Гликозилхлорид N,N-диацетилнейраминовой кислоты в синтезе полипренилсиалилфосфатов - предполагаемых интермедиатов биосинтеза полисиаловых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО РАН

На правах рукописи

ШПИРТ Анна Михайловна

□□3455362

ГЛИКОЗИЛХЛОРИД Д^-ДИАДЕТИЛНЕЙРАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ В СИНТЕЗЕ ПОЛИПРЕНИЛСИАЛИЛФОСФАТОВ -ПРЕДПОЛАГАЕМЫХ ИНТЕРМЕДИАТОВ БИОСИНТЕЗА ПОЛИСИАЛОВЫХ КИСЛОТ

02.00.10 — Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

rf ч "- Н 2008

Москва 2008

003455362

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов Учреждения Российской академии наук Института органической химии им Н.Д. Зелинского РАН НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: кандидат химических наук

Кононов Леонид Олегович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор химических наук

Возный Яков Васильевич кандидат химических наук Пазынина Галина Валентиновна ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Государственное образовательное

учреждение Высшего профессионального образования «Московский педагогический государственный университет», химический факультет

Защита диссертации состоится "23" декабря 2008 г. в К) часов на заседании Диссертационного совета Д 002.222.01 по химическим наукам при Учреждении Российской академии наук Института органической химии им Н.Д. Зелинского РАН (ИОХ РАН) по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинский проспект, д. 47, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН. Автореферат разослан "21," ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор химических наук

Родиновская Л. А.

Общая характеристика работы

Актуальность работы:

Сложные углеводные молекулы, содержащие ТУ-ацетилнейраминовую кислоту (одна из сиаловых кислот, Neu5Ac), являются важнейшими природными соединениями, определяющими протекание целого ряда биологических процессов. В природе известны полимерные формы Neu5Ac — полисиаловые кислоты (ПСК), состоящие из повторяющихся блоков с а(2->8)-, а(2-»9)- или чередующимися а(2-»8)/а(2-»9)-гликозидными связями. Молекулы ПСК являются полианионами, обладающими набором уникальных физико-химических свойств. ПСК встречаются в гликопротеинах эмбриональных нервных клеток позвоночных, в коре головного мозга человека. Защитные капсулы ряда возбудителей менингита, таких как, например, Escherichia coli Kl, К92, Neisseria meningitidis типов В и С, состоят из ПСК. Они определяет иммунологическую специфичность этих бактерий и их способность поражать нервные ткани, являясь, таким образом, одним из важнейших факторов вирулентности. По своей структуре ПСК бактерий близки ПСК человека.

В то время как биосинтез ПСК у млекопитающих (в том числе у человека) хорошо изучен, в биосинтезе бактериальных ПСК остается ряд неясностей, в частности, невыясненными остаются начальные стадии этого процесса. В настоящее время предполагается, что роль первичного гликозил-акцептора выполняет полипренилсиалилфосфат, образование которого инициирует биосинтез ПСК у бактерий. Этот ключевой интермедиат является неустойчивым соединением, которое до сих пор не удалось выделить из природного источника, и его структура была определена косвенными методами. В то же время точное знание строения первичного сиалил-акцептора позволило бы разработать новые подходы к синтезу селективных ингибиторов биосинтеза бактериальных ПСК. Для окончательного прояснения вопроса о его структуре требуется провести синтез полипренилсиалилфосфата и проверить экспериментально, является ли он субстратом сиалилтрансфераз — ферментов, ответственных за биосинтез ПСК. Химический синтез этого соединения ранее не был осуществлен и является актуальной задачей химии углеводов. Поскольку конфигурация аномерного центра в природном полипренилсиалилфосфате неизвестна, необходимо разработать методы, приводящие к получению как а-, так и Р-фосфатов Neu5Ac, и в том числе соответствующих полипренилсиалилфосфатов.

Подходы к синтезу (3-фосфатов Neu5Ac простого строения разработаны достаточно хорошо, тогда как направленный синтез а-фосфатов Neu5Ac в литературе не описан. Процесс получения сиалилфосфатов является частным случаем реакции сиалштирования — гликозилирования производными KeuSAc. Разработка новых

методов эффективного введения остатков сиаловых кислот является одной из фундаментальных проблем современной биоорганической химии. Недавно показано, что на результат сиалилирования существенно влияет характер замещения атома азота нейраминовой кислоты. Большинство успешных препаративных синтезов сиалоконъюгатов было осуществлено с применением производных нейраминовой кислоты, содержащих один ацетильный остаток у атома азота. В то же время в последние годы появились сообщения о том, что использование для синтеза сиалоолигосахаридов тиогликозидных производных Лг,Лг-диацетилнейраминовой кислоты имеет значительные преимущества: реакции гликозилирования идут значительно быстрее, продукты гликозилирования образуются с бблылими выходами и высокой стереоселективностью. Однако причины влияния удаленного заместителя у атома азота на результат реакции гликозилирования до сих пор оставались невыясненными. Поэтому необходим поиск новых сиалил-доноров с модифицированными заместителями у атома азота и исследование их реакционной способности в сравнении с известными .^-ацетильными производными.

Цель работы:

Данная диссертационная работа посвящена исследованию реакционной способности гликозилхлоридов нейраминовой кислоты (сиалилхлоридов) с одной и двумя ацетильными группами у атома азота и их применению для синтеза ранее неизвестных полипренилсиалилфосфатов — предполагаемых интермедиатов биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот.

Научная новизна и практическая ценность работы:

Впервые предложен новый гликозил-донор нейраминовой кислоты — гликозилхлорид Аг,Лг-диацетилнейраминовой кислоты — и изучена его реакционная способность в реакциях с Ы-, 8- и О-нуклеофилами в сравнении с гликозилхлоридом Л'-ацетилнейраминовой кислоты. Показано, что гликозилхлорид Д'/У-диацетил-нейраминовой кислоты гладко реагирует с заряженными нуклеофилами в отсутствие промотора.

Предложен новый эффективный метод синтеза сиалилфосфатов, основанный на реакции О-ацетилированных гликозилхлоридов Аг-ацетил- и Д'.Л'-диацетил-нейраминовых кислот как с защищенными, так и с незащищенными фосфатными нуклеофилами. Установлено, что стереоселективность реакции зависит как от природы фосфатного нуклеофила, так и от числа ацетильных групп у атома азота сиалилхлорида. Показано, что независимо от типа сиалилхлорида реакция с алкиламмониевыми солями дибензилфосфорной кислоты приводит к (З-сиалилфосфатам. В то же время при реакции сиалилхлоридов с солями

монозамещенной фосфорной кислоты образуются смеси фосфатов Neu5Ac с преобладанием p-аномеров при использовании гликозилхлорида N-ацетил-нейраминовой кислоты и а-аномеров в случае Л^Л-диацетильного производного. Впервые получены О-ацетилированные фосфат iV-ацетилнейраминовой кислоты с а-конфигурацией, а также а- и р-фосфаты ДЛ'-диацетилнейрамшювой кислоты.

