Рекомбинантная пероксидаза табака: получение и каталитические свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

ООЗОБЗи(1

ХУШПУЛЬЯН Дмитрий Михайлович

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЕРОКСИДАЗА ТАБАКА: ПОЛУЧЕНИЕ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

02.00.15 - катализ 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2007

003053071

Работа выполнена на кафедре химической эюимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

профессор, доктор химических наук Тишков Владимир Иванович доктор химических наук Орлова Марина Алексеевна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович профессор, доктор химических наук Ярополов Александр Иванович

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 20 марта 2007 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 16 февраля 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Усовершенствование старых и разработка новых вариантов ферментативного анализа для целей здравоохранения и охраны окружающей среды является одним из важнейших и перспективных направлений современной биотехнологии, поскольку именно ферментативные методы обеспечивают высокочувствительное и селективное определение физиологически активных веществ. Поэтому поиск, получение и характеристика новых ферментов для аналитической биотехнологии является актуальной задачей.

Пероксидаза - один из главных ферментов растений, отвечающий за синтез лигнина, расщепление гормона роста растений и нейтрализацию перекиси водорода. Пероксидаза хрена (HRP) - самый популярный биоаналитический фермент, который позволяет детектировать перекись водорода и ферменты ее производящие. HRP нашла применение в различных методах анализа, в частности как хемилюминесцентная метка в иммуноферментном анализе. Однако, ряд недостатков этого фермента - необходимость использования в реакции усиленной хемилюминесценции усилителей типа н-иодфенола и нестабильность пероксидазы хрена в условиях коньюгирования с антителами - приводят к сильным вариациям уровня детекции и не позволяют активно конкурировать с появившемся на рынке методом на основе ИК-меченых антител (фирма Licor, США). Поэтому, замена HRP на более стабильную и активную в хемилюминесценции пероксидазу является условием сохранения рынка меченых антител за пероксидазами.

В настоящее время поиск новых пероксидаз ведется во всем мире. В нашей лаборатории была выделена анионная пероксидаза табака (ТОР) из трансгенных растений, которая обладала рядом уникальных свойств: катализировала окисление люминола без усилителя на порядок лучше, чем HRP с усилителем, отличаясь при этом большей стабильностью к инактивации перекисью водорода, чем пероксидаза хрена. Для разработки лучших катализаторов хемилюминесценции на ее основе методом направленного мутагенеза необходимо иметь данные о структуре фермента. Закристаллизовать нативную гликозилированную пероксидазу вследствие гетерогенности гликозилирования не удалось. Поэтому методом гомологичного моделирования на основе структуры пероксидазы хрена была построена модель структуры ТОР, особенностью которой являлось наличие остатка Glul41 на входе в гем-связывающую полость. У HRP на этом месте находится остаток фенилаланина. Было отмечено, что анионные пероксидазы арабидопсиса, хрена и пероксидазы грибов — все имеют в этом положении остаток Glu, однако роль этого остатка в катализе и стабильности фермента не была изучена.

Цели и задачи исследования. В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

• Разработка метода препаративного получения рекомбинантной неглико-зилированной пероксидазы табака дикого типа (wt-TOP) и ее наработка для последующей кристаллизации и расшифровки структуры;

• Получение мутантной формы пероксидазы табака Glul41Phe (имитация активного центра HRP);

• Сравнительное изучение субстратной специфичности ферментов;

• Изучение окисления фенолов в присутствии ABTS, выполняющего роль медиатора;

• Изучение влияния кальция на кинетические параметры окисления ABTS в присутствии wt-TOP и ее мутантной формы Glul41Phe

• Изучение стабильности wt-TOP и ее мутанта Glul41Phe в условиях радиолиза (имитация инактивации в ходе реакции);

• Изучение свойств wt-TOP и ее мутантной формы Glul41Phe в реакции хемилюминесцентного окисления люминола;

Научная новизна работы. Впервые получена и детально охарактеризована негликозилированная рекомбинантная пероксидаза табака дикого типа, а также ее мутантная форма Glul41Phe. Наработанные препаративные количества были использованы для кристаллизации и последующей расшифровки кристаллической структуры фермента дикого типа. Впервые продемонстрирована роль водородной связи Glul41-Glnl49 в стабилизации холоформы кислой пероксидазы при хранении и в ходе реакции и подтверждена роль остатка Glul4l в контролировании входа в активный центр при фолдинге молекулы пероксидазы табака.

Практическая значимость работы. Введение мутации Glul41Phe может быть использовано для 4-х кратного увеличения выхода реактивации неглико-зилированной пероксидазы табака (с 7 до 30%). Полученная рекомбинантная ТОР является более эффективной по сравнению с нативным гликозилиро-ванным ферментом при использовании в безмедиаторных электрохимических биосенсорах.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях «Биокатализ-2002» (Москва, 2002), «Биокатализ-2005» (Санкт-Петербург, 2005), «American Chemical Society Meeting» (Нью-Йорк, 2003) и «Environmental Biocatalysis» (Кордоба, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы: 1 обзор, 6 статей и 5 тезисов докладов Международных конференций.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы (три главы); описания материалов и методов исследования; результатов и их обсуждения (четыре главы); выводов и списка цитируемой

литературы, включающего 112 ссылок. Работа изложена на 127 страницах и включает в себя 40 рисунков и 8 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ I. Разработка препаративного метода получения негликозилированной пероксидазы табака дикого типа для ее последующей наработки и

кристаллизации

В качестве системы экспрессии негликозилированной пероксидазы табака (ТОР) была выбрана система экспрессии в клетках E.coli. В такой системе фермент экспрессируется в бактериях в виде так называемых телец включения, т.е. в нерастворимом виде без кальция и гемина. Поэтому после культивирования и отделения биомассы от культуральной жидкости проводится разрушение клеток E.coli ультразвуком. После чего полученные тельца включения солюбилизируется в 6М мочевине. Следующим очень важным этапом является процедура реактивации фермента (рефолдинг) при котором происходит сворачивание глобулы белка и встраивание в нее ионов кальция и гемина. Условия рефолдинга ТОР зависят от ряда параметров, которые были нами оптимизированы (рис. 1).

В таблице 1 приведены литературные данные по рефолдингу 5 других пероксидаз в сравнении с таковыми для ТОР. Из этих данных видно, что условия рефолдинга для каждого фермента сугубо индивидуальные. Очень интересным фактом является то, что в случае ТОР оптимальная концентрация кальция для реактивации составляет всего 1 мМ, в то время как для других пероксидаз оптимальная концентрация кальция составляет 5 мМ и более.

Высокий уровень экспрессии фермента порядка 40-50% от общего белка (рис. 2) позволяет нам использовать 1 стадию очистки с помощью метода гель-фильтрации (рис. 3). На рис. 4 представлены результаты аналитического электрофореза очищенного препарата. Такая методика позволила нам получить 150 мг wt-TOP (таблица 2). Полученный препарат был отправлен в Центр Кристаллографии Белка в Университет Копенгагена, где под руководством проф. Сине Ларсен были получены первые кристаллы, а также предварительная кристаллическая структура (рис. 5) анионной пероксидазы табака с разрешением 2,7 А.

Таблица 1. Условия рефолдинга рекомбинантных пероксидаз растений

Пероксидаза РН Мочевина, М Глутатион окисл., мМ Глутатион восст.,мМ Гемин, мкМ Кальций, мМ

Хрена С 8,5 2,00 0,70 0,10(DTT) 5,0 5,0

Ячменя 8,9 1,18 0,65 0,30 1,5 10,0

Сои 8,7 2,25 0,60 0,40 1,5 5,0

Арабидопсиса N 9,2 2,30 0,45 0,25 5,0 5,0

Арабидопсиса А2 8,5 1,20 0,60 0,40 1,5 6,0

Табака 9,6 1,80 0,50 0,1 5,0 1,0

Мочевина 1,8 М Мочевина 2.0 М Мочевина 2.3 М

■

I

В,4

9,0

рН

9,В

I 0.1 нМ РТТ 1 0.5 мМ ОТТ I 1 ММ ОТТ

ж.

