Квантовые точки на основе селенида кадмия: получение, модификация и применение в иммунохимическом анализе

Сперанская, Елена Сергеевна

Квантовые точки на основе селенида кадмия: получение, модификация и применение в иммунохимическом анализе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Сперанская, Елена Сергеевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Саратов МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Квантовые точки на основе селенида кадмия: получение, модификация и применение в иммунохимическом анализе»

Автореферат диссертации на тему "Квантовые точки на основе селенида кадмия: получение, модификация и применение в иммунохимическом анализе"

На правах рукописи

и-

005051458

СПЕРАНСКАЯ ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

КВАНТОВЫЕ ТОЧКИ НА ОСНОВЕ СЕЛЕНИДА КАДМИЯ: ПОЛУЧЕНИЕ, МОДИФИКАЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

02.00.04 - физическая химия 02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

4 АПР 2013

Саратов - 2013

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г.Чернышевского»

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Дмитриенко Александр Олегович

доктор химических наук, доцент Горячева Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты: Горин Дмитрий Александрович,

доктор химических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г.Чернышевского», профессор кафедры физики полупроводников

Панкин Кирилл Евгеньевич,

кандидат химических наук, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова», доцент кафедры техносферной безопасности и транспортно-технологических машин

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН,

г. Москва

Защита состоится 25 апреля 2013 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 по химическим наукам при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, корпус 1, Институт химии СГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич Саратовского государственного университета имени Н.Г.Чернышевского.

Автореферат разослан » марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета 4 * Т.Ю. Русанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (или квантовые точки - КТ) находят широкое применение в самых разных приложениях биоанализа - от иммунохимических тест-методов до визуализации тканей и отслеживания лекарственных веществ в организме. Благодаря уникальным оптическим свойствам - зависимость цвета эмиссии от состава и размера КТ, высокая фотостабильность, широкие спектры поглощения - КТ всё чаще вытесняют используемые ранее органические красители.

В связи с высокой востребованностью КТ публикуется много работ по усовершенствованию методик их синтеза с целью создания нанокристаллов с улучшенными свойствами. В последнее время наметилась тенденция получения КТ из доступных и стабильных реагентов путём использования воспроизводимых методик. Кроме того, важной проблемой остаётся перевод КТ из органических растворителей (в которых получают нанокристаллы) в водные растворы без потери яркости и коллоидной стабильности. На сегодняшний день опубликован ряд работ по применению КТ в качестве меток в твердофазном иммуноанализе и лишь единичные работы посвящены применению КТ в иммунохимических тест-методах.

В данной работе основное внимание уделено получению КТ с различным цветом свечения; улучшению яркости флуоресценции КТ путём оптимизации условий синтеза; переводу КТ из органических растворителей в водные растворы; применению КТ в твердофазном иммунофлуоресцентном анализе и тест-методах.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является получение и модификация квантовых точек структуры ядро/оболочка на основе селенида кадмия и их применение в качестве флуоресцентных меток в иммунохимическом анализе. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- отработать методики получения квантовых точек структуры ядро-оболочка состава СёБе/гпБ и СёБе/СсШ^пБ с длиной волны максимума флуоресценции в интервале 520-650 нм, что соответствует цвету свечения от зелёного до красного; осуществить выбор оптимальных параметров синтеза для воспроизводимого получения КТ с высокой яркостью флуоресценции;

- разработать методики перевода КТ из органического растворителя в водные растворы двумя способами: методом замены лигандов и путем покрытия амфифильными полимерами; синтезировать амфифильные полимеры для гидрофилизации КТ; установить оптимальные условия для перевода КТ в водные растворы; выбрать наиболее подходящий путь получения гидрофильных КТ для использования в качестве биометок;

- сравнить показатели твердофазного иммунофлуоресцентного анализа (КТ в качестве меток) и иммуноферментного анализа (пероксидаза хрена в качестве метки) на примере количественного определения микотоксина зеараленона;

— разработать неинструментальный колоночный тест-метод с применением флуоресцентных квантовых точек Сс18е/2пБ в качестве биометок; оптимизировать методики проведения анализа на примере визуального детектирования микотоксина зеараленона в пшенице.

Методы исследования. Для решения поставленных в работе задач применяли комплекс физико-химических методов исследования (люминесценция, УФ-, ИК-, видимая адсорбционная спектроскопия, дифрактометрия, электронная микроскопия) и иммунохимических методов анализа (твердофазный иммунохимический анализ на полистироловых микропланшетах, иммунохимические тест-колонки с сефарозой 4В и полиэтиленовыми фритами в качестве носителей). Научная новизна состоит в следующем:

— отработаны методики получения квантовых точек структуры ядро-оболочка состава СёБе/гпБ и СёБе/СёБ/гпБ с длиной волны максимума флуоресценции от 520 до 650 нм;

— разработан новый подход к увеличению стабильности коллоидных водных растворов КТ, покрытых тиокислотами, основанный на химическом связывании растворенного кислорода в ходе его реакции с сульфитом натрия;

— синтезированы амфифильные полимеры из недорогих и доступных реагентов; отработана методика перевода КТ из органического растворителя в водные растворы путём покрытия амфифильным полимером;

— проведена сравнительная оценка твердофазного иммуноанализа при использовании в качестве меток КТ и фермента на примере количественного определения микотоксина зеараленона;

— разработан неинструментальный колоночный тест-метод для визуального детектирования зеараленона с применением КТ в качестве меток.

Практическая значимость работы.

В результате проведённых исследований были разработаны методики получения флуоресцентных КТ с цветом свечения от зеленого до красного и тест-системы с применением КТ в качестве биометок для анализа микотоксинов. Разработан новый подход к повышению стабильности водных коллоидных растворов КТ. Синтезированы новые амфифильные полимеры для покрытия КТ. Показано, что полученные КТ могут быть использованы в качестве меток в твердофазном иммуноанализе как в планшетном, так и в тест-вариантах.

На защиту автор выносит:

• Оптимизированную методику получения КТ ядро/оболочка из стабильных и доступных реагентов.

• Новый подход к повышению стабильности водных коллоидных растворов КТ, покрытых меркаптокислотами, на основе химического связывания растворенного кислорода.

• Методику синтеза амфифильного полимера и покрытия им KT для перевода нанокристаллов из органического растворителя в водные растворы.

• Разработанный иммунохимический тест-метод с применением KT в качестве флуоресцентных биометок.

Личный вклад соискателя заключается в постановке задач исследования, выборе методов синтеза и модификации KT, непосредственном проведении экспериментов, обобщении полученных результатов, формулировании выводов.

Публикации. По теме данного исследования опубликовано 12 печатных работ: 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 - в сборнике статей, 7 тезисов докладов, из них 4 - на Международных конференциях; получено положительное решение о выдаче патента на изобретение.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на следующих конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 20102011» (Россия, Москва, 2010, 2011), Всероссийская научная школа-семинар «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине — 2011» (Россия, Саратов, 2011), 5th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (Czech Republic, Prague, 2011), XIth International Conference on AgriFood Antibodies (Austria, Vienna, 2012), Всероссийская школа-конференция «Химия биологически активных веществ» молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «ХимБиоАктив-2012» (Россия, Саратов, 2012), Конференция с международным участием по аналитической спектроскопии (Россия, Туапсе, 2012), International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics SFM 2012 (Россия, Саратов, 2012).

