Методы определения ртути (II), кадмия (II), висмута (III) с использованием пероксидазы хрена тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

РГБ ОД

- о МАЙ Ш5

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА. ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. Ломоносова

Химический факультет

на правах рукописи

ЧЕРНЕЦКАЯ Светлана Валентиновна

УДК 54331 : 543.866

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РТУТИ 01), КАДМИЯ (II), ВИСМУТА <Ш) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1995

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета

Научные руководители: кандидат химических наук, доцент Шеховцова Т. Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Кузьмин Н. М.

кандидат химических наук, доцент Осипов А .П.

Ведущая организация: Российский химико-технологический университет им. Д И Менделеева

Защита состоится "25° мая 1995 г. на заседании диссертационного совета Д. 053. 05. 60. по химическим наукам при Московском государственном университетет им. М. В. Ломоносова в ауд. 337 Химического факультета в 16 ч.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Химического факультета МГУ

Отзывы и замечания просим направлять по адресу:

119899 ГСП, Москва В-234, Воробьевы горы, МГУ, Химический факультет,

кафедра аналитической химии, ученому секретарю диссертационного

совета

Автореферат разослан^^ опрели 1995 г. Ученый секретарь диссерта-

ционного совота

Актуальность. Важной задачей химического анализа является определение микроколичсств таких токсичных ионов металлов, как ртуть(11), кадмий(Н), а также писмута(Ш) в самых разных о&ьсктах -окружающей среды, продуктах питания, медицинских препаратах.

В связи с этим одна из актуальных проблем аналитической химии -разработка высокочувствительных, селективных и в то же ¿ремя простых и экспрессных методов определения указанных выше ионов металлов м некоторых их соединений, таких, например, как ртутьорганические соединения.

В этих целях целесообразно использовать биологические катализаторы - ферменты. Их высокая каталитическая активность дает возможность определять очень малые количества многих веществ, в том числе и ионов металлов.

Следует отметить при этом, что определите многих веществ,-влияющих на каталитическую активность ферментов, - их эффекторов, к которым в большинстве случаев и относятся ионы металлов, не является селективным. Одним из способов повышения не только чувствительности, но и селективности методов определения ионов металлов является использование одновременно с ионами металлов некоторых органических эффекторов.

Для разработки ферментативных методов определения ртути(11), кадмия(Н), висмута(Ш) была выбрана пероксидаза хрена, так как это доступный, относительно дешевый, промыщлешю выпускаемый фермент. Было показано ранее, что ртуть(Ц), кадмий(П), висмут(Ш) оказывают иншбярующее влияние на лероксидазу, усиливающееся в присутствии некоторых серосодержащих соединений.

Иммобилизованная пероксидаза для определения эффекторов ранее не использовалась. В то же время известно, что иммобилизация ферментов позволяет удешевить и упростить анализ, создавать на основе иммобилизованных ферментов тест-устройства.

Цель настоящей работы - на основе изучения индивидуального и совместного действия ионов ртуги(11), кадмия(П), висмута(Ш),

ртугьорганических соединений и серосодержащих веществ на нашвную пероксидазу разработать высокочувствительные и селективные методы определения указанных выше соединений; разработать также тест-методы определения ртути(Н) с использованием иммобилизованной пероксидазы.

Научная новизна заключается в том, что

- на примере пероксидазного окисления ароматических диаминов

показана целесообразность изучения совместного действия двух

эффекторов (ионов ртути(11), кадмия(11), висмута(Ш) или ртугьорганических соединений с одной стороны и серосодержащих веществ с другой стороны) на каталитическую активность фермента в целях разработки чувствительных и селективных методов их определения;

- установлено, что характер действия одного и того же эффектора (иона металла или рпутьорганического соединения) в зависимости от природы второго эффектора (серосодержащего вещества) может быть различным. Так, различные серосодержащие соединения могут усиливать ингибирующее действие металлов; ионы металлов в свою очередь могут изменять характер действия серосодержащего вещества, выступающего в роли второго субстрата пероксидазы; а введение в ферментативную систему метил ртути приводит к либеративному эффекту, т.е. к ослаблению ингибирующего действия на пероксидазу ряда серосодержащих соединений;

- различное действие серосодержащих соединений использовано для повышения чувствительности и селективности определения ионов ртути(И), кадмия(П), висмута(Ш);

- изучено влияние на пероксидазу разных форм ртуги(11), в частности, ртугьорганических соединений, в реакциях окисления ароматических диаминов в отсутствие и присутствии серосодержащих веществ; разработаны методы определения метил-, этил- и фенил ртути;

- предложен новый способ иммобилизации пероксидазы хрена с использованием хитозана;

-иммобилизованная псроксидаза использована для высокочувствительного определения ртути(И);

- для высокочувствительного и селективного определения ионов железа(Ш) использовано его реактивирующее действие на апофермент пероксидазы хрена.

Практическую ценность имеют разработанные с использованием реакций перокендазного окисл«шя о-дианизидита, о-фешшендиамина, о-толидина, 3,3',5,5'-'гетраметилбснзид1ша ферментативные методы:

- определения ртути(И) (Ся=0,1ш,/мл) и кадмия(Ц) (С,л=0,05мкг/мл) по их ингибирутощему действию на каталитическую активность пероксидазы в присутствии тиомочевины и диэтилдитиокарбамшгата натрия ( ДЭДТК Соответственно;

- определения вясмута(Ш) и ртутьорганических соедшшпш по их действию на продолжительность индукционного периода в присутствии ДЭДТК и нативной пероксидазы с С„ 0,05 мкг/мл и 0,05 -0,1 мкмоль/л соответственно;

- полуколичественного определения на уровне 0,1 мкмоль/л метил ртути по ее либеративному действшо на ингибиторы пероксидазы -фенилтиомочешпгу и дитиотреитол;

- определения ряда органических кислот (Сн=10 пмоль/л-0,01ммоль/л), i системна (С„=0,1 мкмоль/л), хлористого тиофенола (Сц=0,1 мкмоль/л), а также фторид- и цнашвд-ионов с Сн 500 и 0,8 нмоль/л соотвстствапю по го ингибиругощему действшо на активность пероксидазы;

определения ионов железа(Ш) (Сц=10 пг/мл) по его реактивирующему действию на катнвную пероксидазу хрена, предварительно ингнбирогшшую салициловой кислотой;

- определения ионов ртутн(11) (Csi= 0,1 пг/мл - 0,01 нг/мл) по их 1шшбирующему действию на пероксидазу, иммобнлизошипгую в хотозанс в ячейках полистирольного платгшета и из бумагах.

