Изучение структурной организации тРНК-связывающих участков рибосом E. coli с помощью УФ-индуцированного образования полинуклеотид-белковых сшивок тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

я

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО АН СССР

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ тГШ-СВЯЗЫВАЩИХ УЧАСТКОВ РИБОСОМ Е.соИ С ПОМОЩЬЮ УФ-ЩВШИРОВАННОГО ОБРАЗОВАНИЯ ШЛИНУКЛЕОТИД-

БЕЛКОШХ СШИВОК

02.00.10 - Еиоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

на правах рукописи УДК 547.963.32

ШЕТКОВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1Э91

Работа выполнена в Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского АН СССР.

Наутаый руководитель.' доктор химических наук, профессор Э.И. Будовский.

Офидаалыиа оппонента: член-корреспондент АН СССР, доктор биологических наук, профессор Л.Л. Киселев

доктор химических наук, профессор В.Н. Шибаев

Ведущая организация:

Московский гоеударственнчй университет им. М.В. . Ломоносова химический факультет

Защита состоится "22." А^Р^оУ 1991 г. в О час. на заседании специализированного совета К 002.62.02 в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского АН СССР по адресу: П7913, Москва, Ленинский проспект 47.

С диссертацией мокко ознакомиться в библиотеке Института органической химии им.Н.Д. Зелинского АН СССР

. Автореферат разослан "2/" ОКТЗ^ОЛ 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета

/Н.Я. Григорьева/

Актуальность проблемы. Одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии является исследование процесса биосинтеза белков на рибосоме. Именно здесь происходит реализация в белковые структуры генетической информации, заключенной в нуклеиновых кислотах.

За последние года рибосомология достигла значительных успехов, но многие проблемы, связанные со структурой и функциями рибосом, до сих пор не решены. Так, мало что избаотно о структурно-функциональной топографии и динамике рибосомного комплекса. Важные данные для решения этих проблем могут быть получены при изучении межмолекулярных, в частности, РНК-белковых контактов в рибосомных комплексах, а также изменений этих контактов при изменении функционального состояния комплекса. Для этой цели широко используют УФ-хцдуцированяое образование и анализ полинуклеотид-белковых сшивок.

С помощью метода УФ-индуцированного образования полинуклеотид-Селковых сшивок показано существование непосредственных взаимодействий рибосомных белков с рРНХ, мРНК и тРНК. Идентификация балков, пришивающихся к тРНК при УФ-облучении рибосомных комплексов, дает структурную характеристику' тРНК-связывакщих участков рибосомы. До сих пор не было известно, какие нуклеогидше остатки тРНК вовлечена в непосредственные взаимодействия с рибосокными белками. Появление новых методов выделения и анализа тРНК-белковых сшивок позволило успешно решать такие задачи. Локализация в тРНК нуклеотидов, которые непосредственно взаимодействуют (спиваются) с белками на разных этапах трансляции, открывает принципиально новые возможности. Такие данные не только уточняют структурные' характеристики ' тРКК-связывавдих участков, но позволяют описать движение тРНК в

!

рибосоме и дают возможность исследовать функциональную топографию тРНК с разрешенном до одного нуклеоищюго звена.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение структуры тРНК-связываодих участков рибосомы и функциональной топографии тРНК в процессе элонгации.

В задачи исследования входила разработка методов выделения и анализа индивидуальных тРНК-Оелковых сшивок, определения места пришивки белков на тГНК.

Научная новизна и практическая ценность. Разработаны методы выделения и анализа индивидуальных тРНК-Оелковых сшивок, возникающих при УФ-облучении различных рибосомных комплексов, в также метод, позволяющий определять основания в тРНК, участвующие в образовании свивок с белками. Определены ' структурные характеристики тРНХ-связывающих участков рибосомы. Показана, связь структурной организации тРНК-связывавдих участков с функциональным состоянием рибосомного комплекса. Впервые определены нуклеотадние остатки тРНК, непосредственно взаимодействующие с- рибосом;шми белками на различных этапах трансляции. Исследована функциональная топография тРНК в процессе элонгации.