Структура п объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 147 ссылок. Работа изложена на 118 страницах, содержит 56 рисунков и 14 таблиц.

Финансовая поддержка работы осуществлялась проектами: гранты РФФИ (12-03-91167, 11-03-93963, 12-03-92699), грант ДААД (А/10/73533, 2011), программой У.М.Н.И.К. (№01201268968).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложены новизна, практическая значимость работы и основные результаты, выносимые на защит}'.

Глава 1. Обзор литературы

В данной главе представлен обзор литературы, в котором рассмотрены основные оптические свойства флуоресцентных КТ и требования, которые предъявляются к КТ, используемым в качестве меток в анализе. Приведены основные стадии синтеза КТ и последние разработки в области наращивания оболочек более широкозонных полупроводников для создания ярких и стабильных КТ структуры ядро-оболочка. Рассмотрены основные подходы к гидрофилизации поверхности КТ с целью перевода их из органического растворителя в водные растворы — метод замены лигандов на поверхности КТ и покрытие КТ амфифильными полимерами — указаны их достоинства и недостатки. Кроме того, кратко рассмотрены последние достижения в области применения КТ в качестве флуоресцентных меток в иммунохимическом анализе.

Глава 2. Экспериментальная часть.

Данная глава содержит описание реагентов, используемых для проведения иммуноанализа, синтеза и модификации КТ. Синтез КТ, а также приготовление прекурсоров проводили в установке, схематически изображённой на рис. 1. Приведены методы, которые применяли для изучения свойств КТ: флуоресценция; УФ-, ИК-, видимая адсорбционная спектроскопия;

дифрактометрия; электронная микроскопия. Описаны

методики, позволяющие

оценить размер КТ и их концентрацию в растворах по спектрам поглощения.

Относительный квантовый выход (КВ) флуоресценции определяли относительно органических люминофоров с известным КВ: кумарина 2 (КВ 94% при хтз5 =365 нм); родамина 6Ж (КВ 95% при Хтз5 =490 нм).

Для использования

полученных гидрофильных КТ в иммуноанализе синтезировали конъюгаты: микотоксина зеараленона (ЗЕА) с овальбумином (ОВА), ЗЕА с пероксидазой хрена (ПХ), КТ с антителами анти-ЗЕА, КТ с ЗЕА-ОВА. В главе приведены методики связывания антител с гелем и пористыми полиэтиленовыми подложками (фритами); приготовления геля с блокированными активными группами; проведения иммунофлуоресцентного анализа в тест-колонках. Для сравнения КТ и фермента в качестве метки проводили твердофазный иммуноанализ на микропланшете. Количественную оценку результатов

термопара, подключенная термоконтроллеру

колбонагре-ватель

ру\

[Г

■у введение прекурсоров, отбор алкивот

магнитная мешалка

Рис. 1 Схема установки для проведения синтеза КТ

выполняли на основе интенсивности флуоресценции (КТ в качестве метки) или оптической плотности (ПХ в качестве метки) с помощью ридера для микропланшетов Тесап 8айге. Также в главе описаны методики проведения экспресс-определения ЗЕА с использованием геля и полиэтиленовых подложек в качестве носителей. Методики были использованы для определения ЗЕА в образцах пшеницы.

Глава 3. Синтез и характеристика иаиокристаллов селеиида кадмия В данной главе описано два способа получения КТ Сс18е: в водном растворе и в органическом растворителе октадецене (1 кип = 315°С). Для синтеза КТ СёБе в водном растворе в качестве стабилизатора использовали меркаптопропионовую кислоту, молекулы

которой покрывают поверхность

образующихся КТ и препятствуют их

коагуляции. Однако, полученные растворы КТ нестабильны. Связано это с тем, что тиольные группы, за счёт которых меркаптопропионовая кислота связывается с атомами кадмия, легко подвергаются окислению до дисульфидных групп. Было показано, что введение сульфита натрия в растворы КТ позволяет

значительно увеличить их стабильность во времени (рис. 2). Стабилизация растворов КТ происходит за счёт химического связывания сульфитом натрия растворённого в воде кислорода. КТ, полученные в водных растворах, имеют в спектре флуоресценции наряду с Рис. 3 Спектр флуоресценции растворов КТ Сс1Яе, экситонным пиком (7ч,акс = 586 покрытых МПК, в воде, Х(возб.)= 400 нм нм) широкую интенсивную

длинноволновую полосу

люминесценции, вызванную дефектами нанокристаллов (рис. 3). КВ полученных КТ не превышал 3%.

га

450 550 650

Лпинп иппны. нм

0 0Л 02 ОЗ 04 05 0.6 Концентрация сульфита натрия, моль/л

Рис. 2 Влияние концентрации №2803 в растворе на стабильность водных растворов КТ во времени и на яркость флуоресценции КТ (вкладка); С(Ыа2803): (а) 0 М, (б) 0.02 М, (в) 0.1 М, (г) 0.5 М.

основной пик флуоресценция,

400 500 600 700 800 900 Длина волны, нм

В органическом растворителе октадецене были получены две кристаллические модификации КТ СдБе: гексагональной структуры (типа вюрцит) и кубической (типа сфалерит). В качестве прекурсора кадмия в обоих синтезах использовали олеат кадмия, в качестве прекурсора селена для

получения КТ Ссйе (вюрцит) применяли

триоктилфосфин селенид (ТОРБе), для получения КТ СёБе (сфалерит) - раствор селена в октадецене. Диаметры КТ и

концентрацию полученных растворов оценивали по спектрам поглощения. На рис. 4 приведены

Рис. 4 Изменение диаметра КТ СсКе в процессе синтеза зависимости, отражающие

рост нанокристаллов Сс18е в процессе синтеза. В случае применения ТОРБе хорошо сформированные кристаллы образуются уже спустя 10 сек после впрыскивания прекурсора селена. Однако после 10 мин синтеза, смещения в спектре поглощения практически не происходит, что свидетельствует об остановке роста нанокристаллов. Таким образом для получения по этой методике КТ Ссйе с диаметром более 4 нм необходимо дополнительное впрыскивание прекуросоров селена и кадмия. В случае использования раствора Бе в ОДЕ рост нанокристаллов не останавливается, и возможно получение КТ с диаметром более 5 нм. На основании данных этих зависимостей в последующих синтезах реакцию останавливали в определённый момент для получения КТ СёБе нужного диаметра. Было показано, что для КТ, полученных в октадецене, также характерна полоса эмиссии в длинноволновой области, связанная с дефектами КТ, однако она малоинтенсивна и по мере роста кристаллов практически исчезает (рис. 5). Квантовые выходы КТ Ссйе и структуры сфалерита, и структуры вюрцита не превышают 1.5%, однако химический выход реакции получения КТ с

использованием ТОРБе

значительно больше, чем с применением раствора селена в октадецене в качестве прекурсора (-50% и -15% соответственно).

Хотя КТ СёБе,

к а,

й о

I -

К -е-

1 2 3 4 5 1(ОСН.)/1(ДЛИННОВ.)

А/ Jw\ 1:4.2

/ i\mm \ 2: 7.3

Г Ш \ / i /А г \\ \ 3: 8.8 4: 14

// Ч\\\ ц д \ \ 5: 15 .............

