Физико-химические и каталитические свойства гемина в водно-мицеллярных растворах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

I. ВВЕДЕНИЕ.'.

П. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Физико-химические свойства феррипротопорфирина IX.

1.1 Спектры поглощения гемина.

1.2 Агрегация металлопорфиринов в водных растворах.

1.3. Протолитические равновесия для феррипорфиринов в водных растворах.

1.4. Солюбилизация гемина в мицеллах ПАВ.

2. Гемин как модель каталазы и пероксидазы.

2.I-. Структура и механизм действия пероксидазы и каталазы.

2.2 Кинетические закономерности разложения перекиси водорода на феррипорфиринах.

2.3. Механизм реакции разложения перекиси водорода на феррипорфиринах.

2.4. Пероксидазная активность железопорфиринов.

Ш. Экспериментальная часть.

1. Исходные вещества.

'В последние годы все более широкое внедрение в практику получают биокатализаторы. Одним из способов их изучения является моделирование. В качестве модели гемсодержащих белков и ферментов широко исследуется феррипротопорфирин IX (гемин). Изучение модельной системы позволяет глубже понять механизм действия биологических катализаторов. Повышенный интерес многих исследователей к гемину и другим металлопорфиринам обусловлен также способностью этих катализаторов проводить с высокими скоростями и селективностью практически важные окислительно- восстановительные процессы. Кроме того, в последние годы гемин находит применение как метка в иммуноферментном анализе.

Большинство работ по изучению физико-химических и каталитических свойств гемина выполнено в воде или органических растворителях. При этом нередко исследователи ограничиваются измерением каталитической активности металлопорфиринов, не выявляя взаимосвязи между ее величиной и физико-химическими свойствами катализатора.

В последние годы интерес многих исследователей вызывают ме-таллопорфирины, включенные в мицеллы поверхностно-активных веществ (ПАВ). Интерес к этим системам обусловлен несколькими факторами. Водно-мицеллярные растворы нередко рассматриваются как модель микрогетерогенной среды - белковой глобулы. Использование водных растворов ПАВ позволяет значительно увеличить растворимость как металлопорфиринов, так и органических субстратов каталитической реакции, а также приводит к увеличению степени мо-номеризации металлопорфиринов. Солюбилизация гемина в мицеллах ПАВ защищает его от окислительной дестрродии под действием кислорода воздуха. В литературе имеется лишь небольшое число работ поизучению физико-химических свойств гемина, включенного в мицеллы поверхностно- активных веществ, и отсутствуют сведения о каталитических свойствах гемина в этих системах.

В связи с этим в настоящей работе предпринято систематическое изучение физико-химических свойств и кинетических особенностей протекания каталазной и пероксидазной реакций в одной из модельных систем - гемина в водно-мицелларных растворах додецшг-сульфата натрия(ДСН), бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ) и Тритона Х-100 (ТХ-100). Основными целями исследования были: I) изучение агрегационных свойств, в частности, димер-мономерного равновесия, гемина; 2^становление закономерностей аксиального ли-гандирования на железо гемина присутствующих в растворе лигандов; 3)исследование протолитических равновесий в водно-мицеллярных растворах гемина; 4)выяснение кинетических закономерностей и определение кинетических параметров каталазной реакции разложения перекиси водорода и окисления о-дианизидина перекисью водорода; 5)изучение влияния на каталитическую активность гемина рН, природы субстратов и аксиальных лигандов.- 7 II. ЖТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. I. Физико-химические свойства те тгоипdo т оп отхТятоина ИРе/Ш/-протопорфирин IX /гемин/ - комплексное соединение со,прочной донорно-акцепторной связью между Ре и атомами азота протопорфирина II /рисЛ/. Порфириновая система представляет собой плоский жесткий лиганд с мощной ароматической системой /в сопряжении участвует 22 электрона порфирина/ /I/. Благодаря высокой сопряженности порфириновая система стабилизирует комплексы с высокоокисленным состоянием железа, например, промежуточные соединения I и'П пероксидазы, где железо формально находится в состоянии окисления +5 и +4, соответственно.о Комплексы Ре с порфиринами являются координационно ненасыщенными и обладают способностью координировать различные лиган-ды /экстралиганды/ в пятом и шестом координационных положенияхо,по отношению к Ре. В качестве экстралигандов могут выступать ОН", CM"", N0g, СГ, HgO, пиридин, имидазол, молекулы растворителя и т.п./I/. Это свойство гемина и других металлопорфири-нов является очень важным, поскольку в гемсодержащих белках перенос электронов может осуществляться через стадию предварительного лигандирования HgOg или второго субстрата пероксидазы на железо протопорфирина /2,3/. I.I Спектры поглощения геминаВследствие высокой ароматичности порфириновых систем гемин и другие металлопорфирины являются хорошими хромофорами, т.е. имеют характерные спектры поглощения в видимой и ближней Уф-об-ласти. Полосы поглощения в этих спектрах соответствуют переходам порфириновой системы /4/.сн=сн2IE: -NH-CH-C-NH-CH-CHj-C^CHCHo оI *СИн3с сн3Анр о/ \ I NMVРисЛ. Феррипротопорфирин IX (гемин) и гемпептид - 6(7)-лей-цингистидин-0-CHg, полученный путем модификации карбоксильной группы порфиринового кольца.

Спектры поглощения металлопорфиринов содержат полосу Сорэ» с т тпри к* 400 нм с 5^10 М см" и две полосы в видимой области с коэффициентами экстинкции на порядок ниже. Спектры поглощения мало чувствительны к инертным растворителям и высоко чувствительны к комплексообразующим и протонирующим реагентам /4/. Спектры мономерных форм гемина /в белках, органических растворителях/ характеризуются наличием острого пика в области Сорэ. Положение полос в видимой части спектра мономерного гемина в значительной степени зависит от лигандного окружения железа /4/.

Обычно гемин используется в виде комплекса с СГ" /хлоргемин/. В апротонных органических растворителях хлоргемин может находиться в двух формах: форме мономерного катиона /ДМСО, диоксан/ или в виде комплекса хлоргемина /ДМФА, ДМА/. Спектры поглощения этих двух форм отличаются по величине коэффициента экстинкции полосы Сорэ и положению полос поглощения в видимой области /5/ /рис.2/.

В водных растворах гемин в значительной степени димеризован /6/. Спектры поглощения димерного гемина и других металлопорфиринов характеризуются более низким значениемпоглощения в области Сорэ, чем мономерные формы / б ^5*I0%^cmV> полосы поглощения в видимой области размыты./7-9/,/рис. 5а,спектр I/. Анализ спектров поглощения гемина и других металлопорфиринов часто используется при изучении процессов агрегации, комплексообразования и протонирования.

1.2. Агрегация металлопорфиринов в водных растворах.

Процессы агрегации порфиринов и металлопорфиринов изучаются давно /10/. Образование димеров металлопорфиринов наблюдалось даже в органических растворителях /II/. Однако при концентрациях, обычно используемых в спектрофотометрическом анализе, меРис.2. Спектры хлоргемина в апротонных растворителях:1 - в диметилсульфоксиде (ДМСО) и диоксане,2 - в диметилформамиде (Щ'ЛФА) и диметиламине.таллопорфирины в органических растворителях мономерны.

Иная картина наблюдается в водных растворах металлопорфиринов. Природные металлопорфирины (дейтеро-, коггро-, протопорфирин) в значительной степени димеризованы даже в разбавленных растворах /6-9/. В работах /12-13/ методом седиментации установлено наличие в водных растворах гемина в присутствии 0,01 М КОН ассоциатов с большим молекулярным весом. Однако наличие в водных растворах крупных ассоциатов отмечалось только в концентрированных растворах гемина. При обычно используемых концентрациях гемина и других металлопорфиринов /Ю""4-10%/ процессы агрегации в воде описываются схемой: КД , ШШ"^Н+ + Д 2М где Ктг=Ктг [Н"5=-/I/Д ДДля изучения процессов агрегации используются как кинетические, так и равновесные методы. К кинетическим методам относится метод температурного скачка, который позволяет определить индивидуальные константы скорости /I/ и, следовательно, величину константы димеризации Кд /7-9/. В равновесных условиях величина Кд определяется с помощью метода разбавления. Метод основан на изучении зависимости степени мономеризации от общей концентрации металло-порфирина. Из этой зависимости рассчитывается величина Кд. В эксперименте степень мономеризации определяется с помощью различных физических методов: спектрофотометрии, ЯМР- спектроскопии, потен-циометрии и т.п. В любом случае степень мономеризации рассчитывается из изменения формы и положения сигнала при изменении концентрации металлопорфирина :£ в спектрофотометрии /6-9/, ширины линии и химического сдвига в ЯМР-спектроскопии /14,15/, формы и потенциала полуволны в потенциометрии /16/. Такими методами величины Кд были определены для большой группы металлопорфиринов в различных условиях. Соответствующие величины собраны в /II/.

