Роль парамагнитных интермедиатов в ферментативном окислении пероксидазой хрена тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

АФАНАСЬЕВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

РОЛЬ ПАРАМАГНИТНЫХ ИНТЕРМЕДИАТОВ В ФЕРМЕНТАТИВНОМ ОКИСЛЕНИИ ПЕРОКСИДАЗОЙ ХРЕНА

01 04 17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ООЗ163379

Новосибирск - 2007

003163879

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат химических наук Тарабан Марк Борисович Официальные оппоненты-

кандидат физико-математических наук Стась Дмитрий Владимирович доктор химических наук Федорова Ольга Семёновна

Ведущая организация:

Институт органической химии им НД Зелинского РАН

Защита диссертации состоится «30» января 2008 г в 15 00 на заседании диссертационного совета Д 003 014 01 в Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу 630090, Новосибирск-90, ул Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН

Автореферат разослан «■/£>» декабря 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор химических наук А А Онищук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последнее десятилетие методы спиновой химии находят все более широкое применение для исследования сложных химических и биологических процессов Их использование позволяет решить одну из ключевых задач современной химии - определение строения и свойств короткоживущих интермедиатов химических реакций

Изучение ферментативных реакций и установление их элементарных стадий имеет особое значение как для понимания механизмов каталитического действия ферментов, так и для исследования актуальной проблемы участия ферментов в процессах регулирования образования и гибели свободнорадикальных частиц в биологических системах

Совместное применение методов спиновой химии и расчетных методов квантовой химии позволяет получать важную информацию о механизмах реакций, катализируемых ферментами Кроме того, установление детальных механизмов ферментативного катализа, важно для понимания факторов, обеспечивающих его эффективность и высокую степень специфичности Спиновые состояния парамагнитных интермедиатов ферментативного каталитического цикла должны обеспечивать такую корреляцию электронных спинов, которая никоим образом (например, вследствие спинового запрета) не нарушила бы закономерной последовательности взаимопревращений в каталитическом цикле Механизм, обеспечивающий необходимую корреляцию электронных спинов, изучен слабо В этой связи, методы спиновой химии представляют огромную ценность, поскольку именно их применение позволяет вскрыть роль спиновых состояний и факторы, определяющие селективность ферментативных процессов Основные цели работы:

1 Кинетическими методами и методами спиновой химии установить элементарные стадии взаимодействия пероксидазы хрена с субстратами нативным - никотинамидадениндинуклеотидом (НАДЕТ), и

специфичным, синтетическим аналогом НАДН - 1,4-дигидро-2,3-диметид-3,5-дикарбометокси-4-нитрофенилпиридином, нифедипином (НФ)

2 Разработать кинетическую модель, описывающую последовательность взаимопревращений интермедиатов каталитического цикла пероксидазы хрена

3 В рамках теории радикальных пар дать описание магнитных и спиновых эффектов для многоспиновых ферментативных систем

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование детального механизма первой стадии каталитического цикла пероксидазы хрена Показано, что при аэробном окислении субстратов без перекиси водорода, начальной стадией цикла является акт одноэлектронного переноса в фермент-субстратном комплексе с образованием ферропероксидазы Впервые зарегистрированы эффекты ХПЯ в ферментативном процессе Впервые использовались расчетные методы квантовой химии для описания многоспиновых ферментативных систем С помощью такого подхода удалось доказать формирование прочного фермент-субстратного комплекса, определить, что в акте одноэлектронного переноса дигидропиридиновый фрагмент НАДН в фермент-субстратном комплексе располагается близко к плоскости гема Продемонстрировано влияние спинового состояния исходной парамагнитной пары на каталитический цикл пероксидазы хрена Также получены доказательства одноэлектронного многостадийного окисления НАДН в биологических системах НАДН —> НАДН + —> НАД' —> НАД1' При исследовании системы НАДН - ПХ методом ХПЯ показано, что неконкурентное ингибирование пероксидазы изменяет ее акцепторные свойства, но существенно не влияет на расстояния в фермент-субстратном комплексе

Практическая ценность работы Проведенное исследование раскрывает элементарный механизм действия пероксидазы хрена, как катализатора, в аэробных условиях в отсутствии инициатора окисления, перекиси водорода, и меняет представление о проявлениях стадии

одноэлектронного переноса в реакциях гем-содержащих ферментов, а также имеет огромное значение для понимания селективного действия ферментов и роли спиновых состояний парамагнитных интермедиатов в обеспечении селективности Тот факт, что парамагнитные интермедиаты могут находиться в двух состояниях, одно из которых является реакционноспособным и приводит к следующей стадии каталитического цикла, а второе возвращает реакцию к исходным реагентам, создает предпосылки для использования этих знаний для разработки новых биотехнологических процессов с использованием моделей активных центров ферментов

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих международных конференциях и симпозиумах 8th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena, Chapel Hill, NC, USA, September, 2003, Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, Россия, 2004, Biological Research Trust Workshop, The Royal Society, London, United Kingdom, January 15, 2004, 2nd International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances, Novosibirsk, Russia, 2004, XVIII Симпозиум «Современная химическая физика», Туапсе, Россия, 22 сентября - 3 октября, 2006

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 3 статьях, 1 обзоре и 3 тезисах международных научных конференций и симпозиумов

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 77 наименований Работа изложена на 131 странице, содержит 2 таблицы, 1 схему и 44 рисунка

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении изложена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи работы

-6В первой главе представлен обзор литературы, посвященный современным представлениям о реакциях, катализируемых пероксидазой хрена (ПХ), а также методам спиновой химии как инструменту исследования ферментативных процессов Описаны особенности процессов окисления субстратов (изобутиральдегида и НАДН), катализируемых ПХ, окисления НАДН в колебательной пероксидазно-оксидазной реакции Рассмотрены методы исследования элементарных процессов, приводящих к свободным радикалам и аспекты применения методов спиновой химии для исследования сложных ферментативных систем Обсуждаются первые попытки применения методов спиновой химии (магнитного эффекта, МЭ) для установления механизмов ферментативных процессов При исследовании окисления 2-метил-1-(триметилсилилокси)проп-1-ена, катализируемого ПХ в присутствии перекиси водорода в стационарном режиме была установлена магниточувствительная стадия процесса - стадия каталитического цикла, включающая взаимодействие компаунда II и субстрата

На основании сопоставления экспериментальных результатов с квантовохимическими расчетами было показано, что радикальная пара, в которой происходит перенос электрона образуется в триплетном состоянии, приводящем к регенерации компаунда II, в то время как ее синглетное состояние приводит к исходной пероксидазе Так, впервые было продемонстрировано влияние спинового состояния радикальной пары на взаимопревращения активных парамагнитных интермедиатов в каталитическом цикле При изучении механизма окисления НАДН в режиме осцилляций было зарегистрировано влияние внешнего магнитного поля на изменение концентрации кислорода, но вследствие отсутствия модели описания магнитного эффекта, проведенные исследования не позволили решить вопрос о магниточувствительной стадии процесса, а также установить точный механизм взаимопревращений парамагнитных интермедиатов Последний раздел литературного обзора посвящен описанию теории магнитных и спиновых эффектов, применяемой для квантово-

механических расчетов вероятности рекомбинации парамагнитных пар в многоспиновых системах