450

550 650

Длина волны, нм Рис. 5 Спектры флуоресценции растворов КТ CdSe в толуоле d(CdSe): 1) ~2,5нм; 2) ~2,7нм; 3) -2,9 нм; 4) -3,0 нм; 5) -3,5 нм.

750

полученные в органическом растворителе, имеют ещё меньший КВ флуоресценции по сравнению с КТ Сс^е, полученными в водной фазе, следует учитывать, что для гидрофобных КТ разработаны подходы к наращиванию оболочек более широкозонных полупроводников, которые приводят к значительному повышению КВ. Для КТ, полученных в водных растворах, в последние годы появляются отдельные публикации о наращивании оболочек, однако в качестве ядер в таких методах используют теллурид кадмия СсГГе, и КВ полученных структур недостаточно высок. Кроме того, синтез КТ С(15е в водных растворах не позволяет получить весь диапазон размеров ядер Сс18е, достигаемый при изменении времени синтеза КТ в органических средах. Гидрофобные КТ, приготовленные в октадецене, были выбраны для дальнейшей работы с целью получения флуоресцентных меток.

Глава 4. Наращивание оболочек более широкозопных полупроводников

на ядрах С(!8е

Для увеличения яркости флуоресценции и стабильности КТ СёБе покрывали оболочками более широкозонных полупроводников. В КТ структуры ядро-оболочка более ширикозонный полупроводник пассивирует поверхность флуоресцирующего ядра - уменьшает число так называемых свободных валентностей, которые могут служить ловушками для носителей заряда. Также оболочка пространственно отделяет флуоресцирующее ядро от окружающей среды, таким образом, уменьшается чувствительность оптических свойств к внешним воздействиям. Важно, чтобы экситон не проникал в материал оболочки: чем больше разница в ширине запрещённой зоны материала ядра и оболочки, тем меньше вероятность проникновения элеткрона или дырки во внешнюю оболочку. В табл.1 приведены характеристики полупроводников, которые могут быть использованы в качестве материала оболочки для КТ СёБе.

Табл. 1 Характеристики кристаллических структур халькогенидов кадмия-цинка

(кубическая кристаллическая решетка)

гпБе саз

Толщина одного монослоя, нм 0.28 0.35 0.31

Постоянная решётки, нм 0.5668 0.6077 0.541

Ширина запрещённой зоны, Еео, эВ 2.69 2.49 3.61

Ядра с с1(Сс18е)<3 нм покрывали оболочкой 2п8 (ширина его запрещённой зоны максимальна). Для этого при комнатной температуре смешивали прекурсоры цинка (ацетат цинка, растворённый в смеси олеиламина и октадецена), серы (раствор серы в октадецене) и ядра Ссйе в октадецене и смесь нагревали до 140 °С и выдерживали при этой температуре. Использовали ядра Сс15е с кристаллической структурой сфалерита, поскольку в этих условиях кристаллизуется в этой структуре. Было оптимизировано время наращивания оболочки показано, что

яркость флуоресценции возрастает практически сразу после смешивания

прекурсоров гпБ и ядер Сс18е и достигает максимума через 2.5 часа. Исследовано влияние исходного количества прекурсоров цинка и серы на оптические свойства КТ С<18е/гп8. Количество прекурсоров цинка и серы, необходимое для получения оболочки гпБ, рассчитывали, используя параметры кристаллических решёток С<18е и 7пБ.

В данной работе варьировали количество прекурсоров цинка и серы для получения КТ СёБе/гпЗ с 3; 4.5 и 6 условными монослоями сульфида цинка. Указанное количество монослоёв не является реальным, а служит лишь для расчёта количества прекурсоров. Условный слой отражает такое количество монослоёв сульфида цинка, которое могло образоваться, если бы всё добавленное количество прекурсоров перешло в оболочки. Показано, что при

наращивании оболочки ZnS экситонный пик смещается в красную область спектра в первые 1.5 ч, затем его положение остаётся

неизменным (рис. 6). Чем меньше смещение в спектре поглощения после

наращивания оболочки, тем в меньшей степени происходит проникновение экситона из

флуоресцирующего ядра СёБе в слой гпБ. Важно отметить, что смещение в спектре поглощения

уменьшается при увеличении количества прекурсоров гпБ в исходной смеси. Полученные значения относительного КВ приведены в табл. 2. Необходимо добавить, что при наращивании оболочки сульфида цинка полностью исчезает флуоресценция в длинноволновой части спектра, вызванная дефектами на поверхности флуоресцирующего ядра.

Для оценочного суждения о равномерности образующейся оболочки был сделан тест на устойчивость флуоресценции КТ к наличию тиолов в растворе. Ранее было показано, что тиольные группы сильно снижают интенсивность флуоресценции КТ: если оболочка гпБ неравномерно покрывает КТ СёБе, и создаётся возможность взаимодействия тиольных групп с атомами кадмия флуоресцирующего ядра, то происходит тушение люминесценции. В качестве тиол-

508.

504

500

496.

0 12 3

Время синтеза, ч

Рис. 6 Изменение положения экситонного пика во время наращивания оболочки ХпЪ

Табл. 2 Квантовые выходы растворов КТ в толуоле_

КТ Квантовый выход

Ссйе Сс^е/згі^ Сс18е/4.5гп СйЗе/бгпБ 1.5% 40% 46% 60%

после добавления додекантиола

СсКе/ЗгпБ СсШе/4.52п СсВе/бгпБ 22% 31% 48%

содержащего вещества использовали додекантиол. Из данных табл. 2 по KB растворов КТ после добавления додекантиола очевидно, что эффективность изоляции ядра возрастает с толщиной оболочки ZnS в изученном интервале. Данные по изменению положения экситонного пика в процессе наращивания оболочки ZnS (рис. 6) позволяют сделать такой же вывод.

Дифрактограм мы КТ CdSe и CdSe/ZnS позволили предположить, что в данных условиях синтеза оболочка ZnS

предпочтительно

растёт на гранях (111) и (311) ядер CdSe. Отсутствие на дифрактограммах характерных для структуры вюрцита пиков после наращивания оболочки указывает на сохранение у КТ структуры сфалерита. Показано, что исходные ядра и полученные структуры ядро/оболочка имеют сферическую форму и однородны по размеру (рис. 7). Для дальнейшего применения в качестве меток были выбраны КТ, обладающие наибольшей яркостью - CdSe/6ZnS.

Ранее было показано, что наращивание оболочек ZnS непосредственно на ядрах CdSe с d(CdSe)>3 нм затруднительно из-за сильных различий в параметрах кристаллической решётки. Для наращивания оболочек на таких ядрах использовали метод послойного наращивания оболочек, который

заключается в

Рис. 7 Данные с просвечивающего электронного микроскопа: КТ CdSe (A), CdSe/6ZnS (Б)

я- 640

Рис. 8 Изменение длины волны максимума флуоресценции при наращивании оболочек на ядрах Ссйе разного диаметра

попеременном добавлении прекурсоров металла и

халькогенида в раствор КТ CdSe при высоких температурах (200°С - 250°С).

Чтобы избежать дефектов на стыке двух кристаллических решёток - СёБе и гпБ - между

ними помещали слой сульфида кадмия, который имеет промежуточные между С(18е и гпБ параметры кристаллической решётки и значение ширины запрещённой зоны (табл. 1).