Полученные данные могут Сыть использованы для уточнения и расширения представлений о механизме трансляции. Разработанные методы могут быть использованы для изучения структуры и функций других нуклеопротевдов

Апробация работа. Материалы работа докладывались на 13-ом-международном рабочем совещании по тРНК (Ванкувер, 198Э), на 11-ом международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), на конференции Американского микробиологического общества по рибосоме (Монтана, 1989).

Объем работа. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, результатов исследования, обсуждения результатов, экспериментальной части, списка литературы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах, содержит 18 рисунков и 10 таблиц. Библиография включает 197 ссылок.

СОДЕРХАНИЕ РАБОТЫ I. Характеристика и облучение рибосошмх комплексов'. -

В настоящей работе исследованы ЗСБ-инициатораий, пре-транслоцированные и посттранслоцированный комплексы 70S рибосом Е.соИ:

ЗСБ-инициаторный комплекс - SOS'поли (U) 'KAcPhe-TPHK^9 ; претранслоцированный

комплекс (I) - тРНК№9 '70S'поли(U)'HAcPliePUe-TPHH^8 ;

АЬ

претранслоцированный

комплекс (II) - rFKH^8'70S-noJM(U)'KAcPhBPhe-TPHKPhe ;

Pb

посттран слоцированный

комплекс (III) • - NAcPhe-TPHK^9'70S• поли(U):

pt

Для структурных исследований необходима высокая гомогенность рибссомных комплексов, основанная на структурной интактности и высокой функциональной активности как отдельных компонентов, так и ■ комплекса в целом. По стандартным тестам гомогенность всех исследованных в работе комплексов была не ниже 80-90%.

Облучение рибосомных комплексов проводили в буферных растворах, используемых для получения этих комплексов, полным светом ртутной лампы низкого давления (Х=254 ни) при постоянном

перемешивании при +4°С. Оптимальной является доза, при которой, с одной стороны, обеспечивается достаточный для анализа выход тРШ-Оелкових сшивок, а с другой - не происходит изменений в структуре нуклеопротеида. Ранее било показано, что оптимальная доза для рибосомных нуклеопротеидов составляет 15-20 квантов на нуклеотид. При таких дозах <10£ тРНК сшивается с рибосомой, но не происходит ни - дестабилизации комплексов, ни деградации его компонентов.

2. Выделение индивидуальных тРНК-белковых сшивок.

2.1 Выделение индивидуальных тРНК-белкових сшивок из облученного ЗСВ-инициаторного комплекса.

Использование мономеркурированной тРНК, которая практически не отличается по функциональным свойствам от нативной тРНК, для получения комплекса позволяет после облучения и диссоциации комплекса выделять хроматографией на тиопропил-Сефароэе фракцию тРНК, содержащую свободную тРНК и тРНК с приштши белками.

Для дальнейшего анализа фракций тРНК подвергали 3'-концевому радиоактивному ме четно (32Р1рСр с помощью' Т4 РНК-лигаэы и разделяли 'электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

На рис.1 представлены результаты электрофоретического разделения -меченой фракции тРНК, содержащей свободную тРНК и тРНК с пришитыми белками. УФ-облучение ЗОБ-инициаторного комплекса приводит к образованию четырех основных тРНК-содержащих продуктов, имеющих меньшую электрофарэшчэ скую подвижность, чем исходная лигированная с 13%>]рСр тРНК (рисЛ, а).

После действия 'прютеиназы К в условиях исчерпывающего протеолиза подвижность соединений в полосах I, 2. и 3

увеличивается и становится такой ке, как и у исходной, меченой тРНК (рас.1, с). Протеолиз не сказывается на. подвижности соединения из полосы 4. Вероятно, полоса 4 содержит продукт внутримолекулярной сшивки в тРНК.

abe - о -

з т

4 в»

! |

I /

РисЛ. Распределение радиоактивности в полиакриламидном геле после электрофореза 3'-меченой фракции ?PHKPÍI8, выделенной из облученного комплекса 30S 'поли (U) •f!AcPhe-TPHKP>íe до (а) и после (Ь) протеиназного гидролиза и из необлучеяного комплекса (с). Электрофорез проводили в IOS полиакриламидном геле, содеркащем 8 М мочевину.

Белки, пришивающиеся к тРНК, идентифицировали с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле после ферментативного расщепления тРНК смесью рибонуклеаз А и Tj. В полосах I, 2 и 3 было обнаружено по одному сэлку - S7, S5 и Б9 соответственно. Продукты сшивки тРНК с' двумя молекулами белка не обнаружены.

