Выделение и свойства пероксидазы табака из трансгенных растений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ПЕРОКСИДАЗЫ: СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ.

1.1 Классификация пероксидаз.

1.2 Структура пероксидаз.

1.3 Структурная роль кальция.

1.4 Грибные пероксидазы.

1.5 Каталитический цикл пероксидазной реакции.

1.6 Ключевые аминокислотные остатки HRP.

1.7. Роль кальция в образовании Соединения 1 пероксидазы ячменя.

1.8 Структура комплексов пероксидазы хрена с ингибиторами и субстратами.

1.8.1 Бензгидроксамовая кислота.

1.8.2 Феруловая кислота.

1.9. Проблема субстратной специфичности: наличие нескольких субстрат-связывающих центров.

1.9.1. Субстрат-связывающий центр лигнинпероксидазы.

1.9.2. Субстрат-связывающие центры пероксидазы хрена.

1.9.3. Окисление индолилуксусной кислоты пероксидазами растений и возможное существование второго центра связывания у пероксидаз растений.

ГЛАВА 2. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА ПЕРОКСИДАЗ.

ГЛАВА 3. ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРОКСИДАЗЫ ТАБАКА.

3.1. Клонирование гена пероксидазы табака.

3.2. Получение трансгенных томатов.

3.3. Каталитические свойства фермента в реакции хемилюминесценции.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Материалы.

4.1.1. Ферменты.

4.2. Методы.

4.2.1. Определение белка.

4.2.2. Определение молекулярной массы.

4.2.3. Спектрофотометрические методы определения активности пероксидаз.

4.2.4. Расчет констант скорости из данных стационарной кинетики.

4.2.5. Спектральные исследования.

4.2.6. Изучение термоинактивации ферментов.

4.2.7. Изучение радиационной инактивации ферментов.

4.2.8. Электрохимические исследования.

4.2.8.1. Приготовление электродов.

4.2.8.2. Электрохимические измерения в ячейке wall-jet.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Выделение анионной пероксидазы табака из транс генных растений, суперпродуцирующих фермент.

5.2. Моделирование структуры пероксидазы табака.

5.3. Моделирование активного центра пероксидазы табака введением мутации Phel43Glu в рекомбинантную пероксидазу хрена.

5.4. Термостабильность пероксидазы табака.

5.5. Спектральные свойства фермента.

5.6. Модуляция спектральных свойств пероксидазы табака ионами металлов.

5.7. Каталитические свойства пероксидазы табака в реакции окисления вератрового спирта.

5.8. Зависимость константы скорости взаимодействия ТОР с перекисью водорода от рН.

5.9. Электрохимические свойства пероксидазы табака.

V. ВЫВОДЫ.

Разработка новых ферментативных систем, позволяющих усовершенствовать старые и предложить новые варианты анализа для целей здравоохранения и охраны окружающей среды, является одним из перспективных направлений современной аналитической биотехнологии. Поскольку использование именно ферментативных методов целесообразно для высокочувствительного и селективного определения физиологически активных веществ, то получение и характеристика новых ферментов является актуальной задачей.

Наиболее распространенным в природе и широко применяемым в аналитических целях ферментом является пероксидаза. До недавнего времени единственно доступным коммерческим препаратом являлась пероксидаза из корней хрена. В последние годы на рынке появились препараты новых пероксидаз. Это прежде всего грибная пероксидаза Coprinus cinereus (Arthromyces ramosus), производимая в коммерческих масштабах в нативной и рекомбинантной формах фирмой Novo Nordisk (Дания); пероксидаза из отходов производства при обработке соевых бобов (Коламбас, Огайо, США); и пероксидаза из суперпродуцирующей культуры клеток сладкого картофеля (фирма Дусан, Южная Корея) [14]. Следует отметить, что наиболее перспективным ферментом является рекомбинантный вариант грибной пероксидазы [1], который отличает не только высокая стабильность в экстремальных условиях, но и присущая нативному ферменту высокая каталитическая активность при хемилюминесцентной детекции (субстрат - люминол).

