Рекомбинантная пероксидаза хрена, экспрессируемая в E. coli, и ее физико-химические свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

б о.

ДЕК -•

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ШЛ МЛЗ. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

НА ОРАВАХ РУКОПИСИ

досеева енкторяя вилориевна

УДК 577JS.02.-577/213/203

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЕРОКСИДАЗА ХРЕНА, ЭКСПРЕССИРУЕМАЯ В Е.сои, И ЕЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

(02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

москва -1994 Г.

Работа выполнена на кафедре химической этимологи» химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: д. б.н.,' профессор Егоров А.М.

к. х. к., сг. н-с. Газарян. И. Г.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Савицкий А.П.

доктор химических наук Габг.бов А.Г.

Зашита состоится "¿? "^^АТЛ1994 г. в ч. на заседании специализированного 'Ученого совета К Д.053.05.76 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 000958, ГСП-3, Москва, Воробьевы горы, химический факультет МГУ, аудитория 202 кафедры химической этимологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан: "22. " 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

ОРЮАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ДЕЗМУ-:ааь_10£ы. Гсм-содержащие . перохсидазы пре,".стк!лякгг собой семейство ферментов, которые лвнякл-ся объектом многосторонних научных, исследований. Пгроксидаза хрепа - наиболее изученный к широко прямыиемнй фермент из числа п:м-содгрЖ2Ш!1х лероксядаз. Эго глшеопротеин с молехулгрной массой 44 хД, который- содержит 8 олигосахаршных цепей, 4 дисуньфндшых связи, 2 иона хальпия я пеивалентно встроенный гсмик. Из -за сложности структуры перохсидазы ло сих пор отсутствует пространственная модель, построенная по данным РСА. В 1935 г. Вслнйдер, по аналогии с пространственной структурой .ивтохром С пероксодазы, предложила компьютерную модель стереоструктуры молекулы персксидазы хрена.

В поел слана года клонированы и сннтезироБаны гены многих растительных и грибных псрскендаз, что позволило осуществить разработку гомо- и гетерологичньп систем экспрессии этого фермента гас с целью последующего направленного мутагенеза, так и для получения препаративных количестз фермента со стаидартизоЕанньми саойствами.

Пероксидата растений и грибов находят все большее практическое применение в различных областях биотехнологии: ферментатнзном я иммуткинализе, модификыик физиологически активных яещсств, синтезе и деструкции биополимеров, очистке сточных вод и многих других процессах инженерной этимологии. 3 сиви с этим разработка и оптимизация системы экспрессии гена пероккиизы хрена в E-coli является актуальной задачей н ■ представляет теоретический и практический интерес. При эзспрессии пероксидазы в E-coli синтезируется значительное количество дмяихозилиромнного гетсролопхчного нерастворимого белка, как правило, в в яде телец волочения. Поэтому реактивация пероЕсииазм позволит ответить на вопрос о роли различных компонентов структуры в свойствах фермента, в том числе выяснеть роль олигосахаршшых остатков.

Нативный фермент характеризуется мгсгрогстерсгешюстьго, связанной с присутствием различных изоформ, а также частичной, инактивацией в холе мстабояичссигх реакций ¡n vivo. Геииоинхенсрные мегогк позволяют получать гомогенный стаидаргазомнный препарат фермента, что имея важное значение для изучения механизм! его действия.

Создание - эффективной системы экспрессии позволит перейти т. разработке способов направленного изменения свойств пероксидаз, выяснсекю роли отдельных остатков в катализе.

Нам и узязчц кселепакзния, Целью настоящей работы явилась разработка системы экспрессии синтсгическсго пена нзофермента С перокекдазы хрена в E.ccii и получение каталитически активного продукта с последующей характеристикой его физкхо-химических свойств. В связи с поставленной проблемой б работе решаются следующие задачи: '

1. Оптимизировать систему вектор-хозяин, обеспечивающую экспрессию апопероксидазы.

2. Разработать н оптимизировать систему реактивации пероксидазы хрена.

3. Разработать методы очистки рекомбинантной пероксияазы хрена.

4. Изучить свойства рекомбинантной перохеидазы и сравнить их со свойствами нагивной гкрокендазы хрена.

Насигаа_шшшха Разработана и оптимизирована система экспрессии гена пероксидззц хрена в ЕсоЧ. Достигнута полная реактивация пгроксидазы хрена из телец включения и получен гомогенный препарат рекомбинантной перокендазы хрена. Изучены физико-химические свойства рекомбинантного фермента.

Практическая значимость работы. Предложенная система экспрессии гена псроксидазы хрена в E.coli обеспечивает высокий уровень синтеза апобелха пероксидазы в количестве 60-75 мг с 1 л культивируемых клеток. Разработанная процедура реактивации и очистки продукта экспрессии позволяет получать до' 20 мг гомогенной рекомбинатной псроксидазы хрена с ! л E-coli и может быть использована для получения препаративных количеств рекомбинантного фермента. Высокая эффектагиосп. системы экспрессии и реакти&ашш рекомбинантной псроксидазы хрена позволяет получать ее в достаточных количествах для рентгеноструктурного аиализа и других структурных исследований и проводить сайт-спсцифический мутагенез для выяснения механизма действия и направленного изменения свойств.