2.2 Выделение индивидуальных тРНК-белковых сшивок из облученных 70S рибосомнЦх комплексов.

Использование мошмеркурировашюй тРНК для получения 70S рибосомных комплексов, как и в случае ЗОБ-инициаторного комплекса, позволяет после облучения и диссоциации комплексов отделить путем сорбции на тиопропил-Сефарозе эту тРШ (свободную и сшитую с белками) от всех остальных компонентов комплекса. Такой прием играет решающую роль при наличии в исходном комплексе нескольких молекул тРНК, занимающих разше тРНК-связывакдае участки рибосомы. При получении комплексов мономеркурированную тРНК можно направленно вводить в любой из этих участков. Таким образом, из облученных комплексов I, II и III были выделены сшивки, индивидуальные по положению тРНК, то есть содержащие тРНК, связанную в исходном комплексе по Ръ и Pt участкам соответственно.

Выделенную фракцию тРНКР1в подвергали 3'-концевому радиоактивному мечешпо 132Р)рСр . эмощыо Т4 РНК-лигазы.

Для идентификации белков, сшитых с меркурированной тРНК и для выделения индивидуальных по белку тРКК-балковых свшвок использовали иммобилизованные ' яа нитроцеллюлозе комплексы индивидуальных рибосомных балков с поликлоналышми антителами (индивидуальные иммунные комплексы). По радиоактивности

[ Р1-меченого тРНК-содержащего материала из облученных .комплексов, связывающегося с иммобилизованными индивидуальными иммунными комплексами, были идентифицированы белки, сшитое с молекулами тРНК, расположенными в Аь, Рь и Рг участках рибосомы (табл. 1).

Идентификация рибосомных белков, сшитых с тРНК' составе 70S рибосомных комплексов.

Phe

Таблица I.

E'.COll В

Приведена радиоактивность (имл/мин), сорбированная на иммобилизованных индивидуальных иммунных комплексах при нанесении аликвот смесей, содеркащих свободные и сшитые с белками мономеркурированнке [3гРЬтРНКРЛ9, выделенные из облученных рибосомных комплексов (средние данные из трех и более независимых опытов, дисперсия не превышает 1056). Фон « 50 имп/мин.

Рибосомше тРНК-связываодие Гкбосомные белки

комплексы участки S5 S7 S9 SI0 1Z L5 127

Претрансло-цирозанный (I) 200 800 56 670 1200 48 1420

Претрансло-цироваяный (И) рь 180 50 1980 52 1020 580 750

Посттрансло-цированный (III) 180 53 2100 55 1900 62 1050

При действии кислого буфера на иммобилизованные иммунные комплексы происходит их диссоциация.

Таким образом, описанный выше подход позволяет выделять сшивки, гомогенные но составу и специфичности, то есть содержащие опрэделешшй белок, пришитый к тРНК, расположенной в заданном участке ' рибосомного комплекса, находящегося в ' одном из функциональных состояний.

3. Определение куклеотидаых остатков тРЩ, непосредственно взаиыодействувдих с белкаии, в составе рибосошшх комплексов.

Ограниченный статистический гидролиз межнуклеотидшх связей кратковременным нагреванием в щелочной среде меченой по 3'-концу тРНК в составе каждой сшивки приводит к образованию набора меченых олигонуклеотадов, отличающихся друг от друга на один нуклеотидний остаток. Все-фрагменты, содержащие пришитый белок, могут быть удалены из смеси экстракцией фенолом. В водной фазе остаются только фрагменты тРНК, не содержащие ковалентно-связадаого белка. Разделение в секвенирувдем ■ геле олигонуклеогидов, содержащихся в водной фазе, позволяет определить номер нуклеотида, непосредственно перед местом пришивки белка, так как длина наибольшего из этих олигонуклеотидных фрагментов соответствует расстоянию от 3'-меченого конца тРНК до нуклеотида, предшествующего месту сшивки с белком. Так как первичная структура

TiV.r,

тРНК Е.аоЛ1 известна, то по номеру нуклеотида можно определить тип основания, участвующего в образовании сшивки с белком.

Результаты представлены на рис. 2 и 3 и в таблице 2.