Целью настоящей работы явилось выделение в препаративных количествах и всесторонняя физико-химическая характеристика анионной пероксидазы табака, суперпродуцируемой трансгенными растениями (табаком и помидорами), сконструированными проф. Марком Лагримини университет штата Огайо, Коламбас, США). Впервые в результате проведенного исследования всесторонне (спектрально, био- и электро каталитически) охарактеризован новый фермент, представляющий несомненный интерес для целей хемилюминесцентного и биосенсорного анализа.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

V. выводы

1. Выделены и охарактеризованы пероксидазы табака из нативных растений табака и трансгенных табака и томатов, супер продуцирующих фермент. Показано, что плоды трансгенных томатов являются перспективным источником фермента (pi 3,5, Мг 35 кД) благодаря его высокому содержанию и простоте выделения.

2. Предложена структура молекулы пероксидазы табака на основе кристаллической структуры пероксидазы арахиса. Показано наличие остатка Glu-141 на входе в активный центр фермента. Введение методом направленного мутагенеза остатка глютаминовой кислоты в рекомбинантную пероксидазу хрена (замена Phel43Glu моделирует остаток Glu 141 в активном центре ТОР) вызывает структурно-функциональные эффекты (кинетика включения гема, стабильность, субстратная специфичность), схожие с наблюдаемыми для пероксидазы табака, что является подтверждением правильности моделирования структуры пероксидазы табака.

3. Обнаружены необычные свойства пероксидазы табака в кислых рН: Соединение I очень стабильно, в то время как Соединение II отличается повышенной активностью. Показана необычная модуляция спектральных и каталитических свойств фермента в присутствии катионов кальция: пероксидаза табака стабильна в присутствии кальция в экстремально кислых рН (ниже 2), имеет спектр, схожий со спектром лигнинпероксидазы, и способна катализировать окисление вератрового спирта.

4. Изучена зависимость константы скорости взаимодействия ТОР с перекисью водорода от рН среды. Показано, что в молекуле фермента имеется группа с рКа 2,5, протонирование которой стабилизирует холофермент в экстремальных рН.

5. Установлено, что влияние ионов кальция на свойства пероксидазы табака в растворе сохраняется и после адсорбции фермента на поверхности графитового электрода. Изучено влияние ионов кальция на электрохимическую активность ТОР, иммобилизованной на графитовых электродах. Показано, что добавление Са приводит к изменению констант скоростей прямого и медиаторного электронных переносов.

1. Gajhede M., Schuller D.J., Henriksen A., Smith А.Т., Poulos T.L. Crystal structure of classical horseradish peroxidase С at 2.15A resolution., Nat. Struct. Biol., 1997, 4, 1032-1038

2. Welinder K.G. Plant peroxidases. Their primary, secondary, and tertiary structures, and relation to cytochrome с peroxidase, Eur. J. Biochem., 1985, 96, 483-502.

3. Baunsgaard L., Dalboge H., Houen G., Rasmussen E.M., Welinder K.G. Amino acid sequence of Coprinus macrorhizus peroxidase and cDNA sequence encoding Coprinus Cinereus peroxidase. A new family of fungal peroxidases, Eur. J. Biochem., 1993, 213, 605-611.

4. Petersen J.F.W., Kadziola A., Larsen S. Three-dimensional structure of a recombinant peroxidase from Coprinus cinereus at 2.6 A resolution, FEBS Lett., 1994, 339, 291-296.

5. Poulos T.L., Edwards S.L., Wariishi H., Gold M.H. Crystallographic refinement of lignin peroxidase at 2 A., J. Biol. Chem. 1993, 268, 44294440.

6. Sundaramoorthy M., Kishi К., Gold M.H., Poulos T.L. The crystal structure of manganese peroxidase from Phamruchaete chrysosporium at 2.06 A resolution,. J. Biol. Chem, 1994, 269, 32759-32767.

7. Patterson W.R., Poulos T.L. Crystal structure of recombinant pea cytosolic ascorbate peroxidase, Biochemistry, 1995, 34, 4331-4341.

8. Van Huystee R.B., McManus M.T. Glycans of higher plant peroxidases: recent observations and future speculations, Glycoconjugate J., 1998, 15, 101-106.

9. Sundaramoorthy M.,Terner J., Poulos T.L. The crystal structure of chloroperoxidase; a heme peroxidase-cytochrome P450 functional hybrid, Structure, 1995, 3, 1367-1377.

10. Welinder K.G., Tams J.W. Effects of glycosylation on protein folding, stability and solubility. Studies of chemically modified or engineered plant and fungal peroxidases, Anal.Biochem., 1995, 228, 48-58.

