Новые аспекты применения нативной и иммобилизованной пероксидазы хрена для определения ее ингибиторов и субстратов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Л

994605432 Яблоцкий Константин Витальевич

НОВЫЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ НАТИВНОЙ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕЕ ИНГИБИТОРОВ И СУБСТРАТОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 о ИЮН 2010

Москва-2010

004605432

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Шеховцова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: Доктор химических наук, профессор

Бабкииа Софья Сауловна

кафедра общей и неорганической химии имени Н.Л. Глинки химико-технологического факультета Московского Государственного Открытого Университета

Доктор химических наук, профессор

Еремин Сергей Александрович

кафедра химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН РФ

Защита состоится 23 июня 2010 г. в 15 ч. 00 мин. в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 20 мая 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В последние годы большое внимание исследователей -аналитиков по-прежнему уделяется проблемам экологического мониторинга, контроля качества пищевых продуктов и лекарственных средств и клинической диагностики. В связи с этим актуальна задача высокочувствительного определения неорганических и органических токсикантов (ионов тяжелых металлов, анионов, фенолов, ядохимикатов) и физиологически активных органических соединений (витаминов, гормонов) в объектах окружающей среды, медицины, продуктах питания. В настоящее время разработано большое количество инструментальных методов определения таких соединений, однако все они не лишены недостатков с точки зрения чувствительности, селективности, простоты и экспрессности определения. Для решения этих проблем одним из перспективных направлений является применение биологических катализаторов - ферментов, поскольку большинство токсичных и физиологически активных веществ является либо их субстратами либо эффекторами. В то же время разработка ферментативных методик определения этих веществ часто ограничена малой доступностью, сложностью выделения, ограниченной субстратной специфичностью или низкой стабильностью препаратов ферментов.

Пероксидаза из корней хрена (ПХ) - один из наиболее изученных и доступных ферментов класса оксидоредуктаз, обладающих групповой субстратной специфичностью и высокой каталитической активностью. Вследствие этого пероксидазу хрена широко используют для разработки ферментативных методик определения большого числа органических и неорганических веществ, являющихся ее субстратами и эффекторами. Однако перспективы дальнейшего использования ПХ в химическом анализе пока ограничены низкой стабильностью и активностью нативного фермента в органических и водно-органических средах. Одним из путей решения этой проблемы может быть переведение нативного биокатализатора в иммобилизованное состояние или включение его в состав прямых и обращенных мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ). Варьирование природы и свойств носителя для иммобилизации фермента и природы ПАВ дает возможность создавать препараты биокатализатора с заданными свойствами. Это, в свою очередь, позволяет расширить круг определяемых соединений за счет ограниченно растворимых в воде и средне окисляемых субстратов, сохранить активность фермента и обеспечить его стабильность в среде органических растворителей, повысить чувствительность методик определения субстратов-флуорофоров за счет варьирования .метода контроля процессов и усиления аналитического сигнала. Все вышесказанное свидетельствует о далеко не исчерпанных возможностях использования пероксидазы хрена в целях химического анализа и перспективности проведения исследований в этой области.

Цель работы заключалась в разработке подходов к расширению возможностей использования нативной и иммобилизованной пероксидазы из корней хрена при определении ее ингибиторов (неорганических анионов), средне окисляемых субстратов-восстановителей (катехоламинов и их метаболитов) и ограниченно растворимых в воде субстратов-окислителей (органических пероксидов).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие

задачи:_____

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической химии МГУ им. М.В. Ломоносова И.А. Веселовой за участие в постановке задач и обсуждении результатов исследований.

- получить стабильные и активные препараты пероксидазы хрена, иммобилизованной на модифицированных силикагелях, выяснить чувствительность иммобилизованной ПХ к действию неорганических анионов (фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов), разработать спектрофотометрические чувствительные и селективные методики их определения в реальных объектах - пищевых продуктах и биологических жидкостях;

- изучить возможность применения нативной пероксидазы для определения ее средне окисляемых субстратов - катехоламипов и их метаболитов с флуориметрическим контролем скорости индикаторных реакций, проводимых в водной, водно-органической средах и в присутствии ПАВ;

- показать возможность применения нативной пероксидазы для определения ее ограниченно растворимых в воде субстратов-окислителей (на примере трет-бутилгидропероксида и 2-бутанонпероксида) в среде органических растворителей и прямых мицелл ПАВ.

Научная новизна. Получены активные и стабильные во времени препараты пероксидазы хрена, иммобилизованной на силикагелях, модифицированных тиоцианатными, изотиоцианатными, эпоксидными и амино-группами с различной длиной углеводородного радикала, связывающего молекулы фермента с носителем. Установлено, что характер влияния ингибиторов (фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов) на каталитическую активность иммобилизованной ПХ зависит от конформационной подвижности активного центра фермента и от времени инкубирования иммобилизованного биокатализатора с ингибитором.

Предложено применение нативной ПХ в среде ДМСО и прямых мицелл цетилтриметиламмонийбромида (ЦТМА) в качестве более эффективного (по сравнению с неорганическими катализаторами) катализатора процессов дериватизации ее средне окисляемых субстратов - катехоламинов (допамина, адреналина, серотонина, добутамина, метилдопы) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) с 1,2-жезо-дифенилэтилендиамином (ДЭД) и бензиламином (БА). Показано, что проведение процессов дериватизации катехоламинов и их метаболитов с БА в присутствии ПХ, включенной в состав прямых мицелл ЦТМА, обеспечивает стабилизацию интенсивно флуоресцирующих дериватизатов. Этот эффект использован для улучшения метрологических характеристик ферментативных методик определения гормонов (адреналина и допамина) и метаболита (гомованилиновой кислоты).

Показано, что введение 75 об.% ДМСО в катализируемую ПХ реакцию окисления флуоресцеина пероксидом водорода и органическими пероксидами приводит к значительному увеличению эффективности возбуждения хемилюминесценции флуоресцеина, что способствует повышению чувствительности определения субстратов-окислителей ПХ.

Практическая значимость работы. На основе полученных препаратов пероксидазы хрена, ковалентно иммобилизованной на модифицированных силикагелях, разработаны высокочувствительные методики определения ее неорганических ингибиторов (фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов). Методики апробированы в анализе питьевых вод и биологических (крови, слюны) объектов. Разработаны высокочувствительные и селективные методики определения ряда катехоламинов (допамина, адреналина, добутамина, метилдопы) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) - субстратов-восстановителей пероксидазы с использованием ее ассоциатов с катионным ПАВ - цетилтриметил-аммонийбромидом. Методика определения гомованилиновой кислоты апробирована

в анализе биологической жидкости (мочи). Разработаны высокочувствительные методики определения ограниченно растворимых в воде субстратов-окислителей пероксидазы - органических пероксидов (mjoem-бутилгидропероксида и 2-бутанон-пероксида) в средах с высоким содержанием полярного органического растворителя ДМСО, которые были использованы в анализе водонерастворимого объекта -оливкового масла.

Автор выносит на защиту:

- способы получения высокостабильных и активных препаратов ПХ, ковалентно иммобилизованной на силикагелях, модифицированных тиоцианатными, изотиоцианатными, эпоксидными и амино-группами, а также флуоресцирующих производных катехоламинов (допамина, адреналина) и их метаболитов;

- результаты изучения кинетики окисления пероксидом водорода о-дианизидина и катехоламинов (допамина и адреналина), катализируемого иммобилизованной и нашивной пероксидазой соответственно;

- сведения о механизме процессов дериватизации катехоламинов с мезо-1,2-дифенилэтилендиамином и бензиламином, катализируемой нативной пероксидазой;

- данные о влиянии параметров среды (pH, природы ПАВ и состава растворителя) на эффективность взаимодействия пероксидазы с ее субстратами и ингибиторами;

- методики определения ингибиторов (неорганических анионов), субстратов-восстановителей (катехоламинов и их метаболитов) и субстратов-окислителей (органических пероксидов), апробированные в анализе реальных объектов: биологических жидкостей, питьевых вод, пищевых продуктов.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на 9 международных и всероссийских конференциях: международной конференции "International Congress on Analytical Sciences "ICAS-2006" (Moscow, 2006); International Symposium "Kinetics in analytical chemistry" (Marrakesh, Morocco, 2006); международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2007» (Москва, 2007), «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008); XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007); International Conference «Chimia 2009. New Trends in Applied Chemistry» (Constanta, Romania,

2009), 6th International Conference on Instrumental Methods of Analysis «Modern Trends and Applications "1МА-2009"» (Athens, Greece, 2009); 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society "Isranalytica-2010" (Tel Aviv, Israel, 2010); Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва,

2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 9 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 211 источников. Работа изложена на 184 страницах машинописного текста, содержит 58 рисунков и 54 таблицы.

Во Введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цели и задачи, научная новизна и практическая значимость.

Обзор литературы включает 2 главы. В 1 главе рассмотрено применение ферментативного метода для определения органических и неорганических анионов. Описаны методики определения анионов с применением как нативных, так и

иммобилизованных ферментов в составе проточно-инжекционных систем и биосенсоров. Сопоставлены метрологические характеристики методик определения анионов ферментативным и различными инструментальными методами (хроматографии, потенциометрии, спектроскопии). Во 2 главе рассмотрены и систематизированы подходы к флуоримегтрическому определению катехоламинов и их метаболитов с использованием процессов дериватизации, хемилюминесценпии и лазерной флуоресценции.

Экспериментальная часть работы описана в шести главах (3 - 8). В 3 главе приведены исходные вещества, их характеристики, использованное оборудование, а также описаны методики приготовления растворов и проведения реакций. В 4 главе представлены результаты оптимизации условий получения стабильных и активных препаратов пероксидазы хрена, ковалептно иммобилизованной на силикагелях, модифицированных различными реакционно-способными группами (амино-, эпокси,-тиоциано-, изоциано-); изучения активности и стабильности во времени полученных препаратов иммобилизованной ПХ; расчета кинетических параметров индикаторной реакции окисления о-дианизидина (о-Д) пероксидом водорода, проводимой с участием пероксидазы, иммобилизованной на модифицированных силикагелях. В 5 главе приведены и обсуждены результаты изучения индивидуального и группового влияния фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов на каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы. Глава 6 посвящена применению ПХ, иммобилизованной на силикагеле, модифицированном тиоцианатными группами, для определения фторид-ионов в питьевых и минеральных водах, цианид- и тиоцианат-ионов - в биологических жидкостях (крови и слюне). В 7 главе представлены результаты изучения возможностей применения ПХ для определения ее средне окисляемых субстратов ~ катехоламинов и их метаболитов методом оптической и лазерной флуориметрии. Приведены и обсуждены результаты исследования влияния ДМСО и различных типов ПАВ на эффективность процессов пероксидазного окисления и дериватизации катехоламинов и их метаболитов с дифенилэтилендиамином и бензиламином. Глава 8 посвящена применению ПХ для определения органических пероксидов (2-бутанон-пероксида и трет-бутилгидропероксида) в нерастворимых в воде объектах (на примере оливкового масла) по реакции окисления флуоресцеина. Обсуждены результаты изучения влияния температуры, природы и содержания органических растворителей и катионного ПАВ цетилтриметиламмонийбромида на эффективность возбуждения хемилюминесценции флуоресцеина в реакции его окисления органическими пероксидами в присутствии нативной пероксидазы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ковалентная иммобилизация пероксидазы хрена на модифицированных силикагелях

Для решения проблем охраны окружающей среды, медицинской диагностики, контроля биотехнологических процессов широко используют иммобилизованные ферменты, для получения которых наиболее целесообразно применять метод химической иммобилизации, основанный на ковалентном связывании биокатализатора с носителем. При этом следует подбирать такие носители и условия иммобилизации фермента, при которых бы достигались его высокая активность при минимальном расходе нативного фермента и стабильность иммобилизованного

препарата в течение длительного времени. Кроме этого носители должны быть доступны, нетоксичны, легко регенерируемы.

Всеми вышеперечисленными качествами обладают силикагели, которые в дополнение к их основным характеристикам могут быть еще и легко модифицированы различными функциональными группами, отдаленными от поверхности носителя на разное расстояние, что позволяет управлять, как было предположено, каталитической активностью, стабильностью ферментных препаратов, а также чувствительностью к их субстратам и эффекторам. На основании литературных данных, а также результатов исследований, проведенных ранее в лаборатории кинетических методов анализа МГУ, в качестве носителей для иммобилизации пероксидазы были выбраны силикагели, модифицированные амино-и эпоксигруппами с разной длиной цепи углеводородного радикала, а также изоцианатной и тиоцианатной группами (табл. 1).

Таблица 1. Силикагели, модифицированные различными функциональными группами

Название силикагеля Формула модификатора

Амино (I) н,с-оч у-. -' ш2 /\ Н3С—0 О н3с

Амино (II) Н3С—,--. 81-' № ын, /\ \ / Н3С—0 0 4-' Н3(/

Амино (III) Н3С-,-> ,-NN2 5!-' КН Ж—' ^ \ / Н3С—0 0 4-' н3с/

Эпокси (1) н3с—о о—V а—' \—, /\ \7 Н30—0 0 0 н3с

Эпокси (И) Н3С—0 \> н,с

Изоциано И3С—0 Б;—N=0=0 /\ Н,С—0 О и/

Тиоциано Н3С—0 31—3-г.=ы /\ Н3С-0 0 Н30

Были оптимизированы условия получения препаратов ковалентно иммобилизованной пероксидазы: время выдерживания с носителем раствора нативного фермента, его начальная концентрация (табл. 2). Изучены свойства иммобилизованных препаратов: каталитическая активность, стабильность во времени; рассчитаны кинетические параметры индикаторной реакции окисления о-Д

пероксидом водорода, по которой спектрофотометрически контролировали активность иммобилизованной пероксидазы.

Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что количество пероксидазы, иммобилизованной на амино-силикагелях, коррелирует с длиной углеводородной цепи, модифицирующей поверхность носителя, причем, чем длиннее цепь, тем меньшее количество фермента связывается с носителем. Это, очевидно, объясняется тем, что более длинная цепочка в растворе обладает большей подвижностью по сравнению с короткими, вследствие чего ферменту труднее связаться с носителем. Несмотря на то, что с роегом длины углеводородного радикала уменьшается количество фермента, связанного с носителем, активность препаратов пероксидазы, иммобилизованной на силикагелях, при этом растет. Наиболее активным среди препаратов пероксидазы, иммобилизованной на амино-силикагелях, является тот, для модификации которого использовали аминогруппу с наибольшей длиной углеводородной цепи.