Анализ этих данных показал, что константы димеризации металлопорфиринов зависят от следующих факторов: I/ природы металла в металлопорфирине ; 2/ природы заместителя в порфириновом кольце ; 3/ величины рН раствора ; 4/ ионной силы раствора -JL ; 5/ природы буфера и природы соли, создающей ионную силу. Рассмотрим отдельно влияние каждого из перечисленных факторов на величину Кд.

Процессы димеризации и агрегации характерны не только для водных растворов металлопорфиринов, но и для безметальных порфи-ринов /II/. Введение в порфириновуго систему ионов металлов приводит, как правило, к значительному увеличению степени димеризации, т.е. величины Кд. В литературе не обсуждаются закономерности изменения величин Кд при варьировании природы металла. Однако отмечается, что степень димеризации Ре-порфиринов выше, чем Си.-, - порфиринов, причем для ?е порфириноввеличина Кд выше, чем для соответствующих £е^+-порфиринов /II/.

Природа заместителей в порфириновом кольце сложным образом влияет на величину Кд /Табл.1/. В литературе отмечены следующиеТаблица IВеличины констант димеризации /Кд/ различных ?е/Ш/-порфиринов в водных растворах /9/.

ФеррипорфиринЗаместители в 2-, 4-положе-ниях порфиринового кольцаКЯПротоферригемМезоферригемДейтероферригемГематоферригемКопроферригем-сн=сн2 -сн2-сн3-Н-СН(0Н)-СН3 -СН2-СН2-С004,5 6,92-10'l-23,4*10' 1,0*10' 2,1-Ю-3г2i-2общие закономерности. Во-первых, на величину Кд влияют электростатические факторы: наличие в кольце заряженных групп приводит к уменьшению величины Кд. Во-вторых, величина Кд возрастает при увеличении асимметрии ^-электронной системы порфири-на/9,14/: для Ре/III/-протопорфирина величина Кд на 2 порядка выше, чем для других природных £е/Ш/-порфиринов. В-третьих,степень мономеризации металлопорфиринов уменьшается при введении в порфириновое кольцо объемных заместителей, например, фенильных групп /17/.

Влияние величины рН раствора на степень димеризации металлопорфиринов будет рассмотрено специально. Здесь можно отметить, что уменьшение величины рН раствора приводит к увеличению степени мономеризации металлопорфирина/6-9/.

Степень мономеризации феррипорфиринов растет при увеличении ионной силы раствора /ji / /14,18/. По-видимому, роль ионной силы сводится к уменьшению электростатического отталкивания между мономерными единицами. Следует отметить, что двухвалентные катионы вызывают димеризацию металлопорфиринов в большей степени. чем одновалентные /18/.

В литературе высказывались различные точки зрения на строение димеров металлопорфиринов и, в частности, железопорфиринов. Лемберг в 1949 г. предположил, что димеры железопорфиринов образуются за счет ионных взаимодействий пропионовокислой группы одного порфиринового кольца с £'е^+другого кольца /19/. Однако эта точка зрения оказалась несостоятельной, поскольку этерифи-кация карбоксильных групп пропионовокислых остатков порфиринового кольца не приводит к мономеризации железопорфиринов /20/. В работе /21/ выдвигалось предположение об образовании димеров феррипорфиринов за счет гидрофобных взаимодействий порфирино-вых колец./Однако образование димеров металлопорфиринов связано,по-видимому, не только с этим фактором. Хоршо известно, чтоо комплексы £е с порфиринами характеризуются значительно более высокими величинами Кд, чем соответствующие порфирины/П/.

Согласно предположению, выдвинутому Кларком,железопорфири-ны могут быть связаны в димер с помощью водных мостиков, подоб -но хлорофиллу, или кислородных мостиков /22/. К настоящему времени различными физико-химическими методами доказано, что мономерные единицы железопорфиринов связаны в димер посредством JI -оксо-мостика. Существование ji -окео-мостиков в димерах железопорфиринов подтверждается методами Меабауэровской спектроскопии /23 / ИК-спектроскопии по наличию полос колебаний связи Fe-0-Fe /24/, определением молекулярных весов /20/, а также теоретическими расчетами стоения димеров на основе данных рентгеноструктурного анализа /2^26/ Согласно теоретическим расчетам строения димеров железопорфиринов угол Fe-0-F-e составляет величину около 165 градусов для феррипротопорфирина IX. ?е/Ш/ в димерах железопорфиринов находится в высокоспиновом состоянии, при этом ионы выходят из плоскости кольца в сторонурсислорода на "0,5 $./26,27/.

Неясным остается вопрос о природе лигандов в пятом и шестом положениях железопорфиринов. Б ряде работ высказано мнение, что высокоспиновый комплекс железопорфиринов не может иметь экстраQ Iлигандов, поскольку Fe выходит из плоскости кольца, что должгэ.но препятствовать перекрыванию электронных облаков 5?е и эк-стралигандов /11,28/. Однако в работе /29/ методом полярографии было доказано существование в водном растворе при различном рН двух различных форм димерного гемина, которые отличаются друг от друга природой экстралигандов. В некоторых работах авторыприписывают димерному гемину ОН- или HgO лиганды, не аргумента -руя этот вывод /29,30/. Мы считаем более правильным записывать равновесие между димерными и мономерными фортами железопорфири -нов в общем виде /уравнение I/.

1.3. Протолитические равновесия для бЬершпотэсЕшшнов в водных •растворах.

При рН растворов близких к нейтральным растворимость железопорфиринов в воде резко падает. Процессы агрегации и ограниченной растворимости железопорфиринов осложняют изучение как их физико-химических, так и кинетических свойств. Для снятияКМэтих ограничений обычно используют несколько способов. Во-первых, многие работы проводятся на синтетических воднорастворимых железопорфиринах с заряженными группами в порфириновом кольце, которые способствуют увеличению растворимости железопорфиринов в воде и уменьшению димеризации / например, тетрасульфо-произ-водное порфиринов/ или на стерически затрудненных железопорфиринах,' имеющих невысокие значения Кд/ тетрафенилпорфирины//11/. Во-вторых,в качестве растворителей железопорфиринов используются водно-спиртовые среды с содержанием С2Н5ОН более 40%, которые вызывают полную мономеризациго железопорфиринов /31/. В-третьих, к увеличению степени мономеризации железопорфиринов приводит использование в качестве растворителя водно-мицеллярных растворов /32-34/.

1.4. Солюбилизация гемина в мицеллах ПАВ.

В ранних работах /32,37/ отмечалось сильное взаимодействие порфиринов и металлопорфиринов в водных растворах с мицеллами поверхностно-активных веществ /ПАВ/, которое приводит к увеличению их степени мономеризации. Подробное изучение процессов мономеризации, протолитических равновесий и комплексообразова-ния гемина в водных растворах различных ПАВ было выполнено в работах Симплисио /33-36/. В качестве ПАВ им были использованы отрицательно заряженный додецилсульфат натрия /ДСН/, положительно заряженный цетилтриметиламмоний бромистый /ЦТАБ/ и нейтральный Тритон Х-100 /ТХ-100/ в присутствии 0,1М тетраметил-аммонийбромида.

При добавлении к водному димерному гемину /рН 9/ ДСН, ЦТАБ или ТХ-100 в концентрациях выше критической концентрации ми-целлообразования /ККМ/ автор наблюдал значительные спектральные изменения, сопровождаемые ростом поглощения в области Сорэ. Эти изменения автор объясняет процессом мономеризации гемина. Автор подчеркивает, что при использовании ПАВ в концентрациях ниже ККМ нет изменений в спектрах поглощения гемина, т.е. в предмицеллярной области нет взаимодействий между геми-ном и молекулами ПАВ.

Добавление лигандов / CN, имидазол/ приводит к появлению спектров поглощения комплексов гемина с соответствующими экст-ралигандами в пятом и шестом положениях /33-36/.

На основе цикла работ Симплисио по изучению состояния гемина в водно-мицеллярных растворах ДСН, ЦТАБ, ТХ-ЮО в литературе признана следующая точка зрения /II/: I/ при концентрациях ПАВ выше ККМ гемин солюбилизуетсяв мицеллах; 2/ солюбилизация гемина в мицеллах происходит только в мономерной форме;.3/ при достаточно высоких концентрациях ПАВ гемин в водных растворах ДСН, ЦТАБ и ТХ-ЮО полностью мономерен при любом значении рН раствора и существует в виде двух форм Н20-5еН20 или Н20-?е-0Н.

Эта точка зрения, однако, противоречит некоторым экспериментальным результатам. Вработе /39/ отмечалось, что добавление к димерному Ре/Ш/-тетра-/р-сульфофенил/порфирину ДСН или ТХ-ЮО в концентрациях 3% и 4$,соответственно, не вызывает мономери-зации металлопорфирина. 0 сложности системы железопорфирины--мицелла свидетельствуют данные работ /40,41/. В работе /40/ на основе анализа спектров поглощения комплексов £е/Ш/-протопор-фирина с цианид-ионами в растворах ЦТАБ различной концентрации было отмечено образование агрегатов РеПП/С1\Г/2 с ЦТАБ в предайцеллярной области концентраций ПАВ. Дальнейшее добавление ЦТАБ к этим агрегатам вызывает мономеризацию РеПП/САГ/^. Автор обращает внимание на невысокую скорость разрушения агрегатов £еПП/СЛ/72 -ЦТАБ в процессе мономеризации. Равновесие в системе достигается за несколько минут. Аналогичные результаты наблюдались для А0- /П/-тетрафенилпорфиринтетрасульфоната в водных растворах ЦТАБ в работе /41/.

