Гидрогели хитозана как новая матрица для извлечения и определения производных дибензотиофена и фенотиазинов оптическими методами

Борзенкова, Наталья Витальевна

Гидрогели хитозана как новая матрица для извлечения и определения производных дибензотиофена и фенотиазинов оптическими методами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Борзенкова, Наталья Витальевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Гидрогели хитозана как новая матрица для извлечения и определения производных дибензотиофена и фенотиазинов оптическими методами»

Автореферат диссертации на тему "Гидрогели хитозана как новая матрица для извлечения и определения производных дибензотиофена и фенотиазинов оптическими методами"

005531652

На правах рукописи

Борзенкова Наталья Витальевна

ГИДРОГЕЛИ ХИТОЗАНА КАК НОВАЯ МАТРИЦА ДЛЯ ИЗВЛЕЧЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ДИБЕНЗОТИОФЕНА И ФЕНОТИАЗИНОВ ОПТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2013

005531652

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Шеховцова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович, Центр «Биоинженерия» РАН

доктор химических наук, профессор Ермолаева Татьяна Николаевна, Липецкий государственный технический университет

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 26 июня 2013 г. в 15 ч. 00 мин. в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат диссертации размещен на сайте Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова: www.chem.msu.ru и на сайте ВАК http://vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан 24 мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, _

кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из актуальных направлений современной аналитической химии является разработка подходов к селективному и экспрессному определению средне и трудно окисляемых ограниченно растворимых или нерастворимых в воде субстратов оксидоредуктаз в матрицах сложного состава. Эта проблема сегодня стоит наиболее остро для серосодержащих субстратов, включающих два класса соединений - производные фенотиазина и дибензотиофена (ДБТ), вследствие необходимости и чрезвычайной важности постоянного контроля содержания этих соединений, являющихся нейролептическими лекарственными препаратами и общепризнанными маркерами качества дизельного топлива соответственно, в биологических жидкостях и тканях человека, а также в нефтепродуктах. В качестве типичных представителей указанных классов субстратов были выбраны промазин и ДБТ, определение которых как с практической, так и с научной точек зрения чрезвычайно актуально. Многокомпонентный состав объектов, содержащих эти аналиты, вызывает необходимость их предварительного извлечения. В настоящее время для этой цели используют длительные, трудоемкие и многоступенчатые схемы извлечения с помощью экстракции органическими растворителями или лигандно-обменной хроматографии. Кроме того, при определении общего содержания серы в топливе применяют различные инструментальные методы (в частности, рентгенофлуоресцентные), что удорожает анализ.

Альтернативным является подход, основанный на твердофазном извлечении аналитов с последующим определением их непосредственно в матрице сорбента методами спектрофотометрии или флуоресценции. Вследствие того, что выбранные аналиты - субстраты оксидоредуктаз, в частности пероксидазы из корней хрена (ПХ), сочетание описанного подхода с использованием биокатализатора способно обеспечить селективность их определения за счет избирательности действия фермента и сорбента.

Для окисления субстратов, в том числе при создании сенсоров, предложен широкий круг аналогов ПХ, включающий гемсодержащие белки (гемоглобин, цитохром с и др.) и биомиметики (комплексы порфирина с Мп, Со, Бе, Мо, гемин, циклодекстрин-гемин, гематин и др.); однако наиболее каталитически активен из них дешевый, доступный коммерческий препарат гемоглобина (Гб) из крови быка. Для повышения практической значимости методик, основанных на указанном подходе, важно сравнение эффективности и стабильности хорошо изученного фермента ПХ и ее гемсодержащего аналога белка Гб в процессе превращения упомянутых субстратов в водной и водно-органической средах. Для успешной реализации такого подхода используемый сорбент должен не только обладать хорошими сорбционными характеристиками и извлекать определяемые соединения или их различные формы из матрицы объекта, но и быть оптически прозрачным и обеспечивать простоту регист-

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической хшши МГУ им. М.В. Ломоносова И.А. Веселовои за активное участие в постановке задач и обсуждении результатов исследований.

рации аналитического сигнала, формируемого в его объеме и на поверхности. В качестве матрицы таких сорбентов перспективен полисахарид хитозан, хорошо зарекомендовавший себя в аналитической практике. Актуально получение сшитых материалов на его основе: модифицированного (сшитого) хитозана и хитозана с молекулярными отпечатками (МО), а также применение их в виде двух типов сорбентов: пленок и гелей.

Цели работы заключались в:

• выработке подходов к определению средне и трудно окисляемых субстратов с использованием ПХ и Гб;

• оценке перспектив использования Гб вместо ПХ в качестве катализатора окисления серосодержащих субстратов в водной и водно-органической средах;

• разработке способов получения оптически прозрачных пленок и гелей сшитого хитозана и хитозана с МО двумя методами: ионной и ковалентной сшивки;

• выборе материала и типа сорбента, обладающего лучшими сорбционными характеристиками в отношении производных фенотиазина и ДБТ;

• разработке методик определения фенотиазинов и производных ДБТ с использованием более эффективного биокатализатора и лучшего сорбента в модельных растворах.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

о оптимизировать условия проведения реакций окисления ДБТ и фенотиазинов в

водной и водно-органической средах; о выбрать оптимальный состав пленок и гелей сшитого хитозана и хитозана с МО

промазина или ДБТ02, получаемых ионной и ковалентной сшивкой; о изучить морфологию, сорбционные характеристики и селективность полученных пленок и гелей;

о выбрать условия определения ДБТ и фенотиазинов в матрице сорбента.

Научная новизна работы. Предложены новые оригинальные подходы к двухстадийному определению серосодержащих субстратов оксидоредуктаз (на примере промазина и ДБТ) методами спектрофотометрии и флуоресценции. В результате систематического изучения окисления фенотиазинов (промазина и хлорпромазина), катализируемого ПХ и Гб, показаны аналитические перспективы использования этих биокатализаторов в водной и водно-органической средах. Выявлены значительные преимущества белка Гб перед ПХ в окислении ДБТ. С использованием Гб впервые достигнута количественная конверсия 230 мкМ ДБТ с высокой селективностью выхода продукта - сульфоксида (ДБТО) (98±1%) в течение 5 мин.

серосодержащих соединений из растворов. Показаны преимущества использования гидрогелей сшитого хитозана перед гидрогелями хитозана с МО для извлечения и последующего определения в сорбенте фенотиазинов и производных ДБТ.

Практическая значимость. Выявлена зависимость эффективности действия биокатализаторов от природы субстрата и содержания органического растворителя в реакционной смеси. Для превращения средне окисляемых субстратов фенотиазинов пригодны оба биокатализатора - ПХ и Гб, как в водной, так и в водно-органической средах, однако в последнем случае применение ПХ предпочтительнее; напротив, при конверсии трудно окисляемого субстрата ДБТ исключительными преимуществами обладает белок Гб.

Предложены простые и экспрессные методики получения пленок и гидрогелей сшитого хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТО2, в том числе в лунках полистирольного планшета. Разработаны простые и экспрессные методики биокаталитического определения промазина и хлорпромазина в водной среде и в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО), а также методики определения промазина и ДБТО в матрице гидрогелей хитозана.

Автор выносит на защиту:

■ результаты изучения окисления ДБТ пероксидом водорода, катализируемого Гб в водно-органической среде;

■ результаты изучения кинетики катализируемого ПХ и Гб окисления промазина и хлорпромазина пероксидом водорода в водной и водно-органической средах;

■ методики биокаталитического определения промазина и хлорпромазина в водной среде и в присутствии ДМСО;

■ установленные условия получения гидрогелей сшитого ГА и ФА хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТ02;

■ данные по изучению оптических и сорбционных свойств гидрогелей сшитого хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТО2;

■ методики определения в гидрогелях хитозана серосодержащих соединений: промазина методом спектрофотометрии и ДБТО методом флуоресценции.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на 6 международных и всероссийских конференциях: Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011», «Ломоносов-2012» и «Ломоносов-2013» (Москва, 2011, 2012, 2013), Республиканской научно-практической конференции (с международным участием) «Зеленая химия» в интересах устойчивого развития» (Узбекистан, Самарканд, 2012), Всероссийских конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев - 2012» и «Менделеев - 2013» (Санкт-Петербург, 2012, 2013), 3rd International Conference on Bio-Sensing Technology (Spain, Sitges, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в российских журналах, 7 тезисов докладов на международных и российских конференциях, получено положительное заключение о выдаче патента РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 65 рисунков и 29 таблиц, и состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 2 глав экспериментальной части, 4 глав обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 188 источников.

Во Введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цели и задачи, научная новизна и практическая значимость.

