Пероксидазная активность железо (III) порфиринов и гемнонапептида в системах обращенных мицелл тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ШШЖ ф^СТИТУТ ХЖМ8СК0Й ФИЗИКИ

На правах рукописи

САРКИСЯН АС1.МК РАЗМКОВНА

ПЕРОШЩАЭНАЯ АКТИВНОСТЬ ЖЕЛЕЗО (III } ИОРЭДРИНОВ И ГаЖИАПЕПТИДА в СИСТЕМАХ ОБРАЩЕННЫХ ЬМЦЕЛЛ

• специальность СЙо00о04 - физическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Ереван - 1993

Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной хи химического факультета Ереванского государственного универ тета и в лаборатории " Неравновесных белковых структур " И титута химической физики РАН.

Научные руководители:

Научный консультант? Официальные оппоненты;

Ведущая организация

доктор химических наук, профессор Бейлерян Н.М.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Пкрумян Г. П. доктор химических наук Давыдов Р.М доктор химических наук, профессор Григорян O.K.

кандидат химических наук, старпий научный сотрудник Куртикян Т„С. Институт органической химии АН РА

Защита состоится ¡уЫОиШ 1993г. в ^"^¿сов

на заседании Специализированного ученного совета К.005,02. по химическим наукам при Институте химической физики АН Ре публики Армения по адресу: 375044, г.Ереван, ул.Паруйра Се 5/2 , ИХФ АН Республики Армения,

Автореферат разослан

Я 1993г.

Ученый секретарь Сдециализированного

совета, кандидат хтсшческих наук, Jj't^y А.Г.Акопян стараий научный сотрудник '

^^/а.Г.

ОВШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЬ'

Актуальность проблемы. В последние годы бкокатализаторы поучают все более широкое внедрение в практику. Одпш из спосо-юв их изучения является моделирование. В качество'модели гем-юдериащих белкой и ферментов,широко исследуется феррилротопор-ирин IX (геыин). Изучение моделью!: системы позволяет глубяе юиять механизм действия биологических катализаторов. Повышений интерес многих исследователей к гемину и другим металлопор-транам обусловлен также способностью этих катализаторов проводить с высокими скоростями и селективностью практически важные жислительно-зосстановительнк" процессы.

В этом отноаении особый интерес вызывают металлопортарины, яслючешше в мицеллы ( особенно обращенные - СИ) .полученные в : [рисутствии поверхностно-активных веществ (,'ИАВ). Интерес к этим ¡истемам, в частности, объясняется тем, что согласно результатам физико-химических исследований микроокружение веществ в ло-[ярном ядре мицелл по ряду физических-параметров ( полярность, (Иэлектркчоская проницаемость вязкость структура водного окру-сения, распределение поверхностных зарядов ) сходно с таковыми в ибласти локализации простатической группы виутр: молекулы фер-1ента. Это указывает на то , что ОМ могут быть относительно ¡ростой и удобной физической моделью ферлентбв.Важюй особен-¡остыэ систем ОМ является т"о, згео физические свойства мккроок-Зудения веществ, расположенных' внутри полярного ядра., глокно лег-ю менять,варьируя либо коЛиче'ство вкутркмицелляркой воды, либо Юбавляя к ней различные вещества.

Системы'ОМ й^Й1кроэ'мульсш1 представляют интерес'не только уш фундшг^ектальньк исследований, но и дая прикладных целей. Ис-7ояьзо3ш?';»е"экос систем существенно расширяет возможности ярак-сическй£Ц;;йрйленёния' высокоактивных , 'селективных , природных таталк^аторов в^биотехнологии , тонком■органическом синтезе и_ 1ругих4э!йлартях'практической деятельности человека. Кроме ,того', ложно полагать-,что 'структурно, организованные системы получат распространение, при разработке различных, практически вадаых ЗиомимёТйческих'1 процессов. ' ;

Целью ":рабо'тк являлосв Исследование-, влияй}«!. мвделлярнрго, микро-

окружения на пероксидазную активность железо-порфиринового ком™ плекса, гемнонапептида и некоторых их комплексов с низкомолеку-лярнши лигавдами. " .

Практическое значение работа. Полученные кинетические резул! татьт могут быть использованы для управления некоторыми процессами, протекающими в ОМ системах (ферментативные реакции, поли-меризационнне процессы и т.д.)с

Научная новизна. Показано, что в зависимости от природы микроокружения (микросреды) и типа эмульгатора, происходят структу] ше изменения во включенных в них веществах. Именно эти структурные изменения предопределяют реакционную способность суб -стрг^ов и каталитическую активность взятых нами систем, т.е. путь и скорость реакции.