п

0,3 0,5 0,7

Окисленный гпутатион, мМ

20 01

1

1 мМ Са

5 мМ Са1* 10 мМ Са3*

I

п

1

16

Генин, мкМ

25

Рис. 1. Результаты оптимизации условий рефолдинга уЛ-ТОР.

220 Ш

^ 66 ф 46

ш

7

М

2

30

21.5 14.3

Рис. 2, Экспрессия \^-ТОР в штамме Е.соН В1_21(ОЕЗ)СЬР1из. 1 и 2 - биомасса Е.соН по и после добавления 1РТв соотвественно, 3 - маркеры молекулярной массы.

6 <

V. ми

Рис.3. Профиль злюции рекомбинантной «■•¡-ТОР при очистке гель-фильтрацией на колонке с носителем БерИасгу) 5-200. Кривая 1 — поглощение на 280 нм, а кривая 2 - активность, Е/мл.

Рис. 4. Электрофорез активной фракции \*1-ТОР после очистки методом гель-фильтрации.

Таблица 2. Получение и очистка рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа из 15 л культуральной среды.

Стадия Очистки Общий белок, мг Общая активность, Е Удельн. актив, Е/мг Выход по акт, % Реактивация, % Фактор очистки RZ

Солюбилиза-ция в 6 М мочевине 950 - 0 0 - - -

Реактивация 950 236000 250 100 - 1 0,8

Ультрафильтрация 750 236000 315 100 - 1,26 1

Гель-фильтрация 160 176000 1100 74,5 16,8 4,4 3,0

Элементарная кристаллографическая ячейка в кристалле ТОР содержала 4 молекулы фермента (рис. 5). Анализ структуры показал, что проксимальный центр связывания кальция занят не полностью (см. рис. 7). Это означает, что для получения активного фермента достаточно встраивания кальция в дистальный центр связывания. По нашему опыту, реактивированная пероксидаза табака была менее стабильна при хранении, чем нативный фермент. Таким образом, проксимальный центр связывания отвечает за стабильность фермента при хранении. Поэтому в дальнейшем для получения стабильных препаратов фермента концентрация кальция в ходе рефолдинга была повышена до 5 мМ. Кроме того, наши данные отличаются от данных по другим пероксидазам растений, для которых дистальный ион кальция более подвижный. В настоящий момент проводится получение крупных кристаллов в присутствии избытка кальция, что позволит повысить разрешение до 1,5 Â.

На рис. 6 представлены результаты сравнения кристаллической и модельной структур ТОР. Видно, что ход цепи для обеих структур практически совпадает. Среднеквадратичное отклонение Са-атомов между реальной и модельной структурой составляет всего 1,3 Â. Одним из важнейших выводов этого сравнения является то, что остаток Glul41 действительно расположен на входе в активный центр фермента. Дальнейший детальный анализ кристаллической структуры в области активного центра (рис. 7) показал, что остаток Glul41 образует водородную связь с остатком Gin 146. Эта связь создает дополнительный барьер, который защищает гем активного центра от растворителя. Первым таким барьером является консервативный остаток Рго137 (рис. 7).

При анализе структур других анионных пероксидаз оказалось, что в них остаток Glu также образует связь с соседним остатком и эта связь экранирует активный центр фермента аналогичным образом, хотя природа связи может быть другой. Например, в пероксидазе арабидопсиса это ионаая связь Glul43-LyslSl (рис. 8).

Рис. 5. Расположение молекул ТОР в кристаллической ячейке

Рис. 6. Наложение структур ТОР: красным - кристаллическая, синим - модельная

Проксимальный 0 е"*

Проксимальный Ос.

Са

Дистальный

Рис. 7. Кристаллическая структура ТОР. Показана ориентация остатков аминокислот активного центра и водородная связь С1п149 -аи141, экранирующая остаток Рго137.

Дистальный

Рис. 8. Кристаллическая структура пероксидазы А.ШаНапа Показана ориентация остатков аминокислот активного центра и связь Ьуэ151 -<31и143, экранирующая остаток Рго139.

II. Получение мутантной формы пероксидазы табака Ыи141Рке

Для изучения роли остатка аи!41 в стабильности и катализе ТОР был получен мутантный фермент с заменой С1и141Рке. Для фермента дикого типа и мутанта рефолдинг проводился в одинаковых условиях (рис. 9). В случае \vt-TOP (кривая 3) выход активного фермента был в 4 раза меньше, чем для мутанта С1и141Рке (кривая 1). Кроме того, в случае мутанта порядок добавления гемина практически не влияет на выход фермента (кривая 2), в то время как для л\1-ТОР добавление гема через сутки (кривая 4) приводит к очень низкому выходу. Это показывает важную роль остатка С?/и 141 в контролировании доступа в гем-связывающую полость фермента. \vt-TOP и ее мутант С1и141Р1ге были получены в гомогенном (рис. 10) виде с помощью очистки методом гель-фильтрации.

М(кОа) 1

!г! 111 ' |'

Дни

Рис. 9. Кинетика рефолдинга \Nt-TOP (3, 4) и ее мутантной формы в1и141РЬе (1, 2)

Рис. 10. ДДС-злеюгрофорез очищенных препаратов ТОР (4 - дикий тип, 6 - мутант)

Таблица 3. Сравнение эффективности реактивации негликозилированной пероксидазы табака с негликозилированной пероксидазой хрена._

Фермент Выход

Пероксидаза табака дикого типа (1 мМ Са2*) 16,8%

Пероксидаза табака дикого типа (5 мМ Са2*) 7,7 %

Мутант ТОР в1и141РГ1е (5 мМ Са2*) 31,5%

Пероксидаза хрена дикого типа 30%

В таблице 3 проведено сравнение выходов реактивации для препаратов негликозилированной \vt-TOP и ее мутанта аи141РИе. Выход мутантной

формы почти такой же, как и в случае негликозилированной рекомбинантной пероксидазы хрена, полученной ранее в нашей лаборатории.

Таким образом, причиной низкого выхода при рефолдинге wt-TOP является именно наличие остатка Glul41 на входе в гем-связывающую полость.

Ш. Изучение субстратной специфичности ферментов

Профиль субстратной специфичности полученных гомогенных препаратов ТОР в сравнении с негликозилированной рекомбинантной HRP представлен в таблице 4.

Таблица 4. Субстратная специфичность негликозилированных пероксидаз табака дикого типа (wt-TOP) и ее мутанта (TOP Glul41Phe) в сравнении с негликозилированной пероксидазой хрена (wt-HRP).

Удельная активность, Е/мг wt-TOP ТОР Glu141Phe wt-HRP

ABTS pH 5 2000 2000 2000

ABTS pH 4,5 4000 2000 2000

Ферроцианид 210 110 g

Иодид 0,5 1,1 110

Гваякол 1550 720 1750

Фенол 26 18 7,5

о-Фенипендиамин 1300 860 460

о-Дианизидин 550 480 520

Вератровый спирт 0,13 0,08 0

Феруловая кислота 400 400 0

л-Кумаровая кислота 180 180 0

Ремазол 140 140 0

Из таблицы 4 видно, что мутация Glul41Phe мало влияет на профиль субстратной специфичности рекомбинантной ТОР. По некоторым ароматическим субстратам активность уменьшилась в 1,5-2 раза, зато обе негликози-лированные формы ТОР были активны с природными субстратами, в то время как HRP такой активности не проявляла. Примечательной особенностью ТОР является то, что она намного более активна по отношению к ферроцианиду, чем HRP. Это является косвенным указанием на более высокий редокс потенциал ТОР, по сравнению с HRP, поскольку при окислении ферроцианида именно редокс потенциал фермента оказывает определяющую роль на общую скорость

реакции. Наличие активности по вератровому спирту также говорит в пользу более высокого редокс потенциала ТОР по сравнению с HRP.

Пероксидаза табака неактивна по отношению к иодиду, окисляемому непосредственно в активном центре. Причиной этого по-видимому является не столько наличие отрицательно-заряженного остатка Glul41, сколько в целом более закрытая конформация активного центра ТОР по сравнению с HRP.

Таким образом, остаток Glul41 и образуемая им водородная связь с остатком Glnl46 играют в молекуле ТОР структурную, а не каталитическую роль.