Разработаны методики определения микрокодияеетв ионов ртути(1Т) на уровне ПДК с использованием натипной пероксидазы в природной воде в присутствии больших количеств желсзз(Ш); кадмия(П) в почве; ионов железа(Ш) в особо чистой воде.

На основе пероксидазы, иммобилизованной в хипозанс в ячейках полистирольного планшета, создано и иромъшигашо выпускается тест-устройство для определения микроколичеств рггути(П) в природных водах.

Автор выносит на защиту:

1. Результаты изучения индивидуального и совместного действия на процесс иероксидазного окисления о-дианизидина "ионов ртуги(П), кадмия (И), висмута(Ш), ртутьоргашшеских соединений и серосодержащих ингибиторов. Механизмы индивидуального влияния на фермент указанных выше веществ и предположения о причинах их совместного действия.

2. Ферментативные методы:

- определешш ионов ртути(11)| кадмия(П), основанные на их шпибирующем действии на активность нативной пероксидазы в реакции окисления ароматических аминов в присутствии тиомочеяины и ДЭДТК с Сл 0,01 нг/мл и 0,05 мхг/мл соответственно;

- определения висмута(Ш) и ртутьорганических соединений (метил-, этил- и фенил ртути) по изменению величины индукционного периода в присутствии ДЭДТК ( €,[=0,05 мкг/мл; 0,1; 0,5; 1 мкмоль/л соответственно);

- определения (10 пмоль/л - 0,01 ммоль/л) органических кислот, цистеина (<^¡=0,1 мкмоль/л), хлористого тиофенола (Сн= 0,1 мкмоль/л), фторид- (0,5 мкмоль/л) и цианид- (0,8 нмоль/л) ионов по их ингибирукяцему действию на лероксидазу;

- тест-метод определения микроколичеств ртути(11) но ее ингибирующему действию на лероксидазу, иммобилизованную в ячейках полистирольного планшета ( Сц= 0,1 - 50 пг/мл ) и на бумаге (Сц = 0,010,04 нг/мл).

3. Ферментативные методики определения: ртути(Н) в подземной воде; кадмия(И) в почве; железа(ПГ) в особо чистой воде.

4. Способ иммобилизации пероксидазы в хитозан с использованием носителей - полистирола и бумаг.

5. Тест-устройство для определения микроколичеств ртути(И) в природных водах.

Апробация работы. Основные результата работы доложены на IV Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (г. Москва, 1991 г), Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-94" (г. Краснодар, 1994 г), II Международном симпозиуме по аналитическим наукам (Швейцария, Монтрё, 1994 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ в виде статей и тезисов. Получен патент РФ и положительное решение на заявку на патент.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава I), экспериментальной части (главы II-IX), выводов и списка литературы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного

текста, содержит 97 рисунков, 31 таблицу и библиографию из 166 названий.

Содержание работы

В работе использовали лиофилшо высушенные твердые препараты иерокелдазм хрена (К.Ф. 1.11.1.7) фирм "Reanal" (Венгрия) (RZ=0,£>; активность 300 уд.сд./мл) и "ДИАМ" (Россия) ( RZ=0,4; активность 250 уд.ед./мл). Оптическую плотность растворов измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-2, спектрофотометре СФ-46 и колориметрическом анализаторе АКИ-Ц-01 (О КБ А, г. Йошкар-Ола).

Использовали микропипспси фирмы "Vari-3000" типа А-20 и А-200 . (Польша). рН растворов измеряли с помощью потенциометра рН-121 с точностью ±0,04.

Скорость реакции характеризовали величиной тангенса угла наклона ( tga ) прямых в координатах оптическая плотность - время ( t,ceK ), либо величиной оптической плотности, измеренной через фнксировашшй промежуток времени (Агмин. )•

Изучение влвяпяя ионов рггути(П), кадмия (II), висиута(Ш) ва скорость перокендазиого окисления о-дианизвдпиа

При изучении влияшм ионов металлов на каталитическую активность иероксидазы в качестве индикаторной использовали

атализирусмую этим ферментом реакцию окисления о-дианизидина псроксидом водорода, поскольку кинетика и механизм се довольно хорошо изучены. Оптимальные условия проведения реакции лероксидазного окисления о-дианизидина следующие: концентрация пероксидазы - 0,6 1Шоль/л, о-дианлзидииа - 50 мкмоль/л, пероксида водорода - 50 мкмоль/л, фталаташй буферный раствор с pH = 5,0. Установили, что ионы ртути(И), кадмия(И), висмута(Ш) оказывают слабое ингибирующее действие на фермент, проявляющееся при концентрациях ртути(П) 0,025 - 0,1 мкг/мл, кадмия(П) и впсмута(Ш) - sl мкг/мл.

Результаты иселсдовашга механизма ингибирования методами разбавления и линеаризации кинетических кривых в координатах Лайнуивера - Берка (1/W-1/[S]0) свидетельствуют о том, что висмут(Ш) является необратимым ингибитором пероксидазы в реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода. Ионы ртути(П) и кадмия(П) выступают в качестве обратимых ингибиторов фермента. Ргуть(П) конкурирует с о-дианизидином за взаимодействие с функциональными группами пероксидазы. Таковой в молекуле фермента, на наш взгляд, может быть имидазольная группа гистидина, с которым ртуть(Ц) образует более устойчивый комплекс, чем кадмий(П) и кисмут(Ш). Кадмий(И) и о-дианизидин взаимодействую!, судя по полученным дашшм, с различными участками молекулы пероксидазы, причем связывание кадмия(П) с ферментом не влияет на сродство к последнему о-дианизидина.

Пероксидазное окисление о-дианизидина в присутствии серосодержащих

соединений

Ранее было показано, что ингибирующее действие ионов ртути(И), кадошя(И), и висмута(Ш) усиливается в присутствии серосодержащих соединений - тиомочевшш или 1,3-дитиотреитола. В целях повышения чувствительности и селективности определения ионов ртути(И), кадмия(И), висмута(Ш) исследовали влияние указанных ионов на каталитическую активность пероксидазы в присутствии серосодержащих соединений.

