Синтез и изучение свойств производных гидрофильных полимеров с ферментами класса оксидоредуктаз тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА им. А. В. ТОПЧИЕВА

На правах рукописи

ЗЕФИРОВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПРОИЗВОДНЫХ ГИДРОФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ С ФЕРМЕНТАМИ КЛАССА 0КСИД0РЕДУКТАЗ

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва, 1991

Работа выполнена, в. .Институте, ^ефтех^ш^чер^ого, синтеза -им'т Д. р. Трпчиев^ АН СССР." , •'

научные руководители .;,. Доктор химических наук

Л. И. Валуев Кандидат химических наук В. А. Постников

научный консультант : Академик Н. А. Платэ

официальные оппоненты : Член-корреспондент АН СССР

Е. Ф. Панарин До..тор химических наук М. И. Штильман

ведущее предприятие : Химический факультет

Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова

Зашита состоится " СС/С'/СИ/ 1991 г. в _/0 часов

на заседании Специализированного Совета К002. 78. 01. по присуждению ученой степени кандидата химических наук в ордена Трудового Красного Знамени Институте нефтехимического синтеза имени А. В. Топчиева АН СССР по адресу : 117912, ГСП-1, Москва В-71, Ленинский проспект, д. 29, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "" Ы.СО.Л- 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат химических наук Э. А. Волнина

Актуальность проблемы. Одной из важнейших задач современной химии медико-биологических полимеров является создание систем, селективно воздействующих на одно или достаточно узкий круг соединений сложных биологических системах. Решение этой проблемы открывает перспективы для создания полимеров, моделирующих функции клеток живых организмов. Одним из немногих путей решения указанной проблеш является использование аффинной хроматографии. Однако, этот метод обеспечивает только- одну операцию - обратимое и'специфическое взаимодействие белков, полипептидов и других биологически активных соединений с определенным лигандом, иммобилизованным на полимерном носителе.

Принципиальным вопросом является расширение функциональных операций с сорбированным веществом, то есть осуществление на полимерном носителе последовательно нескольких реакций. Решение этой задачи видится, например, в совместной иммобилизации нескольких физиологически-активных веществ (ФАВ). В этом случае необходимо осуществить благоприятное расположение ФАВ в объеме полимерного I носителя, обеспечивающего возможность последовательного протекания ряда химических реакций. Это может быть достигнуто путем формирования полимерной матрицы одновременно с иммобилизацией предварительно подготовленных ассоциатов физиологически активных веществ, и наиболее перспективным представляется использование для этих целей реакции сополимеризаиии ненасыщенных производных ФАВ с гидрофильным мономером и сшивающим агентом.

В связи с этик целью настоящей работы является изучение возможности создания полимерных систем на основе нескольких ФАВ, в которых один из иммобилизованных компонентов сорбирует вещество из сложной смеси, а другой Сили другие) трансформируют это вещество до требуекых продуктоз Сприменительно к гекосорбции - до нетоксичных вецеств). Эти продукты должны обладать меньшим сродством к иммобилизованному лиганду и поэтому могут удаляться с зорбента, освобождая лиганд для следующих молекул сорбируемого вещества. Такое одновременное введение специфического лиганда [как низкомолекулярной, так и полимерной природы) и неспоцифлчес-<ого фермента позволило бы существенно повысить селективность

действия последнего и осуществить, применительно к гемосорбции, превращение токслна в нетоксичное соединение, т.е. смоделировать дэтоксикационную функцию гепатоцита.

3 качестве модельного токсина в работе был использован билирубин, являющийся продуктом метаболизма гемоглобина. В качестве ФАВ выбраны: сывороточный альбумин человека, образующий прочные комплексы с билирубином, и ферменты класса оксидоредуктаз Спероксидаза хрена, алкогольоксидаза, глюкозоксидаза), позволяющие окислять широкий спектр органических соединений.