Заканчивается обзор литературы постановкой задачи, в рамках которой планировалось применение методов спиновой химии для исследования радикальных стадий окисления НАДН и его синтетических аналогов, катализируемого пероксидазой хрена, а также для установления структуры и механизмов взаимопревращений парамагнитных интермедиатов этих процессов Предлагается использовать методики остановленной струи со спектрофотометрической регистрацией в сочетании с экспериментами по наблюдению магнитных и спиновых эффектов для получения информации о магниточувствительных стадиях ферментативного окисления и спиновых состояниях образующихся интермедиатов Для установления структуры парамагнитных интермедиатов стадии инициирования каталитического цикла пероксидазы хрена анализируются эффекты химической поляризации ядер в акте фотоиндуцированного одноэлектронного переноса на начальной стадии процесса, а также исследуются спектроскопические характеристики промежуточных частиц в условиях остановки каталитического цикла Для получения выводов о структуре и спиновых состояниях парамагнитных интермедиатов следует провести моделирование экспериментальных магнитных эффектов и эффектов химической поляризации ядер в рамках описания многоспиновых ферментативных систем на основе теории радикальных пар

Во второй главе описаны экспериментальные установки, в частности быстросканирующий спектрофотометр остановленной струи ОЫБ-КЭМ-1000, модифицированный для проведения реакций смешения в магнитных полях различной напряженности, а также установка для исследования фотоиндуцированной химической поляризации ядер в ферментативных системах на базе серийного спектрометра ЯМР Вгикег ОРХ-200 ('Н, 200 мГц) Также приведена подробная методика приготовления образцов

-8В третьей главе обсуждаются результаты кинетических исследований автоокисления НАДН в средах с различным значением рН и флуориметрическое определение концентраций перекиси водорода, накапливающейся при таком автоокислении Показано, что даже в кислых средах при выдерживании раствора при комнатной температуре концентрация образующейся перекиси столь мала (таблица 1), что только через двухчасовой промежуток времени достигает значений, достаточных для инициирования процесса окисления НАДН (1) в результате превращения пероксидазы хрена в компаунд I (2)

НАДН + О, -I W НАД+ + Н202 (1)

Per3" + Н202 -> компаунд I + Н20 (2)

Что касается нейтрального и щелочного значений рН, то в данных условиях концентрация образовавшейся перекиси на два порядка ниже, чем в кислых средах, что недостаточно для инициирования каталитического цикла, включающего превращение пероксидазы хрена в компаунд I

Таблица 1. Концентрация накопленной перекиси водорода при окислении раствора НАДН в различных средах

Среда с(Н202), мкМ

NaOH (рН = 8 1) 0 19

фосфатный буфер (КН2Р04 + К2НР04, рН = 7 2) 02

NaOH + НС1 (рН = 6 4) 14

MES буфер (рН = 5 56) 43

Основываясь на полученных данных о пренебрежимо малой скорости автоокисления НАДН в нейтральных и щелочных средах, не приводящего к достаточным концентрациям перекиси, а также принимая во внимание термодинамические и кинетические особенности данной реакции, разумно

было предположить, что в отсутствии перекиси водорода инициирующей стадией является акт одноэлектронного переноса в фермент-субстратном комплексе [Рег3+" НАДН] с образованием ферропероксидазы (Рег2+) (3)

Рег3+ + НАДН — [Рег3+—НАДН] -» Рег2+ + НАДН"н

(3)

Поскольку образующаяся в акте одноэлектронного переноса ферропероксидаза быстро реагирует с растворенным кислородом буферного раствора с образованием компаунда III (4), для доказательства проявления стадии одноэлектронного переноса между НАДН и пероксидазой хрена в процессе ферментативного окисления, была предпринята попытка остановить реакцию окисления НАДН на стадии образования Рег2+, проводя взаимодействие между пероксидазой хрена и НАДН в бескислородной среде

Рег2+ + 02 ■

■ компаунд III

(4)

позволяет получать 006- Рет!*+Рег3*

трехмерные зависимости 005-

оптического поглощения смеси от времени реакции и длины волны Анализ © 0.04-S X « 3 ооз-о о 002- Рег> \ 1 3ef2\\

кинетики взаимопревращений активных парамагнитных 001000- \ iS?4

400 420 440 460 480 500

интермедиатов пероксидазы хрена на разных длинах волн в фиксированный момент Длина волны, нм Рисунок 1 Суммарный спектр поглощения (Рег^+Рег2*), спектр Per3* и результирующий спектр Per** в реакции ПХ+НАДН Перед смешением растворы реагентов насыщались сверхчистым ксеноном

времени показал, что спектр поглощения реакционной смеси представляет

собой сумму поглощений исходной пероксидазы и интермедиата стадии инициирования реакции, Рег2+

Действительно, после вычета спектра пероксидазы хрена из суммарного спектра реакционной смеси, результирующим оказался известный из литературы спектр Рег2+ с максимумом на 435 нм (рисунок 1)

На основании анализа кинетических кривых, зарегистрированных при проведении реакции между ПХ и НАДН в бескислородной среде, был сделан важный вывод о том, что начальной стадией процесса ферментативного окисления НАДН в отсутствии перекиси водорода, является стадия образования восстановленной формы пероксидазы, ферропероксидазы

Кроме того, было проведено математическое моделирование кинетической кривой окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена в присутствии кислорода в буферном растворе, в предположении определенной последовательности стадий взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов пероксидазы (5)

ki кг къ

Рег2+ —*■ компаунд III —*■ компаунд I —>- компаунд II /г-.

Наилучшее совпадение

экспериментальной и расчетной кривых

(рисунок 2) получено при включении в модель в качестве первой стадии акта переноса электрона между НАДН и пероксидазой хрена

приводящего к

ПХ отн ед

0 22 ^^^..............................................

0 18 g

0 14 -J

0 10

0 5 10 15 20 Время с Рисунок 2 Аналитическое описание экспериментальной кинетической зависимости для реакции пероксидазы и НАДН в рамках предложенной последовательности стадий (о) экспериментальная зависимость, (-) моделирующая кривая

образованию восстановленной формы пероксидазы, Рег2+

Полученные результаты позволили впервые обосновать предположение о том, что первой стадией окисления НАДН в аэробных условиях в отсутствии перекиси водорода является акт одноэлектронного переноса между субстратом и нативным ферментом с образованием восстановленной формы пероксидазы хрена, так называемой, ферропероксидазы (Рег2+) В этом случае каталитический цикл окисления НАДН пероксидазой отличается от общепринятых представлений и включает последовательность стадий, приведенную на рисунке 3

В четвертой главе обсуждаются результаты исследований методами спиновой химии (ХПЯ и МЭ) реакций окисления НАДН и нифедипина, катализируемых пероксидазой хрена в аэробных условиях в отсутствии перекиси водорода

Анализ эффективных констант скоростей, извлекаемых для реакции окисления НАДН, позволил

построить экспериментальную полевую зависимость магнитного эффекта, рассчитываемого как отношение средних значений эффективных констант в магнитном поле к соответствующим константам в нулевом поле При этом такая зависимость от внешнего магнитного поля была зарегистрирована только для константы к\ (рисунок 4) в последовательности стадий (5)

Наиболее вероятной магниточувствительной стадией является акт переноса электрона между нативной ПХ и НАДН Последующее

N НАДН НАД + Н* N

v.__ •'

I Per3* Per2* I \

N(his) N(hts)\

'НАД '\02

%НАДН V

J?n N^.