IV. Изучение окисления фенолов в присутствии ABTS, выполняющего роль медиатора

Большой практический интерес представляет медиаторное окисление фенольных субстратов, которое позволяет преодолевать «стерический барьер» при окислении «термодинамически разрешенных» субстратов. Поскольку пероксидаза табака малоактивна по отношению к фенолам (см. таблицу 4), было изучено их окисление с помощью ABTS в качестве медиатора.

На рис. 11 представлены кинетические кривые окисления ABTS в присутствии различных концентраций фенола. Начальная скорость окисления не изменяется, но концентрация продукта окисления ABTS через какое-то время выходит на стационарное значение, определяемой концентрацией добавленного фенола. Схема 1 описывает неферментативное окисление фенола продуктом ферментативного окисления ABTS.

Схема 1

Е + Н202 —EI + Н20 EI + S ——> ЕИ + Р EII + S —Е + Р

kF V

P + F -> S + Fox

где первые 3 стадии это ферментативное окисление ABTS, а 4 стадия - неферментативное взаимодействие продукта окисления ABTS с фенолом (F - фенол и Fox- продукт его окисления).

1,5

1.0

о 3

о 0,5

0,0 -

200

400 600

Время, сек

Рис. 11. Кинетические кривые окисления ABTS под действием ТОР в присутствии различных концентраций фенола.

Нами была построена математическая модель и выведено уравнение, которое описывает зависимость стационарной концентрации продукта окисления ABTS от концентрации фенола:

Р =_^__(О

(kcai/Ka)[E]0+kF[F]

Упростив его, можно выразить зависимость предельной стационарной концентрации окисленного ABTS от различных концентрации фенола.

к (2) -f4E]0+kAF]

Кт

Уравнение (2) можно линеаризовать следующим образом:

[Р1,Л0) , kFKm[F]

--1 + —--[Е]0 (3)

[Р]ш(П К

cat

Фенол, мкМ

Рис. 12. Линеаризация уравнения (2) в соответствии с уравнением (3)

Из тангенса угла наклона графика на рис. 12 можно рассчитать константу неферментативного взаимодействия окисленного ABTS с фенолом, т.е. kF. Как видно из рис. 12, наблюдаемые зависимости линейны и,

следовательно, экспериментальные данные подчиняются уравнению 3. С помощью такого подхода были определены константы неферментативного взаимодействия окисленного ABTS с фенолом, резорцином и 2-гидрокси-З-метоксибензилом, которые составили 330, 770 и 1600 M'V1 соответственно.

Таким образом, медиаторное окисление можно использовать для окисления «плохих» субстратов пероксидазы табака. Кроме того, с ростом редокс потенциала фенольных субстратов наблюдается тенденция к увеличению константы скорости взаимодействия окисленного медиатора с субстратом.

V. Изучение влияния кальция на кинетические параметры окисления ABTS в присутствии пероксидазы табака дикого типа и ее мутантной формы Glul41Phe

Необычным свойством нативной пероксидазы табака является регуляция стабильности и активности ионами кальция. Поэтому, для проверки предположения о том может ли остаток Glul41 являться одним из лигандов дополнительного кальция, нами была изучена стационарная кинетика окисления ABTS (схема 2) обеими формами пероксидазы табака в присутствии

и отсутствие ионов кальция. Зависимость скорости реакции от концентрации субстратов для этой схемы описывается следующим уравнением: l/v= 1/[Е]0{1 + (1/W[H202]) + (l/£s[S])},

где [Е]0 начальная концентрация фермента, кц202 - константа скорости второго порядка по перекиси водорода, и ks ~ константа скорости второго порядка по субстрату-донору, в данном случае ABTS. Значения констант представлены в таблице 5. Из этой таблицы видно, что величина 202 при увеличении концентрации Са2+ до 50 мМ уменьшается в 2,5 раза в случае фермента дикого типа и в 1,5 раза - в случае мутанта. В обоих случаях величина #abts также уменьшается, но в гораздо меньшей степени.

Таблица 5. Кинетические параметры реакции окисления ABTS, катализируемой рекомбинантной пероксидазой табака в присутствии и отсутствие СаСЬ

Константы скорости wt-TOP TOP Glu141Phe

Без Ca2* 25 мМ Ca2* 50 мМ Ca2* Без Ca2* 25 мМ Ca2* 50 мМ Ca2*

кню2 ХЮ"6. М-'с"1 3,6 ± 0,6 2,1± 0,5 1,4 ±0,4 3,2 ± 0,6 2,4± 0,5 1,9 ±0,4

^abts хЮ"®, М"1с'1 8,2 ± 0,9 7,0 ±0,8 6,0 ±0,7 10,1 ±0,9 8,5 ±0,8 6,9 ± 0,7

Для более наглядного примера на рис. 13 представлены зависимости активности ферментов от концентрации ионов кальция. Видно, что в случае мутанта зависимость частично снимается. Этот же вывод был подтвержден в совместной работе с Лундским университетом (Швеция), куда были переданы препараты ферментов для исследования их свойств при иммобилизации на электродах. На рис. 14 показано изменение силы тока от концентрации кальция, где наблюдается более явное различие в свойствах \vt-TOP и ее мутанта 01и141РИе. Таким образом, было показано, что остаток СЫ141 существенное влияние на взаимодействие ионов кальция с ферментом.

+ Н202

Е » El

Схема 2

Таблица 6. Эффективность прямого переноса электронов (ПЭП) и константы скорости биоэлектрохимического восстановления Н202 рекомбинантной \vt-TOP и ее мутантной формой аи141Р/ге, адсорбированными на графите в присутствии и отсутствии 0,1 М СаСЬ (амперометрический анализ при +50 тУ в проточно-инжекционной ячейке, 0,05 М Иа-ацетатный буфер, рН 5.0).

Форма ТОР % ПЭП к„ с"1 мю5, м~1с1 КзхЮ"*, MV

Дикий тип (без Са2*) 81 ±2 32,9 ± 0,7 3,2 ±0,4 5,5 ± 0,7

Дикий тип (0.1 М Са2*) 65 ±2 17,2 ±0,5 2,8 ±0,3 3,6 ± 0,9

вШ141РЬе (без Са2+) 66 ±5 34,3 ± 0,8 3,4 ± 0,4 5,8 ± 0,3

в!и141РЬе (0 1 М Са2*) 61 ±4 27,4 ± 1,1 3,5 ± 0,2 4,7 ±0,5

TOPWT

О TOP Glu141Phe

CaCl2. мМ

Рис. 13. Зависимость активности с ABTS для wt-TOP и ее мутанта Glu141Phe от концентрации ионов кальция

100 90 £ 80 I 70 60 50

[СаСу.мМ

50

0 20 40 60 80 100

Рис. 14. Зависимость силы тока от концентрации ионов кальция для обеих форм пероксидазы

VI. Изучение стабильности ферментов в условиях радиолиза (имитация инактивации в ходе реакции)

Метод радиоинактивации может быть использован для исследования операционной стабильности ТОР. При у-облучении водного раствора фермента образуется перекись водорода, а также гидрокси-радикал и сольватированный электрон. Поскольку в ходе облучения происходит накопление перекиси водорода (рис. 15), фермент переходит в Соединение II (рис. 16). Как известно, в условиях катализа основной формой пероксидазы является именно Соединение И. Образующиеся в ходе облучения активные радикалы являются аналогами свободно-диффундируемых радикалов, образующихся при окислении субстрата. Ранее для пероксидазы хрена было показано, что инактивация фермента происходит за счет перекиси водорода и за счет свободно диффундируемых радикалов продукта (Капелюх Ю.Л., канд. дисс., 1998, Москва, МГУ). Более наглядное сравнение условий инактивации пероксидазы в ходе реакции и в ходе радиолиза представлено в таблице 7.

Таблица 7. Сравнение состояний ТОР в ходе реакции и при радиолизе.

Основная стационарная форма фермента В ходе реакции При у-облучении

Соединение II (в растворе) Соединение III (на электроде) Соединение II (<120 мин) Соединение III (>120 мин)

Н202 Есть Есть

Активные радикалы ОН* и ag e" PheO*

Обработка и последующая инкубация ТОР в течение 24 часов с перекисью водорода (рис. 17) практически не влияет на активность фермента. Таким образом, в случае ТОР кривые радиоинактивации соответствуют в чистом виде радикальному повреждению Соединения II фермента (рис. 18).