Изучено взаимодействие широкого круга гликозилгалогенидов с новым полимерным реагентом на основе ионообменной смолы Amberlyst А-26 в дибензилфосфатной форме. Установлено, что основными продуктами являются дибензилгликозилфосфаты, образующиеся с высокими выходами. Это первый пример использования полимерного фосфатного реагента для синтеза гликозилфосфатов.

В ходе исследования разработан новый эффективный метод синтеза гликаля Neu5Ac, основанный на взаимодействии JV-ацетилсиалилхлорида с динатрийгидрофосфатом в кипящем ацетонитриле. Этот метод значительно упрощает получение больших количеств гликаля — важного синтетического блока в химии сиаловых кислот.

С использованием предложенного в данной работе нового гликозил-донора — N,N-диацетилсиалилхлорида — и разработанных методов получения сиалилфосфатов впервые синтезированы полипренилсиалилфосфаты — предполагаемые интермедиаты биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот. Полученные соединения переданы в Университет Ганновера (ФРГ) для изучения их активности в качестве субстратов бактериальных сиалилтрансфераз.

Публикации и апробация работы:

По материалам диссертации опубликовано четыре статьи и тезисы девятнадцати докладов на научных конференциях. Результаты диссертационной работы были представлены автором на 9 международных и 10 российских конференциях (из них 5 устных докладов, в том числе 3 на международных конференциях).

Структура и объем работы:

Диссертация изложена на 211 страницах и состоит из введения, литературного обзора на тему «Спектроскопия ЯМР 31Р гликозилмонофосфатов», обсуждения результатов, выводов, экспериментальной части и приложения. Список цитируемой литературы состоит из 155 наименований.

Основное содержание работы

1. Синтез гликозилхлорида ЛУУ-диацетилнейраминовой кислоты

Интересующий нас гликозилхлорид с двумя ацетильными группами у атома азота в литературе описан не был. Гликозилхлорид 2Ь был получен нами с количественным выходом из известного перацетилированнного производного 1Ь, используя те же условия, что и для синтеза известного гликозилхлорида 2а с одной ацетильной группой у атома азота. Было найдено, что новое соединение 2Ь достаточно стабильно и может храниться в течение нескольких месяцев при низкой температуре (Схема 1).

2. Реакции гликозилхлоридов нейраминовой кислоты с нуклеофилами

Далее мы исследовали реакционную способность хлорида 2Ь в реакциях с различными нуклеофилами в сравнении с известным гликозилхлоридом А'-ацегилнейрамшювой кислоты 2а.

2.1 Реакции с незаряженными О-нуклеофилами Сспиртами)

На первом этапе была оценена реакционная способность гликозилхлоридов 2а,Ь в реакциях с незаряженными О-нуклеофилами. В качестве модельных реакции мы выбрали сиалилирование простых спиртов — МеОН и аллилового спирта (А110Н). Все реакции хлоридов 2а,Ь со спиртами проводили в отсутствие промотора, т.к. ранее было показано, что гликозилхлорид 2а с одной ацетильной группой у атома азота реагирует с МеОН за 1 ч без добавления промотора, давая с высоким выходом а-метидгликозид За (а:р = 30:1) (Схема 2). Как и ожидалось на основании данных об ДЛГ-диацетилтиогликозидах, гликозилхлорид 2Ь оказался более реакционноспособным, чем хлорид 2а. Его реакция с МеОН завершилась через 0.5 ч, давая с высоким выходом (-100%) метилгликозид ЗЬ в качестве единственного продукта (таблица 1, опыт 1). Однако неожиданно при реакции гликозилхлорида 2Ь с МеОН наряду с а-метилгликозидом ЗЬ образовалось существенное количество р-аномера (таблица 1, опыт 1).

Схема 1

-100%

Схема 2

ОАс ОАс ОАс

¿АсО ¿АсО I ОАс

АсО' АсМ

2а,Ь

"АсО"

АсМ- , ¿АсО

За,Ь: = Ме 4а,Ь = АН

АсМ-I

X

ОАс 5а, Ь

С02Ме

а Х = Н

Ь: X = Ас

Таблица 1. Результаты реакций гликозилхлоридов 2а,Ь с простыми спиртами

Опыт ИОН гликозпл время выход гликозида а/р продукты

хлорид реакции/ч

1 МеОН" 2Ь 0.5 -100%' 2/1 только ЗЬ

2 МеОН6 2а 3 -100%' 12/1 только За

3 МеОН5 2Ь 3 -100%' 3/1 только ЗЬ

4 А110Н" 2а 24 77%г 6/1 4а + 5а (2%г)

5 А110Н" 2Ь 48 47%'(4а) + 29%'(4Ь) 1.3/1 (4а)+ 1.9/1 (4Ь) 4а + 4Ь

6 А110Н5 2а 24 89%г 3/1 4а + 5а (4%*)

7 А110Н6 2Ь 48 19%'(4а) + 58%'(4Ь) 1.4/1 (4а) + 1.4/1 (4Ь) 4а + 4Ъ

" Реакция проводилась в чистом спирте. ° Реакция проводилась в смеси ЯОН-МеСК (1:1). ' Выходы после жидкостной хроматографии. г Выходы рассчитаны из соотношения соответствующих сигналов в спектре ЯМР *Н с учетом масс смесей после жидкостной хроматографии.

Стереоселективность реакции уменьшается, если проводить ее в смеси МеОН-МеСЫ (1:1). При этом гликозилхлорид 2а давал смесь аномеров а:|3 = 12:1 (таблица 1, опыт 2), а гликозилхлорид 2Ь с двумя ацетильными группами у атома азота приводил к еще большему падению стереоселективности (сс:Р = 3:1, таблица 1, опыт 3).

Гликозилхлорид 2а реагировал с чистым А110Н без промотора, образуя смесь аномеров с преобладанием а-изомера 4а (а:Р = 6:1) (таблица 1, опыт 4). Как и в случае с МеОН, проведение реакции с А110Н в МеСЫ привело к ухудшению стереоселективности (таблица 1, опыты 4,6), существенно возрастала доля р-изомера (а:р = 3:1, таблица 1, опыт 6).