компаУнД|1 компаунд III >f

c/H 9 N

N

N04S)

N(Ws)

НАДН _.„,_ ^

НАД' \ компаунд I

N¡(115)

Рисунок 3. Каталитический цикл окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, в отсутствии перекиси водорода

превращение ферропероксидазы в реакции с кислородом (рисунок 3) протекает в кинетическом диапазоне, поэтому скорость образования компаунда III будет намного меньше скорости гипотетически возможной спиновой конверсии в паре (Рег2+ Ог), следовательно, этот

процесс, скорее всего, не будет спиновозависимым Взаимодействие компаунда III с радикалом НАД' тоже не может быть источником заметного магнитного эффекта, если в результате его встречи с радикалом НАД- в объеме образуется так называемая F-napa, в которой, как известно, не формируются значительные магнитные эффекты Что касается последующих стадий каталитического цикла, то при взаимодействии компаунда I и НАДН не происходит формирования РП, а стадия образования пероксидазы в результате реакции между компаундом II и молекулой НАДН вообще не учитывалась в аналитической функции, поскольку в исследованном временном диапазоне данная стадия не наблюдалась Таким образом, имеются достаточные доказательства полагать, что зависимость константы к\ от напряженности внешнего магнитного поля обусловлена его влиянием на скорость образования ферропероксидазы в процессе одноэлектронного переноса между ИХ и НАДН

Для проверки предположения о формировании магнитного эффекта на первой стадии каталитического цикла был проведен теоретический расчет полевой зависимости магнитного эффекта для парамагнитной пары (Рег2+ НАДН+-) Расчет вероятности рекомбинации исследуемой РП проводился в

1 2п

10- Гх

О 08- 1 У

X 1 7

IT 06- 1 /

04-

0 1000 2000 3000 4000

Магнитное поле, Гс

Рисунок 4 Магнитный эффект для относительной

константы к\ реакции окисления НАДН,

катализируемой пероксидазой хрена (усреднение

трех экспериментальных серий, в каждой по 4

измерения в поле и без поля, соответственно)

рамках формализма матрицы плотности для двухпозиционной модели

Основы этого подхода подробно описаны в первой главе

диссертационной работы Предполагалось, что наблюдаемая спиновая эволюция в РП определяется взаимодействием электронных спинов с постоянным внешним магнитным полем,

изотропным сверхтонким взаимодействием неспаренных электронов с магнитными ядрами и обменным взаимодействием между неспаренными электронами, которое расщепляет термы радикальной пары на дублетный и квартетный

Экспериментальная зависимость МЭ (рисунок 4) демонстрирует хорошее согласие с теоретической (рисунок 5) в

предположении, что РП (Рег2* НАДНГ') образуется в акте одноэлектронного переноса от НАДН к нативной ПХ в квартетном состоянии

Интеркомбинационная конверсия переводит нереакционноспособное исходное квартетное спиновое состояние в реакционноспособное дублетное

1 — IV(Q)

0 72 к

0 68 Д ГЛ

0 64 ' \ I \

0 60 - \ N.

0 56 U 1 it

) 200 400 600 S00 1000

Магпииюе поле, Гс Рисунок 5 Теоретический расчет полевой зависимости (1-ЩО)) для пары (Рег2+ НАДН'+)°, соответствующей экспериментальной полевой зависимости константы к, в реакции ПХ с НАДН

Per2*

компаунд til НАД + Н*

Рисунок 6 Спиновая эволюция в паре (Per2* НАДН +) Q и D — соответственно, квартетное и дублетное спиновые состояния парамагнитной пары (Per2* НАДН

Последнее в результате рекомбинации (обратного переноса электрона) обеспечивает регенерацию исходной ПХ и НАДН (рисунок 6)

Таким образом, проведенные исследования влияния магнитного поля на кинетику процесса каталитического окисления НАДН пероксидазой хрена продемонстрировали, что начальной стадией ферментативного окисления НАДН в отсутствии перекиси водорода является акт одноэлектронного переноса между субстратом и нативным ферментом с формированием РП (Рег2+ НАДН").

Дополнительным подтверждением наличия стадии одноэлектронного переноса в

каталитическом цикле ПХ стали исследования

магнитных эффектов в реакциях ферментативного окисления синтетического аналога НАДН,

нифедипина (НФ) Было показано, что при окислении нифедипина наблюдается аналогичная последовательность взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена (5), причем магниточувствительной также оказывается эффективная константа первой стадии процесса. Расчет в рамках теории радикальных пар для многоспиновых систем показал, что экспериментальная зависимость МЭ совпадает с теоретической в предположении, что магниточувствительной стадией, также как и в случае реакции с НАДН, является первая стадия каталитического цикла, то есть окисление НФ так же начинается со стадии

7 6 5 4 3 2 1 0

З.М.Я

Рисунок 7. Эффекты 1Н ХПЯ в реакции фотоиндуцированного окисления НАДН, катализируемого ПХ (1) реакционная смесь НАДН и ПХ до облучения, (2) времяразрешенная фотоиндуцированная 1Н ХПЯ 5, м д 2 75, эмиссия (С-4 протоны НАДН), 4 75 (НОО)

одноэлектронного переноса и формирования РП (Рег2+ НФ+") в квартетном состоянии

Рег3+

е ) -- Рег2+ + НАДН"+

НАДН-^ Нф"+

НФ

Кроме того, наблюдение эффекта ХПЯ (рисунок 7) при взаимодействии фотовозбужденного НАДН с пероксидазой хрена, который, согласно теоретическим расчетам, формируется в результате квартет-дублетной эволюции в РП (Рег2+ НАДН+) и проявляется только на С(4) атомах НАДН (рисунок 8), не только подтверждает вывод о

возможности переноса электрона между НАДН и гемом пероксидазы, но и позволяет сделать два важных вывода

Первый вывод касается доказательства образования катион-радикала НАДН, которое постулировалось при анализе магнитного эффекта Такой вывод имеет принципиально важное значение, поскольку является убедительным доказательством возможности одноэлектронного постадийного окисления НАДН в биологических системах НАДН —» НАДН'+ —» НАД —> НАД+ Второй вывод основан на особенностях ингибирования пероксидазы продуктами ферментативного окисления и формирования фермент-субстратного комплекса Показано, что при

(1) н н -хг>сжнг >roNlv N 2= "н н ><>СО№2 у - R * * D н н —- ( J Per3"1- У R

1 R i

— а, If ь, (2) [- -Г+'е" +- ЧР ь2 -if ь, в 4f ь,_ D — а] -if b,

Рисунок 8 Спиновая эволюция в паре (Pet2* НАДН'*) (1) Q и О — квартетное и дублетное спиновое состояние парамагнитной пары (Per2" НАДН'*)00, (2) электронные структуры пероксидазы (Per3*) и ферропероксидазы (Рег2+) (*) Поляризованные С(4)-протоны НАДН

неконкурентном ингибировании продуктом окисления (НАД*") реакция смешения ПХ и НАДН не наблюдается Однако такое неконкурентное ингибирование не влияет на фотоиндуцированный перенос электрона между ферментом и субстратом (возможно, при этом меняются акцепторные свойства пероксидазы, например, полуволновой потенциал восстановления), не препятствуя образованию фермент-субстратного комплекса и не оказывая существенного влияния на расстояния между активным центром фермента и связанным с ним в комплекс субстратом

Наблюдение влияния внешнего магнитного поля на эффективные константы скорости трансформации активных частиц каталитического цикла пероксидазы указывает на зависимость каталитических процессов от спиновых состояний парамагнитных интермедиатов Действительно, в рекомбинирующем дублетном состоянии РП приводит к образованию исходной пероксидазы, тем самым, нарушая каталитический цикл (или возвращая его в исходную точку), в то время как в соответствии с правилами отбора РП в нерекомбинирующем квартетном состоянии оказывается предшественником следующей стадии каталитического цикла Таким образом, в зависимости от мультиплетности исходной парамагнитной пары, внешнее магнитное поле может ускорить или замедлить трансформацию реакционноспособных интермедиатов

