Изучение механизмов взаимодействия порфиринов и металлопорфиринов с моноклональными антителами флуоресцентными и кинетическим методами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

и

5 ДЕК

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи УДК 577.127.3

НЕЛЕНЬ Марина Игоревна

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОРФИРИНОВ И МЕТАЛЛОПОРФИРИНОВ С МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ И КИНЕТИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ

(Специальность 02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: д.х.н. Савицкий А.П. профессор, д.х.н. Яцимирский А.К.

МОСКВА - 1994

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. ~ ; Ломоносова

Научный руководители: д.х.н. Савицкий А.П.

профессор, д.х.н. Яцимирский А.К.

Официальные оппоненты: профессор, д.х.н. Дзантиев Б.Б.

- *" д.х.н. Габибов А.Г."

Ведущая организация:

Российский Кардиологический Центр, Институт экспериментальной кардиологии

Защита состоится 1994 г. в 16 час. на заседании

специализированного совета Д.053.05.76 в Московском Государствен« Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 000958, Москва, Ленинск! горы, Химический факультет МГУ, кафедра химической энзимологии, ау 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь )

специализированного совета, кк.н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

I. С 1986 г. активно развивается направление

¡зимов - катализаторов на основе моноклональЫх антител. Действительно 1ачной и результативной остается пока идея каталитических антител, как 1тител специфичных к аналогу переходного состояния катализируемой :акции, высказанная Полингом и Дженксом и шиооко используемая в катализе шостадийных химических превращений (гидролиз, циклические грегруппировки и т.п.). Большинство работ до настоящего времени носит ^лирический характер, констатируя успех или неудачу применения этого >дхода к той или иной реакции. В последний год в ряде публикаций осуждаются механизмы связывания гаптенов с антителами, взаимосвязь руктуры связывающего центра антител и их каталитической активности, эедприняты первые серьезные попытки использования моноклонапьных •тител в сложных химических реакциях для направления процесса по одному | нескольких вероятных путей. Работы, связанные с анти-порфириновыми 1тителами, по сравнению с другими направлениями химии абзимов, только минают развизаться. Очевидно, это объясняется сложностью изучаемых ¡акций, отсутствием каких-либо эффективных подходов к созданию талитических антител для реакции с несколькими переходными состояниями, зактически до сих пор не ясно, насколько гоирода иммунного ответа к |рфиринам обеспечивает структурное подобие функционального центра |тител ферментативному. В связи с этим, полуденные к Рс)(Н)-копропорфирину антитела представляются удачной моделью для детального изучения юцессов связывания порфиринов с белком и взаимосвязи структуры и /нкций.

тигенсвязываюлей области анти-порфириювых антител (константы зфинности, аминокислотное оксужение кофактсса в функциональном центре, о доступность для субстрата и т.п.). исследование свойств антител и >ханизмов их взаимодействия с порфиринами. /сследсзание каталитических зможностей антител позволит судить о том. з какой степени структурное добие определяет каталитическую активность аг-~ител.

Научная нс»изна и графическая значимость заботь. 1. Предложен метод 1уоресцентного изучения взаимодействия антител с пэрфиринами, а также руктуры антигенсвязыеающей области антите.- 2. Впервые показано, что ецифичные к РЗ(П)-копропорфиоину I антитела обладает рядом структурных рактеристик, подобных пероксидазным системам: положение кофактора в

=зляется изучение структурных характеристик

J

активном центре, доступность его для субстрата, присутствие в облас связывания функционально важных.аминокислот. 3. Обнаружена димеризаш антител, в которой участвуют Fab-фрагменты. Димеризация приводит появлению новой полосы в спектре флуоресценции связанного порфирина. Изучена кинетика окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутств! свободного коп ропорфирина и найдено, что механизм окислен! характеоизуется субстратной активацией и ингибированием продуктом. Исследована каталитическая активность моноклональных антител в реакщ окисления о-дианизидина перекисью водорода. В присутствии комплею копропорфирина с антителами при высоких концентрациях перекиси водоро, наблюдается увеличение ксаt в 2-3 раза. 6. В присутствии антител D5I обнаружено увеличение скорости включения ионов Zn(ll) в копропорфирин.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены Международных конференциях: 11th Meeting of European Federation Immunological Societies (Финляндия, 1991), 8-th Conference of Young Scientists , Organic and Bioorganic Chemistry (Латвия. 1991), "Biocatalysis: fundamentals a, applications" (Россия, 1993), "Time-Resolved Laser Spectroscopy in Biochemie IV" (США, 1994), International Symposium on Biomedical Optics, BIOS Europe' (Франция), EUROBIC II 'Metal Ions in Biological Systems" (Италия, 1994), 33

Eastern Analytical Symposiuom (CUJA, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных рабе