Детально изучили влияние на фермент серосодержащих веществ, ингибирующее действие которых было обнаружено ранее, их производных, а также неизученных классов серосодержащих соединении, в частности, аминокислот.

Результаты исследований показали, что серосодержащие сосдннашя, изученные в широком интервале концентраций 0,1 мкмоль/л - 10 ммоль/л, проявляют рах'шчпос но степени и характеру ингибирующее действие на фермент.

Кинетические кривые в присутствии тиомочевзшм, ацетил-, фенил-, S-бензил-, даортотолилтиомочевшш, 1,2,4-триазолтиода, а также тетраметилтиурамдисульфвда прямолинейны в промежутке времени наблюдения за скоростью ферментативного процесса (2 - 2,5 мин), причем чем выше их концентрация, тем меньше скорость индикаторной реакции.

На кинетических кривых в присутстиш ДЭДТК и тиосалициловой кислоты, а также хлористого таофенола и цистсипа в интервалах нх концентраций, указшошх в табл.1, наблюдается индукционный период, продолжительность которого возрастает с увеличением концентрации серосодержащего соединения. Тангенс угла наклона второго участка кинетических кривых, характеризующего процесс ферментативного окисления о-дианизидина, при этом уменьшается (рис.1). Нами было показано, что серосодержащие соединения II группы являются вторыми субстратами пероксидазы в реакции окисления о-даштзидина, окисляясь в присутствии пероксидазы легче и раньше о-диангоцвдта. Механизм их ингибирующего действия включает конкурентное взаимодействие двух субстратов с ферментом, а также их взаимодействие с промежуточным продуктом окисления о-дишшзидина. Ингибирование пероксидазного окисления о-дианизидина при этом обусловлено, по-видимому, несколькими причинами: либо влиянием на пероксидазу недоокислившетося в течение индукциошюго периода серосодержащего соединения, либо влиянием на скорость индикаторного процесса продукта окисления пероксидом водорода серосодержащего соединения, либо одновременно двумя вышеуказанными причинами.

7

4

Таблица 1

Влияние серосодержащих соединений на скорость пероксидазного окисления

о-дканизидика

Группа Название соединения Формула Интервал концентраций Характер действия на фермент *рноот ♦Влияние врем, инкуб, с ферментом

Тиомочевина NHr ^-NH2 0,1 мхмоль/л - t ммоль/л ингибитор 5,0-5,5 влияет

Ацетилтиомо-чевина СНз gNH jfNHj 0,5-10 ммол»/л Ингибитор 4,0 слабо влияет

Фститюмо-чевина CgHjNH^NHj 0,05 - 1 ммоль/л ингибитор 5,0 —

♦S-Бензил-тиомочевнна C6H5CH2NH<jjNHj < 1 ммоль/л 1-10 ммоль/л слаб, ингиб. —

I ♦Диортотолил-тиомочевина H2N|NH^6H3NH|NH2 <0,1 ммоль/л 0,1 -1 ммоль/л слаб, ингиб. 4,0

♦Тетраметвл- тиурамдисуль- Фия ((CH3)2N<jjS)a 0,01 - 1 ммоль/л >1 ммоль/л опалесцешшя раствора

1,4-Дитиотре-итол ÇH2-ÇH-CH<;H2 SH OH OH SH 0,1-100 мкмоль/л ингибитор 4,0 - 5,0 —

1,2,4-Триаэол-тиол C^i tjsH 1 - 100 мкмоль/л ингибитор

♦Хлористый тиофенол HS-C 6HtCI 0,01 - 50 мкмоль/л ивд. период ---- г1мУв. '8аП vt Ув-

Тиосалиця-ловая к- та HOOCC 5H-3SH 0,5-100 мкмоль/л ивд. период 4,0 *ж У* . tgetu V, ув

II ♦Цистеин HS CH2CHg=0 0,1 - 0,8 мкмоль/л 50 - 100 мгмоль/л 1- 50 мкмоль/л ингибитор ингибитор ивд. период 4.5-5.5 (инд. период) Usa У®. t8<*H „ практич. неизм

ДЭДТК (C2H5)2N^SNa 5 - ЮОмкмоль/л > 100 мкмоль/л или. период стон-реагент 4,5-5,5 W исчезает , tgan у, укенып.

данные, полученные впервые

Таким образом, на основании полученных нами экспериментальных данных можно заключить, что все исследуемые серосодержащие соединения объединяет аналогичный характер влияния на скорость пероксидазного окисления о-дианизидина. Отличие их состоит в том, что действие одних серосодержащих соединетгй, которые мы отнесли к первой группе в табл.1, I, заключается только в ингибировантг каталитической активности фермента. Во вторую группу мы объединили соединения, приведешше в табл.1, II, действие которых проявляется не только в шггибироваиии пероксидазы, но и в том, что па кинетических кривых в их присутствии появляется индукционш.ш период.

Характер зависимости скорости пероксидазного окислетпш о-дианизидина от рН одинаков для всех изученных серосодержащих соединений что связано, по-видимому, с тем, что состоя!П1е серы в молекулах рассматриваемых веществ одно и то же, а следовательно, близки и их кислотно-основные свойства, но выражены они в большей или меньшей степени. В то же время продолжительность индукционного периода для разных серосодержащих веществ II группы зависит от рН по разному. Это свидетельствует о другом механизме их влияния на скорость ферментативного процесса, который заключается, очевидно, в том, что эти соединения окисляются пероксидом водорода в присутствии ■ перокевдазы легче и раньше о-дошшзидина. Поскольку продукты их окисления не поглощают в той области спектра, в которой скорость реакции измеряется по поглощению продукта окисления о-дианизидина, оптическая плотность 1-го участка (рис.1) кинетической кривой не изменяется. Окисшпельно-восстановитетышс свойства соединений II группы могут различным образом зависеть от рН среды', что, по-видимому, и объясняет разный характер получешгых зависимостей т,В!Д от рН.