Научная новизна. Впервые обнаружена способность пероксндазы хрена катализировать реакцию окисления связанного в комплекс с альбумином билирубина кислородом воздуха и перекисью водорода. Установлено, что кинетика окисления билирубина кислородом и перекисью водорода подчиняется уравнению Михаэлиса - Ментен, причем при совпадении К», V»»* перекисного окисления приблизительно е 1С раз больше кислородного.

Методами флуоресцентной к ЭПР спектроскопии показано, что механизм обеих реакций включает в себя образование промежуточного комплекса ОгСНЮг) - пероксидаза - альбумин - билирубин.

Показано, что при неглубоких степенях превращения и соблюдении рН-контроля, ацилирование алкогольоксидазы и пероксидазы хлоран-гидридом акриловой кислоты не влияет на каталитическую ахтивность ферментов в окислении комплекса альбумин - билирубин.

Впервые в результате радикальной сополимеризацик ассоциато) макромономеров ФАВ с акриламидом в присутствии сшивателя получен! сильнонабухающие системы с соиммобилизсванными альбумином Сли' гакд), пероксидазой и алкогольоксидазой Скаталитическая система) обладающие высокой активностью в. окислении комплехсносвязанноп билирубина из растворов. Показано, что в отсутствии альбумина а такхе при иммобилизации всех немодифицированных ФАБ на активиро ванные полимерные матрицы активность полимерных производных ФА существенно снижается.

Результаты биохимического испытания полученных многокомпонент ных систем на плазме крови с повышенным содержанием билирубин свидетельствуют о том, что содержание билирубина являете единственным параметром плазмы, изменяющимся в процессе экспери мента

Практическая значимость работы состоит в том, что результат

выполненного исследования открывают возможность воздействия на определенный компонент биологической смеси при подборе соответствующей системы лиганд - катализатор - полимерная матрица. Синтезированные в данной работе сшитые сополимеры на основе альбумина и ферментов класса оксидоредуктаз могут представлять интерес как гемосорбенти для удаления билируоина.

Автор защищает :

- обнаруженное явление катализа пероксидазой хрена окисления билирубина, связанного в комплекс с альбумином, кислородом воздуха или перекисью водорода, генерируемой по реакции :

С2НдОН + 02--алкогольоксидаза-> ^^ + ^ .

- выеод о механизме указанных реакций, заключающийся в образовании сложных промежуточных комплексов окислителя с пероксидазой и альбумином;

- результат сравнительного изучения активностей нативных, аци-лированных хлорангидридом акриловой кислоты и иммобилизованных в полиакриламидный гидрогель пероксидазы хрена и алкогольоксидазы в окислении комплекса альбумин - билирубин:

- подход к созданию гетерогенных систем на основе сополимери-зованных с акриламидом макромономеров алкогольоксидазы, пероксидазы хрена и сывороточного альбумина для избирательного окисления билирубина;

- результаты биохимических испытаний полученных гемосорбентов.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на

VI Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Каунас, 19833, на VIII Всесоюзном научном симпозиум0 "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Киев, 1989), на II Всесоюзной конференции "Катализ и каталитические процессы химфармпроизводств" (Ташкент, 1989), на конференции молодых ученых ИНХС им. А В.Топчиева АН СССР (Москва, 1S88).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части,- результатов исследования и их обсуждения, еыеодов и списка литературы.

Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирован ?. 54 рисунками и 19 таблицами. Список цитируемой литературы включает 155 наименований.

Обзор литературы состоит из четырех глав. В первых трех проа-

нализированы известные литературные данные о многокомпонентных системах физиологически активных веществ С например, комбинаций фермент - кофактор или фермент - микроорганизм и др.), иммобилизованных совместно или раздельно на полимерную матрицу. Четвертая глава посвящена преимущественно описанию получения многокомпонентных систем методом сополимеризации макромономеров ФАВ с ненасыщенными мономерами с анализом возможностей и преимуществ этого метода.

В экспериментальной части приведена характеристика объектов исследования, описаны методы синтеза и выделения макромономеров пероксидазы, алкогольоксидазы и альбумина и их полимерных производных, представлены методики физико-химических и биохимических исследований, уравнения для определения констант, охарактеризованы вещества и реагенты, применявшиеся в работе.