Согласие экспериментальных полевых зависимостей магнитных эффектов, зарегистрированных в процессах окисления, катализируемых пероксидазой хрена, с рассчитанными в рамках развитых приближений теории радикальных пар для многоспиновых ферментативных систем, позволяет сделать важные выводы о детальных механизмах процессов, образующих каталитический цикл

Молекулярная динамика партнеров фермент-субстратного комплекса должна удовлетворять основным приближениям теории РП, а именно скорости переноса электрона в ферментативном процессе должны быть близки к диффузионным (иначе невозможно проявление магнитного

эффекта), времена жизни активных реагирующих интермедиатов не должны быть длиннее микросекунд, а расстояния в фермент-субстратном комплексе находиться в диапазоне расстояний для неконтактных ион-радикальных пар, то есть — 7-10 А Расчетные полевые зависимости лучше всего совпадали с экспериментальными (для НАДН и нифедипина, НФ) для субмикросекундных времен жизни пары парамагнитных частиц Поскольку в основе расчетной модели лежит представление о диффузионном движении партнеров, приходится предполагать, что в ферментативном процессе сохраняется определенная подвижность реагентов Кроме этого, наличие на полевых зависимостях экстремумов в магнитных полях с напряженностью порядка сотен Гаусс однозначно указывает на проявление электронного обменного взаимодействия между партнерами в каталитическом цикле ПХ Последнее, очевидно, указывает на связывание субстрата в активном центре фермента

ВЫВОДЫ

1 В результате спектрофлуориметрических исследований процесса автоокисления НАДН показано, что количество перекиси водорода, накапливающееся при автоокислении НАДН, мало и не может обеспечить протекание постулируемой в литературе первой стадии каталитического цикла пероксидазы хрена - превращение ПХ в активный интермедиат компаунд I

2 На основании анализа кинетических кривых и спектров поглощения короткоживущих интермедиатов, зарегистрированных при взаимодействии пероксидазы хрена и НАДН в бескислородной среде, сделан вывод, что начальной стадией каталитического цикла пероксидазы хрена является образование ферропероксидазы (восстановленной формы нативной пероксидазы)

3 Предложена кинетическая модель каталитического цикла пероксидазы хрена в процессе ферментативного окисления НАДН и нифедипина,

включающая последовательное превращение нативной пероксидазы в ферропероксидазу, компаунд III, компаунд I и, наконец, в компаунд II

4 Обнаружено влияние постоянного внешнего магнитного поля на кинетику превращения парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена Продемонстрировано совпадение экспериментального эффекта с рассчитанным в предположении, что магнитный эффект формируется в акте обратного переноса электрона в паре ферропероксидаза и катион-радикал НАДН (или нифедипина)

5 Дополнительное подтверждение магниточувствительных квартет-дублетных переходов продемонстрировано с помощью наблюдения эффекта ХПЯ в парамагнитной паре ферропероксидаза и катион-радикал НАДН (Рег2+ НАДН'+)

6 Применение методов спиновой химии также позволило сделать ряд важных заключений об особенностях элементарного акта в ферментативных системах на примере пероксидазы хрена

6 1 Наличие магнитного эффекта указывает на то, что скорость превращений парамагнитных интермедиатов в каталитическом цикле может зависеть от их спиновых состояний и меняться при воздействии внешнего магнитного поля 6 2 Совпадение расчетных полевых зависимостей магнитных эффектов, а также эффектов ХПЯ с экспериментальными только с учетом электронного обменного взаимодействия указывает на наличие связывания субстрата с ферментом

6 3 Полученные доказательства участия радикальных состояний НАДН в реакциях ферментативного окисления указывают на возможность постадийного одноэлектронного окисления НАДН в биологических системах НАДН НАДН'+ — НАД' -> НАД" Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах 1 Afanasyeva M.S., Taraban М В , Purtov Р А , Leshina Т V, Grissom С В , Magnetic spin effects m enzymatic reactions radical oxidation of NADH by

horseradish peroxidase // J Am Chem Soc - 2006 - V 128, No 26 - P 86518658

2 Afanasyeva M S., Taraban M В , Polyakov N E , Purtov P A , Leshma T V, Gnssom С В , Elementary steps of enzymatic oxidation of nifedipine catalyzed by horseradish peroxidase // J Phys Chem В - 2006 -V 110, No 42 -P 2123221237

3 Афанасьева M.C., Пуртов П A , Тарабан M Б , Лешина Т В , Гриссом Ч Б , Исследование фотоокисления NADH, катализируемого пероксидазой хрена, методом химической поляризации ядер // Изв РАН, Сер хим - 2006 - № 7 -С 1090-1094

4 Афанасьева М.С., Пуртов П А , Тарабан М Б , Лешина Т В , Спиновая химия ферментативных процессов // Усп хим -2007 -V 76, No 6 - С 651668

5 Афанасьева М.С., Применение методов спиновой химии для изучения цикла окисления NADH, катализируемого пероксидазой хрена Тезисы докладов XLI1 Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», секция «Химия», Новосибирск, Россия - 2004 - С 132

6 Afanasyeva M.S., Taraban М В , Purtov Р А, Leshma Т V , Gnssom С В , New reactive intermediates m enzymatic oxidations studied by means of spin chemistry methods Book of Abstracts of 2nd International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances Novosibusk, Russia September 12-17,2004 -P33

7 Афанасьева M.C., Тарабан M Б , Пуртов П А , Лешина Т В , Гриссом Ч Б , Магнитные эффекты в процессах ферментативного окисления пероксидазой хрена Тезисы докладов XVIII Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, Россия 22 сентября - 3 октября 2006 - С 85

Подписано в печать 03 12 2007г Бумага офсетная Формат бумаги 60x90/16 Тираж 100 экз Заказ № 128

Отпечатано в типографии НВВКУ 630117, Новосибирск, ул Иванова, 35

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Введение.

1.2 Структуры основных парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена.

1.3 Окисление изобутиральдегида пероксидазой хрена в условиях инициирования перекисью водорода/надкислотами.

1.4 Окисление НАДН, катализируемое пероксидазой хрена в отсутствии перекиси водорода.

1.5 Процесс окисления НАДН пероксидазой хрена в колебательной пероксидазно-оксидазной реакции.

1.6 Свободные радикалы в биологических системах. Применение методов спиновой химии для исследования ферментативных процессов.

1.7 Исследование влияния магнитного поля на процесс окисления 2-метил-1-(триметилсилилокси)проп-1-ена пероксидазой хрена.

1.8 Исследование влияния магнитного поля на процесс окисления НАДН пероксидазой хрена в колебательной пероксидазно-оксидазной реакции.

1.9 Теория магнитных и спиновых эффектов в ферментативных многоспиновых системах.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Методы исследования.

2.1.1 Установка остановленной струи для исследования кинетики быстрых ферментативных процессов.

2.1.2 Установка для регистрации эффектов химической поляризации ядер с временным разрешением.

2.1.3 рН- и спектрофотометрия.

2.1.4 Спектрофлуориметрия.

2.2 Методика приготовления образцов.

2.2.1 Магнитный эффект в реакции окисления НАДН, катализируемой пероксидазой хрена.

2.2.2 Магнитный эффект в реакции окисления нифедипина, катализируемой пероксидазой хрена.

2.2.3 Исследование фотоокисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, методом ХПЯ.

2.2.4 Исследование кинетики окисления НАДН в различных средах.