Структура "i nfíbPM писсеот.ацш. Диссертация состоит из введен! обзора литературы, экспериментальной части, результатов й их обсужден:, выводов и списка литературы (123 названия). Работа .изложена на 1 страницах машинописного текста, содержит 36 рисунков и 13 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Б работе использованы антитела D5E3 и D3F5 класса lgG1 специфичны. PddD-копропорфирину l-(PdCPI). Получение этих антител и их крат> биохимическая характеристика опубликованы в работах [1,2]. Для нац исследований были отобраны клоны, специфичные именно к PdCPI, взаимодействующие с фрагментами белка-носителя, а так характеризующиеся наиболее высокими константами аффинности 10-9-10-10 Приведенные в работах [1,2] данные по конкурентному анализу связывания э' клонов с различными производными копропорфирина показывают, ' константы связывания чувствительны к иону металла и расположен периферийных заместителей порфиринового кольца. Следует подчеркнуть,

природные гемовые белки имеют более высокую константу связывания тема элком (10-8-10-13 М), чем полученные антитела. Однако, по сравнению с -ими известными из литературы антипорфириновыми антителами данные пела характеризуются более высокой аффинностью к порфиринам ютанты связывания с антигеном выше в 10-10^ раз).

. ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИТЕЛ С

ПОРФИРИНАМИ

1.1 Взаимодействие Ре(Ш)-копропорфирина I с антителами

В первую очередь были предприняты попытки применить флуоресцентную ктроскопию для изучения системы с Ре(П1)-копропорфирином I (РеСР1), эрая использована в дальнейших кинетических исследованиях.

Большинство металлопорфиринов, в том числе Ре(Ш)-порфирины, не оресцируют, поэтому в качестве флуорофоров были выбраны птофановые остатки белка. Триптофан оказывается уникально ггвительным к тушению различными веществами, и это позволяет еделять доступность его остатков в белках методом тушения.

Тушение флуоресценции триптофана под действием РеСР1, словленное фёрстеровским типом переноса энергии возбуждения, было чено для клонов 05ЕЗ и РЗР5 в интервале рН 5-10. Наличие сильного [ения качественно указывает на присутствие триптофанового остатка вблизи игенсвязывающего центра антител. Количественный анализ полученных ных, однако, не позволяет оценить величины констант связывания. Это зано с тем, что доступные для железопорфирина остатки триптофана, как га обнаружено, находятся не только в области связывания.

1.2 Взаимодействие колропорфирина I с антителами

Существенно более информативной является система с безметальным ропорфирином I в качестве хромофора. При этом замена металлопорфирина безметальный аналог качественно не влияет на результаты исследований уктуры и свойств антител и может количественно сказаться только на ичинах определяемых констант связывания. Причем, первоначальная оценка стант для клона ОЗР5 [1,2] показала, что аффинность антител к ропорфирину I достаточна высока и лишь в 1.5 раза ниже, чем к Ре(Ш)-ропорфирину I.

Известно, что порфирины склонны к димеризации и агрегации в водных :творах, и порядок величины константы димеризации при рН 7 составляет ' М"'. В литературе отсутствуют данные о димеризации использованного «и копропорфирина I (СР1) в водных растворах. Принимая во внимание то, что

димеры порфиринов не флуоресцируют, на основе зависимости интенсивное^ флуоресценции от концентрации копропорфирина была определена констант; димеризации в условиях типичного эксперимента. Её величина при рН 71 (фосфатный буферный раствор, 0.15 М №С1) составила (4.45±0.06)хЮб М"1.

В целом, данные, полученные в результате флуориметрическогс исследования системы моноклональных антител с копропорфирином, логическь можно разделить на две группы:

• дающие информацию собственно об антитгенсвязывающем центре антите; (присутствие функционально значимых аминокислот, положение кофактора ( связывающей области, его доступность для субстрата и т.п.);

• характеризующие процессы связывания антител с лорфиринами (ловедени( в растворе, константы связывания).

Дальнейшее обсуждение основано на этом разделении.

Характеристика антигенсвязываюшего центра антитпп Титрование копропорфирина антителами, Р(аЬ>2- и РаЬ-фрагментам! сопровождается сильным падением интенсивности флуоресценции порфирин; (при пятикратном избытке антител остаточная флуоресценция составляет окол! 20% от исходной, рис 1а). Особо следует подчеркнуть, что столь сильно! тушение флуоресценции является ' следствием именно специфической связывания порфирина антителами, т.к. в случае неспецифических антител ( инсулину) падение интенсивности практически не наблюдается (рис 1Ь).

600 650 700

600

700

Рис I. Тушение флуоресценции копропорфирина антителами 05ЕЗ (а) и антителами к инсулину (Ь).

(a)- [СР[|=1х10-7 М

[ВДхЮ7 М: 0. 0.1. о.: 1.0. 3.0. 5.0 (сверху шип):

(b)- [СР1|=1х10-6 N [ВДхЮ6 М: 0. 2.1, 5.< 12.1

Вполне вероятно, что тушение происходит по следующим причинам: 1. из-за взаимодействия копропорфирина с каким-то аминокислотны остатком в связывающем центре антител;

й

из-за протонирования пропионовокислых остатков копропорфирина в идессе связывания с антителами.

Для проверки обеих версий был выполнен ряд экспериментов. Кинетика ухания флуоресценции копропорфирина была и&ледована при различных центрациях 05ЕЗ и различных значениях рН. Последующая обработка данных основе нелинейного метода наименьших квадратов выявила экспоненциальный характер затухания флуоресценции. Данные по спектрам ¡яризации флуоресценции позволяют отнести медленную компоненту (16 не) бодному порфирину и быструю компоненту (2.5 не) комплексу ропорфирин-антитело. Таким образом, тушение флуоресценции ропорфирина в процессе связывания с белком носит динамический актер, т.е. сопровождается изменением времени жизни молекулы в бужденном состоянии.