В последующих главах изложены и обсуждены экспериментальные результаты.

Система лиганд - катализирующий трансформацию ферментативный микрореактор.

Для создания системы с соиммобилизованным лигандом и группой ФАВ, катализирующих трансформацию субстрата - билирубина, в качестве лиганда был использован сывороточный альбумин, образующий с билирубином прочные комплексы с константой диссоциации С7-9)х10~9 М.

На Рис.1 приведены результаты изучения спонтанного неиниций-руемого окисления билирубина кислородом. Видно, что кислород является достаточно эффективным окислителем свободного билирубина. Добавление к раствору альбумина, то есть связывание билирубина в комплекс, приводит к практически полному ингибированию его окисления. Последующее добавление фермента класса оксидоредуктаз - пероксидазы хрена в полученную систему ССА-БР) вновь приводит к окислению билирубина.

При замене растворенного кислорода на аргон или проведении реакции в вакууме в присутствии пероксидазы, окисления билирубина не происходит. Полное ингибированите процесса достигается также введением в систему обычных ингибиторов пероксидазы - анионов СИ",

При малых степенях конверсии (5-1050 наблюдается хорошая

корреляция между скоростями окисления оилируоина в кимплелие и альбумином, образования биливердина и расходования растворенного кислорода.

0.3

о.о V

[БР] * Ю, М

СА

CN.S

.2-

пх

t,MHH

ю эо

60

Рис. 1. Зависимость концентрации билирубина от времени окисления растворенным кислородом и влияние на этот процесс альбумина и пероксидазы хрена.

Введение в систему БР-СА-ПХ каталазы или супероксиддисмутазы не влияет на скорость процесса. Это дает основание полагать, что окисление билирубина происходит непосредственно в его комплексе с альбумином под действием кислорода,а не перекиси водорода.

Следовательно, в данном случае пероксидаза катализирует окисление билирубина в его комплексе с альбумином кислородом, то есть процесс можно представить в виде:

Альбумин - Билирубин + 1/2 02 пероксидара хрдна, Биливердин + др.

Зависимость начальной скорости окисления билирубина в растворе его комплекса с альбумином от исходной концентрации билирубина CIO"8 - 1СГ4 М) при концентрации пероксидазы 3.1 х 10 М подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен с Km = 14.4 + 0.9 jjM, Vmax = 0.12 + 0.03 мМ/мин. Следует отметить, что окисляется именно ком-плекскосвязанный билирубин, так как в случае окисления лишь равновесного билирубина, теоретически рассчитанная максимальная скорость реакции СVmax) должна была бы быть на два порядка меньше.

Перекисное окисление комплекса альбумин - билирубин, катализируемое системой ферментов.

Естественно, что для увеличения скорости процесса целесооб-

разно попользовать в качестве окислителя перекись водорода, генерируя ее 1.п эНи во избежание разложения каталазой в биологических жидкостях, например, по схеме:

алкогольоксидаза

С2Нз°Н + °2 -пёлоксйдаза °2Н4° + Н2°2 (2)

Альбумин - Билирубин + Н202 хрена > ПР°ДУКТЫ + вв

Скорость окисления билирубина перекисью водорода практически не зависит от концентрации алкогольоксидазы. начиная с [АО] = 10"® М, в то время как от концентрации пероксидазы наблюдается линейная зависимость с насыщением, причем скорость окисления возрастает приблизительно в 3 раза при увеличении концентрации на порядок.

Оценка содержания этанола, необходимого для удаления билирубина при его патологических концентрациях дает величину приблизительно Ю-2 М С менее 1°/ооЗ. Эта величина соответствует области насыщения на кривой зависимости скорости процесса С2) от концентрации спирта.

Результаты изучения ингибирования окисления СА-5Р каталазой в системе С2) свидетельствуют о том, что медленной стадией процесса является образование перекиси водорода, которая затем быстро реагирует с системой ПХ, СА-БР.