Обзор литературы включает 3 главы. В первой главе изложены общие сведения о ДБТ и его производных, а также о фенотиазинах; обсуждены причины и способы их биокаталитического окисления, методы их определения и способы подготовки проб содержащих их объектов к анализу. Вторая глава посвящена свойствам и применению хитозана, а также способам его модификации (сшивки) и получения на его основе полимеров с молекулярными и ионными отпечатками. В третьей главе систематизированы и проанализированы литературные данные о твердофазном извлечении ДБТ и его производных, а также фенотиазинов с помощью полимеров с МО.

Экспериментальная часть работы представлена главами 4 и 5. В 4 главе перечислены исходные вещества, их характеристики, использованное оборудование; описаны методики приготовления растворов, получения пленок и гелей на основе сшитого хитозана, в том числе в лунках полистирольных планшетов, и проведения спектрофотометрических, флуориметрических и хроматографических измерений. В пятой главе обоснован выбор схем определения аналитов - ДБТ и промазина, а также выбор темплатов - соединений для получения МО в хитозане, изученных биокатализаторов (ПХ и Гб), матрицы (хитозана), материалов и типов сорбентов для извлечения целевых соединений.

Обсуждение результатов включает главы 6-9. В шестой главе представлены результаты изучения и сравнения эффективности окисления ДБТ в присутствии ПХ и Гб в водно-органической среде; выбранные условия проведения быстрой и количественной конверсии ДБТ в ДБТО. Описан выбор условий проведения индикаторных реакций биокаталитического окисления промазина и хлорпромазина для их определения; обсуждены данные о влиянии природы и содержания органического растворителя на их скорость. Сопоставлены рассчитанные кинетические параметры реакций окисления промазина в присутствии ПХ и Гб в водной и водно-органической средах. Приведены аналитические характеристики биокаталитических методик определения фенотиазинов в водном растворе и в присутствии ДМСО. Представлены условия выполнения и аналитические характеристики ферментативной методики определения промазина. В седьмой главе описаны особенности получения и свойства пленок сшитого хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТ02. Сопоставлены преимущества и недостатки двух способов сшивки хитозана: ионной - с помощью серной кислоты и ковалентной - с помощью ГА. В восьмой главе обсуждены проблемы получения полимерных материалов и пути их решения; обоснован выбор условий получения и состава гелей сшитого хитозана и хитозана с МО ДБТОг и промазина. Сопоставлены достоинства и недостатки двух способов получения гелей; представлены результаты изучения сорбционных свойств указанных материалов. В девятой главе обоснован выбор условий получения и состава гидрогелей ковалентно

сшитого хитозана и хитозана с МО ДБТО2 и промазина в лунках полистирольных планшетов; обсуждены проблемы получения этих материалов и пути их решения; сравнены свойства двух сшивающих агентов. Приведены результаты изучения оптических и сорбционных свойств, селективности, морфологии поверхности и внутренних структур гидрогелей. Представлены аналитические характеристики методик флуоресцентного определения ДБТО в матрице гидрогелей сшитого хитозана и хитозана с МО ДБТ02; а также спектрофотометрических ферментативных методик определения промазина в указанных сорбентах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обоснование выбора схем определения, биокатализаторов и сорбционных материалов

Методики отделения малополярного ДБТ от неполярных углеводородов топлива сложны и неселективны, поэтому целесообразно первоначальное окисление этого сернистого соединения до какого-либо единственного продукта с последующим извлечением и определением его в матрице сорбента. Выбор ДБТО в качестве продукта окисления, и, как следствие, определяемого соединения, обусловлен его большей полярностью по сравнению с ДБТОг, что, согласно литературным данным, должно обеспечить его лучшее отделение от неполярной матрицы и извлечение полярным сорбентом. Однако в связи с тем, что препарат ДБТО не является коммерческим, и для получения хитозана с МО ДБТО необходим его синтез, для упрощения методик в качестве темплата использовали коммерческий препарат ДБТОимеющий структуру и свойства, максимально близкие к ДБТО (табл.1).

Способы извлечения фенотиазинов из объектов более просты, а реакции окисления лежат в основе спектрофотометрических методик их определения, поэтому целесообразно извлекать фенотиазины в неокисленной форме, после чего определять их в матрице сорбента по реакциям их биокаталитического окисления. Поэтому были выбраны различные двухстадийные схемы определения двух классов субстратов: при определении ДБТ его биокаталитическое окисление предшествует стадии извлечения окисленного продукта и определения его непосредственно в матрице сорбента, а определение фенотиазинов по реакции их биокаталитического окисления в матрице сорбента следует после стадии их извлечения из анализируемого объекта.

В качестве модельных соединений фенотиазинового ряда выбрали широко используемые в медицине препараты - промазан и хлорпромазин (табл. 1).

Вследствие низкой стабильности и активности ПХ в водно-органических средах помимо этого фермента в качестве биокатализатора изучили ее аналог - белок Гб, лишенный этого недостатка, для сопоставления эффективности их действия в реакциях окисления ДБТ и фенотиазинов. Систематическое изучение условий окисления ДБТ, применение этой реакции для решения аналитических задач, а таюке методики определения фенотиазинов с использованием Гб в литературе не описаны.

В соответствии с выбранными схемами проведения анализа сорбент должен обеспечивать не только извлечение, но и определения аналитов в нем оптическим методом. Выбор природного полисахарида хитозана в качестве матрицы для создания таких сорбентов обусловлен наличием в его структуре большого числа амино- и гидроксогрупп, необходимых для взаимодействия с аналитом, а также способностью образовывать оптически прозрачные эластичные пленки и гидрогели.

Таблица 1. Изученные в работе серосодержащие соединения

Производные ДБТ

ДБТ _ДБТО_ДБТ02

Фенотиазины

Промазин Хлорпромазин

Кроме того, благодаря присутствию в структуре хитозана гидрофобной поли-сахаридной основы, а также ацетилированных аминогрупп, этот полимер способен к гидрофобным взаимодействиям, благодаря чему перспективен для извлечения ароматических соединений. Вследствие этого хитозан был выбран в качестве универсальной матрицы для извлечения соединений (производных ДБТ и фенотиазинов), обладающих разными свойствами.

Аналитический интерес представляют два типа материалов на основе хитозана: модифицированный (сшитый) хитозан и хитозан с МО. Модифицированный хитозан отличается от хитозана с МО отсутствием темплата на стадии получения, то есть является для него полимером сравнения (ПС); поэтому эти термины использовали в работе как синонимы. Хитозан с МО представляет собой сшитый полимер, поэтому для него также использовали устоявшийся термин - полимер с МО (ПМО). В литературе показано, что ПМО эффективны для извлечения обоих классов выбранных аналитов и пригодны для проведения сорбции при температуре, близкой к комнатной. Однако в литературе описано применение полимеров с МО ДБТ02 и ДБТ только для извлечения их из модельных топлив, хотя не меньший практический интерес представляет использование таких сорбентов и для определения указанных аналитов. В то же время, в единичных работах показаны возможности ПМО в качестве распознающих компонентов электрохимических сенсоров для определения фенотиазинов, и известна лишь одна работа,- посвященная извлечению фенотиазинов с помощью ПМО (на основе метакриловой кислоты) и изучению характеристик самого сорбента. В связи с этим актуальны не только разработка сорбентов на основе ПМО фенотиазинов, но и систематическое изучение свойств таких сорбентов.

Для получения матриц, обладающих оптимальными свойствами для последующего определения в них серосодержащих соединений спектрофотометрическим и флуоресцентным методами, исследовали два типа сорбентов: пленки а гели немоди-фицированного хитозана, модифицированного хитозана и хитозана с МО. При этом важно было сопоставить два способа модификации хитозана — ионной и ковалентной сшивки. В качестве сшивающих агентов на основании анализа литературы для

проведения ионной сшивки выбрали серную кислоту, а при проведении ковалентной сравнили алифатический и ароматический альдегиды: глутаровый и о-фталевый.

Следует подчеркнуть, что для извлечения фенотиазинов указанные материалы на основе хитозана ранее не использовали вовсе, а извлечение ДБТ и продукта его окисления ДБТОг описано лишь в работах двух научных групп, причем только на примере гидрогелей ПМО; гидрогели ПС изучены не были.

В соответствии с выбранными схемами определения серосодержащих субстратов ПХ исследование состояло из двух основных этапов: 1) выбор условий для эффективной конверсии ДБТ до ДБТО и окисления фенотиазинов с целью разработки методик их определения в матрице сорбента; 2) получение сорбентов и определение в них выбранных аналитов - ДБТО и промазина.

ДБТ в воде не растворим, а для поддержания активности выбранных биокатализаторов - ПХ и Гб - необходимо некоторое содержание воды, поэтому окисление проводили в водно-органической среде (в присутствии 25 об.% ацетонит-рила или 1-пропанола). Исходное содержание ДБТ в реакционной смеси поддерживали постоянным - 50 мкг/г (230 мкмоль/л), соответствующим допустимому содержанию серы в топливе по действующему в РФ стандарту для сверхчистого топлива. Для контроля протекания реакции использовали метод ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием (рис. 1).