Публикации.По теме диссертации опубликованы 3 работы. Содержание и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания эксперимента, изложения результатов и юс обсуждения, вь.«юдов и списка цитируемой литературы 96 названий. Работа представлена на 116 страницах машинописного текста и-включает 43 таблицы и.36 рисунков. ' Методическая часть. Нами использованы: гемин (Г) фирмы " Хос^- ¿¿д^ •• (Англия), тетрасульфофенил порфирин (ТС<Ш) лю- .•' безно предоставленный А.М.Хенкиным (отделение ИХФ АН СССР, Черноголовка) и гемнодапептид (ГНП)^полученный триптолизом цитохро-ма С из сердца лошади, любезно предоставленный Кулишом М.А. (МИШ1). ПАВ: додецилсульфат натрия (ДЦС) и бромистый цетилтри-метиламмоний (ЦГАБ) фирмы " Ssгvan (Германия), аэрозоль ОТ (АОТ) фирмы "МетД" (Германия). 3 работе были использованы также о-ди-анизидин марки "х ", очищенный возгонкой в вакууме, МАОК (Неот1\ 76%-ныЯ раствор пероксида водорода (ПВ) (ос.ч.), имидазол фирмы " ьег-^а." (Германия), Органические растворители: хлороформ, октан, гептан, гексанол, используемые для приготовления ОМ, применяли после очистки двойной перегонкой. Степень очистки проверяли по величине некоторых физико-химических величин. Буфер-нке растворы готовили на бидистиллированной воде с использованием дважды перекристаллизованных солей ( МаНгР0« • НгО > КаНрО^ ■•Г2Н10). Пероксидааная активность Г, ГНП и ТСШ опреде-

лялась по начальной скорости окисления о-дианизидина или NAffi на. спектрофотометре Speooid UV Vi-S (Германия)» Кинетика быстрых реакций измерялась методом остановленного потока на установке фирмы" <Оиггшп" (США). Скорость реакции-определяли измеряя изменение оптической плотности во. врем«..шэс использованием коэффициента экстинкции продукта реакции 8 4gQ=3xI04M~*CM~* для о-дианизидина (по накоплению продукта окисления о-дианизидина) и 6g4Q=6200M'"-'-cM~* для NADH (по убыли f/ADH). Электронные спектры поглощения и реакции комплексообразования Г и ГНП с низкомолекулярными лигандами в мицеллярных системах регистрировали на спектрофотометрах Specote/ UV VIS и М-40 (Германия). Спектры кругового дихроизма ГШ регистрировали на дихрографе фирмы "МагД IIIS " CJoßiii Jvoiv Франция). Спектры кругового дихроизма регистрировали в единицах оптической плотности,-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУйДЕНИЕ

. Кинетика окисления органических субстратов , пероксидом водорода (ПВ) в водных раствора:' железо (!!!) порфиринов

Нами изучена пероксидазная активность железо (111) порфири» нов на примере окисления о-дианизидина и NАПН. Конечным продуктом окисления, о-дианизидина ГШ является бис (3,3- диметокси-- 4 амино) азобифенил, который образуется при конденсации двух молекул -1,4-диаыино - 3,3-диметокси бифенилена (ex» I): HjC04 0СН3' HjCOv OCHs

U)

н,со.

j<-<\ .осн

гм-( \-( \ = ын

- 4 ■

.осн.

н,со.

-<о>

,««3

-NHi

Спектр поглощения конечного продукта характеризуется максимумом при -А =4и0нм с • £460=3xI04frICM"1. За реакцией окисления о-днанизидина следили по накоплению продукта при -Л =4о,нм.

Конечным продуктом пероксидазной реакции с участием NIADH является WAD (ex. 2 ). Кинетику окисления NADH регистрировали по убыли концентрации субстрата.на длине волны .А = =340нм ( б3^q=62C0Kcm ). Нами было установлено, что в водных растворах ПВ наблюдается необратимое уменьшение интенсивноcm спектра поглощения используемых в работе железо (Ш) порфиринов, обусловленное;согласно . литературным данным, окислительной деструкцией порфиринового макроцикла. Поэтому,при анализе кинетических данных использовали начальную скорость реакции ( VG ).

WV

I II ?