Суммарная кинетическая кривая процесса перекисного окисления комплекса альбумин - билирубин при концентрациях АО, пероксидазы хрена и этанола, соответствующих областям насыщения, описывается уравнением Михаэлиса - Мэнтен с Кт = 16. 2^0. 9 Ж; Углах = 3.2+0.1 (М/шш.

Совпадение констант Михаэлиса для процессов кислородного и перекисного окисления указывает на одинаковый механизм процессов С13 и С 2). Однако при перекисном окислении скорость процесса более чем на порядок выше кислородного.

Белок - белковые взаимодействия сывороточного альбумина и пероксидазы хрена.

При исследовании механизма реакций С1) и С 2) было сделано предположение, что необходимым актом реакции окисления является взаимодействие фермента с белкоЕЫМ компонентом комплекса СА-БР. Возможность такого взаимодействия была изучена нами методом флуо-

ресцентной спектроскопии с использованием альбумина, меченного ро-даминизотиоцианатом (Р-СА) и пероксидазы, меченной флуоресцеинизо-тиоцианатом (Ф-ПХ) С Рис. 2).

Рис. 2. Зависимость интенсивности флуоресценции раствора от концентрации о'елка : 1. Ф-ПХ, 2. Ф-ПХ + Р-СА.

При концентрации Ф-ПХ менее 0.15 мг/мл интенсивность флуоресценции раствора смеси белков близка к интенсивности флуоресценции раствора Ф-ПХ С или Р--СА, соответственно). При дальнейшем увеличении содержания белков интенсивность флуоресценции Ф-ПХ в смеси уменьшается СР-СА соответственно увеличивается) в сравнении с индивидуальным раствором фермента за счет передачи части энергии от донора (флуоресцеинизотиоцианат) на акцептор (родаминизотиоциа-нат). Это однозначно указывает на образование ассоциатов альбумина и пероксидазы, в которых расстояние между метками значительно меньше среднего расстояния, рассчитанного длл равномерного распределения белковых глобул в растворе.

Для изучения природы промежуточных комплексов, образующихся при окислении билирубина нами были изучены спектры ЭПР различных комбинаций ФАЗ, участвующих в реакции С1). В ЭПР-спектрах модельных систем ПХ-БР, ПХ-СА не наблюдали никаких радикалов. В ЭПР-спе-ктре системы ПХ-СА-БР наблюдается два сигнала Сд = 2.0435 и д = 1.9797) низкоспинового железа CHI) и сигнал Сд = 6.103) высокоспинового железа (III) (железо входит в состав активного центра пероксидазы). После насыщения этого раствора кислородом интенсивность сигналов возрастает приблизительно в два раза, возможно, благодаря образованию супероксидного комплекса (ПХ..Fe(III).. Oz") Тот жэ самый эффект достигается добавлением в систему ПХ-СА-БР

перекиси водорода, но в этом случае сигнал высокоспинового железа СIII) отсутствует вследствие понижения симметрии комплекса.

Различие в спектрах ЭПР системы ПХ-СА-БР и модельных, а также рост интенсивности сигнала после насыщения раствора кислородом находятся в хорошем соответствии с результатами кинетических экспериментов. Так, при замене воздушной атмосферы на кислородную, скорость процесса окисления комплекса альбумина с билирубином возрастает в 2 раза.

На основании полученных результатов можно заключить, что механизм реакций С1) и С2), по всей вероятности, включает в себя образование сложного комплекса ОгСНгОг)-ПХ-СА-БР, в котором и происходит окисление билирубина вследствие близкого расположения окислителя и катализатора.

Свойства акрилоильных производных СА, ПХ и АО.

Для получения гетерогенных каталитических систем был выбран метод сополимеризации ненасыщенных производных ФАВ с водорастворимыми мономерами, позволяющий сохранить промежуточные ассоциаты и получить полимерные производные с заданной структурой.

Макромономеры всех ФАВ получали, ацилируя белковые молекулы хлорангидридом акриловой кислоты в мягких условиях СО0, рН 8.0). Показано, что модифицированный таким образом альбумин не теряет способности к образованию комплексов с билирубином. Ацилирование аминогупп пероксидазы, не входящих в ее активный центр, не влияет на каталитическую активность фермента при перекисном и кислородном окислении комплекса СА-БР.