Таблица 2. Оптимальные условия иммобилизации пероксидазы на модифицированных силикагелях (иммобилизацию нативного фермента и отмывку препаратов проводили в 0,1 М боратном буферном растворе) и количество ПХ на носителях (Р = 0,95, п = 3).

Носитель сих, мМ pH Сшивающий агент Aihk, Ч Количество Г1Х на носителе, мг/гнос

Амино-силикагели 0,5 7,0 Глутаровый альдегид, 2,5%, pH 4,5, 12 ч 3,5 24 ± 4 (I) 20 ±2 (II) 15 ±2 (III)

Эпокси-силикагели 0,1 7,0 нет 12 18 ±3 (I) 10 ± 2 (II)

Изоциано-силикагель 0,5 8,0 24 23 ±3

Тиоцяано-силикагель 0,01 8,0 6 30 ±5

40

Диагра.мма 1. Начальная скорость индикаторной реакции, катализируемой пероксидазой, иммобилизованной на силикагелях, модифицированных различными функциональными группами: 1 - Амино (I), 2 - Амино (II), 3 Амино (III), 4 - Эпокси (I), 5 - Эпокси (II), 6 - Изоциано, 7 - Тиоциано.

Среди препаратов пероксидазы, иммобилизованной на эпокси-силикагелях, фермент, связанный с силикагелем, модифицированным эпокси-группой, содержащей шестичленное кольцо на конце углеводородной цепи, более активен, чем препарат фермента, иммобилизованный на эпокси-силикагеле с прямой углеводородной цепью; при этом количество пероксидазы, связанной с носителем, во втором случае больше. Сравнение активности всех препаратов иммобилизованной пероксидазы

свидетельствует о том, что наибольшей активностью обладают те из них, для которых в качестве носителя использовали силикагели, модифицированные тиоцианатной группой и аминогруппой с наибольшей длиной углеводородной цепи (диагр. 1).

Изучение стабильности препаратов иммобилизованной пероксидазы показало, что все они стабильны в течение, по крайней мере, 90 дней и сохраняют при этом не

менее 75% первоначальной активности (диагр. 2). Наименее стабильны препараты, иммобилизованные на изоциано- и эпокси (I) - силикагелях.

1-10 суток

шзосуток Диаграмма 2. Стабильность пероксидазы, иммобилизованной на модифицированных силикагелях: 1 - Амино (I), 2 - Амино (II), 3 - Амино (III), 4 - Эпокси (I), 5 -Эпокси (II), 6 - Изоциано, 7 - Тиоциано.

На основании полученных данных наиболее перспективным для дальнейшего аналитического применения был признан препарат ПХ, иммобилизованной на силикагеле, модифицированном тиоцианатными группами.

Кинетические параметры индикаторной реакции окисления 0-диаиизидина, катализируемой пероксидазой, иммобилизованной на модифицированных силикагелях

Для оценки субстратной специфичности препаратов иммобилизованной пероксидазы были определены кинетические параметры индикаторной реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода (табл. 3).

Таблица 3. Субстратная специфичность препаратов иммобилизованной ПХ по отношению к субстратам индикаторной реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, рассчитанная методом Лайнуивера-Берка (Р=0,95, и=3).

Препарат Субстратная специфичность {к^/Ки) хЮ3 по отнршению к

пероксидазы о-Дианизидину Пероксиду водорода

Амино (I) 74 ± 17 8,4 ± 0,3

Амино (II) 49+19 4 ± 1

Амино (III) 165 + 30 3 ± 1

Эпокси (I) 4357±1224 47 + 2

Эпокси (II) 4100 ± 1560 808 ±135

Изоциано 116 ±40 72 ± 15

Тиоциано 3958 ±1102 179 ±90

Значения кинетических параметров (Ут, Км, к^/Ки) индикаторной реакции, рассчитанные методами Лайнуивера-Берка, Хейнса, Иди-Хофсти, свидетельствуют о том, что субстратная специфичность по отношению к пероксиду водорода пероксидазы, иммобилизованной на амино-сшшкагелях, уменьшается по мере роста

углеводородной цепи и числа аминогрупп в ней. В случае эпокси-силикагелей субстратная специфичность по отношению к пероксиду водорода значительно выше у пероксидазы, иммобилизованной на силикагеле, содержащем циклогексильную группу. Наибольшей субстратной специфичностью к основному субстрату -пероксиду водорода, среди всех полученных и изученных препаратов иммобилизованной пероксидазы обладают препараты ПХ, иммобилизованной на эпокси-силикагеле, содержащем шестичленный цикл, и на тиоцианатном силикагеле.

Субстратная специфичность фермента по отношению к о-дианизидину в меньшей степени зависит от длины углеводородной цепи и наименее выражена у пероксидазы, иммобилизованной на силикагеле Амино (II). Наименьшей субстратной специфичностью к о-Д обладают препараты ПХ, иммобилизованной на амино- и изоцианатном силикагелях; наибольшей - препараты, иммобилизованные на эпокси-и тиоцианатном силикагелях.

Таким образом, субстратная специфичность иммобилизованной пероксидазы к субстрату зависит от природы функциональных 1рупп, используемых для модификации носителя. Наилучшими кинетическими характеристиками обладает индикаторная реакция, проводимая в присутствии пероксидазы, иммобилизованной на силикагеле, модифицированном тиоцианатными группами. Этот же препарат ПХ отличается наибольшими активностью и стабильностью, поэтому именно его использовали для изучения влияния на его каталитическую активность неорганических анионов.

Определение неорганических анионов по ингибирующему действию на каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы

Ранее в лаборатории кинетических методов анализа МГУ было выяснено, что среди неорганических анионов наиболее эффективными обратимыми ингибиторами пероксидазы являются фторид- и цианид-ионы. При этом ингибирующее действие этих анионов, так же, как и анионов органических кислот (щавелевой, винной, салициловой, сульфосалициловой), способных образовывать прочные комплексные соединения с железом(Ш) [ре,'ск)б]з- = 43,9 , [рсгб]з- = 16,1) объяснено их взаимодействием с этим катионом, являющимся кофактором пероксидазы.

В литературе отсутствуют какие-либо сведения об использовании ферментативных методов для определения тиоцианат-ионов. Учитывая, что тиоцианат-ионы также образуют довольно устойчивые комплексные соединения с железом(Ш) ОёРб [адстодз-= 3,3), было решено изучить действие этих анионов на каталитическую активность как нативной, так и иммобилизованной пероксидазы хрена. Показано, что тиоцианат-ионы действительно ингибируют активность обоих препаратов фермента.

Влияние анионов на активность нативной и иммобилизованной пероксидазы характеризовали степенью ингибирования (/,%), которую рассчитывали по формуле:

1,%=(ГЬ1-ГюУЦ>г100%,

где Гоь Уо2~ начальные скорости индикаторной реакции в отсутствие и в присутствии ингибитора соответственно, М/мин.

Для разработки ферментативных методик определения неорганических анионов с использованием иммобилизованной ПХ выяснили, при каких рН и времени инкубирования анионов с иммобилизованным ферментом) достигается заметное (1 > 20%) ингибирование, и в этих условиях разработали методики определения

фторид-, цианид- и тиоцианат- ионов, метрологические характеристики которых представлены в табл. 4.

Таблица 4. Метрологические характеристики методик определения фторид-, цианид-и тиоцианат-ионов с использованием пероксидазы, иммобилизованной на силика-геле, модифицированном тиоцианатными группами (тинк- 30 мин), и нативной.

Анион рН0ГГГ Диапазон определяемых концентраций, мкМ ст мкМ с нативной ПХ 5Г (и = 3)

Г 4,2 0,1-10 0,2 0,08 (с = 5 мкМ)

4,5 0,05 -1 0,08 0,05 (с = 0,5 мкМ)

БСМ" 4,5 1-50 100 0,12 (с = 25 мкМ)

Учитывая различие оптимальных значений рН, при которых достигается наибольший ингибирующий эффект анионов, актуальность одновременного определения цианид- и тиоцианат-ионов в биологических жидкостях, а также различие в характере влияния времени инкубирования на ингибирование фермента анионами, изучили совместное влияние фторид- и цианид-ионов, а также цианид- и тиоцианат-ионов на каталитическую активность ПХ, иммобилизованной на тиоцианатном силикагеле. Установили, что в диапазоне концентраций обоих анионов 0,1 - 10 мкМ их ингибирующее действие аддитивно; цианид-ионы можно селективно определить в присутствии тиоцианат-ионов, если концентрация последних < 0,1 мМ.

Таким образом, использование пероксидазы, иммобилизованной на силикагеле, модифицированном тиоцианатными группами, позволяет повысить чувствительность и селективность методик определения изученных неорганических анионов в сравнении с теми же параметрами методик с использованием нативной пероксидазы.

Таблица 5. Результаты определения фторид-ионов в питьевых и минеральных водах ферментативным (I) и потенциометрическим (II) методами

Объект Метод сг, мг/л (п = 3, Р = 0,95) сг произв., мг/л

Питьевая вода «Шишкин лес» I 1,7 ±0,2 0,13 1,5

II 1,3 ±0,2 ' 0,15

Минеральная вода «Заповедник Валдай» I 1,0 ±0,1 0.08 <3

II 1,1 ±0,1 0.11

Разработанные методики определения анионов были применены для анализа реальных объектов: питьевых и минеральных вод и биологических жидкостей (табл. 5 - 7). В клинической диагностике актуальна проблема совместного определения цианид- и тиоцианат-ионов в биологических жидкостях, особенно при лечении курящих людей. Образцы крови курящих и некурящих пациентов были предоставлены институтом пульманологии РАМН при клинической больнице № 57 г. Москвы.

Таблица 6. Результаты определения цианид-ионов в крови с использованием иммобилизованной пероксидазы методом "введено-найдено" (я - 3. Р ~ 0,95)

Кровь пациента Введено, мкМ Найдено, мкМ

Курящего 0,10 0,07 ± 0,03

0,30 0,26 ±0,06

0,50 0,4 ± 0,1

Некурящего 0,10 0,08 ±0,02

0,30 0,28 ±0,05

0,50 0,45 ± 0,09

Таблица 7. Результаты определения тиоцианат-ионов в крови и слюне методом добавок с использованием иммобилизованной пероксидазы

Объект анализа с, мкМ (п = 3,Р = 0,95) sT | слит, мкМ

Кровь

Курящего 92± 11 ^ 0,12 56 ±33

Некурящего 14 ± 2 0,08 11 ± 5

Слюна

Курящего 4,2 ± 0,7 0,15 3±1

Некурящего 0,61 ±0,06 0,10 0,7 ± 0,2

Применение нативной пероксидазы хрена для определения катехоламинов

и их метаболитов

Нативную пероксидазу хрена применили для разработки методик определения ее средне окисляемых субстратов - катехоламинов и их метаболитов - с фяуориметрическим контролем скорости индикаторной реакции.

Катехоламины (КА) - полифункциональные органические вещества, в состав которых входят дигидроксифенильная и аминогруппа, отделенная от ароматического кольца алифатической углеродной цепью. Такие КА, как допамин (ДА), адреналин (АД) и норадреналин (НА) входят в состав живых организмов и играют важную роль в регуляции нервной деятельности и обмене веществ. Конечными продуктами метаболизма КА являются гомованилиновая (ГВК) и ванилилминдальная (ВМК) кислоты. Молекулы КА являются флуорофорами с /1ех 280 и Ат 324 нм.

Определение допамина по его собственной флуоресценции и допамина и гомованилиновой кислоты по пероксидазному окислению в присутствии ДМСО

Прежде всего, нами была выяснена возможность определения КА (на примере допамина) по интенсивности его собственной флуоресценции. Оказалось, что интенсивность флуоресценции допамина невысока, поэтому методика его определения характеризовалась невысокой чувствительностью (сн = 1 мкМ). Для повышения чувствительности его определения была использована реакция его пероксидазного окисления. Для усиления интенсивности флуоресценции ДА использовали ДМСО (аналогичный прием описан в литературе). Этот полярный растворитель применяют в медицинской практике, кроме того он входит в состав многих фармацевтических препаратов, его используют для подготовки проб к анализу

биохимическими методами. Помимо этого, ДМСО смешивается с водой в любых соотношениях, нелетуч, не имеет неприятного запаха и нетоксичен.

В оптимальных условиях флуоресценции ДА (0,1 М фосфатный буферный раствор, 50 об.% ДМСО) и его пероксидазного окисления (0,075 М буферный раствор НЕРЕБ с рН 7,2; растворитель: вода: ДМСО = 3:2; температура 37 °С; концентрации: ПХ - 0,75 мкМ; Н202 - 0,9 мМ) разработали методики его определения с аналитическими характеристиками, приведенными в табл. 8.

Таблица 8. Метрологические характеристики методик определения ДА по его собственной флуоресценции (I, у - /фЛ, х - сдоп, мМ) и по реакции его пероксидазного окисления (II, у - /фл, х - сдоп, мМ).

Методика у = (а±Аа)х + (Ь±АЬ) Диапазон определяемых концентраций, мкМ ¿г (Л = 5)

а Аа Ъ АЬ

I 103 2,55 0,02 0,01 0,4-50 0,01 (с = 5 мкМ)

II 943 10,8 2,46 0,21 10-100 0,09 (с = 50 мкМ)

По нижней границе определяемых содержаний разработанная ферментативная методика уступает методике определения ДА, основанная на его собственной флуоресценции. Однако достигнутая чувствительность определения достаточна для применения ферментативной методики в анализе фармацевтических препаратов, где содержание допамина находится в диапазоне 0,01 -10 мМ.

При оптимизации условий пероксидазного окисления ГВК выяснили, что с наибольшей скоростью процесс протекает в слабощелочной среде фосфатного буферного раствора с рН 8,5 (рис .1). Скорость реакции мало зависит от температуры и содержания ДМСО, поэтому реакцию проводили при комнатной температуре в водной среде.

1да

4 I-

Рнс. 1. Зависимость скорости пероксидазного окисления ГВК от рН в 0,1 М ТРИС (1) и фосфатном (2) буферных растворах.