■ Дшзйалва-ЕаЁаш, Основные результаты работы были представлены на Международном симпозиуме "Lux genes Symposium" (Dawning College, Cambridge, 1991), Международной конференции "Progress in recombinant DNA technology and application" (Potosí, Missouri, USA, 1990), на V конференции Российской Федерации "Новые направленна биотехнологии " (Пушимо, 1990), на 11 Международном симпозиуме "Molecular and Physiological Aspects of Plant Peroxidases" (Lublin. Poland, 1990), на III Международном симпозиуме "Plant Peroxidases Biochemistry and Phisiology" (Elsinore, Denmark, 1993), на VII Международном симпозиуме "Chemiluminesccncc and Bioluminesccnce" (Canada, 1993), на VIII Международном симпозиуме "Biolumincsccnce and Qxmiluminescence" (Cambridge, 1994).

Публикации. По материалам виссергташи опубликовано 8 печатных работ.

С2ьаи_р?£а1Ы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ( главы), экспериментальной части, описыюющей материала и методы исследования, результатов и их обсуждения ( главы), шводоа и списка вотируемой литералы. Работа, изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц. Список литературы ахлгачает ссылки.

МАТЕРИАЛЫ II методы

Гемин, люминал, IPTG, SDS, Трис, 2-мсркагггоэтанол, мочевина, окисленный глугтгион, 3,3'-диаминобешидии, о-феиилещшамин, о-лианизидкн, 4-аминсантипирин, гваякол, ЛБТС, маркеры для SDS-электрофореза фирмы Sigma (США), реактива для 5П8-элекгрофореза фирмы Reanal (Венгрия), багпприптон и дрожжевой экстракт фкрмц Difco (США), рсактиш для изозяектрофокусирования фирмы BioRad (США), Triton XI00, Twcen 20 фирмы Ferai (ФРГ), носители для хроматографии фирмы LKB (Швеция), ген пероксидазы хрена и реактивы для генетической инженерии фирмы Amersham (Великобритания). Остальные реактивы - соли, ы;слоты, перекись водорода - отечественного производства марет осч или чда.

Пероксидаза хрена фирм Sigma, Biozy.uc (США), Biotech (Россия), Биолар (Латвия), перохеидаза культуры клеток люцерны (лаборатория инженерной энзимаюгтш), культуры клеток арахиса (любезно предоставлена проф. Р-Н. юн Хьюсти, университет Западного Онтарио, Лондон, Канада), перохеидаза оболочки семян соезых бобов (фирма Erizymol, США).

Монсклоигшьные мышиные антитела к пероксиаазе хрена получены в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН ст.н.с. Чередниховой Т.В.

Плазмкш pSA233, pSA261 и pSA262 с синтсглческим геном изофермента С пероксидазы хрена (Рис.1) бьщи синтезированы и предоставлены доктором С.А. Орглеппом (Amersham International píe).

M столы исследования.

Штаммы F,coli JM103, JM109, HBIOI, TGl выращивались на LB-среде и использовались в гачссп^с основных для трансформации. Трансформированные клетки выргшголи на LB-среде с ампициллином (100 мы/мл). Компетентные клетки и трансформацию осуществляли методом Mandel и Higa.

Эгсперякеиты по солюбишзацин проводили с осадками после разрушения клеточной биомассы ультразвуком.

Белок определяли спсхтро фотометрически mm методом Бредфораа.

Малек>таряук> массу гомогенного фермента и уровень экспрессии определял!! методом SDS-элпсгрофореза.

W*™1 щы/Еютг

Ч

Sphl / mjdeas» SI INdel

SpN Nudíase SI

B- licherjlormfs amyitf! signal sequence

Ndel c=¡>

Рис. 1 Схема конструирования плазмид со вставкой синтетического гена пероксиаазы дрена.

Изоаясэтрофохусирование проводили на приборе Mini Protean П System фирмы BioRad, США, с последующей идентификацией полос окрашиванием по реакции оикясиия диаыинобензидина (0,2 мг/iui) перекисью водорода.

Схорость реаашии окисления спегтрофотомстричыашх субстратов измеряли на спектрофотометрах Shimadzu, Япония; Hitachi, Япония и Vmax , Molecular ' Devices, США. Измерения простой и усиленной хемилюминесцсншш проводились на люминомсграх LXB 1230, Швеция и ML 1000 (микропланшетный), Dynatech.

Содержание rocina в препаратах псроксидазы определяли методом пириаингаакромогена.

Для определен из числа оборотов фермента скорость реакции, измеряемую в условиях насыщения по обоим субстратам и выраженную в мМ/сск, делили на содержание гемина в М, рассчитанное по пиридингемохромогеновому методу. Удельную активность на мг псм-содержашего ферма п-а определяли умножением числа оборотов на концентрацию фермента в М, состеггстпутощую 1 мт/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И НХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ГЕКОМБИНАНТНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА.