11. Kvaratskhelia M., Winkel C., Thomeley R.N.F. Purification and characterization of a novel class III peroxidase isoenzyme from tea leaves, Plant. Physiol., 1997, 114, 1237-1245.

12. Schuller D.J., Ban N„ Van Huystee R.B., McPherson A., Poulos T.L. Crystal structure of peanut peroxidase, Structure, 1996, 4, 311-321.

13. HenriksenA., Welinder K.G., Gajhede M. Structure of barley grain peroxidase refined at 1.9 A resolution. A plant peroxidase reversibly inactivated at neutral pH., J.Biol.Chem., 1998, 273, 2241-2248.

14. Tams J.W. Welinder K.G. Glycosylation and thermodynamic versus kinetic stability of horseradish peroxidase, FEBS Letters, 1998, 421, 234-236.

15. Rodriguez Maranon M.J., Hoy A.R., Van Huystee R.B. Evidence for the presence of Mn(ll) in a peanut peroxidase. An EPR study, Cell, and Molec. Biol., 1994, 40, 871-879.

16. Haschke R.H., Fnedhoff J.M. Calcium-related properties of horseradish peroxidase, Biochem.Biophys.Res.Commun., 1978, 80, 1039-1042.

17. Morishima I., Kurono M., Shiro Y. Presence of endogenous calcium ion in horseradish peroxidase, J.Biol.Chem., 1986, 261, 9391-9399.

18. Rasmussen C.B., Hmer A.N.P., Smith A.T., Welinder K.G. Effect of calcium, other ions, and pH on the reaction of baley peroxidase with hydrogen peroxide and fluoride. Control of activity through conformational change, J.Biol.Chem., 1998, 273, 2232-2240.

19. Shiro Y., Kurono M., Morishima I. Presence of endogeneous calcium ion and its functional and structural regulation in horseradish peroxidase, J.Biol.Chem., 1986, 261, 9382-9390

20. Banci L., Carlom P., Diaz A., Savellini G.G., Molecular dynamics calculations on peroxidases: the effect of calcium ions on protein structure, J.Biol.Inorg.Chem., 1996, 1,264-272

21. R.B.Van Huystee, Y.Xu, J.P.O'Donnel, Variation in Soret Band absorption of peroxidase due to calcium, Plant Phyiol.Biochem., 1992, 30, 293-297

22. Barber K.R., Rodriguez Maranon M.J., Shaw G.S., Van Huystee R.B., Structural influence of calcium on the heme cavity of cationic peanut peroxidase as determined by ^-NMR spectroscopy. Eur. J. Biochem., 1995, 232, 825-833.

23. Lige В., Ma S., Zhao D., Van Huystee R.B. Cationic peanut peroxidase: expression and characterization in transgenic tobacco and purification of the histidme-tagged protein, Plant Science, 1998, 136, 159-168.

24. Nie G., Aust S.D. Spectral changes of lignin peroxidase during reversible inactivation, Biochemistry, 1997, 36, 5113-5119.

25. Nie G., Aust S.D. Effect of calcium on the reversible thermal inactivation of lignin peroxidase, Arch. Biochem. Biophys., 1997, 337, 225-23 1.

26. Nie G., Reading N.S., Aust S.D., Relative stability of recombinant versus native peroxidase from Phanerochaete chrysosponum, Arch.Biochem.Biophys., 1999, 365, 328-334.

27. Беккер Е.Г., Пирцхалаишвили Д.О., Элисашвили В.И., Синицин А.П. Mn-пероксидаза из Pleurotus Ostreatus: выделение, очистка и некоторые свойства, Биохимия, 1992, 57, 1248-1254.

28. Farhangrazi Z.S., Copeland B.R., Nakayama Т., Amachi Т, Yamazaki I., Powers L.S. Oxidation-reduction properties of Compound 1 and II of Arthromyces rctmosus peroxidase, Boichemistry, 1994, 33, 5647-5652.

29. Van Someren M.K., Kishi K., Lundell Т., Gold M.H. The manganese binding site of manganese peroxidase: characterization of an Aspl79Asn site-direcred mutant protein, Biochemistry, 1995, 34 10620-10627.

30. Kishi K., Hilderbrand D.P., Van Someren M.K., Gettemy J., Mauk A.G., Gold M.H. Site-directed mutations at phenylalanine-190 of manganese peroxidase: effects on stability, function and coordination, Biochemistry, 1997, 36, 4268-4277.