В оптимальных условиях проведения пероксидазного окисления ГВК (0,1 М фосфатный буферный раствор с рН 8,5; с„х = 0,73 нМ, сН202, = 0,3 мМ) ее определение возможно с стт = 3 мкМ. Полученные данные показали, что чувствительность методик определения катехоламинов с флуориметрическим контролем скорости их окисления недостаточна для их применения в анализе крови и мочи, поскольку содержание катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях ниже диапазона определяемых концентраций этих соединений (табл. 9).

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

Таблица 9. Нормы содержания КА и их метаболитов в биологических жидкостях

Вещество Кровь, нМ Моча, мкМ

Допамин 1,3-21 0,25 - 0,65

Адреналин 1,9 0,005-0,082

Гомованилиновая кислота 20-100 9-18

Ваншшлминдальная кислота - 12-25

Для повышения не только чувствительности (на уровне наномолярных концентраций), но и селективности определения катехоламинов и их метаболитов перспективен прием, заключающийся в получении с помощью органических реагентов производных катехоламинов и их метаболитов, обладающих значительно более интенсивной флуоресценцией, чем определяемые соединения, в видимой области спектра (/^ 340 - 355 и ^ 470 - 485 им). Из литературы известно, что наиболее интенсивно флуоресцируют соединения, получаемые при дериватизации КА и их метаболитов с помощью лезо- 1,2-дифенилэтилендиамина (ДЭД) и бензиламина (БА) в присутствии неорганического аналога пероксидазы -ферроцианида калия, катализирующего окисление растворенным в воде кислородом молекул КА до катехол-о-хинонов, которые в свою очередь взаимодействуют с дериватизирующим реагентом (ДЭД или Б А) по реакции Михаэля (схема 1).

Схема 1. Реакции дериватизации КА с БА и ДЭД в присутствии ферроцианида калия.

Конечным продуктом дериватизации КА с ДЭД и БА являются 2-фенил(4,5-дигидропирроло)[2,3-Абензоксазольные производные, обладающие более интенсивной флуоресценцией, чем КА.

Описанный в литературе процесс дериватизации КА с ДЭД и БА осуществляют обычно в среде метанола при термостатировании реакционной смеси при 50°С в течение 40 мин.

Нами впервые предложен подход, заключающийся в замене неорганического катализатора на биологический - пероксидазу хрена, что позволило не только проводить дериватизацию КА и их метаболитов в более мягких условиях и сократить время дериватизации, но и повысить чувствительность определения ряда соединений.

Оптимизация условий получения производных катехоламинов и их метаболитов с л1ез0-1,2-дифенилэтилендиамином и бензиламииом в присутствии пероксидазы

Нами подтверждены данные литературы, согласно которым реакции дериватизации катехоламинов с ДЭД и БА протекают с наибольшими выходами при использовании глицинового и CAPS (циклогексиламинопропансульфоновой кислоты) буферных растворов соответственно. Полученные нами рН-зависимости (рис. 2) показывают, что из всех изученных катехоламинов наиболее эффективно дериватизации с ДЭД подвергается ДА (рН 8,0), а с БА - адреналин (рН 11,0). Поэтому в дальнейшем для разработки методик в качестве модельных КА были выбраны системы: допамин - ДЭД, адреналин - БА (табл. 11).

Рис. 2. Влияние рН 0,2 М глицинового (рН 6 - 10) и 0,1 М CAPS (рН 10 - 11) буферных растворов на скорость ферментативной дериватизации КА (1 -допамин, 2-адренадин, 3 - серотонин, 4 - добутамин, 5 - метилдопа) с ДЭД (рН б - 10) и БА (рН 10-11) соответственно (концентрации: ПХ - 1 мкМ; пероксида водорода - 0,1 мМ; ДЭД (БА) - 3 (33) мМ; допамипа, адреналина, серотонина - 0,3 мкМ, добутамина, метилдопы - 15 мкМ).

Таблица 10. Оптимальные условия проведения реакций дериватизации допамина с ДЭД и адреналина с БА.

Параметр Дериватизирующий реагент

ДЭД БА

Буферный раствор 0,5 М глициновый 0,1 М CAPS

рН 8,0 11,0

Растворитель ДМСО: вода =3:7 Вода

Температура ЪТС 25°С

^реагента» ММ 3 33

СН202, ММ 0,1 0,1

HM 340 356

Хт, нм 470 485

Полученные данные показывают, что использование ПХ вместо ферроцианида калия в процессе дериватизации катехоламинов позволяет повысить эффективность образования их флуоресцирующих производных, сократить время реакции с 40 до 5 мин и исключает длительное термостатирование реакционной смеси при повышенной температуре в присутствии токсичных растворителей.

Методами спектрофотометрии (рис. 3) и жидкостной хроматомасс-спектро-метрии (рис. 4) нами выяснен механизм процесса дериватизации катехоламинов с ДЭД и БА на примере адреналина в присутствии ПХ и доказана идентичность продуктов ферментативной дериватизации и того же процесса в присутствии ферроцианида калия.

Рис. 3. Спектр поглощения адреналина (1), продукта его пероксидазного окисления (2) И его дериватизации с БА (3) (сдд - 30 мкМ; время реакции 5 мин).

В случае пероксидазного окисления адреналина максимум поглощения в спектре при 300 нм соответствует продуктам его окисления, молекулы которых содержат о-хиноидный фрагмент. В спектре поглощения продуктов дериватизации адреналина в присутствии ферроцианида калия имеется максимум при 350 нм, соответствующий длине волны возбуждения флуоресценции дериватизата АД. Полученные спектральные данные косвенно свидетельствуют об идентичности продуктов дериватизации АД, полученных в присутствии ПХ и ферроцианида калия.

Полученные нами масс-спектры продуктов дериватизации адреналина с БА (рис. 4) и допамина с ДЭД в оптимальных условиях проведения реакций дериватизации также доказали идентичность продуктов дериватизации катехол-аминов в присутствии ПХ и ферроцианида калия (последние описаны в литературе).

'MSOISPC, Ume-1i473ofC;\CHEM32\1\QATAISNAi>SHCT,0 jP^s, Scan (

N-

Ph

N

0'

\

Рис. 4. Масс-спектр продуктов дериватизации адреналина с БА в оптимальных условиях проведения реакции.

Определение катехоламинов и их метаболитов по флуоресценции их

производных

В оптимальных условиях получения флуоресцирующих производных КА разработаны методики их определения (табл. 11).

Из табл. 11 видно, что по пределам обнаружения допамина и адреналина ферментативный метод не уступает методу хроматографии. Пределы обнаружения КА по флуоресценции их производных на 3 порядка выше таковых при определении КА по их пероксидазному окислению. Однако даже эта достигнутая чувствительность ферментативных методик недостаточна для определения катехоламинов в биологических жидкостях (см. табл. 9 и 11).

Таблица 11. Метрологические характеристики методик определения КА и их метаболитов по флуоресценции их производных ферментативным методом (1) и методом ВЭЖХ с использованием Кз[Те(СМ)6] (II)

Методика Катехоламин Реагент с„и„, нМ Диапазон определяемых концентраций, мкМ ?щм, мин

I Допамин ДЭД 5 0,03-0,30 5

II 20 0,2 - 2,0 30

I Адреналин БА 3 0,03 - 0,30 5

II 5 0,05 - 0,50 40

I Добутамин ДЭД 60 1,5-15 10

I Метилдопа 20 0,75-15 15

I ГВК БА 0,1 0,3 - 10 5

Кроме того, селективное определение катехоламинов в этих объектах ферментативным методом без их предварительного разделения не представляется возможным ввиду близости длин волн возбуждения и флуоресценции образующихся дериватизатов. В связи с этим следующий этап работы был посвящен поиску и применению новых подходов к повышению селективности и чувствительности методик ферментативного определения КА по флуоресценции продуктов их дериватизации.

Определение катехоламинов и их метаболитов в средах прямых мицелл ПАВ

Известно, что введение ПАВ в раствор флуорофора может усиливать его флуоресценцию за счет того, что заключенная в мицеллу молекула флуорофора обладает меньшим числом вращательных степеней свободы, что понижает долю её безызлучательных переходов.

Для выбора оптимального ПАВ для повышения чувствительности методик определения КА и их метаболитов по флуоресценции продуктов их дериватизации изучили влияние природы и концентрации различных типов катионных (цетилтриметиламмонийбромид, цетилпиридинийбромид (ЦПБ)), анионных (аэрозоль ОТ, додецилсульфат натрия (ДДС)) и неионогепных (Твин 20, Твин 80, Бридж 35) ПАВ на эффективность процессов дериватизации допамина с ДЭД и адреналина с БА. Оказалось, что на интенсивность флуоресценции продуктов дериватизации допамина с ДЭД природа и концентрация всех изученных ПАВ влияет незначительно. В то же время катионный ПАВ ЦТМА в 50 раз усиливает флуоресценцию продукта дериватизации адреналина с бензиламином, стабилизируя его в течение 5 мин, после которых он разлагается в результате окисления растворенным в воде кислородом с образованием индольного производного. Кроме того, при введении ЦТМА в реакцию дериватизации АД с БА, протекающую в сильнощелочной среде (рН 11) происходит, очевидно, электростатическое взаимодействие между отрицательно заряженными глобулами ПХ и положительно заряженными мицеллами ПАВ. В результате этого молекулы ПХ концентрируются на поверхности мицелл, что в свою очередь повышает вероятность взаимодействия дериватизата с мицеллами ПАВ. Выявленный эффект усиления флуоресцентного сигнала при введении ЦТМА в реакцию дериватизации катехоламинов и их метаболитов с БА был использован нами для разработки методик определения катехоламинов (табл. 12). Из данных табл. 12 следует, что наиболее чувствительны методики определения КА и их метаболитов по

флуоресценции их производных, полученных в присутствии ЦТМА. Чувствительность такой методики определения ГВК достаточна для ее определения в моче (табл.13). Определение допамина и адреналина в крови по по флуоресценции их производных в присутствии ЦТМА возможно методом добавок.

В результате изучения селективности методик определения допамина, адреналина и гомованшшновой кислоты установили, что адреналин незначительно влияет на интенсивность флуоресценции дериватизата ГВК с БА при соотношении концентраций ГВК:АД равном 100:1. Допамин не влияет на интенсивность флуоресценции дериватизата АД с БА, если его мольное соотношение с АД не превышает 2,5:1. Присутствие ванилилминдальной кислоты не мешает определению ГВК, поскольку, как было установлено, ванилилминдальная кислота не вступает в реакцию с БА в оптимальных условиях дериватизации ГВК с БА (рис 5,6).

Таблица 12. Метрологические характеристики методик определения КА и их метаболитов по реакциям их пероксидазного окисления (I), по флуоресценции их дериватизатов в отсутствие (II) и в присутствии (III) ЦТМА

Соединение Методика Реагент Л-ех Äет Смит нМ

Допамин I - 278 308 500

II ДЭД 350 495 50

III 350 495 5

Адреналин I - 280 309 500

II БА 354 495 30

III 358 495 10

ГВК I - 315 425 3000

II БА 310 428 100

III 320 430 30

Таблица 13. Результаты определения в моче ГВК по флуоресценции ее производного методом добавок (I) и методом градуировочного графика (II)

Методика с, мкМ (л = 3,Р = 0,95) sr Норма, мкМ

I 29 ± 5 0,09 10-40

II 33 ±7 0,12

Рис. 5. Спектры флуоресценции дериватизатов ГВК с БА в отсутствие (1) и в присутствии (2) АД (при мольном соотношении ГВК:АД = 100:1) в прямых мицеллах ЦТМА, 3 - контрольный опыт.

Рис. б. Спектры возбуждения дериватизатов гомованшшновой кислоты (1) и адреналина (2) с БА в присутствии ЦТМА и ПХ.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что чувствительность и селективность разработанных методик определения катехол-аминов по флуоресценции продуктов их дериватизации с БА недостаточна для их применения в анализе крови, в которой концентрации ДА и АД примерно одинаковы и находятся в диапазоне 1 - 20 нМ при отсутствии патологий. Однако возможно определение ГВК в моче, в которой ее концентрация как минимум на 2 порядка больше концентрации адреналина. Для решения проблемы селективности, а также чувствительности определения близких по природе и структуре флуорофоров, имеющих близкие максимумы длин волн возбуждения флуоресценции, применили метод лазерной флуоресценции, обладающий более интенсивным и когерентным источником возбуждающего излучения.

Изучение спектров флуоресценции продуктов дериватизации допамина с ДЭД и адреналина с БА в присутствии ПХ и мицелл ЦТМА показало, что наибольшей интенсивностью флуоресценции обладает дериватизат АД с БА. Это объясняется тем, что длина волны возбуждения флуоресценции этого продукта (354 им) наиболее близка к длине волны возбуждающего лазерного излучения, соответствующей третьей гармонике (355 им). В оптимальных условиях дериватизации катехоламинов и их метаболитов с ДЭД и БА разработали высокочувствительные методики их определения в присутствии мицелл ЦТМА (табл. 14).

Таблица 14. Сопоставление метрологических характеристик методик определения КА и их метаболитов по флуоресценции их дериватнзатов в присутствии мицелл ЦТМА с использованием в качестве источника возбуждающего излучения ксеноновой лампы (I) и лазера (II) (п = 3).

Соединение Реагент Методика Смит МКМ (с = 0,1 мкМ)

Допамин ДЭД I 30 0,07

II 10 0,15

Адреналин БА I 5 0,04

II 1 0,11

ГВК I 30 0,08

II 10 0,16

Из данных табл. 14 следует, что использование метода лазерной флуориметрии позволило понизить пределы обнаружения КА и их метаболитов по флуоресценции их дериватизатов в 3 - 5 раз, что делает возможным их применение в анализе крови. Следует отметить, однако, что воспроизводимость результатов, полученных при использовании метода лазерной флуориметрии, в 2 - 3 раза ниже. Это объясняется большей нестабильностью лазерного источника по сравнению с ксеноновой лампой.

Рассчитанные времена жизни дериватизатов АД и ДА с БА в возбужденном состоянии составили 3 и 4 не соответственно. Столь близкие значения времен жизни дериватизатов не позволили применить метод стробирования для разделения сигналов флуоресценции дериватизатов ДА и АД для повышения селективности методики для ее применения в анализе крови.

Определение пероксидов в водных, водно-органических и мицеллярных средах с использованием нативной пероксидазы

Определение пероксида водорода и органических пероксидов относится к актуальным задачам пищевой промышленности, косметологии, медицины, охраны окружающей среды. Органические пероксиды в продуктах питания образуются чаще всего в процессе окисления ненасыщенных жирных кислот - основной составляющей растительных масел и жиров. Такое окисление приводит к прогорканию масла, потери качества пищевого продукта, разрушению витаминов, образованию токсичных веществ (в том числе органических пероксидов).