Ингибирующее действие на скорость пероксидазного окисления о-диаиизидина практически всех серосодержащих соединений I и II групп не зависит от времени их предварительного инкубирования с пероксидазой. Исключение составляют гиомочевина и ацетилтиомочевина, в присутствии которых ингибирование фермента протекает во времени. При '

Рис. 1 Вид кинетической кривой о индукционным периодом при различных концентрациях серосодержащего вощосгва II группы (С|(1) <С2(2)<С3(3))

Таблица 2

Характеристика процессов ингибирования пероксидазного окисления о-дианизидина серосодержащими соединениями II группы (п=3; Р=0,95)

Соединение Характер С| для расчета Ктефф*

ингибирования мкмоль/л мкмаль/л

Хлористый смешанный 3 7412

тиофенол 4 106 ±3

8 125 t б

Цистеим смешанный 0,5 4,6 t 0,3

5 28,6 1 0,2

конкурентный 20 2,50 ± 0,09

ДЭДТК 30 0,80 * 0,04

60 0,80 1 0,06

инкубировании тиомочеишш и ацетилтиомочевяны с ферментом они взаимодействуют с псроксидазой обратимо в течение не более 3 мин. Увеличение времстш выдерживания указанных соединений с пероксидазой приводит к их необратимому взаимодействию.

С увеличением времаш тткубировашм с иероксидазой серосодержащих веществ II группы - хлористого тиофенола и цистеина -индукционный период увеличивается. В случае ДЭДТК по мере увеличения времени его выдерживания с перокемдазой индукционный период уменьшается.

В результате изучения механизма действия серосодержащих соединений на пероксидазу установили смешашшй тип ингибирования фермента всеми соединениями I группы, а также хлористым тиофенолом и циститом - представителями II группы. Смешанный тип ингибирования предполагает, что ингибитор действует и на центр связывания о-дианизидина в молекуле пероксидазы, отвегствегашй за.его взаимодействие с ферментом, и на каталитический центр биокатализатора, способствующий превращению уже связашюго субстрата в молекуле белка независимо от того, перекрываются они или нет. При этом образующиеся комплексы {фермент - ингибитор) и {ингибитор - фермент - субстрат} каталитически неактивны. ДЭДТК выступает в качестве конкурентного ингибитора пероксидазы. Рассчитанные величины Кт по о-дианизидину 'для соединений II группы приведены в табл. 2.

Изучение влияния ртути(II), кадмкя(И), впсмута(Ш) и ртутьоргаиических соединений на скорость пероксидазного окисления о-дяакнзндина п присутствии серосодержащих соединений

Изучили влияние ртуги(П), кадмия(11), висмута(Ш) на скорость пероксидазного окисления о-дианнзидина в присутствии исследованных нами серосодержащих соединений I и II групп (табл. 1), а также на величину индукционного периода в присутствии серосодержащих веществ II группы. Кроме того, исследовали влияние на фермент ртутьорганичсских соединении, поскольку данные о их действии на каталитическую активность пероксидазы в литературе отсутствуют.

Установили, что серосодержащие соедииешм I группы -тиомочевина и ацстилтиомочсвина - усиливают ипгибирукацее действие ионов металлов и мегилргути. Совместное действие мсгалргути с остальными серосодержащими соединениями I группы приводит увеличению скорости реакции. Такое действие, когда соединение, не влияющее (или слабо влияющее) на ферментативную активность, может уменьшить или подавить ингибирующий -эффект другого соединения, носит название либеративного действия.

Влияние ионов ртути(11), кадмия(Н), висмута(Ш) в присутствии серосодержащих соединений II группы на нероксидазную активность в процессе окисления о-днанизидоша и величину индукционного периода, характеризующую процесс окисления второго субстрата, различно. Так, висмут(Ш) не влияет на скорость пероксидазного окислешш о-дианизидина в присутствии всех соединений II группы. Ингибирукицее действие ртути(П) и кадмия(П) усиливается в присутствии хлористого тиофенола и ДЭДТК соответствешю. На величину индукционного периода кадмий(11) не оказывает действие в присутствии всех соединений II группы; висмут(П1) изменяет продолжительность индукционного периода только в присутствии ДЭДТК, а ртуть(П) уменьшает индукционный период в присутствии хлористого тиофенола и увеличивает - в случае цистеина. Различие в характере действия ртути(11) на индикаторный процесс в присутствии этих серосодержащих соединений II группы объясняется, по-видимому, различными восстановительными свойствами комплексов, образуемых ими со ртутью.

Таким образом, в присутствии одного и того же. серосодержащего соединения - ДЭДТК, висмут(Ш) и кадопш(11) оказывают влияние на различные процессы. Так, введение 0,05 - 0,5 мкг/мл Еисмута(Ш) в индикаторную систему в присутствии ДЭДТК приводит к сокращению индукционного периода, пропорциональному концентрации металла. Кадмий(11) в том же интервале концентраций в присутствии ДЭДТК гашибируст каталитическую активность псроксидазы тем в большей степени, чем больше его концентрация.

Неизменность величины индукционного периода в присутствии кздмия(П), в отличие от лисмута(Ш), объясняется, по-видимому, значительно меньшей устойчивостью его комплекса с ДЭД'ГК (1&0О1=17,83). Ингибирующее влияние кадмия на перокеидазное окисление о-дианизилипа в отличие от висмута связано, очевидно, с различным механизмом их ингибирующего действия на индикаторный процесс в отсутствии серосодержащих веществ.

ГГри изучении кинетики исроксидазного окисления о-дианизидина при совместном присутствии метилртути и серосодержащих соединений II группы установили, что характер изменения продолжительности индукционного периода и иероксидазной «истинности рахшчен, что может быть связано с образованием комплекса метилртути с серосодержащим веществом. При этом вклад образующегося комплекса зависит от природы серосодержащего лиганда, конца гграциотюго соотношения его и метилртути, устойчивости и окислительно-восстановительных свойетв.Так, например, при совместном присутствии хлористого тяофенола и более чем 10-кратного избытка метилртути, очевидно, образуется комплекс, вследствие чего концентрация свободного хлористого тиофенола (ингибитора пероксидазы) в индикаторной системе уменьшается, а скорость перокеидазного окисления о-дианизидина повышается. Увеличение при этом продолжительности индукционного периода, по-видимому, связано с тем, что образующийся комплекс метилртути с хлористым тиофенолом окисляется пероксидом водорода, в результате чего нарастание оптической плотности реакционного раствора не начинается до тех пор, пока не окислятся хлористый тиофенол и его комплекс с метнлртугыо. При 10-кратном избытке тиосалицнловой кислоты и малых (0,1 -1 мкмоль/л) концентрациях метилртути содержание комплекса, образующегося при их взаимодействии, очевидно, настолько мало, что он не оказывает никакого влияния на индикаторный процесс. При соизмеримых концентрациях (-10 мкмоль/л) каждого из них образующийся комплекс наряду с тиоеалицилоиой кислотой окисляется, ь результате чего нозрастает индукционный период. Падение тангенса угла наклона второго

участка кинетической кривой объясняется, но-видимому, ингибирующим влиянием образовавшегося комплекса на процесс окисления о-дианизидина.