Гликозилхлорид 2Ь вступал в реакцию с чистым А110Н гораздо медленнее, чем гликозихлорид 2а и через 48 ч давал соответствующий аллилгликозид 4Ь с выходом 29% в виде смеси аномеров (а:Р = 1.9:1) (таблица 1, опыт 5). В процессе реакции в значительной степени происходило М-дезацетилирование, которое привело к аллилгликозиду 4а с выходом 47% (а:Р = 1.3:1, таблица 1, опыт 5). Реакция гликозилхлорида 2Ь с А110Н в МеСЫ также сопровождалось ЛЧцезацетилированием, но в этом случае выход аллилгликозида 4Ь был выше (4Ь: 58% (сг.р = 1.4:1), 4а: 19% (а:Р = 1.4:1), таблица 1, опыт 7).

Строение полученных сиалозидов было доказано с помощью спектроскопии ЯМР 'Ни "С.

Таким образом, показано, что гликозилхлориды 2а,Ь реагируют с МеОН и А110Н без добавления промотора, причем стереоселективность реакции зависит от растворителя. Во всех исследованных случаях стереоселективность гликозилирования простых спиртов гликозилхлоридом 2Ь была значительно ниже, чем при использовании гликозилхлорида 2а.

2.2 Реакции с заряженными ЛГ- и Б-нуклеофилами

Следующей стадией явилось исследование реакций гликозилхлорида 2Ь с отрицательно заряженными нуклеофилами. Гликозилхлорид ./У-ацетилнейраминовой кислоты 2а хорошо себя зарекомендовал в реакциях такого типа, приводя к продуктам замещения с высокой а-стереоселективностью (Схема 3). Мы вводили гликозилхлорид 2Ь во взаимодействие с и 5-нуклеофилами — №N3, тиофенолом и калий этилксантогенатом — в условиях, которые ранее были описаны для гликозилхлорида 2а. Выходы всех реакций А^ТУ'-диацетилсиалилхлорвда 2Ь были сравнимы с литературными данными для реакций Л^-ацетилсиалилхлорида 2а. Строение полученных соединений было установлено с помощью спектроскопии ЯМР 'Н, 13С и масс-спектрометрии.

Схема 3

ОАс

ОАс

6Ь только а, 82%

ОАс ¿-1,ОАс С1

1АСО

2а,Ь

РЬБН

аХ=Н Ь: X = Ас

ОАс

С02Ме

с^З^Г

' АсО 7Ь" 91%. а Р = 141

АсО1 АсГ4 _ , ¿АсО

для /7: 8Ь: только а, 70% для м: 8Ь- только а, 76%

Условия реакций:

г СН2С12 / Ви^НвО,,, №НС03 (водн.) И: ацетон ш: 95% ЕЮН

Таким образом, показано, что гликозилхлорид 2Ь гладко реагирует с заряженными И- и Б-нуклеофилами. Получены новый гликозилазид а-6Ь (выход 82%) и потенциальные сиалилдоноры: тиогликозид а-7Ъ (а:р = 14:1, выход 91%) и новый гликозилксантогенат а-8Ь (выход 70 - 76%).

2.3 Реакции с фосфатными нуклеофилами 2.3.1 Реакции с солями дибензилфосфорной кислоты 2.3.1.1 Реакции сиалилхлоридов 2а,Ь дибензилфосфорной кислоты

алкиламмониевыми солями

Как показали опыты с И- и Б-нуклеофилами (см. раздел 2.2), гликозилхлориды нейраминовой кислоты 2а,Ь гладко реагируют с отрицательно заряженными нуклеофилами. К таким нуклеофилам относятся соли также фосфорной кислоты и ее эфиры. В поиске подходов к синтезу полипренилсиалилфосфатов мы изучили реакции гликозилхлоридов 2а,Ь с фосфатными нуклеофилами простого строения. Для этого моноацетшшрованный гликозилхлорид 2а вводили в реакцию с алкиламмониевыми солями дибензилфосфорной кислоты (см. Схему 4), которые готовили смешением дибензилфосфорной кислоты и основания (амин или аммониевое производное). Следует отметить, что во всех случаях в реакцию вводили реагент, содержащий небольшой избыток (-10%) дибензилфосфорной кислоты, чтобы избежать основных условий, способствующих образованию гликаля 5а из хлорида 2а на стадии приготовления фосфатного реагента при неточной дозировке основания.

Схема 4

о Я

.ОАо " ОАс ,0А<=

¿Г.ОАСС1 У-0-^в°пВП ^Г°ДС? 0В° ^°А0С

CH-.CN ' ДсМ-А-'М

^ АсО ^ АсО £ ОАс

а: X = Н Ь: X = Ас

У = /-Рг2Е1МН:только р, 72%, 9Ь У = /-Рг2Е(МН' только |3,74%

Выяснилось, что гликозилирование хлоридом 2а самой дибензилфосфорной кислотой не идет, что находится в полном соответствии с нашими данными о том, что гликозилхлорид 2а плохо реагирует с незаряженными нуклеофилами (см. раздел 2.1). Было также найдено, что для уменьшения выхода гликаля 5а, образующегося в результате реакции элиминирования, необходимо использовать четырехкратный избыток фосфатного реагента,

Применение алкиламмониевых солей дибензилфосфорной кислоты в качестве нуклеофилов позволило стереоселективно получить гликозилфосфат Р-9а с хорошими выходами (63% и 72% в зависимости от используемой соли дибензилфосфорной кислоты). Продукт был охарактеризован спектроскопией ЯМР 'Н, 13С и 31Р.

Гликозилхлорид Л^-диацетилнейраминовой кислоты 2Ь вводили во взаимодействие только с диизопропилэтиламмниевой солью дибензилфосфорной кислоты, синтез которой значительно проще, чем тетрабутиламмониевой соли. Выход продукта Р-9Ь (74%) и стереоселективность реакции не отличалась от результатов реакции с гликозилхлоридом 2а. Структура гликозилфосфата Р-9Ь полностью подтверждена спектроскопией ЯМР 'Н, ЬС и 31Р и масс-спектрометрией.

Таким образом, реакции сиалилхлоридов 2а,Ь с фосфатными нуклеофилами протекают с сохранением конфигурации аномерного центра (т.е. с образованием Р-фосфатов р-9а,Ь), в то время как реакции с N - и Б-нуклеофилами приводят главным образом к сиалозидам с обращенной конфигурацией аномерного центра (см. раздел 2.2). Это может объясняться тем, что небольшой избыток дибензилфосфорной кислоты, содержащийся в фосфатном реагенте, по-видимому, способствует аномеризации, и в результате образуется только термодинамически более выгодный продукт с р-конфигурацией аномерного центра. Аномеризация, по-видимому, протекает через отщепление агликона (дибензилфосфат является хорошей уходящей группой) и повторную нуклеофильную атаку гликозил-катиона в клетке растворителя. Если это так, то подавление аномеризации может позволить получить а-фосфат нейраминовой кислоты.

