксперименте концентраций данные зависимости были линейны. Это позволило рассчитать истинные значения констант скорости окислеиия субстратов па ферментативных стадиях реакции. Расчет проводили методом линейного регрессионного анализа тангенсов углов наклона прямых. Значения полученных констант приведены в таблице I.

Таблицг 1. Результаты определении кинетических констант

ъмиасгарнъи реакщл о^слеша ломаном и п-иодфенола

Эла ПХ, ктъыата ПШМа-ПХ и комплексов ПХ с пол,кативши.

Катализатор Определяемый параметр

люминол

к1, М-у1 х10 к2, М-1«"1 хЮ"5 кЗ, М^с"1 х10"3

ПХ ПАМКа-ПХ ПЭВП + ПХ ПДМ + ПХ 1.9 1-7+/-0.05 1.8+/-0.06 1.8+/-0.03 4.0+/-0.05 2.1+/-0.12 7-3+/-0.08 7-5+/-0-05 6-5+/-0.07 ' 4.1+/-0.06 32+/-0.8 39+/-0.5

п-иодфен ол

к1, М^с"1 х10"7 к4, Ы"1^1 хЮ"7 -хЮ-6

ПХ ПМАИа-ПХ ПЭВП + ПХ ПДМ+ ПХ 1.7+/-0.05 1-8+/-0.08 1.6+/-0-05 1-9+/-0.07 1-5+/-0.09 0.7+/-0.07 2.1 +/-0.06 2.4+/-0.09 1.8+/-0.06 1.2+/-0.13 2.4+/-0.09 2.7+/-0-1

Введение поликатионов в раствор, содержащий все компоненты реакции усиленной хемилюмннесцснцин приводит к пропорциональному увеличению определяемых констант к2, к3> к4 и к5- Добавление ПМАНа в реакционную смесь, катализатором в которой является „ативный фермент, не оказывает влияния „а определяемые константы. Однако,- -в том случае, когда пероксидаза ковале, .тно иммобилизована на полна,1ио..е, эффективность каталитического действия фермента снижается.

Таким образом, действие всех полиэлектролитов, в том числе и ПЭВП, „а ферментативный цикл окисления л.оминола и п-иодфенола может быть объяснено влиянием электростатического поля заряженной полимерной молекулы на активность фермента. Причем, сели в случае катализа реакции кон-ыогатом ПМАЫа-ПХ снижение эффективности катализа обусловлено, по-видимому, лишь изменением локального значения рН вблизи «молекул полинопа, то механизм активации фермента, наблюдаемой при введении поликатиопои, пока неясен и требует дополнительных исследований. Влияние поликатио.юв „а кинетику развития хсмил.о„н..ссие..т„ого сигнала (см. рис.3) свидетельствует о том, что введете ПДМ и образование псковалентпого комплекса фермента с поликатиопом

приводит к покышсншо устойчиоостн ПХ к действию миактипаторои. Кооалснтпая иммобилизация фермента на полкапионс, напротив, вызывает более быструю инактивацию псроксидазъс

Обнаруженное нами существенное активирующее воздействие не содержащих пиридипневых групп алифатических поликатионов на

хемнлюмннесцснтиую реакцию может иметь важное практическое «

значение. Введение в реакционные смеси таких синтетических полнкатионоо, приводящее к увеличению интенсивности сигнала и к возрастанию общей светосуммы является простым и эффективным путем повышения чувствительности хсмилюмкпесиентных методов анализа.

З.ВАИЯНИЕ ТТЗВП НА ПОСТФЕРМЕНТАТИВНЫЕ-СТАЛИН РЕАКЦИИ УСИЛЕННОЙ ХЕМЕГЛЮМИНЕСПЕННИ^

Изложенные в предыдущей главе результаты свидетельствовали о том, что выявленпое нами принципиально отличное протекание реакции усиленной хемилюмипесценции в присутствии ПЭВГХ не связано с его влиянием на ферментативные стадии реакции. Такое специфическое поведение системы обусловлено взаимодействием ПЭВП с промежуточными продуктами процесса двух субстрата ого окисления на постферментативных стадиях реакции. Этот вывод следует из полученных нами данных, изложенных в следующем разделе.

