Электрохимические реакции пероксидазы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.05 ВАК РФ

Российская Академия наук Институт электрохимии им. А.Н. Фрумкина

Фридман Вадим Анатольевич Электрохимические реакции пероксидазы

(02.00.05 - Электрохимия)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

1 ¿рМ^ эд р уарасевич

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

В.А. Богдановская

Москва 1999

Оглавление

Введение.........................................................3

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биоэлектрокаталитические и окислительно-восстановительные реакции ферментов на углеродных материалах.................................5

1.1. Общие представления о структуре и свойствах ферментов............7

1.2. Способы иммобилизации ферментов в электрохимических системах. . . 8

2. Биоэлектрокаталитические реакции в условиях непосредственного обмена электронами между электродом и активным центром фермента (реакции прямого биоэлектрокатализа)................................9

3. Пероксидаза и её функции в электрокатализе........................15

3.1. Строение и краткая характеристика физико-химических и ферментативных свойств пероксидазы...........................................16

3.2. Биоэлектрокатализ пероксидазой на твердых электродах.............19

3.3. Окислительно-восстановительные превращения пероксидазы на электродах............................................................21

4. Механизм биоэлектрокатализа.....................................23

Заключение.......................................................25

ЧАСТЬ 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Методы электрохимических измерений............................27

2. Электроды и электродные материалы..............................28

3. Реагенты и рабочие растворы.....................................31

4. Иммобилизация ферментов.......................................32

ЧАСТЬ 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Редокс-превращения гемсодержащих соединений

1. Редокс-превращения пероксидазы.................................35

2. Редокс-превращения микропероксидазы МП-11......................42

Глава 2. Электрокатализ иммобилизованной пероксидазой

1 .Биоэлектрокаталитическое восстановление Н202 пероксидазой, иммобилизованной на углеродном электроде........................50

1.1. Влияние концентрации пероксида водорода, скорости вращения электрода и рН раствора на скорость электрокаталитической реакции.......51

1.2. Влияние ингибиторов и активаторов фермента на скорость

электровосстановления Н2О2........................................58

1.1. Анализ кинетической схемы реакции.............................63

2. Электрокаталитическое восстановление кислорода пероксидазой, иммобилизованной на сажевом электроде............................66

1. Биоэлектрокатализ пероксидазой, соиммобилизованной с >1-метилпирролом.................................................73

2. Электровосстановление пероксида водорода пероксидазой,

иммобилизованной в Нафион.......................................87

Выводы....................................................... 92

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................94

Введение

Перспективы использования ферментов в электрохимии обусловлены высокой каталитической активностью белковых макромолекул и высокой специфичностью их действия. Разработанные методы сопряжения ферментативных и электрохимических реакций позволяют использовать ферменты в электрохимических процессах. Прежде всего, это возможность осуществлять с высокими скоростями такие важные в практическом отношении реакции, как электровосстановление пероксида водорода и молекулярного кислорода. В этом плане наиболее интересны обнаруженные в конце 70-х годов реакции прямого биоэлектрокатализа, протекающие в условиях непосредственного обмена электронами между электродом и активным центром белкового катализатора. Перечень ферментов, в присутствии которых наблюдаются подобные реакции, заметно пополняется в последние годы, однако механизм реакции остаётся предметом дискуссий.

Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей био-электрокаталитических реакций в системе электрод - активный центр фермента - субстрат для гемсодержащего фермента пероксидазы, адсорбированного на углеродных электродах (сажа, пирографит) и встроенного в полимерные плёнки.

Непосредственный перенос электрона между электродом и активным центром фермента (в отсутствие субстрата) является, по-видимому, необходимым условием для реализации прямого биоэлектрокатализа. В этом случае на циклических вольтамперных кривых (ЦВА) должна наблюдаться характерная картина редокс-превращения простетических групп белковых катализаторов. Первая глава экспериментальной части настоящей работы по-

священа изучению редокс-превращений пероксидазы и её модели микро-пероксидазы на углеродных электродах.

Механизму самой реакции пероксидазного электрокатализа (чрезвычайно важной в практическом отношении) посвящена вторая глава. Подробно анализируется влияние различных экспериментальных факторов на скорость восстановления пероксида водорода и кислорода пероксидазой, адсорбированной на углеродном электроде, на основе чего предлагается возможная схема реакции и механизм переноса электрона между электродом, активным центром пероксидазы и субстратом.

Эффективность функционирования ферментных электродов повышается во многих случаях в результате иммобилизации белковых катализаторов в полимерные плёнки. По этой причине следующий этап диссертационной работы заключался в исследовании реакции восстановления пероксида водорода пероксидазой, соиммобилизованной с электропроводным (полиметил-пиррол) и неэлектропроводным (Нафион) полимерами.

Часть I. Обзор литературы.

1. Биоэлектрокаталитические и окислительно-восстановительные реакции ферментов на углеродных материалах.

Основной задачей электрокатализа является интенсификация электрохимических реакций в условиях, максимально приближенных к равновесным. Значительная эффективность в этом направлении достигнута с использованием ферментов - катализаторов белковой природы. Данная область научных исследований получила название биоэлектрокатализа.