При добавлении прекурсоров сульфида кадмия происходило сильное смещение пиков в спектрах поглощения и эмиссии в длинноволновую область (рис. 8). Связано это с тем, что, несмотря на большее значение ширины запрещённой зоны для сульфида кадмия (табл. 1), разница между краем зоны проводимости для сульфида и селенида кадмия невелика. Поэтому электрон проникает в оболочку сульфида кадмия, что вызывает

смещение пиков в спектрах. При наращивании первой оболочки сульфида цинка смещения практически не происходит (рис. 8), после наращивания второй оболочки сульфида цинка экситонный пик немного смещается в коротковолновую часть

спектра, что вероятно связано с образованием твёрдого раствора СсйпБ из-за диффузии атомов цинка в ядро.

Показано, что при получении КТ

сазе/сёБ/гпз

методом послойного наращивания оболочек диаметр исходных СёБе значительно влияет на

величину смещения экситонного пика и максимума флуоресценции: чем меньше

диаметр исходных КТ, тем сильнее будут смещаться спектры при

2 2,5 3 3.5 4 4,5 2 Диаметр ядер СёЭе, нм

Рис. 9 Смещение максимума флуоресценции в КТ Сс18е/Сс18/2п8 в зависимости от диаметра исходных ядер С(18е

к я =г я

о с; -е-ч о к

260 С (0.5 ч)

С<Ке І ІСсІБ I СсКпБ | гпЪ Са8е(атіпе) 2С(К гСсйпБ

Рис. 10 Изменение квантового выхода флуоресценции в процессе последовательного наращивания оболочек

наращивании одинакового количества слоев (рис. 9).

Было показано, что кристаллическая структура исходных ядер не влияет на яркость полученных КТ Сс18е/Сс15/7п8. Вероятно, связано это с тем, что в таких условиях синтеза (температура 220 °С и наличие амина в реакционной смеси) поверхность КТ Сс18е подвергается трансформации, таким образом, поверхность и КТ структуры вюрцита, и КТ структуры сфалерита, становятся идентичными перед наращиванием оболочек. Поэтому для синтеза структур Сс18е/Сс18/2п8 были использованы ядра СёБе структуры вюрцита, которые можно получать с гораздо большим химическим выходом.

Было исследовано изменение КВ флуоресценции в процессе наращивания оболочек (рис.10): КВ флуоресценции сильно возрастает при наращивании оболочек СсК (КВ (Сс18е/2С(18)= 47%), однако при нанесении цинк-содержащей оболочки, яркость падает (КВ (Сс18е/2Сс18/2Сс12п8)=31%). После наращивания второй оболочки 2п8 и дополнительного нагрева при 260°С яркость флуоресценции несколько увеличивается, и КВ полученных КТ Сс18е/2Сс18/2СЖп8/22п8 составляет 43%. Показано, что яркость флуоресценции всех КТ с цинк-содержащей оболочкой меньше, чем яркость КТ, содержащих только Сс18-оболочки. Однако для дальнейшей работы по переводу в воду и биоприменению необходимы КТ с оболочкой сульфида цинка для эффективной изоляции экситона внутри флуоресцирующей части

сазе/сая.

Таким образом, сочетание двух способов наращивания оболочек позволяет создавать оболочки более широкозонных полупроводников на ядрах Сс18е любого диаметра для получения КТ структуры ядро-оболочка с флуоресценцией голубого и зелёного цвета свечения (КТ Сё8еЖп8) и от жёлтого до красного (КТ Сс18е/Сс18/2п8).

Глава 5. Перевод квантовых точек из органических растворителей в водные растворы

КТ, применяемые как метки в биоанализе, должны образовывать стабильные коллоидные водные растворы. Для успешной конъюгации КТ с биомолекулами на их поверхности необходимы функциональные группы (-СООН или -МНг). Для перевода КТ, синтезированных в органическом растворителе, были использованы два способа: метод замены лигандов и покрытие амфифильным полимером.

По первому способу исходные гидрофобные лиганды, покрывающие КТ, замещаются на гидрофильные. Данный процесс будет происходить только в том случае, если гидрофильный лиганд имеет большее сродство к поверхности КТ, чем исходный. Ранее было показано, что меркаптогруппа имеет наибольшее сродство к атомам металлов на поверхности КТ, поэтому для перевода КТ по этому методу чаще всего используют гидрофильные лиганды с концевой меркаптогруппой. В данной работе была использована меркаптопропионовая кислота (МПК) в качестве гидрофильного лиганда. Меркаптогруппа МПК связывается с поверхностными атомами цинка, а карбоксильная группа обеспечивает растворимость в воде и возможность

конъюгации с биомолекулами. Для покрытия КТ молекулами МПК гидрофобные КТ, растворённые в толуоле, смешивают с водным раствором, содержащим МПК, и оставляют эмульсию при перемешивании на 1-2 часа. Окрашивание нижнего водного слоя свидетельствует о переходе КТ в него. Были подобраны оптимальные условия процесса для более полной гидрофилизации КТ: мольное соотношение МПК:КТ (3000:1), состав водной фазы (водный раствор, содержащий аммиак и МПК в мольном соотношении 1:1)). Однако, полученные водные коллоидные растворы КТ, покрытых МПК, нестабильны во времени из-за склонности тиольных групп к окислению. Небольшие по размеру молекулы МПК не создают защитного слоя между поверхностью КТ и раствором.

Для увеличения стабильности КТ, покрытых МПК, нанокристаллы покрывали денатурированным бычьим сывороточным альбумином (дБСА). В молекулах дБСА в результате реакции с борогидридом натрия ЫаВН4 дисульфидные связи частично восстановлены до тиольных, через которые и происходит связывание молекул белка с атомами цинка на поверхности КТ. Объёмные молекулы дБСА создают хороший изолирующий слой, благодаря чему водные растворы таких КТ стабильны во времени.

В табл. 3 приведены данные по КВ флуоресценции КТ СёБе/^пБ с разной толщиной оболочки гпБ. КТ с более толстой оболочкой имеют изначально более высокий КВ флуоресценции. Показано, что после перевода в воду КТ СсШе/бгпБ лучше сохраняют яркость по сравнению с КТ Табл. 3 Относительный квантовый выход С(Бе/4.52п8. Мы предполагаем, это КТ до и после перевода в воду с помощью связано С тем, что КТ CdSe/6ZnS МПК имеют более равномерную

изолирующую оболочку сульфида цинка, которая препятствует взаимодействию тиольных групп с флуоресцирующим ядром. Как было отмечено выше, тиольные группы сильно снижают флуоресценцию КТ. Для КТ состава СаБе/СаВ/гпБ также характерно сильное падение яркости флуоресценции после перевода в воду с помощью МПК (табл. 3), что свидетельствует о неравномерности оболочки сульфида цинка. Показано, что после перевода в воду ширина пиков не изменяется, дополнительных полос в спектрах флуоресценции не появляется, однако наблюдается небольшое смещение положения пиков флуоресценции (±5 нм), что может быть объяснено некоторыми изменениями в структуре поверхностного слоя КТ.

КТ С<1Ве/62п8, покрытые МПК и дБСА, устойчивы в водных растворах при рН 6-ИЗ в течение по меньшей мере 8 месяцев при комнатной температуре. КВ этих КТ достаточно высокий для использования таких нанокристаллов в качестве биометок в иммунохимичсеком анализе.