Время облучения, мин Длина волны, нм

Рис. 15. Скорость образования Н202 в Рис. 16. Спектры окисленных Соединений ходе облучения Тпв-буфера. пероксидазы табака.

О 200 400 600

Время облучения, мин

Рис. 17. Инактивация полученных форм пероксидазы табака после обработки Н2Ог и последующей инкубации в течение 24 часов

100 150 200 250 Время облучения, мин

350

I Соединение II

100 150 200 250 Время облучения, мин

2500

2000

1500

1000

100 150 200 250 Время облучения, мин

Рис. 18. Стабильность рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа и Glu141Phe мутанта при облучении радиацией в 50 мМ Трис-HCI буфере Измерения активности по ABTS (А), о-дианизидину (Б) и гваяколу (В). Ф - ферри-форма фермента

Анализ зависимостей на рис. 18 свидетельствует, что:

во-первых, кривые различаются для каждого из выбранных субстратов. Этот факт подтверждает, что скорость лимитирующей

стадией является именно восстановление Соединения II, а не образование Соединения I, иначе кривые радиоинактивации не зависели бы от природы субстрата и совпадали бы.

Во-вторых, хотя мутант проявляет более низкую исходную активность, он не менее стабилен чем фермент дикого типа.

В-третьих, интересно, что самый начальный период, показанный на врезках, когда 350 еще не успевает образоваться Соединение II, отличается очень высокими выбросами по активности. Этот факт указывает на то, что в принципе могут существовать более активные конформации, чем у нативного фермента. Другими словами, возможно получение более активных мутантов.

Таким образом радиоинактивация пероксидазы зготабака представляет собой инактивацию Соединения II под действием атаки радикалов, а замена остатка глутаминовой кислоты на фенилаланин незначительно дестабилизирует фермент.

Vil. Изучение свойств пероксидазы табака дикого типа и ее мутантной формы Glul41Phe в реакции хемилюминесцентного окисления люминола

В заключение было проведено сравнение свойств полученных wt-TOP и ее мутанта Glul41Phe в практически значимой реакции хемилюминесцентного окисления люминола На интенсивность хемилюминесценции влияет ряд параметров, таких как рН, концентрации субстратов и молярность используемого буфера. Поэтому мы изучали влияние этих параметров на интенсивность сигнала в реакции хемилюминесценции. На рис. 19А представлены экспериментальные данные.

Видно, что оба фермента имеют практически одинаковую зависимость активности от рН буфера. В случае мутанта рН-оптимум активности немного смещен в щелочную область. Интересным фактом является то, что по сравнению с нативной пероксидазой табака у негликозилированных форм пероксидазы рН-оптимум уменьшился на 1 единицу (рис.20А).

Н2О2, мМ Трис, мМ

Рис. 19. Влияние рН (А), концентрации люминола (Б), концентрации перекиси водорода (В) и концентрации буфера (Г) на реакцию окисления люминола, катализируемую рекомбинантной пероксидазой табака дикого типа и мутантной формой в1и141РЬв

—•— HRP

о ТОР

—'т— SBP

- -V- РР

6

, мМ

в

100

80

60

10

40

20

20

40 60 Tris, мМ

80

100

Рис. 20. Влияние pH (А), концентрации люминола (Б), концентрации перекиси водорода (В) и концентрации буфера (О на реакцию окисления люминола, катализируемую нативными пероксидазами табака (ТОР), хрена (HRP), сои (SBP) и пальмы (РР).

В случае wt-TOP интервал оптимальных концентраций люминола несколько шире, чем для мутанта. Из литературных данных по другим пероксидазам (рис. 20Б) видно, что каждая пероксидаза характеризуется своим сродством к люминолу.

Влияние перекиси водорода на интенсивность хемилюминесценции показано на рис. 19В. Из этого рисунка видно, что wt-TOP и ее мутантная форма практически не отличаются своей чувствительностью к перекиси водорода, но, по сравнению со всеми нативными пероксидазами (рис.20В), рекомбинантные негликозилированные ферменты оказываются более чувствительны к инактивации перекисью.

На рис. 19Г показаны экспериментальные данные по зависимости интенсивности хемилюминесценции от молярности буфера. Для обеих форм пероксидазы табака зависимости сходные и не слишком сильные, в отличие от нативных пероксидаз сои и пальмы (рис. 20Г), у которых такие зависимости имеют разнонаправленный характер и выражены намного сильнее, чем для негликозилированных форм пероксидазы табака.

10000

и 20 30 40 50 60 " 40 60

ТОР в1и141РЬе, лМ

Время, мин

Рис. 21. Кривые хемилюминесценции для пероксидаз хрена (А), табака дикого типа (Б) и ее мутанта (В), а также соответствующие им калибровочные графики (Г, Д, Е)

Кинетические кривые хемилюминесценции в присутствии различных концентраций негликозилированных пероксидаз хрена и табака показаны на рис.21. При одинаковых концентрациях фермента в 100 пМ интенсивность хемилюминесценции в случае негликозилированной пероксидазы хрена (кривая 7 на рис. 21 А) составляет всего 10 тыс. у.е., в то время как для \vt-TOP и ее мутантной формы она равна 4,5 и 6,5 млн. у.е. соответственно (кривые 6, рис. 21Б и В, соответственно). Таким образом, интенсивность хемилюминес-

ценции в случае пероксидазы табака в 300 раз выше, чем в случае пероксидазы хрена.

Такой высокий выход хемилюминесценции позволяет нам снизить предел обнаружения этих ферментов с помощью хемилюминесцентной реакции. Как известно, предел обнаружения - это сигнал, который должен превышать трехкратное значение фона. В случае всех трех ферментов фоновый сигнал составляет 500 у.е.. Поэтому в случае пероксидазы хрена предел обнаружения составляет 37 пМ, а в случае пероксидаз табака - 0,25 и 0,50 пМ для мутанта и wt-TOP соответственно. Эти данные очень хорошо сопоставимы с данными для нативных пероксидаз табака и хрена, для которых сигнал составляет 0,1 пМ и 1 пМ соответственно.

Таким образом, пероксидаза табака является очень перспективным реагентом для хемилюминесценции.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика получения негликозилированных форм пероксидазы табака. Наработанные препаративные количества фермента были использованы нашими коллегами в Дании для его кристаллизации и расшифровки кристаллической структуры;

2. Получен мутант Glul41Phe пероксидазы табака и проведена его детальная характеристика в сравнении с ферментом дикого типа. Подтверждена роль Glul41 в контролировании входа в активный центр при фолдинге молекулы фермента: введение мутации позволило увеличить выход реактивации с 7 до 30%;

3. Впервые продемонстрирована роль водородной связи Glul41-Glnl49 в стабилизации холоформы кислой пероксидазы при хранении и в ходе реакции. Показано, что мутантный фермент менее чувствителен к регуляции активности ионами кальция и не отличается по стабильности от фермента дикого типа в условиях радиоинактивации;

4. Изучено совместное окисление ABTS и фенолов под действием различных форм пероксидазы табака. Показано, что во всех случаях работает механизм неферментативного взаимодействия окисленного ABTS с фенольным субстратом и рассчитаны соответствующие константы скорости;

5. Детально изучены свойства обеих форм пероксидазы табака в реакции хемилюминесценции. Показано, что рекомбинантная пероксидаза табака не уступает по своей эффективности нативной пероксидазе табака и превосходит на 2 порядка по чувствительности рекомбинантную пероксидазу хрена в реакции усиленной хемилюминесценции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Khushpulian D.M., Fechina V.A., Kazakov S.V., Gazaryan I.G. Non-enzymatic step in mechanism of peroxidase catalyzed substrate-substrate co-oxidation. Abstracts of International Conference Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications. 2002, June 22-27, Moscow, Russian Federation, p. 104.

2. Fechina V.A., Savitski P.A., Rozhkova A.M., Chubar T.A., Khushpulian D.M., Gazaryan I.G.. Tobacco peroxidase cloning in E.coli and refolding to yield active enzyme. Abstracts of International Conference Biocatalysis-2002; Fundamentals & Applications. 2002, June 22-27, Moscow, Russian Federation, p.83.