Выбор плазиицы. Плазмнаа pSA233 реплицировалась без экспрессии белка поскольку, не содержала никаких промоторов перед нукпеотшшой последовательностью, кодирующей ген перохеидази.

Для плгзмид pSA261 и pSA262 наблюдалась экспрессия рекомбкнантного белка, образующего тельца включения. В случае . плазмилы pSA262, в которой ген перокевдазы содергсал дополнительную последовательность, кодирующую N-концс-ьой сигкаяькый пептид альфа-амилазы Bacillus - licheniformis, можно было $ы' ' ожидать • секреции рекомбииант-ного белка.

ьр -

Siel 9<0 190 Snj3 I -830 Slul 590 tftfel 2500 Hpt I 1SOO-

bp

Mfi/t 1350 ВНЕ II "" Ap.l 1360 Hif I '8i0 350 £coR V <903

Рис. 2 Рестршшионная карта плазмкды pSA261.

Однако секреции не наблюдалось, т.е. использование конструкции с сигнальной последовательностью не давало никаких преимуществ по сравнению с плазмидой pSA261, Еоторая использовалась в дальнейших экспериментах. (Рис.2).

Выбор штамма E-coli. Большая часть рекоыбикантного белка синтезирсиглась в гиде телец включение и обнаруживалась в осюте после разрушения клеток ультразвуком. Наибольший уровень экспрессии регомбннантного бслха алопсроксилазы был отмечен для трансформатов Ecoli JM 109/pSA261 (выше 209& от общего белка), минимальный - для Bcoli JM 103/pSA261 - 2%. Уровень зкспрсссин в Ecoli НВ101 и TG1 составлял свыше 10%. Полученные

данные указывают на зависимость уровня экспрессии от штамма хозяина. Для дальнейшей работы бьши выбраны два штамма; JMJ09 - как наиболее пропустивши, и TG1. который в. .течение двухлетнего перессвания давал воспроизвошмый уровень экспрессии. II то время как при использовании штамма JM 109 кажшй раз бьшо необходимо проводить трансформацию заново.

'Принимая во внимание литературные данные.'* полученные при низкотемпературной экспрессии функционально-активных белков - гемоглобина, иммуноглобулинов - бьшо изучено влияние температуры на экспрессию пероксидазы хрена в дижазоне от 22°С до 30°С. В этом случае рост трансформированных клеток E.coS осуществляли в присутствии гемина (40 мг/л), а индукцию при различных температурах ниже 37°С. Предполагается, что при этом скорость синтеза гетеролегичшго белка сравнима со скоростью его сборки в функционально-активную ксиформацию. Низкотемпературная экспрессия была исследована в диапазоне температур индукции от 22°С ло 30°С. Наибольший выход был получен при 28°С: to фракции растворимых внутриклеточных белков содержание белка апоперокешазы хрена составляло 3-5% от общего белка, а пероксилззная активность в супернатанте после разрушения клеток ультразвуком составляла 1,5 Е/мл, что в 3-4 раза превышает фоновую реакцию собственно гемина. При этом удельная активность полученных препаратов была довольно низкой по сравнению с нативным ферментом, что требовало проведения последующей процедуры рефалдиига. По-видимому, это обусловлено кж низким выходом при реактивации, так и наличием большого количества примесных белков, удаление которых представляет сложную задачу.' Поскольку низкотемпературная экспрессия не дает явных преимуществ для получения активного рекомбинантного фермента, дальнейшие работы проводились по оптимизации процесса солюбилизации и активации рехомбинантной пероксидазы хрена, синтезируемой в виде телец включения.

3. :

Осадки после разрушения Е.соИ ЛИ 109/р5А2б1 были использованы в экспериментах по солюбилизации белка пероксидазы (Рис.3). Максимальная растворимость была получена при использовании 8 М мочевины в присутствии меркаптоэтанола, который дополнительно увеличивал солюбилизируюшее действие мочевины.

Поверхностноактавные вещества и 2 М ЫаС1 не солюбилизировали рекомбинатный белох. Однахо, обработка хлористым натрием приводила к

солюбилизацин примесных белков £сой, способствуя очисти телец включения, ' содержащих .рекомби-нантный белок. Это наблюдение позволило в дальнейшем использовать обработку 2 М №С1 в присутствии 10 мМ дитиеггреитола в качестве стадии очистки рекомби-кантного белка: после разрушения ультразвуком осадок инкубировали в вышеуказанных условиях в течение 2 часов при комигтной температуре при непрерывном помешиЕанин для

удаления белков ЕсоП из телец Рис. 3 Солюбнлизация рекомбилантной включения. После чего осадок пероксидазы хрена, экспрессвруемой в промывали буфером и солюбшш- Е.соИ ЛМ ЮЭ/рЭА 261. Инкубация в зировали в 8 М мочевине. Чистота течетше 30 мин. в присутствии 8 М солюбилнзировгкного белка состав- мочевины (а), 2% 2-меркаптозтанола (б) ляла до 90%. Выход апобсяка с 1 л и га смеси (в), маркеры (г), инкубация в культивируемых клеток Е.сс1 г7рБА261 присутствии смеси 5% Тритона и 2% 2-составлял 60-75 мг. меркаптоэгпжола (д) и (е) - в присутствии

2М№С1.