Таким образом, система гемин-ПАВ является сложной системой. Имеющиеся в литературе противоречия требуют более детального изучения процессов взаимодействия гемина с различными ПАВ. 2. Гемин. как модель каталазы и пероксидазы. 2.1. Структура и механизм действия пероксидазы и каталазы.

Каталаза и пероксидаза являются важнейшими представителями класса окислительно-восстановительных ферментов. Биологическая их роль заключается.по-видимому, в освобождении клеток от клеточных ядов, таких как перекисные соединения и ароматические амины и фенолы. Возможны два пути разложения перекиси водорода, Первый путь - реакция диспропорционирования катализируется ка-талазой: 2 HgOg-2 HgO + Og Второй - восстановление - катализируется пероксидазой :Н202 +2 ДН -2 Н20 + 2 Д где ДН - донор водорода или электронов. Как каталаза, так и пероксидаза содержат в качастве кофактора гемин. Структура и механизм действия каталаз и пероксидаз хорошо изучены /42-43/. Оба фермента представляют собой удобный объект для изучения: они хорошо растворимы в воде, стабильны в широкой области значений рН. Каталаза состоит из четырех субъединиц,каждая из которых содержит по одному гемину. Пероксидаза содержит однусубъединицу и один гемин. В связывании гемина с алоферментом принимают участие, во-первых, гидрофобные взаимодействия сопряженной ароматической железопорфириновой системы с белковой глобулой, во-вторых, лигандирование. аминокислотных остатков белка на железо гемина, и, в-третьих, ионные взаимодействия между депротонированными пропионовокислыми группами порфирино-вого кольца и аминокислотными группами белка /42/.—ч О VВ гемине четыре лигандных места в координационной ссрере железа заняты атомами азота тетрадиррольного цикла. Природа пятого и шестого лигандов октаэдрического комплекса Ре/Ш/ в катала-зе и пероксидазе различна. Пятым лигандом железа в пероксидазе является,по-видимому, имидазол, а в каталазе-тирозиновая группа. Шестым лигандом в обоих ферментах, вероятно, является подвижная молекула воды /42-45, 125/.

Реакция диспропорционирования перекиси водорода, катализируемая каталазой, протекает с участием одного промежуточного высокоокисленного соединения, обозначаемого I. Пероксидазная реакция восстановления перекиси водорода включает последовательное образование двух высокоокисленных соединений, обозначаемых I и П. В обоих ферментах соединение I, образующееся при взаимодействии гембелков с HgOg, содержит два избыточных окислительных эквивалента. Оно представляет собой, по-видимому, «^-катион-радикал, где один окислительный эквивалент локализован на Ре/1У/, другой - на порфириновом кольце /42/. Соединение П содержит один избыточный окислительный эквивалент на Ре/1У/. Соединения I и П удается зафиксировать кинетически и спектрально. Промежуточная форма I может быть получена в реакциях пероксидазы с алкил- и ацилперекисями, а также другими сильными& — к,— Vокислителями - CI02, CPuCZg S^Of ^ /46-48/. Предполагают, что в каталазной реакции соединение I взаимодействует с перекисью водорода по ионному механизму с одновременным переносом двух электронов с молекулы Н202 на соединение I. Перок-сидазная реакция протекает через две последовательные стадии переноса электрона с донора водорода с возможным образованием органических радикалов /42/.

Константы скорости образования соединения I для обоих ферментов не зависят от рН раствора в области 5,5 * 9,5 и состаа 7 Т —Iвлягат соответственно величины 6*10 * 1,1*10 М" с для ката-fi т тлазы и 9* Ют/Г с для пероксидазы. Константы скорости реакции взаимодействия соединения I с Н202, полученные лишь для некоторых каталаз, не зависят от рН в интервале 3-9 и составляют величину /2 4/,107М1с1 /42/.

2.2 Кинетические закономерности разложения перекиси водорода на йеррипорйиринах.

В литературе известно значительное количество работ, в которых изучалась реакция разложения перекиси водорода на различных катализаторах. В частности,изучалось каталитическое разложение HgOg на гетерогенной поверхности металлов /49-51/ и окислов металлов /52/, а также гомогенные реакции, катализируемые переходными металлами и их комплексами с различными лиганда-ми /53-59/. Переходные металлы и их комплексы катализируют так -же реакцию окисления доноров водорода перекисью водорода /60-65/. Однако эти реакции протекают, как правило, по радикальному или радикально-цепному механизмам.

Особый интерес исследователей вызывает изучение каталазной и пероксидазной реакций, катализируемых железопорфиринами, поскольку £е/Ш/-протопорфирин 12 является простетической группой соответствующих ферментов. В отличие от каталазы и пероксидазы работа в водных растворах с железопорфиринами в особенности с гемином, сопряжена с рядом трудностей: металлопорфирины плохо растворимы в воде, склонны к димеризации, разрушаются под действием перекиси водорода, а водные растворы гемина окисляются кислородом воздуха /66,67/. Несмотря на эти экспериментальные сложности известен ряд работ по изучению кинетических особенностей и механизма разложения перекиси водорода и ее восстановления в водных растворах гемина и других железопорфиринов.

Способность феррипротопорфирина IX катализировать разложение перекиси водорода впервые была отмечена в работе /68/. Продолжением этой работы явился цикл работ Кремера /69-71/. Им был определен порядок реакции по гемину /первый/ и перекисиводорода / изменяется от I до 0 при увеличении концентрации HgOp/ /69,71/. Была изучена также рН-зависимость скорости реакции в области рн 6,4 т 10,2. Согласно /70/ рН-зависимость имеет сложный вид: скорость процесса растет с увеличением рН от 6,4 до 7,26 и падает при дальнейшем увеличении рН до 10,23. Такая сложная зависимость скорости реакции от рН не подтвердилась в работах других авторов. По нашему мнению это может быть связано с методикой проведения эксперимента в данной работе. Кремер оценивал начальную скорость реакции по количеству перекиси водорода, разложившейся за двадцать минут после смешивания реагентов. Пренебрежение процессом окисления гемина при таких временах может исказить кинетические закономерности реакции.

Кинетические закономерности реакции разложения перекиси водорода катализируемой гемином и другими железопорфиринами, подробно изучались в работах Брауна /72,73/. В работе /72/ автор изучил кинетику взаимодействия гемина с HgOg и показал, что скорость реакции растет с увеличением рН. Зависимость скорости каталазной реакции от концентрации перекиси имела вид кривой с насыщением, что совпадало с результатами Кремера /69/. Однако, если в работах Кремера был установлен первый порядок по гемину, то Браун отмечает более сложную зависимость скорости реакции от концентрации катализатора. В работе /73/ им впервые был сделан вывод о существенном отличии в активностях мономерной и димерной форм катализатора. В этой же работе было показано, что каталазная активность £е/Ш/-протопорфирина в ID 4- 100 раз /в зависимости от рН/ меньше активности ?е/Ш/-дейтеропор-фирина. На основе сопоставления кинетических данных и результатов изучениядимер-мономерного равновесия автор делает вывод,что каталитическая активность, ферригемов определяется концентрацией мономерной формы катализатора. Эти выводы были подтверждены в работе /77/, где изучались модельные каталазные системы на основе ряда жлезопорфиринов : дейтеро-, мезо-, копро- и гема-топорфирина. Различия в активностях мономерных и димерных форм катализатора проявляется в этих системах в нелинейной зависимости скорости каталазной реакции от общей концентрации катализатора. Учет степени мономеризации катализаторов позволил рассчитать вклад активностей димерных и мономерных форм в общую акти -вность железопорфиринов. При рН?-10 активность мономерных форм для всех железопорфиринов превосходит активность димерных форм не менее, чем на три порядка /74/.

Различная активность димерной и мономерной формы гемина предполагалась также в работе /75/. Б этой работе изучалась ката-лазная активность гемина, адсорбированного на саже и фосфоли-пидных поверхностях. Быстрое уменьшение удельной активности гемина при увеличении степени заполнения поверхности авторы связывают с различной активностью мономерной и димерной форм гемина, поскольку степень мономеризации падает при увеличении степени заполнения поверхности.

Следует отметить, что скорость каталазной реакции в фосфатном и карбонатном буферах в 5 - 10 раз ниже, чем в других буферных системах /77,78/. Причины этого экспериментального факта неясны. Для всех буферных сред, кроме фосфатной и карбонатной, наблюдается обратно пропорцианальная зависимость скорости каталазной реакции, обусловленная активностью мономерной формы фер-рипорфирина от концентрации Н+. Однако в фосфатном и карбонатном буферах при рН<8 наблюдается отклонение от этой зависимости /75/. Авторы объясняют это общим кислотным катализом кислой компонентой буфера реакции образования активного промежуточного соединения.