2.2.5 Спектрофлуориметрическое исследование образования перекиси водорода при окислении НАДН в различных средах.

2.2.6 Зависимость скорости окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, от концентрации субстрата.

2.2.7 Исследование акта одноэлектронного переноса и образования ферропероксидазы в реакции между НАДН и пероксидазой хрена в бескислородной среде.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕМЕНТАРНЫХ СТАДИЙ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЦИКЛА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ.

3.1 Введение.

3.2 Автоокисление НАДН при различных рН и флуориметрическое определение образующейся перекиси водорода.

3.3 Зависимость скорости окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, от концентрации субстрата и оценка константы Михаэлиса.

3.4 Исследование стадии одноэлектронного переноса пероксидазой хрена и НАДН в бескислородной среде. между

3.5 Анализ кинетической кривой окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена.

4.2 Исследование фотоокисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, методом химической поляризации ядер.85

4.2.1 Эффекты ХПЯ 'Н, зарегистрированные в процессе фотоокисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена.85

4.2.2 Теоретическое описание наблюдаемого эффекта ХПЯ.90

4.3 Магнитные эффекты в процессе окисления НАДН пероксидазой хрена.!.95

4.3.1 Ферментативное окисление НАДН, катализируемое пероксидазой хрена.95

4.3.2 Теоретические расчеты наблюдаемого магнитного эффекта в процессе ферментативного окисления НАДН пероксидазой хрена.101

4.4 Магнитные эффекты в процессе ферментативного окисления синтетического аналога НАДН, нифедипина.109

4.5 Заключение.117

ВЫВОДЫ .120

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.122

ВВЕДЕНИЕ

На современном этапе развития человечества и научной мысли трудно найти такую область науки, которая существовала бы обособленно. Исследования в различных областях науки привели к необходимости решения таких сложных проблем и задач, поставили перед наукой такие емкие вопросы, которые не могут быть объяснены в рамках простых существующих теорий из одной только области знания. Для понимания и решения многих из них необходимы разносторонние, объединенные в единую теорию, знания из различных областей фундаментальных наук: биологии, химии, математики и физики. Именно поэтому в последнее время важнейшие научные открытия сделаны благодаря взаимодополняющему применению законов и методов исследования всей совокупности естественных наук.

В настоящее время исследование химических и биологических процессов в различных условиях и средах невозможно без применения современных физических методов, в частности, радиоспектроскопии: ядерного магнитного резонанса, электронного парамагнитного резонанса, а также многих других. Их использование позволяет вывести ряд физических закономерностей протекания химической реакции, установить особенности электронного строения, структуру и скорость образования короткоживущих интермедиатов, а также исследовать особенности протекания всего процесса: от реагентов через промежуточные частицы и до продуктов.

Одной из наук, позволяющих с помощью физических методов исследовать элементарные акты химических реакций, является спиновая химия. Как раздел науки она сформировалась тогда, когда было установлено, что в элементарных химических актах может изменяться коррелированное состояние спинов и, что особенно важно, были найдены пути целенаправленного влияния на спиновую динамику в ходе элементарных химических процессов, открыты возможности спинового, магнитного контроля химических реакций. Решающую роль сыграли открытие явления химической поляризации электронных и ядерных спинов в 1967 г. [1], открытие влияния внешнего магнитного поля на радикальные реакции в 1972 г. [2].

С помощью всего разнообразия методов спиновой химии, основанных на таких явлениях как химическая поляризация электронов и ядер (ХПЭ и ХПЯ), магнитный (МЭ) и магнитный изотопный эффекты (МИЭ), подробному описанию которых посвящен ряд обзоров и монографий [3, 4], становится возможным исчерпывающее исследование радикальных реакций с участием парамагнитных партнеров.

В последнее десятилетие, после завершения теоретического описания магнитных эффектов в модельных системах, все больший интерес стало представлять практическое применение знаний, полученных при изучении сложных химических и биохимических процессов методами спиновой химии. Такое направление исследований представляется весьма перспективным, поскольку установление строения и свойств короткоживущих интермедиатов химических реакций является одной из ключевых задач современной химии. Методы спиновой химии позволяют изучать парамагнитные интермедиаты, времена жизни которых лежат в диапазоне от нано- до микросекунд: ион-радикалы и нейтральные свободные радикалы, бирадикалы, карбены и их аналоги, а также молекулы в триплетном возбужденном состоянии.

На сегодняшний день существуют впечатляющие примеры успешного применения методов ХПЯ и МЭ для установления механизмов процессов, в которых участие ион-радикалов, радикалов и бирадикалов ранее только постулировалось. Особый интерес представляют современные исследования с применением методик спиновой химии в биологии [5], в том числе для изучения колебательных ферментативных реакций [6] и структурных особенностей обратимого фолдинга белков [7]. Поскольку предполагается, что многие ферментативные системы участвуют в регулировании образования и гибели свободнорадикальных частиц, для установления точных механизмов данных реакций наиболее информативными могут оказаться методы спиновой химии. Исследуя влияние магнитного поля на процессы взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов в каталитических циклах таких ферментов, как пероксидаза хрена (ПХ) или цитохром Р450, можно установить механизм отдельных стадий каталитических циклов, а, применяя теоретическое описание к ферментативным многоспиновым системам - дать детальное описание этого механизма, который включает в себя образование парамагнитных пар в определенном спиновом состоянии, оценить степень связывания и расстояния в фермент-субстратном комплексе. Учет и величина обменного взаимодействия, которое закладывается в модельные теоретические расчеты, может указывать на степень связывания в парамагнитной паре. Совместное применение методов спиновой химии и расчетных методов квантовой химии позволяет получать важную информацию о механизмах реакций, катализируемых ферментами.

Знание детальных механизмов ферментативного катализа позволяет получить представление о факторах, определяющих эффективность и высокую степень специфичности и селективности реакций ферментов [8]. Спиновые состояния парамагнитных интермедиатов ферментативного каталитического цикла должны обеспечивать такую корреляцию электронных спинов, которая никоим образом (например, вследствие спинового запрета) не нарушила бы закономерной последовательности взаимопревращений в каталитическом цикле. Механизм, обеспечивающий необходимую корреляцию электронных спинов, изучен слабо. В этой связи, методы спиновой химии представляют огромную ценность, поскольку именно их применение позволяет вскрыть роль спиновых состояний и факторы, определяющие селективность ферментативных процессов.

До сегодняшнего дня справедливость этого утверждения рассматривалась лишь в единственном исследовании, где методы спиновой химии применялись для изучения механизмов взаимопревращений парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена [9]. В этой работе было продемонстрировано, что в результате катализируемого пероксидазой хрена окисления енола изобутиральдегида, инициируемого перекисью водорода, образуется радикальная пара в триплетном состоянии. Синглет-триплетная конверсия, индуцированная локальными и внешними магнитными полями, приводит к двум различным спиновым состояниям, одно из которых является предшественником следующей стадии каталитического цикла, а второе возвращает его к предыдущей стадии.

Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:

1. Кинетическими методами и методами спиновой химии установить элементарные стадии взаимодействия пероксидазы хрена с субстратами: нативным - никотинамидадениндинуклеотидом (НАДН), и специфичным, синтетическим аналогом НАДН - 1,4-дигидро-2,3-диметил-3,5-дикарбометокси-4-нитрофенилпиридином, нифедипином (НФ).

2. Разработать кинетическую модель, описывающую последовательность взаимопревращений интермедиатов каталитического цикла пероксидазы хрена.

