Анионные пероксидазы и их применение в биоанализе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

/

Алпеева Инна Сергеевна

АНИОННЫЕ ПЕРОКСИДАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В БИОАНАЛИЗЕ

02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат днссер1ации на соискание учёной степени кандидата химических наук

□ОЗОТ12ЭО

Москпа - 2007

003071290

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Иван Юрьевич Сахаров

Официальные оппоненты:

профессор, доктор химических наук Анатолий Николаевич Решетилов доктор биологических наук Ольга Владимировна Королева

Ведущая организация:

ФГУ Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Защита состоится 29 мая 2007 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете им М.В Ломоносова по адресу 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Автореферат разослан 27 апреля 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат химических наук

И К Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка новых ферментативных систем, позволяющих усовершенствовать старые и предложить новые варианты анализа для целей здравоохранения и охраны окружающей среды является одним из важнейших и перспективных направлений современной биотехнологии, поскольку именно ферментативные методы обеспечивают высокочувствительное и селективное определение физиологически активных веществ В этой связи поиск, получение и характеристика новых ферментов дня аналитической биотехнологии является актуальной задачей

Одним из наиболее широко применяемых в аналитических целях ферментов является пероксидаза (КФ 1 1.11 7) Этот биокатализатор - один из ключевых ферментов, контролирующих рост растений, их дифференциацию и развитие In vitro этот фермент широко применяется в иммуноферментном анализе и при конструировании ферментных электродов

Хотя пероксидазы обнаруживаются в тканях практически всех растений, в настоящее время основным источником коммерчески доступной пероксидазы являются корни хрена (Armoracia ruiticana) В то же время появление пероксидаз с повышенной стабильностью и отличной субстратной специфичностью могло бы повысить качество фермент-содержащих наборов и стимулировать разработку новых аналитических методов и промышленных процессов С этой целью в настоящее время проводятся исследования пероксидаз из новых источников На Химическом факультете МГУ им М В Ломоносова под руководством д х н Сахарова И Ю. была впервые выделена пероксидаза из листьев пальм, которая обладала уникальной термостабильностыо и кислотостабильностью, а также обладала повышенной стабильностью в органических растворителях Учитывая многообразие флоры, можно предположить, что анионные пероксидазы растений из новых источников имеют хорошие перспективы для их практического использования в биотехнологии

Цели и задачи исследования. Изучение молекулярных и каталитических свойств анионных пероксидаз растений (сои, пальмы и багата) и возможности их применения в аналитической практике в качестве активных компонентов биосенсоров и метки в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи-

• Разработка метода выделения и очистки пероксидазы из кожуры клубней батата,

• Сравнительное изучение субстратной специфичности анионных пероксидаз (сои, пальмы и батата) по отношению к традиционно

используемым субстратам пероксидаз, металлоорганическим комплексам рутения, хемилюминесцентной реакции окисления люминола

• Изучение свойств анионных пероксидаз в качестве компонентов биосенсоров- с прямым переносом электронов, б—применением орраничееких, с использованием медиаторов (комплекса осмия, модифицированных поливинилимидазолом); в биферменгной системе с использованием алкогольоксидазы

• Изучение свойств анионных пероксидаз в качестве метки в имунноферментном анализе с хемилюминесцетной детекцией на примере пероксидазы сои

Научная новизна работы. Впервые получена и детально охарактеризована пероксидаза батата Выделенная пероксидаза батата была использована для изучения ее субстратной специфичности в сравнении с другими пероксидазами растений Впервые показаны преимущества использования анионной пероксидазы пальмы в качестве компонента биосенсоров для определения пероксада водорода с прямым и медиаторным переносом электронов, а также в составе биферменгных электродов с алкогольоксидазой для определения этанола в образцах вин Впервые продемонстрированы преимущества использования анионной пероксидазы сои в сравнении с катионной пероксидазой хрена в качестве метки в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией на примере «сэндвич» тест-системы для определения IgG мыши

Практическая значимость работы. Как следует из представленных ниже результатов, анионная пероксидаза пальмы является наилучшой пероксидазой для создания пероксндаз-содержащих электрохимических биосенсоров Использование коммерчески доступной анионной пероксидазы сои в сравнении с пероксидазой хрена в составе иммуноферментных наборов с хемилюинесцентной детекцией позволяет существенно улучшить их качество за счет увеличения значения линейного диапазона в области высоких концентраций аналитов и большей стабильности хемилюминесцентного сигнала во времени Также показана перспективность практического использования цикломегаллированных комплексов рутения в качестве медиаторов при проведении ферментативного окисления фенолов

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях «Биокатализ-2000» (Москва, 2000), «Биокатализ-2002» (Москва, 2002), «Биотехнология - состояние и перспективы развития, 2002» (Москва, 2002), «Биотехнология - состояние и перспективы развития, 2003» (Москва, 2003), «Joint Meeting Bioelectrochemistry-2005» (Коимбра, Португалия, 2005) и международном конгрессе по аналитической химии «ISAC-2006» (Москва, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 статей и 7 тезисов докладов международных конференций

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (три главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (четыре главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 152 ссылки Работа изложена на 130 страницах и включает в себя 45 рисунков и 25 таблиц

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ I. Выделение и очистка пероксидазм из кожуры клубней батата

При скрининге тропических растений было найдено, что клубни батата содержат высокий уровень пероксидазной активности Поскольку пероксидазная активность в кожуре была приблизительно в 30 раз выше, чем в мякоти, было высказано предположение, что основной пероксидазный пул локализован в кожуре Подобная локализация может быть связана с участием ПБ в процессе суберилизации при формировании полифенольной матрицы

Первоначально были оптимизированы условия получения экстракта из кожуры батата Наиболее эффективно экстракция происходила при щелочных условиях (10 мМ боратный буфер, рН 9 0) Использование буферов с более низкими значениями рН (цитратный буфер, рН 3 0, ацетатный буфер, рН 5 0 и фосфатный буфер, рН 7 0) снижало выход экстракции и приводило к получению экстрактов с активностью ниже в 2 2-, 13- и 12- раза, соответственно

Поскольку, как хорошо известно, пероксидазы в растительных источниках представлены как в растворимой, так и связанной с мембраной формах, в рамках представленной работы так же были изучены эффекты влияния ионной силы и детергента на выход эксгракции ПБ Оптимальное значение концентрации №С1 для экстракции при использовании боратного буфера с рН 9 0 составило 05 М Повышение концентрации Тритона Х-100 до 0 1% не оказывало влияния на пероксидазную активность получаемого субстрата

Изучение кинетики экстракции показали, что для достижения максимума экстракции необходимо 3-х-часовая инкубации Более длительная экстракция приводила к снижению ферментативной активности, связанное, по-видимому, с инактивацией пероксидазы фенолами и продуктами их окисления, параллельно экстрактируемыми из кожуры батата Подобранные оптимальные условия экстракции ПБ позволили определить уровень пероксидазной активности в кожуре батата, равный 770 единиц на г веса кожуры

Результаты очистки ПБ представлены в Таблице 4 1 Как и многие другие экстракты из растительных источников, экстракт из батата содержал высокую концентрацию пигментов Эти соединения (полифенолы) химически активны и могут необратимо модифицировать хроматографические носители, используемые для выделения ферментов Для предотвращения такой модификации был разработан простой и быстрый метод удаления пигментов Он основывается на разделении пероксидазы и пигментов в водной двухфазной системе, состоящей из полиэтиленгликоля и сульфата аммония Максимальное удаление пигментов и наиболее высокий процент сохранения пероксидазной активности наблюдается в системе, содержащей 8 5% К2НРО4 и 14% ПЭГ (мм 10 000)

Табл. 1. Очистка пероксидазы из кожуры батата

Объем (мл) Концентрация белка Белок (ИГ) Удельная активность белка (и/мг) Суммарная активность (Ц) Выход (%) Степень очистки

Экстракция пигментов 1290 49 6300 42 265 000 100 I

Гидрофобная хроматография 190 1 4 270 700 189 000 70 17

Ионообменная хроматография 36 0 23 83 4 900 40 600 15 117

Дальнейшая очистка ПБ проходила с использованием гидрофобной хроматографии на колонке с Фенил-Сефарозой (рис 2.) Сульфат аммония добавлялся до концентрации 1 7 М к раствору, содержащему пероксидазу, который затем был нанесен на колонку, уравновешенную 0 1 М фосфатным буфером, рН 6 5 с 1 7 М (№Т4)2504 При таких условиях пероксидаза полностью адсорбировалась на Фенил-Сефарозе ПБ элюировалась в градиентенте концентрации (N1(4)2804 от 1 7 до 0 М в фосфатном буфере, рН 6 5 Стадия хроматографической очистки повысила удельную активность в 17 раз

Конечной стадией очистки являлась ионообменная хроматография на колонке с ОЕАЕ-Тоуореаг1 (рис. 3.), в результате которой удельная активность препарата, измеренная по отношению к гвалколу, составила 4 900 и/мг белка

Очищенный препарат ПБ мигрировал в Оэ-Ыа-электрофорсзе как белок с молекулярной массой 37 кДа Это значение было ниже, чем для мол масса ПХ и близко к значениям ПС и пероксидазы табака

Проведение изоэлекторофокусирования показало, что ПБ является анионным ферментом, значение р1 которого составило 3,5 Ранее другие анионные пероксидазы были выделены из табака, пальмы, сои и других растений

Спектр поглощения ПБ с максимумом при 401 нм (полоса Соре), 497 и 638 нм характерен для всех пероксидаз растений. Значение (отношение

поглощения при полосе Соре и 280 им) составило 3 4, что также подтверждает высокую степень очистки полученного препарата ПБ

II. Субстратная специфичность анионных пероксидаз

II.1. Субстратная специфичность анионных пероксидаз в отношении традиционно используемых субстратов

Так как способность окислять различные ароматические субстраты сильно варьирует в ряду растительных пероксидаз, в данной работе была исследована субстратная специфичность выбранных для изучения анионных пероксидаз батага, пальмы и сои (ПБ, ГШ и ПС) Первоначально изучение проводилось в отношении традиционно используемых субстратов (доноров протонов) пероксидаз, а именно АБТС, о-фенилендиамина, о-дианизидина, феруловой кислоты, пирокатехина и гваякола Поскольку субстратная специфичность 1111 и ПС в отношении таких субстратов была уже описана, часть из которых была проведена в нашей лаборатории, для этих пероксидаз использовались литературные данные по субстратной специфичности к представленному ряду субстратов

Хорошо известно, что оптимальные условия катализа для пероксидаз из различных источников могут сильно различаться Поэтому для реакций ферментативного окисления исследуемых субстратов в присутствии ПБ были определены рН-оптимум, оптимальные концентрации пероксида водорода, субстрата-восстановителя и буфера (табл 2)

Табл. 2. Экспериментальные условия определения субстратной специфичности пероксидазы батата

Субстраты (АН) А. ,нм Е, М"1 см1 |н2о2|, мМ |АН], мМ рН [буфер], мМ

АБТС 414 31 100 0,075 0,008 4,3 50

Феруловая к-та 318 6 000 0,5 0,3 4,5 50

о-дианизндпн 420 30 000 4,2 11,4 4,5 50

о-фенилендиамин 445 11 100 4,2 5,5 5,0 50

гилико i 470 5 000 2,5 5,5 5,5 50

2,5 5,5 3,5 50

пирокатехин 295 1 700 1,0 25,0 5,5 20

При найденных выше (табл 2 ) наиболее благоприятных условиях была оценена эффективность катализа окисления изучаемых субстратов пероксидом водорода в присутствие ПБ Как известно, катализ пероксидазы реализуется по механизму «пинг-понг» (1-3) с образованием двух промежуточных соединений -СрсПиСрсШ

к!