К S9 S5 S7

!

JO-a

1 í

1 i

л

Рис,2. Распределение радиоактивности в полиакриламидаом геле после электрофореза смеси олигонуклеотидов, возникающих при статистическом гидролизе í33?)-меченых по 3'-концу исходной tPHKpí№ (К) и TPHKPh9, сшитой с белками S9, S5 и S7 в комплексе 30S"nojní(U)"NAcPhe-TPHKPiie. Электрофорез проводили, в 10% полиакриламидаом геле, содержащем 8 М мочевину.

К12751012 б? К Б91.21.5 1.27 К 5912 \21

? у «

»— —

ТО«*

Вис.З. Распределение радиоактивности в полиакриламидном геле после электрофореза смеси олигонуклейтидов, возникающих • при статистическом гидролизе меченых по 3'-концу исходной тРНК^6 (К) и тРНКР1г8, выделенных из пре- и посттранслоцированшх. комплексов (Ай, Рь и Р^ участки соответственно). Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевину.

Таблица 2.

Нуклеотиднае остатки TPHKphe E.colt, непосредственно взаимодействующие с белками, в составе рибосомных комплексов.

Рибосомные комплекси

ЗОЗ-инициаторшй I II И III

комплекс Участок локализации тРНК

АЪ ръ и Р

S5 ST S9 S7 S10 L2 L27 S9 L2 L5* 127

А21 U45 (J60 А2б А9 V59 С18 U60 С1Г G44 С5б

* - только в Pv, участке.

4. тРНК-белковые взаимодействия в составе ЗОЭ-инициаторного (прединициаторного) комплекса,

30S субчастица, являясь составной частью 70S рибосома, функционирует в ее составе на всем протяжении процесса трансляция. Однако, на стадии инициации она функционирует как отдельная, самостоятельно существующая субчастица.

Методом УФ-индуцированного образования полинуклеотид-Оелковых сшивок показано наличие специфических нековалентных взаимодействий (контактов) тРНК с рибосомными белками в ЗСБ-инициаторном комплексе, образующемся при ассоциации 3QS субчастицы с fMet-TPHKj8t и специфическим участком мРНК на первом этапе трансляции в прокариотической клетке. Шли идентифицирована белки, контактирующие с fMet-TPHKj9t в составе этого комплекса (Вроуде, 1985).

Комплекс SOS'munUlirNAcPhe-TPHK^16 может служить близким структурным аналогом истинного ЗСКЗ-инициаторного комплекса. Основные белки, пришивающиеся к iMet-TPHK1ie,; и NAcPhe-TPHK^®

являются общими, что свидетельствует о сходном расположении í¡tet-TPHKjet и NAcFhe-TPHKpíie на 30S субчастице в составе ЗОй-инициаторного комплекса.

До сих пор не было известно, какие нуклеотидныо остатки тРНК вовлечены в непосредственные взаимодействия с рибосомными белками, что обусловлено, главным образом, методическими трудностями такого исследования. Совокупность методов, использованных в настоящей работе, позволяет достаточно просто решать такие задачи.

Б составе комплекса 303•поли(U)'KAcPhe-THfiC?he белки S5, S7 и S9 непосредственно взаимодействуют с A2I, U45 и U60 (рис. 4 ). Сопоставление нуклеотидных последовательностей инициаторной тРНК и тРИКР11е E.coll показывает, что в обеих этих тРНК в положении 21 находится еде ютовый остаток, а в положении 60 - уридановый остаток . В отличие от тРНКР11е, имеющей в 45 положении уридановый остаток, у TPHKjet в этом положении находится гуаниновый остаток. U45 TPHKPhe участвует в образовании сшивки с белком S7 в состава комплекса 30S-поли(И) •MAcPhe-TPí{Kpíle. Однако ранее било показано,

Мр+

что г PIK J в составе природного предашциаторного комплекса не взаимодействует с белком S? . Так как эффектность образования кавдой сшивки зависит от природа контактирующих компонентов макромолекул, такое различие может быть обусловлено различием первичных структур TPHKjet и TFHKItie.

Сопоставление первичных структур тРНК Е.соИ (Sprinzl, 1989) показывает, что у 91% тРНК в положении 21 находится А, а в• положении 60 - U. В 45-ом положении в дополнительной петле у 86Х тРНК находится пуриновый остаток и только у 14% тРНК - 0.