3. Hushpulian D., Savitski P., Rojkova A., Chubar Т., Fechina V., Sakharov I., Tishkov V., Lagrimini M., Gazaryan I.. Expression and refolding of recombinant tobacco peroxidase from E.coli. Abstracts of the 226th National Meeting of American Chemical Society, #130. Biochemistry, 2003, v.42, № 28, p.8623.

4. Хушпульян Д.М., Фечина B.A., Казаков C.B., Сахаров И.Ю., Газарян И.Г.. Неферментативное взаимодействие продуктов реакции и субстратов в катализе пероксидазой, Биохимия, 2003, т.68, №9, с.1231-1237.

5. Хушпульян Д.М., Савицкий П.А., Рожкова A.M., Чубарь Т.А., Фечина В.А., Сахаров И.Ю., Лагримини Л.М., Тишков В.И., Газарян И.Г.. Экспрессия анионной пероксидазы табака в клетках E.coli и ее рефолдинг из телец включения. Биохимия, 2003, т.68, №11, с.1480 - 1487.

6. Ferapontova, Е.Е., Castillo, J., Hushpulian. D., Tishkov V., Chubar Т., Gazaryan, I., Gorton L. Direct electrochemistry of recombinant tobacco peroxidase on gold. Electrochemistry Communications, 2005, v.7, №12, p.l291-1297.

7. Huspulian D.M., Savitski P.A., Rojkova A.M., Chubar T.A., Poloznikov A.A., Fechina V.A., Uporov I.V., Orlova M.A., Gazaryan I.G., Tishkov V.l. Effect of negative charge removal at the entrance to the heme-binding pocket on properties of recombinant tobacco peroxidase. Abstracts of International Conference Biocatafysis-2005: Fundamentals & Applications. June 19-23, 2005. St.Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russian Federation, p.80.

8. Газарян И.Г., Гортон Л., Рузгас Т., Чореги Э., Шуман В., Лагримини Л.М., Хушпульян Д.М., Тишков В.И. Пероксидаза табака - новый реагент для амперо-метрических биосенсоров. Журнал аналитической химии, 2005, т.60, №6, с.558-566.

9. Castillo J., Ferapontova Е., Hushpulian D., Tasca F., Tishkov V., Chubar Т., Gazaryan I., Gorton L. Direct electrochemistry and bioelectrocatalysis of H202 reduction of recombinant tobacco peroxidase on graphite. Effect of peroxidase single-point mutation on Ca2+-modulated catalytic activity, Journal of Electroanalytical Chemistry, 2006, v.588, p.l 12-121.

10. Газарян И.Г.. Хушпульян Д.М.. Тишков В.И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений. Успехи биологической химии, 2006. т.46. с.303-322.

11. Gazaryan I.G., Khushpulyan D.M., Poloznikov A.A., Tishkov V.l. Recombinant tobacco peroxidase - new enzyme for biosensors. Abstracts of International Symposium on Environmental Biocatalysis "From Remediation with Enzymes to Novel Green Processes", 2006, April 23-26, Cordoba, Spain, P-12.

12. Husbpulian D.M., Poloznikov A.A., Savitski P.A., Rozhkova A.M., Chubar T.A., Fechina V.A., Orlova M.A., Tishkov V.l., Gazaryan I.G., Lagrimini L.M. Glutamic Acid-141: Heme "Bodyguard" In Anionic Tobacco Peroxidase. Biological Chemistry, 2007, Vol.388, DOI 10.1515/BC.2007, published online December 1, 2006.

Подписано в печать 14.02.2007 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 601 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7 2.1. Структура и каталитический механизм пероксидаз растений

2 1 1 Классификация гем-содержащих пероксидаз и реакционный цикл 7 2 1.2 Структура пероксидаз и механизм расщепления пероксида водорода

2.1.3. Структурные и каталитические особенности нативной пероксидазы табака

2.1.4. Проблема субстратной специфичности пероксидаз 18 2 1.4.1. Субстрат-связывающий центр лигнинпероксидазы 19 2.1.4 2 Субстрат-связывающие центры пероксидазы хрена

2.1.5. Роль кальция в структуре и активности пероксидаз

2.1.6. Инактивация пероксидазы пероксидом водорода 28 2 2. Методы получения рекомбинантных пероксидаз

2.2 1. Экспрессия в растениях

2.2.2. Экспрессия в дрожжах и грибах

2.2.3. Экспрессия в Е coli

2 3. Механизм окисления люминола под действием пероксидаз

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы

3.2. Методы исследования 37 3 2.1. Клонирование гена пероксидазы табака

3.2.2. Направленный мутагенез пероксидазы табака

3.2.3. Экспрессия пероксидазы табака в клетках Е coli

3.2.4. Выделение пероксидазы табака

3.2.5. Рефолдинг пероксидазы табака 38 3 2 6 Очистка пероксидазы табака

3.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-электрофорез)

3.2.8. Определение молекулярной массы пероксидаз 40 3 2.9 Спектрофотометрическое определение активности пероксидаз

3.2.10. Расчет констант скорости по данным стационарной кинетики

3.2.11. Совместное окисление фенола и резорцина

3.2.12. Совместное окисление 23НМ и 34НМ

3 2 13. Радиоинактивация пероксидаз 42 3.2.14. Определение концентрации пероксида водорода в ходе радиолиза 43 3.2.14. Реакция окисления люминола

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Рефолдинг рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа

4 1.1. Оптимизация экспрессии и рефолдинга по активности 44 4 1.2 Наработка препаративных количеств фермента дикого типа 47 4 1.3. Особенности кристаллической структуры пероксидазы табака

4.2. Получение мутанта рекомбинантной пероксидазы табака Glul41Phe

4.2.1. Сравнение выходов при рефолдинге ферментов дикого типа и мутанта

4.2.2. Очистка рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа и мутанта

4.3. Сравнение свойств ферментов дикого типа и мутанта

4.3.1. Субстратная специфичность

4.3.2. Влияние катионов кальция на окисление ABTS и электрохимические свойства

4.3.3. Стабильность водных растворов ферментов в условиях радиолиза

4.3.4. Люминесцентные свойства ферментов

4.4. Механизм совместного окисления фенолов и ABTS под действием пероксидазы табака

4.4.1. Окисление фенола и резорцина

4.4.2. Окисление 23НМ и 34НМ

5. ВЫВОДЫ

Усовершенствование старых и разработка новых вариантов ферментативного анализа для целей здравоохранения и охраны окружающей среды является одним из важнейших и перспективных направлений современной биотехнологии, поскольку именно ферментативные методы обеспечивают высокочувствительное и селективное определение физиологически активных веществ. Поэтому поиск, получение и характеристика новых ферментов для аналитической биотехнологии является актуальной задачей

В нашей лаборатории в 90-е годы был проведен скрининг низших грибов и растений, в результате которого было установлено, что анионная пероксидаза листьев табака (ТОР) значительно более активна в хемилюминесцентной реакции окисления люминола, чем пероксидаза хрена (НИР) [1]. Для получения значительных количеств фермента в 1994-98 проводились совместные работы с проф. Лагримини (Университет Небраски-Линкольна, США), предоставившим трансгенные растения табака и томатов, суперпродуцирующих ТОР [2]. Таким образом, удалось наработать значительные количества фермента и провести изучение его каталитических свойств [3-5].

Фермент действительно является лучшим катализатором окисления люминола и не требует добавления усилителей хемилюминесценции благодаря высокой активности Соединения II [1]. ТОР из трансгенных растений табака в условиях люминесцентного ИФА показала себя на порядок лучше по активности по сравнению с НЯР, что явилось отражением большей стабильности фермента при модификации пероксидом водорода при рН 9,5 [6], [7] Таким образом, для целей люминесцентного ИФА новая пероксидаза представляет несомненный практический интерес.

В дополнение к необычно высокой стабильности Соединения I, что отличает пероксидазу табака от всех остальных пероксидаз растений, фермент показал необычную регуляцию спектральных и каталитических свойств под действием катионов кальция [3]. В присутствии 100 мМ Са2+ фермент способен катализировать окисление вератрового спирта с рН-оптимумом 1,8 [3].