31. Kishi K., Van Someren K.M., Mayfield M B., Sun J., Loelir T.M., Gold M.H. Characterization of Mn (II) binding site mutants of manganese peroxidase, Biochemistry, 1996, 35, 8986-8994.

32. Sutherland GRJ, Aust S.D. Thermodynamics of binding of the distal calcium to manganese peroxidase, Biochemistry, 1997, 36, 8567-8573.

33. Sutherland GRJ, Zapanta L.S., Tien ML Aust S.D. Role of calcium in maintaining the heme environment of manganese peroxidase. Biochemistry, 36, 3654-3662.

34. Sundaramoorthy M, Kishi K., Gold M.H., Poulos T.L. Crystal structures of substrate binding site mutants of manganese peroxidase, J.Biol.Chem., 1997, 272, 17574-17580.

35. Yeung B.K.S., Wang X., Sigman J.A., Petillo P.A., Lu Y. Construction and characterization of a manganese-binding site in cytochrome с peroxidase: toward a novel manganese peroxidase, Chem.Biol., 1997, 4, 215-222.

36. Hill A.P., Modi S., Sutcliffe M.J, Turner D.D., Gilfoyle D.J., Smith A.T., Tam B.M, Lloyd E. Chemical, spectroscopic and structural investigation of the substrate-binding site in ascorbate peroxidase, Eur.J.Biochem, 1997, 248, 347-354.

37. Bhattacharyya D.K, Bandyopadhyay U., Banerjee R.K., Chemical and kinetic evidence for an essential histidme in horseradish peroxidase for iodide oxidation, J.Biol.Chem, 1992, 267, 9800-9804.

38. Bhattacharyya D.K, Bandyopadhyay U, Banerjee R.K, Chemical and kinetic evidence for an essential histidine residue in the electron transfer from aromatic donor to horseradish peroxidase compound I, J.Biol.Chem., 1993, 268, 22292-22298.

39. Modi S, Interaction of aromatic donor molecules with horseradish peroxidase: identification of the binding site and role of heme iron in the binding activity, BioMetals, 1995, 8, 218-222.

40. Newmyer S.L., Ortiz de Montellano P., Horseradish peroxidase His-42-Ala, His-42-Val, and Phe-41-Ala mutants, J.Biol.Chem., 1995, 270, 1943019438.

41. Tanaka M., Ishimori K., Monshima 1. Luminol activity of horseradish peroxidase mutants mimicking a proposed binding sites for luminol in Arthromyces ramosus peroxidase, Biochem., 1999, 38, 10463-10473.

42. Savenkova M.I., Newmyer S.L., Ortiz de Montellano P., Rescue of His-42^Ala horseradish peroxidase by a Phe-41->His mutation. Engineering of a surrogat catalytic histidme, J.Biol.Chem., 1996, 271, 24598-24603.

43. Nagano S., Tanaka M., Watanabe Y., Monshima I., Putative hydrogen bond network in the heme distal site of horseradish peroxidase, Biochem.Biophys.Res.Commun., 1995, 207, 417-423

44. Newmyer S.L., Sun J., Loehr T.M., Ortiz de Montellano P., Rescue of the horseradish peroxidase His-170-^Ala mutant activity by imidasole: importance of proximal hgand tethering, Biochemistry, 1996, 35, 1278812795.

45. Newmyer S.L., Ortiz de Montellano P. Rescue of the catalytic activity of an H42A mutant of horseradish peroxidase by exogenous imidasoles, J.Biol.Chem., 1996, 271, 14891-14896.

46. Veitch N.C., Williams R.J.P., Bone N.,M., Burke J.F., Smith A T. Solution characterisation by NMR spectroscopy of two horseradish peroxidase isoenzyme С mutants with alanine replacing either Phel42 or Phel43, Eur.J.Biochem., 1995, 233,650-658.

47. Kunishima N., Fukuyama K., Matsubara H. Ciystal structure of the fungal peroxidase from Arthromyces ramosus at 1,9 A resolution, structural comparisons with the lignin and cytochrome с peroxidases, J.Mol.Biol., 1994, 235, 345-356.