Один из возможных подходов заключается в применении фосфатного реагента, не содержащего избытка кислоты. Этого можно достигнуть, например, при использовании фосфатного реагента на основе ионообменных смол. Другой возможный подход мог быть основан на использовании фосфатного нуклеофила, являющегося худшей уходящей группой, чем дибензилфосфат-анион, например, незащищенного фосфат-аниона. Мы реализовали оба подхода, которые детально рассмотрены в разделах 2.3.1.2 и 2.3.2.

2.3.1.2 Реакция гликозилгалогенидов с дибензилфосфатом на ионообменной смоле

2.3.1.2.1 Синтез полимерного фосфатного реагента ТУ

В качестве полимерной подложки нами была использована коммерчески доступная ионообменная смола АтЬеНуэ! А-26 (Схема 5).

Схема 5

^ №НС03 (нас.)^ (^-МЛаз^-ОН (II)--2-1ММе3+ НС03"(Ш)

Вп20Р(0)0Н

~0Р(0)(0Вп)2 (IV)

Эта макропористая смола, часто используемая в органическом синтезе в неводных растворителях, представляет собой высокосшитый полистирол-дивинилбензольный сополимер, не растворяющийся и не набухающий в органических растворителях. Требуемую нам смолу (IV) в дибензилфосфатной форме получали обработкой избытком раствора (Вп0)гР(0)0Н в смеси МеСЫ-Н20 (1:1) смолы III в гидрокарбонатной форме, в свою очередь полученную из смолы в хлоридной форме I через смолу в гидроксидной форме II.

г\ „ 1 м №ОН

О,/—Ше3 -С1 (I)-«■

1-1У

Ме3Ы+-Х АтЬег^ А-26

2.3.1.2.2 Реакции гликозилгалогенидов с полимерным фосфатным реагентом IV.

Смолу IV вводили в реакции с гликозилхлоридами 2а,Ь, растворенными в МеСИ (Схема 6, таблица 2).

Найдено, что взаимодействие гликозилхлоридов 2а,Ь с ионообменной смолой IV в дибензилфосфатной форме без добавления промотора с высокими выходами приводит к смеси а- и Р- изомеров дибензилфосфатов 9а,Ь (см. Схема 6, табл. 2), причем соотношение изомеров зависит от заместителя у атома азота (см. табл. 2). Как и ожидалось, применение полимерного фосфатного реагента, не содержащего избытка кислоты, действительно повысило долю а-изомера в смеси сиалилфосфатов 9а,Ь. В то же время, в обоих случаях все еще преобладал Р-аномер.

Схема 6

О-Ше3*-0Р(0)(0Вп)2 л „х---О IV__

АсО-^^А^на! ---

2а,Ь, 10-17

.ОАс

<С_.ОАс >

СН3СМ

ОВп

9а,Ь, 18-25

АсО

и

АсО ^ОАс АсО

•Д_ - ¿АсО к

2а 9а- X - Н 10'18- Я = К3 = ОАс, ^ = = Н 13,21: И = И2 = ОАс, = И3 = Н

2ь[эЬ" Х = Ас 11,19; Я = Я2 = ОАс, К1 = Я3 = Н 14, 22: И3 = ^ = ОАс, Я = ^ = Н 12,20 Я1 = ^ = ОАс, = I*2 = Н

^ -^ипс ^-инс ,ОАс ^ОАс

АсО АсО АсНЫ РШММ

15,23 16,24 17 (а:р = 1'1.5), 25 (а:|3 = 1:1 4)

Таблица 2. Результаты реакций гликозилгалогенидов с фосфатным реагентом на основе ионообменной смолы АтЬег^ А-26 в дибензилфосфатной форме

__О с »—^Алл/На! время реакции/ч ^о § ОВп <х:Р выход

2а,На1 = С1 16 9а 1:5 88%

2Ь,На1 = С1 16 9Ь 1:1.4 90%

10, На1 = Вг 96 18 только р 95%

11, На1 = Вг 96 19 только Р 92%

12, На1 = Вг 24 20 только а 15%

13, На1 = Вг 24 21 только р 99%

14, На1 = Вг 24 22 только а 46%

15, На1 = Вг 120 23 только Р 96%

16, На1 = С1 96 24 только а 3%

17, На1 = Вг 96 25 1:1.4 40%

Предложенный метод был расширен для синтеза гликозилфосфатов других Сахаров (см. Схема 6, табл. 2). Взаимодействие ацетобромппокозы 10, ацетобромгалактозы 11, I, - ацет обр о м фу коз ы 13, ацетобромлактозы 15 со смолой IV привело к целевым

дибеюилгликозилфосфатам с высокими выходами (92-99%) (табл. 2). В случае производных маннозы 12, Ь-рамнозы 14, 2-ацетамидо-2-дезоксиглюкозы 16 и 2-дезокси-2-фталимидоглкжозы 17 наблюдалось образование побочных продуктов, поэтому в этих случаях использование полимерного фосфатного реагента не имеет препаративной ценности. Все полученные соединения охарактеризованы спектрами ЯМР 'Н, 13С, 3|Р и масс-спектрометрией.

Данная реакция является первым примером использования ионообменной смолы в качестве гликозил-акцептора в реакциях гликозилирования.

2,3.2. Реакция гликозилхлоридое 2а,Ь с солями ортофосфорной кислоты Второй подход к синтезу а-фосфата нейраминовой кислоты заключался в использовании уходящей группы худшей, чем дибензилфосфат-анион, например, незащищенного фосфат-аниона.

2.3.2.1. Реакции сиалилхлоридое 2а,Ь с динатрийгидрофосфатом Среди дизамещенных фосфатов самым простым и доступным источником незащищенного фосфатного аниона является К'аоНРС^.

Гликозилхлорид 2а при комнатной температуре в МеСЫ не реагировал с безводным динатрийгидрофосфатом, но при кипячении гладко превращался в гликаль 5а (Схема 7). Выделить продукты гликозилирования при этом не удалось.

Синтез гликаля 5а, осуществленный в данной работе, основан на использовании дешевого реагента (Ма2НРО,;), а процедура выделения целевого продукта сводится к простому фильтрованию реакционной смеси. Такой подход является новым высокоэффективным синтезом гликаля Лг-ацстиднейраминовой кислоты — важного синтетического блока в химии сиаловых кислот — и существенно упрощает получение больших количеств этого соединения.