3.1_Изучение влияния ПЭВП на промежуточные продукты

Qfcuc/ieHus лк^иинола

Мы провели эксперименты для выяснения влияния полнкатиоиа на реакцию фото сенсибилизированной хеми люминесценции. Реакция сенсибилизировалась эозином. При облучении системы светом лазерной лампы на длине возбуждения эозина в ней протекали следующие реакции:

3Э + ЫГ —> Э'* + LH*

э'*+ о2 — > э + о2~

LH + 02'*—> Ъ"

Оказалось, что введение ПЭВП в данную систему приводит к эффективному тушению люминесценции. Этот эффект не зависел от длины цепи поликатиона и определялся только концентрацией пиридинисвых звеньев в растворе. Известно, что ПЭВП является тушителем флуоресценции. Наличие в пиридиниевых группах полнкатиоиа ароматического кольца с недостатком электронной плотности па нем обуслопливаст способность ПЭВП вгАступать в роли

акцептора и образовывать с электроиодопорпыми молекулами так называемые комплексы с переносом заряда. По-видимому, и в реакции усиленной хемилюминесценцни ПЭВП-катионы образуют комплексы с переносом заряда с промежуточными ион-радикальными продуктами окисления люминола.

Как мы отмечали выше, введение в реакционную смесь вместо -ПЭВП других полихатионов - ПДМ или 5,6-иоиена не сопровождается тушением свечения (рис.1 .кривые 1 и 2) . Таким образом» обнаруженный нами эффект иигибнрующего действия ПЭВП на реакцию усиленной хемилюмииесцепции связан со специфическим взаимодействием данного полиэлектролита с промежуточными продуктами окисления люмшгола.

3.2. Принципиальное значение близости пиридиниевьз эоеньев-туиштелей ПЭВП к активной зоне реакции Важным следствием обнаруженного нами эффекта специфического взаимодействия ПЭВП с промежуточными продуктами окисления субстратов является принципиальное значение местонахождения фермента и полнкатиона. Акт тушения хемилюминесценцни может иметь место только в том случае, если за время жизни радикала осуществляется его контакт с пиридиниевым звеном-тушителем. Это обусловливает важную роль расстояния между образующимися в результате .реакции радикалами и звеньями полихатиона-тушитсля в процессе специфического ннгкбировапия. Мы обнаружили, что очепь незначительное удаление фермента от цепи ПЭВП может приводить к заметному снижению ингибирования свечения. Этот эффект наблюдается даже в том случае, если пероксидаза копалентио иммобилизована на ПЭВП.

Перейдем к рассмотрению результатов таких экспериментов.

3.2.1 Хемилюминесиасгна? реакииа в растворах пероксидазы^

ко валентно \итоби.*изованн6й на пцриЭцнцевьсс полмкатарнах

различной химической природы Мы синтезировали пиридиниевые поликатионы различной химической природы, отличающиеся как реакциониоспособной группой,

»

так и числом атомов углерода в И-алкильпом радикале.

Структурную формулу поликатноиов можно изобразить следующим образом:

- [СН2 |ш - [СН2- 1- , гас

Вг' "С2Н5

-Я Вг"

К: 1.С2Н4ОН (СЛ1),п =35%

2.а) С^НдСООН (СП2), и =20% б) С12Н24СООН (СПЗ),п =20%.

Оказалось, что как способ получения конъюгата (и,

соответственно, взаимная ориентация ПХ и поликатиона), так и длина "ножки" оказывают существенное влияние на хемилюминесценцию

ния наблюдалось у конъюгата СП2-НХ, хотя и в этом случае степень ингибнрования хемилюминесцентного сигнала достигала лишь 30-40%. При катализе реакции конъюгатом СП1-ПХ эффективность тушения снижается до 10-20%, несмотря на практически одинаковую длину "ножек" у коныогатов СП1-ПХ и СП2-ПХ, через которые фермент пришит к поликатиопу. Активность конъюгата СПЗ-ПХ практически не отличается от активности пативного фермента.

Таким образом, при ковалентиом закреплении молекулы фермента на пиридкниевом поликатионе достигается менее эффективное ннгибнровапие свечения, чем это наблюдается в растворе свободного фермепта при добавлении к нему раствора ПЭВП (рис.1, кривая 3). Разумно полагать, что это обусловлено относительно более жесткой фиксацией белковой глобулы в конъюгате при ее иммобилизации на "пожке". Увеличение длины "ножки* приводит к удалению активного цептра фермента от пиридиниевых звеньев-тушителей поликатиона и, соответственно, к возгоранию хемилюминесценции. Это следует из сравнения эффективности тушения в конъюгатах СП2-ПХ и - СПЗ-ПХ, синтезированных одинаковым способом в обращенных мицеллах.