КТ растворитель КВ,%

Сс18е/4.52п8 толуол вода 45 15

СёЯе/62п8 толуол вода 60 36

сазе/зссмгпз толуол вода 33 9

NaOH

h20

ONa

j1'

r--nh2

б)

•'О

"NH - R'

-2j

Конъюгация с биомолекулами может быть проведена через карбоксильные и аминогруппы дБСА.

По второму способу КТ переводили в водные растворы покрытием амфифильными полимерами. При этом гидрофобные цепи полимеров взаимодействуют с гидрофобными лигандами на поверхности КТ, а гидрофильная часть обеспечивает коллоидную стабильность нанокристаллов в водных растворах.

Для синтеза

амфифильных полимеров использовали поли

(малеиновый ангидрид-октадецен) (ПМАО) и поли (стирол-малеиновый ангидрид) (ПСМА),

отличающиеся длиной гидрофобной цепи и молекулярной массой (М (ПМАО) 30000-50000 г/моль, М(ПСМА) 1700 г/моль). Амфифильные полимеры синтезировали по схемам (рис. 11): реакционноспособное кольцо малеинового

ангидрида раскрывается под действием щёлочи, при этом образующиеся

карбоксилат-ионы сообщают полимеру

водорастворимость. Кроме того, ангидридная группа может взаимодействовать с первичными аминами с образованием амидной связи. В качестве амина нами был использован дешёвый и стабильный водорастворимый полимер Джеффамин Ml 000, состоящий из этиленгликолевых и пропиленгликолевых звеньев. О протекании реакции с Джеффамином судили по ИК-спектрам: в ходе реакции интенсивность колебаний группы С=0 малеинового ангидрида (1858 см"1, 1777 см"1) снижается, а интенсивность колебаний, характерных для группы С=0 карбоновой кислоты (1700-1725 см"1), увеличивается. Для проверки растворимости полимера в воде хлороформ удаляли на роторном испарителе, после чего к полученной полимерной плёнке добавляли воду и подвергали ультразвуковой обработке. Было показано, что амфифильный полимер, растворимый в воде, получается при избытке Джеффамина. При этом после завершения реакции (при любых соотношениях) в смеси остаётся непрореагировавший Джеффамин. Наличие непрореагировавшего

R= -СН--(СН;)И-СН3 (ПМАО)

,,) (ПСМА)

R'=

Рис. 11 Схемы реакций: а) щелочной гидролиз полимера; б) взаимодействие полимера с первичным амином.

Рис. 13 Схемы покрытия гидрофобных КТ (I) различными полимерами: ПМАО (II), ПМАО-Джеффамином (III), ПСМА (IV, где Я = О"), ПСМА-Джеффамином М1000 (IV, где Я = 1ЧН(ОС2Н4)19(ОСзНб)СНз).

виде осадка. Также растворы КТ, покрытых ПСМА-Джеффамин, были стабильны только в течение 1-4 дней: чем больше было в растворе избыточного полимера, тем дольше не выпадал осадок КТ. Возможно, такая нестабильность связана со слишком большим различием в длине гидрофобных цепей исходных лигандов на поверхности КТ (С 18) и кумольных фрагментов полимера ПСМА, и, как следствие, слабым гидрофобным взаимодействием между цепями (рис. 13).

Водные растворы КТ, покрытых ПМАО, стабильны во времени и устойчивы в щелочных буферных растворах. В кислых средах такие КТ выпадают в осадок. Связано это с тем, что коллоидный раствор КТ в данном случае стабилизирован за счёт электростатического отталкивания между карбоксилат-ионами на поверхности КТ (рис. 13). В кислых средах карбоксильные группы не заряжены, следовательно, и полимер, и покрытые им КТ становятся нерастворимыми в воде и выпадают в осадок. Относительный КВ водных коллоидных растворов КТ, покрытых ПМАО, составил 30%, что значительно выше результатов, полученных при переводе КТ в воду с помощью МПК.

Наилучшие результаты показали КТ, покрытые ПМАО-Джеффамин: яркость флуоресценции при переводе в воду практически не падает (относительный КВ водного раствора составил 37%), что выгодно отличает эти точки от КТ, покрытых только ПМАО. По-видимому, гидрофильные цепи Джеффамина создают дополнительный барьер между поверхностью КТ и окружающей средой. После перевода в воду с помощью полимера смещения пика флуоресценции не происходит, однако появляется малоинтенсивная широкая полоса эмиссии в области 400-500 нм, вызванная наличием полимера. Полученные КТ, покрытые ПМАО-Джеффамин устойчивы в буферных растворах в интервале рН 3.8-13. Таким образом, в

отличие от КТ, покрытых только ПМАО, полученные КТ устойчивы и в кислых средах, поскольку в данном случае стабилизированы не за счёт электростатического, а за счёт стерического отталкивания объёмных полиэтилен и полипропилен-гликолевых фрагментов (рис. 13).

иммобилизованные антитела

Глава 6. Разработка тест-методов с применением квантовых точек в качестве флуоресцентных меток

В данной главе описано применение КТ в качестве меток в твердофазном иммуноанализе на микропланшетах и в тест-методах на примере определения микотоксина зеараленона (ЗЕА) в образцах пшеницы. В качестве меток использовали КТ Сё8е/62п8 (Х(флуоресц)=530 нм). Провели сравнение КТ, покрытых МПК-дБСА и полимером ПМАО-Джеффамин. Оба покрытия содержат на поверхности карбоксильные группы, которые были использованы для конъюгирования КТ с аналитом и антителами.

Показано, что оба синтезированных конъюгата КТ с антителами анти-

ЗЕА показали лишь слабое взаимодействие с вторичными

антителами, вероятно, вследствие некоторого изменения структуры антител либо

стерических препятствий. Поэтому для проведения

анализа КТ

конъюгировали с аналитом посредством связывания с

конъюгатом ЗЕА с овальбумином (ЗЕА-ОВА). Выбраны

оптимальные условия конъюгации КТ с ЗЕА-ОВА: мольное

І Ї

добавление образца и конъюгата, меченного КТ

Флуоресценция

промывочный буфер

УФ

V первичные Апй-ЗЕА, " связанные с вторичными аналит (ЗЕА)

удаление несвязавшихся конъюгатов и аналита

конъюгат, меченный КТ

примеси

Рис.14 Схема проведения конкурентного иммуноанализа (метка -КТ)

соотношение ОВА:КТ=5:1, бикарбонатный буфер (рН 8.3), время синтеза - 3 часа.

Сначала было проведено сравнение показателей твердофазного иммуноанализа при использовании в качестве меток КТ и фермента пероксидазы хрена (ПХ) на примере количественного определения ЗЕА. На рис. 14 представлен постадийно процесс конкурентного иммуноанализа с КТ в качестве меток, который включает в себя меньше стадий, чем традиционный иммуноферментный анализ (ИФА). Аналитический сигнал -

1.0 0.8-

_ 0.6 <

< 0.4

0.2 0

Метка:

ПХ

КТ

-/л-

флуоресценцию можно наблюдать сразу после стадии промывки от

несвязавшихся компонентов, в то время как ИФА требует добавление субстрата и времени для развития окраски. Таким образом, при использовании в качестве метки КТ требуется меньше операций и времени на проведение

определения.