4. Оптим»2зття процелуры рефгшяит-з. _ ...

. За основу процедуры реактивзаии рекомбинантной псроксилазы хрена была взята методика А. Смита, по которой рефоддинг белка проводился в Ееиатурируюших окислительных условиях (окисленный гаугатион в присутствии 1,5 М мочевины). Била проведена оптимизация условий рсфолдинга, которая позволила многократно увслич!ггь выход активного фермента. Основное внимание было уделено следукзшим факторам - рН срсды, концентрации я порядку добавления гемнна, ионов кальция, окисленного глугатиона, а также времени инкубации беяка в рефолдинг-срсдс.

В нашем случае оптимизация среды для рсфолдинга привела к другим условиям, чем в работе А.Смнта, что позеолнпо значительно увеличить выход активного фермента. На Рнс.4 представлены данные по кинетике появления перокекдазной активности при различных значениях рН среды, а на Рис.5 показана рН-загисимосгь эффективности рсфолдинга. Из представленных данных следует, что оптимальным значением рН рсфсяяинг-среды является рН 9.8. и время

о ^

е • / *

V

/

10 1Z

рН

Рис. 4 Кшетика рефолдтсга реяомби- Рис. 5 рН-зависилюсть эффективности нантиой сероксидазы хрена при рефолдинга рекомбннантной пероксп-различных значениях рН среды: дазы хрена,

(с). 8,1; («4 -9,0; (7) -10,4.

для досгихсиая максимальной активности составляет zas минимум двое суток.

Бьшо изучено влияние глицерина, хлорида и сульфата натрия, нитрата калия и повсрхяосгао-ахтивных веществ на суммарный выход по активности при проведении рефолдиага. • Показано, что добавление 5-10% "глицерина увеличивает выход на 70%, а присутствие в среда для рефолдинга 0,05 М нитрата калия способствуй- увеличению выхода на'5-105Ь.

Сост® среды был оптимизирован по концентрации ионов кальция, которые являются вагегральной частью белка. Их избыток - выше 25 мМ - приводил к уменьшении выхода при реактивации и увеличению массы осадка, представляющего собой денатурированную гомогенную апопсроксидазу. В отсутствие ионов кальция в рсфолдинг-срое перокейяазная активность не наблюдалась. По-видимому, ионы •кальция необходимы длл формирована структуры рекомбинантного алсбелка, способной (сспьезть пекин и, таким образом, способствуют ассоциации гемина и апоперохигззд.

В зюясриментах по рефолдиигу было отмечено, что формирование правильных S-S связей является ключевым моментом в укладке белковой глобулы. Отсутствие i среве для рефолдинга окисленного глутатиона, который способствует образованна днеульфкдшле связей, приводило к резкому палению выхода активной рскомбинаятной пероксидазы и увеличению времени появления перокендазнай активности.

O JO

40

Для выявления роли А,Е/мл гемина в упаковке молекулы перокскяазы было проведено сравнение эффективности рефолдикга в отсуствкс и присутствия гемина. Подученные, денные сгашстельствутсгг о • том, то гсиии встраивается в молекулу пероссидазы ' "в последнюю очередь. Более того, добгвление гемина после рефолдикга псроксидазы позволяет вдвое повысить выход аетивного фермента. (Рис.б) Это объясняется способностью гемина катализировать окисление сульфгндрильных групп кислородом воздуха н тем самым ускорять образование дисульфидных связей, в том числе и ошибочных.

. . Критическим , моментом j. проведении рсфолдинга является концентрация солюбилизированного апобели. При 10-кратном разбавлении 30 мл 0,6 мг/мл раствора ¡шобелка в 8 М мочевине я 1С0 мл рефачдинг-срсды происходит выпадение в осадок охолэ 3 мг белка (по данным SDS-элскгрофорсза). Таким образом, растворимость рекомбииаятного апобелха в 2 М мочевине состаымег не белее 0.03 мг/мл. Однако, для проведения рефоляинга такая концентр гния является все еше очень высокой. Наибольший выход активного фермента был получен при концентрации солюбилизировакного ал обели равной 0.01 мг/мл.

Выход расомбннангной перошшазы по аггивности в оптимизированных условиях составлял 13 200 Е с 1 л рсфсядинг-среды с удельной активностью фермента около 1200 Е/мг (субстрат АБТС). С учетом удельной активности гомогенного рехомбинанткого фермента, рамой 3500-4000 Е/мг это означает, что выход при проведении рефащтнга составляет около 30% в расчете, на растворенный гпобслег- Таким образом, оптимизация процесса рефоляинга привела г 10-кратному увеличению эффективности процесса реактивации фермента по сравнению с ранее полученными данными.

60 70 С,ч.

Рис. б Эффективность реактивации рекомби-яаятион пероксидазы хрена в зависимости от порядка добавления гемина: (*) - до рефолдикга (о) - после рефоляинга. Концентрация фермента - 1,5х 10'7 М.