При кипячении гликозилхлорида 2Ь в МеСИ в присутствии №2НР04 в течение 3 ч вместо ожидаемого гликаля 5Ь с выходом 95% был выделен гликаль 5а (Схема 8).

Схема 7

АсО

^^¡рСОгМе ОАс

5а, 95%

2а

ОАс ■С1.0АС С1

№2НРО.

Схема 8

ОАс

«ОАс

ОАс

АсО' Ас-

'¿г^Г00*' СН3СЫ ' Ас0Ас25^ГС°2Ме + АС°/

АсО

2Ь

ОАс

5Ь №2НР04

7\ сн3сч д

АсНМ-

СО,Ме

Гликаль 5Ь удалось синтезировать при проведении реакции гликозилхлорида 2Ь с Ка2НР04 при комнатной температуре (25 °С), но реакция оказалась очень длительной (1 месяц) (Схема 8).

Дополнительные эксперименты показали, что в условиях реакции гликаль 5Ь не превращается в гликаль 5а, который образуется из сиалилхлорида 2Ь.

Таким образом, реакции хлоридов 2а,Ь с дизамещенным фосфатом (№2НР04) приводят не к нуклеофильному замещению, а исключительно к элиминированию, что, по-видимому, является следствием высокой основности гидрофосфат-аниона. В связи с этим аналогичные соли с другими катионами в реакциях с сиалилхлоридами 2а,Ь не исследовались.

2.3.2.2 Реакции сиалилхлоридов 2а,Ъ с тетрабутиламмонийдигидрофосфатом

На следующем этапе в качестве пуклеофильных реагентов были изучены однозамещенные соли фосфорной кислоты, являющиеся более слабыми основаниями, чем дизамещешше фосфаты. Известно, что однозамещенная тетрабутиламмониевая соль фосфорной кислоты успешно применяется для синтезов гликозилфосфатов. Реакции гликозилхлоридов 2а,Ь с ВщМН2РС>4 (4.5 экв.) в МеСЫ (20 °С, 3.5-4 ч) привели к смеси гликозилфосфатов а-2ба,Ь, (3-26а,Ь и 27а,Ь, а также гликалей 5а,Ь (Схема 9).

Схема 9

о

ОАС •¿-^.ОАс С1

Ви^-О-^ОН но

АсО1 АсП . ¿АсО

С02Ме

СН^

а: X = Н Ь- X = Ас

2а,Ь

ОАС _

•С^ОАс С02Ме Д

AcN^¿■Г■¿/ и О" *МВи4 ¿АСО

26а: а/р~ 1:1.6, 59% 2бЬ: а/3 - 5:1,60%

ОАс

¿-^>ОАс С02Ме

АсО' АсК , ¿АСО

-О" *МВи4 + 5а,Ь

27а: 11% 27Ь: 4%

Скорость реакций гликозилхлоридов 2а,Ъ с дигидрофосфат-анионом (полная конверсия достигалась за 4 ч) была заметно выше, чем с дибензилфосфат-анионом (12 ч). В результате реакции с гликозилхлоридом 2а с выходом 59% была получена смесь аномеров 26а (а:(5 =1:1.6), которые были разделены с помощью хроматографии на обращенной фазе С-18. Гликозилхлорид 2Ь с двумя ацетильными группами у атома азота реагировал с Ви4>Ш2Р04 в тех же условиях, что и хлорид 2а с одной ацетильной

группой у атома азота, и давал гликозилфосфат 26Ь (а:|3 =5:1) с выходом 60%. Необходимо подчеркнуть, что при применении гликозилхлорида 2а с одной ацетильной группой у атома азота продукт 26а представлял собой смесь приблизительно равных количеств а- и Р-аномеров (а:р = 1:1.6), тогда как при использовании Лг,Аг-диацетшшрованного гликозилхлорида 2Ь заметно преобладал аномер с а-конфигурацией (а:р = 5:1).

В качестве побочных продуктов реакций образовались гликали 5а, Ь и фосфодиэфир 27а,Ь (Схема 9). Строение гликозилфосфатов 26а,Ь и фосфодиэфиров 27а,Ь доказано с помощью спектров ЯМР 'Н, 13С, 31Р и масс-спектрометрии.

Таким образом, реакция гликозилхлорида 2Ь с ВщМТ-^РС^ протекает с высокой а-стереоселективностью и с ее помощью впервые осуществлен синтез гликозилфосфата нейраминовой кислоты с а-конфигурацией аномерного центра.

2.3.2.3 Реакции гликозилхлорида 2а со смолами АтЬеНуя! А-26 в фосфатных формах (V- VIII)

Успешные синтезы а- и р-гликозилфосфатов 26а,Ь реакцией хлоридов 2а,Ь с ВщШ^РС^ (см. раздел 2.3.2.2), а также обнаружение того, что применение полимерного противоиона в реакциях дибензилфосфат-аниона с 2а,Ь (см. раздел 2.3.1.2) позволяет повысить а-селективность гликозилирования, вызвали наш интерес к реакциям 2а,Ь с ионообменными смолами АтЬег^ А-26, (У-УШ) с неорганическим фосфатом в качестве противоиона. Были получены фосфатные реагенты на ионообменной смоле, содержащие в качестве противоионов дигидрофосфат- и гидрофосфат-анионы (ИгРО^, НРО42") в различных соотношениях, определяемых величиной рН раствора, используемого для промывки смолы (Схема 10).

Схема 10

фосфатный буфер идч

~ (№Н2Р04 + №2НР04) ^ у.^.н 7\

Q-NMe31HC03- --—-Нг^-О-^Мез'Т V (РН 7)

,„ с определенном VII (рн 8)

величиной рН VIII (рН 9)

Фосфатные реагенты (У-УШ) с полимерным противоионом вводили во взаимодействие с гликозилхлоридом 2а, растворенным в МеСЫ (Схема 11). Однако в этих условиях основным процессом являлась не реакция замещения (гликозилирование), а элиминирование, и во всех случаях основным выделенным продуктом был гликаль 5а (Схема 11, табл. 3).

Схема 11

О

ОАс ОАс II

—у»ОАс CI NMe3+"Y <С_^ОАс ОАс HN'^

АсО'-А-о-^-СООМв _V'VI11 Ac0»~¿V0>C02Me + "Ч*0^ j

CH3CN ACH^W"

AcO

2a 5a 28a, 9%

только для VI (pH 7)

Таблица 3. Взаимодействие гликозилхлорида 2а с полимерными фосфатными реагентами V-VIII в MeCN.