Модификация алкогольоксидазы хлорангидридом акриловой кислоты также не приводит к потере её каталитической активности, если во время реакции рН поддерживается выше 7.0.

Синтез и свойства иммобилизованных в полиакрилакидном гидрогеле

АО, ПХ и СА.

Иммобилизацию макромоноыеров осуществляли их сополимериз ацией с акриламидом в присутствии сшивающего агента - Н,Н'-метиленбис-акриламида. Полимеризацию инициировали окислительно - восстанозн-тельной системой: сульфит натрия - персульфат амзюния.

Степень вхождения альбумина в полиакриламидной гидрогель СГ1ААГГ) составляет 80-90?i. Алкогольоксидаза такге практически полностью

- 9 - '

С93-95%) связывается с гидрогелем. Активность иммобилизованной АО составляет более 90% от активности нативного фэрмента.

Максимальное количество пероксидазы, входящей в гидрогель, составляет только около 10'/. от ее исходного количества в полимери-эанионной снеси. В результате иммобилизации активность фермента уменьшается и составляет около 50% от активности нативной ПХ.

При исследовании окисления комплекса СА-БР было обнаружено, что водорастворимый сополимер акрила!,ида и макромономера ПХ, содержащего в среднем одну двойную связь на молекулу, и нативный ферменты имеют одинаковую активность. Это означает, что сама по себе иммобилизация пероксидазы практически не влияет на скорость реакции С 2). Существенное падение активности ПХ в гидрогеле может быть объяснимо недоступностью значительной части молекул ПХ в ПААГГ для субстрата или белок - белковыми взаимодействиями ПХ-ПХ с потерей функциональной активности части молекул фермента, доступных для субстрата.

Степень набухания гидрогелей достаточно велика и составляет 10-15 мг воды на мг ненабухшего геля. На кривых зависимости активности иммобилизованных ферментов от их концентрации, количества, соответствующие точкам перехода к областям насыщения, составляют: [СА] = 1.4-0.4 х 10~3 М/мл геля; [АО] = 1.7 х 10"5 М/мл геля; [ПХ] = 1.4 х 10~3 М/мл геля.

Используя эти соотношения, были получены два вида систем : 1) смесь трех вышеуказанных гидрогелей (каждое ФАВ сополимеризо-вали по-отдельностиЗ; 2) гидрогель с совместно иммобилизованными ФАВ. В последнем случае сохраняются все закономерности по общему вхождению ФАВ в гидрогель, а также степень набухания, которая составляет 15 мг воды на мг геля. Активности обеих каталитических систем в окислении комплекса альбумин-билирубин представлены в Таблице 1.

Не Таблицы 1 видно, что активность гидрогелей с совместно иммобилизованными ФАВ в три раза выше активности смеси гидрогелей. Причина этого заключается, по-видимому, в том, что в смеси гидрогелей иммобилизованные ФАВ расположены недостаточно близко друг к другу, что и препятствует успешному протеканию реакции ферментативного окисления комплекса СА-БР. В гидрогеле, полученном сополиме-уизацией предварительно сформированных в растворе ассоциа?ов мак-ромономероз ФАВ с акриламидом и сшивающим агентом, сохраняется

- 10 -Таблица 1.

Составы гидрогелей с иммобилизованными альбумином, пероксидазой алкогольоксидазой и их активность в окислении комплекса СА-БР. [ Акриламид ] = 4.2 х 10"4 М; ШагБОз] = 2.5 х Ю-5 М;

[СШОгЯЮв] = 2.5 х 10 ° М;[СА - БР] =1 х

10~4 М

компо- концентрация концентрация % вошед- % окис-

ненты в полимери- в геле шего от ленного

"5Е°- зационной . хЮ'М/мл исходного СА-БР

геля смеси х 10° —за 1 час М/мл геля

система

С+1)

С+З)

смесь гидро- СА 400 320.0 80

гелей ПХ 140 11.8 8.4 22

АО 1. 7 1.63 55.8

гидрогель с совместно иммобилизованными ФАВ СА ПХ АО 400 140 1. 7 312 11.4 1.65 78 8.3 97.1 65

благоприятное расположение макромолекул СА, ПХ и АО, что и обеспечивает высокую эффективность окисления билирубина этой системой. Определяющая роль предварительной ассоциации молекул ФАВ подтверждается результатами сравнительного изучения систем, полученных традиционным методом взаимодействия предварительно активированного полимера с ФАВ.