Градуировочные

кривые при использовании двух меток приведены на рис. 15. Использование КТ в конкурентном иммуноанализе на микропланшете приводит к значительному увеличению чувствительности метода (табл. 4). Было показано, что ПрО в случае применения КТ, покрытых дБСА и амфифильным полимером, практически совпадают. Однако КТ, переведённые в воду с помощью амфифильного полимера, более устойчивы при их конъюгации с ЗЕА-ОВА, в то время как КТ, покрытые МПК, иногда Табл. 4 Аналитические показатели определения ЗЕА твердофазным иммуоноанализом на

0 0.01 0.1 1 10 100 Концентрация ЗЕА, нг/мл

Рис. 15 Градуировочные кривые для определения ЗЕА с применением фермента и К'Г в качестве меток. А/А(1 -относительный аналитический сигнал: оптическая плотность (А=450 нм) для ПХ и интенсивность флуоресценции (А=590 нм ) для анализа с применением КТ

Фермент КТ, покрытые МПК, дБСА КТ, покрытые полимером

ПрО, нг/мл 0.08 0.03 0.03

1С 50. нг/мл 0.4 0.10 0.13

Диапазон линейной зависимости, нг/мл 0.15-20 0.05-0.24 0.05-0.22

выпадали в осадок при активации карбоксильных групп. Возможно, связано это с частичным понижением рН раствора, при этом растворы КТ, покрытых белком, теряют стабильность. В дальнейшей работе для создания иммунохимических тест-систем были использованы КТ, покрытые полимером.

Тест-определение с применением КТ в качестве меток проводили в колонках с использованием геля на основе цианбромактивированной сефарозы 4В и полиэтиленовых подложек (фритов) в качестве носителей. Учитывая максимально допустимый установленный уровень ЗЕА в необработанном зерне и разбавление при пробоподготовке, чувствительность тест-метода должна быть на уровне 5 нг/мл. Аналитическим сигналом для определения ЗЕА в пробе служила флуоресценция детектирующего слоя,

выходом не менее 40%. Установлено, что при наращивании оболочек ZnS на ядрах CdSe увеличение количества прекурсоров сульфида цинка приводит к повышению яркости флуоресценции КТ CdSe/ZnS и к более эффективной изоляции экситона внутри ядра CdSe. Показано, что при получении КТ CdSe/CdS/ZnS диаметр исходных ядер CdSe влияет на величину смещения экситонного пика флуоресценции: чем меньше диаметр исходных КТ, тем сильнее смещаются спектры в длинноволновую область.

3. Разработаны методики перевода КТ из органического растворителя в водные растворы двумя способами: методом замены лигандов и покрытием полимерами. Показано, что яркость флуоресценции гидрофильных КТ, полученных методом замены лигандов, определяется качеством изолирующей оболочки сульфида цинка.

4. Синтезированы амфифильные полимеры для гидрофилизации КТ, установлены оптимальные соотношения между реагентами, при которых образующиеся полимеры водорастворимы. Показано, что КТ, покрытые полиэтиленгликоль-содержащим полимером, сохраняют до 90% яркости флуоресценции, при этом растворы таких КТ стабильны в широком интервале рН (3.8^13).

5. Реализованы методики конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (пероксидаза хрена в качестве метки) и иммунофлуоресцентного анализа (КТ в качестве метки). Отимизированы условия проведения анализа с использованием КТ. На примере определения зеараленона показано, что иммунофлуоресцентный анализ позволяет достичь меньший предел обнаружения по сравнению с иммуноферментным анализом (0.03 и 0.08 нг/мл соответственно). Использование КТ в качестве меток также позволяет значительно сократить время анализа.

6. Разработан и оптимизирован колоночный тест-метод с использованием геля на основе сефарозы и пористых полиэтиленовых фритов в качестве носителя для визуального детектирования присутствия зеараленона с контрольным уровнем 5 нг/мл. Тест-метод апробирован для определения зеараленона в пшенице. Полученные аналитические показатели разработанных тест-методов позволяют рекомендовать их для экспресс-определения зеараленона в образцах пшеницы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.С. Сперанская, В.В. Гофтман, И.Ю. Горячева. Приготовление водорастворимых квантовых точек CdSe/ZnS с кристаллической структурой сфалерита // Российские нанотехнологии. 2013. Т.8. № 1-2. С. 100-104.

2. N.V. Beloglazova, E.S. Speranskaya, S.De Saeger, S. Abé, I.Yu. Goryacheva. Quantum dot based rapid tests for zearalenone detection // Anal. Bioanal. Chem. 2012. V.403. P. 3013-3024.

3. Е.С. Сперанская, В.В. Гофтман, А.О. Дмитриенко, В.П. Дмитриенко, Т.А. Акмаева, И.Ю. Горячева. Синтез гидрофобных и гидрофильных

квантовых точек ядро - оболочка // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология, выпуск 4. 2012. Т.12. С. 3-10.

4. Е.С. Сперанская, В.П. Дмитриенко, А.О. Дмитриенко, Д.А. Потапкина, И.Ю. Горячева. Влияние условий синтеза на оптические свойства квантовых точек селенида кадмия // Российские нанотехнологии. 2011. Т.6. С. 126-130.

5. И.Ю. Горячева, Е.С. Сперанская. Способ повышения стабильности водного раствора квантовых точек - наночастиц селенида кадмия, покрытых меркаптокислотами. Заявка на патент 2011123121 Дата приоритета 09.06.2011. Решение на выдачу от 30 октября 2012 года.

6. И.Ю. Горячева, Е.С. Сперанская. Приготовление стабильных водорастворимых квантовых точек, покрытых амфифильным полимером // Материалы конференции с международным участием по аналитической спектроскопии. Туапсе. 23-29 сентября, 2012. С. 320.

7. Е.С. Сперанская, В.В. Гофтман, И.Ю. Горячева, D. Knopp. Гидрофилизация полупроводниковых квантовых точек для применения в качестве флуоресцентных меток // «Химия биологически активных веществ»: Межвузовский сборник научных трудов Всероссийской школы-конференции молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием. Саратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2012. С. 289-290.

8. В.В. Гофтман, Е.С. Сперанская, Д.В. Потапкин, O.A. Горячева. Квантовые точки CdSe как флуоресцентные метки в иммунохимических тест-методах анализа природных токсикантов // «Химия биологически активных веществ»: Межвузовский сборник научных трудов Всероссийской школы-конференции молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием. г.Саратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2012. С. 280-282.

9. N.V. Beloglazova, P.S. Shmelin, E.S. Speranskaya, E.P. Grebennikov, I.Yu. Goryacheva, S.De Saeger. Quantum dots and quantum dots loaded liposomes as the labels for immunoassay // Xlth International Conference on AgriFood Antibodies. Vienna, Austria. 3d - 5th September, 2012. P. 112.

10. E. Speranskaya, I. Goryacheva, N. Beloglazova. Quantum dots as new label for rapid tests // 5th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis. Prague. 1st - 4th October, 2011. P. 264.

11. Е.С. Сперанская, И.Ю. Горячева, B.B. Гофтман. Синтез и применение квантовых точек в биохимических тест-методах // Материалы Всероссийской научной школы-семинара «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине-2011». Саратов. 25-27 октября, 2011. С.100-101.

