Рекомбинантная пероксидаза табака: получение и каталитические свойства мутантных форм фермента тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

003453062

полозников

Андрей Александрович

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЕРОКСИДАЗА ТАБАКА: ПОЛУЧЕНИЕ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МУТАНТНЫХ ФОРМ ФЕРМЕНТА

02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2008

003453062

Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики и на Химическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

профессор, доктор химических наук Тишков Владимир Иванович доктор химических наук Газарян Ирина Георгиевна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович профессор, доктор химических наук Ярополов Александр Иванович

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится ¿^-декабря 2008 года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им.М. В.Ломоносова.

Автореферат разослан ) октября 2008 г.

<Г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук и.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пероксидаза является одним из наиболее интенсивно изучаемых ферментов во всем мире. Впервые она была описана еще в 1901 году академиком А.Н.Бахом. В настоящее время в год публикуется несколько тысяч статей, посвященных этому ферменту. Столь пристальное внимание к пероксидазе обусловлено ее очень широким применением в биоаналитических цепях. Наибольшее применение на практике нашла пероксидаза из корней хрена (КФ 1.1.11.7, HRP) Этот фермент широко используется в качестве метки в иммуноферментных наборах, а также для определения различных соединений и детекции пероксида водорода, являющегося продуктом большого количества ферментативных реакций. Определение пероксидазы с помощью хемилюминесцентной реакции окисления люминола является одной из наиболее чувствительных биоаналитических детектирующих систем. Однако HRP обладает рядом существенных недостатков: 1) для достижения высокой чувствительности в хемилюминесцентной системе необходимо использовать специальные соединения -«усилители» (например, л-иодфенол); 2) фермент обладает низкой стабильностью по отношению к инактивации пероксидом водорода; 3) спектр субстратной специфичности не покрывает весь набор анализируемых соединений; 4) низкая эффективность прямого переноса электронов между активным центром и поверхностью электрода не позволят создавать безмедиаторные электрохимические биосенсоры. Поэтому поиск, получение и характеристика новых пероксидаз для аналитической биотехнологии является актуальной задачей.

В настоящее время скрининг источников новых пероксидаз ведется во всем мире. В нашей лаборатории была выделена анионная пероксидаза табака (ТОР) из трансгенных растений, которая обладала рядом уникальных свойств. Например, ТОР катализировала окисление люминола без усилителя на порядок лучше, чем HRP с усилителем, отличаясь при этом большей стабильностью к инактивации перекисью водорода, чем пероксидаза хрена. Также в нашей лаборатории была разработана методика получения рекомбинатного негликозилированного фермента, экспрессированного в клетках E.coli, который был использован для последующей кристаллизации. Анализ кристаллической структуры позволил приступить к белковой инженерии пероксидазы табака методом направленного мутагенеза для повышения ее активности с рядом субстратов, улучшения температурной и операционной стабильности в реакции хемилюминесценции.

Цепи и задачи исследования. Целью данной работы было исследование взаимосвязи структура-функция в рекомбинантной пероксидазе табака и получение мутантных форм фермента с новыми свойствами. Для этого в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

• Провести анализ структуры фермента дикого типа и выбрать наиболее перспективные аминокислотные замены;

• Получить мутантные формы пероксидазы табака;

• Провести сравнительное изучение субстратной специфичности полученных мутеинов;

• Определить кинетические константы для мутантных ферментов в реакции окисления ABTS;

• Изучить термостабильность мутантных ТОР;

• Изучить свойства наиболее интересных мутантных форм фермента в реакции хемилгоминесцентного окисления люминола;

• Исследовать кинетику взаимодействия отобранных мутантных ТОР с пероксидом водорода методом «остановленной струи».

Научная новизна работы. В данной работе получены и охарактеризованы пять новых точечных мутантов ТОР с заменами lle37Met, Gln116Trp, PheUOTyr, Thr151Trp, Leu157Trp и один двойной мутант Phe140Tyi/Thr151Trp. Показано, что, используя подход, основанный на введении в белковую глобулу дополнительных остатков триптофана, можно повысить активность фермента с рядом субстратов, в том числе с фенолом - «плохим субстратом» для фермента дикого типа. Показана важная роль остатка Phe140 в обеспечении термостабильности белковой глобулы. Данная аминокислотная замена также приводит к образованию биокатализатора с повышенной стабильностью сигнала в реакции хемилюминесцентного окисления люминола. Методами стационарной и предстационарной кинетики изучено влияние мутаций на стадии взаимодействия фермента с пероксидом водорода и субстратом АБТС и на стабильность соединений I и II.