Нами была изучена возможность применения нативной пероксидазы хрена для разработки методик определения пероксидов, в первую очередь, органических, по окислению флуоресцеина, катализируемого ПХ в среде органических растворителей. Аналитическим сигналом служила эффективность возбуждения хемилюминесценции флуоресцеина в реакции его пероксидазного окисления.

В качестве модельных соединений нами были выбраны трет-бутилгидропероксид (ТБП) и 2-бутанонпероксид (БП), а также пероксид водорода. Выбранные органические пероксиды легко воспламеняются, раздражают кожу, слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей, ограниченно (ТБП) или полностью нерастворимы в воде (БП).

Реакцию пероксидазного окисления флуоресцеина (схема 2) широко применяют в качестве сопряженного процесса при определении органических веществ с помощью биосенсоров.

Схема 2. Схема реакции окисления флуоресцеина пероксвдом водорода, катализируемая пероксидазой.

Механизм этой реакции хорошо изучен и описан в литературе (схема 3).

Схема 3. Механизм реакции окисления флуоресцеина пероксидом водорода в присутствии пероксидазы.

Определение органических пероксидов по пероксидазному окислению флуоресцеина

НКР + НгОг СрсП, Ср<11 + Б1Н" -» Сра II + Б1\ СрсШ + ИН' ->• НКР + БК,

Р1' +02(аЧ) —* 02(сикглет) + Р1(0Х),

р!2 +02(сянгает)—»■ Р'2 + Оц-фжжф

(1) (2)

(3)

(4)

(5)

(6)

Б!2'* -> Б12" + Ь

В соответствии с этим механизмом окисленная форма ПХ Срё I, образующаяся на первой стадии, взаимодействует с моноанионом флуоресцеина Р1Н" с образованием комплекса СрсШ и анион-радикала флуоресцеина РТ". Вне зависимости от стадии (2) моноанион флуоресцеина Р1Н" выступает в качестве донора прогона в стадии (3), в результате протекания которой регенерируется ПХ (НИР), и так же, как и в стадии (2) образуется анион-радикал флуоресцеина Б!'', который окисляется растворенным в воде кислородом на стадии (4). В результате протекания стадии (4) образуется продукт окисления флуоресцеина Р1(ох) и синглетный кислород, который переводит дианион флуоресцеина Р12" в возбужденное состояние ¥12'* на стадии (5). На заключительной 6-ой стадии процесса дианинон флуоресцеина переходит из возбужденного состояния в основное с испусканием света с длиной волны 540 нм. Интенсивность хемилюминесценцни, возникающей в течение нескольких десятых секунды сразу же после ввода субстрата-окислителя в результате реакции ферментативного окисления флуоресцеина пероксидом водорода, быстро снижается и через 4-5 сек с момента достижения максимального значения падает до сигнала шума (рис. 7).

Рис. 7. Кинетическая кривая хемилюминесценцни флуоресцеина в реакции его пероксидазно-го окисления в воде.

Известно, что эффективность возбуждения хемилюминесценцни флуоресцеина в реакции его пероксидазного окисления в значительной степени усиливают ПАВ. Причем из всех рассмотренных нами ПАВ в наибольшей степени усиливает хемилюми-несценцию ЦТМА.

Нами было изучено влияние природы и содержания органического растворителя (рис. 8) и ЦТМА (рис. 9) на эффективность возбуждения хемилюминесценцни флуоресцеина (которую количественно характеризовали соотношением 7//0, где 1 - интенсивность хемилюминесценцни флуоресцеина в реакции его пероксидазного окисления, /о - интенсивность хемилюминесценцни контрольного опыта) в реакции его пероксидазного окисления различными пероксидами.

I. отн. ед.

1200,

1000}

i

6G0j l/lo 600 400 200 0

ШМ-

EtOH

ВТБП В2-БП ППВ

Рис. 8. Влияние природы растворите-ля на эффективность возбуждения хемилюминесценцни флуоресцеина в реакции его пероксидазного окисления (оптимальные условия: 0,1 MOPS буферный раствор рН 7,0; кояцентра-ции: ПХ - 0,4 мкМ, флуоресцеина - 0,2 мМ, пероксидов - 1 мкМ).

флуоресцеина достигается в среде ДМСО

Рис. 9, Эффективность возбуждения хемшдоминесценции флуоресцеина в реакции его окисления пероксидами в воде и водно-органических смесях при содержании растворителя 50 об.% в присутствии ЦТМА и ПХ (условия как в подписи к рис. 9, конц. ЦТМА - 3 мМ).

Установлено, что наибольшая эффективность возбуждения хемилюминесценции при его содержании 75 об. % (рис. 10).

40 60

Сдмсо, Об. %

Рис. 10. Зависимость эффективности возбуждения хемилюминесценции флуоресцеина в реакции его окисления ТБП от содержания ДМСО (оптимальные условия реакции).

Причиной наблюдаемого эффекта усиления сигнала является повышение растворимости молекулярного кислорода в среде вода - ДМСО, ш так как после вытеснения растворенного кислорода аргоном аналитический сигнал уменьшался в 5 раз. ПАВ также в целом повышает эффективность возбуждения хемилюминесценции флуоресцеина, но в значительно меньшей степени, чем ДМСО. Вероятная причина этого - повышение растворимости ЦТМА вследствие введения апротонного растворителя и разогрева реакционной смеси до 40°С при смешении ДМСО с водой, В результате этого прямые мицеллы ПАВ не образуются, а молекулы ЦТМА за счет электростатических взаимодействий между их положительно заряженными гидрофильными группами и отрицательно заряженными дианионами флуоресцеина экранируют последние. Это приводит к диффузионным препятствиям взаимодействию синглетного кислорода с анионами флуоресцеина, что в свою очередь уменьшает эффективность переноса энергии с молекул синглетного кислорода к молекулам флуоресцеина.

Выявленный эффект повышения эффективности возбуждения хемилюминесценции флуоресцеина использовали для разработки методик определения органических пероксидов и пероксида водорода по реакции окисления ими флуоресцеина (табл. 15).

Из данных табл, 15 видно, что наиболее чувствительны методики определения органических пероксидов и пероксида водорода при проведении реакций окисления флуоресцеина в среде ДМСО - вода в отсутствие ПАВ.

Методика определения органического пероксида ТБП в среде вода - ДМСО была применена для определения его в водонерастворимых объектах -рафинированном и нерафинированном оливковых маслах (рис. 11).

Таблица 15. Сопоставление метрологических характеристик методик определения органических пероксидов и пероксида водорода в отсутствие (I) и в присутствии прямых мицелл ЦТМА (II) водной среде и в среде 75 об.% ДМСО («=3; Р=0,95).

Соединение Методика Среда

Вода Вода-ДМСО

стн, нМ 5г(с = 0,1 мкМ) сШт нМ £г (с = 20 нМ)

2-Бутанонпероксид I 5 0,05 0,5 0,07

11 2 0,08 2 0,09

трет-Бутил- I 50 0,09 1 0,12

гидропероксид 11 40 0,11 6 0,13

Пероксид водорода I 0,08 0,05 0,11

II _0,4 0,13 | 0,1 0,13

Рис. 11. Результаты определения ТБП в рафинированном (I) и нерафинированном (II) оливковых маслах в процессе их термической обработки по реакции пероксидазного окисления фяуоресце-ина в среде ДМСО (75 об.%).

время кипяченая,1

Из подученных данных видно, что в процессе термической обработки масла содержание органического пероксида в нем возрастает. Это связано с тем, что в начале процесса кипячения антиоксиданты масла замедляют окисление непредельных жирных кислот. В процессе кипячения концентрация природных антиоксидантов уменьшается, что способствует окислению масла и образованию продуктов окисления - гидропероксидов. То, что содержание ТБП в нерафинированном оливковом масле в среднем на 30% меньше, чем в рафинированном, связано, по-видимому, с тем, что в процессе рафинизации масла количество природных антиоксидантов в нем уменьшается; следовательно, рафинированное масло в большей степени подвержено окислительным процессам.

ВЫВОДЫ

1. Получены активные и стабильные во времени (не менее 90 дней) препараты иероксидазы хрена, ковалентно иммобилизованной на силикагелях, модифицированных тиоцианатными, изотиоцианатными, эпоксидными и аминогруппами с различной длиной углеводородного радикала, связывающего молекулы фермента с носителем.

2. На основании созданного препарата иммобилизованной пероксидазы хрена, ковалентно иммобилизованной на тиоцианатном силикагеле, разработаны

ферментативные методики определения фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов с пределами обнаружения 2,1 и 500 нМ соответственно.

3. Показано, что жесткое закрепление конформации молекул пероксидазы в результате ковалентной иммобилизации позволяет повысить чувствительность (в 2, 10 и 100 раз по сравнению с использованием нативного фермента) и селективность ферментативных методик определения ее неорганических ингибиторов - фторид-, цианвд- и тиоцианат-ионов, соответственно. Разработанные методики определения неорганических анионов применены в анализе биологических объектов (крови и слюны) на содержание цианид- и тиоцианат-ионов и питьевых вод на содержание фторид-ионов.

4. Показано, что пероксидаза хрена в более мягких условиях (в отсутствие органических растворителей и нагревания) и эффективнее по сравнению с известным неорганическим катализатором Кз[Ре(СЫ)6] катализирует реакции получения флуоресцирующих производных ее средне Окисляемых субстратов -катехоламинов и их метаболитов с использованием мезо-1,2- дифенил-этилендиамина и бензиламина. Продукты дериватизации катехоламинов, полученные в присутствии пероксидазы, идентичны по своему составу и строению дериватизатам, полученным с помощью неорганического катализатора.

5. Разработаны высокочувствительные методики определения катехоламинов: допамина (сми„ = 10 нМ), адреналина (см„„ = 1 нМ), добутамина (смин = 60 нМ), метилдопы (смин = 20 нМ) и метаболита - гомованилиновой кислоты (смин = 10 нМ) по флуоресценции продуктов их дериватизации в присутствии нативной пероксидазы с мезо-1,2-дифенилэтилендиамином и бензиламином. Предложены подходы к повышению чувствительности и селекгивности методик определения катехоламинов и их метаболитов, заключающиеся во введении в сферу реакции полярного органического растворителя ДМСО, прямых мицелл ПАВ и использовании в качестве источника возбуждения флуоресценции лазерного излучения. Показана возможность применения этих методик в анализе биологических объектов на примере определения гомованилиновой кислоты в моче.

6. Выявлено значительное повышение эффективности возбуждения хемилюминесценции флуоресцеина в катализируемой нативной пероксидазой реакции его окисления органическими пероксидами и пероксидом водорода при введении ДМСО. Этот эффект использован для разработки высокочувствительных методик определения ограниченно растворимого в воде 2-бутанонпероксида (сн = 0,5 нМ) и водонерастворимого т/>еот-бутилгидроперок-сида (с„ = 1 нМ). Методика определения трет-бутилгидропероксида применена для анализа нерастворимого в воде пищевого объекта - оливкового масла.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих статьях:

1. Yablotskiy K.V., Radhul O.V., Veselova I.A., Shekhovtsova T.N. Determination of Fluoride, Cyanide, and Thiocyanate Using Horseradish Peroxidase Immobilized on Modified Silica Gel. //Analytical Letters. 2007. V. 40. N. 8. P. 1521 -1539.

2. Поляков А.Е., Яблоцкий КВ., Мугинова С.В., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Ферментативное определение допамина в фармацевтических препаратах. // Заводская лаборатория. 2009. Т. 75. № 12. С. 18 - 23.

3. Яблоцкий КВ., Шеховцова Т.Н. Определение анионов ферментативным методом. // Журнал Аналитической Химии. 2010. Т. 65. Л® 7. С. 676 - 690 (обзор).

тезисах докладов:

1. Shekhovtsova T.N., Veselova 1.А., Radul O.V., Yablotskiy K.V. Determination of fluoride and cyanide using covalently immobilized peroxidase. Book of Abstracts. International Congress on Analytical Sciences. June 25 - 30,2006, Moscow, Russia, V. 1. P. 124.

2. Shekhovtsova T.N., Muginova S.V., Veselova I.A., Karkeshkin MA., Kireyko A.V., Yablotskiy К V. Approaches to improve analytical characteristics of enzymatic methods for the determination of biologically compounds. Book of Abstracts. The 9-th International Symposium on Kinetics in Analytical Chemistry, Marrackech, Morocco, November 2 -4, 2006. P. 18.

3. Yablotskiy К. V. Application of covalently immobilized peroxidase for the determination of anions. Тезисы докладов Международной конференции Ломоносов-2007,11 - 14 апреля, Москва. Секция «Химия». С. 567.

4. Веселова И.А., Мугинова С.В., Кирейко А.В., Яблоцкий КВ., Шеховцова Т.Н. Новые подходы к повышению чувствительности и селективности определения лекарственных препаратов и их метаболитов - субстратов растительных дероксидаз. Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, 23 - 28 сентября, Москва, 2007. Т. 4. С. 514.

5. Яблоцкий К.В. Ферментативный флуориметрический метод определения катехоламинов. Тезисы докладов Международной конференции Ломоносов-2008, 8-11 апреля, Москва. Секция «Химия». С. 85.

6. Yablotskiy K.V., Shirshin Е.А., Veselova J.A., Fadeev V.V., Shekhovtsova T.N. Enzymatic approach to the determination of catecholamines with laser-induced fluoresccnce detection. Book of abstracts. International conference CHIM1A 2009 "New trends in applied chemistry". May 13-16,2009, Constanta, Romania. P. 123.

7. Yablotskiy К.V, Shirshin E.A., Veselova I.A., Fadeev V.V., Shekhovtsova T.N. Laser-induced fluorescence determination of catecholamines in micellar media. Book of abstracts. 6th International Conference on Instrumental Methods of Analysis: Modern Trends and Applications "IMA-2009". October 4-8,2009, Athens, Greece. P. 60.

8. Muginova SK Veselova I.A., Polyakov A.E., Yablotskiy K.V., Shekhovtsova T.N. Enzymatic determination of catecholamines: various approaches to enhancing sensitivity. Book of abstracts. The 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society "IsranaIytica-2010". January 19-20,2010, Tel-Aviv, Israel. P. 120.