48. Ortiz de Montellano P., Hams R.Z., Hartmann C, Miller V.P., Newmyer S.L., Ozaki S. Structural determinants of peroxidase substrate specificity, in: Plant peroxidases: biochemistry and physiology, eds. University of Geneva , 1993, 137-142.

49. Candeias L.P., Folkes L.K., Wardman P. Factors controlling the substrate specificity of peroxidases: kinetics and thennodinamics of the reaction of horseradish peroxidase Compound I with phenols and indole-3-acetic acids, Biochem., 1997, 36, 7081-7085.

50. Folkes L.K., Candeias L.P. Interpretation of the reactivity of peroxidase compounds I and II with phnol by the Marcus equation, FEBS Letters, 1997, 4, 305-308.

51. Rodiguez-Lopez J.N., Smith A.T., Thorneley R.N.F., Role of arginine 38 in horseradish peroxidase, J.Biol.Chem., 1996, 271, 4023-4030.

52. Meunier В., Rodriguez-Lopez J.N., Smith А.Т., Thorneley R.N.F., Rich P.R. Redox- and anion-linked protonation sites in horseradish peroxidase: analysis of distal haem pocket mutants, Biochem. J. 1998, 330, 303-309.

53. Tanaka M., Ishimori K., Mukai M., Kitagawa Т., Morishima I. Catalytic activities and structural properties of horseradish peroxidase distal His42—>Glu or Gin mutant, Biochemistry, 1997, 36, 9889-9898.

54. Tanaka M., Nagano S., Ishimori K., Morishima I. Hydrogen bond network in the distal site of peroxidases: spectroscopic properties of Asn70^Asp horseradish peroxidase mutant, Biochemistry, 1997, 36, 9791-9798.

55. Howes B.D., Rodriguez-Lopez J.N., Smith А.Т., Smulevich G., Mutation of distal residues of horseradish peroxidase: influence on substrat binding and cavity properties, Biochemistry, 1997,36, 1532-1543.

56. Nagano S., Tanaka M., Ishimori K., Watanabe Y., Morishima I. Catalytic roles of the distal site Asparagine-Histidine couple in peroxidases, Biochemistry, 1996,35, 14251-14258.

57. Miller VP., Goodin D.B., Friedman A.E., Hartmann C., Ortiz de Montellano P.R. Horseradish peroxidase Phel72^Tyr mutant, J.Biol.Chem., 1995, 270, 18413-18419.

58. Gazaiyan I.G., Klyachko N.L., Dulkis Yu.K., Ouporov I.V., Levashov, A.V. (1997) Formation and properties of dimenc recombinant horseradish peroxidase in the system of reversed micelles. Biochem. J. 328, 643-647.

59. Henriksen A., Schuller D.J., Meno K., Welinder K.G., Smith A.T., Gajhede M., Structural interactions between horserafish peroxidase С and the substrate benzhydroxamic acid determined by X-ray christallography, Biochemistry, 1998, 37, 8054-8060.

60. Itakura H., Oda Y., Fukuyama K. Binding mode of benzhydroxamic acid to Arthromyces ramosus peroxidase shown by X-ray crystallographic analysis of the complex at 1.6 A resolution, FEBS Letters, 1997, 412, 107-110.

61. Henriksen A., Smith А.Т., Gajhede M. The structure of horseradish peroxidase C-ferilic acid complex and the ternary complex with cyanide suggest how peroxidases oxidise small phenolic substrates, J.Biol.Chem., 1999, 274, 35005-35011.

62. Kvaratskhelia M., George S.J., Thorneley R.N.F. Salicylic acid is a reducing substrate and not an effective inhibitor of ascorbate peroxidase, J.Bio.Chem., 1997, 272, 20998-21001.

63. Abelskov A.K., Smith A.T., Rasmussen C.B., Dunford H.B., Welinder K.G., pH dependence and structural interaction of the reactions of Cuprinus cinerens peroxidase with hydrogen peroxide, ferulic acid and ABTS, Biochemistry, 1997, 36, 9453-9463

64. Khindaria A., Yamazaki I., Aust S.D., Veratryl alcohol oxidation by lignin peroxidase, Biochemistry, 1995, 34, 16860-16869

65. Khindaria A., Yamazaki I., Aust S.D.Stabilization of veratryl alcohol cation radical by lignin peroxidase, Biochemistry, 1996, 35, 6418-6424

66. Tien M., Ma D., Oxidation of 4-methoxymandelic acid by lignin peroxidase. Mediation by veratryl alcohol. J.Biol.Chem., 1997, 272, 8912-8917

67. Blodig W., Smith A.T., Winterhalter K., Piontek K. Evidence from spin-trapping for a transient radical on tryptophan residue 171 of lignin peroxidase, Arch.Biochem.Biophys., 1999, 370, 86-92.