е + н2о2 ера 1 + н2о, (1)

к2

Срс11 + АН2 -> Ср(1 II + АН', (2)

кз

Cpdll + АН2 -> Е + ЛН*+ Н20. (3)

Наиболее медленной реакцией, лимитирующей весь каталитический процесс, как показано было в случае пероксидазы хрена, является реакция между Cpd II и субстратом (АНг) (ур. 3) Поэтому для оценки эффективности катализа пероксидазы должна быть рассчитана величина константы реакции второго порядка (к3)

V

кз =----------------- , (4)

[Cpd II] [АН2]

где V - регистрируемая скорость окисления субстрата Так как при оптимальной концентрации пероксида водорода концентрация Cpd И, как было показано ранее, практически совпадает с исходной концентрацией пероксидазы, то величина к3 приблизительно равна величине кэфф

V

кз !» кэфф =------------. (5)

[Е]„ [АН2]

Аналогичный подход для оценки эффективности различных пероксидаз успешно применялся ранее

Величины кЭфф, характеризующие эффективность ферментативного окисления изучаемых субстратов в присутствие ПБ, приведены в табл 3 Как хорошо видно, наиболее «медленными» субстратами являются пирокатехин и гваякол, производные фенола Такие соединения, как о-дианизидин и о-фенилендиамин (ароматические амины), окисляются пероксидом водорода в присутствие ПБ значительно быстрее Однако наилучшими субстратами для ПБ оказались АБТС и феруловая кислота Если в случае АБТС (синтетического субстрата) высокое значение кЭфф имеет исключительно прикладное значение, то в случае феруловой кислоты высокое значение константы к^ф позволяет предположить, что анионная ПБ в условиях m vivo активно участвует в процессах лигнификации

Сравнение значений кЭфф, полученных для пероксидаз ПБ и ПП, показало, что ПП по отношению к большинству субстратов является более эффективным биокатализатором Сопоставление же субстратной специфичности анионных ПБ, ПП, ПС и пероксидаз из других растений (табл 3 ) показало их каталитическую уникальность, что в сочетании с отмеченной ранее высокой стабильностью, как в случае ПП, так и ПС, создает отличные перспективы для их практического использования

Табл. 3. Субстратная специфичность некоторых растительных пероксидаз

Субстраты ЬаМ, X 10" (M'V1)

Источник пероксидазы

батат пальма соя хрен табак арахис люцерна

АБТС 3.5 52.0 0.36 4.0 1.1 0.37 1.0

феруловая к-та 27.0 63.0 - - - - -

о-дианизидии 0.7 1.0 0.39 4.3 2.0 2.0 2.4

о-фенилеидиамип 1.2 2.9 0.04 0.49 0.03 0.22 0.04

гваякол 0.5 1.2 0.64 1.6 0.51 2.4 15.0

пирокатехин 0.1 0.23 - - - - -

II.2. Изучение реакции окисления металлооргаиических комплексов рутения в присутствии анионных пероксидаз и их медиаторных свойств

Как было показано в II 1 , для пероксидаз существуют субстраты с низкими константами скорости окисления Однако иногда технологическая необходимость требует ускорения протекания таких реакций В связи с этим последнее время наблюдается повышенный интерес к изучению металлооргаиических комплексов на основе рутения и осмия, некоторые из которых уже успешно применяются в качестве медиаторов при конструировании ферментативных биосенсоров Принципиально новыми в ряду соединений такого рода являются рутениевые комплексы с ковалентной связью углерод - рутений Ожидается, что такие комплексы будут хорошими субстратами пероксидаз и обладать высокой медиаторной активностью

Были исследованы пять новых мегаллоорганических комплексов ру гения (табл 4) При этом была использована методология, разработанная и примененная нами при изучении субстратной специфичности ПБ Первоначально была предпринята попытка оптимизировать условия ферментативного окисления рутениевых комплексов пероксидом водорода в присутствии анионных ПП и ПБ и катионной ПХ

Сравнение оптимальных условий окисления рутениевых комплексов перексидом водорода в присутствии ПП, ПБ и ПХ (хабл 4) показывает значительные отличия в оптимальных значениях концентрации окислителя Так, в случае анионных ПП и ПБ максимальная ферментативная активность наблюдалась при концентрации пероксида водорода, равной 0,12 и 0,8 мМ, соответственно, то в случае катионной ПХ это значение было заметно выше и составило 3 3 мМ

При определенных оптимальных условиях (табл 4) были оценены значения эффективной константы второго прядка кэфф, характеризующие эффективность рутениевых комплексов как субстратов ПП, ПБ и ПХ Результаты приведены в табл 5

Полученные данные демонстрируют, что все пять представленных рутениевых комплекса окисляются в присутствии каждой из пероксидаз (Uli, ПБ и ПХ) с примерно одинаковыми скоростями Однако, если сравнивать данные по трем пероксидазам, то можно отметить, что если для 1111 и ПХ значения кэфф были равны 1 0-2 7 х 107 M'V1, то в случае ПБ аналогичные значения было на порядок ниже для всех изученных комплексов

Табл. 4. Оптимальные условия ферментативного окисления рутениевых комплексов в присутствии анионных пероксидаз

ПХ IIb 11П

Рутениевые комплексы IHjOj, [41. p |Буфер], НМЫ, |S|, pH [Буфср|, lliOJ, M. pll |Ьуфер),

MM «M 11 мМ «4 MM мМ mM MM »4

|Ro(php>)(bp»!|PI', 33 0 1 4.5 10 0 82 Ol 45 10 0 12 01 45 10

|Ru(phpy)(phen),lPb 33 0 1 45 10 0 82 0 1 45 10 0 12_| 0 1 45 10

|Ru(phpv)(Me,bpyh№ 3J 0 1 4 5 10 0 82 01 45 10 0 12 0 1 45 10

|Ru(topy)(bpyb|PF« 3J 0 1 45 10 0 82 01 45 10 0 12 0 1 45 10

[Ru(topy)(phen);|Pi<e 33 (11 4 5 10 0 82 01 45 10 0 12 01 45 10

Табл. 5. Эффективная константа скорости окисления рутениевых комплексов для трех пероксидаз растений

Комплекс кЭ(Ь4, MV

ПХ ПБ ПП

[Ru(phpy)(bpy)2|PFe 2.4 x 107 3.1 x 10" 1.0 X 107

iRu(phpy)(phen)2lPF6 2.7 x 107 7.0 x 106 1.6 xlO7

iRu(phpy)(Me2bpy)2lPF6 2.0 x 107 5.3 x 106 1.3 x 107

rRu(topy)(bpy)2]PF6 1.4 x 10' 6.0 x 10" 2.0 x 107

[Ru(topy)(phen)2lPF6 1.0 x 107 1.9 x 106 1.4 xlO7

Сравнение полученных значений констант скоростей окисления рутениевых комплексов с данными по окислению традиционно используемых субстратов для ПП, ПБ и ПХ (табл 3) позволяет сделать вывод о том, что рутениевые комплексы являются «хорошими» субстратами исследуемых пероксидаз.

Высокие значения констант кэфф позволили предположить, что рутениевые комплексы могут быть использованы как медиаторы в реакции окисления некоторых ароматических субстратов в присутствии пероксидазы Как упоминалось выше, реакции окисления некоторых ароматических аминов и фенолов протекают с низкой скоростью, 1 е являются «плохими» субстратами пероксидаз Процесс можно ускорить, используя медиаторы - вещества, которые окисляются пероксидазой с большими скоростями и затем мо1ут регенерировать, передавая полученный окислительный потенциал на «плохой» субстрат Затем этот комплекс может снова участвовать в следующем ферментативном цикле Учитывая выше сказанное, схема взаимодействия выглядит следующим образом

Е + Н202 EI + Н20 к,

EI + Mred -> Ell + Мох к2

Ell + Mred -> Е + Мох к3

М01 + S -> Mred + Р кс,

где Е, El и Ell - пероксидаза и ее окисленные формы, Mred, М01-восстановленная и окисленная форма медиатора, S - «плохой» субстрат пероксидазы, Р - продукты реакции

Так как значения констант скорости окисления для всех комплексов подобны (табл 5 ), для дальнейшего анализа был выбран [Ru(phpy)(bpy)2]PF6 В качестве субстрата с низким значение кЭфф был выбран пирокатехин (табл 3 ), часто используемый как модельный субстрат пероксидаз

Поскольку добавление рутениевых комплексов сильно увеличивает поглощение при длине волны 295 нм (максимум поглощения продуктов окисления пирокатехина), за изменением концентрации пирокатехина в процессе реакции наблюдали методом ВЭЖХ.

Табл. 6. Кинетические параметры реакции ферментативного окисления пирокатехина перекисью водорода

РЕАКЦИЯ к, М'с"1

пирокатехин + Н202 —> 1 1 х КГ 7

пирокатехин [Ru2+(phpy)(bpy)2]PF6 + Н202 —> 9 0 х Ю-3

Е [Ru2+(phpy)(bpy)2]PF6 + Н202 3 1 х 106

[Ru3+(phpy)(bpy)2]PF6 + пирокатехин -» 0 75+0 04

По площадям хроматографических пиков, полученным в различные моменты времени, были определены эффективные константы ферментативного окисления пирокатехина Н202 в присутствии и отсутствии рутениевого комплекса (табл 6), которые составили 50 х 10б М"'с'! и 1 1 х 102 М"'с'' соответственно

Следует отметить, что величина к,фф пирокатехина, определенная в условиях данного эксперимента, несколько ниже кЭфф пирокатехина, определенной в оптимальных условиях окисления пирокатехина Это вызвано несколькими причинами во-первых, введение детергента (ЦТАВ) в реакционную среду, добавленного для увеличения растворимости и стабильности при низких значениях рН рутениевых комплексов, снижает эффективность катализа пероксидазы, во-вторых, процесс исследовался при оптимальных условиях для окисления рутениевых комплексов, которые достаточно сильно отличаются от оптимальных условий окисления пирокатехина

В любом случае, значение кэ<!)ф реакции окисления пирокатехина в присутствии медиатора превышает значение кЭфф в его отсутствии, при оптимальных условиях окисления пирокатехина, более чем в 50 раз (табл 6 )

11.3. Изучение реакции окисления люминола в присутствии анионных пероксидаз

Поскольку в настоящее время пероксидазы широко используются в качестве метки в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией, где применяется реакция окисления люминола пероксидом водорода, в рамках работы по исследованию субстратной специфичности анионных пероксидаз была изучена реакция окисления люминола в присутствии ПП, ПБ и ПС В качестве окислителя использовался пероксид водорода, а активность пероксидаз оценивалась по интенсивности образующегося сигнала хемилюминесценции

Как и на предыдущих этапах работы, вначале были подобраны оптимальные условия катализа для изучаемых ферментов (табл 7.)

Табл. 7. Оптимальные условия окисления люминола в присутствии пероксидаз

растений

Условия ПП ПБ ПС ПХ

рН 8.2 7.8 8.3 8.6

[Н2021, мМ 4-8 4-6 6-10 2.0

[ЛЮМИНОЛ], мМ 6-10 8-10 4-10 1.5

[БУФЕР], мМ 30 100 100 100

Для эффективного окисления люминола в присутствии ПХ требуется введение в реакционную смесь, называемых "усилителями" Классическим "усилителем" для ПХ является р-иодфенол В случае анионных пероксидаз эффект р-иодфснола был крайне невелик

В табл 8 представлены основные данные зависимости интенсивности люминесценции от концентрации пероксидазы Из полученных данных видно, что линейная зависимость интенсивности хемилюминесценции от концентрации пероксидазы наблюдается в диапазоне концентраций 0 2 — 20 пМ для ПБ, 10 - 180 пМ для ПГ1 и 10-100 пМ для ПС Величина предела обнаружения пероксидазы была определена как концентрация фермента, в присутствие которого наблюдается интенсивность хемилюминесценции, втрое превышающей интенсивность фоновой реакции В случае ПП, ПБ и ПС предел обнаружения составил 1 0 пМ, 0 01 пМ и 0 3 пМ соответственно Следует отметить уникально низкое значение предела обнаружения для ПБ

Табл. 8. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от концентрации анионных пероксидаз

Линейный диапазон определяемых кон-ций, пМ Предел обнаружения, пМ

ПП 10-180 1,0

ПБ 0,2 - 2,0 0,01

ПС 10-100 0,3

На рис 1 представлены типичные кинетические кривые окисления

люминола пероксидом

водорода в присутствие различных пероксидаз Как хорошо видно, все приведенные кривые имеют различный характер Так, в случае реакции усиленной хемилюминесценции, наблюдаемой в присутствии ПХ, на первом этапе интенсивность быстро

достигает своего

максимального значения, а затем также быстро уменьшается Падение

интенсивности хемилюминесценции связано с инактивацией ПХ продуктами реакции окисления усилителей и люминола