9. Яблоцкий КВ., Олейник Л.И., Родионов П.В., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Дизайн среды как средство управления ферментативными процессами для повышения чувствительности определения субстратов пероксидазы. Тезисы докладов Съезда аналитиков России 2010 г. Аналитическая химия - новые методы и возможности, 26 - 30 апреля, Москва. С. 345.

Автор выражает благодарность профессору МГУ Фадееву В. В. и аспиранту физического факультета МГУ Ширшину Е.А. за помощь в проведении экспериментов с лазерной флуориметрией и обсуждении результатов.

Отпечатано на ризографе вОНТИГЕОХИРАН Тираж 100 экз.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Ферментативные методы определения анионов

1.1. Определение фторид-ионов

1.2. Определение цианид-ионов

1.3. Определение фосфат-ионов

1.4. Определение тиоцианаг-ионов

1.5. Определение сульфид-ионов

1.6. Определение нитрат-ионов

1.7. Определение сульфит-ионов

1.8. Определение сульфат-ионов

1.9. Определение оксалат-иопов

1.10. Определение формиаг-ионов

1.11. Определение салицилаг-ионов

Глава 2. Применение флуориметрического метода для определения 39 среднеокисляемых субстратов пероксидазы - катехоламинов и их метаболитов

2.1. Определение катехоламинов и их метаболитов по их собственной 41 флуоресценции

2.2. Определение катехоламинов и их метаболитов по флуоресценции 43 их производных

2.3. Хемилюминесцентное определение катехоламинов и их 48 метаболитов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Исходные вещества, посуда, аппаратура, обработка результа- 53 тов измерений, методика эксперимента

3.1. Исходные вещества

3.2. Посуда, аппаратура

3.3. Методики эксперимента

3.4. Обработка результатов измерений

Глава 4. Ковалентная иммобилизация пероксидазы хрена на 63 модифицированных силикагелях — средство повышения её стабильности и чувствительности методик определения ингибиторов

4.1. Выбор носителя для ковалентной иммобилизации пероксидазы

4.2. Оптимизация условий ковалентпой иммобилизации пероксидазы 67 на модифицированных силикагелях

4.3 Свойства препаратов пероксидазы, иммобилизованной на 72 модифицированных силикагелях

4.4. Оптимизация условий проведения индикаторной реакции 75 окисления о-дианизидина пероксидом водорода для контроля активности и стабильности иммобилизованной пероксидазы

4.5. Кинетические параметры индикаторной реакции, проводимой с 77 участием пероксидазы, иммобилизованной на модифицированных силикагелях

Глава 5. Влияние неорганических анионов на каталитическую 85 активность иммобилизованной пероксидазы

5.1. Влияние фторид-ионов на каталитическую активность 85 иммобилизованной пероксидазы

5.2. Влияние цианид-ионов на каталитическую активность 89 иммобилизованной пероксидазы

5.3. Влияние тиоциаиат-ионов на каталитическую активность нативной 91 и иммобилизованной пероксидазы

5.4. Совместное влияние неорганических анионов на каталитическую 94 активность иммобилизованной пероксидазы

5.4.1. Совместное влияние фторид- и цианид-ионов на 95 каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы

5.4.2. Совместное влияние цианид- и тиоциапат-ионов на 96 каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы

Глава 6. Определение неорганических анионов в водах и 98 биологических жидкостях с использованием иммобилизованной I пероксидазы

6.1. Определение фторид-ионов в питьевых и минеральных водах

6.2. Определение цианид- и тиоцианат-ионов в крови

6.3. Определение тиоцианат-ионов в слюне г

Глава 7. Применение нативной пероксидазы хрена для определения катехоламинов и их метабоблитов

7.1 Ферментативное окисление допамина и гомованилиновой кислоты 107 в водных и водно-органических средах

7.1.1. Определение допамина по его собственной флуоресценции 109 и по его пероксидазному окислению в присутствии ДМСО

7.1.2. Определение гомованилиновой кислоты по ее перокси- 112 дазному окислению

7.2 Получение флуоресцирующих производных катехоламинов и их 115 метаболитов в присутствии пероксидазы

7.2.1. Выбор фермента для его применения в процессах 117 дериватизации катехоламинов

7.2.2. Оптимизация условий получения флуоресцирующих 126 производных катехоламинов и их метаболитов с дифенилэтилепдиамином и бензиламином

7.2.3. Разработка ферментативных методик определения 132 катехоламинов и их метаболитов по их флуоресцирующим производным

7.3. Пути повышения чувствительности определения катехоламинов и 133 их метаболитов по их флуоресцирующим производным ферментативным методом

7.3.1. Определение катехоламинов и их метаболитов в средах 134 прямых мицелл ПАВ

7.3.2. Определение катехоламинов и их метаболитов с 143 использованием метода лазерной флуориметрии

7.3.3. Определение гомоваиилиновой кислоты в моче по 144 флуоресценции ее производного

Глава 8. Определение пероксидов в водных, водно-органических и 145 мицеллярных средах с использованием нативной пероксидазы

8.1. Определение органических пероксидов и пероксида водорода в 147 водных и водно-органических средах по пероксидазному окислению ими флуоресцеина

8.2. Влияние ПАВ на катализируемую пероксидазой реакцию 154 окисления флуоресцеина пероксидом водорода и органическими пероксидами в водных и водно-органичееких средах

8.3 Определение /и/?е/и-бутилгидропероксида в оливковом масле

ВЫВОДЫ

Актуальность работы. В последние годы большое внимание исследователей-аналитиков по-прежнему уделяется проблемам экологического мониторинга, конгроля качества пищевых продуктов и лекарственных средств и клинической диагностики. В связи с этим актуальна задача высокочувствительного определения неорганических и органических токсикантов (ионов тяжелых металлов, анионов, фенолов, ядохимикатов) и физиологически активных органических соединений (витаминов, гормонов) в объектах окружающей среды и медицины. В настоящее время разработано большое количество инструментальных методов определения таких соединений, однако все они не лишены недостатков с точки зрения чувствительности, селективности, простоты и длительности определения. Для решения этих проблем одним из перспективных направлений является применение биологических катализаторов - ферментов, поскольку большинство токсичных и физиологически активных веществ является либо их субстратами либо эффекторами. В то же время разработка ферментативных методик определения этих веществ часто ограничена малой доступностью, сложностью выделения, ограниченной субстратной специфичностью или низкой стабильностью препаратов ферментов.

Пероксидаза из корней хрена (ПХ) относится к одним из наиболее изученных и доступных ферментов класса оксидоредуктаз, обладающих групповой субстратной специфичностью и высокой каталитической активностью. Вследствие этого пероксидазу хрена широко используют для разработки ферментативных методик определения большого числа органических и неорганических веществ, являющихся ее субстратами и эффекторами. Однако перспективы дальнейшего использования ПХ в химическом анализе ограничены низкой стабильностью и активностью нативного фермента в агрессивных и органических средах. Одним из путей решения этой проблемы может быть переведение пагивпого биокатализатора

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической химии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова И.А. Веселовой за участие в постановке задач и обсуждении результатов. в иммобилизованное состояние или включение в состав прямых и обращенных мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ). Варьирование природы и свойств носителя для иммобилизации фермента и природы ПАВ позволяет создавать препараты ферментов с заданными свойствами. Это позволяет расширить круг определяемых соединений за счет ограниченно растворимых в воде и средне окисляемых субстратов ПХ, сохранить активность ферментов в агрессивных средах, обеспечить стабильность биокатализаторов в среде органических растворителей, повысить чувствительность методик определения субстратов-флуорофоров за счет усиления аналитического сигнала. Все вышесказанное свидетельствует о далеко не исчерпанных возможностях использования пероксидазы хрена в целях химического анализа и перспективности проведения исследований в этой области.

Цель работы заключалась в разработке подходов к расширению возможностей использования нативной и иммобилизованной пероксидазы из корней хрена при определении ее ингибиторов (неорганических анионов), средне окисляемых субстратов-восстановителей (катехоламинов и их метаболитов) и ограниченно растворимых в воде субстратов окислителей (органических пероксидов).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: получить стабильные и активные препараты пероксидазы хрена, иммобилизованной на модифицированных силикагелях, выяснить чувствительность иммобилизованной ПХ к действию неорганических анионов (фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов), разработать спектрофотометричсскис чувствительные и селективные методики их определения в пищевых продуктах и биологических жидкостях;

- изучить возможность применения нативной пероксидазы для определения ее средне окисляемых субстратов - катехоламинов и их метаболитов с флуориметрическим контролем скорости индикаторных реакций, проводимых в водной, водно-органической средах и в присутствии ПАВ;

- показать возможность применения нативной ПХ для определения ее ограниченно растворимых в воде субстратов-окислителей (на примере трет-бутилгидропероксида, 2-бутанонпероксида) в среде органических растворителей и прямых мицелл ПАВ.

Научная новизна. Получены активные и стабильные во времени препараты фермента ПХ, иммобилизованной на силикагелях, модифицированных тиоцианатными, изотиоцианатными, эпоксидными и амино-группами с различной длиной углеводородного радикала, связывающего молекулы фермента с носителем. Установлено, что характер влияния иигибиторов (фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов) на каталитическую активность иммобилизованной ПХ зависит от конформационной подвижности активного центра фермента и от времени инкубирования иммобилизованного биокатализатора с ингибитором.

Предложено применение нативной ПХ в среде ДМСО и прямых мицелл цетилтриметиламмоний бромида (ЦТМА) в качестве более эффективного катализатора процессов дериватизации ее средне окисляемых субстратов — катехоламинов (допамина, адреналина, серотонина, добутамина, мегилдопы) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) с 1,2-^езо-дифенил-этилендиамином (ДЭД) и бензиламином (БА) по сравнению с неорганическими катализаторами. Показано, что проведение процессов дериватизации катехоламинов и их метаболитов с БА в присутствии ПХ, включенной в состав прямых мицелл • ЦТМА, обеспечивает стабилизацию интенсивно флуоресцирующих дериватизагов. Этот эффект использован для улучшения метрологических характеристик ферментативных методик определения гормонов (адреналина и допамина) и их метаболитов (гомованилиновой кислоты).

Показано, что введение 85 об.% ДМСО в катализируемую ПХ реакцию окисления флуоресцеина пероксидом водорода и органическими пероксидами, приводит к значительному усилению его хемилюминесценции вследствие увеличения концентрации растворенного кислорода, что в свою очередь повышает выход реакции образования синглетного кислорода под действием пероксидазы.

Практическая значимость работы. На основе полученных препаратов пероксидазы хрена, ковалентпо иммобилизованной на модифицированных силикагелях, разработаны методики определения ее неорганических ингибиторов (фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов). Методики апробированы в анализе питьевых вод и биологических (кровь, слюна) объектов. Разработаны высокочувствительные и селективные методики определения ряда катехоламинов (допамина, адреналина, добутамина, метилдопы) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) - субстратов-восстановителей пероксидазы с использованием ее ассоциатов с катионным ПАВ — цетилтриметил-аммонийбромидом (ЦТМА). Методика определения гомованилиновой кислоты апробирована в анализе биологической жидкости (моче). Разработаны высокочувствительные методики определения ограниченно растворимых в воде субстратов-окислителей пероксидазы — органических пероксидов (тре/п-бутил-гидропероксида, 2-бутанонпероксида) в средах с высоким содержанием полярного органического растворителя ДМСО, которые были использованы в анализе водонерастворимого объекта - оливковом масле. Автор выносит на защиту:

- способы получения высокостабильных и активных препаратов ПХ, ковалентно иммобилизованной на силикагелях, модифицированных тиоцианатными, изотиоциапатными, эпоксидными и амино-группами, а также флуоресцирующих производных катехоламинов (допамина, адреналина) и их метаболитов;

- результаты изучения кинетики окисления пероксидом водорода о-дианизидина и катехоламинов (допамина и адреналина), катализируемого иммобилизованной и нативной пероксидазой соответственно;

- сведения о химизме процессов дериватизации катехоламинов с лгезо-1,2-дифенил-этилендиамином и бензиламином, катализируемой нативной пероксидазой;

- данные о влиянии параметров среды (рН, природы ПАВ и состава растворителя) на эффективность взаимодействия I1X с ее субстратами и ингибиторами;

- методики определения ингибиторов (неорганических анионов), субстратов-восстановителей (катехоламинов и их метаболитов) и субстратов-окислителей (органических пероксидов), апробированные в анализе реальных объектов: биологических жидкостей, питьевых вод, пищевых продуктов. f

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время применение ферментативных методов позволяет определять широкий круг органических и неорганических соединений в различных объектах. Однако все большее распространение ферментативных методов и внедрение их в повседневную аналитическую практику сдерживается ограниченными их возможностями при определении ингибиторов - в частности анионов а также средне и трудно окисляемых субстратов. Возможность применения ферментов для разработки методик определения анионов, прежде всего, определяется строением молекулы биокатализатора и природой ингибитора и, как правило, сводится к образованию устойчивого комплексного соединения между анионом и кофактором фермента, в случае если последний содержит ион металла. Проблема определения средне и трудно окисляемых субстратов ферментов заключается в большом расходе биокатализатора и часто недостаточной чувствительности и селективности методик их определения, обусловленной тем, что в ферментативных методах в основном в качестве метода контроля применяется спектрофотометрия. Использование более чувствительного флуориметрического метода позволило бы повысить чувствительность и селективность определения средне окисляемых субстратов. Особенно это важно при разработке методик определения физиологически активных соединений в объектах медицины. Пероксидаза из корней хрена является гем-содержащим ферментом, и в то же время в круг ее средне окисляемых субстратов-восстановителей входят такие физиологически активные соединения как катехоламины, являющиеся флуорофорами, и их метаболиты, продукты ферментативного окисления которых флуоресцируют. В связи с этим применение ПХ является перспективным направлением при разработке методик определения анионов и физиологически активных соединений. Поэтому настоящий обзор литературы содержит сведения о применении ферментативных методов для определения анионов и об использовании метода флуориметрии при определении физиологически активных субстратов ферментов.

выводы

1. Получены активные и стабильные во времени (не менее 90 дней) препараты пероксидазы хрена, ковалентно иммобилизованной на силикагелях, модифицированных тиоцианатными, изогиоцианатными, эпоксидными и амино-группами с различной длиной углеводородного радикала, связывающего молекулы фермента с носителем.