Структурная модель фермента была получена к.ф.-м.н. Упоровым И.В. методом гомологичного моделирования на основании кристаллической структуры пероксидазы хрена и аминокислотной последовательности пероксидазы табака. Модель продемонстрировала основное отличие активных центров пероксидазы табака и пероксидаз арахиса и хрена, состоящее в присутствии на входе в активный центр фермента остатка глутаминовой кислоты-141, которая может отвечать за выявленные необычные свойства фермента [8]. Проверка этого предположения потребовала проведения клонирования гена пероксидазы табака и его экспрессии в Ecoli, разработки процедуры рефолдинга фермента дикого типа с последующей кристаллизацией, получения мутантной формы TOP Glul41Phe и сравнения ее каталитических свойств с ферментом дикого типа.

Ген пероксидазы табака был любезно предоставлен проф. Лагримини, конструирование плазмид, экспрессирующих рекомбинантный фермент дикого типа и мутантную форму, было проведено к.х.н. Савицким ПА. и к.х.н. Рожковой A.M.

Задачей настоящей диссертационной работы является:

1) Оптимизация условий экспрессии гена ТОР в клетках Ecoli, рефолдинга фермента из телец включения и очистки рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа с целью ее последующей препаративной наработки и кристаллизации;

2) Оптимизация рефолдинга мутантной формы Glul41Phe пероксидазы табака;

3) Сравнительное изучение субстратной специфичности и стабильности обоих ферментов, в особенности в реакции люминесценции;

4) Изучение стабильности ферментов в условиях радиолиза (имитация инактивации в ходе реакции); л,

5) Изучение влияния ионов Ca на кинетические параметры окисления ABTS;

6) Изучение совместного окисления ABTS и фенолов (фенол, резорцин и т.д) под действием различных форм пероксидазы табака,

Диссертационная работа выполнена в рамках и при финансовой поддержке гранта РФФИ 04-04-48286.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Структура и каталитический механизм пероксидаз растений

5. ВЫВОДЫ

1. Разработана методика получения негликозилированных форм пероксидазы табака Наработанные препаративные количества фермента были использованы нашими коллегами в Дании для его кристаллизации и расшифровки кристаллической структуры.

2. Получен мутант GluMJPhe пероксидазы табака и проведена его детальная характеристика в сравнении с ферментом дикого типа Подтверждена роль Glul41 в контролировании входа в активный центр при фолдинге молекулы фермента введение мутации позволило увеличить выход реактивации с 7 до 30%.

3 Впервые продемонстрирована роль водородной связи Glul41-Glnl49 в стабилизации холоформы кислой пероксидазы при хранении и в ходе реакции. Показано, что мутантный фермент менее чувствителен к регуляции активности ионами кальция и не отличается по стабильности от фермента дикого типа в условиях радиоинактивации.

4 Изучено совместное окисление ABTS и фенолов под действием различных форм пероксидазы табака. Показано, что во всех случаях работает механизм неферментативного взаимодействия окисленного ABTS с фенольным субстратом, и рассчитаны соответствующие константы скорости.

5. Детально изучены свойства обеих форм пероксидазы табака в реакции хемилюминесценции. Показано, что рекомбинантная пероксидаза табака не уступает по своей эффективности нативной пероксидазе табака и превосходит на 2 порядка по чувствительности рекомбинантную пероксидазу хрена в реакции усиленной хемилюминесценции

1. Gazaryan,I.G. and Lagrimini,L M Purification and unusual kinetic properties of a tobacco anionic peroxidase.//Phytochemistry, 1996,41, 1029-34.

2. Gazanan,I G., Lagrimini,L.M., George,S.J. and Thorneley,R.N. Anionic tobacco peroxidase is active at extremely low pH: veratryl alcohol oxidation with a pH optimum of 1 8 // Biochem. J., 1996, 320, 369-72.

3. Gazanan,I G., Lagrimini,L.M., Mellon,F.A., Naldrett,M J., Ashby,G A. and Thorneley,R.N. // Identification of skatolyl hydroperoxide and its role in the peroxidase-catalysed oxidation of indol-3-yl acetic acid. // Biochem. J., 1998,333,223-32.

4. Gazaryan,I.G , Lagrimini,L.M, Ashby,G.A. and Thorneley,R.N. Mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by plant peroxidases: anaerobic stopped-flow spectrophotometric studies on horseradish and tobacco peroxidases. // Biochem. J., 1996,313, 841-7.

5. Dzgoev,A.B, Gazaryan,I.G., Lagrimini,L.M, Ramanathan,K. and Danielsson,B. High-sensitivity assay for pesticide using a peroxidase as chemiluminescent label. // Anal. Chem , 1999, 71, 5258-5261.

6. Surugiu,L, Svitel,J., Ye,L., Haupt,K. and Danielsson,B. Development of a flow injection capillary chemiluminescent ELISA using an imprinted polymer instead of the antibody. //Anal. Chem, 2001, 73,4388-4392.

7. Газарян,ИГ, Упоров,И В, Чубарь,ТА, Фечина,В.А, Мареева,Е.А. and ЛагриминиДМ. Влияние рН на стабильность пероксидазы табака и на ее взаимодействие с пероксидом водорода. // Биохимия, 1998, 63, 708-715.

8. Welinder,K G. Plant peroxidases. Their primary, secondary and tertiary structures, and relation to cytochrome с peroxidase. // Eur. J. Biochem, 1985, 151,497-504.

9. Finzel,B.C, Poulos,TL. and Kraut,J. Crystal structure of yeast cytochrome с peroxidase refined at 1 7-A resolution. // J. Biol. Chem, 1984,259, 13027-36.

10. Patterson,WR and Poulos,T.L. Crystal structure of recombinant pea cytosolic ascorbate peroxidase. // Biochemistry, 1995, 34,4331-41.

11. Piontek,K, Glumoff,T. and Winterhalter,K. Low pH crystal structure of glycosylated lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.5 A resolution. // FEBS Lett, 1993,315, 119-24.

12. Poulos,T.L, Edwards,SL, Wariishi,H. and Gold,M.H. Crystallographic refinement of lignin peroxidase at 2 A. // J. Biol. Chem, 1993,268,4429-40.

13. Sundaramoorthy,M, Kishi,K, Gold,M.H. and Poulos,T.L. The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2 06-A resolution. // J. Biol. Chem , 1994, 269, 32759-67.

14. Petersen,J.F, Kadziola,A. and Larsen,S. Three-dimensional structure of a recombinant peroxidase from Coprinus cinereus at 2.6 A resolution. // FEBS Lett., 1994, 339,291-6

15. Schuller,D.J., Ban,N., Huystee,R.B., McPherson,A. and Poulos,TL. The crystal structure of peanut peroxidase. // Structure, 1996,4,311-21.

16. Gajhede,M, Schuller,D.J., Henriksen,A., Smith,A.T and Poulos,TL. Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 A resolution. // Nat. Struct Biol, 1997, 4, 1032-8.

17. Henriksen,A., Welinder,K.G. and Gajhede,M. Structure of barley grain peroxidase refined at 1 9-A resolution. A plant peroxidase reversibly inactivated at neutral pH. // J. Biol. Chem, 1998, 273,2241-8.

18. Henriksen,A., Mirza,0., Indiani,C., Teilum,K., Smulevich,G, Welinder,K.G. and Gajhede,M Structure of soybean seed coat peroxidase: a plant peroxidase with unusual stability and haem-apoprotein interactions. //Protein Sci., 2001, 10, 108-15.

19. Mirza,0., Hennksen,A., Ostergaard,L, Welinder,K.G. and Gajhede,M. Arabidopsis thaliana peroxidase N: structure of a novel neutral peroxidase. // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 2000, 56, 372-5.

20. Bhattacharyya,D.K., Bandyopadhyay,U. and Banerjee,R.K. Chemical and kinetic evidence for an essential histidine residue in the electron transfer from aromatic donor to horseradish peroxidase compound I. // J. Biol. Chem., 1993, 268, 22292-8.