В отличие от ПХ, интенсивность свечения в реакции окисления люминола при использовании анионных пероксидаз (ПП, ПБ и ПС), хотя и нарастала несколько медленней, но, достигнув своего максимального значения, на протяжения длительного периода времени не изменялась Данное явление, по-видимому, можно объяснить большей стабильностью анионных пероксидаз к воздействию радикальных продуктов реакции окисления люминола, что косвенно подтверждается данными по устойчивости ПП к радиационному облучению

На основании полученных результатов можно говорить о перспективности использования анионных пероксидаз пальмы, батата и сои в иммуноферментном анализе в формате с хемилюминесцентной детекцией ферментативной активности Так, все изученные в рамках данной работы анионные пероксидазы стабильны к продуктам реакции, что обеспечивает высокий стабильный сигнал на протяжении длительного времени Особенно следует отметить, что для получения высокою хемилгоминесцентного сигнала

О SO 100 150

Время, мин

Рис. 1. Типичные кинетические кривые изменения интенсивности свечения в процессе окисления люминола перекисью водорода в присутствии ПХ, ПП, ПС и ПБ

в случае изученных анионных пероксидаз не требуется использования усилителей Кроме того, сравнение полученных данных показало, что хотя катализ окисления люминола анионными пероксидазами имеет много общего, все же каждая из анализируемых анионных пероксидаз привносит некую специфику в катализ реакции окисления люминола

11.3. Биоселсоры для определения пероксида водорода на основе анионных

пероксидаз

П.3.1. Биосенсоры для определения пероксида водорода на основе анионных пероксидаз с прямым переносом электронов

Хорошо известно, что пероксидазы являются рН-зависимыми ферментами Более того, пероксидазы, выделенные из различных источников,

проявляют максимальную

активность при различных значениях рН В этой связи биосенсоры, основанные на трех различных растительных

пероксидазах (ПХ, ПП и ПБ), в первую очередь были

протестированы при различных значениях рН (рис 2 )

Для всех ферментов изучался прямой перенос электронов с поверхностьи электрода на фермент Ранее было показано, что для ПХ, ПП и ПБ наблюдается 49 + 4%, 56 ± 5%, 91 ± 6% активных молекул, участвующих в прямом переносе электронов, соответственно Сравнение полученных данных демонстрирует, что биосенсоры на основе адсорбированных ПХ и ПБ имеют очень похожие профили рН-зависимости сигнала в диапазоне от 3 до 7 с максимальным значением при рН 5-6 Для биосенсоров на основе ПП, напротив, наблюдается расширенная область максимального значения сигнала на профиле рН-зависимости (рис 2) Для таких биосенсоров высокие значения тока были получены в диапазоне рН от 2 до 6 Данное явление можно объяснить более высокой рН-стабильностью ПП по сравнению с ПХ и ПБ

рн

Рис. 2. Влияние рН на ответ биосенсоров на основе ПП (сплошная линря), ПХ (пунктирная линия), ПБ (штрих-пунктирная линия) для 0 1 мМ Н2О2 в 0 1 М фосфатном буфере при значении приложенного потенциала -50 мВ

Для всех изученных нероксидазных электродов наблюдался высокий ответ при рН 6 0 При данном значении рН были получены градуироочные графики по пероксиду водорода для всех типов биосенсоров (рис 3) Полученные данные позволили рассчитать основные

биоэлектрохимические параметры биосенсоров

(чувствительность, S, линейный диапазон, LR) Полученные данные представлены в габл 9

Сравнение полученных данных демонстрирует, что при сопоставимой чувствительности биосенсоры на основе анионной ПП обладают значительно более широким линейным диапазоном

(1 - 700 мМ), чем биосенсоры на основе катионной ПХ (10 -анионной пероксидазы ПБ (10 - 200 мМ)

Сравнительное изучение инактивации ПХ, 1111 и ПБ по отношению к пероксиду водорода

О 1000 2000 Э000 4000 5000

[Нгсу, КМ

Рис. 3 Градуировочные графики, полученные с помощью биосенсоров на основе ПП (сплошная линия), ПХ (пунктирная линия), ПБ (штриховая линия) Экспериментальные условия проточно-ишкекционная система, приложенный потенциал -50 мВ, скорость поюка 0 5 мл/мия, 0 1 М фосфатный буфер, рН 6 0

200 мМ) и другой

Табл. 9. Инактивация растительных пероксидаз в --------------11 ">2

позволило объяснить причину того, что для биосенсоров на

основе ПП

наблюдается более широкий линейный диапазон, чем в случае других

биосенсоров Как видно из табл 9,

1111 не инактивируется в присутствии 0 2 мМ пероксида водорода в нейтральных условиях Повышение концентрации пероксида водорода до 20 мМ позволяет обнаружить инактивацию ПП, однако константа скорости инактивации принимала очень низкое значение В случае же двух других пероксидах (ПХ, ПБ) специфическая активность напротив значительно понижалась при воздействии на них пероксида водорода

[И,С>2], мМ kmac X Ю3 (МИН"')

ПП ПБ ПХ

ОмМ 0 0 0

0.2 мМ 0 13 + 0 1 1 6±0 1

2 мМ 0 4 ± 0 05 40 + 02 3 810 1

20 мМ 0 7 ±0 05 150 + 03 5 6 ± 0 3

Таким образом, более высокая стабильность ГШ в присутствии пероксида водорода является ключевым моментом, позволяющим измерять концентрацию пероксида водорода вплоть до 700 мкМ при использовании биосенсоров на основе ПП (табл 10)

Более высокая

кислотостабршьность ПП дает возможность использования

биосенсоров на основе ПП в кислых условиях, которые часто используются в пищевых процессах (табл 10)

Для сравнения для биосенсоров на основе ПХ, ПП и ПБ были получены

градуировочные графики по пероксиду водорода при кислых условиях (рН 4 5) (рис 4) Из полученных результатов видно, что при понижении рН с 6 до 4 5 чувствительность биосенсоров на основе ПХ и ПБ заметно снижается, в то время как в случае биосенсоров на основе ПП градуировочные графики при обоих значениях рН были одинаковы и, следовательно, высокое значение чувствительности сохраняется и при кислом значении рН Таким образом, биосенсоры на основе ПП демострируют уникальную возможность определения пероксида водорода в кислых и нейтральных условиях с одинаковой эффективностью

Табл. 10. Биоэлектрохимические параметры биосенсоров на основе 1111, ПХ и ПБ с прямым переносом электронов

рН 6.0 рН 4.5

Чувствительность2, нА*мкМ"'*см"2 Линейный диапазон, мкМ Чувствительность2, IIA*mkM Чм"2 Линейный диапазон, мкМ

ПП 53 1-700 56 1 - 1000

ПХ 49 10-200 30 10-200

ПБ 10 10-200 16 10-200

Для практического применения ферментных электродов особое внимание следует уделять повышению операционной стабильности сенсора

[Нгсу, мМ

Рис 4. Градуировочные графики, полученные с помощью биосенсоров на основе ПП (сплошная линия), ПХ (пунктирная линия), ПБ (штриховая линия) Экспериментальные условия проточно-инжекционная система, приложенный потенциал -50 мВ, скорость потока 0 5 мл/мин, 0 1 М фосфатный буфер, рН 4 5

Стабильность биосенсора главным образом определяется стабильностью используемого фермента

Сравнение операционной стабильности биосенсоров на основе ПХ, ГШ и ПБ проводили путем пропускания через электролитическую ячейку раствора субстрата в течение длительного времени При этих условиях сигнал биосенсора на основе 1111 снижается лишь до 90%, в то время как для ПБ и ПХ ответ снижался до 30 и 45% от первоначального, соответственно

Также была протестирована стабильность при хранении пероксидазных электродов, которые между измерениями хранились при + 4 °С После семи дней хранения для биосенсоров на основе ПХ и ПБ наблюдалось лишь 27 и 22% от первоначального значения ответа (по току), тогда как для биосенсоров на основе ПП не наблюдалось какою-либо значительного снижения сигнала по отношению к 0 1 мМ Н2Ог за весь период

Н.3.2. Биосенсоры для определения псроксида водорода на основе анионных пероксидаз с медиа! орным переносом электронов

Г\

сг

о

»£ ын,

гель

В настоящее время описан ряд биосенсоров с применением ПХ на основе медиаторного переноса электронов В нашей работе иммобилизацию пероксидазы (ПХ, ПП, ПБ) на поверхности электрода проводили путем формирования слоя гидрогеля с а включенными молекулами фермента, полученный в

результате обработки редокс полимера (ПВИю-Об) и пероксидазы бифункциональным сшивающим агентом (ПЭГДГЭ) (сх 1) С использованием оптимизированных по составу биосенсоров были построены градуировочные графики по пероксиду водорода (рис 5 ) и рассчи ганы основные параметры биосенсоров (табл 11)

Схема 1 Взаимодействие комплекса Об, модифицированной ПВИ, с концевыми МДг-группами пероксидазы I бифункцианалыгого сшивающего агента ПЭГДГЭ

Сравнение полученных данных показало, что биосенсоры на основе ПП и

ПХ демонстрируют наибольший

пероксиду

линеиныи диапазон определяемых

концентраций пероксида

водорода, который составил

10-5 ООО мМ В случае ПХ

и ПБ линейный диапазон

был уже и его значение

составило 10-4 ООО мМ и

10 - 1 ООО мМ

соответственно Более

значительные отличия

—1 наблюдались в

10000

чувствительности изученных биосенсоров Так,

чувствительность биосенсоров на основе ПП практически в 1.5 раза превышала аналогичные параметры для Г1Х и ПБ Данные, полученные в случае медиаторного переноса электронов, хорошо коррелируют с данными в случае прямого переноса электронов (II 3 1 ), что свидетельствует о том, что при иммобилизации исследованные пероксидазы сохранили свои каталитические свойства Особенно следует отметить, что использование медиатора привело к значительному увеличению значения линейного диапазона определяемых концентраций пероксида водорода в сторону увеличения концентрации для всех представленных пероксидаз

Табл. 11. Биоэлектрохимические параметры биосенсоров на основе ПП, ПХ и ПБ с медиаторным переносом электронов

[Н,0,1, ИМ

Рнс. 5. Градуировочные графики по водорода, полученные с помощью бтосексоров на основе медиаторного переноса электронов ПП (сплошная линия), ПХ (пунктирная линия), ПБ (штрих-пунктирная линия) Экспериментальные условия проточно-инжекционная система, приложенный потенциал -50 мВ, скорость потока 0 5 мл/мин, 0 1 М фосфатный буфер, рН б О

Тип биосепсора Чувствительность, нА*мМ 'см-2 Линейный диапазон, мкМ

ПП/ПГЭДГЭ/ПВИюОа (45 35%/11.33%/43.32% (по весу)) 164 10 - 5000

ПХ/ ПГЭДГЭ/ПВИюОв (22.67%/11.33%/65 99% (по весу)) 117 10-4000

ПБ/ ПГЭДГЭ/ПВИюОя (29 41%/22 59%/48 0% (по весу)) 103 10 - 1000

Кроме того, иммобилизация в редокс геле привела к ожидаемому увеличению операционной стабильности и стабильности при хранении биосенсоров для всех изученных пероксидаз Как и в случае адсорбции на

поверхности электрода, наибольшая стабильность полученных биосенсоров наблюдалась для ГШ

11.3.3. Бнферменты биосенсоры на основе анионных пероксидаз и алкогольоксидазы

В последнее время разработано большое

количество различных

биосенсоров для определения этанола, главным образом, при использовании алкогольоксидазы (АО)

Зачастую, однако, низкая стабильность полученных сенсоров является основным фактором, ограничивающим их практическое применение Таким образом, в настоящее время остается актуальным вопрос о создании биосенсора для определения этанола с улучшенными

характеристиками (высокая чувствительность, быстрый ответ, стабильность)

Оптимальный перенос электронов между иммобилизированной в редокс-гидрогеле пероксидазой оказывается возможным только в гом случае, когда этот слой не содержит АО, которая вероятно повышает среднее расстояние между редокс-полимером и пероксидазой Поэтому был сконструирован двухслойный биосенсор, где первый слой содержал пероксидазу (ПХ или ПП), иммобилизированную в редокс гидрогеле, модифицированном комплексом Оэ, а второй слой был создан электрополимеризацией катодного полимера КП5 с одновременным включением в структуру АО