Практическая значимость работы. Мутантная форма TOP Thr151Trp может быть использована при создании высокочувствительных электрохимических безреагентных биосенсоров, для определения фенолов в различных смесях. Полученная рекомбинантная TOP Phe140Tyr позволяет повысить чувствительность анализа в 5 раз при использовании в качестве системы детекции реакции хемилюминесцентного окисления люминола. Высокая стабильность хемилюминесцентного сигнала у TOP Phe140Tyr также обеспечивает более высокую воспроизводимость результатов анализа и снижает требования к временным характеристикам выполнения отдельных операций.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях «Biocatalysis-2005» (Санкт-Петербург, 2005), «Biocatalysis-2007» (Москва-Санкт-Петербург, 2007), на Международной конференция «Environmental Biocatalysis» (Испания, Кордоба, 2006), IV Международном Московском биотехнологическом конгрессе "Biotechnology 2007: state of the art and prospects of development" (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы; 3 статьи и 5 тезисов докладов Международных конференций, подана заявка на патент РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы (три главы); описания материалов и методов исследования; результатов и их обсуждения (три главы); выводов и списка цитируемой литературы, включающего /¿^ссылок. Работа изложена на /3/ страницах и включает в себя

J0

рисунков и /У таблиц

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Анализ кристаллической структуры пероксидазы табака и выбор возможных положений аминокислотных замен.

На рис. 1 представлено схематическое изображение кристаллической структуры рекомбинатной пероксидазы табака. Видно, что этот фермент состоит в основном из а-спиралей и содержит всего 2 небольших Р-тяжа. Выбор положения для аминокислотных замен осуществляли исходя из следующих соображений:

1). Из литературных данных известно, что остаток триптофана может способствовать переносу электрона через белковую глобулу. Поэтому одной из идей нашей работы было введение на поверхности глобулы ТОР дополнительных остатков триптофана (рис. 2). Положения для аминокислотных замен были выбраны на стороне, противоположной ко входу в активный центр. Это было сделано по двум причинам. Во-первых, при сорбции фермента на поверхности электрода этой частью белковой глобулы эффективность прямого электронного переноса между активным центром фермента дикого типа и поверхностью электрода должна быть низкой, а введение остатка триптофана будет ее увеличивать. Во-вторых, из литературы известно, что в ходе каталитического цикла не все субстраты пероксидазы табака входят непосредственно в активный центр фермента - некоторые объемные субстраты связываются на поверхности белка. Можно полагать, что введение дополнительных остатков триптофана в эти участки белковой глобулы (или рядом с ними), может привести к увеличению активности фермента с такими субстратами. Для введения дополнительных остатков триптофана нами были выбраны остатки в положениях 116, 151 и 157.

2). Остаток Phe140 находится на входе в активный центр фермента (рис. 3). Нами было выдвинуто предположение, что замена Phe140Tyr может привести к повышению операционной стабильности фермента. Остаток тирозина в положении 140 может забирать на себя электроны с радикалов - продуктов окисления субстратов и таким образом будет защищать активный центр фермента от нежелательных модификаций. Также нами был получен мутант, содержавший двойную замену Phe140Tyr/Thr151Trp.

3). Из литературы также известно, что пероксидаза сои обладает высокой операционной стабильностью. Карен Велиндер (KG. Welinder et a/., Protein Science, 2001) высказала предположение, что это свойство связано с наличием в активном

центре этого фермента остатка метионина 37. В пероксидазе табака в этом положении находится остаток изолейцина (рис. 4). Для проверки влияния аминокислотного остатка в положении 37 на стабильность пероксидазы табака была осуществлена замена остатка Не на остаток Met.

Таким образом, в настоящей работе было получено пять точечных мутантов ТОР с заменами lle37Met, Gln116Trp, Phe140Tyr, Thr151Trp, Leu157Trp и один двойной мутант Phe140Tyr7Thr151Trp.

Рис. 1. Кристаллическая структура пероксидазы табака.

Рис. 2. Положения остатков, замененных на остаток Тгр.

Phe140

Thr151

Рис.4. Положение остатка Пе37,

замененного на остаток Met.

l(e37Met

Рис. 3. Положение остатка Phe140, замененного на остаток Туг.

Помимо этого, анализ кристаллической структуры, выявил еще один участок для замены - А1а162Туг, которая также могла приводить к повышению стабильности фермента. Нами была получена генная конструкция, содержащая в гене ТОР замену А1а162Туг, однако получить фермент в активной форме не удалось (см. ниже).

И. Получение мутантных форм пероксидазы табака.

Введение мутаций осуществляли методом направленного мутагенеза. Секвенирование полученных плазмид из 3 отдельных клонов для каждого мутанта фермента показало отсутствие посторонних нуклеотидных замен. Эффективность введения мутаций составляла 100%.

В качестве системы экспрессии мутантных форм пероксидазы табака была выбрана система экспрессии в клетках Е.соИ. На рис. 5 представлены электрофореграммы образцов клеток штамма - продуцента, отобранных на различных этапах культивирования. Видно, что через 6 часов после добавления индуктора, масса целевого белка во всех случаях составляла около 50-60% от массы всех белков клетки.