Углеродные материалы широко используются в качестве электропроводящей подложки для иммобилизации (привязывания) ферментов [1,66]. Это обусловлено такими свойствами углеродных электродов, как широкий спектр состава поверхностных групп (хиноновые, карбоксильные, лактоно-вые), по которым происходит адсорбция белков, а также гидрофобно-гидрофильных характеристик электродной поверхности [2]. Привлекательность физико-химических свойств различных углеродных материалов открывает перспективы для применения их в качестве основы ферментных электродов (в особенности одноразовых) для анализа различных субстратов [5]. Углеродные электроды широко используются и в фундаментальных работах, посвященных исследованию электрохимических превращений белков и ферментов, что позволяет получить более детальную информацию о кинетике ферментативных окислительно-восстановительных реакций [1,3,6]. Небольшие по размеру редокс-протеины можно рассматривать как модельные белки для некоторых ферментных молекул, электрохимические реакции которых во многих случаях затруднены [84,86,87,90]. Однако в некоторых ра-

ботах удалось непосредственно зафиксировать редокс-превращения ряда ферментов на циклических вольтамперных кривых (ЦВА), о чем будет сказано далее.

Многие ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции (их называют оксидоредуктазы) [4,6] ускоряют биэлектрохи-мические реакции окисления (восстановления) с участием медиаторов (низкомолекулярных переносчиков электронов между электродом и активным центром белкового катализатора).

Как удалось установить в 70 ~ 90-е годы, некоторые из подобных ферментов катализируют электрохимические реакции соответствующих субстратов и в отсутствие медиаторов. Было высказано предположение, что в данных реакциях, которые называют реакциями безмедиаторного электронного переноса между электродом, активным центром фермента и субстратом (реакциями прямого биоэлектрокатализа), электрод непосредственно обменивается электронами с активным центром фермента. Впервые эти реакции были исследованы именно на углеродных электродах [1,3,11-15].

Авторы некоторых публикаций полагают, что прямой электронный перенос возможен в том случае, когда в результате взаимодействия фермента с поверхностью электрода формируется комплекс, подобный по своему строению промежуточному комплексу белкового катализатора и одного из субстратов ферментативного катализа. В этом случае возможно электрохимическое восстановление (окисление) второго субстрата [1,3,4]. Данное условие как раз реализуется на углеродной поверхности. Функциональные кислородсодержащие группы углеродного электрода обеспечивают не только адсорбционное привязывание ферментов, но и ,по-видимому, необходимое для реализации прямого электронного переноса микроокружение ферментной глобулы. [1,3-5,31].

1.1. Общие представления о структуре и свойствах ферментов.

Ферменты представляют собой катализаторы белковой природы [1]. Белки - это высокомолекулярные соединения, состоящие из а - аминокислот, связанных пептидными связями. Полипептидная цепь определяет первичную структуру белка. Помимо первичной, белки имеют вторичную, третичную и иногда четвертичную структуру. Вторичная структура определяется специфической укладкой локальных участков полимерной цепи в пространстве. Наиболее характерной для белков является а - спираль, которая поддерживается за счёт образования водородных связей. Третичная структура определяется свёртыванием полипептидной цепи в компактную сферическую глобулу. Полипептидные цепи стремятся свернуться таким образом, чтобы во внутренней части молекулы находилось как можно больше гидрофобных боковых цепей аминокислот, что предохраняет их от термодинамически невыгодного контакта с водной средой. В больших белковых молекулах имеется в ряде случаев не одна, а несколько полипептидных цепей, которые в результате взаимодействия укладываются в четвертичную структуру.

Помимо белковой глобулы (апофермента), ферменты содержат небелковую часть - простетическую группу, состоящую из ионов металлов или низкомолекулярных органических редокс-соединений. Из простетической группы и фрагментов полипептидной цепи формируется активный центр белка. Перенос электрона в белковых молекулах протекает с окислением или восстановлением активных центров. Простетическая группа гемсодержащих белков (цитохром С, пероксидаза, каталаза) представляет собой порфирин железа [72]. Большая группа флавопротеинов содержит в активном центре флавинадениндинуклеотид (ФАД).

1.2. Способы иммобилизации ферментов в электрохимических системах.

Под иммобилизацией понимают способ "привязывания" ферментов к носителю (в данном случае к электроду). Иммобилизация за счет сил физической и химической адсорбции представляет собой наиболее простой метод, широко используемый в случае углеродных электродов. Однако данный способ имеет тот недостаток, что в процессе работы часть белка десорбиру-ется с поверхности, особенно если проводить исследования с вращающимися электродами или в проточном растворе. Для предотвращения вымывания с поверхности сорбента используют иммобилизацию белков в полимерные, в том числе электрохимическими методами осаждённые пленки. В условиях катодной поляризации (которая, как правило, не инактивирует фермент) применяют соосаждение фермента с гелем ПВС (поливинилового спирта) и с акриламидом [1,4]. Используют и другой способ - после обычной адсорбционной иммобилизации белки "сшивают" глутаровым альдегидом [1,4,5 ], покрывают поверхность электрода ионообменными мембранами или растворами ионообменных полимеров Naflon (Нафион - сополимер тетрафторэтиле-на и перфторалкилвинилового эфира) [77, 78] и Eastman AQ (полистер-сульфоновая кислота) [7,8,31].