Рис. 1. Типичные хроматограммы реакционной смеси до (а) и после (6) окисления ДБТ (Времена удерживания ДБТО; ДБТ02 и ДБТ -1,5; 2,2 и 7,5 мин соответственно).

ПХ оказалась неэффективной в качестве катализатора окисления ДБТ перокси-дом водорода в водно-органической среде: продукты реакции не удалось зафиксировать даже через 1 ч проведения реакции. Замена неорганического пероксида на органический ягрет-бутилгидропероксид позволила обнаружить продукт окисления ДБТ - ДБТО и следовые количества ДБТ02, однако степень конверсии ДБТ составила всего (7±3)% за 10 мин реакции. Низкая эффективность ПХ как катализатора окисления ДБТ обусловлена, очевидно, природой этого субстрата, который не относится к классическим субстратам оксидоредуктаз и трудно окисляется, а также присутствием органического растворителя в смеси.

Белок Гб оказался значительно более эффективным катализатором. В результате варьирования содержаний Гб и пероксида водорода в смеси, изменения температуры,

Окисление серосодержащих соединений в водной и водно-органической средах

природы растворителя и окислителя, а также изучения кинетики окисления ДБТ в условиях, представленных в табл. 2, удалось добиться быстрой и селективной конверсии ДБТ в сульфоксид (выход 98±1% за 5 мин) при сохранении прозрачности реакционной среды.

Таблица 2. Выбранные условия окисления ДБТ

Биокатализатор Гб, 10 мкМ

Окислитель Н202,10 мМ

Буферный раствор Ацетатный, 10 мМ, рН 5,2

Органический растворитель Ацетонитрил, 25 об.%

Температура 20°С

Время реакции 5 мин

Для разработки методик определения промазина и хлорпромазина в матрице сорбента предварительно изучили кинетику их окисления в растворе и сравнили эффективность ПХ и Гб. С целью расширения области линейности кинетической кривой для реакции накопления промежуточных продуктов окисления фенотиазинов - катион-радикалов и достижения удобных для измерения скоростей реакции варьировали условия проведения реакций (природу, рН и ионную силу буферного раствора, концентрации биокатализаторов и пероксида водорода). Установили, что уменьшение ионной силы и рН раствора повышает устойчивость катион-радикалов обоих фенотиазинов.

Таблица 3. Оптимальные условия окисления фенотиазинов в присутствии двух биокатализаторов

Фенотиазин ^тпах» нм Биокатализатор, нМ с(Н202), мкМ Буферный раствор рН

Промазин 512 Гб, 250 500 25 мМ цитратный 3,5

ПХ,3 670

Хлорпромазин 525 Гб, 200 580 25 мМ ацетатный 4,0

ПХ, 8 200

Для экстракции фенотиазинов из биологических жидкостей и тканей используют органические растворители, поэтому на примере промазина в выбранных для каждого биокатализатора условиях (табл. 3) изучили влияние природы полярных органических растворителей (наиболее часто используемых при подготовке проб лекарственных препаратов и биологических объектов) на скорость окисления (рис. 2). Выявили, что с повышением полярности органического растворителя растёт его содержание, при котором биокатализатор сохраняет свою активность.

Расчет кинетических параметров реакции окисления промазина пероксидом водорода показал, что эффективность (кса/К,„) и удельная активность ПХ в водной среде были в 100 и 9,4-104 раз, а в присутствии 10 об.% ДМСО - в 60 и 4,6-104 раз соответственно выше, чем в случае Гб. На основании полученных результатов можно заключить, что активность обоих биокатализаторов зависит от типа субстратов: в

случае средне окисляемых субстратов активность фермента закономерно выше, чем Гб; напротив, в случае трудно окисляемых субстратов выше активность Гб. Причиной этого может служить различие в механизмах окисления двух типов субстратов.

tga■100

И 1-Пропанол К Ацетонитрил ■ ДМСО

tga■100

□ 1-Пропанол 53 Ацетонитрил ■ ДМСО

Рис.

О 1 5 10 20

Содержание растворителя, об. %

2. Зависимость скорости окисления промазина пероксидом водорода в

0 1 5 10 20 30 Содержание растворителя, об. %

присутствии ПХ (а) и Гб (б) от содержания органического растворителя (25 мМ нитратный буферный раствор, рН 3,5; концентрации промазина - 50 мкМ, Гб - 250 нМ, ПХ - 3 нМ, Н202 - 670 (а) и 500 (б) мкМ; п=5, Р=0,95).

В выбранных оптимальных условиях изученных индикаторных реакций разработали методики определения промазина и хлорпромазина в водной среде и в присутствии 10 об.% ДМСО (табл. 4 и 5).

Таблица 4. Аналитические характеристики методик биокаталитического определения промазина и хлорпромазина в водном растворе (и=3, Р=0,95).

Биокатализатор ґ£а°= (а±Да)- 10і с + (Ь±АЬ) ДОК6, мкМ .уг при с„

а Да Ь АЬ

Промазин

ПХ 1,1 0,2 0,010 0,002 10-100 0,08

Гб 2,3 0,4 0,06 0,01 10-100 0,03

Хлорпромазин

ПХ 3,4 0,2 0,020 0,001 10-200 0,02

Гб 1,4 0,2 0,09 0,01 10-100 0,07

" tga - скорость реакции окисления фенотиазинов, с — концентрация анапита, М. 6 ДОК-диапазон определяемых концентраций.

Таблица 5. Аналитические характеристики методик биокаталитического определения промазина в 10%-ном ДМСО (п=3, Р= 0,95).

Биокатализатор (а±Аа)- Ю-'с + (Ь±АЬ) ДОК, мкМ при с„

а Д а Ь АЬ

ПХ 1,70 0,06 0,05 0,01 25-500 0,02

Гб 0,73 0,02 0,082 0,002 25-100 0,05

0,042 0,004 0,20 0,005 500-2000 0,008

Гемоглобин может быть использован для определения обоих фенотиазинов в водной среде с аналитическими характеристиками, мало уступающими таковым в реакциях, катализируемых ПХ. В водно-органической среде предпочтительнее использовать ПХ, так как в присутствии Гб область линейности градуировочной зависимости делится на две подобласти, что сужает единый диапазон определяемых содержаний промазина и может быть объяснено особенностями кинетической схемы окисления фенотиазинов в присутствии Гб. Разработанные методики определения промазина и хлорпромазина сравнимы по чувствительности с описанными спектро-фотометрическими методиками, однако могут отличаться большей селективностью за счет избирательности действия биокатализаторов, а также характеризуются экспрес-сностью (время анализа не более 10 мин) и простотой методического и аппаратурного оформления.

Для решения практических задач химического анализа и определения промазина в матрице сорбента (в пленках и гелях) выбрали оптимальные условия (табл. 6) и разработали методику его определения методом фиксированного времени (табл. 7), пригодным доя работы, как на спектрофотометре, так и на планшетном фотометре.

Таблица 6. Условия определения фенотиазинов методом фиксированного времени в лунках полистирольного планшета. Время реакции 2 мин.

Компонент Природа Концентрация

Биокатализатор ПХ 5 нМ

Окислитель Н202 1,5 мМ

Буферный раствор Цитратный 25 мМ; рН 3,5

Таблица 7. Аналитические характеристики методики пероксидазного определения промазина в водной среде методом фиксированного времени (и=7, Р=0,95)

Аа= (а±Аа)с + (Ь±АЬ) ДОК, При Сн

а Д а Ъ Д Ь мкМ

660 30 0,14 0,01 70 - 1000 0,03

"А - оптическая плотность раствора, с - концентрация промазина, М.

Получение пленок полимеров на основе хитозана и изучение их свойств

Для изготовления однородных, воспроизводимых по качеству и удобных в использовании пленок немодифицированного хитозана, а также сшитого хитозана и хитозана с МО использовали подложки из кварцевого стекла с адгезивным покрытием. Как оказалось, пленки немодифицированного хитозана, будучи оптически прозрачными, обладают неудовлетворительными сорбционными свойствами: степени извлечения ими промазина и ДБТ02 из растворов в воде (0,5 мМ) и ацетонитриле (2,7 мМ), соответственно, не превышали 5% за 16 ч, и при этом воспроизводимость результатов была чрезвычайно низкой (вг ~ 0,5). Эти факты свидетельствуют о необходимости проведения модификации (сшивки) хитозана.