3. В рамках теории радикальных пар дать описание магнитных и спиновых эффектов для многоспиновых ферментативных систем.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы.

ВЫВОДЫ

1. В результате спектрофлуориметрических исследований процесса автоокисления НАДН показано, что количество перекиси водорода, накапливающееся при автоокислении НАДН, мало и не может обеспечить протекание постулируемой в литературе первой стадии каталитического цикла пероксидазы хрена - превращение ПХ в активный интермедиат компаунд I.

2. На основании анализа кинетических кривых и спектров поглощения короткоживущих интермедиатов, зарегистрированных при взаимодействии пероксидазы хрена и НАДН в бескислородной среде, сделан вывод, что начальной стадией каталитического цикла пероксидазы хрена является образование ферропероксидазы (восстановленной формы нативной пероксидазы).

3. Предложена кинетическая модель каталитического цикла пероксидазы хрена в процессе ферментативного окисления НАДН и нифедипина, включающая последовательное превращение нативной пероксидазы в ферропероксидазу, компаунд III, компаунд I и, наконец, в компаунд II.

4. Обнаружено влияние постоянного внешнего магнитного поля на кинетику превращения парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена. Продемонстрировано совпадение экспериментального эффекта с рассчитанным в предположении, что магнитный эффект формируется в акте обратного переноса электрона в паре ферропероксидаза и катион-радикал НАДН (или нифедипина).

5. Дополнительное подтверждение магниточувствительных квартет-дублетных переходов продемонстрировано с помощью наблюдения эффекта ХПЯ в парамагнитной паре ферропероксидаза и катион-радикал НАДН (Рег2+ НАДН'+).

6. Применение методов спиновой химии также позволило сделать ряд важных заключений об особенностях элементарного акта в ферментативных системах на примере пероксидазы хрена:

6.1 Наличие магнитного эффекта указывает на то, что скорость превращений парамагнитных интермедиатов в каталитическом цикле может зависеть от их спиновых состояний и меняться при воздействии внешнего магнитного поля.

6.2 Совпадение расчетных полевых зависимостей магнитных эффектов, а также эффектов ХПЯ с экспериментальными только с учетом электронного обменного взаимодействия указывает на наличие связывания субстрата с ферментом.

6.3 Полученные доказательства участия радикальных состояний НАДН в реакциях ферментативного окисления указывают на возможность постадийного одноэлектронного окисления НАДН в биологических системах: НАДН НАДН'" НАД' НАД+.

4.5 Заключение

Полученные результаты демонстрируют принципиальную важность методов спиновой химии (ХПЯ, МЭ) для исследования взаимопревращений и структуры промежуточных парамагнитных частиц процессов ферментативного окисления. Сам факт проявления магнитных эффектов в ферментативных реакциях указывает на связь реакционной способности парамагнитных интермедиатов каталитического цикла ПХ с их спиновыми состояниями. Методами спиновой химии показано, что начальной стадией ферментативного окисления в отсутствии перекиси водорода является перенос электрона между нативным ферментом и субстратом с формированием РП (Рег2+ НАДН+#). Дополнительным подтверждением наличия стадии одноэлектронного переноса в каталитическом цикле ПХ стали исследования магнитных эффектов в реакциях ферментативного окисления синтетического аналога НАДН - нифедипина. Было показано, что окисление НФ так же начинается со стадии одноэлектронного переноса и формирования РП (Рег2+ НФ+#) в квартетном состоянии.

Кроме того, наблюдение эффекта ХПЯ [65] при взаимодействии фотовозбужденного НАДН с пероксидазой хрена не только подтверждает вывод о возможности переноса электрона между НАДН и гемом пероксидазы, но и позволяет сделать еще два важных вывода. Первый вывод касается доказательства образования катион-радикала НАДН, которое постулировалось при анализе магнитного эффекта. Такой вывод имеет принципиально важное значение, поскольку до сих пор в литературе не

Per2* + НАДН ■ +

НФ

НФ приводились доказательства в пользу возможности одноэлектронного постадийного окисления НАДН в биологических системах: НАДН —> НАДН'+ —* НАД' —► НАД+. Второй вывод основан на особенностях ингибирования пероксидазы продуктами ферментативного окисления и формирования фермент-субстратного комплекса. Показано, что при неконкурентном ингибировании не происходит реакции смешения ПХ и НАДН, однако такое неконкурентное ингибирование не влияет на фотоиндуцированный перенос электрона между ферментом и субстратом, а значит, изменяет акцепторные свойства пероксидазы (возможно, изменяет полуволновой потенциал восстановления), но не препятствует образованию фермент-субстратного комплекса и существенно не влияет на расстояния между активным центром фермента и связанным с ним в комплекс субстратом.

Наблюдение влияния внешнего магнитного поля на эффективные константы скорости трансформации активных частиц каталитического цикла пероксидазы указывает на зависимость каталитических процессов от спиновых состояний парамагнитных интермедиатов. Действительно, в рекомбинирующем дублетном состоянии РП приводит к образованию исходной пероксидазы, тем самым, нарушая каталитический цикл (или возвращая его в исходную точку), в то время как в соответствии с правилами отбора РП в нерекомбинирующем квартетном состоянии оказывается предшественником следующей стадии каталитического цикла. Таким образом, в зависимости от мультиплетности исходной парамагнитной пары, внешнее магнитное поле может ускорить или замедлить трансформацию реакционноспособных интермедиатов.

Согласие экспериментальных полевых зависимостей магнитных эффектов, зарегистрированных в процессах окисления, катализируемых пероксидазой хрена, с рассчитанными в рамках приближений теории радикальных пар, позволяет сделать важные выводы о детальном механизме процессов, которые образуют каталитический цикл.

Молекулярная динамика партнеров фермент-субстратного комплекса должна удовлетворять основным приближениям теории РП, а именно: скорости переноса электрона в ферментативном процессе должны быть близки к диффузионным (иначе невозможно проявление магнитного эффекта), времена жизни активных реагирующих интермедиатов не должны быть длиннее микросекунд, а расстояния в фермент-субстратном комплексе находиться в диапазоне расстояний для неконтактных ион-радикальных пар, то есть ~ 7-10 А. Расчетные полевые зависимости лучше всего совпадали с экспериментальными (для НАДН и нифедипина, НФ) для субмикросекундных времен жизни пары парамагнитных частиц. Поскольку в основе расчетной модели лежит представление о диффузионном движении партнеров, приходится предполагать, что в ферментативном процессе сохраняется определенная подвижность реагентов. Кроме этого, наличие на полевых зависимостях экстремумов в магнитных полях с напряженностью порядка сотен Гаусс однозначно указывает на проявление электронного обменного взаимодействия между партнерами в каталитическом цикле ПХ. Последнее, очевидно, отражает связывание субстрата в активном центре фермента.

1. Bargon J. Chemish induzierte dynamische kernpolarisation / J. Bargon, H. Fischer, U. Johnson // Z. Naturforschung 1967. - В. 22A. - S. 1551-1555.

2. Сагдеев Р.З. Влияние магнитного поля на соотношение продуктов реакции пентафторбензилхлорида с п-СД^Ы / Р.З. Сагдеев, Т.В. Лешина, М.А. Камха и др. // Изв. АН СССР. Серия химическая. 1972. -С. 2128-2129.

3. Salikhov К.М. Spin polarization and magnetic effects in chemical reactions / K.M. Salikhov, Yu.N. Molin, R.Z. Sagdeev, A.L. Buchachenko. -Amsterdam: Elsevier, 1984. 419 P.