В работе была, исследована иммобилизация вышеуказанной системы ФАВ на полиакрилонитрил С ПАН) и альдегидсодерхащий носитель на основе поливинилового спирта и перфтордекалина СПВАФ). Иммобилизацию ФАВ на ПАН проводили с использованием водорастворимого карбо-диимида в качестве сшивающего бифункционального агента. Показано, что активности иммобилизованных СА и АО на таком сорбенте практически полностью сохраняются, а пероксидаза сохраняет 50у. своей активности аналогично ситуации с сополимерным гидрогелем. Однако эффективность полученной системы очень мала независимо от концентрации карбодиимида, альбумина и ферментов.

Аналогичные результаты были получены при изучении ферментов, иммобилизованных на ПВАФ с содержанием 0.7 мМ альдегидных групп на поверхности 1 ил сорбента. Полученные системы также имеют малую

активность в окислении комплексносзязанного билирубина, несмотря на сохранение актизности иммобилизованных ферментов. Отметим, что в обоих случаях при иммобилизации затрагивались только свободные аминогруппы ФАВ, как и при получении гидрогелей.

Данные этих экспериментов дают основание полагать, что именно метод сополимеризации, в котором стадия образования полимерной матрицы происходит одновременно с иммобилизацией ФАВ, позволяет сохранить ассоциаты и, таким образом, обеспечить значительную эффективность полученного гидрогеля в окислении комплексносвязанного билирубина.

Эффективность гидрогеля с совместно иммобилизованньпя! ФАВ практически не зависит от концентрации сывороточного альбумина Св пределах С1.4-0.43 х 10 М/мл геля) и алкогольоксидазы C1.S - 3) х 10~® М/мл геля), но несколько повышается с увеличением количества пероксидазы в гело вплоть до концентрации ПХ равной приблизительно 12.0 х 10~5 М/мл геля С Таблица 2).

Таблица 2. Эффективность биореактора с совместно иммобилизованными АО, ПХ и СА в окислении комплекса альбумин-билирубин [САЗисх.= 4.00 х 10~~ М/мл геля, С АОЗисх. = 1.7 х 10"6М/мл геля

Концентрация пероксидазы Концентрация перо- Эффективность хрена в полимеризаци- ксидазы в гидроге- з окислении онном растворе, х 10 ле, х 10 М'мл геля СА-БР, % С+3)

50 2.2 13

100 5.4 28

120 И. С 60

140 11.9 63

160 12.0 65

В Таблице 3 приведены результаты изучения кинетики окисления СА-БР гидрогелей с совместно иммобилизованными ФАВ.

Как видно из этой таблицы, за два часа происходит практически полная конверсия билирубина. Кинетика окисления СА-БР гидрогелем с соиммобили-с"- лны' ?ДВ подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен с Кш - 16.0 ккМ, \feax = 0.03 мхМ/шга.

Таблица 3. Зависимость окисления СА-БР в гидрогеле от времени реакции Сконцентрации те же, что и в Таблице 1).

-,-1-

Время окисления, мин. Конверсия БР, %

'

30 35

60 65

90 82

120 95

Сравнение максимальных скоростей реакции показывает, что окисление СА-БР, катализируемое иммобилизованными ферментами протекает в три раза медленнее, чем растворимыми. Возможной причиной такого замедления является потеря значительной доли активности перо-ксидаэой при иммобилизации.

С целью выяснения роли альбумина были исследованы гидрогеля, содержаще совместно и раздельно иммобилизованные алкогольоксидаз| и пероксидазу Сем. Таблицу 4).