Ионная и ковалентная сшивки хитозана при использовании выбранных агентов происходят по следующей схеме:

а) Хитоэан -МН2 + Н28С>4-== Хитозан......'ЯОд2' »іппішмн34-Хитозан

С использованием метода ионной сшивки пленки модифицированного хитозана и хитозана с МО получали следующим образом: раствор хитозана или раствор смеси хитозан-темплат наносили на подложку, высушивали во избежание стекания с пластины и выдерживали в растворе серной кислоты 24 ч. В результате были получены оптически прозрачные бесцветные пленки сшитого хитозана и хитозана с МО промазина. Получить пленки хитозана с МО нерастворимого в воде ДБТОг не удалось по причине нерастворимости смеси сухих препаратов хитозана и ДБТОг в водно-органической среде. Полученные пленки для извлечения промазина плохо удерживались на подложке, отслаивались от ее поверхности при промывании, необходимом для удаления избытка сшивающего агента, а также темплата из ПМО. Это косвенно свидетельствует об уменьшении числа свободных аминогрупп хитозана, способных к взаимодействию с поверхностью подложки, и подтверждает наличие сшивки. Выявлены низкие степени извлечения (<10%) промазина полученными пленками из 0,5 мМ водного раствора за 16 ч и неудовлетворительная воспроизводимость результатов (бг> 0,4).

Пленки модифицированного хитозана и хитозана с МО на поверхности стеклянных пластин методом ковалентной сшивки получали в три стадии: наносили раствор хитозана (или в случае ПМО смеси хитозан-темплат) на пластины; проводили реакцию с ГА в течение времени, необходимого для полного высыхания смеси; после чего промыванием удаляли избыток сшивающего агента и темплат. Для растворения ДБТО2 использовали органический растворитель (пороген) - ацетонит-рил. Для адекватного сравнения свойств ПМО и ПС при получении последнего также использовали ацетонитрил. Полученные пленки были оптически прозрачными, но имели бурую окраску, вызванную образованием хромофорных групп (иминогрупп) при протекании сшивки. Тем не менее, поглощение пленок в видимой области спектра было пренебрежимо мало. Для промывания пленок после сравнения с ДМСО выбрали ацетонитрил, не вызывавший их набухания и вымывавший темплат.

Согласно литературным сведениям, свойства ПС и ПМО определяются мольным соотношением сшивающего агента и функционального мономера (1), а во втором случае также темплата и функционального мономера (2). Соотношение (1) характеризует степень сшивки полимера (плотность полимерной сетки), что определяет размер образующихся пор, а соотношение (2) определяет их число. При выборе состава полимеров соотношения компонентов реакционной смеси (в молях) рассчитывали на мономерную единицу хитозана - глюкозамин (ГАм), для краткости

поил

б)

ни, „♦

1 N

+ н,0

эти соотношения обозначали как Скошюнепта'СгАяр Надежное закрепление пленок на поверхности подложки обеспечивал следующий состав реакционной смеси: соотношение СГА:СГАм=0,25:1; а в случае ПМО также СДБто2:сгам = 0,01:1. Однако степени извлечения ДБТ02 (5 мл 2,7 мМ раствора в ацетонитриле, 16 ч) пленками ПС не превышали 5% при неудовлетворительной воспроизводимости, то есть соответствовали таковым при использовании пленок немодифицированного хитозана. Степени извлечения ДБТ02 из раствора пленками ПМО имели отрицательные значения, что обусловлено конкурирующим с сорбцией процессом вымывания темплата из пленки. На основании полученных результатов можно заключить, что использованного количества сшивающего агента было недостаточно для изменения свойств хитозана, однако повысить это значение не представлялось возможным из-за неудовлетворительного удерживания пленок на поверхности подложки.

Для извлечения промазина пленки на основе сшитого хитозана получали в отсутствие органического растворителя, для промывания использовали воду. Полученные пленки извлекали промазин из водного раствора более эффективно, чем описанные выше, однако воспроизводимость результатов была неудовлетворительна. Вследствие этого, полученные путем сшивки хитозана оптически прозрачные пленки оказались непригодными для извлечения целевых соединений.

Получение гелей на основе хитозана и изучение их свойств

Метод ионной сшивки оказался непригодным для получения не только пленок, но и гелей хитозана с МО ДБТ02. Гели, полученные этим методом для извлечения промазина, мало набухали в воде и состояли из множества мелких частиц. При 4-х-кратном промывании гелей водой темплат удалялся более, чем на 74%. Для выбора оптимального состава гелей ПС и ПМО варьировали концентрацию сшивающего агента (СГА:СГАм изменяли в пределах 4:1 - 24:1), однако значимого изменения степени извлечения промазина (23 - 40%) из 0,5 мМ водного раствора добиться не удалось. Полученные гели обладали значительно лучшими сорбционными характеристиками, чем аналогичные пленки, однако низкая воспроизводимость результатов (бг > 0,2) не позволяла использовать их для дальнейшей работы.

При использовании метода ковалентной сшивки в раствор хитозана или смесь хитозан - темплат добавляли ГА; проводили реакцию в течение 2 ч при 50°С, после чего удаляли непрореагировавший сшивающий агент, а из ПМО также темплат. Важным технологическим преимуществом получения гидрогелей по сравнению с получением аналогичных пленок была возможность остановки реакции в нужный момент времени декантацией реакционного раствора и промыванием полученного гидрогеля, что делало методику получения гидрогелей более экспрессной, чем в случае получения пленок. В результате были получены оптически прозрачные гидрогели светло-желтого цвета.

Сравнение органических растворителей (ацетонитрила, ДМСО и этанола) в качестве промывных жидкостей показало, что ацетонитрил непригоден для промывания гидрогелей, поскольку вызывает резкое уменьшение объема гидрогеля -его коллапс. Степень извлечения ДБТ02 из раствора гидрогелями ПМО при использовании ДМСО была выше (43±5%), чем при использовании этанола (31±3%), поэтому для удаления темплата из гидрогелей ПМО выбрали ДМСО.

Гидрогели на основе ковалентно сшитого хитозана для извлечения промазина получали аналогично, но без добавления порогенного растворителя в реакционную

смесь. Для удаления темплата требовалось многократное промывание гидрогелей ПМО водой, однако из-за малой прочности полученных гидрогелей это нарушало их целостность, образовывались плохо отделявшиеся от промывной жидкости частицы. Для удаления темплата и удовлетворительного внешнего вида гидрогелей оптимальными были 12 промывок водой. Для выбора состава гидрогелей поочередно варьировали соотношения Сга:Сгам и Спромюин^СгАм- Все эксперименты проводили с серией гидрогелей, а не с частями одного и того же гидрогеля. Установили, что при соотношениях Сгд:Сгам < 2:1 прочность гидрогелей недостаточна для их промывания и дальнейшей работы с ними. С увеличением соотношения Сга:Сгам прочность гидрогелей возрастала, благодаря повышению степени сшивки полимеров; однако при этом степени извлечения темплата и сорбционная емкость гидрогелей ПМО убывали, по-видимому, в связи с затруднением диффузии темплата к МО. Изменение этого соотношения не влияло на сорбционные характеристики ПС (степень извлечения промазина и сорбционную емкость гидрогелей), которые были несколько лучше или сравнимы с характеристиками ПМО. В качестве оптимального было выбрано соотношении Сга:Сгам = 2:1, обеспечивающее более высокие степени извлечения промазина гелями ПМО, а таюке лучшую воспроизводимость результатов (5Г=0,02). С уменьшением соотношения Спромазин:СгАк. до 0,05:1 возрастали степени извлечения промазина из раствора (предположительно из-за более полного удаления темплата из гидрогелей при промывании), а таюке незначительно повышалась прочность гидрогелей. На основании полученных результатов был выбран следующий состав гидрогелей ковалентно сшитого хитозана: Сгд:Сгам=2:1, Спромазин:СгАм=0,05:1 (для получения ПМО).

Для оценки распознающей способности хитозана с МО промазина изучили сорбцию промазина и пиперазинового производного фенотиазина - трифторперазина на гидрогелях, полученных при выбранном составе. Степени извлечения обоих фенотиазинов гидрогелями ПС были выше, чем гидрогелями ПМО. При этом степень извлечения промазина гидрогелями ПС была примерно в 1,7 раз ниже, чем трифторперазина; т.е. сшитый хитозан имел большее сродство к последнему, обусловленное, по-видимому, образованием водородных связей между тремя его электроотрицательными атомами фтора и свободными аминогруппами хитозана. Напротив, степени извлечения обоих фенотиазинов хитозаном с МО промазина были сравнимы, что свидетельствует об уменьшении сродства хитозана к трифторперазину при формировании в нем МО и о проявляемой им некоторой избирательности по отношению к фенотиазинам.

В отличие от пленок гидрогели сшитых полимеров на основе хитозана обладали лучшими сорбционными характеристиками в отношении ДБТ02 и промазина; характеризовались большей простотой получения и большей эффективностью удаления темплата из ПМО, благодаря возможности их многократного промывания. Однако гидрогели были недостаточно механически прочными. Таким образом, гидрогели оказались перспективными для решения поставленных в работе задач, однако требовалось найти способ сохранения их целостности и измерения формируемого на их поверхности аналитического сигнала. Простым, но многообещающим решением этой проблемы представлялось получение гидрогелей в лунках полистирольных планшетов для иммуноферментного анализа. Эти планшеты удобны для регистрации аналитического сигнала оптическими методами. Кроме того,

подложка из полистирола может обеспечить более прочное удерживание гидрогелей на основе сшитого хитозана за счет гидрофобных взаимодействий, способствуя тем самым сохранению их целостности.