Наблюдаемую разпицу в эффективности тушения в растворах конъюгатов СП1-ПХ и СП2-ПХ,- имеющих одинаковую длину. "ножки*, следует, по-видимому, отнести к различной ориентации активного центра иммобилизованного фермепта по отношению к звеньям-тушителям полимерного носителя. Можно полагать, что образование ковалентных амидиых связей при синтезе конъюгата СП2-ПХ приводит к фиксации белковой глобулы, обеспечивающей более высокую концентрацию пиридиниевых звеньев в активной зоне реакции, чем в случае пришивки белка через ОН-группы при получении конъюгата

иммобилизованного фермента. Наиболее выраженное тушение свече-

СП1-ПХ.

I , мВ

2000 Р

1000 -

! хл, мВ

2000

1000

1л, отк.ед

-1-1 40

с«?

0

/

о

/

©

0«

2

30

20

10

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

[ПЭВП],,/ [ПМАЫа]*,

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 [ЫаС1], М

Рис. 4. Зависимость 1ХД от концентрации ПЭВП (р=2700) для нативного фермента (1); от сотно-шекня концентраций звеньев ПЭВП и ПМАЫа для коныогатаПМАЫа-ПХ при РПЭВП: 18(2),600(3), 1350(4), 2700 (5) и 9000 (б); от концентрации поликатиона (р=2700) для смеси ПХ и ПМАЫа ([ПЭВП]зв/[ПМАМа|зв «=1 в каждой точке кривой) (7).

Рис.5. Зависимость 1хл(1) и

1фЛ от концентрации КаС1 в растворе ПЭК (ПМАЫа-ПХ +

ПЭВП), (ПМАКа|зв =610 М(1) и 1,3"10"5М(2), [ПЭВП) =бЮ-6м,Рпэвп=соо

3.2.2. Катализ пероксидаэой. включенной в полиэлектролигный комплекс

Введение ПЭВП в раствор конъюгата ПМАИа-ПХ сопровождается значительным тушением свечения (рис.4,кривая 5), причем, гораздо более эффективным, чек в случае нативного фермснта(рис.4,кривая 1). При добавлении ПЭВП к коныогату ПМАЫа-ПХ 1ХЛ линейно уменьшается вплоть до практически полного исчезновения сигнала при достижении стехиометрического состава смеси полиэлектролитов [ПЭВП]зв/ (ПМАЫа-ПХ]зв = 1. Эффект тушения не зависит от длины цепи поликатиона. Как видно из рис.4 (кривые 2-6), варьирование ^ПЭВП 8 интервале 18-9000 не приводит к изменению вида зависимос-ПМАНа-ПХ определяется только отношением звеньев разноименно заряженных полиионов. Этот результат подтверждает важность близости звеньев поликатиона-тушитсля к активному центру фермента для тушения хсмилюминссцентного сигнала. Такая близость в максимальной степени реализуется в частицах образующегося -в бессолевой срсдс стсхиометричного поли электролитного комплекса (ПЭК) (ПЭВП + ПМАЫа-ПХ), в котором количество интсрполкэлсктролитных солевых связей максимально. Частицы ПЭК к этих условиях весьма

гидрофобпы и агрегируют, что зарегистрировано нами метолом хва-зиупругого рассеяния спета. Измеренный нами эффективный средний диаметр частиц составил 36 им, что превышает линейные размеры и поликатиона, и хопъюгата.

Интересно, что добавление ПЭВП х раствору смеси ПХ и ПМАМа (оис.4, кривая 7) практически не влияет на 1хд. Это объясняется тем, что белки не могут конкурировать с линейными полиномами в интерполиэлсктролитных реакциях и не включаются в частицы ПЭК.

Добавление в систему, содержащую копъюгат ПМАМа-ПХ и ПЭВП, нн эхом ол скул ярного полиэлехтролита (N»01) приводит к полному восстановлению хемилгоминесцентного сигнала, как показано на рис.5 (хривая 1). Это объясняется влиянием ионов добавленной соли на реакцию образования ПЭК и разрушенном части мехиспных солевых связей, стабилизирующих ПЭК (ПЭВП + ПМАЫа-ПХ). В результате агрегаты частиц ПЭК набухают, их диаметр возрастает и в 0,01 М ИаС1 составляет 65 им. Очевидно, что при этом концентрация звеньев ПЭВП-туииитсля в зоне реахции заметно уменьшается. Существенно, что это происходит в условиях, когда частицы ПЭК сохраняют устойчивость. Полная диссоциация ПЭК на составляющие полииопы ПЭВП и ПМАИа-ПХ (рис.5, кривая 2) происходит при гораздо более высокой концентрации соли - 0,55 М. Кривая 2 на рис.5 получена измерением интенсивности флуоресценции в водно-солевых растворах

ПЭК, образованных ПЭВП и содержащим люминесцентные (пиреновые) *

метки ПМАКа .