2. На основании созданных препаратов иммобилизованной пероксидазы хрена, ковалентно иммобилизованной на тиоцианатпом силикагеле, разработаны ферментативные методики определения фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов с пределами обнаружения 2, 1 и 500 нМ соответственно.

3. Показано, что жесткое закрепление конформации молекул пероксидазы в результате ковалентной иммобилизации позволяет повысить чувствительность (в 2, 10 и 100 раз по сравнению с использованием нативного фермента) и селективность ферментативных методик определения ее неорганических ингибиторов - фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов, соответственно. Разработанные методики определения неорганических анионов применены в анализе биологических объектов (крови и слюны) на содержание цианид- и тиоцианат-ионов и питьевых вод на содержание фторид-ионов.

4. Установлено, что пероксидаза хрена в более мягких условиях (в отсутствие нагревания и органических растворителей) и эффективнее по сравнению с известным неорганическим катализатором Кз[17е(СН)б] катализирует реакции получения флуоресцирующих производных ее средне окисляемых субстратов - катехоламинов и их метаболитов с использованиием мезо-1,2-дифенилэтилепдиамина и бензиламина. Показано, что продукты дериватизации катехоламинов, полученные в присутствии пероксидазы, идентичны по своему составу и строению дериватизагам, полученным с помощью неорганического катализатора.

5. Разработаны высокочувствительные методики определения катехоламинов: допамина (смин = 10 нМ), адреналина (смип = 1 нМ), добутамина (смнн = 60 нМ), метилдопы (еМШ1 = 20 нМ) и их метаболитов - гомованилиновой кислоты (смин =10 нМ) по флуоресценции продуктов их дериватизации в присутствии нативной пероксидазы с лгез<э-1,2-дифенилэтилендиамином и бензиламином. Предложены подходы к повышению чувствительности и селективности методик определения катехоламинов и их метаболитов, заключающиеся во введении в сферу реакции полярного органического растворителя ДМСО, прямых мицелл ПАВ и использовании в качестве источника возбуждения флуоресценции лазерного излучения. Показана возможность применения этих методик в анализе биологических объектов на примере определения гомованилиновой кислоты в моче. Выявлено значительное повышение эффективности возбуждения хемилюминесценции флуоресцеина в катализируемой нативной пероксидазоЙ реакции его окисления пероксидом водорода и органическими псроксидами при введении ДМСО. Этот эффект использован для разработки высоко-чувствительных методик определения ограниченно растворимого в воде 2-бутанонпероксида (с„=0,5 нМ) и водонерастворимого гаре/я-бутилгидропероксида (си = 1 нМ). Методика определения трет-бу-тилгидропероксида применена для анализа нерастворимого в воде пищевого объекта - оливкового масла.

1. Allen D. Determination of sulfite in beer samples using an amperometric fill and flow channel biosensor employing sulfite oxidase // Food Technol. Aust. 1985. V. 37. № 3. P. 506-512.

2. Шеховцова Т. H., Митюрева И. Л., Швецкая М. В., Долманова И. Ф. Использование кислых фосфатаз для определения микроколичеств анионов // Журн. Аналит. Химии. 1991. Т. 46. № 3. С. 571 578.

3. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Долманова И.Ф. Ферментативный метод определения микроколичеств железа (III) и ряда ингибиторов пероксидазы // Журн. Аналит. Химии. 1993. Т. 48. № 1. С. 129 136.

4. Krajewska В., Zaborska W., Leszko М. Inhibition of chitosan-immobilized urease by slow-binding inhibitors: Ni , F" and acetohydroxamic acid. .// J. Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2001. V. 14. №4-6. P. 101-109.

5. Marcos J., Townshend A. Fluoride determination by its inhibitory effect on immobilized liver esterase. //Anal. Chim. Acta. 1995. V. 310. № 1. P. 173 180.

6. Yablotskiy K.V., Radhul O.V., Veselova I.A., Shekhovtsova T.N. Determination of Fluoride, Cyanide, and Thiocyanate Using Horseradish Peroxidase Immobilized on Modified Silica Gel. // Anal. Lett. 2007. V. 40. № 8. P. 1521 1539.

7. Liawruangrath S., Oungpipat W., Watanesk S., Liawruangrath В., Dongduen C., Purachat P. Asparagus-based amperometric sensor for fluoride determination. I I Anal. Chim. Acta. 2001. V. 448. № 1 2. P. 37 - 46.

8. Evtugin G. A., Ivanov A., Gogol E., Marty J., Budnikov H. Amperometric flow-through biosensor of cholinesterase inhibitor. // Anal. Chim. Acta. 1999. V. 385. № 1 -3.P. 13-21.

9. Шеховцова Т. H., Ремизова А. А., Чумакова А. И., Долманова И. Ф., Соколов Ю. И. Метод определения неорганических анионов — ингибиторов фермента супероксиддисмуразы. // Журн. Аналит. Химии. 1994. Т. 1994. № 7. С. 749 754.

10. Whitaker J.R. Enzyme inhibitors. New York: Marcel Dekker Inc, 1972. P. 255.

11. Ikebukoro K., Shimomura M., Onuma N., Watanabe A., Nomura Y., Nakanishi K., Arikawa Y„ Karube I. A novel biosensor for cyanide based on a chemiluminiscence reaction. // Anal. Chim. Acta. 1996. V. 329. № 1 2. P. 111 - 116.

12. Volotovsky V., Kim N. Cyanide determination by ISFET-based peroxidase biosensor. //Biosens. Bioelectron. 1998. V. 13. № 9. P. 1029 1033.

13. Tatsuma Т., Oyama N. H202-Generating peroxidase electrodes as reagentless cyanide sensors. // Anal. Chem. 1996. V. 68. № 9. P. 1612 1615.

14. Smit M., Cass A. Cyanide detection using a substrate-regenerating, peroxidase-based biosensor. // Anal. Chem. 1990. V. 62. № 22. P. 2429 2436.

15. Besombes J., Cosnier S., Labbe P., Reverdy G. A biosensor as warning device for the detection of cyanide, chlorphenols, atrazine and carbamate pesticides. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 311. №3. P. 255 -263.

16. Lopez-Ruiz B. Advances in the determination of inorganic anions by ion chromatography. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. № 1 2. P. 607 - 627.

17. Conrath N. Grundig В., Huwel S., Camman K. A novel enzyme sensor for the determination of inorganic phosphate. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 309. № 1-3. P. 47-52.

18. WeetallH., Jacobson M. //IFS: Ferment. Technol. Today. Proc. IV. 1972. P. 361.

19. Guilbault G., Nanjo M. A phosphate selective electrode based on immobilized alkaline phosphatase and glucose oxidase. // Anal. Chim. Acta. 1975. V. 78. № 1. P. 69-80.

20. Urso E., Coulet P. Phosphate-sensitive enzyme electrode: a potential sensor for environment control. // Anal. Chim. Acta. 1990. V. 239. № 1. P. 1-5.

21. Mousty C., Cosnier S., Shan D., Mu S. Trienzymatic biosensor for the determination of inorganic phosphate. // Anal. Chim. Acta. 2001. V. 443. № 1. P. 1 8.

22. Huwel S., HaalckL., Conrath N., Spener F. Maltose phosphorilase from Lactobacillus brevis\ purification, characterization, and application in a biosensor for ortho-phosphate. // Enzyme Microbial Technology. 1997. V. 21. № 6. P. 413 420.

23. Cosnier S., Gondran C., Watelet J., Giovani W., Furrel R., Leone F. A bienzyme electrode (alkaline phosphatase-polyphenol oxidase) for the determination of phosphate. // Anal. Chem. 1998. V. 70. № 18. P. 3952 3956.

24. Ikebukoro K., Nishida R., Yamamoto II, Arikawa Y., Nakamura H., Suzuki M., Kubo /., Takeuchi T. A novel biosensor system for the determination of phosphate. // J. Biotech. 1996. V. 48. № 6. P. 67 72.

25. Ikebukoro K., Wakamura II, Karube I., Kubo I., Inagawa M., Sugawara Т., Arikawa Y., Suzuki M., Takeuchi T. Phosphate sensing system using pyruvate oxidase and chemiluminescence detection. 11 Biosens. Bioelectron. 1996. V. 11. № 10. P. 959 -965.

26. Nakamura H., Ikebukoro K., McNiven S., Karube I., Yamamoto H., Hayashi K, Suzuki M., Kubo I. A chemiluminiscent FIA biosensor for phosphate ion monitoring using pyruvate oxidase. // Biosensors & Bioelcctronics. 1997. V. 12. № 9-10. P. 959-966.

27. Zhao J., Henkens R., Crumbliss A. Mediator-free amperometric determination of toxic substances based on their inhibition of immobilized horseradish peroxidase. // Biotechnol. Prog. 1996. V. 12. № 6. P. 703 708.

28. Yang Y., Yang M., Wang H., Jiang J., Shen G., Yu R. An amperometric horseradish peroxidase inhibition biosensor based on a cysteamine self-assembled monolayer forthe determination of sulfides. // Sensors and Actuators B. 2004. V. 102. № 1. P. 162-168.

29. Liu L., Chen Z., Yang S., Jin X., Lin X. A novel inhibition biosensor constructed by layer-by-layer technique based on biospecific affinity for the determination of sulfide. // Sens. Actuators B. 2008. V. 129. № 1. P. 218 224.

30. Miura Y., Matsushita Y., Haddad P. Stabilization of sulfide and sulfite and ion-pair chromatography of mixtures of sulfide, sulfite, sulfate and thiosulfate. // J. Chromatogr. B. 2005 V. 1085. № 1. P. 47 53.

31. Amine A., Palleschi G. Phosohate, nitrate and sulfate biosensors. // Anal. Lett. 2004. V. 37. № 1. P. 1 19.

32. Gennaro M., Angelino S. Separation and determination of inorganic anions by reversed-phase high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 789. №1-2. P. 181-194.

33. Hlavav J., Guilbault G. Determination of sulphite by use of a fiber-optic biosensor based on a chemiluminescent reaction. // Anal. Chim. Acta. 1994. V. 299. № 1. P. 91-96.

34. Edberg U. Enzymatic determination of sulfite in foods: NMKL interlaboratory study. // J. AOAC Int. 1993. V. 76. № 1. P.53 58.

35. Situmorang M., Hibbert D., Gooding J., Barnett D. A sulfite biosensor fabricated using electrodeposited polytyramine: application to wine analysis. // The Analyst. 1999. V. 124. № 12. P. 1775 1779.

36. Dinckaya E., Sezginturk M., Akyilmaz E., Ertas F. Sulfite determination using sulfite oxidase biosensor based glassy carbon electrode coated with thin mercury film. // Food Chem. 2007. V. 101. № 4. P. 1540 1544.

37. Mulchandani A., Groom C., LuongJ. Determination of sulfite in food products by anenzyme electrode. // J. Biotech. 1991. V. 18. № 1 2. P. 93 - 102.

38. Jankovskiene G., Paliulionyte V, Padarauskas A. Determination of sulfite by ion pair chromatography using pre-column dcrivatization with iron(III)-l,10-phenanthroline complex. // Chemia Analityczna. 2002. V. 47. № 6. P. 847 854.

39. Vadgama P., Sheldon W., Guy J., Covington A., Laker M. Simplified urinary oxalate determination using an enzyme electrode. // Clin. Chim. Acta. 1984. V. 142. № 2. P. 193 -201.

40. Nabi Rahni M., Guilbault G. Immobilized enzyme electrode for the determination of oxalate in urine. // Anal. Chem. 1986. V. 58. № 3. P. 523 526.

41. Sezginturk M., Dinckaya E. A novel amperometric biosensor based on spinach (iSpinacia oleracea) tissue homogenate for urinary oxalatedetermination. // Talanta.2003. V. 59. №3. P. 545 -551.

42. Hong F., Nilvebrant N., Johnson L. Rapid and convenient determination of oxalic acid employing a novel oxalate biosensor based on oxalate oxidase and SIRE technology. //Biosens. Bioelectron. 2003. V. 18. № 9. P. 1173 1181.

43. Reddy S., Higson S., Vadgama P. Amperometric enzyme electrode for the determination of urine oxalate. // Anal. Chim. Acta. 1997. V. 343. № 1-3. P. 59 68.

44. Fiorito P., Cordoba de Torresi S. Optimized multilayer oxalate biosensor. // Talanta.2004. V. 62. № 3. P. 649 654.

45. Capra R., Strumia M., Vadgama P., Baruzzi A. Mucin/carbopol matrix to immobilize oxalate oxidase in a urine oxalate amperometric biosensor. // Anal. Chim. Acta. 2005. V. 530. № l.P. 49-54.

46. GengX., Zhang S., Wang Q., Zhao Z. Determination of organic acids in the presence of inorganic anions by ion chromatography with suppressed conductivity detection. // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1192. № 1. P. 187 190.

47. Tzang C., Yuan R., Yang M. Voltammetric biosensors for the determination of formate andglucose-6-phosphate based on the measurement ofdehydrogenase-generated NADH and NADPH. // Biosens. Bioelec. 2001. V. 16. № 3. P. 211 219.

48. Мак К., Wollenberger U., Scheller F., Renneberg R. An amperometric bi-enzymesensor for determination of formateusing eofactor regeneration. // Biosens. Bioelec. 2003. V. 18. №9. P. 1095- 1100.

49. Sandstrom K., Sunesson A., Levin J., Turner A. A gas-phase biosensor for environmental monitoring of formic acid: laboratory and field validation. // J. Environ. Monit. 2003 V. 5. № 3. P. 477 482.

50. Kieber D., Vaughan G., Mopper K. Determination of formate in natural waters by a coupled enzymatic/high-performance liquid chromatographic technique. // Anal. Chem. 1988. V. 60. № 16. P. 1654 1659.

51. Schelp C., Scheper Т., Buckmann F., Reardon K. Two fibre-optic sensors with confined enzymes and coenzymes: Development and application. // Anal. Chim. Acta. 1991. V. 255. № 2. P. 223-229.

52. Campanella L., Gregori E., Tomasetti M. Salicylic acid determination in cow urine and drugs using a bienzymatic sensor. 11 J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. V. 42. № 1. P. 94 99.

53. Junior L., Neto G., Fernandes J., Kubota L. Determination of salicylate in blood serum using an amperometric biosensor based on salicylate hydroxylase immobilized in a polypyrrole-glutaraldehyde matrix. // Talanta. 2000. V. 51. № 3. P. 547 557.