5. Разработка методов очистки рекпмВтдигной псроксидазы хрена.

В рсзртьтате стадий рсфолдинга только часть рскоибиналпюго белка переходго в активную форму фермента (около 30%). Кроне того, белок находится в разбавлеввом состоянии в присутствии сложной по составу рефолдннг-среды. Для концентрирования образцов рекомбинантной псроксидазы с целью последующей очистхи применялась лиофилизация или осаждение сульфатом аммония. 20% насыщение сульфатом аммония ведет г осаждению нереахтивированного апобелка. Активный фермент осаждается при 60-80% от насышения. Проведение лиофишшции было предпочтительно при концентрировании образцов объемом до 1 л. При больших объемах концентрирование проводилось осаждением сульфатом аммония. В этом случае падения суммарной активности не наблюдалось, и практичесхи весь активный белок переходил в осадок.

Последующая очистка препаратов лероксидазы после рсфолдинга и осаждения сульфатом аммония проводилась по различным схемам, приведенным в Таблице 1.

Гель-фильтрация на колонке (2,6x90 см) с носителем Тоуореаг1 ШУ 55Р, уравновешенным 0,1 М Трис-НС1 буфером, рН 8,0, приводила к получению препаратов реактивированной псроксидазы с максимальной удельной активностью 4000 Е/мг по субстрату АБТС (средняя удельная активность составляла до 2500 Е/мг). Фермент выходил в объеме 20 мя при нанесении объема 3 мл. При использовании и л колонки (5,2x70 см) объем наносимой пробы можно увеличить ао 15 мл, ври этом фермент злюировал в 30-40 мл при той же степени очистки. В целом, учитывая необходимость лимитирования объема наносимого образца фермента при гель-фильтрации, при масштабировании процесса очистки рекомбинантной псроксидазы эта стадия должна быть заменена.

Для дальнейшей очистки рекомбинантной псроксидазы была использована ионообмешш хроматография на системе Я?ЬС с носителем Мопой. Препараты рекомбишштной псроксидазы после гель-фильтрации и диализа против 0,02 М На-ацетатного буфера. рН 4,3, наносили на колонку, уравновешенную тем же буфером. ' Фермент авизировали линейным градиентом 0,43 М ИаС1. Удельная активность рекомбинантной псроксидазы хрена после хроматснрафической очистки на ЯРЬС составляла 3600 Е/мг. При использовании нелинейного градиента удавалось получать фракции с удельной активностью до 4000 Е/мг.

Поскольку иммунсафиниая хроматография является эффективным и высокоспецефкчным методом очистки белков, се использование позволило получить ■ гомогенный препарат рекомбинантной псроксидазы хрена с удельной ахгивностью около 4000 Е/мг. В качестве иммуносорбента использовали моноклональные антитела 90 и 9Р к пероксидазе хрена, иммобилизованные на активированной СН-

Таблица 1. Сравнение различных вариантов схем очистки рекомбинантной псроксщазы после проведения ргфолдинпи

Метод очястеи Суг.марная активность, Е Суммарный белок, мг Удельная активн., Е/мг Выход , %

Исх. препарат после осаждения сульфатом аммония 1000 0,83 1200 100

1 .Гель-фильтрация 960 0,38 2500 , 96

Ионообменная хроматография 720 0.2 ЗбОО 75

2.Гель-фияьтрация 960 0,38 2500 96

Иммуноафинная хроматография 670 0,17 4000 70

3.Иммуноафинная хроматография 850 0.27 ' 3200 85

Иммуноафинная хроматография 680 0.17 4000 80

сефгрозс. Антитела типа 90 позволяют разделить ало- и холофермент, что было подтверждено нстодом аналитического изоалехтрофокусирования.

Таким образом, все использованные схемы очистки дают один и тот же результат - гомогенную рехомбинантную пероксидазу хрена с удельной активностью порядка 4000 Е/мг.

Разработанная система экспрессии в ЕсоИ позволяет получать каталитически более активный препарат пероксидазы, чем нативный фермент в-количесгвс 20 мг с I л культуры Е-соИ.

СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА.

1. Физикг>-)Лтч;гчк-*и- свойства препаратов иативной и рекомрииантнпй

перо^стппды туета, ■ Полученный фериет- с удельной активностью около 4000 Е/мг (по субстрату АБТС) был гомогенным по данным БОЗ-элсхтрофореза и ВЭЖХ (Рис.7,8) и показыва присутствие трех основных полос в изоэлсктро фокусировании (Рис.9).

Для белков сложного строения (наличие простетячесия групп, ионов металлов) феномен поли-, морфизма при трансляции с одного гена в Ecoli не является уникальным и описан для многих ферментов. Можно полагать, что причиной существования нескольких ' изоформ как для нативного препарата перокекдазы хрена, так и для регомби-нантного фермента, может быть наличие набора активных кон-формаций перокекдазы с разным числом дн сульфидных связей.

A, mV

Jk-

35 кД

0 4 8

10 14 18 20 22 t, Mira.