После оптимизации состава биферментных биосенсоров были получены градуировочные графики по этанолу (рис 6) и рассчитаны основные биоэлектрохимические параметры (табл 12 ) Значения Км схожи для двух типов биосенсоров и значительно превышали значение Км, полученного для АО в растворе (2.7 мМ). Это указывает на затрудненную диффузию этанола сквозь слой осажденного КП5 Подобное явление наблюдалось также для биосенсоров в отсутствии второго слоя при определении пероксида водорода

Значение предела обнаружения (величина, превышающая в гри раза соотношение сигнал/шум) было равным 0,02 мМ для обоих типов биосенсоров

-.-|-.-[-■-,-.-,-,-!---1-.-,

0 10 20 Э0 4£> ВО ВО 7С

{этанол], мМ

Рнс б Градуировочные графики, полученные с помощью биферментных биосенсоров на основе ПП (сплошная линия), ПХ (пунктирная линия) Экспериментальные условия проточно-инжекционная система, приложенный потенциал -50 мВ, скорость потока 0 5 мл/мин, 0 1 М фосфатный буфер, рН б 0

Разработанные биосенсоры демонстрировали достаточно высокую воспроизводимость сигнала по току (Б, 5-10%, п = 3)

Табл. 12. Биоэлектрохимические параметры биосенсоров на основе алкогольоксидазы и пероксидазы (1111, ПХ)_

Тип биосенс ора 1щаи "А Кт, мМ Чувствии-тельность, нА*мМ"1*см"2 Линейный диапазон, мМ Предел обнаружения, мМ

ПХ/АО 572 + 7 9 6 ± 0 3 60 1 -10 0 02

ПП/АО 940 ±15 9 6 ± 0 5 98 1 -10 0 02

Для оценки операционной стабильности оптимизированных биферментных биосенсоров, они были интегрированы в автоматический инжекционный анализатор, позволяющий многократно впрыскивать образцы этанола с объемом 100 мкл и концентрацией 5 мМ

Для определения операционной стабильности биосенсоров для анализа этанола в качестве образцов были использованы также образцы вина Полученные константы инактивации демонстрируют, что стабильность биосенсоров в разбавленных образцах вина была несколько ниже, чем стабильность в водном растворе этанола

Табл. 13. Константы инактивации биферментных биосенсоров в растворе

ПЕРОКСИДАЗА к,п.с1. мин 1

Раствор этанола в буфере Образец вина, разбавленный буфером

ПС 0 09016 0 00027

пх 0 00017 0 00046

Полученные биосенсоры были использованы для определения этанола в образцах вин, содержание этанола в которых достигало 18% Для анализа, проводимого методом добавок, использовались разведенные буфером в 1000 раз образцы вина Данные по определению концентрации этанола в вине представлены в таблице 14 Результаты, полученные с помощью биосенсоров, демонстрируют хорошую корреляцию с другими методами

Табл. 14. Определение этанола в образцах вин различными методами

Образец вина [EtOH], М

Метод добавочных стандартов при испо тыовании бифернентных биосенсоров на основе ПП Метод добавочных стандартов при испочьзовании биферчентных биосенсоров на основе ПК Спектрофото-метрический метод при испо1ьзовании PQQ-ЛДГ Концентрация, заявленная производителем (рефракто чеп*ри ческий метод)

Каберне Совиньон (красное вино) 1 945 1 948 2 023 1 956

Херес (крепленое белое вино) 3 200 3 199 3 080 3 191

Шардоне (белое вино) 1 890 1 865 1 878 1 870

III. Применение анионных пероксидаз в иммунофермеитиом анализе на примере пероксидазы сои

Как было показано выше (II2), анионные пероксидазы растений, катализируя окисления люминола пероксидом водорода, продуцируют стабильный длительный во времени хемилюминесцентный сигнал Обнаруженный эффект послужил основание для использования анионных пероксидаз в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией Так как для синтеза иммуноконъюгатов с пероксидазой требуются препаративные количества фермента, в данной работе нами была использована пероксидаза сои, которая является коммерчески доступной Как обычно, в качестве фермента сравнения была использована пероксидаза хрена (изофермент с)

В качестве модельной тест-системы был выбран «сэндвич» ИФА для определения IgG мыши В «сэндвич» системе используются антитела, иммобилизированные на поверхности планшета, и антитела, меченных ферментом Эта система является одной из наиболее распространенных для анализа поливалентных антигенов, таких как, например, иммуноглобулины класса G

Выбор данной тест-ситемы объясняется доступностью иммунореагентов Однако следует учесть также тот факт, что определение IgG имеет также практическое значение в связи с тем, что существует множество иммунологических наборов, включающих в качестве активного компонента моноклональные антитела мыши, и, соответственно, требующего их количественного определения

Для синтеза коньюгатов пероксидазы с антителами использовали периодатный метод В основе этого метода лежит окисление углеводных цепочек пероксидазы NalOj с образованием альдегидных групп, которые затем реагируют с аминогруппами молекулы антитела или антигена Данная реакция

широко используется на практике для получения коньюгатов ПХ с антителами или антигенами

Хорошо известно, что степень гликозилирования ПХ и ПС различна, а также наблюдаются существенные различия в составе и локализации углеводной части. Поскольку совокупность данных параметров сильно влияет

на свойства пероксидаз, в

о 8 мМ N310

-•-и мм маю, первую очередь были

^ 32 «м маю.0' оптимизированы условия

-•-40 мм маю, окисления ПС Следует

отметить, что ранее такие исследования не

проводились.

При оптимизации г -—, условий окисления ПС

,000 юооо юоооо юооооо варьировали концентрацию

Разведение коиьюгатг ОКИСЛИТвЛЯ (№Ю4) В

Рис. 7. Кривые разведения коньюгагов пероксидазы

сои с антителами кролика против 1уО мьипи, реакционной среде в синтезированные при использовании раствора интервале от 8 до 40 мМ окислителя с различной концентрацией №104, Полученные окисленные получены методом ИФА со , ы „„ ^ овал

спектрофотометрическим детектированием формы реагировали С

очищенными антителами, полученными при иммунизации кроликов мыши. Эффективность

синтезированных коньюгатов сравнивали, используя «сэндвич» ИФА с колориметрическим детектированием активности пероксидазы На рис 7 видно, что наибольшую активность проявляет коньюгаг, синтезированный при использовании раствора №Ю4 с концентрацией 32 мМ Интересно отметить, что оптимальная концентрация №104 в случае ПС значительно выше, чем используемая в случае ПХ (17 мМ)

Рис 7 наглядно демонстрирует, что активность коньюгатов ПС с антителами против мыши, полученных при различных концентрациях ЫаЮ4, была не одинаковая Для выяснения причин такого явления была проводена гельфильтрация полученных коньюгатов на Суперозе 12 Сравнение хроматограмм коньюгатов, синтезированных при различной концентрации ^таЮ4, показывает, что увеличение концентрации окисляющего агента приводит к уменьшению площади пика, характерного для несвязанной формы ПС Это означает, что выход коньюгата напрямую зависит от концентрации окисляющего агента

Параллельно наблюдалось появление пиков, характерных для коньюгатов Наличие нескольких пиков, соответствующих соединениям с высокими значениями молекулярной массы, означает, что в результате синтеза

образуется ряд коньюгатов с различным соотношением компонентов (фермент/антитело) Также следует отметить, что при наиболее низком значении концентрации окисляющего агента (8 мМ ЫаЮ,*) основной пик наблюдается для коньюгата с эквивалентным молекулярным соотношением ПС/антетело (время выхода 135 мин), в то время как при высоких концентрациях Ыа1С>4 (32 и 40 мМ) основной пик наблюдается для коньюгатов с более высокой молекулярной массой (время выхода 80 минут)

Основываясь на полученных результатах, дальнейшая работа

400000 350000 300000 2(<ОООи 200000 1БОООО 100000 5000С

Вромя измерения

2 мин —ф— 4 мин —А— 12 мин

(а)

^ 450000 ! 400000 Г 350000

[ ззеюоо

| 250000 ' 200003 I 150003 ; 'ооооо

■ 50000

1000 нг/мл

Время МХМ«р0НИЯ

—О — А МЛН

—Л— 12 мин

1000 [1дС] нг/мп

Рис. 8. Градуировочные графики определения концентрации 1£0 мыши «сэндвич»-методом ИФА с хемилюминесцентиым детектированием при использовании коньюгатов антител кролика против ^О мыши с пероксидазами сои (а) и хрена (б)

проводилась с использованием коньюгата ПС, синтезированного при концентрации 32 мМ №104. В хИФА данный коныогат сравнивали с аналогичным коныогатом ГГХ, синтезированным по стандартной методике при концентрации №1С>4, равной 17 мМ Состав субстратной смеси, используемой для хемилюминесцентного детектирования в случае коньюгата ПС, был оптимизирован ранее (II 2), в то время как для коньюгата на основе ПХ использовали стандартный состав субстратной смеси Здесь еще раз следует отметить, что для эффективного катализа реакции окисления люминола пероксидом водорода как для ПС, так и для других анионных пероксидаз, не требуется присутствия усилителей

Па рисунке 8 представлены результаты определения ^О мыши методом хИФА при использовании коньюгатов ПС и ПХ с антителами против ígG мыши Для каждого опыта были проведены параллельные измерения (п=6), для холостых опытов было проведено 10 параллельных измерений

Для нахождения аналитических характеристик определения 1§С мыши была проведена статистическая обработка полученных результатов Статистические данные представлены в таблице 15

Таблица 15. Аналитические характеристики «сэндвич»-метода ИФА определения IgG мыши с хемилюминесцентным детектированием

Пероксидаза Линейным диапазон, нг/мл Предел обнаружения, нг/мл ■Sr, %

Время измерения 2минуты

ПС 100 - 10 000 (R2 0 996) 25 10 8

пх 200 - 3 000 (R2 0 996) 25 113

Время измерения 4 минуты

ПС 100- 10 000 (R2 0 996) 25 11 0

пх 200 - 2 500 (R2 0 995) 25 11 1

Время измерения 12минут

ПС 100-10 000 (R* 0 996) 25 107

ПХ 200 - 2 ООО (R2 0 993) 25 11 2

Сравнение полученных параметров показало, что при применении коньюгата ПС значительно увеличивается линейный диапазон определяемых концентраций IgG мыши (100 - 10 ООО нг/мл) по сравнению с коньюгатом ПХ (200 - 2 500 нг/мл), при этом значения предела обнаружения и относительного стандартного отклонения для обоих конъюгатов были одинаковыми (таб 15 ) Увеличение линейного диапазона определяемых концентраций при определении IgG мыши с использованием коньюгата на основе ПС можно объяснить более высокой стабильностью ПС к радикальным продуктам окисления люминола Данное явления было подробно описано в II2 при изучении пероксидазного катализа окисления люминола пероксидом водорода и характерно для всех изученных анионных пероксидаз. Таким образом, пероксидаза в составе коньюгата сохраняет высокую стабильность, характерную для нативного фермента

Особенно следует отметить стабильность хемилюминесцентного сигнала для коньюгата на основе пероксидазы сои Как показано на рис 4 4 4, вид градуировочного графика меняется для определения IgG мыши с течением времени Однако, если в случае ПС наблюдается лишь незначительное падение интенсивности сигнала после 12 минут реакции окисления, а линейный диапазон определяемых концентраций сохраняет свои значения (100 - 10 000 мМ), то для ПХ интенсивность хемилюминесцентного уменьшается на порядок за тот же промежуток времени и происходит сокращение верхнего предела линейного диапазона с 3 000 до 2 000 мМ (табл 15) Ранее было показано, что ПХ инактивируется под действием образующихся радикальных продуктов окисления усилителей Данное явление наиболее характерно при определении высоких концентраций определяемого вещества, а, следовательно, и концентрации пероксидазной метки В итоге с течением времени такая высокая скорость снижения интенсивности излучения сигнала для высоких концентраций пероксидазной метки приводит к уменьшению линейного диапазона в области высоких концентраций (табл 15 )

выводы

1 Используя кожуру клубней батата (Ipomoea batatas) была выделена до гомогенного состояния анионная пероксидаза Очистка пероксидазы проводилась включала следующие стадии гомогенизация, экстракция пигментов с помощью 2-х-фазной системы, включающей полиэтиленгликоль и сульфат аммония, гидрофобную хроматография на Фенил-сефарозе и ионнообменную хроматографию на ДЭАЭ-тоеперле Чистота препарата была подтверждена с помощью SDS-электрофореза в денатурирующих условиях и изоэлектрофокусированием