ThrlSITrp

0 2 4 6 Glnll6Trp

ж л

9-Ш9

0 2 4 6 Leu!57Trp

^Й^ лк

0 2 4 6 Ile37Met

Phel40Tvr

PheUOTvr/ThrlSlTrp

Время с начала индукции, ч Рис. 5. Кинетика экспрессии мутантных ТОР в штамме E.coli BL21(DE3)CdPlus.

Пероксидаза табака экспрессируется в клетках E.coli в виде так называемых телец включения, т.е. в нерастворимом виде без кальция и гемина. Поэтому после отделения биомассы от культуральной жидкости и разрушения клеток ультразвуком

осадок клеточных стенок отмывали от растворимых белков, а тельца включения солюбилизировали в 6М мочевине. Далее в специально подобранных условиях проводилась процедура реактивации (рефолдинг) ферментов. В результате рефолдинга происходило правильное сворачивание глобулы белка, встраивание в нее ионов кальция и гемина, а также образование четырех дисульфидных связей.

Условия рефолдинга ТОР зависят от ряда параметров, которые были оптимизированы ранее для рекомбинантного фермента дикого типа (\М-ТОР). Максимальная степень реактивации наблюдалась при концентрации ионов Са2+ 1 мМ, однако полученный фермент обладал низкой стабильностью при хранении. Как показали кристаллографические исследования это было вызвано с нехваткой кальция в проксимальном центре связывания. Поэтому в нашей работе мы продолжили изучение влияния различных параметров на эффективность рефолдинга. Данные на рис. 6 свидетельствуют о том, что даже момент добавления гемина в среду для рефолдинга - на следующий день, а не в самом начале, позволяет повысить выход активного фермента более, чем на 20%. В случае ионов Са2* наилучшей оказалась концентрация ЗмМ (табл. 1). Оптимальные параметры для рефолдинга мутантных ТОР суммированы в таблице 1.

30 1

Дни

Рис. 6 Влияние времени добавления гемина и концентрации Са2* на процесс рефолдинга \лД-ТОР. 1,3,5 - 0,5, 1, 3 мМ Са2*, гемин добавлен сразу; 2,4,6 - 0,5, 1, 3 мМ Са2*, гемин добавлен на следующий день

Таблица 1. Оптимальные условия рефолдинга рекомбинантных пероксидаз табака.

пН Мочевина, Глутатион отт, Гемин, Время добавления Кальций,

рп М окисл., мМ мМ мкМ гемина мМ

9,6 1,80 0,50 0,1 5,0 На след. день 3,0

На рис. 7 представлена кинетика рефолдинга полученных мутантных ТОР в оптимальных условиях, найденных для фермента дикого типа (концентрация белка равна 0,1 мг/мл).

Рис. 7. Кинетика рефолдинга мутантных ТОР и фермента дикого типа 1 - М-ТОР, 2 - Не37Ме1 3 - &п116Тгр, 4 -РИеМОТуг, 5 - "П1г151Тгр, 6 - 1_еи157Тгр, 7 -А1а162Туг, 8 - РЬе140ТугШ1г151\Л/

Активность (Е 'мл), Ч

■ »Я» ^

Активность (Ь'мл), Ч

На 160 100 200 220 240 260 330 300

80 100 120 140 1 60 190 200 220 V (МЛ)

Рис. 8 Профили эпгации мутанта ТОР 1_еи157Тгр при очистке гель-фильтрацией А — первичная очистка на колонке 2,6x90 см с ЭерЬасгу! Э 200, уравновешенным 0,05 М буфером трис-НС1, рН 8,5, Б — повторная очистка на колонке 2,6x90 см с Тоуореаг! Н\Л/ 55, уравновешенным 0,05 М буфером трис-НС1, рН 8,5

Наибольший выход по активности наблюдался в случае мутантной формы ТИг151Тгр и фермента дикого типа. В остальных случаях он был в 2 раза ниже. А в случае мутантной формы А1а162Туг, образование активного фермента не наблюдалось. Это свидетельствует о том, что даже единичная мутация может существенно повлиять на процесс реактивации фермента.

Методика очистки полученных мутантов включала в себя 2 стадии гель-фильтрации через ЭерЬасгу! Э-200 и Тоуореаг! Н\Л/ 55 (рис. 8). Согласно данным

аналитического электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии БОЭ-Ыа чистота полученных препаратов ферментов составляла не менее 95%.

III. Субстратная специфичность.

Данные по исследованию субстратной специфичности полученных препаратов мутантных ТОР в сравнении с рекомбинантной пероксидазой табака дикого типа и негликозилированной рекомбинантной HRP (wt-HRP) представлены в таблице 2.

Таблица 2. Субстратная специфичность мутантных ТОР.