12. Е.С. Сперанская, Д.А. Потапкина. Синтез и оптические свойства квантовых точек селенида кадмия // Материалы XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов, молодых учёных «Ломоносов». Москва, 11-15 апреля, 2011.

13. Е.С. Сперанская. Синтез наночастиц селенида кадмия в водных растворах // Материалы XVII Международной конференции студентов, аспирантов, молодых учёных «Ломоносов». Москва, 12-15 апреля, 2010.

Подписано в печать 22.03.2013. Формат 60x84 i/i6. Бумага офсетная. Гарнитура Times.

Объем 1.5 печ. л. Тираж 120 экз. Заказ № 56-Т _Типография СГУ_

г. Саратов, ул. Б. Казачья 112а тел.: (845-2) 27-33-85

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Сперанская, Елена Сергеевна, Саратов

Саратовский государственный университет имени Н.Г.Чернышевского

Институт химии

04201355604 На праТРУкописи

Сперанская Елена Сергеевна

КВАНТОВЫЕ ТОЧКИ НА ОСНОВЕ СЕЛЕНИДА КАДМИЯ: ПОЛУЧЕНИЕ, МОДИФИКАЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММ УНОХИ МИЧЕ С КОМ

АНАЛИЗЕ

02.00.04 - физическая химия 02.00.02 - аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Дмитриенко Александр Олегович доктор химических наук, доцент Горячева Ирина Юрьевна

Саратов - 2013

выполнена на кафедре общей и неорганической химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Л/

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ............... 5

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................. 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................. 9

1.1. Квантовые точки в зонной теории. Уравнение Брюса............ 9

1.2. Особенности оптических свойств квантовых точек............... 11

1.3. Применение квантовых точек в качестве флуоресцентных биометок.......................................................................... 13

1.4. Синтез квантовых точек селенида кадмия и квантовых точек структуры ядро-оболочка..................................................... 14

1.5. Перевод квантовых точек из органических растворителей в водные растворы............................................................... 18

1.6. Применение квантовых точек в иммуноанализе в качестве флуоресцентных меток........................................................ 22

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................. 24

2.1. Вещества и материалы................................................... 24

2.2. Характеристика свойств квантовых точек........................... 25

2.3. Синтез коныогатов для проведения иммуноанализа.............. 27

2.4. Подготовка носителей, методики проведения анализа и обработки результатов......................................................... 28

ГЛАВА 3. СИНТЕЗ И ХАРАКТЕРИСТИКА НАНОКРИСТАЛЛОВ СЕЛЕНИДА КАДМИЯ............................................................... 33

3.1. Синтез квантовых точек селенида кадмия в водном растворе... 33

3.2. Увеличение стабильности растворов гидрофильных квантовых точек................................................................ 35

3.3. Получение квантовых точек Сс18е гексагональной и кубической структуры в органическом растворителе и характеристика их свойств................................................... 36

3.4. Оптимизация процесса очистки квантовых точек Сс18е.......... 42

ГЛАВА 4. НАРАЩИВАНИЕ ОБОЛОЧЕК БОЛЕЕ ШИРОКОЗОННЫХ ПОЛУПРОВОДНИКОВ НА ЯДРАХ СЕЛЕНИДА КАДМИЯ............... 45

4.1. Получение квантовых точек состава СсЗЗе^пБ..................... 47

4.2. Исследование влияния параметров синтеза на квантовый выход флуоресценции, морфологию и кристаллическую

структуру квантовых точек С(18е/2п8..................................... 4$

4.3. Улучшение воспроизводимости наращивания оболочек 2п8

на ядрах С(18е................................................................... 55

4.4. Получение квантовых точек состава С(18е/Сс18/2п8............... 56

4.5. Влияние послойного наращивания оболочки на оптические свойства полученных квантовых точек.................................... 58

4.6. Влияние размера ядер селенида кадмия на положение максимума флуоресценции КТ состава С<38е/Сс18/2п8................ 62

4.7. Изменение яркости флуоресценции квантовых точек в процессе послойного нанесения оболочек................................ 64

ГЛАВА 5. ПЕРЕВОД КВАНТОВЫХ ТОЧЕК ИЗ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ В ВОДНЫЕ РАСТВОРЫ................................... 68

5.1. Метод перевода квантовых точек в водные растворы путём замены исходных лигандов на меркаптопропионовую кислоту...... 70

5.1.1. Отработка воспроизводимой методики............................ 70

5.1.2. Увеличение стабильности водных растворов квантовых

точек.............................................................................. 73

5.1.3. Изменение в спектрах флуоресценции квантовых точек

после перевода в водные растворы......................................... 74

5.2. Метод перевода квантовых точек в водные растворы путём покрытия амфифильными полимерами.................................... 76

5.2.1. Получение амфифильных полимеров.............................. 76

5.2.2. Получение гидрофильных квантовых точек и изучение их свойств........................................................................... 87

5.2.3. Очистка водных коллоидных растворов квантовых точек от избытка полимера.............................................................. 91

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-МЕТОДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 3 Е А РАЛЕ I ЮНА С ПРИМЕНЕНИЕМ КВАНТОВЫХ ТОЧЕК В КАЧЕСТВЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТОК.................................... 95

6.1. Конъюгация квантовых точек с иммунореагентами.............. 96

6.2. Сравнение твердофазного иммуноанализа с пероксидазой

хрена и квантовых точек в качестве метки................................ 98

6.3. Разработка иммунофлуоресцентного колоночного тест-метода 101

6.4. Аналитические характеристики колоночных тест-методов...... 104

ВЫВОДЫ........................................................................ 107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................... 108

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

FLISA - флуоресцентный твердофазный иммуноанализ

SILAR - Successive Ion Layer Adsorption and Reaction (метод послойного

наращивания оболочек)

Анти-ЗЕА - моноклональные мышиные антитела к зеараленону

БСА — бычий сывороточный альбумин

дБСА - денатурированный бычий сывороточный альбумин

ДМФА - диметилформамид

ЕС - Евросоюз

ЖХ -МС/МС - высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемной

масс-спектрометрией

ЗЕА - зеараленон

ЗЕА-ПХ - конъюгат зеараленона с пероксидазой хрена

ЗЕА-ОВА - конъюгат зеараленона с овальбумином

ЗЕА-КМО - зеараленон -б'-карбоксиметилоксим

ИК - инфракрасный

ИФА — иммуноферментный анализ

ИФлА - иммунофлуоресцентный анализ

ИХА — иммунохимический анализ

KB - квантовый выход

KT — квантовые точки

МПК - меркаптопропионовая кислота

нм - нанометр

ОВА - овальбумин

ОДА - октадециламин

ОДЕ - октадецен

OK - олеиновая кислота

OJIA - олеиламин

ПМАО - поли(малеиновый ангидрид-октадецен) ПСМА - поли(стирол-малеиновый ангидрид) ПрО - предел обнаружения ПХ - пероксидаза хрена ПЭГ — полиэтиленгликоль

ТМБ/Н2О2- 3,3\5,5'-тетраметилбензидин/пероксид водорода

ТОФ - триоктилфосфин ТОФО - триоктилфосфиноксид ТОФБе - триоктилфосфин селенид УФ - ультрафиолетовый ФСБ - фосфатно-солевой буфер эВ — электронвольт

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (или квантовые точки - КТ) находят широкое применение в самых разных приложениях биоанализа - от иммунохимических тест-методов до визуализации тканей и отслеживания лекарственных веществ в организме. Благодаря уникальным оптическим свойствам — зависимость цвета эмиссии от состава и размера КТ, высокая фотостабильность, широкие спектры поглощения — КТ всё чаще вытесняют используемые ранее органические красители.