В случае свободного копропорфирина протонирование периферийных тионовокислых групп снижает квантовый выход флуоресценции, что .ясняет резкое падение интенсивности флуоресценции в области рН 5-6.5. ;ледование кинетики затухания флуоресценции свободного копропорфирина азало, что время жизни молекулы порфирина в возбужденном состоянии не <яется при рН 5-8 и равно примерно 16 не. Ввиду того, что процесс 'тонирования копропорфирина в водном растворе очень сложен, были юрены времена жизни копропорфирина в возбужденном состоянии в творе поверхностно-активного вещества Тритон Х-100 (0.6% об/об), где, как ю опубликовано ранее, происходит протонирование только одной боксильной группы. Оказалось, что и в этом случае время жизни в бужденном состоянии не меняется. Таким образом, протонирование пионовокислых остатков копропорфирина снижает квантовый выход гаресценции свободного основания, но не меняет формы спектра и времени 1ни молекулы в возбужденном состоянии.

Следовательно, сильное тушение флуоресценции копропорфирина при зывании антителами, сопровождающееся изменением времени жизни з бужденном состоянии, не может быть объяснено протонированием боковых пионовокислых остатков.

В поисках возможных тушителей из аминокислотного окружения зывающего центра антител нами было изучено влияние аминокислот, их изводных или функциональных групп на флуоресценцию свободного ропорфирина. Константы тушения Штерна-Фольмера (рис 2) определены из исимости интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя з тветствии с уравнением Штерна-Фольмера:

... Ь.= 1+к[<2] (1

где I - интенсивности флуоресценции порфирина; [О] - концентрац! соответствующего тушителя. Из рисунка 2 видно, что больший или меныш эффект на флуоресценцию порфирина оказывают только три аминокислот лизин, метионин и триптофан, причем последняя имеет исключительно высоку константу тушения. К, М"'

50 40

30' ЕЯ Рис. 2. Константы Штсриа-

2ог " ЕИ ''""лшера аля тушения

флуоресценции

копропорфирина I а-РИе Эег Агд Суз Ме1 Туг 1_уэ 1гп АсМа Суз„Тгр аминокислотами.

Для определения типа тушения была исследована кинетика затухан флуоресценции копропорфирина при нескольких концентрациях пизт метионина и триптофана. Можно утверждать, что время жизни порфирина возбужденном состоянии в присутствии этих трёх аминокислот не меняется пределах ошибки эксперимента.

Полученных данные указывают на то, что сильное тушен копропорфирина при связывании антителами наиболее вероятно обусловле контактом с остатками триптофана, расположенными вблизи связывающе центра. Динамический характер тушения, т.е. падение квантового выхо флуоресценции в результате случайных столкновений между флуорофором тушителем, объясняется в этом случае конформационной подвижност системы в области связывания. Не исключено присутствие лизина и метиои* в антигенсвязывающем кармане. Следует подчеркнуть, что для функциональнс центра пероксидазы триптофан является инвариантной аминокислотой, метионин часто встречается в гемсвязывающих центрах гемсодержащих белке

Для получения более полной информации о положении гаптена связывающем центре антител было изучено влияние внешних тушителей (иo^ иода и цезия) на флуоресценцию связанного копропорфирина I в диапазоне 7-10. Как следует из рис. 1, даже при большом избытке антител по отношени: порфирину форма рпектра флуоресценции практически не меняется, и пик г длине волны 612 нм сохраняется. Однако, поведение системы в присутсп

нешних тушителей отлично от поведения копропорфирина, что подтверждает уществование комплексов антител с копропорфирином с той же полосой спускания, что и для свободного порфирина (612 нм). При высокой онцентрации антител или Р(аЬ>2 фрагментов остаточная флуоресценция на 612 е тушится иодидом (рис.За). Тушение ионом цезия в присутствии Э5ЕЗ или (аЬ>2 в ТРИ раза меньше, чем для свободного копропорфирина (рис.ЗЬ). Зти анные позволяют утверждать, что копропорфирин глубоко погружен в вязывающий карман антитела и малодоступен для внешних тушителей значения констант тушения связанного порфирина значительно ниже в обоих лучаях. чем для свободного). Гораздо большее относительное ослабление лияния иодид-иона можно объяснить отрицательным зарядом около вязывающего кармана антител. В сильнощелочной области происходит силение влияния тушителей независимо от заряда, что, вероятно, объясняется онформационным переходом в области связывания и некоторым раскрытием вязывающего кармана.

К, М'1

б а ю 6 в ю

рН рН

пс. 3. рН-профлль констант Штерна-Фольмера для тушения флуоресценции при 612 м иодид-нонам (а) и цезнй-ионамн (Ь) для свободного кйпронорфнрнна (•», омплекса копропорфирин (¡хМ'^МИеС (1х10"^М) Со) и комплекса копропорфирпн ЫО^М^аЬЬ (1хЮ"бМ) (V)

Доступность копоопопфирина ппя п-пианизилина Данные, позволяющие оценить доступность порфиринового цикла з омплексе с антителами для о-дианизидина как возможного окисляемого убстрата. имеют большое значение для дальнейших кинетических сследований. Для субстратов типа иодид-иона и феррицианида бьшо найдем, то конформационная подвижность в области гемового кармана фермента казывает существенное влияние на проникновение субстратов.