Таким образом, можно предположить, что нековалэнтиые взаимодействия рибосомшх белков S5 и S9 с нуклеотидами A2I и U60 являются общими для практически всех тРНК Е.col i при образовании

«змгиекса о 30S субчастицей, а взаимодействие бежа S? с U45 -специфично для TPHKíhe.

он

А,

См

С

А

pG С С О С С то С <5

10 G . А

С О

А ° А

С U С С

i 3 А О С ts А

!

S5

С

с

и «J

о сс

mTG

АО С И С 5

90

G С О С

>00 С «о А \J»

* Л\

9 д А

S7

S9

U и с и

PU0.4.

Pbft

Расположение на вторичной структуре тРНК E.colt нуклеотидных звеньев, сшивающихся с белками S5, S7 и S9 при УФ-оОлучении комплекса 303"поли(U) •NAcPhe-TPHKpíle

Рис.5.

Расположение на трехмерной структуре ïFHKPiie E.coït нуклеотидных звеньев, сшивающихся с белками S5, S7 и S9 при УФ-облучении комплекса 3QS 'шли (U ) 'NAcPhe-TPHK^®

5. Структурная характеристика тРНК-связываюодих участков рибосомы.

Очевидно, что эффективность и точность трансляции обусловлены фавильнш расположением молекул тРНК в рибосоме на каждом этапе ¡лонгащш. Ранее било показано, что кроме кодон-антккодоновых ззаимодействий в рибосомннх комплексах существуют специфические юковалентные взаимодействия (контакты) тРНК с рибосомными 5елками и рРНК. Эта контакты отражают взаимное расположение тРНК и сошонентов рибосомы. В связи с этим, наборы таких контактов, тлится прямой структурной характеристикой тРНК-связывающих участков рибосом. Для молекул тРНК. взаимодействующих с кодонами в 1 и Р участках, набор тРНК-белковых контактов зависит от функционального состояния комплекса (Abdurashldova, 1986). Это эбусловлено тем, что изменение функционального сост™лг.:я комплекса зопряхено с изменением как конформашга рибосомных субчастиц , так а их взаимного расположения.

Более детальную структурную характеристику тРНК-связивающих участков рибосомы дает определение не только белков, взаимодействующих с тРНК, но и полокениэ в тРНК нуклеотидных звеньев, вовлеченных'в эти взаимодействия. Так, хотя белки L2 и L27 взаимодействуют с тРНК, расположенными как в А^, так и в Р участках, точки контакта этих белков с тРНК в Аь участке отличаются от таковых с тРНК в Р участках, (рис.6, табл.3);

Php

В случае тРШг структурной характеристикой Аь участка являются непосредственные тРНК-белковые взаимодействия Â9-SI0, 3I8-L27, A26-S7 и U59-L2; ДЛЯ ?ь участка - CI7-L2, G44-L5, СБ6-К7 н U60-S9; для Pt участка - то же, что и для Рь , минус G44-I5.

6. Поворот молекула тРНК при ее переходе из А в Р участок

рибосомы.

При переходе тРНК из Аь в Р участок меняются не только точки контакта тРНН с белками L2 и L27, но и петли на вторичной структуре тРНК, с которыми взаимодействуют эти белки (рис. 6 ). Полученные данные свидетельствуют о том, что при переходе из А^ в Р участок может происходить поворот тРНК вокруг оси, соединяющей антикодон с аминоацильнкм концом молекулы, относительно 50S субчастицы.

Размещение двух молекул тРНК со сближенными ССА концами на соседних кодонах мРНК (в А и Р участках) возможно только при наличии изгиба мРНК мевду этими кодонами (Rich, 1974). В этом случав пептидил-тРНК, связанная с А участком, при транслокации в Р участок должна совершать вращательное движение вокруг оси, соединяющей концы Ь-образной молекулы.

Хотя кодоны, взаимодействующие с тРНК в каждом из циклов элонгации, ■расположены на 3QS субчастице, наличие изгиба мРНК мевду кодоками в А и Р участках должно приводить к вращению тРНК в 70S рибосоме относительно не только 30S, но и 50S субчастицы. В связи с зтим, полученные данные о повороте относительно 50S субчастицы молекулы тРНК при еэ переходе из А в Р участок, хорошо согласуются с представлением о наличии изгиба в мРНК мевду кодонами, расположенными в А и Р участках рибосомы.