54. Neumayr M., Sontag G,, Pittner F. Enzymatic sensor coupled to a flow-injection analysis system for the determination of salicylate. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 305. № 1-3. P. 26-31.

55. Ehrendorfer M., Sontag G., Pittner F. Determination of salicylate in beverages and cosmetics by use of an amperometric biosensor. // Fresenius J. Anal. Chem. 1996. V. 356. № l.P. 75 -79.

56. Siontorou C., Nikolesis D. Cyanide ion minisensor based on methemoglobin incorporated in metal supported self-assembled bilayer lipid membranes and modifiedwith platelet-activating factor. // Anal. Chim. Acta. 1997. V. 355. № 2 -3. P. 227 234.

57. Engblom S. Determination of inorganic phosphate in a soil extract using a cobalt electrode. // Plant and Soil. 1999. V. 206. № 1. p. 173 179.

58. Amini M., Shahrokhian S., Tangestaninejad S. Thiocyanate-selective electrodes based on nickel and iron phthalocyanines. // Anal. Chim. Acta. 1999. V. 402. № 1 2. P. 137- 143.

59. Hassan S., Marzouk S., Sayour IT. Methylene blue potentiometric sensor for selective determination of sulfide ions. // Anal. Chim. Acta, V. 466. № LP. 47 55.

60. Mourzina Yu., Ermolenko Yu., Yoshinobu Т., Vlasov Yu., Iwasaki II, Schdning M. Anion-selective light-addressable potentiometric sensors (LAPS) for the determination of nitrate and sulphate ions. // Sens. Actuators B. 2003. V. 91. № 1—3. P. 32-38.

61. Seungwon J., Heekyoung Y., Haesang J., Min О., Kye C. Polymeric ISE for hydrogen sulfite based on bis-urea calix|4.diquinones as neutral lipophilic ionophores. // Elcctroanal. 2003. V.15. № 10. P. 872-877.

62. Mazloum Ardakani M., Jalayer M, Naeimi H., Heidamezhad A., Zare H.R. Highly selective oxalate-membrane electrode based on 2,2'-l,4-butandiyle bis(nitrilo propylidine).bis-l-naphtholato copper(II). // Biosens. Bioel. 2006. V. 21. №7. P. 1156- 1162.

63. Drochioiu G. Fast and highly selective determination of cyanide with 2,2-dihydroxy-1,3-indanedione. // Talanta. 2002. V. 56. № 6. P. 1163.

64. Diniz M., Filho О., Aquino E., Rohwedder J. Determination of phosphate in natural water employing a monosegmented flow system with simultaneous multiple injection. // Talanta. 2004. V. 62. № 3. P. 469 475.

65. Pinillos S., Vicente I., Bernal J., Asensio J. Determination of thiocyanate by carbonyl sulphide (OCS) generation and gas-phase molecular absorption spectrometry. // Anal. Chim. Acta. 1996. V. 318. № 1 3. P. 377 - 383.

66. Staden J., Botha A. Spectrophotometric determination of thiocyanate by sequential injection analysis. // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 403. № 1-2. P. 279 286.

67. Safavi A., Ramezani Z. Kinetic spectrophotometric determination of traces of sulfide. //Talanta. 1997. V. 44. № 7. P. 1225 1230.

68. Nagaraja P., Hemanta Kumar M. Spectrophotometric Determination of nitrate in polluted water using a new coupling reagent. // Anal. Sci. 2002. V.18. № 3. P. 355 -357.

69. Hassan S. ,Hamza M., Mohamed A. A novel spectrophotometric method for batch and flow injection determination of sulfite in beverages. // Anal. Chim. Acta. 2006. V. 570. №2. P. 232-239.

70. Santos de Oliveira F., Кот M. Spectrophotometric determination of sulphate in automotive fuel ethanol by sequential injection analysis using dimethylsulphonazo(III) reaction. // Talanta. 2006. V. 68. № 3. P. 992 999.

71. Perez-Ruiz Т., Lozano C., Tomas V., Sanz A. Flow-injection spectrophotometric determination of oxalate, citrate and tartrate based on photochemical reactions. // Anal. Lett. 1998. V.31. № 8. P. 1413 1427.

72. Хабаров ЮТ., Яковлев M.C. Повышение чувствительности спектрофото-метрического определения муравьиной кислоты с помощью ацетата ртути(П). // Журн. Прикл. Химии. 2007. V.80. № 9. Р. 1449 1449.

73. Parham Н., Rahbar N. Solid phase extraction-spectrophotometric determination of salicylic acid using magnetic iron oxide nanoparticles as extractor. // J. Pharm. Biomed Anal. 2009. V. 50. № 1. P. 58 63.

74. Geng X., Zhang S., Wang Q., Zhao Z. Determination of organic acids in the presenceof inorganic anions by ion chromatography with suppressed conductivity detection. // J. Chromatog. A. 2008. V. 1192. № 1. P. 187 190.

75. Bing-Sheng Y., Li-IIua N. Shou-Zhon Y. Ion chromatographic determination of salicylate in human serum with a bulk acoustic wave sensor as detector. // J. High Resol. Chromatogr. 1997. V. 20. № 3. P. 227 230.

76. Miralles E., Prat D., Compano R., Granados M. Assessment of different fluorimetric reactions for cyanide determination in flow systems. // The Analyst. 1997. V. 122. №6. P. 553 -558.

77. Zhang В., BeckH. P. A rapid and sensitive method for the fluorimetric determination of phosphate by flow-injection. // Anal. Lett. 2001. V. 34. № 15. P. 2721 2733.

78. Zhang G., Li В., Fan J., Feng S. Determination of trace thiocyanate in body fluids by a kinetic fluorimetric method. // Talanta. 1997. V. 44. № 7. P. 1141-1147.

79. Choi M. Fluorimetric optode membrane for sulfide detection. // The Analyst. 1998. V. 123. №7. P. 1631 1634.

80. Moorcroft M.J., Davis J., Compton R.G. Detection and determination of nitrate and nitrite: a review. // Talanta. 2001. V. 54. № 5. P. 785 803.

81. Rubio S., Gomez-Hens A., Valcarcel M. Fluorimetric determination of sulphate by ternary complex formation with zirconium and biacetylmonoxime nicotinylhydrazone. // Talanta. 1985. V. 32. № 3. P. 203 206.

82. Perez-Ruiz Т., Martinez-Lozano C., Tomas V., Fenoll J. Chemilumincscent determination of oxalate based on its enhancing effcct on the oxidation of methyl red by dichromate. // Anal. Chim. Acta. 2005.V. 552. № 1-2. P. 147 151.

83. Ibanez G.A., Escandar G.M. Combined liquid and solid-surface room temperature fluorimetric determination of naproxen and salicylate in serum. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V. 37. № l.P. 149- 155.

84. Zhang X., Sweedler J. Ultraviolet native fluorescence detection in capillary electrophoresis using a metal vapor NeCu laser. // Anal. Chem. 2001. V. 73. № 22. P. 5620-5624.

85. Hsieh M., Hsu C., Tseng W. Chang H Amplification of small analytes in polymer solution by capillary electrophoresis. // Electrophoresis. 2002. V. 23. № 11. P. 1633 -1641.

86. Hsieh M., Chang H. Discontinuous electrolyte systems for improved detection of biologically active amines and acids by capillary electrophoresis with laser-induced native fluorescence detection. // Electrophoresis. 2005. V. 26. № 1. P. 187 195.

87. Kuo I.T., Huang Y.F., Chang H.T. Silica nanoparticles for separation of biologically active amines by capillary electrophoresis with laser-induced native fluorescence detection. // Electrophoresis. 2005. V. 26. № 13. P. 2643-2651.

88. Wood А.Т., Hall M.R. Reversed-phase high-performance liquid chromatography of catecholamines and indoleamines using a simple gradient solvent system and native fluorescence detection. // J. Chromatog. B. 2000. V. 744. № 1. P. 221 225.

89. Wang H.Y., Sun Y., Tang B. Study on fluorescence property of dopamine and determination of dopamine by fluorimetry. // Talanta. 2002. V. 57. № 5. P. 899 907.

90. Pagel P., Blome J., Wolf H. U. High-performance liquid chromatographic separation and measurement of various biogenic compounds possibly involved in the pathomechanism of Parkinson's disease. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 746. № 2. P. 297-304.

91. Balaji J., Reddy C.S, Kaushalya S.K., Maiti S. Microfluorometric detection of catecholamines with multiphoton-excited fluorescence. // Appl. Optics. 2004. V. 43. № 12. P. 2412-2417.

92. Lin V.S.Y., Lai C.Y., Huang J.G., Song S.A., Xu S. Molecular recognition inside of multifunctionalized mesoporous silicas: Toward selective fluorescence detection ofdopamine and glucosamine. // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. № 46. P. 11510 — 11511.

93. Tsunoda M. Recent advances in methods lor the analysis of catecholamines and their metabolites. // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V. 386. № 3. P. 506 514.

94. Bowser M.T., Kennedy R.T. In vivo monitoring of amine neurotransmitters using microdialysis with on-line capillary electrophoresis. 11 Electrophoresis. 2001. V. 22. № 17. P. 3668-3676.

95. Tsai C.H., Huang H.M., Lin C.H. Violet light emitting diode-induced fluorescence detection combined with on-line sample concentration techniques for use in capillary electrophoresis. // Electrophoresis. 2003. V. 24. № 17. P. 3083 3088.

96. Huang H.M., Lin C.H. Methanol plug assisted sweeping-micellar electrokinetic chromatography for the determination of dopamine in urine by violet light emitting diode-induccd fluorescence detection. // J. Chromatogr. B. 2005. V. 816. № 1 2. P. 113-119.

97. Chen Z., Wu J., Baker G.B., Parent M., Dovichi N.J. Application of capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection to the determination of biogenic amines and amino acids in brain microdialysate and homogenate samples. //

98. J. Chromatogr. A. 2001. V. 914. № 1 2. P. 293 - 298.

99. Xiong S.X., Han H.W., Zhao R., Chen Y, Liu G.O. Capillary electrophoresis of catecholamines with laser-induced fluorescence intensified charge-coupled device detection. // Biomed. Chromatogr. 2001. V. 15. № 2. P. 83 88.

100. Zhang J. Y., Chen X.G., Ни Z.D., Ma X. Quantification of noradrenaline and dopamine in Portulaca oleracea L by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 471. № 2. P. 203 209.

101. Du M., Flanigan V., Ma Y.F. Simultaneous determination of polyamines and catecholamines in PC-12 tumor cell extracts by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. // Electrophoresis. 2004. V. 25. № 10 11. P. 1496- 1502.

102. Wang H., Li J., LiuX., Yang T.X., Zhang H.S. N-hydroxysuccinimidyl fluorescein-O-acetate as a fluorescent derivatizing reagent for catecholamines in liquid chromatography. // Anal. Biochem. 2000. V. 281. № 1. P. 15 20.

103. ZhuX.L., Shaw P.N., Barrett D.A. Catecholamines derivatized with 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole: characterization of chemical structure and fluorescence properties. // Anal. Chim. Acta. 2003. V. 478. № 2. P. 259 269.

104. Tsunoda M., Takezawa K., Masuda M., Imai K. Rat liver and kidney catechol-O-methyltransferase activity measured by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. // Biomed. Chromatogr. 2002. V. 16. № 8. P. 536 541.

105. Hirano Y., Tsunoda M., Funatsu Т., Imai K. Rapid assay for catechol-o-methyl-transferasc activity by high-performance liquid chromatography-fluorescence detection. // J. Chromatogr. B. 2005. V. 819. № 1. P. 41 46.

106. Tsunoda M., Imai K. An assay for determination of rat adrenal catechol-o-methyl-transferase activity: Comparison of spontaneously hypertensive rats and Wistar-Kyotorats. // Anal. Bioanal. Chem. 2004. V. 380. № 7 8. P. 887 - 890.

107. Masuda M., Tsunoda M., Imai K. High-performance liquid chromatography-fluorescent assay of catechol-O-methyltransferase activity in rat brain. // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 376. № 7. P. 1069 1073.

108. Wang H.Y., Нги Q.S., Xu LX, Jiang J.G., Sun Y. Fluorimetric determination of dopamine in pharmaceutical products and urine using cthylenediamine as the fluorigenic reagent. // Anal. Chim. Acta. 2003. V. 497. №1-2. P. 93 99.

109. Kundu S., Ghosh S.K., Mandal M., Pal A., Pal T. Fluorimetric determination of dopamine via its derivatization with 1,2-phenylenediamine. // J. Indian. Chem. Soc. 2004. V. 81. № 10. P. 868 873.

110. Tsunoda M., Imai K. Analytical applications of peroxyoxalate chemiluminescence. // Anal. Chim. Acta. 2005. V. 541. № 1 2. P. 13-23.

111. Knight A. W. A review of recent trends in analytical applications of clectrogenerated chemiluminescence. // Trends Anal. Chem. 1999. V. 18. № 1. P. 47 62.

112. Fahnrich K.A., Pravda M., Guilbault G.G. Recent applications of electrogenerated chemiluminescence in chemical analysis. // Talanta. 2001. V. 54. № 4. P. 531 559.

113. Higashidate S., Imai K. Determination of femtomole concentrations of catecholamines by high-performance liquid chromatography with peroxyoxalate chemiluminescence detection. // Analyst. 1992. V. 117. № 12. P. 1863 1868.

114. Takezawa K., Tsunoda M., Murayama K., Santa Т., Imai K. Automatic semi-microcolumn liquid chromatographic determination of catecholamines in rat plasma utilizing peroxyoxalate chemiluminescence reaction. // Analyst. 2000. V. 125. № 2. P. 293-296.

115. Tsunoda M., Takezawa K., Yanagisawa Т., Kato M, Imai K. Determination of catecholamines and their 3-O-methyl metabolites in mouse plasma. // Biomed.

116. Chromatogr. 2001. V. 15. № 1. P. 41 44.

117. Zheng X.W., Guo Z.H., Zhang Z.J. Flow-injection electrogenerated chemiluminescence determination of epinephrine using luminol. // Anal. Chim. Acta. 2001. V. 441. № l.P. 81-86.

118. Su Y.Y., Wang J.A., Chen G.N. Determination of epinephrine based on its enhancement for electrochemiluminescence of lucigenin. // Talanta. 2005. V. 65. № 2. P. 531 -536.

119. Zhu L.D., Li Y.X., Zhu G.Y. Flow injection determination of dopamine based on inhibited electrochemiluminescence of luminol. // Anal. Lett. 2002. V. 35. № 2. P. 2527-2537.