Константы скорости реакции окисления иодид-иона пероксидазой хрена (Г тесно коррелирую* с доступностью порфирина для прямого контакта с иодидс Для того, чтобы определить характеристики взаимодействия связаннс антителами порфиринового кофактора с субстратом, мы изучили тушеь свободного и связанного с антителами порфирина о-дианизидином. В табл* 1 эти данные представлены в сравнении с цифрами, полученными ; протопорфирина IX и его комплекса с апопероксидазой хрена. Констан тушения Штерна-Фольмера свидетельствуют о том, что доступность ; субстрата, связанного антителами копропорфирина, близка к доступно« протопорфирина в ПХ, хотя при этом апо-ПХ усиливает тушение о-дианизиди а антитела ослабляют.

Таблица!. КопсгаигьГШтсрпа-Фольмсра для тушения флуоресценции свободных связанных с белком норфирииов. свободный_"

порфирип

протоиорфирип IX кон"ропорфирии I

7.1хЮ2 М"1 6.7х103 М"Г

связанный

2.4х103 М"> 1.9x103 М"1

* - комплекс с аио-нероксидазои хрена; ** - комплекс с антителами D5E3

Механизму тяимоляйствия антител с кептпорФиоином Форма спектра флуоресценции зависит от концентрации белка. Г высоких концентрациях антител, F(ab)2 и Fab фрагментов появляется но полоса при 628 нм (рис. 4,ab). Наиболее ярко это выражено для F фрагментов антител. Так как молекула иммуноглобулина и Р(аЬ)2-фрагм имеют два связывающих центра, в то время как Fab-фрэгмент имеет о, связывающий центр, то эта полоса может соответствовать комплексу антите копропорфирином состава 1:1. Как обсуждалось выше, в присутствии мены концентраций антител в форме спектра флуоресценции никаких .измeнe^ кроме сильного падения интенсивности, не наблюдается. Эксперименты тушению флуоресценции внешними ионами показали, что этот спектр отвечает остаточной флуоресценции свободного порфирина, а соответсте некоторой связанной с антителом форме. Следовательно, пик при 612 нм мо быть отнесён к 1:2 комплексу антител с копропорфирином (насыщение связывающим центрам антител и Р(аЬ)2-фрагментов). Это наиболее очевид объяснение не может описать полностью поведение системы, прежде всего, низких концентрациях компонентов.

При низкой концентрации копропорфирина (10"7 М) новая полоса при нм не появляется (рис.1) вплоть до той же концентрации антител, что и в слу

а

/

/

L

600 650 700 еоо 650 700 600 650 700

A.,rtm

Рис. 4. Тушение флуоресценции копропорфирина I антителами D5E3 (а) и Fab-фрагментами ib) и фпуоресненнии ко1п»югата копропорфирин-SlT (1х10"бМ антителами D5E3 (е):

(a)- |СР1|=1х10-0 M. |lgG]xl06 M: 0. 0.2. 0.5. 0.6. 0.8. 1.3:

(b)- [CPI|=2xi0"^ M. [FahlxlO6 M: 0. 0.5. 1.4. 2.8. 3.1. 4.5

высоких концентраций копропорфирина (10*® M) (рис 4). Это свидетельствует о том. что за новую полосу ответственней некоторый процесс, связанный с концентрацией антител. Неспецифическое связывание копропорфирина антителами можно исключить, т. к. в случае неспецифичных к копропорфирину антител (к инсулину) подобные изменения в спектре не наблюдаются (рис. 1).

Наиболее реальной представляется димеризация антител. В процесс непосредственно вовлечены Fab-фрагменты антител (рис. 4Ь). В то же время, в димеризации не затрагивается антиген (CPI) или антиген-связывающий центр, т.к. полоса 628 нм возникает и в случае белкового конъюгата копропорфирина (рис. 4с). Большие молекулы SIT предотвращают прямое взаимодействие в активном центре, но новая полоса по-прежнему существует.

Тот факт, что при концентрации копропорфирина 1x10"' M даже при относительно высоком избытке антител (или Fab-фрэгментов) новая полоса з спектре флуоресценции не возникает, позволяет в первом приближении принять во внимание образование только комплекса порфирин-белок 1:1. На основании этого определены константы связывания копропорфирина с антителами и Fab фрагментами методом нелинейной регрессии с использованием уравнений (2) и

/„"- - 16П _ I СР1]0

(2)

[CPI]

' 1+4СР1]у

где [1дС]о и [СР1]о - начальные концентрации лорфирина и активных центров белка Р5ЕЗ или их РаЬ-фрагментов), [СР1] - равновесная концентрация лорфирина; , 'со .