Удельная активность, Е/мг wt-ТОР Q116W T151W L157W F140Y F140Y/ T151W I37M wt-HRP

ABTS pH 4,5 4000 3710 4455 2130 1920 1780 780 2000

Ферроцианид 210 270 195 180 170 135 70 9

Иодид 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 110

Гваякол 1550 1310 1467 940 550 470 55 1750

Фенол 26 113 113 28 26 20 30 7,5

о-Фени-лендиамин 1300 1100 1420 760 660 320 545 460

о-Диани-зидин 550 545 620 410 200 180 50 520

Полученные данные свидетельствуют, что введение мутаций приводит к существенному изменению спектра субстратной специфичности фермента. Это хорошо видно из диаграмм удельных активностей, где за 100% принята величина активности пероксидазы табака дикого типа по различным субстратам (рис. 9а,Ь). Например, в случае мутантной формы ТОР Пе37Ме( практически полностью исчезла активность по гваяколу, притом, что активность по фенолу осталась на уровне фермента дикого типа. Такой фермент может быть использован для определения фенолов в смесях, содержащих гваякол. В большинстве случаев в результате мутагенеза произошло снижение активности. Однако введение мутаций ТИг151Тгр и 01п116Тгр привело к 4-х кратному увеличению активности по фенолу. Также отметим увеличение активности мутантной формы ТОР ТЬг151Тгр по отношению к АБТС, о-фенилендиамину и о-дианизидину.

в

Фенол Гваякол Ферроцианид

АБТС

Рис. 9. Сравнение активности полученных мутантных форм ТОР и фермента дикого типа с различными субстратами. Активность м-ТОР с каждым субстратом принята за

100%.

IV. Кинетические параметры реакции окисления АБТС.

Реакция, катализируемая пероксидазами, протекает по механизму типа «пинг-понг» и включает в себя два типа основных стадий: окисление фермента пероксидом водорода и взаимодействие окисленных форм фермента Соединений I и II (El и Ell соответственно) непосредственно с субстратом (схема 1).

Для выяснения на какую из этих стадий повлияли введенные мутации, мы определили кинетические параметры реакции окисления АБТС в присутствии полученных мутантных форм пероксидазы табака. Для этого мы изучали зависимость скорости реакции от концентрации АБТС при нескольких фиксированных концентрациях пероксида водорода (рис. 10).

Для пероксидазной реакции зависимость скорости реакции от концентрации субстратов описывается следующим уравнением:

1/1/ = 1/[E]o{1//Coat + 1/(W>[H202]) + M(ks[S])},

где [Е]о общая концентрация фермента, kcat - эффективная мономолекулярная каталитическая константа, /сн2о2 - константа скорости второго порядка по перекиси водорода, и ks - эффективная константа скорости второго порядка по субстрату-донору, в данном случае АБТС. Константа ks является комбинацией констант fe и к3 (Схема 1).

+ н2о2

kk3 к2

* El

+ABTS \ S +ABTS

Ell'

Схема 1

10

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.00 0.07 0.01

1/[АБТС], мкМ'1

Рис. 10. Первичные графики Лайнуиаера-Берка зависимости скорости реакции от концентрации АБТС в присутствии нескольких концентраций пероксида водорода для ТЬг151Тгр

Рис. 11. Вторичный график зависимости величин отсекаемых отрезков на рис. 10 от обратной концентрации пероксида водорода для фермента дикого типа и мутантной ТОР ТИг151Тгр.

Из первичных графиков (рис. 10) по тангенсу угла наклона определяли константу скорости взаимодействия с АБТС кя, а из тангенса угла наклона зависимости величин отсекаемых отрезков от обратной концентрации пероксида водорода (рис. 11) определяли константу скорости взаимодействия с Н2О2 Ан2о2.

Значения констант представлены в таблице 3. Из этой таблицы видно, что введенные мутации повлияли на обе стадии пероксидазной реакции. Для всех мутантных форм наблюдалось уменьшение константы скорости взаимодействия с пероксидом водорода. Для большинства ферментов это уменьшение было незначительным. Исключение составляют мутантные ТОР, содержащие замены 1_еи157Тгр и РИе140Туг/ТЬг151Тгр.

В случае стадии взаимодействия с АБТС, наблюдалось как увеличение константы ^ (замены ФпИбТгр и ТЬг151Тгр), так и ее уменьшение. Таким образом,

50

ТЬг151Тгр

чЛ-ТОР

0 -,-,-.-----1-.

0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0 030 0.035 0.040

11Н2О2], МКМ*1

мутантные ТОР, имеющие более низкие по сравнению с \л^-ТОР значения констант скоростей взаимодействия и с пероксидом водорода, и с АБТС, обладают более низкой удельной активностью. В случае мутантной формы ТИг151Тгр, небольшое уменьшение константы скорости взаимодействия с пероксидом водорода компенсируется увеличением константы скорости взаимодействия с АБТС. В результате удельная активность с АБТС у этого мутанта выше, чем у фермента дикого типа.