2 Молекулярная масса и изоэлектрическая точка пероксидазы батата равны 37000 Да и 3.5 соответственно, удельная активность, измеренная в отношении гваякола, - 4900 ед/мг белка Электронный спектр пероксидазы батата совпадал с типичным спектром гем-содержащих пероксидаз растений Показано, что субстратная специфичность пероксидазы батата, изученная в отношении феруловой кислоты, гваякола, о-фенилендиамина, о-дианизидина, 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) аммония и пирокатехина, отлична от субстратной специфичности других пероксидаз растений

3 Изучено влияние условий проведения реакции (рН и концентрации реагирующих соединений и буфера) окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой пероксидазами пальмы, батата и сои, на интенсивность хемилюминесценции Показано, что максимальная хемилюминесценция регистрируется при рН 8.3, 8 4 и 7 8 в случае использования пероксидазы пальмы, сои и батата соответственно Продемонстрировано, что эффективность катализа исследованных анионных пероксидаз практически не зависит от наличия в реакционной среде «усилителей» (4-иодфепола и 4-гидроксикоричной кислоты) Предел чувствительности определения пероксидаз пальмы, сои и батата по реакции окисления люминола пероксидом водорода составил 1 пМ, 0 3 пМ и 0 01 пМ, соответственно Особенностью анионных пероксидаз растений является стабильность производимого ими при окислении люминола хемилюминесцентного сигнала, что позволяет говорить о перспективности применения этих новых ферментов в аналитической практике

4 Показано, что комплексы рутения(П) с общей формулой [Ru"(C~N)(N~N)2]PF6, где C-N = 2-фенилпирпдин или 2-(4'-толил)пиридин, a N-N = 2,2'-бипиридин, 1,10-фенантролин или 4,4'-диметил-2,2'-бипиридин, легко окисляются Н202 в присутствии пероксидаз пальмы, батата и хрена Все ферменты окисляют изученные комплексы рутения с одинаковой эффективностью Найдено, что синтезированные рутенивые комплексы являются прекрасными

метиаторами в пероксидазном катализе «плохих» субстратов, что было показано на примере изучения реакции окисления пирокатехина

5 Изучены пероксидазы пальмы, хрена и батата, как активные компоненты ферментных электродов с прямым и медиаторным переносом электронов Показано, что биосенсоры для определения Н2Ог на основе пероксидазы пальмы обладали наиболее высокой чувствительностью, более широким рабочим диапазоном и повышенной операционной стабильностью и стабильностью при хранении Исследования по рН-зависимости сигнала биосенсоров продемонстрировали, что электроды, модифицированные пероксидазой пальмы, сохраняют способность детектировать Н202 при кислых условиях (рН З-4) Найдено, что конструирование ферменгных электродов с медиаторным переносом электронов приводит к значительному увеличению чувствительности и стабильности биосенсоров для всех изученных пероксидаз

6 На основе пероксидазы пальмы/хрена и алкогольоксидазы конструированы двухслойные биферментные биосенсоры для определения этанола При создании чувствительного слоя биосенсора ферменты разного типа включались в разные слои электропроводящих полимеров Сравнение биферментных биосенсоров на основе пероксидазы пальмы показало преимущество перед пероксидазой хрена-более высокая чувствительность, более широкий линейный диапазон определяемых концентраций этанола, большая операционная стабильность Полученные биосенсоры протестированы для контроля качества вина. Результаты биоэлектрохимического анализа для реальных образцов вина показали хорошую корреляцию с спектрофотометрическим и рефрактометрическим методами, используемыми в настоящее время в виноделии

7 Оптимизирован периодатный метод синтеза иммуиоконъюгата пероксидазы сои и антител против иммуноглобулина О мыши На примере разработанной тест-системы для определения мыши продемонстрирована перспективность использования анионной пероксидазы сои в ИФА с хемилюминесцентной детекцией как ферментного маркера Сравнения конъюгатов используемых антител с пероксидазами сои и хрена показало, что в случае пероксидазы сои в условиях реального анализа затухание образующегося хемилюменесцентного сигнала протекало значительно медленней Применение конъюгата с пероксидазой сои позволило повысить чувствительность и рабочий диапозон изучаемой тест-системы

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1) Leon J С, Alpeeva I.S., Chubar Т.A, et al, Purification and substrate specificity of peroxidase from sweet potato tubers, Plant Science, 2002, 163 (5), 1011-1019.

2) Alpeeva I.S., Soukharev V S, Alexandrova L, et al, Cyclometalated ruthenium(II) complexes as efficient redox mediators in peroxidase catalysis, Journal of biological inorganic chemistry, 2003, 8 (6), 683-688

3) Alpeeva I.S., Sakharov IY, Soybean peroxidase-catalyzed oxidation of luminol by hydrogen peroxide, Journal of agricultural and food chemistry, 2005, 53 (14), 5784-5788

4) Alpeeva I.S., Niculescu-Nistor M, Leon J С, et al Palm tree peroxidase-based biosensor with unique characteristics for hydrogen peroxide monitoring, Biosensors andBioelectronics, 2005,21(5), 742-748

5) Alpeeva I.S., Vilkanauskyte A, Ngounou В , et al Bi-enzyme alcohol biosensors based on genetically engineered alcohol oxidase and different peroxidases, Microchimica Acta, 2005, 152 (1-2), 21-27

6) Алпеева И.С., Сахаров И Ю, Окисление лгоминола, катализируемое пероксидазой, выделенной из листьев королевской пальмы, Приклодиая биохимия и микробиология, 2007,43 (1), 31-35

7) Sakharov IY, Alpeeva I.S., Efremov Е Е, Use of soybean peroxidase in chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay, Journal of agricultural andfood chemistry, 2006, 54 (5), 1584-1587

8) Alpeeva I.S., Sakharov IY, Lumonol-hydrogen perpxide chemiluminescence produced by sweet potato peroxidase, Luminescence, 2006, 21, in print (available online www interscience wiley com DPI 10 1002/bio 931)

9) Sakharov I Yu , Vesga В M К, Bovin N V , Roig M G , Sakharova IV , Alpeeva I.S., Bautista A G Isolation and some properties of thermostable peroxidase from royal palm tree leaves Proc. Internal.Conf. Biocatalysis-2000, 10-15 June, Moscow, Russia, p 150

10)Alpeeva I.S., Alexandrova L, Gazaryan IG, Ryabov A, Sakharov IYu Ruthenium-Organic Complexes are Efficient Redox Mediators of Plant Peroxidases Proc. Intern.conf. Biocatalysis-2002, June 22-27,2002, Moscow, Russia, p 66-67

11) Alpeeva 1.S, Alexandrova L, Gazaryan IG, Ryabov A, Sakharov IYu Cyclometalated Ruthenium (II) Complexes As Efficient Redox Mediators in Peroxidase Catalysis Proc. VI Intern. Plant Peroxidase Symp., Murcia, Spain, July3-7, 2002, S2-P9

12)Alpeeva I.S., Castillo Leon J, Chubar ТА, Galaev IYu, Csoregi E, Sakharov I Yu Purification and substrate specificity of peroxidase from sweet potato tubers Proc. VI Intern. Sym. Biotechnology- state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, October 14-18, 2002, С 6 23

13)Alpeeva T.S., Nistor M, Castillo Leon J, Csoregi E, Sakharov IYu Biosensors for determination of hydrogen peroxide with improved parameters based on palm tree peroxidase Proc. VII Intern. Sym. Biotechnology- state of

the art and prospects of development, Moscow, Russia, November 10 -14, 2003, v 2, p 194-195

14) Alpeeva I.S., Niculescu-Nistor M, Castillo Leon J , Csoregt E , Sakharov I Yu Palm tree peroxidase-based biosensor with unique characteristics for hydrogen peroxide and glucose monitoring Proc. 18 Intern Svmp. On Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 14-19 June 2005, Coimbra, Portugal, P-123

15) Берлина A H, Алпеева И.С., Жердев А В , Дзантиев Б Б , Сахаров И Ю Иммуноферменгный анализ сульфаметоксипиридазина с помощью биотин/стрептавидиновой пары Труды междунар. копф. Биотехнология и медицина, Москва, Россия, 14-17 марта 2006, р 247

16)Alpeeva I.S., Berlma AN, Zherdev AV, Efremov EE, Dzantiev ВВ., Sakharov I Yu. Advantages of application of anionic soybean peroxidase in chemilummescent ELISA Proc. Intern. Congress on Analytical Sciences, Moscow, Russia, 25-30 June 2006, 137-138

Формат 60x88 1/16 Объем 2 п л Тираж 100 экз Заказ № 663 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ И СВОЙСТВАХ ПЕРОКСИДАЗ

2.1.1. Общая характеристика пероксидаз

2.1.2. Структура пероксидаз и механизм расщепления пероксида водорода

2.1.3. Механизм инактивации пероксидазы в ходе реакции

2.1.4. Реакция усиленной хемилюминесценции

2.1.5. Пероксидазы из различных растительных источников

2.2. ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗ В БИОСЕНСОРНЫХ КОНСТРУКЦИЯХ

2.2.1. Общие представления о ферментативных биосенсорах

2.2.2. Применение пероксидаз в биоэлектрокатализе

2.2.3. Биосенсоры для определения пероксида водорода

2.2.4. Биферментные биосенсоры

2.3. ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗ В ИМУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

2.3.1. Иммунохимические методы анализа

2.3.2. Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы исследований

3.2. Методы исследований

3.2.1. Спектрофотометрические измерения

3.2.2. Окисление металлорганических комплексов рутения

3.2.3. Окисление пирокатехина

3.2.4. Анализ методом ВЭЖХ

3.2.5. Определение константы взаимодействия окисленной формы рутениевого комплекса [Ru(phpy)(bpy)2]PF6 с пирокатехином кс

3.2.6. Окисление люминола перексидом водорода в присутствии анионных пероксидаз

3.2.7. Приготовление электродов для определения пероксида водорода с прямым переносом электронов

3.2.8. рН-стабильность пероксидаз в растворе

3.2.9. Инактивация анионных пероксидаз в присутствии пероксида водорода

3.2.10. Приготовление электродов для определения пероксида водорода с прямым переносом электронов

3.2.11. Приготовление биферментных биосенсоров для определения этанола

3.2.12. Синтез коньюгатов пероксидазы с антителами кролика против IgG мыши

3.2.13. Очистка коньюгатов антител против IgG мыши и пероксидаз

3.2.14. Выбор оптимального разведения коньюгата меченных пероксидазой хрена антитител кролика к IgG мыши для проведения ИФА с хемилюминесцентной и спектрофотометрической детекцией

3.2.15. Колориметрическая детекция пероксидазной активности коньюгата меченных пероксидазой антител кролика к IgG мыши

3.2.16. Хемилюминесцентная детекция пероксидазной активности коньюгата меченных пероксидазой антител кролика к IgG мыши

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Выделение пероксидазы батата и ее молекулярные свойства

4.2. Субстратная специфичность анионных пероксидаз

4.2.1. Субстратная специфичность анионных пероксидаз в отношении традиционно используемых субстратов

4.2.2. Изучение реакции окисления металлоорганических комплексов рутения в присутствии анионных пероксидаз и их медиаторных свойств

4.2.3. Изучение реакции окисления люминола в присутствии анионных пероксидаз

4.3. Применение анионных пероксидаз при конструировании ферментативных биосенсоров

4.3.1. Биосенсоры для определения пероксида водорода на основе анионных пероксидаз

4.3.1.1. Биосенсоры для определения пероксида водорода на основе анионных пероксидаз с прямым переносом электронов

4.3.1.2. Биосенсоры для определения пероксида водорода на основе анионных пероксидаз с медиаторным переносом электронов

4.3.2. Биферменты биосенсоры на основе анионных пероксидаз и алкогольоксидазы

4.4. Применение анионных пероксидаз в иммуноферментном анализе на примере пероксидазы сои

5. ВЫВОДЫ

Разработка новых ферментативных систем, позволяющих усовершенствовать старые и предложить новые варианты анализа для целей здравоохранения и охраны окружающей среды является одним из важнейших и перспективных направлений современной биотехнологии, поскольку именно ферментативные методы обеспечивают высокочувствительное и селективное определение физиологически активных веществ. В этой связи поиск, получение и характеристика новых ферментов для аналитической биотехнологии является актуальной задачей.