Многие авторы пытались увеличить скорость каталазной реакции, катализируемой гемином,путем добавления к нему различных лигандов /19,78-80/. В некоторых системах увеличение скорости каталазной реакции достигало одного-двух порядков. Однако мы считаем, что рассчитанные на основе этих данных константы скорости являются, по-видимому, эффективными величинами, поскольку авторами не учитывается сдвиг димер-мономерного равновесия в сторону образования каталитически активных мономерных форм гемина в присутствии лигандов. Таким образом, вопрос о влиянии лигандов на активность мономерного гемина остается открытым.

2.3. Механизм реакции -разложения перекиси водорода на йеррипоргМринах.

Механизм взаимодействия феррипорфиринов с перекисью водорода близок к механизму ферментативной реакции. В работах /81,82/ сообщалось о получении промежуточного соединения в реакции дейтероферригема с перекисью водорода. Это соединение обладало как пероксидазной, так и каталазной активностью. При добавлении к дейтероферригему перекиси водорода наблюдалось изменение спектра поглощения, сопровождавшееся уменьшением поглощения в области Сорэ. При добавлении к этому производному дейтероферригема доноров водорода /гидрохинона, аскорбиновой кислоты/ наблюдалась быстрая регенерация исходного спектра. На основе этих данных был сделан вывод об образовании активного "пероксидазно-го" комплекса в реакции дейтероферригема с перекисью водорода. В остутствие донора водорода при использовании небольших избытков перекиси водорода также наблюдалась частичная регенерация исходного спектра, что было связано авторами с каталазной реакцией, протекающей через этот активный комплекс, в процессе которой регенерируется исходный гемин /81/. Реакция образования "пероксидазного" комплекса описывалась кинетикой псевдопервого порядка в условиях 100-1000-кратного избытка перекиси водорода по сравнению с дейтероферригемом. Изученная методом быстрой кинетики зависимость константы скорости от концентрации Н202 имела вид кривой с насыщением, на основании чего авторы предположили следующую схему образования активного комплекса:дфг + н2о2 к - дфг-н2о2^ ДФГ*где ДФГ - дейтероферригем, ДФГ'НрОр - комплекс Михаэлиса,fДФГ35 - "пероксидазный"комплекс.

Б работе /76/ из зависимости константы образования активного комплекса от рН авторы делают вывод об участии Н02-ионов как в образовании комплекса Михаэлиса, так и в последней стадии взаимодействия активного комплекса М55 со второй молекулой Н202. Были рассчитаны величины и ^ == б-ю^Лг1-.

Б реакции образования "пероксидазного" комплекса перекись водорода может быть заменена на другие окислители: С102/84/, производные пероксибензойных кислот /85/. Авторами работы /85/ методом спектрофотометрического титрования ферригема производными пероксибензойных кислот с различными заместителями в бензольном кольце установлена стехиометрия реакции: [ферригем^ : IR OOllJ = 2:1. Пероксибензойная кислота обладает двумя окислительными эквивалентами, поэтому формальная степень окисления железа в промежуточном "пероксидазном" комплексе дейтеро- so ферригема равна +4. Авторы объясняют этот факт двумя различными способами: либо " пероксидазный" комплес является аналогом соединения П пероксидазы, либо при взаимодействии HgOg с дейте-роферригемом образуется сначала аналог соединения I, который затем быстро реагирует с исходным мономерным или димерным ферри-гемом, образуя спектрально регистрируемый димерный "пероксидазный" комплекс. Таким образом,природа "пероксидазного" высокооки-сленного комплекса остается не ясной.

Следует отметить, что промежуточный "пероксидазный" комплекс был зарегистрирован спектрально только для дейтероферригема. Для других железопорфиринов такой комплекс не зарегистрирован. Вопрос об изучении каталазной активности железопорфиринов тесно связан с вопросом об его окислении, поскольку в процессе каталазной реакции в этих системах происходит разрушение катализатора. Этот процесс сопровождается характерными спектральными изменениями: уменьшением интенсивности поглощения на полосе Сорэ, размыванием полос поглощения в видимой области/86/.Вследствие этого многие работы по изучению каталазной реакции с участием феррипорфиринов проводятся по оценке начальных скоростей реакции. Процесс окисления железопорфиринов протекает как под действием перекиси водорода, так и кислорода воздуха. В обоих случаях реакция протекает сложным образом через несколько промежуточных стадий, в ходе которых образуются бил^ивердин и бесцветные бил-пигменты:кЖ м М<й/ IVНоОц ля тVmu мХ бесцветныеР Рбиливердин бил-пигментыгде М - CHg-группа, Р - СН2-СН2-С00-группа, Х- СН=СН2 для протоферригема,-Н - для дейтероферригема, -CHg-CHg для мезо-ферригема, -СН2-СН2-С00Н для копроферригема. Для протоферри-гема первой стадией окисления является по-видимому, окисление винильных групп или так называемое, "старение" гемина /87/.

На основе изложенных выше литературных данных можно сделать следующие выводы:1. Общая активность железопорфиринов в реакции разложения пере-киси|водорода меньше, чем активность ферментативной реакциив ТО2- 103раз.

2. Механизм ферментативной и модельной реакции близки между собой. Лимитирующей стадией модельной реакции является стадия образования промежуточного высовоокисленного состояния.

3. Константы скорости индивидуальных стадий каталитического разложения HgOg близки для мономерных железопорфиринов и каталазы.

4. рН-зависимость ферментативной и модельной реакций различны. Зто связано с тем, что перекись водорода принимает участие вКэтих процессах в форме HgOp - для ферментативной, и в форме HOg-- для модельной реакций.

5. В отличие от ферментативной, модельная реакция разложения перекиси водорода связана с окислением катализатора. Процесс окисления и каталазная реакция протекают через одни и теже промежуточные стадии.

2.4. Петзоксидазная активность железопотхйишнов.

Предложенный в литературе механизм окисления органических субстратов перекисью водорода в присутствии пероксидазы предполагает участие двух активных промежуточных соединений фермента, которые.удается зарегистрировать спектрально. В отличие от этого в литературе нет сообщений о регистрации второго промежуточного соединения в пероксидазной реакции, катализируемой гемином. При добавлении доноров водорода к промежуточному "пероксидазному" комплексу наблюдается непосредственное образование продуктов реакции и исходного гемина /81/. В связи с этим авторы этой работы рассматривают стадию окисления второго субстрата пероксидазы как процесс одновременного переноса двух электронов от до -нора водорода на "пероксидазный"активный комплекс. В литературе существует также противоположное мнение о последовательном переносе электронов в этой реакции. Например, в работе /78/ для реакции окисления бензидина раствором перекиси водорода в присутствии гемина и его диимидазольных комплексов авторы зарегистрировали при рН = 4,5 -г 5,0 спектр промежуточной формы, исчезающей в ходе окисления бензидина. Этот спектр поглощения авторы приписывают промежуточному тройному комплексу гемина с H^Og и полуокисленным субстратом, который образуется в результате переноса одного электрона от бензидина на комплекс гемина с Последняя точка зрения кажется нам более обоснованной, поскольку в качестве окисляющегося субстрата в реакции могут участв-вовать и одно электронные восстановители, например, Э7Н/» Однако в условиях, когда стадия окисления донора водорода промежуточным соединением не является лимитирующей, механизм окис ления не проявляется в общей кинетике реакции. Поэтому в дальнейшем мы будем залисываеть эту реакцию в одну стадию.

Согласно схемам/2/ и /3/ для пероксидазной и каталазной реакций, соответственно обе эти реакции протекают через общеепромежуточное высоко-окисленное состояние гемина, причем стадия образования этого соединения, как правило, является лимитирующей. Из этого следует, что скорость обеих реакций должна одинаково изменяться с изменением рН. Однако скорость каталазной реакции непрерывно растет с увеличением рН, в то время как рН-зависимость пероксидазной реакции имеет вид кривой с максимумом. Положение максимума, согласно работам /78,93,94/, зависит от экстрали-гаядов гемина и природы второго субстрата и может изменяться от pH/v3 до рН"8. Такой вид зависимости начальной скорости пероксидазной реакции V0nf от рН трудно объяснить в рамках схемы /3/. В работе /78/ авторы объясняют экстремальный характер зависимости начальной скорости реакции окисления бензи>дина перекисью водорода в присутствии. диимидазольного комплекса гемина следующим образом. В пероксидазной и каталазной реакциях участвуют два различных активных высокоокисленных комплекса: комплекс гемина с HOg", активный в каталазной реакции, и комплекс гемина с HgOg, ответственный за пероксидазную реакцию. Кислую ветвь рН-зависимости пероксидазной реакции авторы объясняют увеличением концентрации комплексов гемин-Дмидазол^ за счет увеличения концентрации имидазольного основания в интервале рН 6 4- 9. Щелочную ветвь зависимости 1У0п1 от рН авторы объясняют увеличением скорости конкурирующей каталазной реакции за счет увеличения концентрации НО^-. Это объяснение кажется нам маловероятным по следующим причинам. Во-первых, из анализа литературы следует, что в области рН 7 * II при взаимодействии дейтерогемина с ^разуется только одна спектрально регистрируемая форма, которая проявляет как каталазную, так и пероксидазную активность. Поэтому нет оснований считать, что в пероксидазной и каталазной реакциях участвуют различные активныекомплексы гемина. Во-вторых, экстремальный вид зависимости от рН отмечается не только для диимидазолъного комплекса гемина, но и для самого гемина, что ставит под сомнение объяснение кис-слой ветви рН-зависимости. Таким образом, вопрос объяснения рН-зависимости пероксидазной реакции остается открытым.