68. Blodig W„ Doyle W.A, Smith A.T, Winterhalter K, Choinowski Т. Piontek K. Autocatalytic formation of a hydroxy group at С beta of Tip 171 in lignin peroxidase, Biochemistry, 1998, 37, 8832-8838.

69. Doyle W.A, Blodig W, Veitch N.C, Piontek K, Smith A.T. Two substrate interaction sites in lignin peroxidase revealed by site-directed mutagenesis, Biochemistry, 1998, 37, 15097-15105.

70. Van Haandel M.J.H, Claassens M.M.J, Van der Hout N, Boersma M.G, Vervoort J, Rretjens M.C.M. Differential substrate behaviour of phenol and aniline derivatives during conversion by horseradish peroxidase, Biochim.Biophys.Acta, 1999, 1435, 22-29.

71. Bursey E.H, Poulos T.L. Two substrate binding sites in ascorbate peroxidase: the role of Arginine 172, Biochemistry, 2000, 39, 7374-7379.

72. Rodrigues-Lopez J.N, Gilabert M.A, Tudela J, Thomeley R.N.F, Garcia-Canovas F. Reactivity of horseradish peroxidase Compound II toward substrates: kinetic evidence for a two-step mechanism, Biochemistry, 2000, 39, 13201-13209.

73. Adak S, Banerjee R.K. Haem propionates control oxidative and reductive activities of horseradish peroxidase by maintaining the correct oreientation of the haem, Biochem.J, 1998, 334, 51-56.

74. Timofeevski S.L, Nie G, Reading N.S, Aust S.D, Substrate specificity of lignm peroxidase and S168W variant of manganese peroxidase, Arch.Biochem.Biophys, 2000, 373, 147-153.

75. Dunford H.B., Adeniran A.J., Hammet correlation for reactions of horseradish peroxidase Compound II with phenols, Arch.Biochem.Biophys., 1996, 251, 536-542.

76. Laberge M., Osvath Sz., Fidy J. Aromatic substrate specificity of horseradish peroxidase С by a combined fluorescence line narrowing/energy minimization approach: the effect of localized side-cham reorganization, Biochemistry, 2001, 40, 9226-9237.

77. Gazanan, I.G., Lagrmini, L.M., Mellon, F.A., Naldrett, M.J., Ashby, G.A., Thorneley, R.N.F., Identification of skatolyl hydroperoxide and its role in peroxidase-catalysed oxidation of indol-3-yl acetic acid. Biochem. J., 1998, 333 (1), 223-232.

78. Malkowski M.G., Ginell S.L., Smith W.L., Garavito R.M., The productive conformation of arachidomc acid bound to prostaglandin synthase, Science, 2000, 289, 1933-1937

79. Savitsky P.A., Gazaiyan I.G., Tishkov V.I., Lagrimini L.M., Ruzgas Т., Gorton L., Oxidation of indole-3-acetic acid by dioxygen catalysed by plant peroxidases: specificity for the enzyme structure, Biochem. J., 1999, 340(3), 579-583.

80. Tarasevich M.R., Yaropolov A.I., Bogdanovskaya V.A., Varfolomeev S.D. electrocatalysis of a cathodic oxigen reduction by laccase, Bioelectrochem.Bioeng., 1979, 6, 393- 399.

81. Yaropolov А.1., Varfolomeev S.D., Berezin I V. Bioelectrocatalysis. Activation of a cathode oxygen reduction in the peroxidase-mediator carbon electrode system . FEBS Letters, 1976, 71, 306-308.

82. Варфоломеев С.Д., Тарасевич М.Р., Ярополов А.И., Березин И.В., Богдановская В.А. Свойства ферментов участвовать в переносе элкронов, открытие № 311, зарег. в Госуд. реестре открытий СССР 19.12.85.

83. Ярополов А. И. Исследование кинетических закономерностей ферментативных реакций в электрохимических системах. Дисс. канд. хим. наук, М., 1978, 159 л.