4. РЕАКЦИЯ УСИЛЕННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В ПРИСУТСТВИИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ КАК ДЕТЕКТИРУЮЩАЯ СИСТЕМА

В МЕТОДАХ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

В работе проанализирована возможность создания гомогенных вариантов ИФА на основе обнаруженного эффекта специфического ин-гибирования свсчепня молекулами ПЭВП. Кроме тоге, разработан вариант псевдогомогенпого ИФА в растворах синтетических полиэлектролитов, в котором в качестве детектирующей использована реакция усиленной хсмилюмипссцепции. Перейдем к рассмотрению этих вопросов.

!хл*10-3, мВ

О

— « 2

1 1 _л 1 Б -

/о 2 -о

НГ 1 I- 1 1

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

[ ПЭвН», ккМ

[|дС], хМ

О

0.00 0.05 0.10

[инсулин] нМ

Рис.6. Зависимость максимальной интенсивности хемнлюмннесценции от кок центра ции: (А) ПЭВП (РпэВГТ в реакции, катали-

зируемой коныогатом инсулин-ПХ (1) и нативным ферментом (2); (Б) специфических антител к инсулину (1) и неспе-. цифических иммуноглобулинов (2) в системе, содержащей коныогат инсулин-ПХ и ПЭВП;(В) свободного инсулина в системе, содержащей коныогат инсулин-ПХ, ПЭВП и специфической антнинсулиновой сыворотки.

4.1 Р^гуляиия. реакиии усиленной рсми^юминесиениии пояиэяеггролитами как возможный путь для создании грмогенных методов иммуноанализа Одним из примеров использования свойства ПЭВП тушить хеми-люминесценцию для целей ИФА является изученная нами модельная реакция совместного окисления люмннола н п-иодфенола перекисью водорода, катализируемого коиъюгатом инсулин-псроксидаза, в растворах ПЭВП и в присутствии специфических антител к инсулину.

ПЭВП оказывает существенное ингнбнрующее влияние на 1ХЛ при катализе реакции коиъюгатом инсулин-ПХ. Как видно из рис.бА, в зтой системе тушение гораздо сильнее, чем в растворе нативного фермента ( соответственно кривые 1 и 2). Такое эффективное ииги-бнрование ферментативной реакции объясняется, по-видимому, возросшим отрицательным зарядом конъюгата (р^инсудил.цх"^»^)» обеспечивающим тесный контакт с поликатионом.

Конкурентами являлись специфические антитела к инсулину. Мы использовали поликлоиальные антитела, полученные иммунизацией морских свинок и имеющие высокую константу связывания с антигеном (Касс-10П М"1). Воелснис раствора антител в раствор комплекса ПЭВП с коиъюгатом иисулин-Пх приводило к увеличению хемилюминесцснтного сигнала, который возрастал пропорционально концентрации добавленных антител (рис.бБ, кривая 1). Таким

образом удавалось сиять до 60-80% эффекта ингибировання реакции поликатионом. В контрольном эксперименте при добавлении неспецифического иммуноглобулина в реакционную смесь подобного возрастания сигнала не наблюдали (рис.бБ,. кривая2). Эти результаты могут быть положены в основу количественного определения специфических антител к инсулину.

Возможно использование этой же системы и для определения концентрации инсулипа. Если в раствор, содержащий конъюгат инсу-лин-ПХ, поликатион и антитела к инсулину в концентрациях, обеспечивающих значение 1хл, составляющее 60-80% от значения интенсивности свечения для свободного хонъюгата, добавлять раствор свободного инсулина, то регистрируемый хемилюминссцентныи сигнал падает (рис.бБ).

Гомогенность иммуиохнмичесхих стадий реакции позволяет сократить время конкурентного люминесцентного иммуноапализа инсулипа до 7-10 мип при чувствительности определения гормона в растворе 2х10-11 М.