Выше угле отмечалось, что скорость окисления доноров водорода перекисью водорода в присутствии гемина на несколько порядков ниже скорости соответствующего ферментативного процесса. Увеличения скорости пероксидазной реакции на один-два порядка можно добиться за счет изменения лигандного окружения гемина /78,93-•95/. Многие авторы считают, что наличие имидазола в координационной сфере иона железа должно приводить к заметному увеличению скорости пероксидазной реакции, поскольку в пероксидазе одним из лигандов гемина является имидазол. В самом деле, для гемина в присутствии избытка имидазола наблюдается увеличение в 5 - 10 раз скорости реакции окисления субстратов пероксидазы по сравнению с реакцией, катализируемой гемином /78,94/. Однако, как уже отмечалось выше, авторы этих работ не учитывают изменения степени мономеризации при добавлении к гемину лигандов, т.е. увеличения концентрации каталитически активной формы катализатора, что само по себе может приводить к увеличению скорости пероксидазной реакции. По этой причине вопрос влияния лигандного окружения гемина на его каталитическую активность остается не решенным.

Известно /96/, что изменение полярности среды может сильно изменять окислительно-восстановительный потенциал Ре/Ш/-порфи-ринов и, вследствие: этого, должно оказывать влияние на константы скоростей индивидуальных стадий каталитических реакций. Известно также, что в гембелках гемин находится в более гидрофобном окружении, чем в водном растворе. Однако экспериментально влияние микроокружения на каталитическую активность гемина не изучалось. Всвязи с этим целью нашей работы явилось изучение пероксидазной и каталазной каталитической активности гемина в водно-мицеллярных растворах, геде гемин находится в более гидрофобном по сравнению с водой окружении. Такие условия проведения реакции позволяют изучить влияние на каталитическую активность гемина различных факторов - рН и полярности среды, степени мономеризации и природы экстралигандов гемина, распределения субстратов в микрогетерогенной среде. Применение водно-мицеллярных растворов позволяет варьировать эти факторы по отдельности или одновременно, сравнить масштабы их влияния и выявить параметры, определяющие скорость реакции.

Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. I. Исходные вещества.

Гемин - кристаллический чистый, фирмы " КосК- "/Англия/.

Гемпептид - 6/7/-лейцингистидин-0-CHg - получен по методике /96/, был любезно предоставлен нам Филиппович Е.И./МИТХТ/.

ТХЮ0 - препарат фирмы "<Тега& " /Западный Берлин/.

Додецилсульфат натрия - дважды перекристаллизован из этилового спирта.

Цетилтриметиламмоний бромистый - Cfetri(ipo& /ЧССР/.

Цетилтриметиламмоний ацетат - получали обработкой продажного препарата ЦТАБ ацетатом серебра по методике /97/.

О-дианизидин - марки "ч", очищали возгонкой в вакууме.

Перекись водорода - 76%-ный раствор, ос:.ч.

Гидроперекись трет-бутила - получали по методике /98/.

Дитионит натрия - преперат фирмы " SifrmQ- " /США/.

Пиридин, диметилсульфоксид - очищали перегонкой.HgPO^, HCI, СНдСООН /ледяная/, HNOg - марки ос.ч., гидроокиси калия и натрия - продажные препараты марки х.ч.

В работе использовались соли ос.ч. или х.ч., дважды перекристаллизованные из тридистиллированной воды. Для приготовления растворов использовали трижды перегнанную в стекле воду.- 40 2. Использованная аппаратура.

Запись спектров поглощения и кинетики пероксидазной реакции осуществляли на двухлучевом спектрофотометре В-25 "Ьео4та.п " /США/ с использованием кювет с длиной оптического пути от ОД до 5 см. Фотометрическая точность прибора составляет 1% от данной величины шкалы, точность установки длины волны -0,5 нм.

Для регистрации быстрых кинетик использовали установку PA-40I "Stopped ЛонгftaactLo-n " фирмы " Union,(rl&enДля измерения величины электропроводности раствора использовали кондуктометр марки " fLadLometei " /Дания/.

Измерения скорости седиментации гемина проводили на аналитической ультрацентрифуге "bec-iman -Е" с фотоэлектрической абсорбционной сканирующей системой и мультиплексором. Скорость ротора составляла 60000 оборотов в минуту. Коэффициенты седиментации определяли из зависимости 'in. г- от времени где г -расстояние от центра вращения до центра границы разделе /100/.

Кинетику каталазной реакции регистрировали с помощью электрода Кларка, присоединенного к полярографу 0H-I05, " (Lade " /Венгрия/.

Для измерения рН растворов использовали рН-метр марки РНМ-64, " (Ladiometet » /Дания/. Точность измерений ± 0,001ед.рН. Калибровку прибора проводили стандартными буферными растворами.

Математическая обработка результатов проводилась на ЭВМ "Электроника ДЗ-28".- 41 3. Приготовление рабочих растворов.

Буферные растворы готовили путем смешивания отдельно приготовленных 5мМ кислотной и щелочной компонент в 0,IM NaCIO^ В работе использовали Ма-фосфатный буферный раствор.

Растворы ПАВ готовили по навеске в Na-фосфатном буферном растворе.

Растворы гемина и гемпептида готовили непосредственно перед использованием путем растворения небольшого количества вещества в 0,1 мл 0,IM NaOH или ДМСО и последующего разбавления буферным раствором или раствором ПАВ. Концентрацию определяли по пиридин-гемохромогену /80/. Растворы гемина в ПАВ устойчивы в течение нескольких дней.

Раствор о-дианизидина готовили по навеске в 96% этаноле.

Раствор перекиси водорода готовили путем разбавления 76% водного раствора тридистиллированной водой. Концентрацию определяли спектрофотометрически / ^ззо" ИГ^см"^ /101//.

Раствор гидроперекиси трет-бутила готовили путем разбавления в даСО. Концентрацию определяли иодометрически по стандартной методике /102/.

Раствор гидроперекиси ТХ-100 готовили путем растворения в тридистиллированной воде тритонаХ-ЮО, содержащего 0,0Ш гидро-перекисных групп. Концентрацию определяли иодометрически /102/.

4. Методики проведения экспериментов.

Пероксидазная активность гемина определялась по начальной скорости окисления о-дианизидина при комнатной температуре. Типичный эксперимент состоял в следующем: к 1,9 мл 5мМ Na-фос-фатного буфера с заданным рН прибавляли 0,1 мл запасного раствора гемина, 45мкл 5мМ раствора о-дианизидина. Реакцию инициировали добавлением 100 мкл запасного раствора HgOg./ 9м М/. После быстрого перемешивания реагентов следили за изменением оптической плотности на 460 нм /по накоплению продукта окисления о-дианизидина/ или на 300 нм /по исчезновению субстрата / /рис.3/. Скорость реакции определялась по скорости изменения оптической плотности с использованием коэффициента экстинкции продукта реакции <546q= /ЮЗ/ и разности коэффициентов экстинкции исходного вещества / £ / и продукта реакции / Р / <5 soo= гр =2,5*Ю4 У.Г^-см"1, расчитанной изэксперимента.

Рис.3Изменение оптшеской плотности в процессе реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии гемина в 0,05М ДСН, 1 -1= 300 нм, 2 -Я =460 нмней не оставалось пузырьков воздуха, зачтем с помощью шприца вводили в ячейку микроколиичества /24-10 мкл / запасного раствора HgOg. За кинетикой накопления кислорода следили непрерывно по увеличению тока в системе.

Концентрацию гемина и гемнептида определяли по методу пири-дингемохромогена, описанному в работе /80/. Для этого к 0,5 мл раствора гемина добавляли 4,5 мл 20% раствора пиридина в 0,1М NaOH. Смесь перемешивали и отбирали по 2,3 мл раствора в две спектрофотометрические кюветы /г = I см /. В рабочую кювету добавляли 0,1 мл тридистиллированной воды и на кончике шпателя дитионит натрия, в кювету сравнения - 0,1 мл 6 мМ раствора fyl&CCNJe] • Разностный спектр для растворов восстановленного и окисленного пиридингемохрома записывали в интервале 490 -590 нм. Концентрацию гемина расчитывали по формуле, предложенной в работе /80/.

Статистическая обработка результатов проводилась стандартными способами. В качестве экспериментальных ошибок, если это не оговорено специально, приводятся среднеквадратичные отклонения определяемых величин.

1У. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

У, ВЫВОДЫ.