4. Steiner U. Magnetic field effects in chemical kinetics and related phenomena / U. Steiner, T. Ulrich // Chem. Rev. 1989. - V. 89, No. 1. - P. 51-147.

5. Grissom C.B. Magnetic field effects in biology: a survey of possible mechanisms with emphasis on radical-pair recombination / C.B. Grissom // Chem. Rev. 1995. - V. 95, No. 1. - P. 3-24.

6. Moller A.C. Further studies of the effect of magnetic fields on the oscillating peroxidase-oxidase reaction / A.C. Moller, A. bunding, L.F. Olsen // Phys. Chem. Chem. Phys. 2000. - V. 2, No. 15. - P. 3443-3446.

7. Hore P.J. Stopped-flow photo-CIDNP observation of protein folding / P.J. Hore, S.L. Winder, C.H. Roberts, C.M. Dobson // J. Am. Chem. Soc. 1997. -V. 119,No. 21.-P. 5049-5050.

8. Murakami Y. Artificial enzymes / Y. Murakami, J. Kikuchi, Y. Hisaeda, O. Hayashida// Chem. Rev. 1996. - V. 96, No. 2. - P. 721-758.

9. Taraban M.B. Magnetic field dependence of electron transfer and the role of electron spin in heme enzymes: horseradish peroxidase / M.B.Taraban, T.V. Leshina, M.A. Anderson, C.B. Grissom // J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119,No. 24.-P. 5768-5769.

10. Oxygen radicals and human disease / C.E. Cross, B. Halliwell, E.T. Borish et al. // Ann. Intern. Med. 1987. - V. 107, No. 7. - P. 526-545.

11. Matsuzaki S. Inhibition of complex I by Ca (2+) reduces electron transport activity and the rate of superoxide anion production in cardiac submitochondrial particles / S. Matsuzaki, L.I. Szweda // Biochemistry -2007. V. 46, No. 5. - P. 1350-1357.

12. Castro G.R. Controlled release biopolymers for enhancing the immune response / G.R. Castro, B. Panilaitis, E. Bora, D.L. Kaplan // Mol. Pharm. -2007.-V. 4, No. 1.-P. 33-46.

13. Novel porphyrin-incorporated hydrogels for photoactive intraocular lens biomaterials / C. Brady, S.E.J. Bell, C. Parsons et al. // J. Phys. Chem. B. -2007.-V. Ill,No. 3. P. 527-534.

14. Gaggelli E. Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer's, Prion, and Parkinson's deseases and amyotrophic lateral sclerosis) / E. Gaggelli, H. Kozlowski, D. Valensin, G. Valensin // Chem. Rev. 2006. - V. 106, No. 6. - P. 1995-2044.

15. Zhang A. Recent progress in development of dopamine receptor subtype-selective agents: potential therapeutics for neurological and psychiatric disorders / A. Zhang, J.L. Neumeyer, R.J. Baldessarini // Chem. Rev. 2007. -V. 107, No. l.-P. 274-302.

16. Concentration dependent Cu" induced aggregation and dityrosine formation of the Alzheimer's disease amyloid-P peptide / D.P. Smith, G.D. Ciccotosto, D.L. Tew et al. //Biochemistry 2007. - V. 46, No. 10. - P. 2881-2891.

17. Lukin M. NMR structures of damaged DNA / M. Lukin, C. de los Santos // Chem. Rev. 2006. - V. 106, No. 2. - P. 607-686.

18. Burrows C.J. Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission / C.J. Burrows, J.G. Muller // Chem. Rev. 1998. - V. 98, No. 3. - P. 11091152.

19. Halliwell В. Role of free radicals and catalytic metal ions in human desease: An overview / B. Halliwell, J.M. Gutteridge // Methods in Enzymology. Edited by L. Parker and A.N. Glaser. New York: Academ Press. - 1990. -V. 186.-P. 1-85.

20. Cross A.R. The flavoprotein component of the superoxide generating NADPH oxidase / A.R. Cross // The Molecular Basis of Oxidative Damage by Leukocytes. Edited by A.J. Jesaitis and E.A. Dratz. Boca Raton: CRC Press. - 1992.-P. 37-44.

21. The Respiratory Burst and Its Physiological Significance / Eds. A.J. Sbarra, R.R. Strauss. New York: Plenum Press. - 1988. - 500 P.

22. Welinder K.G. Amino acid sequence studies of horseradish peroxidase / K.G. Welinder//Eur. J. Biochem. 1979. - V. 96, No. 3. - P. 483-502.

23. The peroxidase-oxidase oscillator and its constituent chemistries / A. Scheeline, D.L. Olson, E.P. Williksen et al. // Chem. Rev. 1997. - V. 97, No. 3. - P. 739-756.

24. Schannon L.M. Peroxidase isozymes from horseradish roots. I. Isolation and physical properties / L.M. Schannon, E. Kay, J.Y. Lew // J. Biol. Chem. -1966. V. 241, No. 9. - P. 2166-2172.

25. Yokota K. Analysis and computer simulation of aerobic oxidation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide catalyzed by horseradish peroxidase / K. Yokota, I. Yamazaki // Biochemistry 1977. - V. 16, No. 9. -P. 1913-1920.

26. Magnetic spin effects in enzymatic reactions: radical oxidation of NADH by horseradish peroxidase / M.S. Afanasyeva, M.B. Taraban, P.A. Purtov et al. //J. Am. Chem. Soc. 2006. - V. 128, No. 26. - P. 8651-8658.

27. Baader W.J. Peroxidase-catalyzed formation of triplet acetone and chemiluminescence from isobutyraldehyde and molecular oxygen / W.J. Baader, C. Bohne, G. Cilento, H.B. Dunford // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260,No. 18.-P. 10217-10225.

28. Dawson J.H. Probing structure-function relations in heme-containing oxygenases and peroxidases / J.H. Dawson // Science 1988. - V. 240, No. 4851.-P.433-439.

29. Bohne C. Transient state kinetics of the reactions of isobutyraldehyde with compounds I and II of horseradish peroxidase / C. Bohne, I.D. MacDonald, H.B. Dunford // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262, No. 8. - P. 3572-3578.

30. Yokota K. Reaction of peroxidase with reduced nicotinamide-adenine dinucleotide and reduced nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate / K. Yokota, I. Yamazaki // Biochim. Biophys. Acta 1965. - V. 105, No. 2. - P. 301-312.

31. Halliwell B. Lignin synthesis: the generation of hydrogen peroxide and superoxide by horseradish peroxidase and its stimulation by manganese (II) and phenols / B. Halliwell // Planta 1978. - V. 140, No. 1. - P. 81-88.

32. Akazawa T. The oxidation of reduced pyridine nucleotides by peroxidase / T. Akazawa, E.E. Conn // J. Biol. Chem. 1958. - V. 232, No. 1. - P. 403415.

33. Degn H. Bistability caused by substrate inhibition of peroxidase in an open reaction system / H. Degn // Nature 1968. - V. 217, No. 5133. - P. 10471050.

34. Aguda B.D. Experimental evidence for the coexistence of oscillatory and steady states in the peroxidase-oxidase reaction / B.D. Aguda, L.-L.H. Frisch, L.F. Olsen // J. Am. Chem. Soc. 1990. - V. 112, No. 18. - P. 66526656.

35. Chance B. The enzyme-substrate compounds of horseradish peroxidase and peroxides. II. Kinetics of formation and decomposition of the primary and secondary complexes / B. Chance // Arch. Biochem. 1949. - V. 22, No. 2. -P. 224-252.