4.2 Использование реакиии усиленной хемилюминесиенпии в качестве сисгемыщ_ детекиии в методе псевдогомогенного ИФА с использованием синтетических' полиэлектралитов.

Продемонстрируем преимущества использования в качестве детектирующей системы реакции усиленной хемилюмнпесцеиции на модельной системе псевдогомогенпого ИФА тестостерона.

Специфические поликлональные антитела к тестостерону ховалеитно иммобилизовали на ПМАКа. . К раствору полученного конъюгата добавляли- меченный пероксидазой тестостерон и алнквоту раствора, содержащего тестируемый гормон в неизвестной концентрации. После 30 мин инкубации * добавляли раствор ПЭВП. Образующийся осадок полиэлехтролитного комплекса отделяли центрифугированием и определяли активность 1 пероксидазы в персраст-воренном осадке.

На рис.7 приведены калибровочные кривые для определения тестостерона в растворе, получеппые при использовании двух систем детекции. Первая - традиционно применяемая в псевдогомогенном анализе спектрофотометрнческая система, которая представляет собой катализируемую пероксидазой реакцию окисления о-фени-лендиамина перекисью водорода (кривая 1), а вторая - реакция усиленной хемилюмипесценцни (кривая 2).

Рис.7. Зависимости оптической плотности на длине полны 450 нм (1) н максимальной интенсивности хемилюминесцсн-цин (2) от концентрации тестостерона в растворе. Система содержала конъюгат ПМЛЫа со специфическими антителами к тестостерону (1,2) или с не-спсцифкческимк иммуноглобулинами (3).

[ПЭВП]зв/[11МА^]зв=1 •

Как в ид по из рис.7, калибровочная кривая в случае хемилю-минесцентной системы детекции идет круче, чем при использовании спектрофотометрической системы, т.е. значение производной функции, описывающей калибровочную кривую, выше в области низких и средних концентраций определяемого - вещества. Это приводит к уменьшению ошибки при определении, концентрации анализируемого гормона в области низких концентрации и увеличению чувствительности метода.

Не менее важным преимуществом предлагаемой нами детектирующей системы на основе реакции усиленной хемилюминесценции является существенное сокращение времени проведения стадии детекции ферментной метки. Оно сокращается от 20-30 мин, требуемых для спектрофотометрической реакции до 5-7 мин при использовании

N

хемилюминесцентной реакции.. Такой выигрыш достигается, если регистрировать максимальное значение 1хл. Если вести измерения в кинетическом режиме, то это время сводится к одной - двум мину-гам.

Таким образом, использование реакции усиленной хемнлюми-нссцепции в качестве детектирующей системы в методе псевдогомогенного твердофазпого иммуноферментного анализа представляется более перспективным по сравнению' с традиционной спектрофо-

томстричсскок детекцией ИХ.

А , отн.ед. 450км

1хл, мВ

1500

0.5

- 1000

500

0.0

0 1 2 ' 3 4 5

[тестостерон]» нг/мл

ВЫЗОЛЫ

1. Показано, что синтетические полиэлсктролиты могут существенно влиять па реакцию усиленной хсмилюмииссцспции. Способность полнэлектролита оказывать активирующее или ннгибирукпцее действие на интенсивность хемилюминссцепции определяется химической природой полиионов и знаком их заряда, и обусловлено, в большинстве

случаев действием электрического поля заряженных цепей на « ч '

активность фермента. Важным для практического применения

следствием этого влияния является возможность существенного

усиления детектируемого сигнала и увеличения общей светосуммы

. при введении алифатических поликатионов, что перспективно для

повышения чувствительности хемнлюминесцентного анализа.

2. Обнаружено и изучено специфическое ингибирующее действие ПЭВП на реакцию усиленной хемилюминесценции. Установлено, что этот эффект обусловлен взаимодействием пиридиниевых звеньев-тушителей поликатиопа с промежуточными продуктами окисления люминола. »

3. Доказано принципиальное для процесса тушения значение близости звеньев ПЭВП к активной зоне реакции, реализующееся в максимальной степени в полнэлектролнтном комплексе, включающем в себя ПЭЙП и коныогат ПМАЫа-ПХ.

4. На основании обнаруженного эффекта специфического ингибиро-вания свечения в растворах ПЭВП предложен высокочувствительный гомогенный экспресс-метод анализа инсулина и специфических антител к инсулину.