Таблица 2. Кинетические параметры окисления АБТС различными ТОР.

Форма фермента Константа скорости

кн2о2х10*, М 'с-' Ьабтс хЮ"6, М-'с'

М-ТОР 3,6 + 0,4 8,2 ±0,9

ТОР ОпПбТгр 2,9 ±0,3 8,7 ± 0,7

ТОР ТЬг151Тгр 2,6 ±0,3 12,1 ±0,9

ТОР 1_еи157Тгр 1,5 ±0,2 6,4 ± 0,7

ТОР Р(1е140Туг 2,9 ±0,3 2,3 ±0,3

ТОР РЬе140Тугти151Тгр 2,0 ±0,2 2,5 ±0,3

ТОР Не37Ш 3,1 ±0,3 0,55 ± 0,06

V. Термостабильность мутантных ТОР.

На рис. 12 в полулогарифмических координатах представлены зависимости остаточной активности от времени инкубации ферментов при 56 "С. Как видно из этого рисунка термоинактивация фермента протекает в соответствии с кинетикой реакции первого порядка. Рассчитанные значения констант скоростей термоинактивации приведены в таблице 3.

1, мин

О 5 10 15 20 25 30

Рис. 12. Зависимость остаточной активности от времени инкубации при 56 °С. 1 - М-ТОР, 2 — Ие37Ме^ 3-ап116Тгр, 4 - РЬе140Туг, 5-1_еи157Тгр, 6-Т1и151Тгр, 7 - РЬе140ТугШи151Тгр. 50 мМ Тле-НС!, рН 8,0, при 54°.

Как видно из таблицы 3. термостабильность ощутимо (в 1,5 раза) ухудшилась только у мутанта ФлИбТгр. В двух случаях - РИе140Туг и РЬе140Туг/ТЬг151Тгр, введение замен приводит к улучшению термостабильности. Константы скорости термоинактивации этих мутантных форм ТОР уменьшились в 1,9 и 1,4 раза соответственно. У мутантной формы ТЬг151Тгр термостабильность ухудшилась в 1,2 раза.

Таблица 3. Кинетические параметры термоинактивации мутантных форм ТОР и фермента дикого типа при 56 °С.

Форма фермента Константа скорости термоинактивации, к х102, мин"1

\лЛ-ТОР 7,3 ± 0,4

ТОР ИпПбТгр 11 ±0,3

ТОР Т|1г151Тгр 9,1 ±0,3

ТОР 1_еи157Тгр 9,0 ± 0,2

ТОР РГ1е140Туг 3,9 ± 0,2

ТОР Р1ае 14ОТуг/ТЬг 151 Тгр 5,6 ±0,3

ТОР Ие37Ме( 7,7 ±0,3

Если сложить общий эффект мутаций РИеМОТуг и ТНг151Тгр, то полученная величина, будет близка по значению величине эффекта двойной замены Р(1е140Туг/ТЬг151Тгр, что позволяет говорить об аддитивности данных замен.

У остальных мутантных форм термостабильность осталась приблизительно на уровне пероксидазы табака дикого типа.

Таким образом, по совокупности данных по активности и термостабильности полученных ферментов для дальнейших исследований нами были выбраны следующие формы пероксидазы табака: ТЬг151Тгр, Р1пе140Туг и РЬе140Туг/ТИг151Тгр.

VI. Изучение свойств пероксидазы табака дикого типа и ее мутантных форм в реакции хемилюминесцентного окисления люминола.

Реакция хемилюминесцентного окисления люминола, катализируемая пероксидазами, является одной из наиболее чувтствительных систем детекции и широко применяется в анализе. Как уже отмечалось выше, в случае ТОР не требуется добавления специальных соединений - усилителей этой реакции. Нами было изучено влияние введенных мутаций ТМг151 Тгр, РИе140Туг и Р|1е140Ту|7Т11г151Тгр на свойства мутантных ТОР в реакции хемилюминесцентного окисления люминола.

На первом этапе мы изучили зависимость интенсивности хемилюминесценции от условий проведения реакции. Результаты представлены на рис. 13.

Как видно из рис. 13А, оптимальное значение рН буфера для мутантных ТОР по сравнению с ферментом дикого типа возросло на 0,2 единицы рН - с 8,3 до 8,5 При этом также наблюдается небольшое уширение формы кривой зависимости активности от рН.

Концентрация буфера Трис-НС1 оказывает сильное влияние на интенсивность сигнала (рис. 13Б). Ранее для фермента дикого типа было показано, что при повышении значения молярности буфера от 0,01 до 0,1 М, происходило увеличения сигнала в реакции хемилюминесценции. Нами такая зависимость была исследована в более широком диапазоне концентраций буфера Трис-НС1 (рис. 13Б). Из рис. 13.Б видно, что оптимальным значением для фермента дикого типа, является концентрация буфера 1 М. Введение мутаций приводит к снижению оптимального значения молярности буферного раствора. В случае мутантной формы Т1-и151Тгр максимальная величина сигнала наблюдается при концентрации буфера уже 0,6 М, а замена Р11е140Туг позволяет снизить концентрацию Трис до 0,1 М.