-снг .0;

н

он он

НО-Р-О

но-р =о

не

•С-с-цНг. I II

нсч+/"

N

он он

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД)

н ,и н

с \

Не' Чс-с-ннг не'' Чс-с-мн,

II 11 И +н-0-0-Н «г II I 5 Ьн20 «сч>/« V Г2)

I I

я к

маон ШШ

В изученном диапазоне концентраций ПВ (до 100 мМ) у4 окисления о-диаяизид1'ла и МА0Н?катализируемых Г-ом, пропорциональна концентрации ПВ. При концентрации о-диани?чдина и МАШ выше Ю-5 М скорость реакции практически не зависит от количества их содержания в реакционной смеси» При концентрациях Г низке 5 мкы % реакции пропорциональна его концентрации,, Таким образом, при достаточно низких-концентрациях Г и Г^ кинетика перск-епдазной реакции Г в воде приблизительно описывается следующим выражением: '

стътъ (з)

Из данных, представленных в таблице 1>следует, что с ростом рН величина в фосфатном буфере увеличивается. При -рН ^7,0 слабо'зависит от природы субстрата и строения порФиркнового мякроцикла катализатора. Различия пероксидазных реакций, катализируемы Г и ТС®^ увеличивается :;ри понижении рН. Указанное закономерности объясняются, с одной стороны, стаби-лизирупккм влиянием р.Н на промежуточно образующийся тройной комплекс Г-.З- £, с .другой - состоянием Г в реакционной зоне преобладание рзакционноспособной цономерной формы или малоактивного д;::.-.арг). Зог.'зпа-о-дпанизвдина МАШ-ом приводит к значительно;.?/ увеличению скорости реагасш СтабдД).

Таким образом,получешше даняне показывая-'„'что кинетика процесса зависит от строения катлтизатора и субстрата,а такие от степени устойчивости тройного промежуточного комплекса Г—ПВ—&

Таблица I

Значения в 5хЮ~^М фосфатном буфере в зависимости от

рН,. при Т=295°К и [ПВ 30=4,5хЮ-4М

Катализатор [КаП>= =10™°М Субстрат С 5 VI ,5x10-% рн

8,0 69,72

Г МАОН 7,2 41,81

5,7 . 7,00 .

. 3,0 , . 2,80

8,0 7,72

Г о-дианизидин 7,2 ' 6,93

5,7 ; ' 2,91 -

.3,0- 0,23 —

8,0 11,00

теш о-дианизидин 7,2 - 10,70

5,7.' 4,00 ..

. 3,0 . : . 0,01

Мицеллярные системы ЦГАБ

Установлено, что при СПАВ3 о=(2,5«.ЭД)х10"%"1 и СКа"Л = как в водных растворах, так и в ОМ системах. V, пероксидазной реакции может быть приблизительно описана у! -нением (3)" . При С5]ф=Ю мкМ до I мМ'.)/' Дл*

оценк.1. константы скорости в мицеллярной фазе ( использовг ли общепринятое вьфажение (4).

Расхождения между значениями констант скоростей «"превыше« .' ют 8-105?. '

где - мольный объем 01,1, ¡.10 - полная концентрация мицелл»

В этой серш работ нами изучена зависимость ч<м от содержания внутримицеллярной воды, т.е. от отношения [¿¿ОУСПАЗЗ = =П, а в реакциях с МАОН „ каталпзкруешх Г-ом - от СЦТАБ]0„ '

Установлено, что при рг!-7,2 I ) с увеличением п. от 4,4 до 25 ( при [ЦТАЫ =5x10""" М )

• . - к - 'о " "" ' "эфф

¡уменьшается от 0,45 до 0,25, а увеличивается от 0,18 до

D,56 Vf1сек"1. -

2 ) при увеличении СЦТАБ]0 от 2,5x10"^ до 20ХЮ"2 м(п=15) ^^ уменьшается от 63,3 до 11,1 , а увеличивается от 4,2 до"

3 ,0 ¿Г^сек"^.

, Подобно реакциям с участием Г» окисление о-дианизи-

¿лс

дина в присутствии ТССП в 01.1 ЦТАБ слабо зависит от содержания воды к с ростом концентрации ПАВ ( в этих экспериментах л=10 поддерживалось постоянным ) скорость этой реакции уменьшается,, Следует отметить, что величина ^^ реакции с участием ТСФа сильнее зависит от концентрации IJAB, чем $3фф реакции с участием То ■

Более слабое шгибпрующез действие, до сравнению с Г, оказывают мицеллы катионного ПАВ на каталитическую активность ТСФП^ пргеем мицеллярнш эффект ослабляется с ростом а „

Влияние Ш на кинетику пероксвдазяой реакции заметно зависит от строения желе зол .¡р&ирнкоЕого комплекса» Константа ско = рости пероксндаэной реакции с участием Г в ОМ ЦТАБ,яри р1=7г2^ близко .соответствующей константе в водной фазе.