36. Kobayashi K. Reactions of the NAD radical with higher oxidation states of horseradish peroxidase / K. Kobayashi, K. Hayashi, A.J. Swallow // Biochemistry 1990. - V. 29, No. 8. - P. 2080-2084.

37. Land E.J. One-electron reactions in biochemical systems as studied by pulse radiolysis. IV. Oxidation of dihydronicotinamide-adenine dinucleotide / E.J. Land, A.J. Swallow // Biochim. Biophys. Acta 1971. - V. 234, No. 1. - P. 34-42.

38. Nakamura S. Sustained oscillations in a lactoperoxidase, NADPH and 02 system / S. Nakamura, K. Yokota, I. Yamazaki // Nature 1969. - V. 222, No. 5195.-P. 794-794.

39. Olsen L.F. Oscillatory kinetics of the peroxidase-oxidase reaction in an open system / L.F. Olsen, H. Degn // Biochim. Biophys. Acta 1978. - V. 523, No. 2.-P. 321-334.

40. Hauser M.J.B. On the role of methylene blue in the oscillating peroxidase-oxidase reaction / M.J.B. Hauser, A. Lunding, L.F. Olsen // Phys. Chem. Chem. Phys. 2000. - V. 2, No. 8. - P. 1685-1692.

41. Olsen L.F. Mechanism of protection of peroxidase activity by oscillatory dynamics / L.F. Olsen, M.J.B. Hauser, U. Kummer // Eur. J. Biochem. -2003. V. 270, No. 13. - P. 2796-2804.

42. Hawkins C.L. Generation and propagation of radical reactions on proteins / C.L. Hawkins, M.J. Davies // Biochim. Biophys. Acta 2001. - V. 1504, No. 2-3.-P. 196-219.

43. Hirata H. Free radicals in living systems: In vivo detection of bioradicals with EPR spectroscopy / H. Hirata, H. Fujii // Curr. Org. Chem. 2006. - V. 10, No. 5.-P. 521-534.

44. Biological effects of electromagnetic fields / Eds. P. Stavroulakis. Berlin: Springer, 2003. - 793 P.

45. Elementary steps of enzymatic oxidation of nifedipine catalyzed by horseradish peroxidase / M.S. Afanasyeva, M.B. Taraban, N.E. Polyakov et al. // J. Phys. Chem. B. 2006. - V. 110, No. 42. - P. 21232-21237.

46. Schulten K. Semiclassical description of electron spin motion in radicals including the effect of electron hopping / K. Schulten, P.G. Wolynes // J. Chem. Phys. 1978. - V. 68, No. 12. - P. 3292-3297.

47. Attempts to observe spin catalysis by paramagnetic particles in the photolysis of 7-silanorbornadiene in solution / O.S. Volkova, M.B. Taraban, V.F. Plyusnin et al. // J. Phys. Chem. A. 2003. - V. 107, No. 19. - P. 40014005.

48. Purtov P.A. The Green function method in the theory of nuclear and electron spin polarization. I. General theory, zero approximation and applications / P.A. Purtov, A.B. Doktorov // Chem. Phys. 1993. - V. 178, No. 1-3. - P. 47-65.

49. Пуртов П.А. Теория поляризации спинов в радикальных реакциях и ее приложения: диссертация на соискание ученой степени докт. физ.-мат. наук / П.А. Пуртов; ИХКиГ СО РАН. Новосибирск, 2000. - 340 С.

50. Colonna S. Recent biotechnological developments in the use of peroxidases / S. Colonna, N. Gaggero, C. Richelmi, P. Pasta // Trends Biotechnol. 1999. -V. 17,No. 4.-P. 163-168.

51. Battistuzzi G. Redox thermodynamics of the Fe3+/Fe2+ couple in horseradish peroxidase and its cyanide complex / G. Battistuzzi, M. Borsari, A. Ranieri, M. Sola // J. Am. Chem. Soc. 2002. - V. 124, No. 1. - P. 26-27.

52. The catalytic pathway of cytochrome P450cam at atomic resolution / I. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu et al. // Science 2000. - V. 287, No. 5458.-P. 1615-1622.

53. Harbury H.A. Oxidation-reduction potentials of horseradish peroxidase / H.A. Harbury // J. Biol. Chem. 1957. - V. 225, No. 2. - P. 1009-1024.

54. Атауллаханов Ф.И. Фотоиндуцированное восстановление феррипероксидазы. I. Реакция с восстановленным никотинамидадениндинуклеотидом / Ф.И. Атауллаханов, A.M. Жаботинский // Биофизика 1975. - Т. 20, № 4. с. 596-601.

55. Lee J.H. Nonenzymatic method for the determination of hydrogen peroxide in atmospheric samples / J.H. Lee, I.N. Tang, J.B. Weinstein-Lloyd // Anal. Chem. 1990. - V. 62, No. 21. - P. 2381-2384.

56. Fukuzumi S. NAD(P)H, NAD(P)+, and Analogues / S. Fukuzumi T. Tanaka // Part C. Photoinduced electron transfer reactions: Organic substrates. Edited by M.A. Fox, M. Chanon. Amsterdam, Elsevier. - 1988. - Ch. 4.10.

57. Zheng X. Does internal water influence electron tunning in proteins? Example of cytochrome с oxidase / X. Zheng, D.M. Medvedev, A.A. Stuchebrukhov // Int. J. Quantum Chem. 2005. - V. 102, No. 5. - P. 473479.

58. Tan M.-L. Dynamics of electron transfer pathway in cytochrome с oxidase / M.-L. Tan, I. Balabin, and J.N. Onuchic // Biophys. J. 2004. - V. 86, No. 3. -P. 1813-1819.

59. Исследование фотоокисления NADH, катализируемого пероксидазой хрена, методом химической поляризации ядер / М.С. Афанасьева, П.А. Пуртов, М.Б. Тарабан и др. // Изв. АН. Сер. хим. 2006. - № 7. - С. 1090-1094.

60. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Т. Келети. М.: Мир, 1990.-350 С.

61. Ноге P.J. Photoreduction of flavin by NADH. A flash photolysis photo-CIDNP study / P.J. Hore, A. Volbeda, K. Dijkstra, R. Kaptein // J. Am. Chem. Soc. 1982. - V. 104, No. 23. - P. 6262-6267.

62. The mechanisms of the oxidation of NADH analogues 1. Photochemical oxidation of JV-unsubstituted 1,4-dihydropyridines by various acceptors /

63. M.B. Taraban, A.I. Kruppa, N.E. Polyakov et al. // J. Photochem. Photobiol. A: Chem. -1993. V. 73, No. 2. - P. 151-157.

64. The mechanisms of the oxidation of NADH analogues 2. N-Methyl-substituted 1,4-dihydropyridines / A.I. Kruppa, M.B. Taraban, N.E. Polyakov et al. //J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 1993. - V. 73, No. 2. -P. 159-163.

65. Берсукер И.Б. Электронное строение и свойства координационных соединений / И.Б. Берсукер. JL: Химия, 1986. - 352 С.

66. Бучаченко A.JI. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях / A.JI. Бучаченко, Р.З. Сагдеев, К.М. Салихов. Новосибирск: Наука, 1978.-296 С.

67. Shushin A.I. The relaxational mechanism of net CIDEP generation in triplet—radical quenching / A.I. Shushin // Chem. Phys. Lett. 1993. - V. 208,No. 3-4.-P. 173-178.

68. Бучаченко A.JI. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях / A.JI. Бучаченко, Р.З. Сагдеев, К.М. Салихов. Новосибирск: Наука, 1978. - 296 С.