Одним из наиболее широко применяемых в аналитических целях ферментов является пероксидаза (КФ 1.1.11.7). Этот биокатализатор - один из ключевых ферментов, контролирующих рост растений, их дифференциацию и развитие. In vitro этот фермент широко применяется в иммуноферментном анализе и при конструировании ферментных электродов.

Хотя пероксидазы обнаруживаются в тканях практически всех растений, в настоящее время основным источником коммерчески доступной пероксидазы являются корни хрена (Armoracia rusticana). В то же время появление пероксидаз с повышенной стабильностью и отличной субстратной специфичностью могло бы повысить качество фермент-содержащих наборов и стимулировать разработку новых аналитических методов и промышленных процессов. С этой целью в настоящее время проводятся исследования пероксидаз из новых источников. На Химическом факультете МГУ им. М.В.Ломоносова под руководством д.х.н. Сахарова И.Ю. была впервые выделена пероксидаза из листьев пальм [1], которая обладала уникальной термостабильностью и кислотостабильностью [2], а также обладала повышенной стабильностью в органических растворителях. Учитывая многообразие флоры, можно предположить, что анионные пероксидазы растений из новых источников имеют хорошие перспективы для их практического использования в биотехнологии.

Задачей настоящей диссертационной работы является:

• Разработка метода выделения и очистки пероксидазы из кожуры клубней батата;

• Сравнительное изучение субстратной специфичности анионных пероксидаз (батата, пальмы и сои): по отношению к традиционно используемым субстратам пероксидаз, металлоорганическим комплексам рутения, хемилюминесцентной реакции окисления люминола;

• Изучение свойств анионных пероксидаз в качестве компонентов биосенсоров: с прямым переносом электронов, с применением органических; с использованием медиаторов (комплекса осмия, модифицированных поливинилимидазолом); в биферментной системе с использованием алкогольоксидазы;

• Изучение свойств анионных пероксидаз в качестве метки в имунноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией на примере пероксидазы сои.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Используя кожуру клубней батата (Ipomoea batatas) была выделена до гомогенного состояния анионная пероксидаза. Очистка пероксидазы проводилась, включая следующие стадии: гомогенизация, экстракция пигментов с помощью 2-х-фазной системы, включающей полиэтиленгликоль и сульфат аммония, гидрофобную хроматография на Фенил-сефарозе и ионнообменную хроматографию на ДЭАЭ-тоеперле. Чистота препарата была подтверждена с помощью SDS-электрофореза в денатурирующих условиях и изоэлектрофокусированием.

2. Молекулярная масса и изоэлектрическая точка пероксидазы батата равны 37000 Да и 3.5 соответственно; удельная активность, измеренная в отношении гваякола, -4900 ед/мг белка. Электронный спектр пероксидазы батата совпадал с типичным спектром гем-содержащих пероксидаз растений. Показано, что субстратная специфичность пероксидазы батата, изученная в отношении феруловой кислоты, гваякола, о-фенилендиамина, о-дианизидина, 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) аммония и пирокатехина, отлична от субстратной специфичности других пероксидаз растений.

3. Изучено влияние условий проведения реакции (рН и концентрации реагирующих соединений и буфера) окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой пероксидазами пальмы, батата и сои, на интенсивность хемилюминесценции. Показано, что максимальная хемилюминесценция регистрируется при рН 8.3, 8.4 и 7.8 в случае использования пероксидазы пальмы, сои и батата соответственно. Продемонстрировано, что эффективность катализа исследованных анионных пероксидаз практически не зависит от наличия в реакционной среде «усилителей» (4-иодфенола и 4-гидроксикоричной кислоты). Предел чувствительности определения пероксидаз пальмы, сои и батата по реакции окисления люминола пероксидом водорода составил 1 пМ, 0.3 пМ и 0.01 пМ, соответственно. Особенностью анионных пероксидаз растений является стабильность производимого ими при окислении люминола хемилюминесцентного сигнала, что позволяет говорить о перспективности применения этих новых ферментов в аналитической практике.

4. Показано, что комплексы рутения(Н) с общей формулой [Run(C~N)(N~N)2]PF6, где C-N = 2-фенилпиридин или 2-(4'-толил)пиридин, a N-N = 2,2'-бипиридин, 1,10-фенантролин или 4,4'-диметил-2,2'-бипиридин, легко окисляются Н2О2 в присутствии пероксидаз пальмы, батата и хрена. Все ферменты окисляют изученные комплексы рутения с одинаковой эффективностью. Найдено, что синтезированные рутенивые комплексы являются прекрасными медиаторами в пероксидазном катализе «плохих» субстратов, что было показано на примере изучения реакции окисления пирокатехина.

5. Изучены пероксидазы пальмы, хрена и батата, как активные компоненты ферментных электродов с прямым и медиаторным переносом электронов. Показано, что биосенсоры для определения Н2О2 на основе пероксидазы пальмы обладали наиболее высокой чувствительностью, более широким рабочим диапазоном и повышенной операционной стабильностью и стабильностью при хранении. Исследования по рН-зависимости сигнала биосенсоров продемонстрировали, что электроды, модифицированные пероксидазой пальмы, сохраняют способность детектировать Н2О2 при кислых условиях (рН 3-4).

Найдено, что конструирование ферментных электродов с медиаторным переносом электронов приводит к значительному увеличению чувствительности и стабильности биосенсоров для всех изученных пероксидаз.

6. На основе пероксидазы пальмы/хрена и алкогольоксидазы конструированы двухслойные биферментные биосенсоры для определения этанола. При создании чувствительного слоя биосенсора ферменты разного типа включались в разные слои электропроводящих полимеров. Сравнение биферментных биосенсоров на основе пероксидазы пальмы показало преимущество перед пероксидазой хрена: более высокая чувствительность, более широкий линейный диапазон определяемых концентраций этанола, большая операционная стабильность. Полученные биосенсоры протестированы для контроля качества вина. Результаты биоэлектрохимического анализа для реальных образцов вина показали хорошую корреляцию с спектрофотометрическим и рефрактометрическим методами, используемыми в настоящее время в виноделии.

7. Оптимизирован периодатный метод синтеза иммуноконъюгата пероксидазы сои и антител против иммуноглобулина G мыши. На примере разработанной тест-системы для определения IgG мыши продемонстрирована перспективность использования анионной пероксидазы сои в ИФА с хемилюминесцентной детекцией как ферментного маркера. Сравнения конъюгатов используемых антител с пероксидазами сои и хрена показало, что в случае пероксидазы сои в условиях реального анализа затухание образующегося хемилюменесцентного сигнала протекало значительно медленней. Применение конъюгата с пероксидазой сои позволило повысить чувствительность и рабочий диапозон изучаемой тест-системы.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор благодарит ИНТ АС (контракт 00-751), ИНТ АС для молодых ученых (контракт 03-55-2428) и Федеральное агентство по науке и инновациям (государственный контракт 02.512.11.2009) за финансовую поддержку данной диссертационной работы.

1. Sakharov, I.Yu., Vesga Blanco, M.K., Galaev,I .Yu., Sakharova, I.V., Pletjushkina,O.Yu. (2001) Peroxidase from leaves of royal palm tree Roystonea regia: purification and some properties. Plant Science, 161, 853-860.

2. Welinder, K.G., Rasmussen, S.K., Penel, C., & Greppin, H., eds. (1993) Structure and Evolution of Peroxidases. In Plant Peroxidases Biochemistry and Physiology, 35-42.

3. Finzel, B.C., Poulos, T.L. and Kraut, J. (1984) Crystal structure of yeast cytochrome с peroxidase refined at 1.7-A resolution. J Biol Chem, 259,13027-36.

4. Patterson, W.R. and Poulos, T.L. (1995) Crystal structure of recombinant pea cytosolic ascorbate peroxidase. Biochemistry, 34,4331 -41.

5. Piontek, K., Glumoff, T. and Winterhalter, K. (1993) Low pH crystal structure of glycosylated lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.5 A resolution. FEBS Lett, 315,119-24.

6. Poulos, T.L., Edwards, S.L., Wariishi, H. and Gold,M.H. (1993) Crystallographic refinement of lignin peroxidase at 2 A. J Biol Chem, 268,4429-40.

7. Sundaramoorthy, ML, Kishi, K., Gold, M.H. and Poulos, T.L. (1994) The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.06-A resolution. J Biol Chem, 269, 32759-67.

8. Petersen, J.F., Kadziola, A. and Larsen, S. (1994) Three-dimensional structure of a recombinant peroxidase from Coprinus cinereus at 2.6 A resolution. FEBS Lett, 339,291-6.

9. Schuller, D.J., Ban,N., Huystee, R.B., McPherson, A. and Poulos, T.L. (1996) The crystal structure of peanut peroxidase. Structure, 4,311-21.

10. Gajhede, M., Schuller, D.J., Henriksen, A., Smith, A.T. and Poulos, T.L. (1997) Crystal structure of horseradish peroxidase С at 2.15 A resolution. Nat Struct Biol, 4,1032-8.

11. Henriksen, A., Welinder, K.G. and Gajhede, M. (1998) Structure of barley grain peroxidase refined at 1.9-A resolution. A plant peroxidase reversibly inactivated at neutral pH. J Biol Chem, 273,2241-8.

12. Henriksen, A., Mirza, O., Indiani, C., Teilum, K., Smulevich, G., Welinder, K.G. and Gajhede,M. (2001) Structure of soybean seed coat peroxidase: a plant peroxidase with unusual stability and haem-apoprotein interactions. Protein Sci, 10,108-15.

13. Mirza, O., Henriksen, A., Ostergaard, L., Welinder, K.G. and Gajhede,M. (2000) Arabidopsis thaliana peroxidase N: structure of a novel neutral peroxidase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 56 (Pt 3), 372-5.

14. Bhattacharyya,D.K., Bandyopadhyay,U. and Banerjee,R.K. (1993) Chemical and kinetic evidence for an essential histidine residue in the electron transfer from aromatic donor to horseradish peroxidase compound I. J Biol Chem, 268,22292-8.

15. Newmyer, S.L., Sun, J., Loehr,T.M. and Ortiz de Montellano,P.R. (1996) Rescue of the horseradish peroxidase His-170-->Ala mutant activity by imidazole: importance of proximal ligand tethering. Biochemistry, 35, 12788-95.

16. Berglund,G.L, Carlsson,G.H., Smith,A.T., Szoke,H., Henriksen,A. and Hajdu,J. (2002) The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution. Nature, 417,463-8.

17. Newmyer,S.L. and Ortiz de Montellano,P.R. (1995) Horseradish peroxidase His-42 --> Ala, His-42 --> Val, and Phe-41 --> Ala mutants. Histidine catalysis and control of substrate access to the heme iron. J Biol Chem, 270,19430-8.

18. Newmyer,S.L. and de Montellano,P.R. (1996) Rescue of the catalytic activity of an H42A mutant of horseradish peroxidase by exogenous imidazoles. J Biol Chem, 271,148916.

19. Savenkova,M.I., Newmyer,S.L. and Montellano,P.R. (1996) Rescue of His-42 --> Ala horseradish peroxidase by a Phe-41 —> His mutation. Engineering of a surrogate catalytic histidine. J Biol Chem, 271,24598-603.

20. Tanaka,M., Ishimori,K., Mukai,M., Kitagawa,T. and MorishimaJ. (1997) Catalytic activities and structural properties of horseradish peroxidase distal His42 --> Glu or Gin mutant. Biochemistry, 36,9889-98.

21. Tanaka,M., Nagano,S., Ishimori,K. and MorishimaJ. (1997) Hydrogen bond network in the distal site of peroxidases: spectroscopic properties of Asn70 --> Asp horseradish peroxidase mutant. Biochemistry, 36,9791-8.

22. Nagano,S., Tanaka,M., Watanabe,Y. and MorishimaJ. (1995) Putative hydrogen bond network in the heme distal site of horseradish peroxidase. Biochem Biophys Res Commun, 207,417-23.

23. Nagano,S., Tanaka,M., Ishimori,K., Watanabe,Y. and MorishimaJ. (1996) Catalytic roles of the distal site asparagine-histidine couple in peroxidases. Biochemistry, 35,14251-8.