В случае 10ФП,дри рН=7,2, константа скорости реакции окисления о-диннкзидика,пр;1 переходе от водного раствора к шцел-яярной системе ЦТАБдвеличивается до. 50' раз»

И в этом случав наблюдаемые, кинетические закономерности изучаемых лероксидазных реакции могут быть объяснены в рамках представлений об образовании тройного комплекса ПВ - Kai-S» что доказана на схеме: " ; ' '."

. При условии KgCSl» К_£~и при t~*0 из ( 5 ) получается ( 3). В рамках этого поручаем,, что V0 окисления субстрата не зависит от его концентрации к прямо пропорциональна концентрация!.! Г и ИВ, Согласно уравнению{3J,VQ процесса не зависит от его природу.

Согласно.данным спектральных измерений в слабогидратиро-ванных мицеллах ( рис.1 (а и б)) молекулы Г имеют измененную структуру с железом i III) t координированным двумя молекулами вода. Такая форма Г в водных растворах реализуется при гН<5,6 и обладает пониженной пероксидазноп активностью. В мицеллах с высокш содержанием воды, константа скорости дероксидазной реакции составляет О054 М" сек-"'" „ что значительно меньше , чем в водной фазе несмотра на то„ что в этих условиях спектр поглощения солюбилизованного Г практически совпадает с сост. ветствующим спектром в водном растворе-. Можно полагать , что, значительный вклад, в ингибирующее действие мицелл на рассматриваемую реакцию оказывает пониженная доступность Г, локализованного в монослое ПАВ8дая молекул ПВ. С этим выводом согласуются результаты кинетических исследований по влиянию ОМ ЦТАБ на каталитическую активность более гидрофобного ТСФП. Константа скорости окисления о-дианизидша ПВ, катализируемого ТСФП в мицеллярннх системах ЦТАБ, с низкой степенью а равна 1,5 М^х Х.сек-^ и'возрастает до 9,0 ГГ^сек-* при п.=20,приближаясь к . значению соответствующей константе в водной фазе, равной 10,7 l^ceK"1, . ,

В таблице 2 приведены значения констант скоростей в зависимости от jil в водных и мицеллярннх системах ЦТАБ. .

В водных растворах константа скорости реакции НАШ с ПВ, катализируемой Г, увеличивается от 2,8 до 70 ЬГ*сек~^,при изме нении jH от 3,0 до 8,0. В мицеллярном растворе ЦТАБ соответств щая константа уменьшается лишь в малой степени (табл.2) ,что мотет быть интерпретирована стабилизирующим влиянием мицелляр-

(а) 16)

Рис. I (а и б) Зависимость спектров поглощения Г от «г в ОМ ЦТАБ в области Соре (а) и в видимой области (б) I -а= 282 2 = 20с,

ного шкроокрунения на тройной комплекс Г - ПВ - $ , не только при нейтральных ( как это имеет место в водном растворе^ но и при значениях |й< 7„0о

В минеллярчых системах с ростом рН среда активность ТСФЛ резко уменьшается,, в то время с как в воде такая зависимость

Таблица 2

3 реакционной ■ RH

смеси 3,0 7,2 8,0 .мицеллы

)

Г, МАЬН 2,8 41,2 70

Г, о-д-н 0,23 .7,0 7,7 -

ГСШ,о-д-н , 0,01 10,7/ ' II . , - ■

Г., МЬК 33,5 31,2 26,0 СЦГАБ]0=5х10^М

ГСШ «о-д-н 2060 492 185. 'ClffABJ^SxICTM

каталитической активности этого комплекса имеет обратный характер» Т.о,, в определенных условиях, мицеллы могут оказывать сель ное активирующее влияние на каталитические свойства ТСФ11, что объясняется влиянием мкцеллярюго микроокрукеюш на структуру катализатора. ТОФП, который реализуется в ОМ лри низких значеш 1Й и обладает высокой, пероксидазной активностью, в спектрах характеризуется максимумами 394, 526, 567, 606 и 680 нм.