Рис. 8 Профиль злюини очншетюго препарат рекомбняштюй псроиснаа-1ЫС колонки TSK G5000 SW в 0,05 М К-фосфатном буфере, рН 8,0.

Рис. 7 ЭСЗ-электрофорез препаратов рекомбинантной пероксидазы: (а) - реактивированный фермент в среде для рефолдинга, (б) - после осаждения сульфатом аммония, (в) -после очистки гель-фильтрацией (г) -после иммуноафнкной хроматографии; (д) - солюбилюированные тельца включения; (е) - маркеры.

. - : • Р1 --—10

CE3S3 С2ЕЗ> 'l'llii'tf * * "t'lT"

fefcí'n" 'i CTf^rT*

Рис. 9 Изоалекгрофокусирование препаратов реконбннашнон перокекдазы (в,г) и натнвной пероксидазы хрена фирмы Sigma (а,б).

Однако для регомбннантной псроксидазы наблюдается сдвиг полос огткоагтельно нативного фермекга, что можно обменить посгтрансляционной модификацией в системе экспрессии Есо/1, особенностью которой является сохранение ^-терминального мстионнна при синтезе гстсролопгчного белка и его дальнейшая модификация.

В Таблице , 2 свойства рекомбинантного фермента сравниваются с препаратами нативной псроксидазы хрена различного производства. Из представленных данных следует, что препараты нативной псроксидазы хрена с высокой удельной активностью содержат 20%. избыточного гемина, который, по-видимому, добашяется в процессе производства для предотвращения диссоциативной инактивации фермента. В препаратах пероксидазы фирмы Биолар присутствует определенное количество апофермента, удаление которого предеггвлет собой весьма сложную задачу. Прямое определение содержания гемина в препарате рскомбинантной псроксидазы также свидетельствует о присутствии апофермента. Полное отделение рекомбинантного апофермента позволило бы получить сше более гысокие значения удельной ахтивности (сравнимые с расчетной величиной удельной активности на мг гем-содсржгшего белка).

Таблица 2. Характеристики различных препаратов пероксидазы хрена.

Препарат Уд-акгивн., KZ Сод.гем1Ша, Число Активность,

пероксидаы Е/мг. % оборотов, Е на мг

* - сек"1 гемсодерЖ.

белка

Biotech 2300 3,4 123 1370 2300

Biozyme 2250 3,1 120 1250 2250

Биолар 740 2,1 67 810 1104

Рск.ПХ 4000 3 93 2635 4301

Высокая удельная активность препарата рекомбинантного фермента, реконструированного in vitro, может быть объяснена различными причинами. Во-первых, инактивация пероксидазы связана с действием радикалов окисленного субстрата, образующихся в ходе реакции, которые модифицируют как гемин, так и белковую часть молекулы. Так как препарат иативного фермента, выделенного из растений, на протяжении определенного времени выполнял свои каталитические фуккции.то, слслсвгтельно, ол гачхен содержать какую-то долга инактивированной перокенпазы. Рскомбинантная перокснягза не подвергалась в процессе получения модифицирующему воздействию радикалов окисленного субстрата и ■ поэтому показывает более высокую каталитическую активность. Во-вторых, в

рскомбннантной пероксидазе хрена отсутствует олигосахаридная оболочка, способная изменять хонфигурацию молекулы, в тс;.; числе и хонфигурацию активного центра. В-трстьих, в процессе рефолдинга может образовываться новая коиформация молекулы фермента, имеющая другие свойства.

2- Каталитические свойства и субстратна» специфичность

Каталитические свойства рскомбинантной пероксидазы хрена изучались б реакции усиленной хемилюминесценции - окислении перекисью водорода люминола в присутствии л-иодфенала. рН-зависимосгь интенсивности хсмилюмннсецекцни (Рис.10) имеет тот же профиль, что и для нативного фермента, но с более острым максимумом при рН 8.6. Зависимости интенсивности хемилюминесценции от концентраций субстратов, показанные на Рис.11, имеют максимумы, что, как было

Icra.u.

250

200 г

150 100

L

50 j-

I

О

-50 L

6

Ов

U

с/

ОЭ

V

10

Рис. 10 рН-зависимость усиленной хемклюминссиешши для рекомби-нанггной (о) и иативкой (е) пероксидазы хрена. Реакционная смесь содержит I мМ люминола, 0,3 мМ и-иодфенола. 1 мМ перикиси водорода и ДО"10 М пероксидазы в 0,05 М Трис-НС1 буфере, pH 8,6.

12

pH

показано ранее, связано с ингибироЕанием субстратом. Коэффициент усиления, т.е. соотношение интенсивности хемилюминесценции в отсутствие и в присутствии усилителя (и-иодфеноя), сильно зависит от концентрации фермента и субстратов. Наибольшая величкиа коэффициента усиления, равная 500, совпадает с таковой для нативного фермента. Рекомбиналгный фермент, отличаясь более высокой активностью по отношению к АБТС, также демонстрировал и более высокий сигнал в усиленной хемилюминесценции.

I ,,а.и.

(а)

-о.