Подтверждение предположения об образовании комплексного соединения мегилртути с серосодержащим соединением получили в результате спектрофотометрического изучения индикаторной системы в присутствии ДЭДТК. Образующееся комплексное соединение ири этом обладает менее сильными восстановительными свойствами, чем свободный ДЭДТК, в результате чего ио мере его связывания в комплекс с увеличешгем концентрации мегилртути уменьшается индукционный • период. При соотношении метилртуть : ДЭДТК=1 : 1 весь серосодержащий органический субстрат связан в комплекс - индукционный период исчезает, зато возрастает скорость окисления о-дианизидина. Другими словами, роль мегилртути в индикаторной реакции сводится в конечном итоге к уменьшению и устранению "конкурирующего" действия второго субстрата псроксидазы. Аналогичным образом, по-видимому, о&ьяснястся влияние мегилртути на величину индукционного периода в присутствии других серосодержащих соединений II группы.

Таким образом, проведенное нами исследование показало целесообразность изучения не только раздельного, но и совместного действия двух эффекторов на индикаторный процесс пероксидазного окисления о-дианизидина. Мы показали, что совместное присутствие иона металла или ртутьорганического соединения и какого-либо серосодержащего вещества может приводить к проявлению различных эффектов:

- усилению ингибирующего действия металлов на пероксидазную активность в реакции окисления о-дианизидина: ртути в присутствии тиомочевины; висмута - днтиотреитола;

- изменению действия серосодержащего соединения: висмуг(Ш) или метилртуть сокращают индукционный период в присутствии ДЭДТК как второго субстрата; ртуть(П) увеличивает продолжительность шщукционного периода в присутствии цистеина; рггуть(П) повышает

скорость пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии хлористого тиофенола, кадмий(П) понижает се в присутствии ДЭДТК;

- проявлению либеративного действия мстил ртути в присутствии фенилтиомочспинм и дитиотрситола.

Характер действия одного и того же эффектора (иона металла или ртутьорганического соединения) может быть различен в'зависимости от природы второго эффектора (серосодержащего вещества). Так, например, в присутствии тиомочевины и дитиотрентола висмут(Ш) является ингибитором фермента. В присутствии ДЭДТК, он связывает этот второй субстрат, изменяя его способность к окислению и не влияет при этом на пероксидазную активность, Метилртуть в присутствии ДЭДТК ведет себя аналогично висмуту(Ш), а в случае большинства серосодержащих соединений I группы выступает либератором их ингибирующего действия на пероксидазу.

Мы установили также, что характер и степень совместного действия двух эффекторов зависит не только от их природы, но и от соотношения их концентраций, а также условий подготовки фермента к воздействию ингибиторов: времени и порядка инкубирования.

Результаты изучения совместного действия ионов ртути(11), кадмия(П), висмута (III) или ртуп,органических соединений и серосодержащих веществ использовали для разработки новых методик определения указанных соединений.

Ферментативные методы определения рггутя(И), кадмия(П), висмута(Ш) и ртутьорганических соединений С целью повышешш чувствительности определегатя ртути(П) в присутствии тиомочевины, мы расширили круг индикаторных реакций: помимо использованных ранее в качестве субстратов при определении Р1ути(11) при рН=5,0 о-диашиидоша (о-Д), о-фенилендиамина ( о-ФДА ), мы выбрали 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) и о-толидин (о-Т). В выясненных оптимальных условиях проведения новых индикаторных реакций разработали методики определения ртути(П) с Сд 0,1 нг/мл (^=0,30; п=3, Р=0,95) и 0,3 пг/мл (яг=0Л6; п=3, Р=0,95) соответственно.

Используя рззлич1плй характер действия попов кадмия(Н), висмута(Ш) на процесс исроксидазпого окисления о-дианизидина в присутствии ДЭДТК, разработали ферментативный метод их определения с С,, 0,05 мкг/мл (%(Сс1)=0,05, хг(ш)=0,0б; п=3, Р=0,95) и изучили также возможность селективного определения кадмия(Н) и висмута(Ш) при их различных соотношениях в реакционной смеси. Показано, что определению 0,05 мкг/мл кадмия(П) не мешает присутствие висмута(НГ) при его 5-кратных избытках в реакционной системе.

При использовании в качестве индикаторных реакций перокеидазного окисления о ФДЛ н ТМБ предел обнаружения кадмня(1[) удается понизить в 5 раз (10 иг/мл). Чувствительность определения виемуга(Ш) с применением указанных индикаторных систем остается такой же, как и в случае системы о-дианизндин - лероксид водорода.

На основе выявленного в присутствии фенилтиомочевины к дитиотреитола либеративного эффекта мегилртути разработали методику, позволяющую оценить ее содержание в реакционной системе на уровне 0,1 мкмоль/л.

Обнаруженную нами в присутствии ДЭДТК и тиосалициловой кислоты обратнопропорциональную зависимость величин тщ^ и ос соответственно от концентрации метилртути использовали для разработки метода ее определения (табл. 3).

Изучение влияния этил- и фенилртуги, сопутствующих метилртути в природных объектах, на скорость индикаторной реакции в присутствии ДЭДТК показало, что указанные ртутьорганические соединения уменьшают величину индукционного периода по мере увеличения их концентрации вплоть до полного его исчезновения. Величина же тангенса угла наклона II участка кинетических кривых при этом оставалась неизменной.