,612

- интенсивность флуоресценции копропорфирина:

начальная, конечная и соответствующая различным добавкам белка;К -константа связывания лорфирина с антителами; аир- квантовые выходы свободной и связанной формы порфирина, определённые по начальному и конечному приближениям. Константа ассоциации для РаЬ-фрагментое составляет (4.5±0.3)х107 М'1 (рН 7.5). Для антител 05ЕЗ константа ~былг определена в диапазоне рН 7-8. Оказалось, что в этой области К практически не зависит от рН и равна (2.3±0.2)хЮ7 М'1. *

Проведённое флуориметрическое исследование показало, что выбранные антитела характеризуются высокой аффинностью к копропорфирину, причел порфирин глубоко погружен внутрь белковой глобулы и малодоступен Дл' тушения внешними гидратированными ионами. Такие субстраты ПХ, как о дианизидин, проникают в связывающую область антител, и досгупност связанного порфирина близка к доступности тема .в пероксидазе. Данные п тушению флуоресценции копропорфирина антителами, а также по тушени! флуоресценции остатков ■ триптофана в молекуле антитела Яе(11); копропорфири'ном I, указывают на присутствие остатка триптофана в облает антигенсвязывающего центра, который по литературным данным необходим дл пероксидазного катализа. Таким образом, комплексы антител с кофакторо обладают рядом структурных характеристик, подобных пероксидазны системам, и являются интересной моделью для детальных кинетичет исследований.

■ 2_ ЛЕРОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 2.1 Кинетика окисления о-дианизидина перекисью водорода, катализируемого III) - копропорфирином

Ре!Ш) - копропорфирин является синтетическим аналоге простетической группы пероксидаз. Данные о его пероксидазной активности литературе отсутствуют, поэтому нами была исследована кинетика окисления дианизидина перекисью водорода в присутствии свободного железо копр порфирина.

Как ферментативное, так и не ферментативное окисление о-дианизидина |риводит к образованию конечного продукта бис(3,3'-диметокси-4-1Мино)азоби-фенила (1):

Н-,СО

- " 1

Желёзопорфирины легко димеризуются в водных растворах, образуя неактивные димеры с оксомостиками. Т.к. в литературе отсутствуют данные о юведении в водных растворах Ре(Ш)-копропорфмрина I, нами была определена юнстанта димеризации РеСР1 на основе зависимости начальной скорости >еакции ^от концентрации порфирина при постоянных концентрациях обоих :убстратов. Принимая во внимание известный из литературы факт, что димеры юрфиринов неактивны в пероксидазной реакции, была предложена следующая :инетическая схема:

2 FeCPI - d<aPP> >(FeCPl)l s + H.o. WP1I '

->p

(4)

(5),

де P - продукт реакции, kQ - константа скорости реакции с мономерной формой юрфирина, /<cf(app) - кажущаяся константа димеризации.

В интервале рН 6 - 9 log Kcflapp) ПРЯМ0 пропорционален рН, что хорошо югласуется с литературными данными для других порфиринов и может быть юъяснено следующими равновесиями:

FeCPI (Н:0),+ FeCPI (ОН)(Н20) + Н+ (6)

2FeCPl(0H)(H10)f±0-(FeCPl(H10))i+H20 (7)

2.2 Механизм окисления о-дианизидина перекисью водорода

Последующие исследования проводились при концентрациях келезокопропорфирина, не превышающих 5x10"? М, что позволяет исключить шлее из рассмотрения процессы димеризации.

, Кинетический анализ реакции выявил сложный механизм окисления, источающий субстратную активацию и ингибирование продуктом. Полные :инетические кривые в координатах Уокера-Шмидта ([Р]Д от 1п((8]0/[3]0-[Р]))Л'.>

имеют положительный наклон, что указывает на ингибирование продуктом реакции. Однако, при рассмотрении начальных скоростей реакции ингибирование можно исключить, т.к. этот процесс становится заметным только по истечении некоторого времени от начала реакции (порядка 1-2 мин.).

Субстратная активация, обнаруженная при анализе данных по начальным скоростям реакции (рис. 5а), довольна необычна для подобных систем. Трудно представить как сам факт связывания двух молекул о-дианизидина с FeCPI, так и механизм такой активации. Более вероятным объяснением наблюдаемой кинетики является предположение о том. что вторая молекула органического субстрата взаимодействует с промежуточной формой окисления первой молекулы. Предполагается, что окисление о-дианизидина в присутствии пероксидазы хрена включает промежуточный комплекс фермента с радикалом -продуктом одноэлектронного окисления субстрата, который может взаимодействовать с акцептором свободных радикалов. Логично предположить, что таким акцептором может быть и вторая молекула о-дианизидина. С учетом этого, механизм окисления формально можно представить уравнениями (8) и О).

FeCPI - S ^ К"-> (FeCPI -S) —FeCPI + Р (8)

(FeCPI -S) + (FeCPI -S,)- tf >(FeCPI -S) + P (9)

1 Na , min/Abs

10--- 20 ——----

0 5 10 15 0 1 2*3 4 5

1/[8]о-10"4, М"1

Рис. 5. Типичные зависимости начальной скорости окисления о-лианизилниа (Б I перекисью водорода от начальной концентрации 5 в обратнвых координатах при 1вух концентрациях перекиси: 2.0х10~*М (о) и 4х10~*М (•> - в присутствии свободного РеСР1 (а) и его комплекса с антителами (Ь).