О /

/ о О

1 О^

//

■ I

- .-0 о

-1ШН1 (] 1 ООО ^0(11) :1()Ш) ЮГ|1) г,ООП Г,1)01)

I ,а.и.

С1

[Н202],ткМ

(б)

Рис. 11 Зависимость интенсивности усиленной хемилюминесценции для (о) рекомбкиантной и' (») мативной пероксидазы от концентрации:

(а) - перекиси водорода (1 иМ люминала и 0,1 яМ л-иодфенала),

(б) - люминала (1 мМ'перекиси и 0,1 мМ л-иодфенала),

(в) - л-иодфенолз (1 мМ люминола и перекиси).

Концентрация фермеита 10"10 М.

1о1,а.ц.

(В)

250 200 1Г>0 100 50 о

-50

О— / о

0 а 1 ~ о

- 1 е

о

300 250 200 150 100 50 0

-50

-200 0 200 400 600 800 10001200

[1ит].ткМ

-200 0 200 400 600 800 1000 . [Р1Р],ткМ

Сравнение субстратной специфичности иативного и рекомбинантиого фермента было проведено по отношению к целому ряду субстратов (Табл.3). Полученные результаты указывают на определенные отличия в механизме катализа рскомбинаитного фермента по сравнению с к »тисним. Активность рекомбинантного фермента по о-дианизшшну ниже, чем у нзтивного, в то время как агтивности по другим субстратам - выше (по АБТС - в 1 раза выше). Наблюдаемые различия могут бьгть отнесены к изменениям в структуре активного центра, которые, возможно.

Таблица 3. Сравнение субстратной специфичности рскоибкнангной к лдтивмой пероксидазы хрена.

Субстрат Активность, Е/мг гем-содеряс. балка

Нативная ПХ Рекомбинаитая ПХ

. ' АБТС 2250 (100%) 4000 (100%)

Гваякол 190(8,5%) 200(5%)

Фснол-антипииин 700 (31%) 1060 (26,5%)

о-Дианизшшн 3120 (139%) 2790 (70%)

р-Фенилен-днамин 460 (20,5%) 570 (14%)

О 470 (21%) 570 (14%)

связаны хах с изменениями субсграт-связываюшнх центров, так и с изменениями скоростъ-лимитирующей стадии. Только детальные кинетические исследования могут ответить на вопрос о конкретной причине измененной субстратной специфичности рехомбинантного фермента.

4. Стабильность рекомбикз1гтой прроксиплм. . '

Растворы (даже очень разбавленные) реактивированной пероксидазы оказались стабильными при хранении 44°С, в течение года. Однако операционная и термостабильность были несколько ниже, чем у дативной. Используя тот факт, что спад на кривой усиленной хемилюмннесиенции, катализируемой пероксидазой, обусловлен инактивацией фермента в ходе реакции, было проведено сравнительное изучение обоих ферментов в этой реакции. Оптимальные условия проведения реакции одинаковы для натианого и рскомбинаэтного фермента, в этих условиях инактивация пероксидазы описывается кривой первого порядка. Константа скорости инактивации фермента в течение реакции для рекомбинактой пероксидазы хрека (5.74 х 10- мин"1) более чем в иа раза выше, чем для иативного фермента (114 х 10-2 мин"1)(Рис.12). Возможной причиной дестабилизации может быть • отсутствие- олигосахаридкых цепей г регоибинлнтшм белке.

. Тсрмоинакгивация нативной к рекоыбинакгной пероксидазы при ,5б°С описывается кинетихой первого порядка. При этой температуре рекомбинантная

щи

Рис. 12 Спал сигнала хемнлюминесцетти в полулогарифмических, координатах для илтивион .(о) и рекомбинантной (•) пероксидазы хрена.

г.ероксидаза в три раза менее стабильна, чем натиЕная (Рис.13). Одна из существенных _ особенностей механизма перокси-дазвого катализа - образование активных радикалов окисленного субстрата, которые способны атаковать фермент и вызывать его инактивацию. Полученные данные * позволяют говорить о защитной роли "полисахаридной шубы" в нативном ферменте, предохраняющей молег.улу от атаки радикалами субстрата.

10 " 20 30 40 1, мин.

ЫЧ (активность)

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

0 100. 200 300

I, мин.

Рис. 13 Кинетика термоинактивацки при 5б°С и рН 8,0 натгашой (о) и рекомбинантной (с) пероксидазы в полулогарифмических координатах.

При изучении термоинактивации при пониженных значениях рН по сравнению с термоинактивацией при слабощелочных -значениях рН (7,5; 8.0) отмечается все меньшее .расхождение в стабильности рекомбинантного и нативного фермента.. В этом случае констакта инактивации для рекомбинантного фермента составляет 8,3 х 10"5мнн'', что в полтора раза выше, чем для нативной пероксидазы. Для сравнения - константа инактивации рекомбинантного фермента при рН 8,0 и 5б°С в три раза выше по сравнению с нативным .