Поведение феиилртут» в индикаторной системе в присутствии тиосалициловой кислоты аналогично действию метил- и этнлртуш в присутствии ДЭДТК, в то время как мстил- и этилртуть п присутствии тиосалициловой кислоты уменьшают величину Свал, а продолжительность

Таблица 3

Метрологические характеристики методик определения метил-, этил-, фенилртути в присутсгвииДЭДТК и ТСК

1-х. —3

Ргутьорга-ническое соединение Индикаторная реакция дэдтк ТСК

Аналит. сигнал Сн. мкмоль/л Яг (п=3, Р=0,95) Аналит. сигнал Сн, мкмоль/л 5г (ч=3, Р=0,95)

Метшгртуть о-Д - Н202 Т1ШД. 0,1 0,03 1В<Ч1 0,1 0,09

о-ФДА - Н202 тинд. 0,1 0,03 - - -

ТМБ - Н202 хинд. 0,05 0,04 - - -

Этилртуть о-Д - Н202 хинд. 0,5 0,0 2 1 0,21

Фенилртуть о-Д - Н,0, ТИНЛ. 1 0,03 Тоттгт 1 • 0,29

индукционного периода при этом остается прежней. Наличие обратиопрогюрционалълых зависимостей и т^д от концентрации

мстил-, этил- и фенилртуги в нрисугствии ДЭДТК и тиосалщциоиой кислоты позволило предложить методики их определения (табл. 3). Методы определения ртути(И) и кадмия(П) в природных объектах Разработанные методы определения ртути(II) .. и кадмия(П) использовали для определения их в конкретных объектах.

При разработке метода определения ртути(И) в природной воде в присутствии больших количеств железа(Ш) для устранения его мешающего влияния выбрали органические соединения, образующие устойчивые комплексные соединения с железом(Ш) (табл. 4).

С целью выяснения характера действия выбранных лигандов на каталитическую активность иероксидазы в реакции окисления о-дианизи-дина изучили их влияние на скорость ферментативного процесса в отсутствие тиомочевины и ртути (К). Установили, что все исследуемые соединения ингибируют активность пероксидазы, но только после предварительного выдерживания их с ферментом. Причем ингибирующее действие изучаемых соединений проявляется в различных интервалах их концентраций и возрастает с увеличением времени их инкубирования с пероксидазой (табл. 4).

Установили, что с повышением константы устойчивости комплекса желсзо(Ш) - ингибитор уменьшается время инкубирования лиганда с ферментом, а также понижается концентрация лиганда, при которой проявляется его заметное ингибирующее действие на фермент. Полученные данные свидетельствуют о том, что ингибирующее действие изученных органических соединений связано с образованием ими прочных комплексов с жслезом(Ш) гема пероксидазы. Малое время инкубирования пероксидазы с фторид-ионами и отсутствие необходимости инкубирования фермента с цианид-ионами объясняется, на наш взгляд, не только высокой устойчивостью их комплексов с железом(Ш), но и малым размером их ионов.

Таблица 4

Характеристики ферментативных методик определения ряда ингибиторов пероксидазы (Р=0,95; п=3)

Ингибитор Интервал Оп|гиб.> мгмаль/л мин фермента с ингибитором 1ёЗп СШШ1 моль/л Уравиекие градуировоч-ного графика с,„моль/л

Фторид-ион 10-100 5 16,1 (а=5) 2 10-7 у = 7,2 - 0,2х 5 10-7 0,20

Цианпд-иоп 0,0010,01 0 43,9 (а=6) 5 10"10 у = 9,4 - 0,3х 8 10-1° 0,15

Винная кислота 10-100 60 11,9 <а=2) 6 1(Н у = 12,1 - 0,3х 210-5 0,16

Щавелевая кислота 1-10 60 20,2 (ч=3) 6 10-7 у = 12,3 - 0,3х 1 -10« 0,17

Сульфоса-лициловая кислота 0,0010,01 30 33,1 (п=3) 6 10-ю у = 16,0 - 0,2х 8 -НИ» 0,16

Салициловая кислота 0,00001 -0,0001 30 36,3 (ч=3) 9 10-12 у = 8,5 - 0,1х 2 10-» 0,16

где у - 1да • 102, х - Сингибигора'Ю*. моль/л (к=5-12)

Поскольку в литературе отсутствуют ферментативные методы определения выбранных соединений, то обнаруженную нами прямолинейную зависимость скорости индикаторной реакции от концентрации выявленных ингибиторов использовали для разработки ферментативных методов их определения (табл. 4).

Наиболее чувствительная из разработанных метода'гка определения цианид-иона превышает по чувствительности все известные в литературе методы его определения, даже такие чувствительные, как ферментативные с использованием инвертазы и супероксцвдисмутазы. Предложенный нами ферментативный метод определения салициловой кислоты значительно превышает но чувствительности наиболее чувствительные из описанных в литературе, хроматографические и кинетические методы.

В результате проведенного исследования в качестве маскирователя ионов железа(Ш) при определения ртути(II) выбрали винную кислоту, образующую устойчивый комплекс с железом(Ш) и не оказывающую ллия1шя на нсроксидазу при концентрациях, необходимых для маскирования > 1 мкг/мл жслеза(Ш). Результаты анализа подземной природной воды Московской области разработанным нами ферментативным методом (0,82 ± 0,02) иг/мл (п=4; Р=0,95) и атомно-флуорссцентным методом с холодным паром (0,66 + 0,04) нг/мл (п~4; Р=0,95) хорошо согласуются между собой. При этом ферментативный метод отличается большей простотой и экономичностью.

Разработанную методику определения кадмия(И), основанную на его ингабирующем дейстшш на скорость пероксидазного окисления о-дошшзидина в присутствии ДЭДТК, использовали для анализа пробы почвы. Установили, что исследуемая проба содержит (3,2±0,2) мкг кздмия(П) на г почвы (^=0,02; п=3; Р=0,95).

Ферментативный метод определевия желсза(Ш) Обнаружили, что добавление ионов железа(Ш) к раствору пероксидазы, предварительно ингнбированной салициловой кислотой, приводит к реактивации фермента. На основе этого явления разработали метод определения железа(Ш) с (^¡„=10 пг/мл. Столь

иысокочувствительный метод определения желсза(Ш) целесообразно использовать для анализа особо чистых вод, применяемых в электронной и авиационной промышленности, при производстве материалов ВТСП и т.д.