5. Разработан вариант псевдогомогенного анализа тестостерона с использованием хемилюминесцентпой системы детекции 'пероксидазной метки и продемонстрированы его преимущества по сравнению с традиционной спектрофотометрической системой определения.

Основные работы диссертационной работы Горовип Е.Л. отражены в следующих публикациях;

1. С.Б.Власснко, Е.ЛХоровиц, Е.МХаврилова, А.М.Егоров.

Непрерывный проточный метод для изучения кинетики расходования субстратов в реакции пероксидазного окисления люминола// Вести .Моск.ун-та, сер.Химия, 1988, Т.30, N 4, С.413-419.

2. Е.Л.Горооии, Б.Б.Ким, С.Б.Власснко, Е.МХаврилова,

A.M.liropou. Оптимизация условий определения перохеидазы в реакции каталитического окислспия Аюмипола и люциферина перекисью водорода.// Биотехнология, 1988, Т-5, N.1, С.97-102.

3. Е.Л.Горовиц, Е.МХаврилопа,. В _А. Изумрудов, А.М.Егоров,

А.БЗезин.Реакция усиленной хемилюминссценцни в растворах полиэлектролитных комплексов.//ДАН СССР, 1989, Т307, N4, С.1004-1006.

4. Е.Л.Горовиц, С.Б.Влассию,В А..Изумрудов, Е.М.Гаврилова.

Реакция усиленной хемилюмипесценцин с присутствии синтсти-, ческого поликатиона и ее использование для определения

инсулина и специфических ап*гител.//ЖВХО им. А.И.Менделеева, 1989, TJCXXIV, N.1", С.126-127.

5. Viasenko S.B., Arefiev АЛ., Klimov A.D., Gorovits E.L.,

Osipov A.P, Gavrilova E.M., Yegorov A.M. An investigation of Catalytic Mechanism of Enhanced Chemiluminescence: Im munochemical Application of this reaction. //J.Biolum. Chemilum,1989, V.4, N1, P.164-176.

6. Е.Л.Горовиц, Е.МХаврилова, В_А.Изумрудов, А.М.Егоров. Влия-

ние полиэлектролнтов на хемилюминесцентнуго реакцию совместного окисления люмкнола и п-иодфенола перекисью водорода, катализируемого пероксидазой хрена.//В сб. материалов VI Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии, ч.И, Вильнюс, 1988, С.9-10.

7. Е.Л.Горовиц, Е.М.Гаврилова, .А.М.Егоров, А.БЗезии, В-А.Каба-

нов. Регуляция реакции усиленной хемилюминесценции полиэлектролитными комплексами.//В сб. материалов П Всесоюзной конференции "Интерполиэлектролитные комплексы", Рига, 1989, С. 270-273.

8. Е.ЛХоровиц, Л:С.1Хивилева, БХ^зантиев, Е.М.Гаврилова,

B-Л.ИзумруАОВ, А .М .Егоров. Реакция усиленной хсмилюминес-аенции как перспективная система детекции для изучения взаимодействия антигенов с антителами в присутствии синтетических полиэлектролитов.// В сб. материалов XIV Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Ташкент, 1989, NJL, С.424.

9. A.M.Egorov, B.B.Kim, V.V.Pisarev, E.L.Gorovits, I.G.Gazarian,

I.A.Rei.h(;tbt»:ova. Tbe ргсЫеш оГ the mechanism of pcroxidise-iudiiccd luminal oxidation.// В сб. материалов 'IV Istcruatioiia! Symposium on Quantitative lutnicescencc

spcctromctry in biomedical sciences", Gent, 1991, P.67. 10. Б.Б.Ким, В.В.Писарсв, Е.Л.Горопиц. Хсмилюмипссцсптные методы детекции пероксидазы.// В сб. материлов VII Всесоюзного симпозиума по Инженерная он зимологии, Москва, 1991, С.18.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПХ пероксидаза из корней хрена

ПМА№ полиметакрилат натрия

ПЭВП поли-К-этил-4-винилпириднний бромид. ^

ПДМ полидкметнлдиаллиламмоний хлорид

ПЭК полиэлектролитный комплекс

Е пативная форма пероксидазы

Е^ соединение I пероксидазы ч

Е2 соединение П пероксидазы

ЫГ люминол

1ЛС' радикал люминола

Б" субстрат-усилитель

Б* радикальный продукт окисления субстрата-усилителя

Э эозин

3

•\Э триплет эозина

3~' промежуточный продукт восстановления эозина

О2"' супероксид радикал

ФБ фенобарбитал