Кинетические особенности пероксидазнюс реакций» катализируемух железо (Ш) порфиринами,в мицеллах анионных ПАВ

Известно, что такие анионные ПАВ,.как аэрозоль ОТ, (АОТ) и додецилсульфат натрия (ДЦС) образуют ОМ в неполярных растворителях. К сожалению, используемые нами железопор$иринорые'комплексы мало растворимы в мицеллярных системах ДОТ, поэтому все кинетические исследования нами были выполнены. в ОМ,образуемых системой гептан-гексанол-ДДС. Здесь1 также кинетика пероксидазной реакции описывается уравнением (3). скорости окисле-

шш МАШ в мицеллах анионного ПАВ, г.атализпрусгдого Г, примерно на порядок вше, чем в 1.а:целлах катионного ЦТАБ и п воде. Золичн-на |эгТ)ф логически не зависит от а и от С в диапазоне от 2,5x10"" до 2х10_1М. Эти закономерности сохраняются дяя пе-роксидазного окисления о-диашгзвдина, катализируемого Г, т.с величина реакции практически не зависит от содержания вода и лишь слегка умньшается с ростом [ПАВЗ . Но отношение ^ скорости окисления в гящеллярпой системе к соответствующей константе в водной фазе составляет приблизительно 4,5-5, в то врогш: как для о-дпаиизвдина это соотношение не превышает 1,6 раза. Таким образом, можно утверждать, что' влияние мицелл па кинетику пероксвдазной реакции зависит от пргроды 5 , т.с проявляется своеобразная' субстратная сяецидлгчность , характерная: для ферментативных реакций. Субстратную специфичность мкцеллярккх систем моздо объяснить, как изменением локализации комплекса Т - £ внутри мицеллярного агрегата, так и различным нлиянис-м мицеллярного микроокружеккя'на кинетические параметры распада комл-лекса Г - Н^' если место раслолокения комплекса к« п:з.-,-няется.

С ростом С11АВ]0 от. 2,5x1с"2 до 20x10-2 М ^ . возрастает .примерно'В 5 'раз ( дая о-диадкзвдина и КАОН , катализируемые г), что объясняется гетерогенностью'самых мицелл.

Мицеллы анионного ПАВ оказывают значительно более сильное влияние на пероксидазную реакцию о-дканизидана катализируемого ТСФЛ , по сравнению с Г . В шцеллах с низким содерканиетл вода (л= 8) 8 окисления о-дканизидика составляет приблизительно 4Х10"4 1.1 ^сек"^ , в то время , как в'воде $эфф= 1С>7 1/г1х хсек . Изменение гг от 8 до 30 сопровоздается почти сороко-кратным увеличением Несмотря на наличие четырех от;-

тельно заряненных сульфатных групп в молекуле ТСШ недъ:.. -включить возможность локализации молекулы катализатора в зоне , близкой к поверхности мицеллы из-за наличия достаточно гидрофобного лорфиринового макроцикла . Очевидно , что с ростом содержания внутримицеллярной воды , часть катализатора будет перераспределяться в более полярное водное ядро. О влиянии мицелляр-ного микроокруяения на электронную структуру ТСФП свидетельству-

ют данные оптических измерении ( рис.2 (а и б)) , причем величина элкЬекта зависит от а .

D

1П

0,2

27 25 23 (а)

к К

22 20

18 И

16

кК

■ Рис. 2, Спектры поглощения ТСОП в кицеллярных системах ДЦС в зависимости от а в области Соре (а) и в видимой области (б) ( ШС30 = 5x10~2 !.!,СГСФП] = =5x10"° Ы, ?Н=7.2 , Т=2Э5°К, I- П«7,6; 2-п.=30

На основе изложенного можно заключить, что низкая каталитических активность ТСФП в мицеллах анионного ПАВ обусловлена его отношением к одинаково,заряженным молекулам ДЦС.

Другая возможная 'причина уменьшения скорости пероксидазкол реакция з мицеллах ДДС. связана с неоднородным распределением pea гентов в мицеллах. В лринщше возможна такая ситуация, когда гздрофобныИ субстрат локализуется з поверхностном слое ПАВ , в то время как молекулы отрицательно заряженного катализатора концентрируются в водном ядре. Такое' перераспределение реагентов внутри мицелл таксе может привести к заметному замедлению ле-роксвдазной реакции.' Наконец, трудно исключить действие дшэдл-лярного мкроокдуженмя на &нест тройного комплекса ТСФБ-ДВ-З .

. - 13 -

Влияние рН на кинетику пероксидазной реакции

в ОМ ДДС

. В мицеллярных системах анионного ПАВ рН зависимость каталитической активности железопорфиринов существенно зависит от их строения.(Таблица 3) '

Таблица 3

Реакционная смесь рН ¡£ (М^сек"1)

2,6 7,2 9,0

Г, ЩСН 186 204,7 400

2,5 2,8 5,4 '(ь м

Г, о-д-н 10 II 22 АэФф

1,4 1,5 3,0 10 х 1и

ТС®, о-д-н . 73 2,3 2,7 Ю3х &эфф |

33 1,1 1,2 Ю3х Аи

Константы скорости окисления NАОН и о-д-н, катализируемого Г, практически не зависят от рН в диапазоне 2,6 до 7,2 и возрастают в 2 раза при повышении рН до.9,0. Напротив, при изменении рН от 2,4 до 7,2 каталитическая активность ТСШ в ми~ целлярной системе уменьшается почти з 300 раз и практически нз изменяется при дальнейшем повышении рН. Высокую активность ТС® в системах ОМ можно объяснить ослаблением взаимодействия ПАВ с катализатором.при низких значениях рН.