Методом радиационной инактивации в широком диапазоне доз для нативной пероксидазы хрена било отмечено наличие индукционного периода на дозовых кривых инактивации, появление которого вероятно связано с защитным эффектом полиеахаридных. цепей. При изучении дозовых зависимостей инактивации рекомбинантной пероксидазы никакого индукционного периода не наблюдалось. Существенным отличием дозовых зависимостей инактивации рекомбинантной пероксидазы по сравнению с нативной является наличие плато в областях доз 0,5-3 Гр и 15-90 Гр. Не исключено, что различия в механизмах радиационной инактивации рекомбинантной и нативной пероксидазы обусловлены хонформацией белковой глобулы.

Таблица 4. Стабильность нативной и рекомбинантной пероксидазы хрена

Свойство Нативкзя пгроксидаза Рекомбинантнак пероксидаза

киа, мин"1 2.14 х ¡.О"2 5.74 х 10"2

Цсрмокн- мин"'- 56°С 2 х Ю'3 б х 10"3

Время 1/2 радиолиза, мин., (ПХ1 КЯМ 70 10

Таким образом, сравнение влияния нескольких инактивируюших факторов на нативную и рскомбинантную пероксидазы хрена выявляет уменьшение стабильности последней. ' ■ ■ ■

выводы

1. Разработана и оптимизирована система экспрессии синтетического гена пероксияазы крена з Е.соИ. Выход апобелка псроксидазы составляет 60-75 мг с 1 л культивируемых клеток Е.соИ Д1 109/рЗА2б1.

2. Разработана Процедура рефолдинга и реактивации глобелка рекомбинантной пероссягазы хрена. Исстсяогано влияние различных факторов среды на лроиссс рефолдинга рекомбинантной псроксидазы и оптимизированы его условия. Последовательное проведение стадий рефолдинга и реаггавашш обеспечивают 30%-ный выход активного фермыгта.

3. Предложены различные варианты схем очистки рекомбинантной псроксидазы хрена, позволяющие получать гомогенные препараты белка с удельной активностью 4000 Е'мг (субстрат АБТС).

4. Изучены физико-хииичссхис свойства рекомбинантной пероксидазы хрена (молекулярная масса, изоферментный спектр, операционная и термостабильность, субстратная специфичность, реакция усиленной хсмилюминесценции). Рехомбинактнкй фермент отлетался от наивного-по субстратной специфичности, что отражает изменения в структуре активного центра. Отмечено увеличение числа оборотов фермента (субстрат АБТС) в 1,5 раза по сравнению с коммерческими препаратами натишгай псроксидазы хрена.

5. Проведенй сра^шп-ельное изучение операционной а термостабильностн рехомбинантной и натизной псроксидазы хрена. Существенным отличием рехомбинантного фермента было уменьшение операционной стабильности в два раза, а термостабильностн при 5б°С п 3 раза по сравнению с нативным. Обнаружены различия в процессах радиационной инактивации нативной и рекомбинантной псроксидазы хрена. Вероятно, меньшая стабильность рекомб.чнантногэ фермента связана с отсутствием олигосахарндной оболочки и измененной пространственной структурой молекулы.

Основные результаты диссертации изложены l следующих работах:

1. Газарян- И.Г., Ким Б.Б., Досеева В.В.; Ееревкин А.Н.,- Егоров A.M. -Физико-' химические и каталитические свойства рскомбинантиой пероксидазы. синтезированной в Ecoli.il Докл. Акад. Наук, 1992, N 325 (2), с.397-401.

2. Doseeva V.V., Gazaryan I.G., Kim B.B., Egorov A.M. Ciicmiluminesccnl propeties of native and recombinant horseradish peroxidase produced in EcoliJI Plant Peroxidases. Biochemistry and Physiology/July'10-14 1993, Elsinore, Denmark/: Abstracts - 1993 -N 134.

3. Egorov A.M., Gazaryan I.G., Kim B.B., Doseeva V.V., etc. Horseradish peroxidase isozyme C. A comparative study of native and recombinant enzyme produced by ExoliJ! Annals NY Acad. Sci. - 1994 - V.721 - P.73-82.

4. I.G. Gazaryan. V.V. Doseeva, A.G. GalMn, Yu.L. Kapcliuch, D.B. Loginov, A.M. Egorov Heme cataiitic propeties in plant and fungal peroxidases.// Metal ions in biological systemsJEurobic, August 30 - September 3, 1994, Florence-Italy/: Abstracts -1994 - P. 140.

5. I.G. Gazaryan, V.V. Doseeva, A.G. Gaffin, Yi.L. Kapeliuch and A.M. Egorov Chemilummescent propeties of recombinant horseradish peroxidase and its mutant forms expressed in EcoliJ! Journal of Bioiuminescence and Chcmiluminescence - Absracts -1994 - V.9 - N 5 - P.347. "

6. Логинов Д.Б.. Газарян И.Г., Досеева В.В., Галкин А.Г., Тишхса В.И., Мареевз Е.А., Орлова М.А. Каталитические свойства Phe 41->His мутанта псроксидазы хрена, экспрессируемой в Exoli.ll Известия АН РФ, 1994, серия химич..-N 11, С.20-341.