Для его апробации проанализировали на содержаш1с жслеза(Ш) воду, полученную после очистки на установке "Milli-Q". Найденное ферментативным методом содержание железа в анализируемой пробе - 4 иг/мл хорошо согласуется с результатами анализа той же воды на содержание железа (2 иг/мл) методом атомной абсорбции с электротермической атомизащ1ей (спектрофотометр Spectr АА-30 фирмы Vanan).

Использование иммобилизованной пероксидазы для разработки тсст-иетода определения ртутн(Н)

При разработке тест-метода определения payni(II) представлялось целесообразным объединить преимущества иммобилизации фермента с его аналитическими возможностями, обнаруженными нами ранее при использовании нативной пероксидазы.

Для иммобилизации пероксидазы исследовали возможность ее включения в пространственную сетку гелей агар-агара, желатина и хитозана, а также в поры бумага. Для контроля активности иммобилизованных препаратов пероксидазы и разработки тест-методов в качестве индикаторных использовали реакции окисления о-диашиидина, о-ФДА, ТМБ, о-толидина. В зависимости от природы используемого субстрата-восстановителя при введении в реакционную систему Н2О2 наблюдали различный переход окраски раствора в ячейке планшета или бумаги, содержащих иммобилизовашшй фермент (табл5).

В результате изучения каталитической активности, стабильности иммобилизовашшх препаратов пероксидазы, возможности визуального наблюдеши за скоростью ферментативного процесса в качестве оптимального способа иммобилизации выбрали модификацию пероксидазы хитозаном, а наилучшими носителями оказались полистнрольный планшет и хроматографическая бумага. Предаожешгын нами способ иммобилизации

Таблица 5

Переход окраски растворов в ячейке планшета и на бумаге, содержащих иммобилизованную перокеидазу, в различных индикаторных реакциях

Индикаторная реакция Переход окраски

Подистирояышй планшет Бумага

о-Д -НА зеленый—»бурый—»красный переход неконтрастен

о-ФДЛ - Н202 бледно-желтый -»оранжевый корига 1СВЫЙ—»зеленый

о-Т - «202 гояу6ой-»зсяеиый—»желтый—»розовый переход неконтрастен

ТМН - Н202 голубой-»зеяе11ый—»желтый—»еишисвый голубой -»коричневый

Таблица б

Метрологические характеристики тест-методик определения ртути (II) с использованием перокевдаш, иммобилизованной в планшете и на бумаге

Индикаторная сЕспема Визуальная детекция скорости Фотометрическая детекция скорости

с« (Ив(Щ) % (Р=0,95, п=3) Св^П)) пт/мл % (Р=0,95, п=3)

Планшет пт/мл Бумага нг/мя Планшет Бумага

о - ФДА-НгОз 50 0,04 ОДО 0,06 5,0 0,11

о ■ Д -Нг02 10 — 0Д7 — 0,3 0,11

о-Т - Н^ од — 0,29 — од 0,29

ТМБ - Н202 од од 0Д9 0,14 ОД* ОД" 0,19* 0,24"

* - фтаяатаый буферный раствор, рН=5.0

* * - боратно-фосфагшый буферный раствор, рН=7.0.

пероксидазы применили для разработки тест-мстода определения ртути (табл. 6).

В тех случаях, когда необходимо установить более точное (в пределах одного порядка) содержание ргути в пробе, целесообразно использовать фотометрическую детекцию скорости индикаторного процесса, исключив тем самым субъективный фактор. Скорость ферментативной реакции в этом случае контролировали с помощью прибора АКИ-Ц-01. Градуировочный график строили в координатах: процент ингибирования фермента - логарифм концентрации ртути. Процент 1Шгибирования рассчитывали по предложенной нами формуле:

где и - скорости ферментативной реакции в отсутствие

(контрольный опыт) и в присутствии (проба) ртути соответственно. Содержание ртути в анализируемой воде находили по градуировочному графику.

Использование фотометрической детекции скорости ферментативных процессов окисления о-дианизидипа и о-ФДЛ позволило в 10 раз повысить чувствительность определения ртути по сравнению с таковой при визуальной детекции. Наиболее чувствительной и контрастной из предложенных нами является тест-методика определения ртути по реакции • псроксидазного окисления ТМБ, позволяющая определять ртуть на уровне ОД пг/мл, что в 1000 раз ниже ПДК ртути(И) в природных водах.

На основе пероксидазы, иммобилизованной по предложешюй нами методике в пленках хитозана в ячейках нолистирольного планшета, промышлетшо выпускается , тест-устройство для определения микроколичеств ртути(Н). Оно прошло лабораторные испытания в Центральной Специализированной Инспекции Минэкологии России и было рекомендовано к использованию в природоохранной деятельности в качестве средств;! первичного контроля природных вод (циркулярное письмо N ЦС 20/15-80 от 6.02.92.)

Выводы

[.Установлено ингибирующее дсйствисртути(11), кадмия(П), висмута(Ш) на каталитическую активность пероксидазы в реакциях окисления о-дианизидина, о-фенилендиамина, о-толидина и 3,3', 5, 5'-тстраметилбензидина. Показано, что ртуть(Н) является обратимым конкурентным ингибитором, кадмий(П) - обратимым 'неконкурентным ингибитором, а висмут(Ш) необратимым ингибитором пероксидазы.

2. Обнаружено ингибирующее действие метил-, этил-, фенилртути на уровне их кмщентрации 0,1 ммоль/л на каталитическую активность пероксидазы в реакции окисления о-дшцшзидина.

3. Обнаружено, что серосодержащие соединения различных классов (тиомочевины, тиолы.тиокарбаминаты, аминокислоты) ингабируют нерокевдазу в реакции окисления о-дианизидина. Изучение характера и механизма действия этих соединений на фермент позволило разделить их на две группы: I - собственно ингибиторы пероксидазы, II - вторые субстраты , окисляющиеся наряду с о-дианизидином пероксидом водорода.

4. Результаты изучения совместного действия двух эффекторов - ионов металов или ртутьорганических соединений в присутствии серосодержащих веществ -свидетельствует о том, что характер действия иона металла или ртутьорганического соединения в зависимости от природы серосодержащего вещества может быть различным. Так, серосодержащие соединения I группы могут усиливать ингибирующее действие ионов металлов и ртутьорганических соединений; ионы металлов и метил ртуть в свою очередь могут уменьшать или увеличивать индукционный период, а также повышать или понижать скорость пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии серосодержащих веществ II группы; метилртугь проявляет либеративное влияние на серосодержащие соединения I группы, ослабляя их ингибирующее действие на пероксидазу.