■ Пероксидазная активность гемнонапептида (ГНП) в ОМ

Влияние систем ОМ на спектральные свойства ГНП .....

Низкую пероксицазную активность железо (Ш) порфирина в ОМ можно было бы объяснить, во-первых, отсутствием гистидина в координированной сфере железа и, во-вторых, специфическим вли-

- - К -

яннем белкового окружения на ого активность (пероксидаза более актигнъл, яелезо (11:) порЛфин у которого пятым к шестым аксиальными лигакдами является молекулы гистидина и воды). Для того, "тобы спснить степень влияния этих факторов, нами выполнены аналогичные исследован::« на микропероксидазе IX (ГШ),

Б настоящей работе было изучено влияние обращенных мицелл на спектрп поглощения и кругового дихроизма (1\Ц) микроперокси-дагы IX.

¡¡а рисунках За и Зб приведены спектры поглощения ГШ в вс чых растворах при различных значениях рН.

Рис. 3 (s и б). Спектры поглощения солрбилизсванного •

ГШ в фосфатном буфере при различных зна- ■ : чен/.ях рН,в области Соре. (а), и в. видимой области ( Сф.б. 1 =5x1 Й,!, [ГШ ] =Зх1(Г5М, , Т=2Э5°К, А-рН=9,0, Б-рК=7,2, В~рН=2,4)

При кислотно-основном титровании ГШ, в его спектрах отсутствуют изобисгические точки, .Это означает, что в изученном диапазоне pli существует, по крайней мере, три конфермора (А,Би В) с соответствующими харсктерннми спектральными поглощениями. . В спектре А ионы железо (ill) находятся в низкоспиновом состоянии

в спектре В - в высокослшовом состоянии { на это указывает наличие максимума при 617нм), а с спектре Б - нпряду с низкоспиновым находятся и ионы железо (И) в енсокоспиновом состояний (максимум при 625 нм). Результаты, полученное показали.

что мицеллярное микроокружение может оказывать влияние на кон-формационное состояние ГШ. и на константы его димеризацин, причем величина эффекта зависит от природы ПАВ, от концентрации ГНП и степени гидратации мицелл.

Рис.4. Спектры КД ГНП в мицеллярной системе ЦГАВ в зависи-- мости от концентрации катализатора в области Соре ( [ЦГЛБЗ=0,1М, а =20, рН=7,2, Т=295СК, I -[ГШ1 = =2, 5х105М , - 2 - [ ГШ ] =2, 5x10%) .

Рис.5. Спектр ВД ГШ.в мицеллярной системе ДЦС в области полосы Соре ( [ДЦС]=5х102М, п. =15, ^№0=2,5x10%,

рН=7,2, Т=295°К)

Этот вывод подтверждается данными спектрофотометрических измерен:::". Б таблице 4 приведены характерные длины волн в спектрах поглощения ГШ в разных млцеллярных системах.

Таблица 4

1.!пксимумы спектров поглощения ГНП в мицеллярных системах АОТ, ДДС и ЦГАБ

Ыицеллярные системы а 1,5 . шл (±1нм)

ЦТ А Б 4С6 - . 529 570(пл) 631

1С 7 403 485(пл) 526 570(пл) 631

да 339 495 532(пл) 575(пл) ■ 625

20 ЗЭ9 ' 495 532(пл) 575(пл) 625

лот 1,5 ■ 406 - 525 ЗоС(пл) . 621

20 399 468(пл) 518 556(пл) . 625

То обстоятельство , что мицеллы двух анионных ПАВ ДЦС и АОТ по разному влияют на спектральные характеристики солюбили-зовакного ГНП, позволяет сделать вывод о том, что как и в случае с Г; увеличение высокоспинового конфорыера ГНП в мицелляр-кых системах ДДС, по видимому,, является следствием специфического взаимодействия молекулы ПАВ с ГШ.