24. Rodriguez-Lopez,J.N., Smith,A.T. and Thorneley,R.N. (1996) Role of arginine 38 in horseradish peroxidase. A critical residue for substrate binding and catalysis. J Biol Chem, 271,4023-30.

25. Rodriguez-Lopez,J.N., Smith,A.T. and Thorneley,R.N. (1997) Effect of distal cavity mutations on the binding and activation of oxygen by ferrous horseradish peroxidase. J Biol Chem, 272,389-95.

26. Henriksen,A., Smith, A.T. and Gajhede,M. (1999) The structures of the horseradish peroxidase C-ferulic acid complex and the ternary complex with cyanide suggest how peroxidases oxidize small phenolic substrates. J Biol Chem, 274,35005-11.

27. Frew,J.E., Jones,P.L., (1984) Structure and Functional Properties of Peroxidases and Catalases. Advances in Inorganic and Bioinorganic Mechanisms, 3,175-212.

28. Arnao,M.B., Acosta,M., Del Rio,J.A., Garcia-Canovas,F. (1990) Inactivation of Peroxidase by Hydrogen Peroxide and its Protection by a Reductant Agent. Biochim.Biophys.Acta,. 1038, 85-8

29. Arnao,M.B., Acosta,M., Del Rio,J.A., Varon,R., Garcia-Canovas,F. (1990) A kinetic study on the suicide inactivation of peroxidase by peroxide. Biochim.Biophys.Acta,. 1041, 43-47.

30. Acosta M., Arnao M.B., Del Rio J.A., Garcia-Canovas F. (1989) Kinetic Characterisation of the Inactivation Process of Two Peroxidase Isozymes on the Oxidation of Indolyl-3-acetic Acid. Biochim.Biophys.Acta, 996, 7-12.

31. Arnao,M.В., Sanchez-Bravo,J., Acosta,M. (1993) Indole-3-Methanol as a Substrate of Horseradish Peroxidase, in Plant Peroxidases Biochemistry and Physiology, K.G. Welinder, et al., Editors., University of Geneva: Geneva., 181-184.

32. Ator,M.A., David,S.K., De Montellano,P.R.O. (1987) Structure and Catalytic Mechanism of Horseradish Peroxidase. Regiospecific meso alkylation of the prosthetic heme group by alkylhydrazines. J.Biol.Chem.,. 262, 14954-14960.

33. Ator,M.A., De Montellano,P.R.O., Protein control of Prostetic Heme Reactivity. Reaction of substrates. J.Biol.Chem., 1987.262, 1542-1551.

34. Cormier, M. J.; Prichard, P. M. (1968) An Investigation of the Mechanism of the Luminescent Peroxidation of Luminol by Stopped Flow Techniques. J. Biol. Chem. 243, 4706-4714.

35. Whitehead, T.P.; Thorpe, G.H.G.; Carter, T.J.N.; Groucutt,C.; Kricka, L.J. (1983) Enhanced Luminescence Procedure for Sensitive Determination of Peroxidase-Labelled Conjugates in Immunoassays. Nature, 305,158-159.

36. Thorpe, G. H. G.; Williams, L. A.; Kricka, L. J.; Whitehead, T. P.; Evans, H.; Stanworth, D. R. (1985)A Rapid Luminescently Monitored Enzyme Immunoassay for IgE. J. Immunol. Method., 79, 57-63.

37. Kricka, L. J.; Stott, R. A. W.; Thorpe, G. H.(1988) Enhanced Chemiluminescence Enzyme Immunoassays. In Complementary Immunoassays; W.P. Collins, Ed.; Chichester, Willey., 3(2), 1-5.

38. Thorpe, G. H. G.; Kricka, L. J. (1986) Enhanced Chemiluminescent Assays for Horseradish Peroxidase: Characteristics and Applications. In Bioluminescence and Chemiluminescence, New Perspectives; J.Scholmerich et all, Ed.; Chichester, Willey; 199208.

39. Ohnishi, Т.; Jamasaki, I.; Jyanagi, Т.; Nakamura, Т. (1969) EPR Investigation of Cooxidation of Two Peroxidase Substrates. Biochim. Biophys. Acta, 172(3), 357-359.

40. Piette, L. H.; Jamasaki, I. (1963) The Rapid Oxidation of Ascorbic Acid by HRP-Containing System. Biochim. Biophys. Acta, 77(1), 47-64.

41. Лебедева, О. В.; Угарова, Н. Н.; Березин, И. В.(1981) Совместное Окисление Ферроцианида Калия и О-Дианизидина Перекисью Водорода, Катализируемое Пероксидазой Хрена. Субстрат-Субстратная Активация. Биохимия, 46(7), 1202-1209.

42. Merenyi, G.; Lind, J.; Eriksen, Т. E. (1984) The Equilibrium Reaction of the Luminol Radical With Oxigen and the One-Electron-Reduction Potential of 5-AminophtaIazine-l,4-Dione. J. Phys. Chem., 88(11), 2320-2323.

43. Hodson, M.; Jones, P. L. (1989) Enhanced Chemiluminescence in the Peroxidase-Luminol-H202 System: Anomalous Reactivity of Enhancer Phenols With Enzyme Intermediates. J. Biolumines. Chemilumines., 3(1), 21-25.

44. Кулис, Ю. Ю.; Казлаускайте, Ю. Д.; Виджюнайте, А.; Разумас, В. Й. (1991) Биохимия, 56, 78-84.

45. Merenyi, G.; Lind, J.; Shen, X.; Eriksen, Т. E. (1990) Oxidation Potential of Luminol. Is the Autoxidation of Singlet Organic Molecules an Oute-Sphere Electron Transfer J. Phys. Chem.,94, 748-758.

46. Jansen, E. H. J. M.; Van der Berg, R. H. (1991) High-Performance Liquid Chromatographic Investigation of Product Formation in the Horseradish Peroxidase-Enhanced Chemiluminescence of Luminol With Different Enhancers. J. Chromatogr., 566, pp: 461-469.

47. Diaz.A.N.; Sanchez, F. G.; Garcia, J. A. G. (1995) Enhancement and Inhibition of Luminol Chemiluminescence by Phenolic Acids. J. Biolumines. Chemilumines., 10(3), 175184.

48. Easton, P.; Simmonds, A. C.; Rakishev, A.; Egorov, A. M.; Candeias, L. P. (1996) Quantitative Model of the Enhancement of Peroxidase-Induced Luminol Luminescence. J. Am. Chem. Soc„ 118(28), 6619-6624.

49. Kauffmann, C., Petersen, B.R., and Bjerrum, M.J. (1999) Enzymatic removal of phenols from aqueous solutions by Coprinus cinereus peroxidase and hydrogen peroxide J. Biotechnol., 73, 71-74

50. Ferrari, R.P., Laurenti, E., and Trotta, F. (1999) Oxidative 4-dechlorination of 2,4,6-trichlorophenol catalyzed by horseradish peroxidase. J. Biol. Inorg. Chem., 4,232-237

51. Adam, W., Lazarus, M., Saha-Moller, C.R., Weichold, 0., Hoch, U., Haring, D., and Schreier, P. (1999) Biotransformations with peroxidases. Biochem. Engineering Biotechnology (Scheper, Th., ed.), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 63, 74-108

52. Kim, S.J., and Shoda, M. (1999) Purification and characterization of a novel peroxidase from Geotrichum candidum Dec 1 involved in decolorization of dyes. Appl. Environ. Microbiol., 65, 1029-1035

53. Thongsook, Т., Bamet, D.M. (2005) Purification and patial charcterization of Broccoli peroxidases. J. Agric. Food Chem., 53, 3206-3214.

54. Roberts E; Kutchan T; Kolattukudy P.E. (1988) Potato Peroxidase. Plant Mol Biol, 11, 15-31.

55. Pomar, F., Angeles Bernal, M., Diaz, J., Merino, F. (1997) Purification, characterization an kinetic properties of pepper fruit acidic peroxidase. Phytochemistry, 46 (8), 1313-1317.

56. Duarte-Vazquez, M.A., Whitaker, J.R., Rojo-Dominguez, A., Garcia-Almendarez, B.E., Regalado, C. (2003) Isolation and thermal characterization of an acidic isoperoxidase from turnip roots. J. Agric. Food Chem., 51, 5096-5102.

57. Schmitz, N., Giles, K.A., van Huystee, R.B. (1989) Characterization of anionic soybean (Glycine max) seed coat peroxidase. Can. J. Bot. 75, 1336-1341.

58. Brooks, J. L. (1986) Oxidase reactions of tomato anionic peroxidase. Plant Physiol., 80, 130-133.

59. Mazza, G.; Welinder, K. G.(1980) Covalent Structure of Turnip Peroxidase 7. Cyanogen Bromide Fragments, Complete Structure and Comparison to Horseradish Peroxidase C. Eur. J. Biochem., 108(2), 481-489.

60. Clemente, E. (1998) Purification and thermostability of isoperoxidase from oranges. Phytochemistry, 49,29-41.

61. McLellan, К. M.; Robinson, D. S. (1987) Purification and heat stability of Brussels sprout peroxidase isoenzymes. Food Chem., 23, 305-319.

62. Lagrimini L.M.; Burkhart W; Moyer M.; Rothstein S (1987) Tabac Peroxidase. Proc Natl Acad Sci USA, 84, 7542-7546.

63. Abeles, F. В.; Dunn, L. J.; Morgens, P.; Callahan, A.; Dinterman, R. E.; Schmidt, J. (1988) Cucumber Peroxidase. Plant Physiol, 87, 609-615.

64. Anthon, G. E.; Barrett, D. M. (2002) Kinetic parameters for the thermal inactivation of quality-related enzymes in carrots and potatoes. J. Agric. Food Chem., 50,4119-4125.

65. Shinmen Y.; Asami S.; Amashi Т.; Shimizu S.; Yamada H.(1986) Novell Peroxidase From Arthromyces Ramosus. Agric. Biol. Chem., 241(4), 247-249.

66. Da Silva, E.; Lourenco, E. J.; Neves, V. A. (1990) Soluble and bound peroxidases from papaya fruit. Phytochemistry, 29, 1051.

67. Мухамеджанов Б.Г. (1983) Новые Источники Пероксидаз. Изв. АН КазСС, Сер. Биол., 48(4), 14-17.

68. Halpin, В.; Pressey, R.; Jen, J.; Mondy, N. (1989) Purification and characterization of peroxidase isoenzymes from green peas (Pisum sativum). J. Food Sci., 54,644.

69. Triplett, B. A.; Mellon, J. E. (1992) Purification and characterization of anionic peroxidases from cotton (Gossypium hirsutum). Plant Sci., 81,147-154.

70. Civello, P. M.; Martinez, G. A.; Chaves, A. R.; Anon, M. C. (1995) Peroxidase from strawberry fruit (Fragaria ananassa-Duch)-partial-purification and determination of some properties. J. Agric. Food Chem., 43,2596-2601.

71. Nair, A. R.; Showalter, A. M. (1996) Purification and characterization of a wound-inducible cell wall cationic peroxidase from carrot roots. Biochem. Biophys. Res. Commun., 226,254.

72. Van Huystee, R. В.; Ни, C.; Sesto, P. A. (1990) Comparisons Between Cationic and Anionic Peanut Peroxidase As Glycoproteins. In Isozymes: Structure, Function, and Use in Biology and Medicine; Wiley-Liss: 1; 315-325.

73. Buffard, D.; Breda, C.; Van Huystee, R. В.; Asemota, O.; Pierre, M.; Ha, D. B. D.; Esnault, R. (1990) Molecular Cloning of Complementary DNAs Encoding Two Cationic Peroxidases From Cultivated Peanut Cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87,8874-8878.

74. Kristensen, В. K.; Bloch, H.; Rasmussen, S. K. (1999) Barley coleoptile peroxidases. Purification, molecular cloning, and induction by pathogens. Plant Physiol., 120, 501-518.

75. Ito, H.; Hiraoka, N.; Ohbayashi, A.; Ohashi, Y. (1991) Purification and characterization of rice peroxidases. Agric. Biol. Chem., 55,2445-2454.

76. Fujiyama, K.; Takemura, H.; Shinmyo, A.; Okada, H.; Takano, M. (1990) Genomic DNA Structure of Two New Horseradish-Peroxidase-Encoding Genes. Gene, 89(2), 163-169.