84. Ярополов А.И., Маловик В., Варфоломеев С.Д., Березин И.В. Биоэлектрокатализ. Прямой перенос электронов с активного центра пероксидазы на электрод, ДАН, 1979, 249, 1399-1401.

85. Ruzgas Т., Gorton L., Emneus J., Marko-Varga G., Kinetic models of horseradish peroxidase action on a graphite electrode, J.Electroanal. Chem., 1995, 391. 41-49.

86. Lindgren A., Ruzgas Т., Gorton L., Csoregi E., Ardila G.B., Sakharov I.Y., Gazatyan I.G. Biosensors based on novel proxidases with improved properties in direct and mediated electron transfer, Biosensors abd Bioelectronics, 2000, 15, 491-497.

87. Gaspar S., Popescu I.C., Gazaryan I.G., Bautista A.G., Sakharov I.Y., Mattiasson В., Csoregi E. Biosensors based on novel plant peroxidases: a comparative study, Electrochim. Acta, 2000, 46, 255-264.

88. Bard A.J., Faulkner L.R., Electrochemical Methods Fundamental and Applications, Whiley, New York, 1980.

89. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Gorton L., The electrocatalytic activity of Prussian Blue in hydrogen peroxide reduction studied using a wall-jet electrode with continious flow, J.Electroanal. Chem., 1998, 456, 97-104

90. Lindgren A., Emneus J., Ruzgas Т., Gorton L., Marko-Varga G., Amperometric detecton of phenols using peroxidase-modified graphite electrodes, Analyt.Chim.Acta, 1997, 18067, 1-12.

91. Lindgren A., Tanaka M., Ruzgas Т., Gorton L., Gazaryan I.G., Ishimori K., Morishima 1. (1999) Direct electron transfer catalysed by recombinant forms of horseradish peroxidase: insight into the mechanism. Electrochem.Communs 1 (5), 171-175.

92. Gorton L., Lindgren A., Larsson Т., Munteanu F-D., Ruzgas Т., Gazaiyan I., Direct election transfer between heme-containmg enzymes and electrodes as basis for third generation biosensors. Analytica Chimica Acta, 1999, 400, 91-108.

93. Fujiyama K., Takemura H., Shinmyo A., Okada H., Takano M. Biochemical, molecular and physiological aspects of plant peroxidases. Ed. J.Lobarzewski Geneve, Geneve Univ., 1991, 81-88.

94. Rothstem S.J., Lahners K.N., Lotstein R.J., Carozzi N.B., Jayne S.J., Rice D.A., Promoter cassettes, antibiotic-resistance genes, and vectors for plant transformation, Gene, 1987, 53, 153-161.

95. Lagrimini L.M. Biochemical, molecular and physiological aspects of plant peroxidases. Ed. J.Lobarzewski Geneve, Geneve Univ., 1991, 59-67.

96. Lagrimini L.M., Bradford S., Rothstein S., Peroxidase induced wilting in transgenic tobacco plants, The Plant Cell, 1990, 2, 7-18

97. McEldoon J.P., Pokora A.R., Dordick J.S. (1995) Enzyme Microbiol Technol 17, 359-365.

98. Tien M, Kirk Т.К. (1988) Methods Enzymol 161, 238-249.

99. Kalb V.F., Bernlohr R.W. A new spectrophotometric assy for protein in cell extracts, Analyt.Biochem., 1977, 82, 362-371

100. Bradford M.M., A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analyt.Biochem., 1976, 72, 248-254.

101. Childs R.E., Bardsley W.G., A steady-state kinetics of peroxidase with 2,2"-azmo-di(3-ethyl-benzthiazolme-6-sullfomc acid) as choromogen, Biochem.)., 1975, 145, 93-103.

102. Hosoya Т., Turnip peroxidase. II The reaction mechanisms of turnip peroxidase Al, A2 and D, J.Biochem., 1960, 47, 794-803.

103. Doerge D., Divi R.L., Churchwell M.l. Identification of the colored guaiacol oxidation product produced by peroxidases, Analyt.iochem., 1997, 250, 1017.

104. Gallati H., Enzyme-immunological tests: determination of the activity of peroxidase with the aid of the Trinder reagent, J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 197, 15, 699-703.

105. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В., Кинетическое окисление реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена, Биохимия, 1977, 42, 1372-1379.