Получение гидрогелей хитозана в лунках полистирольных планшетов и изучение их свойств

Извлечение сульфона дибензотиофена. Для получения гидрогелей в планшетах, как и ранее, сшивающий агент добавляли непосредственно в раствор хитозана или смесь хитозан - темплат, залитые в лунки. Для получения однородных по всему объему лунки гидрогелей чрезвычайно важным оказалось интенсивное перемешивание смеси при добавлении сшивающего агента. Материал планшета ограничивал круг органических растворителей, пригодных для промывания гидрогелей и проведения сорбционных экспериментов. В результате изучения влияния природы полярного органического растворителя (спиртов, ацетонитрила, ДМСО, диметилформамида) на материал планшета, растворимость ДБТСЬ и внешний вид гидрогелей для промывания и изучения их сорбционных свойств выбрали этанол.

Сорбционные характеристики гидрогелей зависят от эффективности взаимодействия полимерной матрицы с целевым соединением. Присутствие в структуре сшитого хитозана ароматических фрагментов может улучшить его взаимодействие с ароматическими темплатами - ДБТО2 и промазином. Учитывая это, получили гидрогели хитозана с использованием алифатического (ГА) и ароматического (ФА) сшивающих агентов. При применении ФА вместо ГА закономерно увеличивалась сорбция ДБТОг на гидрогелях. Независимо от природы сшивающего агента и степени сшивки хитозана сорбция ДБТ02 на ПС всегда была выше, чем на ПМО. Это может быть вызвано различиями в структуре этих двух типов гидрогелей, а также неполным удалением темплата из ПМО на стадии его получения. Соотношение сшивающего агента и ГАм, равное 0,5:1, (как в случае ГА, так и ФА) недостаточно, образующиеся непрочные гидрогели не удерживались в планшете и удалялись при декантации промывной жидкости. При более высоких соотношениях сшивающего агента и ГАм (1:1 -2:1 и 1:1 -4:1 в случае ГА и ФА соответственно) гидрогели хорошо удерживались в лунках планшета, при этом повышение соотношения сшивающего агента и ГАм не оказывало статистически значимого влияния на степень извлечения ДБТ02, как гидрогелями ПМО, так и ПС. Необходимо подчеркнуть, что гидрогели, полученные при использовании ФА, были не только оптически прозрачными, но и практически бесцветными, в отличие от желтых гидрогелей, полученных при использовании ГА (рис. 3). Гидрогели полимеров, сшитых ФА, могут быть использованы для регистрации в них сигнала определяемого соединения в видимой области спектра (/. > 450 нм, А < 0,15).

Таким образом, как сорбционные, так и оптические свойства гидрогелей, полученных с использованием ФА, свидетельствовали о преимуществе этого сшивающего агента перед ГА. При выборе соотношения Сфа:Сгам стремились к одновременному увеличению степени извлечения ДБТ02, уменьшению степени извлечения его менее полярного аналога - ДБТ, а также к снижению оптической плотности гидрогелей. Этим критериям наилучшим образом соответствовало соотношение СфА:Сгам = 2:1, которое и было выбрано для дальнейших исследований (табл.8).

Регистрация ИК спектров немодифицированного хитозана и хитозана, сшитого ФА и ГА, подтвердила присутствие в структуре хитозана фрагментов сшивающих агентов и образование ковалентной сшивки в модифицированном хитозане.

В соответствии с выбранной схемой определения ДБТ было необходимо, чтобы полученные гидрогели были пригодны для извлечения ДБТО из раствора.

Таблица 8. Выбранный состав гидрогелей сшитого хитозана и хитозана с МО ДБТ02

Полимер Сшивающий агент СфА-СгАм Стемплат-СгАм Пороге«, об.%

ПС ФА 2:1 - Ацетонитрил, 30

ПМО 0,05:1

Для ответа на вопрос о возможности использования для этого полученных гидрогелей изучили изотермы адсорбции ДБТО на гидрогелях ПМО и ПС и аппроксимировали полученные данные изотермами Ленгмюра и Фрейндлиха. Оба типа изотерм хорошо описывали адсорбцию ДБТО на ПС. Адсорбция ДБТО на ПМО лучше описывалась эмпирическим уравнением Фрейндлиха, что может свидетельствовать о протекании многослойной адсорбции.

Изучение структуры гидрогелей методом СЭМ показало, что в случае ПС и ПМО она значительно различается (рис. 4). Более того, структура поверхности отличается от структуры в объеме гидрогеля. Так, гидрогель ПС имел развитую, пористую поверхность и плотную гладкую структуру в объеме (рис. 4 а, б). Такая структура гидрогеля ПС объясняет высокую сорбцию на нем исследованных соединений. Напротив, поверхность гидрогелей хитозана с МО ДБТОг была плотной и ровной и напоминала структуру в объеме гидрогелей ПС (рис. 4 в, г). В результате сорбция за счет неспецифических поверхностных сил снижалась и, сорбция на ПМО происходила, по-видимому, по расположенным в объеме гидрогеля специфическим распознающим каналам. Малая доступность этих каналов объясняет более низкие степени извлечения сернистых соединений гидрогелями ПМО, по сравнению с ПС. Напротив, гидрогели ПС и ПМО извлекали все исследованные соединения, но с разной эффективностью. Сорбция всех соединений, и, что особенно важно, целевого соединения - ДБТО, на ПС была несколько выше, чем на ПМО. Этот факт объясняется более высокой пористостью и, как следствие, большей площадью

Рис. 3. Спектры поглощения гидрогелей ПМО (а) и ПС (б), полученных с использованием ФА и ПМО (в) и ПС (г), полученных с использованием ГА. (Мольное соотношение ФА (ГА) и ГАм=2:1; ДБТ02 и ГАм=0,05:1).

поверхности ПС по сравнению с ПМО. Степени извлечения сернистых соединений обоими полимерами убывали в ряду: ДБТО2 ~ ДБТО > ДБТ > 4,6-ДМДБТ.

Рис. 4. Микрофотографии гидрогелей: поверхности (о) и среза (б) гидрогеля ПС; поверхности (в) и среза гидрогеля ПМО ДБТ02(г). Увеличение: 8500 раз.

Соединения, не содержащие кислород, также сорбировались обоими типами полимеров, что обусловлено возможностью гидрофобных взаимодействий их ароматической системы с ароматическим остатком ФА, а также с полисаха-ридной основой хитоза-на. Так, гидрогели ПС и ПМО извлекали ДБТ из раствора, однако хуже, чем продукты его окисления.

Эта зависимость лучше прослеживалась при использовании ПМО, хотя степени извлечения ДБТО и ДБТ02 были близкими, что объясняется схожей структурой этих соединений и способностью их к взаимодействию с хитозаном с образованием водородных связей с его группами. Это свидетельствует о целесообразности сделанного выбора темплата для получения ПМО.

Примечательно, что степень извлечения разветвленного алкшшрованного производного ДБТ - 4,6-ДМДБТ была значительно ниже, чем окисленных производных ДБТ. Это объясняется большим размером молекул 4,6-ДМДБТ, который, по-видимому, препятствует его прохождению в образующиеся поры, что приводит к сорбции за счет неспецифических поверхностных сил. Таким образом, гидрогели сшитого хитозана, а также хитозана с МО ДБТОг пригодны для извлечения

ДБТ02 пктп

ДБТ0 ДБТ 4,6-ДМДБТ

га Хитозан • ПМО □ ПС

Рис. 5. Извлечение производных ДБТ гидрогелями ПС и ПМО, а также пленками хитозана. (Темплат - ДБТ02, Сдбто2:Сгам =0,05:1; СФА:СГАм=2:1; сорбцию проводили из индивидуальных растворов;. п=7, Р=0,95).

целевого соединения - ДЕТО и проявляют некоторую избирательность сорбции по отношению к полярным соединениям. Это свидетельствует о необходимости проведения количественного биокаталитического окисления ДБТ до ДБТО.

Определение супьфоксида дибензотиофена в матрице гидрогелей. ДБТО обладает собственной флуоресценцией, и спектр его испускания имеет максимум в области длин волн (Ае„,) 410 - 430 нм (рис. 6). Мы разработали методики определения ДБТО, адсорбированного на гидрогелях, методом твердофазной флуоресценции с аналитическими характеристиками, мало различающимися при использовании ПМО и ПС (табл. 9).