77. Fujiyama, K.; Takemura, H.; Shinmyo, A.; Okada, H.; Takano, M. (1990) Genomic DNA Structure of Two New Horseradish-Peroxidase-Encoding Genes. Gene, 89(2), 163-169.

78. Газарян И.Г., Решетникова И.А., Досеева И.И., Беккер E.G. (1995) Биохимия, 60, 767-772.

79. Сахаров, И.Ю. (2004) Пероксидазы пальм (обзор). Биохимия, 67, 1013-1020

80. Liu, W., Cholli, A.L., Nagarajan, R., Kumar, J., Tripathy, S., Bruno, F.F., and Samuelson, L. (1999) Enzymatically synthesized conducting polyaniline. J. Am. Chem. Soc., 121,71-78.

81. Березин И.И., Угарова Н.Н., Кершенгольц Б.М., Бровко Л.Ю. (1975) Влияние простетической группы пероксидазы хрена на стабильность фермента. Биохимия, 40, 297-300.

82. Pina, D.G., Shnyrova, A.V., Gavilanes, F., Rodriguez, A., Leal, F., Roig, M.G., Sakharov, I.Yu., Zhadan, G.G., Villar, E., and Shnyrov, V.L. (2001) Thermally induced conformational changes in horseradish peroxidase. Eur. J. Biochem., 268,120-126.

83. Sakharov, I.Yu., and Sakharova, I.V. (2002) Extremely high stability of african oil palm tree peroxidase Biochim.Biophys.Acta, 1598,115-121.

84. McEldoon, J.P., and Dordick, J.S. (1996) Unusual thermal stability of soybean peroxidase . Biotechnol. Prog., 12, 555-558.

85. Clark, L.C., Lyons, C. (1962) Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann. NY Acad. Sci., 102, 29-45.

86. Guilbault, G.G., Lubrano, G.J. An enzyme electrode for amperometric determination of glucose. Anal. Chim. Acta, 64 (3), 439-455 (1973).

87. Тернер, Э., Карубе, И., Уилсон, Дж. (1992) Биосенсоры: основы и приложения. "Мир", М.,614.

88. Schmidt, H.-L., Schuhmann, W. (1996) Reagentless oxidoreductase sensors. // Biosens. Bioelectron. 11 (1/2), 127-135.

89. Mauk, A.G., Scott, R.A., Gray, H.B. (1980) Distances of electron transfer to and from matalloprotein redox sites in reaction with inorganic complexes. J. Am. Chem. Soc., 102 (13), 4360-4363.

90. Григоров, JI.H., Чернавский, Д.С. (1972) Квантово-механистическая модель переноса электрона от цитохрома к хлорофилу в фотосинтезе. Биофизика, 17 (2), 195202.

91. Кулис, Ю.Ю., Разумас, В.И. (1983) Биокатализ в электрохимии органических соединений. "Москлас", Вильнюс, 168 .

92. Eddowes, М. J.; Hill, Н.А.О. (1977) Novel metod for investigation of electrochemistry of metalloproteins cytochrom-C. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 21,771.

93. Yeh, P.; Kuwana, T. (1977) Reversible electrode-reaction of cytochrome-C. Chem. Lett., 10,1145.

94. Yaroplov, A.I.; Malovik, V.; Varfolomeev, S.D.; Berezin, I.V.; Dokl. Akad. Nauk. SSSR 1979,249,1399.

95. Larsson, Т.; Elmgren, M.; Lindquist, S.E.; Tessema, M.;Gorton, L.; Henriksson, G. (1996) Electron transfer between cellobiose dehydrogenase and graphite electrodes. Anal. Chim. Acta, 331,207.

96. Schumacher, J.T., Hecht, H-J., Dengler, U., Reichelt, J., Bilitewski, U. (2001) Direct electron transfer observed for peroxidase to screen-printed graphite electrodes. Electroanalysis, 13,779-785.

97. Gorton, L., Lindgren, A., Larsson, Т., Munteanu, F.D., Ruzgas, Т., Gazaryan, I. (1999) Direct electron transfer between heme-containing enzymes and electrodes as basis for third generation biosensors. Anal. Chim. Acta, 400, 91-108.

98. Gaspar, S., Popescu, I.C., Gazaryan, I.G., Bautista Ardila, G., Sakharov, I.Yu., Mattiasson В., Csoregi E. (2000). Biosensors based on novel plant peroxidases: a comparative study. Electrochem. Acta, 46,255-264.

99. Ferapontova, E., Puganova, E., (2002) Effect of pH on direct electron transfer between graphite and horseradish peroxidase. J. Electroanal. Chem. 518,20-26

100. Ruzgas, Т.; Csoregi, E.; Emneus, J.; Gorton, L.; Marko-Varga, G. (1996) Peroxidase-modified electrodes: Fundamentals and application. Anal. Chim. Acta, 330, 123-130.

101. Renato, S. F., Christiana, A. P., Lucilene, D. M. and Lauro, Т. K. (2003) Direct Electron Transfer: An Approach for Electrochemical Biosensors with Higher Selectivity and SensitivityJ. Braz. Chem. Soc., 14(2), 230-243.

102. Kok, G.L., Darnall, K.R., Winer, A.M., Pitts, J.N. and Gay, B.W. (1978) Chemiluminescence method of the determination of hydrogen peroxide in the ambient atmosphere. Environ. Sci. Technol., 12,1077.

103. Jolliet, P., Polla, В., Donath, A., Slosman, D.(1994) Early hydrogen peroxide-induced pulmonary endothelial cell dysfunction: detection and prevention. Critical Care Medicine, 22, 157-162.

104. Tatsuma, Т., Gondaira, M. and Watanabe, T. (1992) Peroxidase-Incorporated Polypyrrole Membrane Electrode. Anal. Chem., 64, 1183-1187.

105. Price, D., Mantoura, R.F.C., Worsfold, P.J. (1998) Shipboard determination of hydrogen peroxide in the western Mediterranean sea using flow injection with chemiluminescence detection. Anal. Chim. Acta, 371,05-215.

106. Navas, M.J., (1999) Air analysis: determination of hydrogen peroxide by chemiluminescence. Atmospheric Environment, 33,2279-2283.

107. Tanner, P.A., Wong, A.Y.S. (1998) Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide in rainwater. Anal. Chim. Acta, 370,279-287.

108. Sakuragawa, A., Taniai, Т., Okutani, T. (1998) Fluorimetric determination of hydrogen peroxide with an immobilized enzyme prepared by coupling horseradish peroxidase to chitosan beads. Anal. Chim. Acta, 374,191-200.

109. Karyakin, A.A., Karyakina, E.E.(1999) Prussian blue-based "artificial peroxidase" as a transducer for hydrogen peroxide detection. Application to biosensors. Sensors and Actuators B, 57,268-273.

110. Gorton, L. (1995) Carbon paste electrodes modified with enzymes, tissues, and cells. Electroanalysis 7,23-45.

111. Roda, A., Girotti, S., Ghini, S., Carrea, G. (1989) Coupled reactions for the determination of analytes and enzymes based on the use of luminescence. J. Biolum. and Chemilum 4 (1), 423-435.

112. Girotti, S., Roda, A., Angellotti, M.A., Ghini, S., Carrea, G., Bovara, R., Piazzi, S., Merighi, R. (1988) Bioluminescence flow system for determination of branched chain L-amino acids in serum and urine. Anal. Chim. Acta, 205,229-237.

113. Blum, L.J., Gautier, S.M., Coulet, P.R. (1989) Design of luminescence photobiosensors. J. Biolum. and chemilum., 4 (1), 543-550 .

114. Olsson, B. (1985) A flow-injection system using immobilized peroxidase and chromogenic reagents for possible determination of hydrogen peroxide. Microchim. Acta., 2 (3-4), 211-221 .

115. Diaz, A.N., Peinado, M.C.R., Minguez, M.C.T. (1998) Sol-gel horseradish peroxidase biosensor for hydrogen peroxide detection by chemiluminescence. Anal. Chim. Acta, 363, 221-227.

116. Xiao, Y., Ju, H.X., Chen, H.Y. (1999) Hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase-labeled Au colloids immobilized on gold electrode surface by cysteamine monolayer. Anal. Chem, 391, 73-82 .

117. Wellinberger, U., Wang, J., Ozsoz, M., Gonzalez-Romero, E., Scheller, F. (1991) Bulk modifme enzyme electrodes for reagentless detection of peroxides. Bioel.Bioeng, 26,287295.

118. Lotzbeyer, Т., Schuhmann, W., Schmidt, H-L. (1995) Direct electrocatalytical H202 reduction with hemin covalently immobilized at monolayer-modified gold electrode.

119. J. Electroanal. Chem, 395, 341-344 .

120. Woodward, J. R., Gibson ,T. D., Parker, S. (1993) Interactions of proteins and stabilizers in biosensor systems. Proc. Symp. Chem. Sensors, Honolulu, Hawaii, May 16-21.

121. Dock, E., Lindgren, A., Ruzgas, Т., Gorton, L. (2001) Effect of interfering substances on current response of recombinant peroxidase and glucose oxidase-recombinant peroxidase modified graphite electrodes. Analyst, 126(11), 1929-1938.

122. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. (1986) Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Anal. Biochem. 133, 27-42.

123. Swerdlov, P., Finley, F., Varshavstry, A. (1986) Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153.

124. Freire, R.S., Pessoa, C.A., Mello, L.D., Kubota, L.T. (2003) Direct Electron Transfer: An Approach for Electrochemical Biosensors with Higher Selectivity and Sensitivity. J. Braz. Chem. Soc., 14(2), 230-243.

125. Tijssen, P. (1985) Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, Elsevier, Amsterdam.

126. Nakane, P.K.; Kawaoi, A. (1974) Peroxidase-labeled antibody: a new method of conjugation. J.Histochem.Cytochem., 22, 1084-1091.

127. Miles L., Hales C. (1968) Labelled antibodies and immunological assay systems. Nature, 219,186-189.142. van Weemen, B.K, Schuurs, A. (1971) Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett, 15, 232-236.

128. Engvall, E, Perlmann, P. (1971) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry; 8, 871-874.

129. Hammock, B.D. and Mumma, R.O. (1980) Potential of immunochemical technology for pesticide analysis. In: Pesticide Analytical Methodology, (Harvey, J., Jr. and G. Zweig, eds.), 10, 321-352

130. Sibanda, L, De Saeger, S. & Van Pethegem, C. (2000) Detection of T-2 toxin in different cereals by flow-through enzyme immunoassay with a simultaneous internal reference. J. Agric. Food Chem., 48, 5864-5867.

131. Habermuler K, Ramanavicius A, Laurinavicius V, Schuhmann W (2000) An Oxygeninsensitive Reagentless Glucose Biosensor Based on Osmium-Complex modified Polypyrrole. Electroanalysis, 12,1383.

132. Ngounou, B, Ruhlig, D, Neugebauer, S, Ryabova, V, Hartwich, G, Schuhmann, W Osmiumcomplexmodified cathodic and anodic electrodeposition paints as a basis for the development of reagentless glucose biosensors. Submitted for publication.

133. Gonchar, M, Maidan, M, Korpan, Y, Sibirny, V, Kotylak, Z, Sibirny, A (2002) Metabolically engineered methylotrophic yeast cells and enzymes as sensor biorecognition elements. FEMS Yeast Research, 2,307.

134. Kulmacz, R.J. (1986) Prostaglandin H synthase and hydroperoxides: peroxidase reaction and inactivation kinetics, Arch. Biochem. Biophys. 249,273-285.

135. Ryabov, A.D., and Goral, V.N. (1997) Steady-state kinetics, micellar effects, and the mechanism of peroxidase-catalyzed oxidation of n-alkylferrocenes by hydrogen peroxide. J.Biol.Inorgan.Chem., 2, 182-190.

136. Sakharov, I.Y., Bautista Ardila, G., Sakharova, I.V., Rojas, A., Pletjuschkina, O.Y. (1999) Peroxidase of tropical plants, Rev. Col. Qui'mica, 28, 97-106.

137. Henriksen, A., Mirza, O., Indiani, C., Teilum, K., Smulevich, G., Welinder K.G. and Gajhede, M., (2001) Structure of soybean seed coat peroxidase: A plant peroxidase with unusual stability and haem-apoprotein interactions. Protein Sci., 10,108-115