Начальная скорость реакции при условии [5]о»[Е]о описывается выражением:

и

V +

И.

[51 + ^ +

И° к.

■ Кт и кс могут быть определены в условиях низких концентраций о-дианизидина (ниже ЗхЮ"5 М). В этом случае уравнение (10) принимает вид простой зависимости Михаэлиса-Ментен. Для определения второй пары констант при высоких концентрациях Б (более ЗхЮ'^М) использована _ линеризация в координатах {У0/(у0-Ут); 1/[30]>. Рассчитанные кинетические параметры собраны в таблице 2. Зависимость обеих кинетических констант от концентрации-перекиси водорода носит гиперболический характер и стремится к некоторому пределу при

концентрациях Н2О2 более 1х10"3 м. /Ст и К,

практически не меняются с ростом концентрации, что указывает .на то, что оба субстрата, о-дианизидин и Н2О2, взаимодействуют с катализатором независимо друг от друга (неупорядоченный механизм). Перекись водорода не включена в обсуждаемые кинетические схемы, т.к. это не' искажает характер зависимости скорости реакции от концентрации- второго субстрата и сказывается лишь на абсолютных значениях каталитических констант.

Таблица 2. Кинетические параметры .реакции окисления о-дианизидина пероксилом водорода и ирисусгвии свободного РеСР! (5х№~7 М) и связанного с антителами РеСР1 (5х10-7М РеСР!. 7.5хК)-5М Р5ЕЗ). Условия: 25 "С. рН 7.5.

1Н202]х104, М кс х 102, сек'1 Кт х 10б, М

свободный РеСР1 комплекс с Э5ЕЗ свободный РеСР! комплекс с 05 ЕЗ

1.0 _. 2.4±0.1 2.3+0.5

2.0 6.3+0.3 3.2±0.2 1.8+0.3 3.7+1.8

4.0 7.9+А.З 5.3+0.3 0.53±0.33 5.5+2.4

8.0 10.8+0.8 10.4+0.3 1.2+0.3 5.9±1.4

(Нчсьию4, м Кщ X 103, М

свободный РсСР! комплекс с 05 ЕЗ свободный РеСР! комплекс с 05 ЕЗ

1.0 0.10+0.01 1.7+0.7

2.0 0.57+0.06 0.068±0.002 4.;±1.3 0.46±0.21

. 4.0 0.89±0.04 0.38±0.01 1.7+1.0 3.7±0.3

8.0 0.94±0.09 0.73+0.04 ' 5.3±2.1 3.1 ±0.2

2.3 Окисление в присутствии антител

При добавлении антител наблюдается падение начальной скорости окисления о-дианизидина, и в условиях насыщения антителами величины скоростей для связанного РеСР1 примерно в 3-4 раза ниже, чем для свободного (при концентрации порфирина 10"7 М и низкой концентрации Н202). Используя зависимость начальной скорости окисления от концентрации антител в системе, мы оценили константу связывания РеСР! с антителами Э5ЕЗ в расчете на активный центр. При этом в качестве концентрации антител была использована концентрация активных центоов, и двухвалентность антител не учитывалась, т.к. во всех экспериментах концентрации антител равны и выше концентрации копропорфиоина. Величина <05ЕЗ составила (1.5±0.3)х107 М-1.

Анализ кинетики показал, что представленный выше механизм окисления сохраняется и в присутствии антител (рис. 5Ь). Следовательно, молекула антитела не препятствует взаимодействию РеСР1 со второй молекулой субстрата ¡-ли продукта, несмотря на глубокое проникновение порфирина в белковую глобулу. Известно, что пероксидазное окисление о-дианизидина также сопровождается ингибированием продуктом, механизм которого до конца не ясен. Ин'ибирование продуктом, наблюдаемое для свободного и связанного с антителами порфирина. а также ПХ системы, вероятно, может объясняться высокой гидрофобностью продукта, позволяющей ему сильно адсорбироваться на гидрофобных участках катализатора, как белковой природы, так и свободного металлопорфирина.

Кинетические параметры реакции для свободного и связанного железокопрспорфирина представлены в таблице 2. Следует отметить следующее: 1) зависимость констант К^ и Кт' от концентрации Н202 при переходе от свободного порфирина к комплексу с белком не изменилась; 2) кс и кс Для безбелковой реакции выше пзи определенной концентрации перекиси водорода, -ем при реакции, катализируемой комплексом РеСР1 с белком. Важно, что зависимости каталитических констант от концентрации Н202 носят различный .арактер для свободного и связанного порфирина. Для свободного РеСР1 наблюдается насыщение при высоких концентрациях перекиси водорода, тогда как для связанного РеСР1 кс линейно зависит от концентрации Н202. Измерения -ри более высоких концентрациях перекиси водорода показали, что скорости счисления практически равны для свободного и связанного с антителами порфирина. Грасик зависимости ^ от [Н202] для связанного РеСР1 линеен во всем диапазоне концентраций перекиси водорода (рис. 6), а величины кс связанного пороирина превышают в 2-3 раза кс для свободного.