Таблица 9. Аналитические характеристики методик определения ДБТО в гидрогелях хитозана методом флуоресценции. (п=7, Р=0,95)

Полимер Л=(а±Да)'104с + (Ь±ДЬ) ДОК, мкМ вг при сн

а Да Ь ДЬ

ПМО 2,0 0,1 16,5 0,5 30-900 0,06

ПС 1,4 од 19,0 0,7 30 - 900 0,04

Рис. 6. Спектр испускания 100 мкМ раствора ДБТО в этаноле (длина волны возбуждения 320 нм).

Рис. 7. Спектры поглощения гидрогелей ПМО промазина (а) и ПС (б). (Сфа:Сгам=2:1; Стгмплгт:СгАМ=0,1:1).

Напомним, что разработанная методика предназначена для определения ДБТ, который предварительно окислен до ДБТО. По этой методике можно определить минимально 30 мкМ ДБТО, что при количественной конверсии соответствует 6,5 мкг/г ДБТ. Допустимое содержание серы (в основном, в виде ДБТ и его производных) в дизельном топливе класса Евро-4 составляет 50 мкг/г. Таким образом, разработанные методики перспективны для анализа топлив, удовлетворяющих современным стандартам.

Извлечение промазина. На основании описанных выше результатов для получения гидрогелей с целью извлечения промазина выбрали ФА. Несмотря на отсутствие преимуществ хитозана с МО ДБТО2 перед сшитым хитозаном, ввиду

больших различий в свойствах двух выбранных темплатов представлялось целесообразным сравнение характеристик этих типов полимеров при извлечении промазина. Для удаления избытка сшивающего агента и темплата из гидрогелей использовали многократное промывание этанолом. При выборе состава гидрогелей ПС и ПМО на них изучили сорбцию не только темплата, но и его структурного аналога трифтор-перазина. Оба фенотиазина практически не извлекались из раствора немодифи-цированным хитозаном. Сорбция фенотиазинов на сшитом хитозане во всем изученном диапазоне соотношений Сфа:СгДм (1:1 - 5:1) была сопоставима или превышала таковую на хитозане с МО промазина. Установленные зависимости степеней извлечения промазина от соотношения Сфа:СГДм для ПС и ПМО имели одинаковый характер. На основании того, что и при СфД:Сгам=2:1 степень извлечения промазина обоими типами полимеров была максимальна и не меньше таковой для его структурного аналога, это соотношение было выбрано для получения гидрогелей. Варьирование С-гемши^СгАм (в диапазоне 0,1:1 - 0,3:1) показало, что при его увеличении степень извлечения промазина ПМО уменьшается, в то время как степень извлечения трифторперазина остается практически постоянной. Это может быть связано с тем, что при использовании ббльшего количества промазина при получении полимера снижается степень вымывания темплата из полимера при проведении одного и того же числа промывок. Возрастание числа промывок увеличило бы длительность и трудоемкость процесса получения гидрогелей, поэтому для дальнейшего получения гидрогелей было выбрано Стемплэт:СГАм=0,1:1 (табл. 10).

Таблица 10. Выбранный состав гидрогелей на основе хитозана для извлечения промазина

Полимер СфА;СгАм Стсмплат-Срдм Пороген, об.%

ПС 2:1 - Этанол, 30

ПМО 0,1:1

Необходимо отметить, что гидрогели, полученные при выбранном составе, обладали низким поглощением в видимой области спектра (рис. 7). Немаловажным является также то, что поглощение гидрогелей было хорошо воспроизводимым: при длине волны определения промазина (492 нм) оптическая плотность серии гидрогелей ПС, полученных в одинаковых условиях, составила 0,115±0,003, а гидрогелей ПМО 0,128±0,004. Благодаря совокупности оптических и сорбционных свойств, гидрогели на основе хитозана оказались пригодными для спектрофотометрического определения адсорбированного на них промазина.

Изучение изотерм адсорбции промазина на гидрогелях, полученных при выбранном составе, показало, что, как и в случае сорбции на гидрогелях ДБТО, для описания полученных с использованием ПС экспериментальных данных пригодны изотермы Ленгмюра и Фрейндлиха, в то время как случае ПМО результаты лучше аппроксимировались изотермой Фрейндлиха.

Исследование структуры гидрогелей методом СЭМ выявило, что применение в качестве порогена этанола вместо ацетонитрила (который использовали при полу-

чении гидрогелей для извлечения ДБТО), приводило к образованию менее однородных и более пористых гидрогелей (рис. 8).

На поверхности гидрогелей ПС различались неоднородные области, одни из них напоминали губку, другие имели плотную структуру и единичные поры. В объеме гидрогель ПС имел пористую структуру. Гидрогели хитозана с МО промазина имели схожую структуру с гидрогелями с МО ДБТ02 и были более однородны, чем ПС.

Они имели плотную поверхность, в которой были видны поры, а в глубине гидрогеля

располагались вытянутые каналы - МО.

Такое строение гидрогелей ПС и ПМО объясняет наблюдавшееся различие в их сорбционных свойствах: при более пористой структуре гидрогели ПС в большей степени сорбировали соединения, чем гидрогели ПМО.

Для оценки селективности гидрогелей, полученных при выбранном составе, изучили сорбцию на них модельных лекарственных соединений: алифатических (промазина и прометазина) и пиперазиновых (трифторперазина и перфеназина) производных фенотиазина, а также энрофлоксацина — соединения ряда фторхинолонов, применяемого в качестве антибиотика (рис. 9).

Статистически значимой разницы в извлечении различных соединений гидрогелями ПМО и ПС выявлено не было. Оказалось, что полученные гидрогели обладают групповой селективностью в отношении фенотиазинов. В связи с тем, что соединения ряда фенотиазинов являются нейролептическими препаратами и не могут присутствовать в реальных объектах одновременно, проявляемая гидрогелями групповая селективность в их отношении позволяет использовать один сорбент для анализа различных объектов. Высокое сродство хитозана к энрофлоксацину обусловлено наличием в структуре этого антибиотика карбоксильной группы, а также атомов фтора, обладающих высокой электроотрицательностью, обеспечивающих взаимодействие с функциональными группами хитозана. Однако мешать определению фенотиазинов энрофлоксацин не может в силу того, что не является субстратом ПХ и не окисляется в ее присутствии.

¿Шве ■НЯННЁЯНВ*

Рис. 8. Микрофотографии гидрогелей: поверхности (а) и среза (б) гидрогеля ПС; поверхности (в) и среза (г) гидрогеля ПМО Увеличение: 8500 раз.

Определение промазина в матрице гидрогелей. В выбранных ранее условиях (табл. 6) разработали методику пероксидазного определения промазина в матрице гидрогелей хитозана (табл. 11).

Рис. 9. Извлечение различных соединений гидрогелями ПС и ПМО, а также пленками хитозана (СфА:СгАм-2:1; Спромазин:СГАм=0,1:1; условия проведения эксперимента: 1 мМ индивидуальные растворы в этаноле, 16 ч; п=7, Р=0,95).

Таблица 11. Аналитические характеристики методик ферментативного определения промазина в гидрогелях хитозана (п=7, Р=0,95)

Полимер ^2мин=( а±Да)с + (Ь±ДЬ) ДОК, мкМ при с„

а Да Ь ДЬ

ПС 380 20 0,11 0,01 70- 1000 0,07

ПМО 230 9 0,20 0,01 100-2000 0,05

В связи с тем, что в структуре ПМО остается значительное количество темплата (что согласуется с результатами сорбционных экспериментов, рис. 9), в качестве сорбента для извлечения промазина и матрицы для его определения более перспективным следует считать ПС.

***

Настоящая работа является первым исследованием, посвященным применению материалов на основе сшитого хитозана для извлечения и определения серосодержащих органических соединений. Полученные результаты свидетельствуют о непригодности пленок немодифицированного хитозана для извлечения указанных соединений и о необходимости модификации этого полисахарида. В результате сопоставления двух способов модификации хитозана выявлены преимущества

ковалентной сшивки перед ионной, главные из которых заключаются в возможности получения оптически прозрачных гидрогелей и большей универсальности методик получения ПМО за счет вовлечения в круг темплатов не только водорастворимых, но и нерастворимых в воде соединений. Показана перспективность использования для ковалентной сшивки хитозана нового агента - ФА, особенно для получения оптически прозрачных гидрогелей и извлечения ароматических соединений.

Сравнение двух типов материалов на основе хитозана - сшитого хитозана и хитозана с МО продемонстрировало ббльшую сорбцию серосодержащих соединений на первом из них. Причина этого, как показало изучение поверхностной и объемной структуры гидрогелей методом СЭМ, заключается в большей пористости сшитого хитозана по сравнению с хитозаном с МО. Преимущественная сорбция сшитым хитозаном окисленных производных ДБТ свидетельствует о перспективности использования этого материала для выделения продуктов из смеси после проведения биокаталитической конверсии. В то же время проявляемая сшитым хитозаном групповая селективность в отношении фенотиазинов и отсутствие необходимости определения этих нейролептических препаратов при совместном присутствии обусловливает возможность использования одного сорбента для анализа различных объектов, то есть делает его универсальным. Влияние соединений, содержащих карбоксильную и гидроксогруппы и не являющихся субстратами ПХ, может быть устранено на стадии биокаталитического определения. Таким образом, сочетание сорбента, извлекающего целевое соединение и выполняющего роль матрицы при его определении с селективным биокаталитическим окислением или определением целевого соединения (в зависимости от аналита), по нашему мнению, обеспечивает перспективность предложенного подхода для анализа реальных объектов.