5. Разштаюе действие серосодержащих соединений в реакциях окисления о-дианизидина, о-фенилендиамина, о-толидина, 3,3',5,5' тетраметилбензидина использовано для повышения селективности

ферментативного определегшя ртуги(П), кадмия(П), писмута(Ш), а также для разработки методов определения:

- ртути(Н) (С,,= 0,1 нг/мл) и кадмия(И) (Сн= 0,05 мкт/мл) по их ингибируклцему действию на каталитическую активность пероксидазы в присутспнш тиомочевины и ДЭДТК соответственно;

- висмута(Ш) (С,{= 0,05 мкг/мл) и ртутьорганическнх соединений (Сп= 0,05 - 0,1 мкмоль/л) по их действию на продолжительность шщукциотшого периода в присутствии ДЭДТК и нероксидазы;

- метилртути на уровне 0,1 мкмоль/л по ее либератииному действию на ингибиторы пероксидазы - фагалтиомочевину и дитиотрентол.

6. Разработаны методики ферментативного определения таких органических кислот, как винная, щавелевая, сульфосалициловая, салициловая с С„ 20 мкмоль/л, 1 мкмоль/л, 0,8 нмоль/л и 20 тюль/л соответственно; цистеина (Сн=0,1 мкмоль/л), хлористого тиофенола (С,,=0,1 мкмоль/л) ,а также фторид- и цианид - ионов с С„ 500 и 0,8 нмолъ/л соответственно по их ингибирующему действию на активность пероксидазы.

7. Реактивирующее действие железа(Ш) на пероксидазу, ингибированную салициловой кислотой, использовано для разработки метода его определения ( Сц^Ю пг/мл).

8. Предложен новый способ иммобилизации пероксидазы с использованием хитозана.

9. Ингибирующее действие ртути (II) на каталитическую активность пероксидазы, иммобилизованной в ячейках полистирольного планшета и на бумагах, использовано для разработки тест-методик определишя ртути (II) по реакциям окисления о-диализпдина, о-фешшендиамшт, о-толидина,3,3',5,5'-тетраметилбешндшга с визуальной и фотометрической детекцией скорости индикаторного процесса (С„=0,1 пг/мл - 0,01 нг/мл в зависимости от индикаторной реакции, носителя и способа детекции).

10. На основе пероксидазы, иммобилизованной в ячейках полистирольного планшета, создано и промышлегаю выпускается тсст-устройство для определения ртуш(П) в природных подах на уровне 11ДК.

11. Разработаны методики определения : ргути(11) на уровне ИД К. с использованием натнвной пероксидазы в природной под-земной воде в присутствии больших количеств жслеза(Ш), кадмия(Н) в почве на уровне ПДК; железа(Ш) в особо чистои воде на уровне его концентраций 10 нг/мл. Публикация:

1. Шеховцова Т. II., Долматова И.Ф., Чернецкая С. В. Определение рада органических соединении ферментативным методом.-Тез. докл. IV Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ. Москва. 1991. /23 - 25 января/. С. 97.

2. Шеховцова Т. Н., Чернецкая С. В., Долманова И.Ф. Ферментативный метод определения микроколичеств железа(Ш) и ряда ингибиторов пероксидазы // Журн. аналит. химии. 1993. Т. 48. N1. С.129-136.

3. Шеховцова Т. Н.,' Чернецкая С. В., Долманова И. Ф., Никольская Е. Б. Тесг-мстод определения ртути на уровне ПДК с использованием пероксидазы, иммобилизованной в пленке хитозака // Журн. аналит. химии. 1994. Т.49. N8. С. 862-867.

4. Шеховцова Т. Н., Чернецкая С. В., Долманова И. Ф. Использование иммобилизованных ферментов для определения ионов металлов // Журн аналит. химии. 1994. Т. 49. N 8. С. 789-795.

5. Шеховцова Т. Н.,Чернецкая С. В., Долманова И. Ф. Тест-метод определения ргя'и на уровне ПДК с использованием пероксидазы, иммобилизованной на бумаге // Журн. аналит. химии.1995. Т. 50. N5.

6. Шеховцова Т. Н., Чернецкая С. В., Долманова И. Ф. Ферментативный метод определения ртути в природной воде // Журн. аналит. химии.1995. Т. 50. N3.

7. Шеховцова Т. Н., Чернецкая С. В., Закурдаева Г. Г. Ферментативный метод определения кадмия в почве. - Тез. докл. Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика - 94". Краснодар. 1994. С. 102.

8. Шеховцова Т. II., Чернецкая С. В., Долманова И. Ф. Определение малых количеств серосодержащих органических соединений с использованием пероксидазы. Там же. С. 173-174.

9. Шеховцова Т. Н., Чернецкая С. В., Нагамедьянова 3. А. Определение слсдокых количеств мстилргути. Там же. С. 172-173.

10. Шехоицова Т. Н., Чернецкая С. В., Долманова И. Ф. Ферментативный тест-мстод определении микроколичеств ртуги. В кн. Фундаментальные методы исследования новых материалов и процессов в веществе. М. : МГУ. 1994. Т.1. С. 205-210.

11. Shekovtsova Т. N.,Chernetskaya S. V. Determination of mercury at the picogram per mililiter level using immobilized horseradish peroxidase // Anal. J^etters. 1994. V.27. N15. P. 2883 - 2838.

12. Shekovtsova Г. N., Chcruetskayu S. V. Biosensor for mercury microquantitics determination. Il-nd Symposium oil analitical sciences. Switzeland. Montreux. 1994. P. 468.

13. Шеховцова Т. H., Чернецкая С. В., Долманова И. Ф. Способ ферментативного определения микроколичеств ртути. Заявка тга патент РФ N94011562 от4. 04. 94.

14. Долманова И. Ф., Никольская Е. Б., Шсхощова Т. Н., Чернецкая С. В. Способ ферментативного определения микроколичеств ртути.. Бюлл.изобр.1994. N10. N2013770.