1. Показано, что гемин взаимодействует с молекулами поверхностно-активных веществ (ПАВ) додецилсульфата натрия (ДСН), бромистого цетилтриметиламмония (ЦТАБ), Тритона Х-100 в широкой области концентраций ПАВ. При концентрациях ПАВ ниже ККМ гемин полностью связан с молекулами ПАВ, образуя агрегаты гемин-ПАВ. Гемин, включенный в мицеллы, находится в виде равновесной смеси димерной и мономерной форм. Степень мономеризации гемина зависит от природы ПАВ.

2. Определены константы равновесия и кинетические константы димер-мономерного равновесия гемина в водных растворах ПАВ.

3. Рассчитаны константы протолитических равновесий для различных форм гемина в растворах ДСН, ЦТАБ и Тритона Х-100. Определены области существования и спектральные характеристики комплексов гемина с различными лигандами ( Off", С Г", В2~, KS04~, HgO, имидазол).

4. Получены количественные характеристики для каталитической активности гемина в реакции разложения HgOg (каталазная реакция) и окисления о-дианизидина гидроперекисями (пероксидазная реакция) в водных растворах различных ПАВ. Показано, что катализатором обеих реакций■является только мономерная форма гемина.

5. Предложены кинетические схемы и определены кинетические параметры каталазной и пероксидазной реакций, катализируемых гемином в водно-мицеллярных растворах. Показано, что лимитирующей стадией каталитических реакций является мономеризация гемина.

6. Показано, что при лигандировании одного или двух имида-зольных лигандов на железо гемина каталитическая активность мономерного гемина не изменяется, но увеличивается степень мономеризации гемина.

7. Проведена оптимизация условий протекания реакции окисления о-дианизидина гидроперекисями. Предложены условия, при которых скорость реакции, катализируемой гемином в водно-мицеллярных растворах, превышает более, чем в сто раз скорость реакции в воде.

1. Березин Б.Д. Координационные соединения порфиринов и фталовда^ " нинов. - М.: Наука, 1978, 280 с.

2. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Дероксдцазный катализ и его применения: методическая разработка к спецкурсу "Физическая химия ферментов". М.: Московский университет, 1981, 92 с.

3. Kremer M.L. Mechanism of catalase action. J.Chem.ooc., Faraday Trans. 1, 1983, v.79, No.9, p. 2125-2131

4. Гуринович Г.П., Севченко А.Н., Соловьев К.П. Спектроскопия ■ хлорофиллов и родственных соединений Минск: Наука, 1968, 517 с.

5. Brown S.B., Lantzke I.R. Solution structures of ferriheme in some dipolar aprotic solvents and their binary aqueous mixtures . Biochem.J., 1969, v.115, No.2, p. 279-285.

6. Brown Б.В., Dean Т.О., Jones P. Aggregation of ferrihemes. Di• merization and protolytic equilibria of protoferriheme and deu-teroferriheme in aqueous solution. Biochem.J., 1970, v.117, No .4, p. 733-739.

7. Brown S.B., Hatzikonstantin ou H. The dimerization of ferri-hemes. II. Equilibrium and kinetic studies of mesoferriheme dimerization. Biochim.Biophys.Acta, 1978, v.539, No.3, p. 352-363.

8. Brown Б.В., Hatzikopstantinou H. The dimerization of ferri-hemes. Ill. Equilibrium and kinetic studies on the dimerization of coprof erriheme . Biochim .Biophys .Acta, 1978, v.544-, No. 2, p. 407-417.

9. Brown S.B., Hatzikonstantinou H., Herries D.G. The structure of porphyrins and hemes in aqueous solution. Int.J.Biochem., 1980, v.12, No.5, P. 701-707.- 142

10. Taylor J.Fx Metalloporphyrins II. Cobalt and. manganese meso-porphyrins in coordination with nitrogenous bases. J.Biol. Chem., 194-0, v. 135, p. 569-595.

11. White V/.I. Aggregation of porphyrins and metalloporphyrins. -In: The porphyrins/Ed.Dolphin D. New York: Academic Press, 1979, v.V, Physical Chemistry, Part C, p. 303-339.

12. Inada I., Shibata K. boret band of monomeric hematin and its changes on polymerization. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1962, v.9, No .3, p. 323-327.

13. Blauer G., Zvilichovsky B. Ultracentrifugation studies on the aggregation of ferriprotoporphyrin IX by electrolytes in aqueous alkaline medium. Arch.Biochem Biophys., 1968, v. 127, No.3, p. 74-9-755.

14. Viscio D.B., La-Mar G.N. NMR studies of low-spin ferric complexes of natural porphyrin derivatives. 3. Thermodynamics of dimerization and the influence of substituents on dimer structure and stability. J.Am.Chem.Soc., 1978, v.100, v.26, p. 8096-8100.

15. Adler A.D. Redox potential studies on pyridine protohemin. -In: Hemes and hemoproteins/Eds.Chance В., Estabrook R.W., lonetani T. New York: Acad.Press, 1966, p. 255-262.- 143

16. Голубчиков О.А., Березин Б.Д., Казакова И.М., Березин М.Б. Кинетика и механизм диссоциации Зе.(Ш)-тетрафенил порфиринаjK-оксо-димера. Ж.Орг.хим., 1982, т.52, & I, с. 83-90.

17. Brown S.B., Hatzikonstantinou Н., Herries D.G. The effect of buffer ions and specific cations on deuteroferriheme dimeri-zation. Biochem.Biophys.Acta, 1978, v.539, No.3, P.338-351.

18. Lemberg R., Legge J.w. Hematin compounds and the pigments. -New York: Interscience Rublishers Inc., 1949, 775 p.

19. Cohen I.A. The dimeric nature of hemin hydroxides.- J.Am.Chem. Soc., 1969, v.91, No.8, p. 1980-1983.

20. Gallagher W.A., Elliott W.B. Alkaline haematin and nitrogene-ous ligands. Biochem.J., 1968, v.108, No.1, p.131-136.

21. Shack J., Clark W.M. Metalloporphyrins. Cycles of changes in systems containing heme.- J.Biol.Chem., 1947, v.171, Ж0.2, p. 143-187.

22. Перфильев K)JI., Бабешкин A.M., Веселова M.H,, Чухрай B.C., Полторак O.M. Изучение строения адсорбированных комплексов гематина методом Мессбауэровской спектроскопии. Вестн.Моск. ун-та, серия 2, 1973, т.14, № I, с. 100-102.

23. Brown S.B., Jones P., Lantzke I.R. Infrared evidence for an oxo-bridged (Fe-O-Fe) hemin dimer. Nature(London), 1969, v.223, No.5209, p. 960-961.

24. Kadish K.M., Bottomley L.A., Brace J.G., V/inograd N. X-ray photoelectron spectroscopic studies on monomeric and dimeric iron porphyrins.- J.Am.Chem.Soc. ,1980, v.102, No.13, p.4341-4344.

25. Koffman А.В., Collins D .M., Day V.W., Fleisher, Srivastava T.B., Hoard J.L. The crystal structure and molecular stereochemistry of ^-oxo-bis£o6,6, -tetraphenylporphynatoiron(III)}.■ J.Am.Chem.Soc.,1972, v.94, No.10, p. 3620-2626.- 144

26. Cohen I.A. Metal-metal interaction in metalloporphyrins, me-talloproteins and metalloenzymesStruct.Bonding, 1980, v.10, No.1, p. 3-18.

27. Wicholas M., Mustacich R., Jayne D. Proton niclear magnetic resonance contact shift of binuclear oxo-bridged iron(IIl) porphyrins.- J.Am.Chem.Soc., 1972, v.94, No.13, p.4518-4522.

28. Jordan J., Bednarski Ф.М. Polarography of Hemin. Evidence for a two-electrone transfer.- J.Am.Chem.Soc., 1964, v.86, No.24, p. 5690-5691.

29. Gallagher W.A., Elliott V/.B. Alkaline heematin and nitrogenous ligands.- Biochem.J., 1968, v.108, No.1, p. 131-136.

30. Davies Т.Н. Ferriprotoporphyrin and its imidazole complex in aqueous ethanolic solution.- Biochim.Biophys.Acta, 1973, v. 329, No.1, p. 108-117.

31. PorraR.J., Jones O.T.G. Studies on ferrochelatase. An investigation of the role of ferrohelatase in the biosynthesis of various heme prosthetic groups.- Biochem.J., 1963, v.87, No.1, p. 186-192.

32. Simplicio J. Hemin monomers in micellar sodium lauryl sulfate. A spectral and equilibrium study with cyanide.- Biochem., 1972, v.11, Ко. 13, P. 2525-2528.

33. Simplicio J., Schwenzer K. Hemin intercalated in micellar ce-tyltrimethylammonium bromide and triton X-100. A kinetic, spectral and equillibrium study with cyanide.- Biochem.,1973, v. 12, No.10, p. 1923-1929.

34. Simplicio J., Kinetics of binding of cyanide to hemin intercalated in micellar sodium lauryl sulfate.- Biochem., 1972, V.II3, p. 2529-2534.- 145

35. Simplicio J., iDChwenzer K., Maenpa F. Kinetic,? of cyanate and imidazole binding to hemin in micelles.- J.Am.Chem.Soc.,1975, v. 97, No.25, p. 7319-7326.