Широко распространенным методом иммобилизации белков является привязывание к поверхности электрода через модификаторы. В качестве модифицирующих агентов используют дипиридил , пурин, метилвиологен [1]. Основные требования, которые предъявляют к модифицирующим агентам, заключаются в том, что они должны иметь две функциональные группы, одна из которых образует прочную связь с поверхностью электрода, а вторая взаимодействует с белковой глобулой. В последнее десятилетие широко используют водорастворимые производные карбодиимида для ковалентного привязывания амино- (или карбоксильных) групп белковых молекул к кар-

боксильным (или, соответственно, аминогруппам), предварительно синтезированным на поверхности электрода [49,52,60].

Опубликовано ряд работ, в которых использовали электрохимическую иммобилизацию ферментов в электропроводные полимерные пленки (полипиррол и его производные, полианилин, и т.д.) [9, 10, 39 -41, 82, 87, 88, 90, 91]. Варьируя параметры электрохимической полимеризации и применяя различные допирующие агенты, можно синтезировать непосредственно на электроде пленку определенной толщины и структуры, а путем соосаждения ферментов с мономерами, устойчивыми в нейтральной среде (пиррол и его производные), обеспечить эффективное встраивание белка в полимерную матрицу. В этом случае ферментная глобула как бы "обволакивается" со всех сторон цепями электропроводного полимера что, по мнению ряда авторов, способствует переносу заряда между электродом и активным центром включенного в полимер белка [26,40].

2. Биоэлектрокаталитические реакции в условиях непосредственного обмена электронами между электродом и активным центром фермента (реакции прямого биоэлектрокатализа).

Еще в 1978 году было показано, что фермент лакказа (медьсодержащая п-фенолоксидаза), адсорбированная на сажевом электроде, катализирует электровосстановление молекулярного кислорода в отсутствие медиатора [11]. Позже на углеродном электроде были обнаружены и редокс-превращения ионов меди активного центра фермента [12]. Другой медьсодержащий фермент - тирозиназа также ускоряет реакцию восстановления кислорода. [13].

Цитохром b2 (фермент, содержащий флавинмононуклеотид и гем) ускоряет электроокисление лактата на оргметаллическом (электронпроводящее органическое соединение) и углеродном электродах [4,6].

В 1980 году опубликована статья [14], посвященная прямому электроокислению молекулярного водорода гидрогеназой - ферментом, содержащим в активном центре железосерный кластер.

Сажевый электрод с адсорбированной пероксидазой из хрена катализирует безмедиаторное электровосстановление пероксида водорода, что было впервые показано в 1979 году в работе [15]. Аналогичные результаты были получены в 1989 году с цитохром С пероксидазой, адсорбированной на пирографите [81].

В 1989 году [16] обнаружен эффект безмедиаторного переноса электрона между п-крезолметилгидроксилазой (ферментом, содержащем в активном центре гем и ФАД, и катализирующем процессы бактериального метаболизма п-крезола) и краевой плоскостью пирографитового электрода. Рост анодного тока окисления п-крезола наблюдается в присутствии промоторов - положительно заряженных катионов и органических молекул (полиаминов и аминогликозидов) в объеме раствора. Положительно заряженные ионы промотора концентрируются во внешней плоскости Гельм-гольца и уменьшают отталкивающее влияние электрода на отрицательно заряженную ферментную глобулу. В присутствии органических промоторов белок претерпевает на электроде квазиобратимые редокс-превращения вблизи окислительно-восстановительного потенциала гем-содержащей субьединицы (0,04 В), определенного в обьеме раствора потенциометриче-ским титрованием редокс-медиатором. (Здесь и далее потенциалы приведены по насыщенному хлорсеребряному электроду (Ag/AgCl) при рН=7). К этой величине близок и потенциал полуволны Е ш окисления п-крезола

(0,03 В). Обобщив полученные экспериментальные данные, а также исходя из известной ранее схемы ферментативного катализа п-крезолметил-гидроксилазой, авторы [16] предложили механизм электрохимической реакции: субстрат вначале окисляется на флавинадениндинуклеотиде (ФАД), после чего происходит быстрая передача электрона на гем, который затем электрохимически окисляется на поверхности электрода. Аналогичные результаты получены этими же авторами на пирографите с другим флавогемо-вым ферментом - флавоцитохромом С552, который катализирует электроокисление гидросульфидов [17]. Здесь, как и в предыдущем случае, на электроде зафиксированы редокс-превращения, близкие к редокс-потенциалу гемсодержащей субьединицы и к потенциалу полуволны окисления субстрата.

В работе [18] описываются электрохимические свойства и электрокаталитическая активность другого фермента - метиламин дегидрогеназы, катализирующего электроокисление метиламина на пирографите и модифицированном золотом электроде. Кофактор фермента имеет хиноидную структуру , и его р