Таблица 4 . Составы гидрогелей и их активность в окислении комплекса СА-БР

вид компо-гидрогеля ненты гидрогеля

Смесь гидро- АО 1.7 1.63 95.8

гелей 21.5

ПХ 140 11.8 8.4

Гидрогель АО с совместно т иммобилизованными ферментами 1.7 140 1.66 12 97.6 8.3 23.0

Гидрогель с АО совместно гту иммобилизованными ФАВ СА 1.7 140 400 1.65 11.4 312 97.1 8.3 78 65

концентрация концентрация % вошед- % окис-

в полимери- ФАВ в геле шего от ленного

зационной х 10 М/мл исходного СА-БР за

смеси х 106 геля _ 1 час-

М/мл геля (+1) С+3)

Как видно из таблицы, активность двух первых систем приблизительно одинакова и мала по сравнению с третьей. Это подтверждает идею о необходимости альбумина, являющегося "вспомогательным" ФАВ. При этом происходит изменение функции СА: в растворе, в случае самопроизвольного окисления БР кислородом или перекисью водорода при катализе пероксидазой, он ингибирует окисление БР. Здесь же, концентрируя БР вблизи пероксидазы, СА ускоряет окисление этого вещества. Еще одним подтверждением этого положения являются результаты, полученные при изучении взаимодействия гидрогеля, содержащего соиммобилизованньте АО, ПХ и СА, с растворами СА-БР различной концентрации альбумина СТаблица 5). Как видно из таблицы, в

Таблица S. Активность совместно иммобилизованных АО, ПХ, СА в ПААГГ в окислении комплекса СА-БР с различной концентрацией альбумина С[БР] = 1 х 10"4 М, [EL0H3 = 2 х 10~2 М ).

Концентрация [СА.], : Эффективность окисления

х Ю-4 М : СА - БР, %

1,5 65

7,5 38

22,5 22

этом случае по мере увеличения концентрации СА эффективность гидрогеля снижается и приближается к эффективности гидрогеля, не содержащего альбумина С с соиммобилизованныни АО и ПХ). Причина этого заключается в том, что при увеличении концентрации альбумина доля молекул билирубина, сорбирующегося на ковалентно связанном с полимерной матрицей альбумине Св сформированном ассоциате с ПХ) уменьшается и, следовательно, уменьшается количество окисленных молекул.

Таким образом, механизм действия системы с совместно иммобилизованными ФАВ состоит в следующем. Альбумин сорбирует из раствора билирубин, концентрируя его в непосредственной близости от молекулы пероксидазы. Алкогольоксидаза генерирует перекись водорода, а пероксидаза катализирует окисление билирубина образующейся перекисью. Продуктом окисления является биливердин, который не образу-

ет устойчивых комплексов с альбумином н вымывается в раствор, освобождая место связывания на молекуле СА для новой молекулы БР.

Предлагаемый нами подход, состоящий в одновременной иммобилизации на полимерной матрице лиганда и ферментативной системы, катализирующей окисление сорбированного на лиганде токсина, на примере удаления билирубина, можно изобразить схемой, приведенной на

в полиакриламидном геле ФАВ для детоксификации билирубина СА - сывороточный альбумин; ПХ - пероксидаза хрена; АО - алкогольоксидаза; ЕЮН - этиловый спирт;

Биохимические испытания системы А0-ПХ-С4, включенной в ПААГГ.

С целью изучения избирательности действия синтезированных гидрогелей были проведены их испытания на сложных биологических системах. Результаты определения биохимических показателей плазмы с повышенным содержанием билирубина до и после сорбции представлены в Таблице 6. Ка нее следует, что единственным существенно изменяющимся параметром в составе плазмы является концентрация билирубина. Таким образом, предложенный подход дает возможность, используя при иммобилизации относительно неспецифические ФАВ, получить достаточно селективную систему, которая позволяет детоксифицировать биологические жидкости от билирубина.