А Б

[Н,0,], ты

10 15

[Люминол], тМ

Рис. 13. Изучение влияния параметров на уровень сигнала в реакции хемилюминесцент-ного окисления люминола. А - влияние рН, Б - влияние буфера, В и Г -влияние концентраций пероксида водорода и люминола соответственно

Полученные данные имеют важное практическое значение. Как правило, рабочие концентрации буфера при проведении имунноферментного анализа составляют 0,05 - 0,1 М. В этих условиях интенсивность сигнала в реакции хемилюминесцентного окисления люминола у мутантных ТОР РИе140Туг и РЬе140Туг/ТЬг151Тгр практически является максимальной, в то время как у фермента дикого типа эта величина сигнала составляет всего около 60% от максимальной.

На рис. 13В. представлены зависимости интенсивность сигнала в реакции хемилюминесценции от концентрации пероксида водорода. Оптимальное значение концентрации пероксида водорода для всех ферментов оказалось схожим - 2 мМ. Однако, в случае мутантной формы ТЬг151Тгр наблюдается более быстрое по сравнению с ферментом дикого типа падение активности при концентрациях пероксида водорода выше 2 мМ. Скорее всего это может быть связано с низкой операционной стабильностью данного мутанта, о чем свидетельствует более быстрое затухание сигнала со временем (см. ниже). В ходе реакции хемилюминесцентного окисления люминола происходит образование радикалов, которые, атакуя активный центр фермента, приводят к его инактивации. Мутантная форма ТИг151Тгр, обладающая наиболее низкой стабильностью, имеет наиболее узким оптимумом. Введение мутации Р(1е140Туг, которая, как показали проведенные эксперименты по изучению термоинактивации ферментов, может приводить к увеличению стабильности, наоборот - увеличивает диапазон рабочих концентраций пероксида водорода. В случае двойного мутанта оптимум также шире, чем у фермента дикого типа.

Как видно из рис. 13Г, введение мутации РЬе140Туг приводит к тому, что фермент способен катализировать реакцию хемилюминесценции при более высоких концентрациях люминола. Таким образом, оптимальное значение концентрации люминола для данной мутантной формы составляет 5 мМ, что значительно отличается от таковой для других форм фермента (1-2 мМ). Фермент, содержащий двойную замену, обладает более узким оптимумом, но шире, чем ферменты дикого типа и мутантная форма ТОР Т1пг151Тгр.

Наиболее важным параметром хемилюминесцентной реакции является стабильность сигнала. Поскольку фермент инактивируется в ходе реакции под действием радикалов, форма сигнала представляет собой начальный пик с последующим затуханием (рис. 14).

Время, мин

Рис. 14. Форма сигнала в реакции хемилюминесценции.

Как видно из рис. 14, введение мутации ТЬг151Тгр приводит к двукратному увеличению величины начального сигнала, однако скорость его затухания также возрастает в два раза. Наиболее интересные данные были получены для мутантной формы РИеНОТуг, у которого уровень начального сигнала в 2 раза ниже, по сравнению с пероксидазой табака дикого типа, но его повышенная операционная стабильность позволяет сохранять его на протяжении длительного времени. Следует отметить, что кривые хемилюминесценции были получены в условиях оптимальными для данного мутанта. Если учесть, что для фермента дикого типа оптимальной является концентрация буфера 1 М, а для мутанта РЬе140Туг- 0,1 М, то при этой концентрации буфера интенсивности сигнала у \лЛ-ТОР и ТОР РИе140Туг будут почти одинаковыми. Мутант, содержащий двойную замену РНе140Туг/Т11г151Тф, также обладает повышенной стабильностью в хемилюминесцентной реакции, однако его низкая активность по отношению к люминолу не позволяет говорить о его дальнейшем практическом применении.

Результаты определения предела обнаружения в сравнении с ферментом дикого типа представлены в таблице 4.

Таблица 4. Предел обнаружения различных ТОР в хемилюминесцентной реакции окисления люминола.

Форма фермента Предел обнаружения, пМ

\M-TOP 1 ±0,15

ТОРТЬг151Тгр 0,6 ± 0,09

ТОР РИе140Туг 0,2 ± 0,03

ТОР РЬе140Тугт1г151Тгр 2,6 ± 0,4

Из данной таблицы видно, что с помощью введения мутации Phe140Tyr возможно повысить предел обнаружения пероксидазы табака в реакции хемилюминесцентного окисления люминола в 5 раз, что говорит о перспективности использования данной мутантной формы в биоаналитических целях.

VII. Изучение предстационарной кинетики взаимодействия пероксидазы табака дикого типа и ее мутантных форм с пероксидом водорода.