21. Newmyer,S.L., Sun,J., Loehr,T.M. and Ortiz de Montellano,P.R. Rescue of the horseradish peroxidase His-170~>Ala mutant activity by imidazole: importance of proximal ligand tethering. // Biochemistry, 1996,35,12788-95.

22. Berglund,G.I., Carlsson,G.H., Smith,A.T., Szoke,H., Henriksen,A. and Hajdu,J. The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution. //Nature, 2002, 417,463.8.

23. Newmyer,S.L. and Ortiz de Montellano,P.R. Horseradish peroxidase His-42--> Ala, His-42 --> Val, and Phe-41 --> Ala mutants. Histidine catalysis and control of substrate access to the heme iron. // J. Biol Chem , 1995, 270, 19430-8

24. Newmyer,S.L. and de Montellano,P.R. Rescue of the catalytic activity of an H42A mutant of horseradish peroxidase by exogenous imidazoles. // J. Biol. Chem., 1996, 271, 14891-6.

25. Savenkova,M I, Newmyer,S.L. and Montellano,P.R. Rescue of His-42 --> Ala horseradish peroxidase by a Phe-41 --> His mutation. Engineering of a surrogate catalytic histidine //J Biol Chem , 1996, 271, 24598-603.

26. Tanaka,M, Ishimori,K., Mukai,M., Kitagawa,T. and Morishima,I. Catalytic activities and structural properties of horseradish peroxidase distal His42 --> Glu or Gin mutant. // Biochemistry, 1997, 36, 9889-98.

27. Tanaka,M., Nagano,S., Ishimori,K. and Morishima,I. Hydrogen bond network in the distal site of peroxidases: spectroscopic properties of Asn70 --> Asp horseradish peroxidase mutant //Biochemistry, 1997, 36, 9791-8.

28. Nagano,S., Tanaka,M., Watanabe,Y. and Morishima,I. Putative hydrogen bond network in the heme distal site of horseradish peroxidase. // Biochem Biophys. Res. Commun , 1995, 207, 417-23.

29. Nagano,S., Tanaka,M., Ishimori,K, Watanabe,Y. and Morishima,I. Catalytic roles of the distal site asparagine-histidine couple in peroxidases. // Biochemistry, 1996, 35, 14251-8

30. Rodriguez-Lopez,J N., Smith,A.T. and Thorneley,R.N. Role of arginine 38 in horseradish peroxidase. A critical residue for substrate binding and catalysis. // J. Biol. Chem., 1996,271,4023-30.

31. Rodriguez-Lopez,J.N., Smith,A.T. and Thorneley,R.N. Effect of distal cavity mutations on the binding and activation of oxygen by ferrous horseradish peroxidase. //

32. J. Biol. Chem, 1997,272, 389-95.

33. Henriksen,A, Smith,A.T. and Gajhede,M. The structures of the horseradish peroxidase C-ferulic acid complex and the ternary complex with cyanide suggest how peroxidases oxidize small phenolic substrates. // J. Biol. Chem , 1999, 274, 35005-11.

34. Farhangrazi,Z.S, Copeland,B.R, Nakayama,T, Amachi,T, Yamazaki,I. and Powers,L S Oxidation-reduction properties of Compound I and II of Arthromyces ramosus peroxidase // Biochemistry, 1994,33, 5647-5652.

35. Мареева,ЕА. Выделение и свойства пероксидазы табака из трансгенных растений. // Дисс.к х.н., 2002, МГУ, 110 с.

36. Tanaka,M., Ishimori,K. and Morishima,I. Structural roles of the highly conserved glu residue in the heme distal site of peroxidases. // Biochemistry, 1998, 37, 2629-38.

37. Doyle,W.A., Blodig,W., Veitch,N.C., Piontek,K. and Smith,A.T. Two substrate interaction sites in lignin peroxidase revealed by site-directed mutagenesis. // Biochemistry, 1998, 37, 15097-105.

38. Timofeevski,S.L , Nie,G., Reading,N.S. and Aust,S D. Addition of veratryl alcohol oxidase activity to manganese peroxidase by site-directed mutagenesis. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 256, 500-4.

39. Blodig,W., Doyle,W.A., Smith,A.T., Winterhalter,K., Choinowski,T. and Piontek,K. Autocatalytic formation of a hydroxy group at С beta of trpl71 in lignin peroxidase. // Biochemistry, 1998, 37, 8832-8.

40. Khindaria,A , Yamazaki,I. and Aust,S.D. Stabilization of the veratryl alcohol cation radical by lignin peroxidase. // Biochemistry, 1996, 35, 6418-24.

41. Sundaramoorthy,M, Kishi,K, Gold,M.H. and Poulos,T.L. Crystal structures of substrate binding site mutants of manganese peroxidase. // J. Biol. Chem., 1997, 272,17574-80.

42. Kishi,K, Kusters-van Someren,M., Mayfield,M.B., Sun,J., Loehr,T.M. and Gold,MH Characterization of manganese(II) binding site mutants of manganese peroxidase //Biochemistry, 1996, 35, 8986-94.

43. Kishi,K, Hildebrand,D.P., Kusters-van Someren,M., Gettemy,J., Mauk,A.G. and Gold,MH Site-directed mutations at phenylalanine-190 of manganese peroxidase: effects on stability, function, and coordination. // Biochemistry, 1997, 36,4268-77.

44. Kusters-van Someren,M., Kishi,K., Lundell,T. and Gold,M.H. The manganese binding site of manganese peroxidase: characterization of an Aspl79Asn site-directed mutant protein //Biochemistry, 1995,34, 10620-7.

45. Harris,R Z , Newmyer,S L and Ortiz de Montellano,P.R Horseradish peroxidase-catalyzed two-electron oxidations. Oxidation of iodide, thioanisoles, and phenols at distinct sites // J. Biol Chem , 1993, 268,1637-45.

46. Meunier,B, Rodriguez-Lopez,J.N., Smith,A.T., Thorneley,R.N. and Rich,P.R. Redox- and anion-linked protonation sites in horseradish peroxidase: analysis of distal haempocket mutants //Biochem J., 1998, 330, 303-9.

47. Gilfoyle,D J., Rodriguez-Lopez,J.N. and Smith,A.T. Probing the aromatic-donor-binding site of horseradish peroxidase using site-directed mutagenesis and the suicide substratephenylhydrazine. //Eur J. Biochem., 1996, 236, 714-22.

48. Henriksen,A., Schuller,D.J., Meno,K., Welinder,K.G., Smith,A.T. and Gajhede,M. Structural interactions between horseradish peroxidase C and the substrate benzhydroxamic acid determined by X-ray crystallography. // Biochemistry, 1998, 37, 8054-60.

49. Henriksen,A, Schuller,D.J, Meno,K., Welinder,K.G., Smith,A.T. and Gajhede,M. Structural interactions between horseradish peroxidase C and the substrate benzhydroxamic acid determined by X-ray crystallography. // Biochemistry, 1998, 37, 8054-8060.

50. Gazaryan,I.G., Klyachko,N.L., Dulkis,Y.K, Ouporov,I.V. and Levashov,A.V. Formation and properties of dimeric recombinant horseradish peroxidase in a system of reversed micelles. // Biochem. J., 1997, 328, 643-7.

51. Gazaryan,I G., Doseeva,V.V., Galkin,A.G. and Tishkov,V.I. Effect of single-point mutations Phe41->His and Phel43-->Glu on folding and catalytic properties of recombinant horseradish peroxidase expressed in E. coll. // FEBS Lett, 1994, 354, 24850

52. Rodriguez-Lopez,J.N., Gilabert,M.A., Tudela,J., Thorneley,R.N. and Garcia-Canovas,F. Reactivity of horseradish peroxidase compound II toward substrates: kinetic evidence for a two-step mechanism. // Biochemistry, 2000, 39, 13201-9.

53. Dunford,HB. and Adeniran,A.J. Hammett rho sigma correlation for reactions of horseradish peroxidase compound II with phenols. // Arch. Biochem. Biophys., 1986, 251,536-42.

54. Van Haandel,M.J., Claassens,M.M., Van der Hout,N., Boersma,M.G, Vervoort,J. and Rietjens,I.M. Differential substrate behaviour of phenol and aniline derivatives during conversion by horseradish peroxidase // Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1435,22.9.