36. Phillips J.N. Physico-chemical properties of porphyrin.- In: Comprehensive biochemistry, Ch.Il/Ed. Florkin M., Stotz E.H.Amsterdam: Elsevier 1963, v.9, p. 34-72.

37. Hambright P., Rishnamurthy M.K., Chock P.B. Metal-porphyrin interactions. V. Kinetics of cyanide addition to a water soluble iron porphyrin dimer.- J.Inorg.Nucl.Chem.,1975, v.37, No.2, p. 557-561.

38. Minch M.J., La- Mar G.N. Spectroscopic studies of dicyano hemin in cationic micelles.- J.Phys.Chem.,1982, v.86, No.8, p. 1400-1406.

39. Eck V., Marcus M., btange G., Westerhausen J., Holzwarth J.P. Investigation of electron transfer reactions of meta'l-porphy-£in complexes in micellar solutions.-- Ber .Bunsenges .Phys .Chem., 1981, v.85, No.10, p. 869-876.

40. Пратт Д. Каталаза и пероксидаза. В кн.:Методы и достижения бионеорганической химии/Под ред.МакОлифф К.А. - М.:Мир, 1978, с. 194-228

41. Hewson W.D., Hager L.P. Peroxidases, catalases and chloroper-oxidaseIn: The porphyrins/Ed.Dolphin D.—New fork: Academic Press, 1979, v.7, Biochemistry, Part B, p. 295-332.- 146

42. Д.И.Метелица. Моделирование окислительно-восстановительных ферментов. Минск: Наука и техника. - 1984- 292 с.

43. Morrison М., Schonbaum G.-ti. Peroxidase-catalyzed halogenation Annu .Rev.Biochem., 1976, v.45, P. 861-868.

44. Chance B. Enzyme-subs crate compounds of horseradish peroxidase and peroxides. II. Kinetics of formation and decomposition of the primary and secondary complexes.- Arch.Biochem.Biophys., 1949, v.22, p. 224-252.

45. Marklund S. Hydroxymethylhydroperoxide as inhibitor and peroxide substrate of horseradish peroxidase.- Eur.J.Biochem., 1971, v.21, No.3, p. 348-354.

46. George P. Intermediate compound formation with peroxidase and strong oxidizing agents.- J.Biol.Chem., 1953, v.201, No.1, p. 413-426.

47. Леденченко И.А., Ступиченко P.H. Каталитическое разложение перекиси водорода в щелочной среде. Взаимоотношение гомогенного и гетерогенного процессов. Ж.Физ.Хим., 1981, т.55, 9, с. 2407-2410.

48. Леденченко И.А., Ступиченко Р.Н. К вопросу о каталитическом разложении перекиси водорода в щелочной среде. П. Влияние водорода и кислорода, адсорбированных скелетным никелем, на кинетику разложения Н202. -Ж.Физ.Хим., 1975, т.49, №6, с.1434-1437.

49. Леденченко И.А., Ступиченко Р.Н. О каталитическом разложении перекиси водорода в щелочной среде.; Ш-. Влияние содержания щелочи в растворе на кинетику разложения в присутствии серебра. Ж.Физ.хим., 1977i т.51, В 9, с. 2253-2256.

50. Громов В.В., Бондаренко Г.П., Попова А.П. Разложение перекиси водорода в щелочной среде в присутствии галлия и германия. -Ж.Физ.хим., 1983, т.57, Щ1, с. 2721-2725.- 147

51. Сычев А.Я., Исак В.Г., Пфаннмеллер У. Высокие состояние окисления комплексов марганца в катализе. П. Механизм распада HgOg в присутствии бикарбснатных комплексов марганца. Ж,физ,хим., 1983, т.57, В 3, с. 760-762.

52. Cohen &., Lev/is D., Einet P.M. Oxygen consumption during the Fenton-type reaction between hydrogen peroxide and a Ferrous2+ ч

53. Chelate (Fe -DTPA). J.Inorg.Biochem1981, v.15, No.2, p. 143-151.

54. Hinisci F. Nucleophilic and radicalic reactivity of hydrogen per oxide. Chim.Ind.(Milan), 1983, v.65, No.7-8, p.487-496.

55. Melnyk A.C., Kildahl N.K., Rendina A.R., Busch D.H. Catalysis of the decomposition of hydrogen per oxide by a complex of iron (III) with a synthetic macrocyclic ligand.- J.Am.Chem. Soc., 1979, v.101, No.12, p. 3232-3240.

56. Шамб У., Сеттерфилд Ч., Вентвортс Р. Перекись водорода. М.: Издатинлит., 1958т 578 с.

57. Ariel М., Manka J. ITie spectrophotometric determination of chromium and vanadium with ortho-dianisidine,- Anal.Chim.acta, 1961, v.25, N о. 3, p. 248-256.- 148

58. Borman S.S., Beamish F.E., McBryde W.A.E. The colarimetric determination of iridium by o-dianisidine.- Anal.Chim.Acta,1956, v.15, p. 363-366.

59. Po.pa G., Negoiu D., Baulescu Gh. Zur colorimetrischen Bestim-mung von Cer(IV) bei Anwesenheit von Eisen(IIl) Und Lanthan (III) mittels orthodianisidin.- Z.Anal.Chem.,1959, v.167,1. No.5, p. 329-331.

60. Vassiliades C.} Manoussakis G. Dosage spectrophotometrique de Fe(IIl) avec la dianisidine (3-3-dimethoxybenzidine).- Bull. Soc.Chim. France, 1960, No.2, p. 390-393 (J.Chem.Phys., 1960, v.33, No.1-3).

61. Крейгольд С.У., Васнев A.H. Пероксидазная активность анионных комплексов переходных элементов У и У1 групп периодической системы. Кинет.катал., 1979, т.20,№ 6, с. 1483-1487.

62. Яцимирский К.Б. Кинетические методы анализа. М,: Химия,1967, 199 с.

63. Brown S.B., Hatzikonstantinou Н., Herries D.G. The role of peroxide in haem degradation. A study of the oxidation of fer-rihaems by hydrogen peroxide.- Biochem.J., 1978, v.174, No.3, pp. 901-907.

64. Rajananda V., Brown S.p. The mechanism of heme degradation.1R

65. An 0 study of heme coupled oxidation at low oxygen partial pressure'.- Tetrahedron, 1983, v.39, No.11, p.1927-1932.

66. Euler H., Josephson K. Uber die Katalytische Spaltung des Wesserstoffperoxyds durch Hamin. Justus Liebigs Ann.Chem., 1927, v.456, p. 111-115.

67. Kremer H.L. Decqmposition of hydrogen peroxide by hemin; dependence of the reaction velocity on pH. Trans.Faraday Soc., 1965, v.61, No.511, p. 1453-1458.- 149

68. Gatt R., Kremer M.L. Decomposition of hydrogen peroxide by Hemin. Dependence of the reaction velocity on pH in the alkaline range. Trans.Faraday Soc., 1968, v.64, No.543, p. 721726.

69. Kremer M.L. The effect of dimerization on the catalytic activity of haemin.- Biochim.Biophys.Acta, 1973, v.297, No.2, p.268-275.

70. Brown S.B., Jones P. Reactions between haemin and hydrogen peroxide. Part 3. Catalytic decomposition of hydrogen peroxide Trans.Faraday Soc., 1968, v.64, No.545, p.999-1005.

71. Brown S.B., Dean T.C., Jones P. Catalytic activity of Iron(III)-centred catalysis. Role of dimerization in the catalytic action of ferrihaems.- Biochem.J., 1S70, v.117, No.4, p.741-744.

72. Hatzikonstantinou H., Brown S.B. Catalase model systems. Decomposition of hydrogen peroxide catalysed by mesoferrihaem, deuteroferrihaem, coproferrihaem and haematoferrihaem.- Bio-chem.,0"., 1978, v.174, No.3, p. 893-900.

73. Веселова M.H., Чухрай E.C., Полторак O.M. Адсорбция и катали*-тические свойатва гемина на саже и фосфолипидных поверхностях. Веот.Моск. ун-та. Сер.П, 1970, т.II, № I, с. 14-17.

74. Kelly Н.С., Davies D .М., King M.J., Jones P. Pre-steady-state kinetics of intermediate formation in the deuteroferriheme-hydrogen peroxide system.- Biochemistry, 1977, v.16, No.1o, p. 3543-3549.

75. Jones P., Robson Т., Brown S.B. Catalase activity of ferri-hemes.- Biochem.J., 1973, v.135, No.2, p.353-359.

76. Ярославов А.А. Исследование каталитических свойств комплексов гемина в окислительно-восстановительных реакциях. Канд.хим. наук Москва, МГУ, 1978, 126 с.- 150

77. Веселова М.Н., Чухрай Е.^., П0лторак О.М. Активация и ингиби-рование каталазной функции гематина гистиднном. Вестн.Моск. ун-та, Сер.П, 1970, т.II, В 3, с. 289-292.