гликозилхлорид 2а фосфатный реагент Время реакщш/ч Выход 5а

0.093 ммоль V (рН 6, 660 мг) 500 91 %

0.088 ммоль VI (рН 7, 600 мг) 96 29%

0.092 ммоль VII (рН 8, 660 мг) 96 62%

0.099 ммоль VIII (рН 9, 600 мг) 3 47%

Наивысший выход гликаля (91%) был достигнут при использовании смолы V (рН 6), хотя для этого требовалось значительное время, что снижает препаративную ценность данного метода синтеза гликаля 5а. Скорость реакции гликозилхлорида 2а со смолой VIII (рН 9) была наиболее высокой, но по данным ТСХ происходило О-дезацетилирование, что снижало выход продукта 5а. О-Дезацетилирование и, следовательно, снижение выхода гликаля N-ацетилнейраминовой кислоты 5а наблюдалось также и во всех остальных случаях.

Реакцией гликозилхлорида 2а со смолой VI (рН 7) была получена смесь гликаля 5а и N-гликозида 28а (5а:28= 3.2:1), который мог образоваться по реакции Риттера из хлорида 2а и MeCN. К сожалению, данные ЯМР 'Н, 13С и масс-спектрометрии не позволили сделать вывод о конфигурации аномсрного центра в производном 28а.

Таким образом, гликозилхлорид 2а реагировал со смолой Amberlyst А-26 в фосфатных формах (V-VIII), давая гликаль Neu5Ac 5а. Однако или выходы продуктов этой реакции были низкие, или реакция протекала медленно, поэтому взаимодействие гликозилхлорида 2Ь с двумя ацетильными группами у атома азота со смолами (V-VIII) не исследовали.

3. Синтез интермедиатов биосинтеза полисиаловых кислот

Успешные синтезы фосфатов нейраминовой кислоты (раздел 2.3.2.2) позволили, используя накопленный опыт, перейти к синтезу полипренилсиалилфосфатов.

Как уже отмечалось (стр. 1), полипренилсиалилфосфат постулирован как ключевой интермедиат в биосинтезе бактериальных ПСК. Из-за крайне малой доступности природный ундекапренилфосфат Neu5Ac 29а (Схема 12) никогда не был выделен в индивидуальном состоянии. В связи с этим структура 29а может быть окончательно установлена только химическим синтезом, а поскольку конфигурация аномерного

центра Лг-апетилнейраминовой кислоты в природном сиалилфосфате 29а достоверно не известна, то необходимо получить оба изомера. Ранее попытки получить полипренилсиалилфосфат 29а не предпринимались.

Схема 12

29а: п = 8. т = 2 29Ь: п = 6-8, т = 3

В качестве реалистичного и практически значимого целевого продукта был выбран полипренилсиалилфосфат 29Ь, включающий морапренильный остаток, т.к. с одной стороны растительный морапренол значительно более доступен, чем бактериальный ундекапренол, а с другой стороны показано, что он может быть с успехом использован в ферментативных реакциях вместо ундекапренола.

3.1. Планирование синтеза полипренилсиалилфосфатов

Детальный ретросинтетический анализ привел к выводу о том, что возможны два подхода к синтезу целевого соединения 29Ь. Путь А предполагает использование в качестве нуклеофила защищенного гликозилфосфата 26а,Ь, а в качестве электрофила полипренильные производные 30. При реализации пути В нуклеофилом является полипренилфосфат 32, а электрофильным компонентом производное нейраминовой кислоты 31 (Схема 13).

Схема 13

Мы экспериментально изучили возможность использования обоих подходов, причем первым был исследован путь А, так как гликозилфосфаты 26а,Ь уже были нами синтезированы.

3.2. Синтез защищенного фосфодиэфчра 34а,Ь

3.2.1 Взаимодействие гликозилфосфата Н-аиетптейрамиповой кислоты с моуапретатрихлораиетгтидатом (путь А)

Гликозилфосфат №и5Ас 26а с а-конфигурацией аномерного центра вводили во взаимодействие с известным морапренилтрихлорацетимидатом 33 в СН2С12 (Схема 14).

Фосфодиэфир а-34а был зафиксирован в реакционной смеси с помощью спектроскопии ЯМР 3|Р, а интегрирование соответствующих сигналов позволило оценить его выход, который составил -5%. В ходе этой реакции не затрагивается аномерныа центр №и5Ас, поэтому его конфигурация не изменяется и конфигурация полученного фосфодиэфира 34а совпадает с конфигурацией исходного гликозилфосфата а-26а. Это обстоятельство позволило получить спектральные характеристики для а-изомера тетрабутила.чмонисвой соли целевого фосфодиэфира 34а, использованные нами впоследствии для анализа состава реакционных смесей, полученных по пути В (см. далее).

Схема 14

■—^ОАс С02Ме ^ \ г

~ 5% (по данным ЯМР 31Р )

Проведенное исследование показало, что, к сожалению, путь А не может служить препаративным методом получения полипренилсиалилфосфатов 29Ь, и поэтому был исследован также путь В.

3.2.2 Взаимодейстивие сиалилхлоридов с морапреншфосфатом (путь В) Использование пути В для синтеза морапренилгликозилфосфатов является новаторским, так как до сих морапренилфосфаты Сахаров получали другими методами. Путь В предполагает сиалилирование полипренилфосфата 32 электрофильным производным нейраминовой кислоты 31. Известен целый ряд сиал ил-доноров, которые в принципе могли бы быть использованы для гликозилирования полипренилфосфата 32. Однако все они требуют промоторов, которые могут затронуть изопреноидную цепь полипренола и привести к

образованию побочных продуктов. Сиалилгалогениды 2а,Ь лишены этих недостатков и хорошо зарекомендовали себя в проведенных нами реакциях с фосфатными нуклеофилами простого строения (2.3). Преимуществом использования сиалилхлоридов 2а,Ь являлось также то, что защищенные фосфодиэфиры 34а,Ь могут быть получены в одну стадию из легко доступных предшественников. Учитывая, что, как было показано нами, гликозилхлориды нейраминовой кислоты реагируют с тетрабутиламмониевыми солями фосфатных реагентов, ранее известный морапренилфосфат 32 был использован в виде тетрабутиламмониевой соли.

3.2.2.1 Реакция гликозилхлорида Ы^-диацетилнейраминовой кислоты 2Ь с тетрабутиламмонийморапренилфосфатом

Для получения целевого фосфодиэфира а-29Ь с а-конфигурацией аномерного центра была использована реакция полипренилфосфата 32 с гликозилхлоридом 2Ь с двумя ацетильными группами у атома азота, т.к. а-стереоселективность реакции хлорида 2Ь с ВщМ^РС^ была значительно выше, чем реакция сиалилхлорида 2а (см. раздел 2.3.2.2). Гликозилирование проводили в смеси растворителей (СП3СИ- СН2С12, 3:1), в которой хорошо растворимы оба реагента. Для минимизации побочной реакции элиминирования, приводящий к образованию гликаля 9Ь, использовался избыток полипренилфосфата 32 (Схема 15).