Заключительным этапом нашей работы было изучение кинетики взаимодействия пероксидазы табака с пероксидом водородом методом «остановленной струи».

При взаимодействии ТОР с пероксидом водорода происходит образование Соединения I с максимумом поглощения на 401 нм. Соединение I обладает более низким коэффициентом молярного поглощения, чем исходный фермент (рис. 15). Затем оно переходит в Соединение II с максимумом поглощения на 416 нм. Кинетику перехода свободного фермента в Соединение I можно наблюдать на длине волны 385 нм, которая является изобестической точкой для Соединений I и II, а на длине волны 433 нм (изобестическая точка для свободного фермента и Соединения I) -образование Соединения II из Соединения I.

385 нм 433 нм

Длина волны, нм

Рис. 15. Спектральные переходы между различными формами пероксидазы табака.

На рис. 16 представлена кинетика образования Соединения I из фермента дикого типа при различных концентрация пероксида водорода. Она описывается экспоненциальной функцией А=Аое^. Кинетика образования Соединения II, описываемая уравнением А=Ао(1-е'^и'), представлена на рис. 17.

Время, сек

Рис. 16. Кинетика образования Соединения I при различных концентрациях Н2О2

для М-ТОР.

Время, сек

Рис. 17. Кинетика образования Соединения!! из Соединения I при различных концентрациях Н202 для \/\Л-ТОР.

[н2о2], м

Рис. 18. Зависимость эффективной константы /с1/ от концентрации Н2О2 для \дЛ-ТОР.

Из тангенса угла наклона зависимостей эффективных констант К\ и от концентрации пероксида водорода рассчитывают истинные значения констант скоростей образования Соединений I и II (рис. 18). Значения полученных констант представлены в таблице 5. Видно, что порядок и характер изменений значений константы К| в зависимости от типа замены, полученных методами стационарной (табл. 2) и предстационарной (табл. 5) кинетики идентичен.

Величина константы Кц характеризует скорость перехода Соединения I в Соединение II. Чем она меньше, тем стабильнее будет Соединение 1 и тем выше операционная стабильность фермента. Из таблицы 5 видно, что введение замены РИе140Туг снижает величину ки в 4 раза, а в случае двойного мутанта Р|1е140Туг/Ш151Тгр эта константа уменьшается почти в 10 раз. Полученные данные хорошо согласуются с более высокой операционной стабильностью этих мутантов в реакции хемилюминесцентного окисления люминола.

Таблица 5. Бимолекулярные константы скорости образования Соединений I и II.

Форма фермента Константа скорости

/с,х10"6, М~'с"' к„ хЮ'3, М 'с-1

М-ТОР 2,20 ±0,12 2,23 ±0,12

Т11г151Тгр 1,63 ± 0,09 2,19 ±0,12

РЬе140Туг 2,10 ± 0,11 0,54 ± 0,03

РИе 140Туг/ТЛг151 Тгр 0,98 ± 0,05 0,24 ± 0,01

Таким образом, в ходе выполнения данной работы были получены мутантные формы пероксидазы табака с улучшенными свойствами. Наиболее интересным является мутант ТОР РЬе140Туг, который превосходит фермент дикого типа как по термостабильности, так и по стабильности сигнала в реакции хемилюминесцентного окисления люминола. Мутанты ТОР С1п116Тгр и Т11г151Тгр обладают по сравнению с \М-ТОР в 4 раза более высокой активностью с фенолом.

ВЫВОДЫ

1. Методом направленного мутагенеза получено 6 точечных мутантов - Пе37Ме1, ОпИбТгр, РЬе140Туг, Т(1г151Тгр, 1_еи157Тгр, А1а 162Туг, и один двойной мутант РЬе140Туг/ТНг151Тгр пероксидазы табака. Полученные мутантны экспрессировались в клетках Е.соП в виде нерастворимых телец включения в количестве не менее 40-50% от общего белка клетки. Изучена кинетика и проведена оптимизация условий рефолдинга мутантных ТОР из телец включения. Эффективность рефолдинга зависела от типа аминокислотной замены и составляла от 2 до 12,5%. В случае мутанта А1а162Туг реактивации фермента не происходило. Активные мутантны после рефолдинга были очищены с выходом по активности - 40-50% и степенью чистоты не менее чем 95%.

2. Изучены кинетические свойства полученных мутантов. Показано, что наблюдаемое в результате замен увеличение или уменьшение каталитической активности обусловлено изменением величин констант скоростей элементарных стадий. На примере мутанта ТОР ТИг151Тгр показано, что точечные замены позволяют селективно влиять на каталитическую активность с одним типом субстратов (увеличение скорости в реакциях с феррицианидом и фенолом в 1,5 и 4 раза соответственно) без изменения таковой с субстратами другого типа (АБТС и гваякол).