Из литературы известна попытка моделирования пероксидазного

1А

катализа на основе моноклональных антител, специфичных в этом случае к /V-метилпорфи'рину IX. Успех работы оказался довольно ограниченным, и для реакции окисления о-дианизидина было достигнуто ускорение лишь в 4 раза по

Рис. б. Зависимость кинетических констант реакции окисления о- диацичиднна от концентрации перекиси водорода. рН 8.0 в" -присутствии (о)-2хЮ"9М РеСР1:(*)-2.\10"9М РсСР1 и 7.5х10"7М аптитсч

05ЕЗ.

[Н2О2] -104, М

В природных системах различие в каталитической активности свободного гема и связанного с апопероксидазой составляет 10000 раз. Принимая во внимание то, что доступность порфирина в апопероксидазе и в исследованных нами антителах практически равны, разница в скоростях для антител и фермента, наиболее вероятно, объясняется сменой скоростьопределяющей стадии. Лимитирующей 'стадией пероксидазного окисления о-дианизидина является окисление второй молекулы донора водорода. Из полученной нами зависимости каталитической константы от концентрации перекиси водорода, вероятно, следует, что скоростьопределяющей стадией для системы РеСР1-антитело является взаимодействие с перекисью водорода. Эта гипотеза частично подтверждается тем фактом, что высокие концентрации перекиси инактивируют пероксидазу из хрена, в противоположность увеличению кс при повышении концентрации окислителя" в системе РеСР1-антитело.

3. МЕТАЛЛОХЕЛАТАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ 3.1 Кинетика металлирования порфирина

Некаталитические реакции встраивания ионов металла в порфирины отличаются очень низкими скоростями. Антитела, полученные против искаженного (непланарного) А/-метилпорфирина, как было опубликовано, обладают хелатазной активностью. Тот факт, что эти же антитела проявили некоторую перохеидазную активность, заставил нас также обратиться к реакциям включения ионов металлов в порфириновый цикл.

сравнению со свободным порфирином.

*с.1/з __________

О - - ——;---:--—

0 5 "" 10 15 20 25

Исследовано влияние антител на кинетику металлирования копропорфирина I. Т.к. антитела специфичны к Рс1(11)-копропорфирину, то нами в первую очередь было изучено включение ионов двухвалентных переходных металлов: Cu2+, Zn2+, Ni2+. Со2+. Fe2+, Мп2+. Включение иона в макроциклический лиганд для всех исследуемых металлов сопровождается падением интенсивности флуоресценции порфирина.

В случае ионов Cu(ll), Zn(ll), Co(ll) и Fe(ll) константа скорости реакции псевдо-первого порядка линейно зависит от концентрации металла:

(11)

где (<2 - константа скорости второго порядка включения иона металла в копропорфирин. Константы скорости 1<2 равны (1.4+0.1 )х103 М"'сек"', (3.6+ 0.2)х103 М^сек"1, 7.2Ю.6 М"'сек_1и 2.0Ю.6 М'1сек'1 для ионов Cu(ll), Zn(ll), Co(ll) и Fe(ll), соответственно.

Таким образом, получен следующий ряд активности ионов металлов: Zn>Cu>>Co>Fe>>Mn, Ni. Это подобно тому, что приведено в литературе, за исключением обратного порядка для ионов меди и цинка. Вероятное объяснение этой инверсии заключается в использовании имидазолильного буферного раствора. На основе опубликованных констант устойчивости, нами рассчитано распределение различных комплексов имидазола с ионами металлов. Доминирующими формами иона Cu(ll) являются трис- и тетракис-имидазольные комплексы (52% и 32%, соответственно). В случае цинка найдено более широкое распределение комплексов приблизительно в равных долях (25%): моно- ,бис- и трис -комплексы. Логично предположить, что активность в реакции комплексов с имидазолом разного состава различна. Вероятно, что комплексы более высокого порядка менее активны, чем комплексы с промежуточным числом лигандов.

Это подтверждается тем, что характер зависимости константы скорости включения от концентрации имидазола индивидуален для каждого металла (рис. 7). Истинные константы скорости, отвечающие имидазолильным комплексам различного состава, были определены по уравнению (12).

Y 1с. Ü.[L]'

к. = ^ - ' (12), ■ 1+1№Г

где к£/ - константа скорости второго порядка для взаимодействия соответствующего комплекса MeLj с CPI, ßj- константа устойчивости, [L]-концентрация имидазола и /=1-4. Для ионов Cu(ll) было получено, что к22=(9.0+ 0.3)х103 М'1сек"1, к23=к24=0. В случае цинка Аг22=(9.3±0.8)х)03 М"1сек"1,

Я23=(3-3±0.7)х103 М-Ьек'1, ^24=°- I

к , э-1

о.оз •

0.02-

0.01^

0.01

0.02

0.04

Рис. 7. Зависимости наблюдаемой константы скорости псевдо-нервого порядка от концентрации имидачола (1т) XIя реакции включения ионов

[1т], М Си(И) (о). гпШ) (•) и Со(П) (V).