Схема 15

Определенные трудности вызвало отделение целевого фосфодиэфира 34Ь от избытка исходного полипренилфосфата 32. Эти два соединения похожи друг на друга: их молекулы имеют заряженную группу и длинную изопреноидную углеродную цепь. Тем не менее, нам удалось отделить большую часть реагента 32 с помощью центрифугирования (полипренилфосфат 32 плохо растворим в МеСЫ) и последующей ионообменной хроматографии. Фосфодиэфир 34Ь был получен с выходом 71% в виде смеси аномеров (а:Р = 2.5:1) с преобладанием фосфодиэфира а-34Ь с а-конфигурацией аномерного центра. Следует подчеркнуть, что хотя стереоселективность гликозилирования хлоридом 2Ь несколько уменьшилась по

сравнению с гликозилированием дигидрофосфата тетрабутиламмония (см. раздел 2.3.2.2), выход продукта реакции возрос до величин, характерных для гликозилирования алкиламмониевых солей дибензилфосфорной кислоты (см. раздел 2.3.1.1). Спектры ЯМР 'Н, 13С и 31Р и данные масс-спектрометрии подтвердили строение фосфодиэфиров 34Ь.

3.2.2.2. Реакция сиалшхлорида 2а с тетрабутиламмонийморапренилфосфатом Реакцию гликозилхлорида Ж-ацетилнейраминовой кислоты 2а с тетрабутиламмонийполипренилфосфатом 32 проводили в тех же условиях (Схема 16), что и реакцию гликозилхлорида 2Ь.

Схема 16

Ас0 34а, а р = 1 1.6, 58%

После завершения реакции избыток полипренилфосфата 32 отделяли от фосфодиэфира 34а тем же способом, что и в случае 34Ь. В результате были получены чистый Р-фосфодиэфир Р-34а (выход 28%) и аномерная смесь фосфодиэфиров а,Р-34а (а:Р = 2.5:1, 30%). Строение фосфодиэфиров 34а было подтверждено спектрами ЯМР 'Н, 13С и 31Р и данные масс-спектрометрии.

В этой части работы мы столкнулись с плохой воспроизводимостью методики очистки полипренилфосфата 34а с одной Л'-ацетильной группой у атома азота, который не всегда удавалось полностью очистить от примеси аммониевой соли полипренилфосфата 32 даже с помощью ионообменной хроматографии. Известно, что при ионообменной хроматографии полипренильных производных в МеОН происходит фракционирование супрамолекулярных агрегатов с участием полипренилфосфатов. В данном случае смешанные мицеллы, образованные из 32 и 34а, могли быть дополнительно стабилизированы за счет межмолекулярных водородных связей с участием ацетамидной группы остатка Меи5Ас. Такие мицеллы могут оказаться настолько устойчивыми, что их компоненты не поддаются фракционированию даже в условиях, которые успешно применяются для разделения других полипренильных производных. В то же время процедура выделения фосфодиэфира 34Ь с двумя ацетильными группами у атома азота воспроизводилась

достаточно хорошо, что подтверждает наши представления об определяющей роли водородных связей в стабилизации смешанных мицелл фосфодиэфира 34а и полипренилфосфата 32.

Необходимо подчеркнуть, что при использовании гликозилхлорида 2а образуется смесь аномеров с небольшим преобладанием фосфодиэфира с Р-конфигурацией, в то время как при использовании хлорида 2Ь с двумя ацетильными группами у атома азота реакция идет, главным образом, в сторону образования фосфодиэфира с а-конфигурацией аномерного центра. Следовательно, закономерности, выявленные при гликозилировании дигидрофосфата тетрабутиламмония сиалилхлоридами 2а,Ь (см. раздел 2.3.2.2), сохраняются и в случае более сложных фосфатных нуклеофилов.

Таким образом, применение гликозилхлорида Л^-диацетилнейраминовой кислоты 2Ь позволило нам разработать простой и удобный препаративный синтез защищенного полипренилгликозилфосфата Л^-диацетилнейраминовой кислоты 34Ь, тогда как использование ранее известного гликозилхлорида Л'-ацетилнейраминовой кислоты 2а натолкнулось на проблему плохой воспроизводимости процедуры выделения конечного продукта.

3.3. Удаление защитных групп из полипренилгликозилфосфатов 34а,Ь

Следующим этапом явилось удаление защитных групп с полученных фосфодиэфиров 34а,Ь. Необходимо было селективно удалить все О-ацетильные и одну из К-ацетильных групп, а также метальную защитную группу, не затронув при этом лабильную фосфодиэфирную функцию. Подбор оптимальных условий удаления защитных групп с полученных фосфодиэфиров 34а,Ь оказался нетривиальной задачей и потребовал специального исследования.

3.3.1. Постадийное -удаление защитных групп

3.3.1.1 Дезацетилирование34Ь под действием системы Е^- МеОН- ЩО

При дезацетилировании фосфодиэфира 34Ь действием системы Ме0Н-Н20

(1:6:1) с последующей ионообменной хроматографии была выделена не ожидаемая соль карбоновой кислоты 29Ь, а метиловый эфир 35 (Схема 17). Выход фосфодиэфира 35 составил 63%, его строение было подтверждено данными спектров ЯМР 'Н, 13С и 31Р и масс-спектра. Реакция сопровождалась гидролизом фосфодиэфирной связи, который привел к аммониевой соли морапренилфосфата 32, выделенной в качестве побочного продукта.

19

Схема 17

,0Ас п

<С_.ОАс С02Ме

34Ь, сер-2 5.1 ]

Н20

ЕМ

МеОН

/он о

•С^ОН С02Ме „

НО"

НО

35, а'Р ~ 1.1, ~ 63%,

Кроме того, изменилось также соотношение аномеров в продукте (а: [5 ~ 1:1) по сравнению с исходным 34Ь (а:р = 2.5:1). Это, вероятно, связано с различием в скорости гидролиза фосфодиэфирной связи в зависимости от стереохимии аномерного центра, как это было установлено нами экспериментально (см. далее раздел З.З.2.). Отмечалась также неполнота удаления ацетильных групп.

3.3.1.2 Дезацетилирование фосфодюфира 34Ь действием МеОИа Чистый метиловый эфир 35, не содержащий примесей частично О-ацетилированных соединений, удалось получить при дезацетилировании защищенного фосфодиэфира 34Ь мегилатом натрия (Схема 18).