Влияние обращенных мицелл на пероксидаз-нуто активность ГКП

Как в водных растворах, так и в изученных мицеляяркых системах зависимость Уо пероксидазной реакции от концентрации реагентов описывается уравнением (3). В таблице 5 приведены кон« анты скорости окисления о-дионизидина и /.'АОН^ката-лизируемой ГНП/в фосфатном буфере при различных-значениях рН

Таблиц'

■5 рН ГмЗД

5,2 5,8 7,2 8,5 '8,8

о-д-н 14,8 - 146 ^23 -

и лон - 446 1660 - 5950 ^ Эф<р

В таблице 6 приведены константы скоростей реакции окисления о-дканизидина и МАОН в разных шщеллярных системах при различных значениях ( а= 15 ) , СПАВ30= 5x10"^ Ы,.Т=2 95°К.

Таблица 6

я ПАЗ ь __ - _Р'1__________ в буфере пру; *сек ) |

2,7 4,8 7,2 8,0 8,6 рН=7,2

ЦТ А Б 2600 - 4020 7810 9120 1060 к^-Г '

МАОН 35,1 - 54,3 105,4 123,2 - /; •Ц -:

да 2390 3290 4190, 7170 1800

32,3 44,4 56,6 26,8 107 -

лот 8670 7770 9560 8Э70 - 1860

78 70 80 . 81 - -• К

ЦТАБ 18,7 2230 3300 4000 145 офф

- 0,5 60,2 89,2 108 -

да - , .53,3 1бП 169 1691 146 к,-

э-д-н - 0,7 2,2 2,3 2,3 -

АОТ - 314 353 377 300 146 к ** эфф

4,24 4,8 5,1 4,0 - |

Разное влияние мицеллярного шжроо^.ружения на кинетику окисления МАШ и о-диализодияа указывает на то, что мицеллярноо ккк-роокруяенпе монет оказывать заметное влияние на селективность

действия каталитической спсти.м. В ОМ ЦТАБ, как и в водном растворе ( см. табл. 5 и 6 },с ростом рН среда скорость реакции увеличивается. Кроме того, в мицелляршх системах заметно ослабляется р! завнсг-лость скорости окисления МАНН)по сравнению с аналогичной зависимостью в водной ¿азе, в то время как для окисления о-дпанпзпдша переход от водной к мвдаллярной фазе не влияет на крутизну этой зависимости.

Как и в водной флзе,в кицелдярнкх растворах обоих анионных ПАВ кокстпнта скорости реакц;'.и возрастает с ростом рК. В систе- ' мах содержащих ЛЬТ,в изученном диапазоне рН, константа скорлсти практически не зависит от [Н+] в водной фазе. рН зависимость скорости пероксидазных реакций в рассмотренных, мице.ллярных системах выражен значительно слабее, чем в водной фазе. Это объ- -яснгется:

а) буферным действием мицеллярпой поверхности на значение рН в зоне локалкзации реагентов,

б) изменением р'1 зависимости константы скорости стадии лимитирующей скорость процесса ( взаимодействие ПВ с комплексом

гнп- 3).

Констан1с» скорости окисления МАОН в мицеллярной системе ЦТАБ практически не зависит от а ,-в то время , .как при уменьшении пот 15 до 5 э-йекгавносгь оккмеяия о-д'. гнизидпна в этой системе уменьшается в 2-2,5 раза. В мицеялярных системах анионных ПАВ КС и АОТ существенно возрастает селек-тииность действия ШП по отношению к 5 по сравнению с вод-, яш раствором и мкцелляриымп растворами катконного ДАВ. Соответствующие константы скоростей для окисления ИАПН и о-диа-низцдина ( $Егщ(НА0Н)) ^эфй(о-д-н)} Б водной¿озе клицел-лярнш- системах ЦТАБ, Д5С и АОТ с низко;": степенью. содортлния воды (а =7) составляет приблизительно 13; 1,3; 38 и.43 соответственно. В системах содержащих ДЦС, в качестве глицеллооб-. разователя^ изменение п от 7 до 30 приводит к уведичешзз . окисленуч о-дканизвдина от 0,6 до 2,9 ¡.Г^сек"1. В этих ус-' ловиях окисления МаСй возрастает от 29,4 до 213,8 1,Гхсек_х. Соответствующие изменения в мкцеялярных системах АОТ состав-' ляат 1,3 до 10,8 ЬГ^сек^для -одиаяизидина н 54,5. до 140 ¿.Г^х :хсек""* дая МАЙН. , , 1 .

- В мицеллярных системах ЦГДБ, ДЦС и ЛОТ константа скорости реакции в мицеллярной фазе заметно увеличивается с ростом ее эбьема, что объясняется гетерогенностью мицелл.