Отметим,что полученный реактор, в отличие, например, от аф-

Таблица 6 . Биохимические показатели плазмы крови до и после сорбции.

Параметры плазмы

Содержание до опыта

+5%

"Содержание после контакта с сорбентом

бет епипта • с Д°°авкой спирта спирта . мкл/мл раствора

Общий белок,т'л 5.1 Общий билирубин, 7.65 иг'/,

а о

Холестерин, мг% Триглицериды, 86 ыгУ.

Лактатдегидро-геназа, ед.акт. 633

Щелочная фосфа-таза, ед.акт. 118

Аспарагинтранс-фераза, мгИ 8

Аланинтрансфе- 25 раза, мг'4

4.9

2.65

76

633

120

7 23

4.8

1.75 73

85

640

118

9 25

финного сорбента, может быть использован неоднократно без существенного изменения активности иммобилизованных ФАВ.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что билирубин, будучи комплексносвязанным с альбумином, окисляется кислородом воздуха в присутствии фермента класса оксидаз - пероксидазы хрена.

2. Предложен и экспериментально изучен подход к окислению билирубина под действием двухкомпокэнтной каталитической системы . пероксидаза - глюкозсксидаза и пероксидаза - алксгояьоксидаэа, и показано, что кинетика изученных реакций описывается уравнением Михаэлиса - Ментэн.

3. Методами флуоресцентной и ЭПР-спектроскопии показано, что механизм реакции окисления комплексносвязанного билирубина включает образование комплекса [ БР-СА... ПХ... 0г].

4. Разработан экспериментальный подход к синтезу полимерных производных алкогольоксидазы, пероксидазы хрена и сывороточного альбумина методом ссвместной одновременной полимеризации ассо-циатов ненасыщенных производных этих соединений с акриламидом в присутствии сшивающего агента. Показано, что полученный гидро-

гель способен избирательно сорбировать билирубин и катализировать его превращение в нетоксичный и не взаимодействующий с альбумином продукт. Тем самым сделан существенный шаг в создании многоцелевого сорбента - катализатора.

5. Проведены биохимические испытания полученного гидрогеля в реакторе проточного типа на плазме кроЕИ и показано, что его эффективность в окислении билирубина в модельных условиях превышает эффективность обычно используемых аффинных сорбентов.

6. На основании полученных результатов предложена оригинальная модель полимерного гидрогелевого аффинного сорбента "бесконечной" емкости, сочетающего функции адсорбции и катализа химической реакции сорбируемого вещества.

Основные результаты работы изложены в следуквдих публикациях :

1. В.А.Постников, О.Н.Зефирова, Г.А.Сытов, Л.И.Вачуев, Н. А. Платэ "Применение пероксидазы хрена для окисления билирубина из его комплексов с альбумином". - Тезисы докладов VI Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии - Каунас. - 1988. - С. 59.

2. В.А.Постников, О.Н.Зефирова, Г.А.Сытов, Л. И. Балуев, Н. А. Платэ "Оксидазная активность пероксидазы хрена в окислении комплекса альбумин - билирубин". - Тезисы докладов II Всесоюзной конференции "Катализ и каталитические процессы химфармпроизвсдств". - Москва. - 1989. - Ч. I. - С. 222.

3. В. А. Постников, О.Н.Зефирова, Г.А.Сытов, Л.И.Валуев, Н. А. Платэ

• "Биоспецифический сорбент для окисления билирубина". - Тезисы докладов VIII Всесоюзного научного симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения". - Киев. - 1989. - С. 51.

4. V. A.Postnikov, P.Stopka, F.Svec, 0. A.Zefirova, L.I.Valuev "Study of the oxidase activity of horseradish peroxidase by ESR spectroscopy". - Studia Biophysica. - 1990. - V. 139. - No. 3.

5. О.Н.Зефирова, Г.А.Сытов, В.А.Постников, Л.И.Валуев, Н.А.Платэ "Оксидазная активность пероксидазы хрена в окислении комплекса альбумин - билирубин". - Прикл. биохим. и микробиол. - 1990. -Т. 26. - No 6. - С. 761 - 753.