3.2 Влияние антител на кинетику металлирования порфирина

Были изучены зависимости начальной скорости металлирования для ионов Си(Н), гп(Н), Ре(И), N¡(11) и Мп(И) от концентрации антител 05ЕЗ. Некоторый каталитический эффект обнаружен для реакции включения ионов 2п(И) в макроциклический лиганд (рис. 8). Для остальных металлов в присутствии антител наблюдается падение скорости' металлирования. Столь разное поведение ионов меди и цинка объяснить довольно сложно, так как параметры, характеризующие состояние этих ионов в растворе (энергии гидратации, константы скорости обмена молекулы воды в координационной зфере и т.п.), существенно, не различаются. Вероятно, причина заключается в использовании имидазольного буферного раствора. Как обсуждалось выше, эаспределение имидазольных комплексов меди и цинка значительно этличаются, причем в последнем случае преобладают комплексы с малым и средним числом лигандов. Для меди характерны комплексы более высокого порядка и это может создавать стерические затруднения для включения иона металла в связанную антителами порфириновую структуру.

0.02

Рис. 8. Зависимости начальной скорости металлирования копроцорфприпа от концентрации антител 05ЕЗ для ионов Си(Н) (•) и гпШ) (о).

[1де],х107м

выводы

1. Взаимодействие копропорфирина I с моноклональными антителами изучено флуоресцентными методами и показано, что порфириновый макроцикл погружен глубоко внутрь белковой глобулы и недоступен для тушения внешними гидратированными ионами (Cs+, I"). Такие субстраты пероксидазы, как о-дианизидин, проникают в антигенсвязывающий центр антител, и доступность порфирина близка к доступности гема в ПХ.

2. При высоких концентрациях антител обнаружены процессы димеризации, в которых участвуют Fab фрагменты антител. Димеризации приводит к появлению новой полосы в спектре флуоресценции связанного порфирина.

3. Данные по тушению флуоресценции порфирина антителами с высокой степенью вероятности указывают на присутствие остатка триптофана в области ангигенсвязывающего центра, который, по литературным данным, необходим для пероксидазного катализа.

4. Кинетика окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии свободного копропорфирина свидетельствует о том, что механизм окисления характеризуется субстратной активацией и ингибированием npoivtTo.vi.

5. В присутствии комплекса копропорфирина с антителами механизм окисления о-дианизидина перекисью водорода существенно не меняется. Однако, изменяется характер зависимости Vcat от концентрации перекиси водорода, и при высокой концентрации перекиси водорода наблюдается увеличение кса} в 2-3 раза по сравнению со свободным копропорфирином.

6. В присутствии антител D5E3 обнаружено увеличение скорости включения ионов Zn(ll) в порфирин.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. А.Р. Savitsky, M.V. Demcheva, E.Yu. Mantrova. Universal phosphorescence immunoassay // Proceedings of SPIE, Bellingham, Washington-1993. Vol.1885-P. 258-269.

2. M.B. Дёмчева. Получение моноклональных антител к инсулину и Pd-копролорфирину, их биологическая характеристика и использование в иммунохимическом определении инсулина. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1989.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. M.V.Demcheva, M.I.Nelen', S.A.Deiko, G.V.Ponomarev, T.V.Cherednikova, A.P.Savitsky and A.K.Yatsimirsky. Monoclonal Antibodies Against Pailadium(ll)

Coproporphyria: Hapten Binding and Peroxidase Catalytic Activity of Complexes with Iron(lll) Copropor'phyrin. j'/ Proc. 11th Meeting of European Federation oflmmunological Societies, 9-12 June 1991, Espoo, Finland, p. 10-10. I. M.I.Nelen. Catalytic Activity of Antibody-lron(IIH-coproporphyrin Complexes. // 8-th Conference of Young Scientists on Organic and Bioorganic Chjemistry, 2-9 November 1991, Riga, p. 143. i. A.P. Savitsky, M.I. Nelen, A.K. Yatsmirsky, M.V. Demcheva, G.V. Ponomarev and I.V. Sinikov. Kinetics of Oxidation of o-dianisidine by Hydrogen Peroxide in the Presence of Antibody Complexes of Iron(lll) Coproporphyrin. // Applied Biochemistry and Biotechnology, 1994. Vol. 47, p. 317 - 327 I. "A.K. Yatsimirsky, M.I. Nelen', A.P. Savitsky and G.V.Pomomarev. Kinetic Determination of Cu(ll) and Zn(ll) by Their Incorporation Reactions Into a Water-soluble Porphyrin With a Fluorimetric Detection. // Talanta, 1994. Vol. 41, p. XX. j. A.P. Savitsky, M. Nelen, O.V. Lobanov, M.V. Demcheva, A.K. Yatsimirsky, J. Korppi-Tommola. Time-resolved fluorescence study of the interaction of monoclonal anti-coproporphyrin antibodies and Fe(lll)-coproporphyrin.// Abstract Book of the International Symposium on Biomadical Optics, BIOS Europe'94, 6-10 September 1994, University of Lille, Lille, France, p.111 j. M.I. Nelen'. Kinetics of Oxidation of o-dianisidine by Hydrogen Peroxide in the Presence of Antibody Complexes of Iron(lll) Coproporphyrin, // Proc. EUROBIC II "Metal tons, in Bioorganic Systems", Aug.30 - Sept. 3 1994, Florence," Italy,' p. 247