Влияние аксинальных лигандов

Пероксйдазная активность некоторое комплексов Г и ГНП в системах ОМ

■ Для того, чтобы оценить эффект комплексообразования на активность Г и ГНП- исследовалась пероксйдазная активность комп-гексов Г и ГНП с имидазолом. Присоединение яигандоз к Г по ак-•.иальным положениям приводит к двух-трех кратному увеличению ¡го пероксидазной активности, причем величина эффекта слабо за-(исит от среды проведения реакции. На основании этих данных южно заключить, что наблюдаемое в мицеллярнкх системах силь-юе уменьшение пероксидазной.активности Г, по-видимому, нельзя |бъяснить только изменением структуры той координационной сфе-ы, в которой находится металл в молекуле катализатора. Повы-1енная каталитическая активность изученных комплексов Г может 'ьть обусловлена как увеличением относительного содержания бо-ее активной мономерной формы Г, так и небольшим влиянием троения аксиального лигацца на пероксидазнув активность ката-изатора.

В отличие от Г комплексообразование ГНП приводит к умень-ению его пероксидазной активности приблизительно от 2 до 7 раз водной, и мицеллярных системах, причем величина эффекта слабо ависит от среды проведения реакции. Ингибиругащее действие мидазола можно объяснить тем, что молекула лигавда вытесняет олекулу субстрата из координационной сферы металла в комплек-з Ка-Ь -$. Подобный эффект может влиять на активность ГНП в ицеллярной фазе молекулы ПАЗ, в частности ДЦС.

Все изложенное указывает на то, что слабые межмолекуляр-те взаимодействия между молекулами реагентов и окружающей редой играют предопределяющую роль в кинетике и механизме однофазных реакций вообще и реакций с участием биологически

активных веществ' - в частности.

ВЫВОДЫ

I. Показано, что включение аелезо (III I лорфирина и ГНП в ОМ анионных к катионных ЛАВ сопровождается структурными изменениями, которые отражаются в их спектрах поглощения и кругового дихроизма t Величины этих изменений зависят'от природы ПАВ,'числа модеку; воды, приходящей на одну молекулу ПАВ ia),pü среды и природой зоны локализации.

20 Показано, что в системах ОМ катионных и анионных ПАВ железо (III) лорфиршы катализируют окисление органических веществ ( о^-даанизидин, {}АЩ) пероксидом водорода. -

3. Установлено, что пероксвдная активность келезо (Ш)дорфи-риновых комплексов к ГНП в системах 01.1 ниже, чем в водных растворах. Величина эффекта зависит от строения катализатора,' оргаличес кого субстрата, ПАВ, содержания воды внутри мицеллярной фазы (т.е. от " а")ы pH среды.

4. Обнаружено, что мицеллярное микроокружение оказывает сильное влияние на .различие селективности действия оолюбилизованных железо (III) дорфирияов и ШП.

5. Установлено, что в системах ОМ лероксвдазная активность солюбилизованных железо (III)порфиринов и'ГНП зависит от объема мицеллярной фазы. Гетерогенность мицеллярной системы играет важ-jt-™ толь в юшетсасв изученных реакций»

6. Показачо, что низкомолекулярнне лиганды приводят к небольшое увеличении пероксвдазной активности железо (1П)порфирйНов. Присоединение же лмвдазола в шестом координационном положении др водит к двух-трех кратному уменьшении его пероксвдазной активности.

ОСНОШОЕ СОДЕРаАНЯЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛСЕШО

, в следующих публикациях

I; Саркисян А.Р., Пирумян Г.П., Давыдов P.M.' и Бейлерян H.LI. Спектральные свойства гомнонапепткда в системах обрацешшх мицелл. Межвузовский сборнст научных трудов, Еревал-1991, .Химия и хим. технология, Л6, с.187-197.

2.. Саркисян А.Р., Пирумян Г. П., Давыдов P.M. и Бейлерян Н.М. Пероксидазная активность гешонапептида з системах обращенных мицелл. Меявузоьзккй сборпж научных трудов, Ереван-1991, Химия и хим. технология, JJ6, с.198-204.

3. Саркисян А.Р., Пирумян Г.П., Даввдов P.M. и Бейлерян Н.М. Пероксидазная активность железо (III) тетрасульфофенил по пурина в системах обращенных мицелл. Межвузовский сборлик научных трудов, Ереван-1991, Химия и хим. технология,, Ji£f с ¡>205-214,'

Сдано в производство 22.04.1993г. Бум. 60x84- печ. 1,5 листа Заказ Хб Тираж 100

Цех'"Ротапринт" йреванского госунивереитета. Ереван* ул. Маиукяна й I..