7. Функциональная топография тРНК

О функциональной топографии тРНК на стадии элонгации, то есть о расположении в этой молекуле нуклеотидных звеньев, необходимых для специфических нековалентных взаимодействий с компонентами элонгирувдей рибосомы, известно мало.

В tPHK^®, расположенной в Aö, Pb и Pt участках рибосомы, с белками обеих субчастиц непосредственно взаимодействуют восемь нуклеотидных остатков (табл. 3 ). Ни один из этих остатков не участвует в стабилизации вторичной структуры тРНК - они расположены (рис. 6) либо в D (CI7 и GI8), ТФС (С56, U59 и USO) и дополнительной (G44) петлях, либо между двуспиралышми участками (А9 И А26) .

Следует отметить, что и в составе комплекса 30S'поли(U)'NAcPhe-TPHK5^6 белки S5, S? и S9 непосредственно, взаимодействуют с A2I, расположенным в дигидроуридиловой петле, U45 - в вариабельной петле й U60 - в TSC петле молекулы TPHKPhe (рис.4 ), то есть ни один из этих остатков также не участвует в стабилизации вторичной структуры тРНК.

Все тРНК, несмотря на различия первичных структур имеют, сходные вторичную и третичную структуры. По аналогии с дрожжевой тРНК*"э, из восьми нуклеотидных остатков тРНКРйе Б.coli, для которых обнаружено непосредственное взаимодействие с рибосомными белками в составе элонгационных комплексов, пять вовлечет в образование третичной структуры (рис, 6) - АЭ, G18, А26 (тРНК в Аь участке), G44 и 056 (тШК в Р^ и Pt участках).

Участие оснований, взаимодействующих с рибосомами белками, в образовании третичной структура может служить аргументом в пользу изменений третичной структуры тРНК при ее связывании с рибосомой и/или при ее перемещении в рибосоме в процессе элонгации.

Рис.6. Расположение на вторичной структуре тРНК^19 2.col! нуклеотидаых звеньев, которые сшиваются с белками при УФ-облучении пре- и посттранслодаровашшх рибосомных комплексов. В квадратах ъ кружках обозначены белки, сшшзаюциеся с тРНК в и Р участках соответственно. Пунктиром обведен белок, который сшивается с тРНКР1в только в Рь участке.

Тонкими линиями обозначены третичные - взаимодействия (по аналогии с тРНК^16 дрожжей).

ÍL27) ■127

L2

—<L5l

phfl'

Рис.7. Расположение на третичной структуре тРШ E.colt вуклеотидных звеньев, которые спиваются с белками при уф-облучедаи пре- и посттранслоцированшх рибосомных комплексов. В квадратах и кружках обозначены белки, сшивающиеся с тРНК в Аь и Р участках • соответственно. Пунктиром обведен белок, который сшивается с. TPHKPhe только в Ph участке.

7.1 Вариабельность нуклеотадных остатков тГНК, взоимодеАствутаих с рибосомными белками в процессе элонгации.

В н участках (пептидил- и деацшшрованная тРНК№е в пост- и претранслоцированном состояниях соответственно) белки SIO, L2 и 127 контактируют с основаниями 60, 17 и 56 соответственно (табл. 3). Сопоставление первичных структур тРНК E.colt, известных в настоящее время показывает, что для всех тРНК положение 56 инвариантно, положение 60 сильно консервативно, а в положении 17 -всегда пиримидина, преимущественно дигидроурэцил. Лишь в положении 44, контактирующем с белком 15 (деацшшрованная тРНК в Рь учвстке претранслоцированноя рибосомы), может Сыть расположено любое из канонических оснований (табл. 3). Таким образом, в контакты рибосомних белков с тРНК, расположенной в Р участках, вовлечены нуклеотидные остатки в инвариантных или сильно консервативных положениях молекул тРНК E.coli (кроме положения 44, характерного только для TPHKp!ie в Рь участке ).