120. Li F., Pang Y.Q., Lin X.Q., Cui H. Determination of adrenaline by using inhibited Ru(bpy)3.2+ electrochemiluminescence. // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 47. № 2. P. 187- 194.

121. Li F., Pang Y.Q., Lin X.Q., Cui H. Determination of noradrenaline and dopamine in pharmaceutical injection samples by inhibition flow injection electrochemiluminescence of ruthenium complexes. // Talanta. 2003. V. 59. № 3. P. 627-636.

122. Kang J.Z., Yin X.B., Yang X.R., Wang E.K. Electrochemiluminescence quenching as an indirect method for detection of dopamine and epinephrine with capillary electrophoresis. // Electrophoresis. 2005. V. 26. № 9. P. 1732 1736.

123. Nalewajko E., Ramirez R.B., Kojlo A. Determination of dopamine by flow-injection analysis coupled with luminol-hexacyanoferrate(III) chemiluminescence detection. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. V. 36. № 1. P. 219-223.

124. Wang S.H., DuL.Y., Wang L.Y., Zhuang H.S. jV-Bromosuccinimide-fluorescein based sensitive flow-injection chemiluminescence determination of phenformin 11 Anal. Sci. 2004. V. 20. №2. P. 315-317.

125. Ни Y., Li X., Pang Z. Indirect chemiluminescence detection for capillary zone electrophoresis of monoamines and catechol using luminol K3Fe(CN)6. system. // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1091. № 1-2. P. 194- 198.

126. Sun Y.Y., Tang Y.H., Zheng X.H., Yao H, Xu Z. Determination of catecholamines byflow injection chemiluminescence method based on their restraining effects on the luminal-potassium chlorate system. // Anal. Lett. 2004. V. 37. № 12. P. 2445 2458.

127. Michalowski J., Halaburda P. Flow-injection chemiluminescence determination of epinephrine in pharmaceutical preparations using raw apple juice as enzyme source. // Talanta. 2001. Y. 55. № 6. P.l 165- 1171.

128. Li В., Zhang Z., Jin Y. Plant tissue-based chemiluminescence flow biosensor for determination of unbound dopamine in rabbit blood with on-line microdialysis sampling. // Biosens. Bioelectron. 2002. V. 17. № 6 7. P. 585 - 589.

129. WangH., FengX.G., Zhang M., Zhao II. Determination of dopamine in injections and urine by an enzyme-catalyzed fluorescence quenching method. // Anal. Sci. 2007. Y. 23. № 11. P. 1297- 1300.

130. Zhou G.J., Zhang G.F., Chen H.Y. Development of integrated chemiluminescence flow sensor for the determination of adrenaline and isoprenaline. // Anal. Chim. Acta. 2002. Y. 463. № 2. P. 257 263.

131. Du J.X., Shen L.H., Lu J.R. Flow injection chemiluminescence determination of epinephrine using epinephrine-imprinted polymer as recognition material. // Anal. Chim. Acta. 2003. Y. 489. № 2. P. 183 189.

132. Liu H., Zhang L., Zhou J., Hao Y., He P., Fang Y. Flow injection chemiluminescence determination of dobutamine hydrochloride injection using luminol-ferricyanide/ferrocyanide system. // Anal. Chim. Acta. 2005. Y. 541. № 1 2. P. 125- 129.

133. Yakabe Т., Yoshida H., Nohta H., Yamaguchi M. ITPLC determination of catecholamines based on precolumn derivatization with 6-aminomethyl-phthalhydrazide followed by chemiluminescence detection. // Anal. Sci. 2002. V. 18. № 12. P. 1375-1378.

134. Adcock J.L., Barnett N.W., Costin J.W., Francis P.S., Lewis S.W. Determination of selected neurotransmitter metabolites using monolithic column chromatography coupled with chemiluminescence detection. // Talanta. 2005. Y. 67. № 3. 585 589.

135. Su R.G., Lin J.M., Qu F., Chen Z.F., Gao Y.H., Yamada M. Capillary electrophoresis microchip coupled with on-line chemiluminescence detection. // Anal. Chim. Acta.2004. № 1. V. 508. P. 11 15.

136. Shannon L.M., Kay E., Lew J.Y. Peroxidase isozymes from horseradish roots. Isolation and physical properties. // J. Biol. Chem. 1966. V. 249. № 9. P. 2166 2172.

137. Сладкое А.З. Таблицы буферных растворов. // Заводск. Лаб. 1969. Т. 35. № 9. С. 1146- 1148.

138. Колътгофф И.М., Сендел Е.Б. Количественный анализ. М.: Госхимиздат. 1948. С. 312-316.

139. Золотое Ю.А. Химический аиализ без лаборатории: тест методы. // Вестник РАН. 1997. Т. 67. № 6. С. 508 513.

140. Амелин А.В., Колодкип И.С., Иринипа Ю.А. Тест-метод определения пероксида водорода с использованием индикаторных бумаг в атмосферных осадках и водах. // Журнал Апалит. Хим. 2000. Т. 55. № 4. С. 419 422.

141. Островский Ю.М., Золотое Ю.А., Давыдов А.В. Экспрессное тест-опрсделенис пероксида водорода реагептпымп индикаторными полосами. // Журнал Аналит. Хим. 1999. Т. 54. № 8. С. 860 868.

142. Евгенъев М.И. Тест-методы и экология. // Сорос. Образ. Журн. 1999. № 11. С. 29-34.

143. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир. 1989. Т. 1. С. 238-249.

144. Иммобилизованные ферменты (под ред. Березина И.В., Антонова В.К., Мартинека К.). М.: Изд во МГУ. 1976. Т. 1. С. 68 - 212.

145. Григорьева Д.Л., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Определение ртути(П) с использованием пероксидазы, ковалентно иммобилизованной на силикагелях. // Вест. Моск. Ун та. Сер. 2. Химия. 2003. Т. 44. № 3. С. 178 - 182.

146. Веселова И.А. Иммобилизованная пероксидаза и щелочная фосфатаза в тест-методах определения биологически активных веществ. Дисс. Канд. Хим. Наук. Москва, МГУ, 2001. 294 с.

147. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В. Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа. 1987. Т. 7. С. 27 35, 77 - 100, 119 - 134.

148. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена. // Биохимия. 1977. Т. 42. № 8. С. 1372 1379.

149. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Совместное окисление ферроцианида калия и о-дианизидина перекисью водорода, катализируемое пероксидазой из хрена. Субстрат-субстратная активация. // Биохимия. 1981. Т. 46. № 7. С. 1202- 1209.

150. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Никольская Е.Б., Долманова И.Ф. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использованием иммобилизованной пероксидазы. // Журн. аналит. химии. 1994. Т. 49. № 8. С. 862 867.

151. Шеховцова Т.Н., Белкова Н.В., Долманова И.Ф. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использование пероксидазы, иммобилизованной на бумаге. // Журн. аналит. химии. 1995. Т. 50. № 5. с. 538 542.

152. Мугинова С.В., Аковбян Н.А., Шеховцова Т.Н. Использование бумаги в качестве носителя для иммобилизации пероксидазы в тест-методе определения микроколичеств ртути (И). // Журн. аналит. химии. 1999. Т. 54. № 8. С. 862-867.

153. Диксон М., Уебб Э. Ферменты. М.: Изд- во Иностр. Лит. 1961. С. 140.

154. Клесов А.А., Березин И.В. Ферментативный катализ. М.: Высш. Школа. 1980. С. 120.

155. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир. 1990. С. 213.

156. Ellis W., Danford В. The kinetic of cyanide and fluoride binding by ferric horseradish peroxidase. // Biochem. 1968. V. 7. № 6. P. 2054 2062.

157. Савицкий А. П. Исследование структуры активного центра гемсодержащей пероксидазы спектрально-люминесцентным методом. М. 1979. Автореферат канд. хим. наук. 17 с.

158. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.1.4.1116 02 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества"

159. Zhang G., Li В., Fan J., Feng S. Determination of trace thiocyanate in body fluids by a kinetic fluorimetric method. // Talanta. 1997. V. 44. № 7. P. 1141 1147.

160. Bisaglia M., Mammi S., Bubacco L. Kinetic and structural analysis of the early oxidation products of dopamine. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 21. P. 15597 15605.i

161. Guilbault G.G., Brignac P., Zimmer M. Homovanilic acid as a fluorimetric substrate for oxidative enzymes. //Anal. Chem. 1968. V. 40. № 1. P. 190 196.

162. Wang H.Y., Sun Y., Bo T. Study on fluorescence property of dopamine and

163. T' determination of dopamine by fluorimetry. // Talanta. 2002. V. 57. № 5. P. 899 907.

164. Gebicka L., Gebicki J. Dimethyl sulfoxide rather then superoxide is the reactive species in horseradish peroxidase K02/DMS0 system. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1995. V. 37. P. 1021 - 1026.

165. Karon B.S., Daly T.M., Scott G. Mechanisms of dopamine and dobutaminc interference in biochemical tests that use peroxide and peroxidase to generate chromophore. //Clin. Chem. 1998. V. 44. № 1. P. 155 160.

166. Moreno M.G., Conesa M.M., Lopez J.N.R. Varon R. Oxidation of 4-tert-butylcatechol and dopamine by hydrogen peroxide catalysed by horseradish peroxidase. // Biol. Chem. 1999. V. 380. № 6. P. 689 694.

167. Алпеева И. С. Анионные пероксидазы и их применение в биоанализе. М. 2007.I

168. Автореферат канд. хим. наук. 28 с.у 188. NohtaH., Mitsui A., Ohkura Y. Spectrofluorimetric determination of catecholamines with1,2-diphenylethylenediamine. // Anal. Chim. Acta. 1984. V. № 2. 165. P. 171 176.

169. Yamaguchi M., Ishida J., Yoshimura M. Simultaneous determination of urinary catecholamines and 5-hydroxyindoleamines by high-performance liquidchromatography with fluorescence detection. // Analyst. 1998. V. 123. № 2. 1 P. 307-311.

170. Pennington J.P., Schoneich C., Stobaugh J.F. Selective fluorogenic derivatization with isotopic coding of catechols and 2-amino phenols with benzylamine: A chemical

171. Y basis for the relative determination of 3-hydroxytyrosine and 3-nitro-tyrosinepeptides. // Chromatographia. 2007. V. 66. № 9 10. P. 649 - 659.

172. Huang C., Chen H., Qiaohong H Determination of adrenaline in pharmaceutical preparations by flow injection photochemical spectrofluorimetry. // Canadian J. Anal. Sci. Spectr. 2004. V. 49. № 5. P. 296 301.

173. Давлетшин А.И., Егоров В.В., Зубов В.П. Влияние поверхностно-активных 1 веществ на активность пероксидазы. Влияние анионных ПАВ. //

174. Биоорганическая химия. 1998. Т. 24. № 6. С. 426 429.

175. Давлетшин А.И., Егоров В.В., Зубов В.П. Влияние поверхностно-активных ■j' веществ на активность пероксидазы. Влияние катионных ПАВ. //I

176. Биоорганическая химия. 1998. Т. 24. № 6. С. 430 432.

177. Давлетшин А.И., Егоров В.В., Зубов В.П. Влияние поверхностно-активных веществ на активность пероксидазы. Влияние неионных ПАВ. // Биоорганическая химия. 2000. Т. 26. № 8. С. 605 608.

178. Давлетшин А.И., Силъвестрова И.Г., Егоров В.В., Зубов В.П. Влияние ПАВ различной природы на активность пероксидазы и трипсина. // Вестн. Моск. Ун -та. Сер. 2. Химия. 1998. Т. 39. № 4. С. 272 275.

179. Omenetto N. (ed.). Analytical Laser Spectroscopy. Wiley, New York, 1979. : 197. Letokhov V.S. (ed.). Laser Analytical Spectroscopy, Nauka, Moskow, 1986.

180. Hieftje G.M., Travis J.C., Lytle F.E. Lasers in Chemical Analysis. Humana Press, Clifton, NJ, 1981.

181. RabekJ.F. Experimental Methods in Photochemistry and Photophysics, Part 2, Wiley, New York, 1982.

182. Garcia-Moreno E., Ruiz M.A., Barbas C., Pingarron J.M. Determination of organic peroxides in reversed micelles with a poly-N-methylpyrrole horseradish peroxidaseamperometric biosensor. // Anal. Chim. Acta. 2001. V. 448. № 1. P. 9 17.

183. Wang J., Lin Y., Chen L. Organic-phase biosensors for monitoring phenol and hydrogen peroxide in pharmaceutical antibacterial products. // The Analyst. 1993. V. 118. №3. P. 277-280.

184. Wang J., Freiha В., Naswr N., Romero E.G., Wollenberger U., Ozsoz M. Amperometric biosensing of organic peroxides with peroxidase-modified electrodes. //Anal. Chim. Acta. 1991. V. 254. №1-2. P. 81 88.

185. Mailer R., Beckingham C. Testing olive oil quality: chemical and sensory methods. // Premefact. 2006. V. 231. № 1. P. 1 5.

186. Seller R.M. Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide using potassium titanium(IV) oxalate. // The Analyst. 1980. V. 105. № 10. P. 950 954.

187. European official method. // Official Gazette of European Community L 248. 1991. 15th September.

188. Segawa Т., Ishikawa H., Kamidate Т., Watanabe H. Micelle-enhanced fluorescein chemiluminescence catalyzed by horseradish peroxidase for the determination of hydrogen peroxide. // Anal. Sci. 1994. V. 10. № 4. P. 589 593.

189. Battino R., Rettich T.,Tominaga T. The solubility of oxygene and ozone in liquids. // J. Phys. Chem. Data. 1983. V. 12. № 2. P. 163 178.

190. Magde D., Wong R., Seybold P. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetime of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: Improved absolute standards for quantum yields. // Photochem Photobiol. 2002. V. 75. № 4. P. 327 436.

191. Campanella L., Favero G., Pastorino M., Tamassetti M. Monitoring the rancidification process in olive oils using a biosensor operation in organic solvents. // Biosens. Bioelectron. 1999. V. 14. № 2. P. 179 186.

192. Campanella L., Giancola D., Gregori E., Tomassetti M. Determination ofhydroperoxides in nonaqueous solvents or mixedsolvents, using a biosensor with two antagonist enzymesoperating in parallel. // Sens. Actuators B. 2003. V. 95. №1—3. P. 321 -327.