55. Folkes,L.K. and Candeias,L.P. Interpretation of the reactivity of peroxidase compounds I and II with phenols by the Marcus equation. // FEBS Lett., 1997,412,305.8.

56. Haschke,R.H. and FriedhoffJ.M. Calcium-related properties of horseradish peroxidase //Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, 80, 1039-42

57. Ogawa,S., Shiro,Y. and Morishima,I. Calcium binding by horseradish peroxidase С and the heme environmental structure. // Biochem. Biophys. Res Commun., 1979, 90, 674-8.

58. Shiro,Y., Kurono,M. and Morishima,I. Presence of endogenous calcium ion and its functional and structural regulation in horseradish peroxidase // J. Biol. Chem., 1986, 261,9382-90.

59. Howes,B.D., Feis,A., Raimondi,L., Indiani,C. and Smulevich,G. The critical role of the proximal calcium ion in the structural properties of horseradish peroxidase. // J. Biol. Chem., 2001,276, 40704-11.

60. Wright,P.J. and English,A.M. Buffer-anion-dependent Ca2+ leaching from horseradish peroxidase at low pH. // J. Biol. Inorg. Chem., 2001, 6, 348-58.

61. Van Huystee,RB., Xu,Y. and 0'Donnel,J.P. Variation in Soret band absorption of peroxidase due to calcium // Plant Physiology & Biochemistry, 1992, 30, 293-297.

62. Nie,G., Reading,N.S. and Aust,S.D. Relative stability of recombinant versus native peroxidases from Phanerochaete chrysosporium. // Arch. Biochem. Biophys., 1999, 365, 328-34.

63. Timofeevski,S.L. and Aust,S.D. Kinetics of calcium release from manganese peroxidase during thermal inactivation. // Arch. Biochem. Biophys., 1997, 342, 169-75.

64. Reading,N.S. and Aust,S.D. Engineering a disulfide bond in recombinant manganese peroxidase results in increased thermostability. // Biotechnol. Prog., 2000, 16, 326-33.

65. Arnao,M.B., Acosta,M., del Rio,LA., Varon,R. and Garcia-Canovas,F. A kinetic study on the suicide inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide. // Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1041,43-47.

66. Arnao,M.B., Acosta,M., del Rio,J.A. and arcia-Canovas,F. Inactivation of peroxidase by hudrogen peroxide and its protection by a reductant agent. // Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1038, 85-89.

67. Газарян,И.Г., Гортон,Л., Рузгас,Т, Чореги,Э., Шуман,В., Лагримини,Л.М, Хушпульян,Д.М. and Тишков,В.И. Пероксидаза табака новый реагент для амперометрических биосенсоров. // Журнал Аналитической Химии, 2005, 60,629.638.

68. Cherry,J.R., Lamsa,M.H., Schneider,Р, Vind,J., Svendsen,A., Jones,A. and Pedersen,A.H. Directed evolution of a fungal peroxidase. // Nat Biotechnol., 1999, 17,379.84.

69. Teilum,K, Ostergaard,L. and Welinder,K.G, Disulfide Bond Formation and Folding of Plant Peroxidases Expressed as Inclusion Body Protein in E coli Thioredoxin Reductase Negative Strains. // Protein Expression and Purification, 1999, 15, 77-82.

70. Zhanglin,L, Thorsen,T and Arnold,F.H. Functional Expression of Horseradish Peroxidase in E. coli by Directed Evolution. // Biotechnol. Prog., 1999, 15,467-471.

71. Березин,И В, Угарова,Н.Н. and Кершенгольц,Б.М. Определение константы равновесия для нативной пероксидазы хрена и ее апо-фермента. // Биохимия, 1974, 214,701-704.

72. Kalb,V.F. and Bernlohr,R.W. A new spectrophotometric assy for protein in cell extracts // Analyt. Biochem., 1977, 82, 362-371.

73. Bradford,M M A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Analyt Biochem, 1976, 72,248.254

74. Childs,R E and Bardsley,W.G. A steady-state kinetics of peroxidase with 2,2'-azino-di(3-ethyl-benzthiazoline-6-sullfonic acid) as choromogen. // Biochem. J., 1975,145,93.103.

75. Hosoya,T. Turnip peroxidase. II The reaction mechanisms of turnip peroxidase Al, A2 and D. // J. Biochem., 1960, 47, 794-803.

76. Gallati,H. Enzyme-immunological tests: determination of the activity of peroxidase with the aid of the Trinder reagent. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1997,15, 699-703.

77. Hasinoff,F. and Dunford,H.B. Kinetics of the oxidation of ferrocyanide by horseradish peroxidase Compounds I and II. // Biochemistry, 1970, 9, 4930-4939.

78. Bhattacharyya,D.K., Bandyopadhyay,U. and Banerjee,R.K. Chemical and kinetic evidence for an essential histidine in horseradish peroxidase for iodide oxidation. //

79. J. Biol. Chem, 1992, 267, 9800-9804.

80. Лебедева,O.B, Угарова,H H. and Березин,И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена //Биохимия, 1977,42,1372-1379.

81. Gallati,H. and Brodbeck,H. Horseradish peroxidase: kinetic studies and optimization of the activity determination with the substrates H202 and o-phenylenediamine. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem, 1982, 20,221-225.

82. Renganathan,V., Miki,K. and Gold,M.H. Multiple molecular forms of diarylpropane oxygenase, an H202-requiring, lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium. //Arch. Biochem. Biophys., 1985, 241, 304-314.

83. Gazaryan,I G., Ouporov,I.V., Chubar,T.A., Fechina,V.A., Mareeva,E.A. and Lagrimini,L.M. Effect of pH on tobacco anionic peroxidase stability and its interaction with hydrogen peroxide. // Biochemistry (Mosc), 1998, 63,600-6

84. Капелюх,Ю.Л. Кинетика и механизм инактивации пероксидазы в хемилюминесцентной реакции окисления люминола в присутствии производных фенолов // Дисс.к х.н., 1998, МГУ.

85. Kim,B.B., Pisarev,V.V. and Egorov,A.M. A comparative study of peroxidases from horse radish and Arthromyces ramosus as labels in luminol-mediated chemiluminescent assays.//Anal. Biochem., 1991, 199, 1-6.

86. Alpeeva,I.S. and Sakharov,I.Y. Soybean peroxidase-catalyzed oxidation of luminol by hydrogen peroxide. // J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 5784-5788.

87. Gazarian,I.G., Loginov,D.B, Lialulin,A.L. and Shekhovtsova,T.N. Determination of phenols using various peroxidases. // Analytical Letters, 1994,27,2917.

88. Kodun,R.S. and Tien,M. Kinetic Analysis of Lignin Peroxidase: Explanation for the Mediation Phenomena by Veratryl Alcohol. // Biochemistry, 1994, 33, 4225-4230.

89. Koduri,RS. and Tien,M. Oxidation of Guaiacol by Lignin Peroxidase: Role of Veratryl Alcohol. // J. Biol. Chem, 1995,270, 22254-22258.

90. Goodwin,D.C, Aust,S.D. and Grover,T.A. Evidence for veratryl alcohol as a redox mediator in lignin peroxidase-catalyzed oxidation. // Biochemistry, 1995,34, 5060-5065

91. Sheng,D. and Gold,M.H. Oxidative polymerization of ribonuclease A by lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. //Eur. J. Biochem., 1999,626-634.

92. Khindaria,A., Yamazaki,I. and Aust,S.D. Veratryl alcohol oxidation by lignin peroxidase. //Biochemistry, 1995, 34, 16860-16869.

93. Khindaria,A., Nie,G. and Aust,S.D. Detection and characterization of the lignin peroxidase compound II-veratryl alcohol cation radical complex. // Biochemistry, 1997, 36, 14181-5.

94. Candeias,L.P. and Harvey,P. J. Lifetime and reactivity of the veratryl alchol radical cation. //J. Biol. Chem., 1995, 270, 16745-16748.

95. Bourbonnais,R., Leech,D. and Paice,M.G. Electrochemical analysis of the interactions of laccase mediators with lignin. //Biochim Biophys. Acta, 1998, 1379,381.390.