В At участке (претранслоцированная рибосома) в контакты пептидил-тРНКР1ге с белками S7, SIO, L2 и 127 вовлечены нуклеотидные остатки в положениях 26, 9, 59, и 18 соответственно (табл. 3 ). Как и в обоих Р участках, с белком 127 контактирует остаток в инвариантном ( с точки зрения основания) положении 18. Хотя в остальных положениях (9, 26, и 59) у молекул тРНК E.colt преобладают пурины («852), но вариабельность по этим положениям весьма значительна (табл. 3). Однако, если принять за "норму" наличие аденина во всех этих положениях, то замены оказываются сцепленными, то есть отличие от аденина в одном из этих положений (9, 26 или 59) сопряжено в большинстве' случаев с отличием от аденина в другом и/или с 2•-О-кетилированлем инвариантного гуанозина в положении 18.

Таблица 3.

Основания тРНК E.coll, непосредственно взаимодействующие с белками в составе рибосомных комплексов.

Локализация тРНК в рибосоме

АЬ участок ръ иРХ участки

>елки, лришивавдиеся t тРНК S7 S10 12 127 S9 L2 15* 127

Юлокение и тип осно->аний в TPHKPhe2.coIi, А26 А9 U59 GI8 U6Q CI 7 G44 С56

фишиванцихся к белку

Соличество звеньев

юответствующего к 24 25 22 0 0 0 13 0

гипа в этих С 17 10 12 43 0 0 9 0

юлокениях у всех С 2 6 I 0 4 6 9 43

гРНК E.colt и 0 2 8 0 39 20 12 0

^ только в Рь участке

Все эти данные можно рассматривать как свидетельство в пользу Универсальности функциональной топографии злонгаторных тРНК ?.соИ.

Полученные данные могут быть использованы не только для :истематизации . уже имеющихся .• сведений о структурных и функциональных особенностях тРНК, рибосом и их компонентов, но и открывают возможность исследования структуры и функциональных звойств тРНК и рибосом путем направленного изменения определенных. юложений в молекуле тРНК и/или в соответствующих рибосомных. 5ел!(ах. . ...

22 ВЫВОДЫ

1. Разработан метод идентификации и выделения индивидуальных тРНК-белковых саивок с помощью иммобилизованных иммунных комплексов рибосомных белков с антителами против этих белков.

2. Разработан метод определения положения нуклеотидных остатков тРНК, образующих сшивки с белками при УФ-облучении рибосомных комплексов.

3. Показано, что в составе комплекса 30S'rcwiH(U}*HAcPhe-TPHKPlie с белками S5, S7 и S9 непосредственно взаимодействуют нуклеотидные остатки A2I, U4S и U60 TPHKPh0 E.coll.

4. Определены нуклеотидные остатки тРНКР1~ш E.coll, принимающие участие в непосредственном взаимодействии с рибосомными белками в А& и участках претранслоцирозанного, а также в Pt участке посттранслоцированного рибосомных комплексов. Показано, что в контакты рибосомных белков с тРНК^9 расположенной' в Р участках, вовлечены нуклеотидные остатки в инвариантных или сильно консервативных положениях молекул тРНК E.coli (CI7, C5S и U6Q). В контактах с белками в А участке принимают участие основания АЭ, GI8, А26 и U59 тРНК№е. В тих положениях тип основания у молекул тРНК E.coll существенно варьирует, однако эти вариации си-,.¡лены. Это может служить аргументом в пользу того, что тРНК E.coll имеют сходную функциональную топографию в процессе элонгации.

Список работ, опубликованных по теие диссертации

1. Abdurashldova G.G., ïavetkova Е.А. and Budowsky E.I., Nucleotiûe resldues or tRNA, directly Interacting with proteins wlthlii the complexes oi the 3QS suburilt of E.coll rlbosomes wlth poly(U)

and NAcPhe-tRNAPhe// FEES Lett. - 1989. - V. 243. - P. 299-302.

2. Abdurashidova G.C., Tsvetltova E.A. and Budow3ky E.I. Determination ol the tENA. nucleotide residues dlrectl. Interacting with proteins in poat- and pretranslocated ribosomal complexes// FEDS Lett. - 1990. - V. 2b9. - P. 398-401.

3. Abdurashidova G.C., Tsyetkova E.A. and Budowsky E.I. Direct tENA-proteln interactions In rlbosomal coralexes // Kucl. Acida Reg. - 1991. - V. 19. - P. 1909-1915.