106. Hasinoff F., Dunford H.B., Kinetics of the oxidation of ferrocyanide by horseradish peroxidase Compounds I and II, Biochemistry, 1970, 9, 49304939.

107. Porstmarm Т., Porstmann В., Wietschke R., von Baehr R., Egger E., Stabilization of substrate reaction of horseradish peroxidasewith o-phenylene diamine in the enzyme immunoassay, J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 1985, 23, 41-44.

108. Nissum N., Schiodt C.B., Welinder K.G., Reactions of soybean peroxidase and hydrogen peroxide pH 2,4 12,0 and veratryl alcohol at pH 2,4, Biochim.Biophys.Acta, 2001, 1545, 339-348.

109. Беккер Е.Г., Хартиг К., Лорбеер X., Синицин А.П., Выделение изоферментов лигнинназы из Sporotrichum pulverulentum и их некоторые свойства, Биохимия, 1991, 56, 1413-1419.

110. Nakajnna R., Yamazaki I., The mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by horseradish peroxidase, J.Biol.Chem.,1979, 254, 872-878.

111. Газарян И.Г. Пероксидазы растений, Итоги науки и техники. Биотехнология, том 36, М., 1992.

112. Gazaryan I.G., Lagrimini L.M. Tobacco anionic peroxidase overexpressed in transgenic plants: aerobic oxidation of indole-3-acetic acid, Phytochemistiy, 1996, 42, 1271-1278.

113. Shinmen J. (1984) Peroxidase and process of its preparation. US Patent 4.737,460. Priority date 7.08.84

114. Орлова M.A. Радиационная инактивация протеолитических ферментов, Успехи химии, 1993, 62, 529-544.

115. Орлова М.А. Применение метода радиационной инактивации для изучения структуры и каталитических свойств ферментов, Изв. АН, сер. Химич., 2828-2836.

116. Orlova М.А., Kost О.A., Gribkov V.A., Gazaryan I.G.Dubrovsky A.V., Egorov V.A., Troshina N.N. Enzyme activation and inactivation induced by low doses of irradiation, Applied Boichein. Biotechnol., 2000, 88, 321-333.

117. Adednan S.A., Kinetics of the formation of P-670 and of the decay of Compound III of horseradish peroxidase, Arch.Biochem.Biophys., 1996, 327, 279-284.

118. Henriksen A., Mirza O., Indiani C., Teilum K., Smulevich G., Welinder K G., Gajhede M., Structure of soybean seed coat peroxidase: A plant peroxidase with unusual stability and haem-apoprotem interactions, Prot.Sci., 2001, 10, 108-115.

119. Marques L., Warushi D., Dunford H.B., Gold M.H., Spectroscopic and kinetic properties of the oxidised intermediates of lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium, J.Biol.Chem., 1988, 263, 10549-10552.

120. Munir I.Z., Dordick J.S., Soybean peroxidase as an effective bromination catalyst. Enzyme and Microbial Technol., 2000, 26, 337-341.

121. Gajhede M., Plant peroxidases: substrate complexes with mechanic implications, Protein Engineering of Peroxidases and Cytochrome P450, 672 Meeting of Bioenergetic Group Colloquium, University of Sussex, 2000.

122. Gazaryan, I.G., Doseeva, V.V., Galkin, A.G., Tishkov, V.l. Effect of single-point mutations Phe41^His and Phel43^Glu on the folding and catalytic properties of recombinant horseradish peroxidase expressed in E.coli. FEBS Lett. 1994, v.354, p.248-250.

123. Rodriguez-Lopez, J.N., Hernandez-Ruiz J., Garcia-Canovas F., Thomeley R.N.F., Acosta M., Arnao M.B. (1997) The inactivation and catalytic pathways of horseradish peroxidase with m-chloroperoxybenzoic acid. J.Biol.Chem. 272, 5469-5476.

124. Andersen M.B, Hsuanyu Y, Welinder K.G, Schneider P, Dunford H.B. (1991) Spectral and kinetic properties of oxidized intermediates of Coprinus cinereus peroxidase. Acta Chem Scand 45, 1080-1086.

125. Kim B.B, Pisarev V.V, Egorov A.M. A comparative study of peroxidases from horseradish and Arthromyces ramosus as labels in luminol-mediated chemilummescent assays. Anal. Biochem, 1991, 199, 1-6.