ВЫВОДЫ

1. Предложены двухстадийные схемы извлечения и последующего определения производных дибензотиофена и фенотиазинов в сорбентах на основе биополимера хитозана. В соответствии с ними дибензотиофен окисляют до сульфоксида с последующим извлечением последнего гидрогелем сшитого хитозана и определением в матрице сорбента флуоресцентным методом. Напротив, фенотиазины сначала извлекают гидрогелем, после чего их определяют в матрице указанного сорбента по реакции ферментативного (пероксидазного) окисления.

2. Показано, что использование гемоглобина вместо пероксидазы хрена обеспечивает быстрое (за 5 мин) окисление 230 мкМ (50 мкг/г) дибензотиофена пероксидом водорода в присутствии 25 об.% органического растворителя (ацетонитрила) с образованием практически единственного продукта -сульфоксида (98±1%).

3. Предложены способы получения пленок и гидрогелей модифицированного хитозана методами ионной и ковалентной сшивки. Получены гидрогели на основе хитозана, сшитого о-фталевым альдегидом, не обладающие собственным поглощением в видимой области спектра (при 1 > 450 им), что свидетельствует о

перспективности их использования в методе спектрофотометрии. Установлено, что гидрогели сшитого хитозана и хитозана с молекулярными отпечатками, полученные в лунках полистирольного планшета, обладают лучшими оптическими и сорбционными характеристиками, а также лучше удерживаются на носителе, чем аналогичные пленки, полученные на поверхности стеклянной подложки.

4. В результате сравнительного изучения свойств гидрогелей сшитого хитозана и хитозана с молекулярными отпечатками выявлено, что для извлечения сульфоксида дибензотиофена и промазина предпочтительнее применение первого типа материалов в сочетании со стадией биокаталитического окисления аналита. Разработаны методики определения 30 - 900 мкМ сульфоксида дибензотиофена в матрице гидрогелей методом флуоресценции и ферментативного определения 70 мкМ - 1 мМ промазина методом спектрофотометрии.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих

статьях:

1. Борзенкова Н.В.. Веселоеа H.A., Шеховцова Т.Н. Возможности искусственных рецепторов в повышении селективности определения субстратов оксидоредуктаз. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2012. Т. 53. № 5. С. 291 - 311.

2. Борзенкова Н.В., Веселоеа H.A., Шеховцова Т.Н. Биохимические методы обессеривания углеводородного сырья. Обзор // Усп. совр. биол. 2013. Т. 133. № 1. С. 63 - 80.

3. Борзенкова Н.В., Веселоеа И.А., Шеховцова Т.Н. Применение гемсодержащих биокатализаторов для окисления и определения сероорганических соединений. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2013. Т. 54. № 2. С. 92 - 101.

и тезисах докладов:

1. Борзенкова Н.В. Конверсия дибензотиофена в присутствии гемсодержащих биокатализаторов. XVIII Международная научная конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Москва, 2011, 6 - 9 апреля.

2. Борзенкова Н.В.. Веселоеа И.А., Шеховцова Т.Н. Окислительное обессеривание дизельного топлива с использованием пероксидазы хрена и гемоглобина. Республиканская научно-практическая конференция (с международным участием) «Зеленая химия» - в интересах устойчивого развития». Самарканд, 2012, 26 - 28 марта. С. 175-177.

3. Борзенкова Н.В.. Шеховцова Т.Н. Определение фенотиазинов с помощью гемсодержащих биокатализаторов в водной и водно-органической средах. VI Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев - 2012». Санкт-Петербург, 2012, 3 - 6 апреля. С. 50 - 52.

4. Борзенкова Н.В.. Кислая A.B. Применение гемсодержащих биокатализаторов для определения фенотиазинов. XIX Международная научная конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012». Москва, 2012, 9 -14 апреля. С. 12.

5. Борзенкова Н.В., Шеховцова Т.Н. Хитозан с молекулярными отпечатками - новый сорбент для селективного извлечения фенотиазинов. VII Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев - 2013». Санкт-Петербург, 2013, 3-6 апреля. С. 100-101.

6. Борзенкова Н.В. Селективное извлечение серосодержащих соединений с помощью гидрогелей хитозана. XX Международная молодежная научная конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013». Москва, 2013, 8-13 апреля.

7. Veselova I.A., Rodionov Р. К, Malinina L.I., Borzenkova N. V.. Shekhovtsova T.N. Optical biosensors for the determination of biologically active compounds in samples with complex matrices. Book of abstracts of 3rd International Conference on Bio-Sensing Technology. Spain. Sitges, 2013, May 12 - 15. P. 82.

8. Заявка на патент N 2012155428. Метод биокаталитической конверсии дибензотиофена. Дата подачи заявки: 20.12.2012.

Автор выражает искреннюю благодарность проф., д.х.н. А.В. Пирогову, к.х.н. А.А. Бендрышеву и к.х.н. Е.Б. Пашковой за помощь в проведении экспериментов методом ВЭЖХ; проф., д.х.н. М.А. Проскурнину и м.н.с. Д.С. Волкову за проведение экспериментов методом ИК-спектроскопии и помощь в обсуждении результатов; к.х.н. И.Э. Власовой за проведение экспериментов методом СЭМ; д.х.н. H.JI. Клячко за предоставление планшетного спектрофотометра; к.х.н. В.П. Кислому за синтез препарата сульфоксида дибензотиофена; проф., д.х.н. С.Г. Дмитриенко за ценные замечания при обсуждении результатов.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (госконтракт №П991 от 27.05.2010 и соглашение 8448 от 31.08.2012) и РФФИ (гранты: №09-03-00823-а и 12-03-00249-а).

Подписано в печать 23.05.2013. Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического факультета МГУ Тираж 100 экз. Заказ № 20

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Борзенкова, Наталья Витальевна, Москва

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Химический факультет Кафедра аналитической химии

04201357945

На правах рукописи

Борзенкова Наталья Витальевна

02.00.02 - Аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н., проф. Т.Н. Шеховцова

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................9

Глава 1. Серосодержащие гетероциклические субстраты оксидоредуктаз........9

1.1. Дибензотиофен..................................................................................................................10

1.1.1. Способы пробоподготовки топлива........................................................11

1.1.2. Окисл ение дибензотиофена......................................................................16

1.1.3. Сравнительная характеристика катализаторов

окисления дибензотиофена.....................................................................................17

1.1.4. Биокаталитическое окисление дибензотиофена.....................................19

1.1.5. Способы повышения стабильности гемсодержащих биокатализаторов.....................................................................................................24

1.2. Фенотиазины.........................................................................................................25

1.2.1. Биокаталитическое окисление фенотиазинов.............................................29

Глава 2. Сорбенты на основе хитозана......................................................................33

2.1. Общие сведения о хитозане.............................................................................34

2.2. Использование хитозана для получения полимеров с отпечатками............36

Глава 3. Полимеры с молекулярными отпечатками.............................................39

3.1. Извлечение дибензотиофена и его производных..........................................41

3.2. Извлечение фенотиазинов...............................................................................43

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................................47

Глава 4. Исходные вещества, посуда, аппаратура, обработка

результатов измерений, методика эксперимента...................................................47

4.1. Исходные вещества...........................................................................................47

4.2. Посуда, аппаратура............................................................................................49

4.3. Методики эксперимента ..................................................................................50

4.4. Обработка результатов измерений.................................................................60

Глава 5. Обоснование выбора схем определения, биокатализаторов

и сорбционных материалов..........................................................................................61

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................................66

Глава 6. Окисление серосодержащих соединений в водной и в водно-органической средах.......................................................................................66

6.1. Окисление ДБТ в водно-органической среде................................................66

6.2. Окисление фенотиазинов в водной и водно-органической средах.............73

6.3. Определение фенотиазинов в водной и водно-органической средах.........81

6.4. Определение промазина методом фиксированного времени......................85

Глава 7. Получение пленок полимеров на основе хитозана и изучение

их свойств........................................................................................................................87

7.1. Использование ионной сшивки хитозана.........................................................89

7.1.1. Получение пленок для извлечения промазина..........................................89

7.1.2. Получение пленок для извлечения сульфона дибензотиофена...............92

7.2. Использование ковалентной сшивки хитозана................................................93

7.2.1. Получение пленок для извлечения сульфона дибензотиофена...............93

7.2.2. Получение пленок для извлечения промазина........................................100

Глава 8. Получение гелей на основе хитозана и изучение их свойств .............105