78. Falk J.В. Porphyrins and metalloporphyrins jFheir general physical and coordination chemistry, amd laboratory methods.-Amsterdam:Elsevier, 1964, p. 266.

79. Portsmouth D., Beal Е.Д. The peroxidase activity of deutero-hemin.- Eur.J.Biochem., 1971, v.19, No .4, p.479-487.

80. Jones P. The evoluation of catalase activity. In: Oxidases and related redox systems/Ed. King 'X'.E., Mason Н.Б., Morrison M. -University Park Press: Baltimore, 1973, v.1, p.333-349;

81. Jones P., Prudhoe K., Robson Т., Kelly H.C. Kinetics of formation of the peroxidatic intermediate from deuteroferriheme and hydrogen peroxide.- Biochemistry, 1974, v.13, No.21, p .42794284.

82. Chlorite Ion oxidation of the Iron(IIl) complex of deuteropor-phyrin IX/Kelly H.C., Perigi K.J., Wilson I. et al. Inorg. Chem., 1981, v.20, No.4, p. 1086-1090

83. Jones P., Mantle D., Davies D.M., Kelly H.C. Hydroperoxidase activities of ferrihemes: Heme analogues of peroxidase enzyme intermediates.- Biochemistry, 1977, v.16, No.18, p.3974-3978.

84. Brown S.B., Jones P. Reactions between hemin and hydrogen peroxide. II. Destructuve oxidation of hemin. Trahs.Faraday Soc., 1968, v.64, No.4, p. 994-998.

85. Brown S.B., Jones P., Suggett A. Reactions between hemin and hydrogen peroxide. I. Aging and nondestructive oxidation of hemin.- Trans.Faraday Soc., 1968, v.64, No.4, p. 986-993.- 151

86. Jones P., Prud<-hoe K., Robson i1. Oxidation of deuteroferriheme by hydrogen peroxide.- Biochem.J., 1973, v.135, No.2, p.361-365.

87. Угарова H.H. Кинетические закономерности катализа пероксида-зой и люциферазой и проблемы использования этих ферментов для определения микроколичеств веществ. Дисс.докт.хш.наук -Москва, 1982, МГУ, 385 с.

88. Frew J.Е., Jones P. Peroxidase-like activities of iron(IIl)-porphyrins: kinetics of the reduction of a peroxidatically active derivative of deuteroferriheme by anilines.- J.Inorg. Bio-chem., 1983, v.18, No .4, p. 33-39.

89. Jones P., Nantle D., Wilson I. Influence of ligand modification on the kinetics of the reactions of iron (III) porphyrins with hydrogen peroxide in aqueous solutions.- J.Chem.Бос., Dalton Trans., 1983, No.1, p. 161-164.

90. Olson Т., Ewetz L., '4iore A. Catalytic action and destruction of protohematin during peroxide dependent luminol chemiluminescence.- Photochem.Photobiol., 1983, v.38, No.2, p. 223-229.

91. Tohjo M., Nakamura I., Kurihara K., Somejima Т., Hachimori Y., Shibata K. Peroxidase activity of hemoproteins. IV. Hematin complexes as model enzymes of peroxidase.- Arch.Biochem.Bio-phys., 1962, v.99, No.2, p. 222-240.

92. Nakamura I., Tohjo Mbhibata К. Peroxidase activities of hemoproteins. V. Hematin complexes with heterogeneous ligands.-Arch .Biochem .Biophys ., 1963, v.102, No.'l, p.144-151.

93. Beskova G.G., Sokolovskig V.D., Shitova N.B. Semikolenov V.A. Effect of medium composition on the monooxygenase activity of immobilized hemin in aniline oxidation.- Reac.Kinet.Catal. Lett., 1981, v.18, No.3, P. 269-293.

94. Kassner ^.J. Effects of nonpolar environments on the redox potentials of heme complexes.- Proc.Nat.Acad Sci.USA,1972, v.69, No.8, p. 2263-2267.- 152

95. Кавецкая О.И., Яцимирский А.К., Березин И.В. Кинетика анации • аквакобалоксимов, включенных в мицеллы поверхностно-активныхвеществ. Докл. АН СССР, 1984, т.277, В 5, с. II70-II74.

96. Milas N.A., Surgenor D.M. Organic peroxides JQU. Tei?t~Butylhydroperoxide and di-tert-bytyl peroxide. J.Am.Chem .Sci., 1946, v.68, No.1, p. 205-208

97. Эмануэль H.M., Гал Д. Окисление этилбензола (Модельная реакция)-!.: Наука, 1984, с. 186-219.

98. Маршелл Э. Биофизическая химия. ivi.: Мир, 1981, т.1, с.187-198.

99. George P. The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome с peroxidase and horseradish peroxidase 1. Titration v;ith reducing agents.- Biochem.J., 1953, v.54, No.2, p. 267-276.

100. Wibaut J.P., Van Leenwen H.B., Van der Wal B. On the determination of hydroperoxides. Recuel des.Trayaux Chimiques des Pays-Bas. Rec . tra«r. chim., 1954, v.73, No.11, p. 1033-1036.

101. Лебедева O.B., Угарова H.H., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена. Биохимия, 1977, т.42,1. В 8, стр. 1372-1379.

102. Трушанов А.А. Изготовление в лабораторных условиях закрытого полярографического электрода Кларка В кн.:Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. -М.: Наука, 1973, с. 78-79.

103. Handbook of; Chemistry and Physics/Ed. Hodgman C.D., 33 edition, v.2, 1951, 2894, p.

104. Mukerjee P., Mysels K.J. A Re-evaluation of the spectral chance method of determining critical micells concentration.-J.Am.Chem.Soc., 1955, v.77, p. 2937-2943.- 153

105. Wennerstrom H., Lindman В. Micelles physical chemistry of surfactants association. Physics reports, 1979, v.52, No .1, p. 1-86.

106. Collier G.S., Pratt J.M., De-Wet C.R., Tshabalala C.F. Studies on hemin in di methyl sulfoxide/water mixtures.- Biochem. J., 1979, v.179, No.2, p. 281-289.

107. Brown S.B., Lantzke I .R. Solution structures of ferriheme in some dipolar aprotic solvents and their binary aqueous mixtures." Biochem.J., 1969, v.115, No.2, p. 279-285.

108. Tachiyashikt S., Yamatera H. Aggregate formation of tris1,10-phenanthrolike)iron( II) ions with ionic surfactsnts. Kinetic studies of racemization and dissociation of the complex.- ^hem.Lett., 1S81, No.12, p. 1681-1684.

109. Katsumata M., Kasatani K., Kawasaki M., Sato H. Highly aggregated state of the dye with the detergent in the premicellar region as revealed by resonance Raman spectra.- Bull.Chem. Soc., <Jpn. , 1982, v.55, No .3, p. 717-720.

110. Ривс P.Л., Харковей Ш.А. Смешанные мицеллы, состоящие из красителя метилового оранжевого и катионных ПАВ. В кн.:Мицел-лообразование, солюбилизация и микроэмульсии/Под ред.К.Мит-тел. - М.: top, 1980, 499-514.

111. Mauzer Н. Formale Kinetik. Bertelsmann Universitatsverlag, 1974, s.368.

112. Березин PI.В., Клёсов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: йз-во Моск. ун-та, 1976, 320 с.

113. Fuhrhop J.-H. The oxidation states and reversible redox reactions of metallo porphyrins. In: otruct.Bonding/Ed.J.D.Dunitz-Berlin: Springer-Verlag, 1974, v.18, p. 1-67.

114. Gans P., Marchon J.G., Reed C.A., Regnard J.R. One-electron oxidation of chloro iron(IIl) tetra phenyl porphyrin. Evidence for porphyrin cation radical in the oxidized product.-Nouv.J.Chim., 1981, v.5, No.4, p. 203-204.

115. Davis D.G. Electrochemistry of porphyrins,- In: The porphyrins ./Ed .Dolphin D. New York: Academic Press, 1978, v.5, Physical Chemistry, Part C, p. 127-152.

116. Moller K.M., Ottolenghi P. The oxidation of o-dianisidine by HgOg and peroxidase at neutral pH.- Compt.rend.trav.lab. Carlsberg, 1966, v.35, N0.16, p. 369-389.

117. Claiborne A. J.Fridovich. Chemical and Enzymatic Intermediates in the Peroxidation of o-dianisidine by horseradish peroxidase . 1. Spectral properties of the products of dianisidine oxidation.- Biochem.,1979, v.18, No.11, p. 2324-2329.

118. Григорян С.К. Кинетика разложения перекиси водорода в присутствии амино-комплексов ионов металла в водном растворе.-Арм.Хим.Ж., 1981", т.34, J) 6, с.443-8.

119. Грирогян С.К. Реакции гидропероксидов с аминами и амино-спиртами в водных растворах в присутствии и в отсутствии ионов металлов,- Усп.Химии, 1983, т.52, № 69, с.936-52.

120. Mathur R.N., Reid T.J., Sicignato A. et al. Structureof beef liver catalase.- J.Mol. Biol., 1981, v.152, No 2, p.465-499»