В связи с высокой востребованностью КТ публикуется много работ по усовершенствованию методик их синтеза с целью создания нанокристаллов с улучшенными свойствами. В последнее время наметилась тенденция получения КТ из доступных и стабильных реагентов путём использования воспроизводимых методик. Кроме того, важной проблемой остаётся перевод КТ из органических растворителей (в которых получают нанокристаллы) в водные растворы без потери яркости и коллоидной стабильности. На сегодняшний день опубликован ряд работ по применению КТ в качестве меток в твердофазном иммуноанализе, и лишь единичные работы посвящены применению КТ в иммунохимических тест-методах.

- отработать методики получения квантовых точек структуры ядро-оболочка состава Сс18е^п8 и Сс18е/Сс18/^п8 с длиной волны максимума флуоресценции в интервале 520-650 нм, что соответствует цвету свечения от зелёного до красного; осуществить выбор оптимальных параметров синтеза для воспроизводимого получения КТ с высокой яркостью флуоресценции;

- сравнить показатели твердофазного иммунофлуоресцентного анализа (КТ в качестве меток) и иммуноферментного анализа (пероксидаза хрена в

качестве метки) на примере количественного определения микотоксина зеараленона;

— разработать неинструментальный колоночный тест-метод с применением флуоресцентных квантовых точек Сс18е/7п8 в качестве биометок; оптимизировать методики проведения анализа на примере визуального детектирования микотоксина зеараленона в пшенице.

Научная новизна состоит в следующем:

- отработаны методики получения квантовых точек структуры ядро-оболочка состава Сс18е/2п8 и Сс18е/Сс18/2п8 с длиной волны максимума флуоресценции от 520 до 650 нм;

- синтезированы амфифильные полимеры из недорогих и доступных реагентов; отработана методика перевода КТ из органического растворителя в водные растворы путём покрытия амфифильным полимером;

- проведена сравнительная оценка твердофазного иммуноанализа при использовании в качестве меток КТ и фермента на примере количественного определения микотоксина зеараленона;

Практическая значимость работы.

На защиту автор выносит:

• Оптимизированную методику получения КТ ядро/оболочка из стабильных и доступных реагентов.

• Новый подход к повышению стабильности водных коллоидных растворов KT, покрытых меркаптокислотами, на основе химического связывания растворенного кислорода.

• Разработанный иммунохимический тест-метод с применением KT в качестве флуоресцентных биометок.

Публикации. По теме данного исследования опубликовано 12 печатных работ: 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 - в сборнике статей, 7 тезисов докладов, из них 4 - на Международных конференциях; получено решение о выдаче патента на изобретение (Заявка №2011123121/05(034311)).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на следующих конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 20102011» (Россия, Москва, 2010, 2011), Всероссийская научная школа-семинар «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине - 2011» (Россия, Саратов, 2011), 5th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (Czech Republic, Prague, 2011), Xlth International Conference on AgriFood Antibodies (Austria, Vienna, 2012), Всероссийская школа-конференция «Химия биологически активных веществ» молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «ХимБиоАктив-2012» (Россия, Саратов, 2012), Конференция с международным участием по аналитической спектроскопии (Россия, Туапсе, 2012), International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics SFM 2012 (Россия, Саратов, 2012).

Структура Ii объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 147 ссылок. Работа изложена на 118 страницах, содержит 56 рисунков и 14 таблиц.

Глава 1. Обзор литературы

Уникальные оптические свойства КТ делают их перспективным материалом для применения в самых различных областях. В частности, ведутся разработки по использованию КТ в светоизлучающих диодах, дисплеях [1,2], лазерах [3-6], солнечных батареях [7-9]. Кроме того, КТ могут быть переведены в водные растворы путём модификации их лигандного слоя. Они могут быть сконъюгированы с биомолекулами за счёт ковалентного связывания между группами лигандов, покрывающих КТ, и функциональными группами биомолекул [10]. В таком виде они могут быть использованы в качестве флуоресцентных меток в самых разных приложениях биоанализа - от иммунохимических тест-методов до визуализации тканей и отслеживания лекарственных веществ в организме [11-13]. Применение КТ в биоанализе на сегодняшний день является одной из перспективных областей применения люминесцирующих нанокристаллов.

Такие уникальные характеристики КТ, как зависимость цвета эмиссии от размера, высокая фотостабильность, широкие спектры поглощения делают их идеальными флуорофорами для сверхчувствительной, многоцветной детекции биологических объектов и медицинской диагностики, требующей регистрации нескольких параметров одновременно [14,15].

1.1. Квантовые точки в зонной теории. Уравнение Брюса

Полупроводниковые КТ представляют собой нанокристаллы, размеры которых по всем трём направлениям меньше радиуса экситона Бора для данного материала [11, 12]. В таких нанокристаллах наблюдается размерный эффект: оптические свойства, в частности ширина запрещенной зоны и коэффициент экстинкции, зависят от размеров наночастиц и их формы [6,14,16,17].

На рис. 1.1. схематически показан процесс образования экситона в КТ. КТ, в отличие от микрокристаллических полупроводников, имеют дискретные уровни энергии и в валентной зоне, и в зоне проводимости [18]. При возбуждении КТ энергиями, превышающими Е8 (для КТ Ее представляет собой энергетический зазор не между зонами, а между высшим уровнем в валентной зоне и низшим уровнем зоны проводимости) электроны (отображены заштрихованным кружком) из валентной зоны абсорбируют эту энергию, то есть переходят в запрещённую зону, при этом образуется элеткронно-дырочная пара (именуемая экситоном). Затем электрон и дырка (отображена незаштрихованным кружком) рекомбинируют, при этом испускается фотон с энергией соответствующей Е§ (как более вероятный переход в бездефектном полупроводнике). Как правило, часть поглощённой энергии расходуется безызлучательным путём (АЕ), поэтому энергия флуоресценции всегда меньше поглощённой энерги. Если в КТ присутствуют примеси и/или дефекты, то внутри запрещённой зоны возникают уровни, из-за чего спектр флуоресценции КТ будет содержать наравне с пиком,

ДОВОДИМ!

валентная зона

Е,„ ^^

^(возбужд.)

Рис. 1.1. Схематическое изображение процессов возбуждения и излучения в КТ с позиций зонной теории полупроводников.

соответствующим энергии Eg, длинноволновые полосы, соответствующие переходам Еь Е2, Е3, Е4.

Необходимо заметить, что возникшие в результате поглощения энергии электрон и дырка не движутся независимо друг от друга, расстояние между ними характеризуется радиусом экситона Бора - постоянной характеристикой данного материала [6, 19]. В КТ размеры кристаллов по всем трём направлениям меньше радиуса экситона Бора для данного материала.

Для описания оптических свойств КТ, их рассматривают в рамках квантовой теории частицы в ящике. При этом учитывают кулоновское взаимодействие между возникшими разноимёнными зарядами (электроном и дыркой) и предполагают сферическую форму нанокристаллов КТ.