8.1. Использование ионной сшивки хитозана.......................................................105

8.1.1. Получение гелей для извлечения сульфона дибензотиофена ...............105

8.1.2. Получение гелей для извлечения промазина...........................................105

8.2. Использование ковалентной сшивки хитозана..............................................110

8.2.1. Получение гелей для извлечения сульфона дибензотиофена ...............110

8.2.2. Получение гелей для извлечения промазина...........................................115

Глава 9. Получение гидрогелей хитозана в лунках

полистирольных планшетов и изучение их свойств ...........................................124

9.1. Получение гидрогелей для извлечения сульфона дибензотиофена.........125

9.1.1. Выбор условий получения гидрогелей.....................................................125

9.1.2. Выбор состава гидрогелей.........................................................................129

9.1.3. Изучение сорбционных свойств гидрогелей............................................138

9.1.4. Определение сульфоксида дибензотиофена в матрице гидрогелей......142

9.2. Получение гидрогелей для извлечения промазина....................................144

9.2.1. Выбор условий получения гидрогелей.....................................................144

9.2.2. Выбор состава гидрогелей.........................................................................145

9.2.3. Изучение сорбционных свойств гидрогелей............................................148

9.2.4. Определение промазина в матрице гидрогелей.......................................154

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................157

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................158

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБТС - 2,2'-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГА - глутаровый альдегид

Гб - гемоглобин

ГАм - глюкозамин

ДБТ - дибензотиофен

ДБТО - сульфоксид дибензотиофена

ДБТ02 - сульфон дибензотиофена

4,6-ДМДБТ - 4,6-диметилдибензотиофен

ДМСО - диметилсульфоксид

ДОК - диапазон определяемых концентраций

МО - молекулярные отпечатки

МС - масс-спектрометрия

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды ПМО — полимер с молекулярными отпечатками ПС - полимер сравнения ПХ - пероксидаза хрена

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ФА - о-фталевый диальдегид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Кт - константа Михаэлиса

кш - каталитическая константа скорости

ВВЕДЕНИЕ

(3-циклодекстрин-гемин, гематин и др.); однако наиболее каталитически активен из них дешевый, доступный коммерческий препарат гемоглобина (Гб) из крови быка. Для повышения практической значимости методик, основанных на указанном подходе, важно сравнение эффективности и стабильности хорошо изученного фермента ПХ и ее гемсодержащего аналога белка Гб в процессе превращения упомянутых субстратов в водной и водно-органической средах. Для успешной реализации такого подхода используемый сорбент должен не только обладать хорошими сорбционными характеристиками и извлекать определяемые соединения или их различные формы из матрицы объекта, но и быть оптически прозрачным и обеспечивать простоту регистрации аналитического сигнала, формируемого в его объеме и на поверхности. В качестве матрицы таких сорбентов перспективен полисахарид хитозан, хорошо зарекомендовавший себя в аналитической практике. Актуально получение сшитых материалов на его основе: модифицированного (сшитого) хитозана и хитозана с молекулярными отпечатками (МО), а также применение их в виде двух типов сорбентов: пленок и гелей.

Цели работы заключались в:

• выработке подходов к определению средне и трудно окисляемых субстратов с использованием ПХ и Гб;

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

о оптимизировать условия проведения реакций окисления ДБТ и фенотиазинов в водной и водно-органической средах;

о выбрать оптимальный состав пленок и гелей сшитого хитозана и хитозана с

МО промазина или ДБТОг, получаемых ионной и ковалентной сшивкой; о изучить морфологию, сорбционные характеристики и селективность

полученных пленок и гелей; о выбрать условия определения ДБТ и фенотиазинов в матрице сорбента.

Научная новизна работы. Предложены новые оригинальные подходы к двухстадийному определению серосодержащих субстратов оксидоредуктаз (на при-мере промазина и ДБТ) методами спектрофотометрии и флуоресценции. В результате систематического изучения окисления фенотиазинов (промазина и хлорпромазина), катализируемого ПХ и Гб, показаны аналитические перспективы использования этих биокатализаторов в водной и водно-органической средах. Выявлены значительные преимущества белка Гб перед ПХ в окислении ДБТ. С использованием Гб впервые достигнута количественная конверсия 230 мкМ ДБТ с высокой селективностью выхода продукта - сульфоксида (ДБТО) (98±1%) в течение 5 мин.

На основе биополимера хитозана предложены новые сорбционные материалы - пленки и гидрогели, полученные путем сшивки серной кислотой, глутаровым (ГА) и о-фталевым (ФА) альдегидами. Продемонстрированы преимущества использования ФА по сравнению с ГА для получения оптически прозрачных гидрогелей. Получены оптически прозрачные (в видимой области спектра) гидрогели ковалентно сшитого хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТ02, обеспечивающие извлечение этих серосодержащих соединений из растворов. Показаны преимущества использования гидрогелей сшитого хитозана перед гидрогелями хитозана с МО для извлечения и последующего определения в сорбенте фенотиазинов и производных ДБТ.

предпочтительнее; напротив, при конверсии трудно окисляемого субстрата ДБТ исключительными преимуществами обладает белок Гб.

Предложены простые и экспрессные методики получения пленок и гидрогелей сшитого хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТ02, в том числе в лунках полистирольного планшета. Разработаны простые и экспрессные методики биокаталитического определения промазина и хлорпромазина в водной среде и в присутствии ДМСО, а также методики определения промазина и ДБТО в матрице гидрогелей хитозана.

Автор выносит на защиту:

■ результаты изучения окисления ДБТ пероксидом водорода, катализируемого Гб в водно-органической среде;

■ методики биокаталитического определения промазина и хлорпромазина в водной среде и в присутствии ДМСО;

* установленные условия получения гидрогелей сшитого ГА и ФА хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТОг;

■ данные по изучению оптических и сорбционных свойств гидрогелей сшитого хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТ02;

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы систематизированы и обсуждены сведения из научных публикаций, посвященных окислению (в том числе ферментативному) серосодержащих субстратов ПХ и извлечению их из объектов с помощью полимеров с молекулярными отпечатками, а также получению и свойствам таких полимеров на основе хитозана.

Глава 1. Серосодержащие гетероциклические субстраты

оксидоредуктаз

Серосодержащие гетероциклические субстраты оксидредоредуктаз и, в частности, широко используемой в аналитической практике ПХ, включают два класса соединений - фенотиазины и производные ДБТ. Эти субстраты обладают схожей структурой (имеют трехядерную ароматическую гетероциклическую систему, содержащую атом серы), но разными свойствами. Так, ДБТ и его алкилированные производные нерастворимы в воде, а фенотиазины способны образовывать растворимые в воде соли. Фенотиазины и производные ДБТ не относятся к «классическим» субстратам ПХ, и по скорости окисления их можно отнести к средне и трудно окисляемым субстратам соответственно.

Изучение катализируемого ПХ окисления указанных серосодержащих субстратов (на примере их модельных представителей - ДБТ и хлорпромазина) для решения аналитических задач ранее не проводилось. По этой причине мы рассмотрим литературные данные, посвященные биокаталитической конверсии ДБТ и направленные на решение технологических задач, стоящих перед современной нефтеперерабатывающей промышленностью. Кроме того, ввиду отсутствия сведений о ферментативном определении фенотиазинов, уделим внимание окислению этих соединений, изученному с целью определения Гб и его каталитической активности, а также моделирования путей метаболизма этих лекарственных препаратов в живых системах. Анализ указанной литературы, по нашему мнению, необходим для выявления путей решения непосредственно аналитических задач.

1.1. Дибензотиофен

Сгорание моторного топлива приводит к загрязнению окружающей среды аэрозолями и различными газами (оксидами серы и азота). Оксиды, взаимодействуя с парами воды в атмосфере, образуют серную и азотную кислоты, которые становятся компонентами кислотных дождей. Ухудшение экологической обстановки способствует развитию различных заболеваний у человека. Наличие серы снижает эксплуатационные качества топлив и масел, вызывает коррозию аппаратуры, уменьшает активность антидетонаторов и антиокислительную стабильность топлива [1]. Сера отравляет каталитические конвертеры в автомобильных выхлопных системах, снижая их эффективность и способствуя загрязнению воздуха в городах [2].

Для снижения вредного воздействия серы на окружающую среду и здоровье человека в большинстве стран ее содержание в топливе с каждым годом все более жестко регламентируется (табл. 1). Так, в ЕС, США и Японии допустимое содержание серы в топливе в настоящее время составляет 15 мкг/г. С 1 июля 2006 года в РФ в соответствии с ГОСТ Р 52368-2005 (ЕН 590:2004) установлено допустимое содержание серы не более 350 мкг/г для топлива вида I, 50 мкг/г - для вида II и не более 10 мкг/г - для вида III (топливо, не содержащее серы, или сверхчистое топливо).

Таблица 1. Нормативы по содержанию серы в