3. Изучена термостабильность полученных мутантов при 56 °С. Показано, что для всех мутантных ТОР, как и для фермента дикого типа, зависимость остаточной активности от времени описывается в соответствии с кинетикой реакции первого порядка Введение остатков триптофана приводит к увеличению скорости термоинактивации на 20-50%, а введение замены Р1че140Туг приводит к ее уменьшению в 1,5 раза. Анализ термостабильности точечных мутантов с заменами ТЬг151Тгр и РЬе140Туг и двойного мутанта РИе140ТугЛ"Ьг151Тгр свидетельствует об аддитивности эффектов точечных замен.

4. Определены оптимальные условия для мутантных форм пероксидазы табака ТМ51Тгр, РИе140Туг и РЬе 140Туг/ТЬг 151 Тгр в реакции хемилюминесцентного окисления люминола. Показано, что в начальный момент реакции в случае мутантной ТОР ТИг151Тгр интенсивность сигнала в 2 раза больше, чем у фермента дикого типа. Введение замены РЬе140Туг обеспечивает значительное улучшение стабильности сигнала в течение длительного времени и позволяет повысить чувствительность детекции фермента в 5 раз.

5. Методами предстационарной кинетики изучено образование Соединения I и Соединения II мутантных форм ТОР ТЬг151Тгр, РЬе140Туг и РЬе140Туг/ТЬг151Тгр при взаимодействии с пероксидом водорода. Показано, что Т1и151Тгр влияет на скорость образования Соединения I, а замена РЬе140Туг - на скорость образования Соединения II. Сильное снижение каталитической эффективности фермента при двойной замене РЬе140ТугГГЬг151Ттр, наблюдаемое при исследовании стационарной кинетики окисления АБТС, связано со снижением констант скоростей образования обоих промежуточных форм ТОР.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полозников A.A., Савицкий П.А., Хушпульян Д.М., Чубарь Т.А., Газарян И.Г., Тишков В.И. Получение и свойства мутантных форм пероксидазы табака с дополнительным остатком триптофана. Вестн. Моск.Ун-та.Сер.2.Химия, 2006, т. 47, N1, с.20-24.

2. Hushpulian, D.M., Poloznikov, A.A., Savitski, P.A., Rozhkova, A.M., Chubar, T.A., Fechina, V.A., Orlova, M.A., Tishkov, V.l., Gazaryan, I.G., Lagrimini, L.M. Glutamic acid-141: a heme 'bodyguard' in anionic tobacco peroxidase. Biological Chemistry, 2007, v.388, N4, p 373-380.

3. Hushpulian, D.M., Poloznikov, A.A., Savitski, P.A., Rozhkova, A.M., Chubar, T.A., Fechina, V.A., Lagrimini, L.M. Tishkov, V.l., & Gazaryan, I.G. (2007) Biocatalytic properties of recombinant tobacco peroxidase in chemiluminescent reaction. Biocatalysis & Biotransformation 2007, v. 25, N2-4, p. 163-170

4. Poloznikov A.A., Savitski P.A., Khushpulyan D.M., Chubar T.A., Gazaryan I.G., Tishkov V.l. Preparation and properties of mutant tobacco peroxidase with additional tryptophan residues. Abstracts of International Conference "Biocatalysis 2005. Fundamentals and Applications" (St.Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russian Federation) p.56.

5. Hushpulian D.M., Savitski P.A., Rojkova A.M., Chubar T.A., Gazaryan I.G., Poloznikov A.A., Fechina V.A., Uporov I.V., Orlova M.A., Gazaryan I.G., Tishkov V.l. Effect of negative charge removal at the entrance to the heme-binding pocket on properties of recombinant tobacco peroxidase. Abstracts of International Conference "Biocatalysis 2005. Fundamentals and Applications" (St.Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russian Federation) p.80.

6. Gazaryan I.G., Khushpulyan D.M., Poloznikov A.A., Tishkov V.l., Recombinant tobacco peroxidase - new enzyme for biosensors. Abstracts of international symposium on environmental biocatalysis "From remediation with enzymes to novel green processes", 2006, April 23-26, Cordoba, Spain, P-12.

7. Hushpulian D.M., Poloznikov A.A., Chubar T.A., Rojkova A.M., Savitskiy P.A., Lagrimini L.M., Gazaryan I.G. and Tishkov V.l. Preparation of tobacco peroxidase mutants with improved catalytic properties. Abstracts of International conference "Biocatalysis 2007" (Moscow-St.Petersburg, Russia), p.116.

8. Hushpulian D.M., Poloznikov A.A., Chubar T.A, Rojkova A.M., Savitskiy P.A., Lagrimini L.M., Gazaryan I.G., Tishkov V.l. Preparation and characterization of new mutant tobacco peroxidase. Abstracts of International congress "Biotechnology 2007: state of the art and prospects of development" (Moscow, Russia), p.268.

Подписано в печать 13.10.2008 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 150 экз. Заказ № 760 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102