Схема 18

,ОАс

-С">ОН С02Ме ||

НО

35, - 100%

Синтез проводили при пониженной температуре для подавления расщепления фосфодиэфирной связи. С помощью ионообменной хроматографии был выделен полипренилсиалилфосфат 35 с высоким выходом (-100%). Существенно, что при дезацетилировании №ОМе соотношение между аномерами не изменялось.

3.3.1.3 Получение незащищенного полипренилфосфата Ыеи5Ас 29Ь деметилированием

Синтезированный метиловый эфир 35 нерастворим в воде, поэтому его деметилирование проводили в двухфазной системе п-ВиОН-О.1 М КОН (водн.) (Схема 19).

Схема 19

,он п

■С^ОН С02Ме\?

Н0 35 (а:р - 1:1)

КОН (водн.)

п-ВиОН

ОН _

но

29Ь, только р (данные ЯМР 31Р)

В этой реакции был получен только р-полипренилсиалилфосфат |3-29Ь, выделенный в виде аммониевой соли с выходом 28%. Отсутствие в данном случае а-фосфодиэфира а-29Ь объясняется, по-видимому, его полным разложением вследствие гидролиза фосфодиэфирной связи, менее устойчивой, чем в р-аномере Р-29Ь.

Для повышения надежности отнесения характеристических сигналов в спектрах ЯМР 31Р 29Ь мы провели встречный синтез р-29Ь с выходом 19% из защищенного фосфодиэфира Р-34а с Р-конфигурацией аномерного центра (Схема 20).

3.3.2. Одностадийное удаление защитных групп

Полное удаление всех защитных групп из защищенного фосфодиэфира 34Ь удалось провести в одну стадию в двухфазной системе 1 М ЫаОН (водн.)-СНС1з-МеОН (0.6:5:2) (Схема 20).

Схема 20

,ОАс

АсО"-Ас,М

АсО

34Ь, (3-34а

ЫаОН (водн) СНСЬ

СНС13 МеОН

п

т

ОН

НО"-АсНМ

Полученные целевые фосфодиэфиры 29Ь были разделены с помощью ионообменной хроматографии при элюировашш линейным градиентом МН4ОАс (0 -> 0.2 М) в МеОН. Были получены Р-фосфодиэфир Р-29Ь (выход 42%) и его а-изомер а-29Ь (выход 3.4%). С помощью спектроскопии ЯМР 31Р было показано, что реакция омыления протекает за 1 ч в смеси СНС13-МеОН-1 М ЫаОН (водн.), 65:25:1, тогда как увеличение концентрации №ОН (СНС13-МеОН-1 М КтаОН (водн.), 65:25:2) вызывает быстрое разложение фосфодиэфиров 29Ь. Анализ соотношения между а- и Р-аномерами 29Ь (а:р ~ 1:3) и соотношения между 29Ь и полипренилфосфатом 32 (29Ь:32 ~ 1.1:1) приводит к выводу о том, что в условиях омыления разлагаются оба аномера 29Ь, что приводит к образованию полипренилфосфата 32. Однако скорость расщепления фосфодиэфирной связи в а-изомере а-29Ь значительно выше, чем в Р-апомере Р-29Ь, вследствие чего основным выделяемым продуктом является фосфодиэфир Р-29Ь с Р-конфигурацией аномерного центра.

Таким образом, впервые осуществлен полный синтез а- и Р-полипренилсиалилфосфатов 29Ь — предполагаемых интермедиатов биосинтеза бактериальных ПСК. Полученные соединения переданы в Университет Ганновера (ФРГ) для изучения их активности в качестве субстратов сиалилтрансфераз.

4. Выводы

1. Синтезирован новый сиалил-донор — О-ацетилированный гликозилхлорид Л^-диацетилнейраминовой кислоты — и изучена его реакционная способность в реакциях с различными нуклеофилами в сравнении с гликозилхлоридом нейраминовой кислоты с одной ацетильной группой у атома азота. Показано, что новый гликозилхлорид гладко реагирует с заряженными нуклеофилами в отсутствие промотора.

2. Впервые установлено, что О-ацетилированные гликозилхлориды Л-ацетил- и Лг,Лг-диацетилнейраминовых кислот реагируют как с защищенными, так и с незащищенными фосфатными нуклеофилами. На основе этого предложен и

реализован новый эффективный метод синтеза сиалилфосфатов. Установлено, что стереоселективность реакции зависит как от природы фосфатного нуклеофила, так и от числа ацетильных заместителей у атома азота сиалилхлорида.

3. Впервые получены О-ацетилированные фосфат Л^-ацетилнейраминовой кислоты с а-конфигурацией, а также а- и р-фосфаты Л^-диацетилнейраминовой кислоты.

4. Впервые для синтеза гликозилфосфатов использован полимерный реагент на основе ионообменной смолы Amberlyst А-26 в дибензилфосфатной форме. Установлено, что взаимодействие широкого круга перацстилированных гликозилгалогенидов с новым фосфатным реагентом приводит к дибензилгликозилфосфатам с высокими выходами.

5. Впервые осуществлен синтез ранее неизвестных полипренилсиалилфосфатов — предполагаемых интермедиатов биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот.

6. Разработан новый эффективный метод синтеза гликаля Лг-ацстилнейраминовой кислоты — важного синтетического блока в химии сиаловых кислот, основанный на взаимодействии гликозилхлорида /V-ацетилнейраминовой кислоты с динатрийгидрофосфатом в кипящем ацетонитриле.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Шпирт А. М., Кононов JI. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Превращение гликозилхлорида iV-ацетилнейраминовой кислоты в гликозилдибензилфосфат: О-гликозилирование в отсутствие промотора // Изв. АН. Сер. хим. -2004, -с. 684-686.

2. Шпирт А. М., Кононов JI. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Селективное образование а-гликозилфосфата из гликозилхлорида Л-ацетилнейраминовой кислоты // Изв. АН. Сер. хим. -2005 -с. 470-472.

3. Kulikova N. Yu., Shpirt A. M., Kononov L. О. // A facile synthesis of iV-acetylneuraminic acid glycal // Synthesis -2006 -p. 423-424

4. Шпирт A. M., Кононов Л. О., Шибаев В. H. // Синтез Р-дибензилфосфата А'-ацетилнейраминовой кислоты // Синтезы органических соединений; ред. Егоров М. П. -М. «МАКС Пресс» -2008 -с. 262-265.

5. Shpirt A.M., Kononov L.O., Shibaev V. N. // New synthesis of sialic acid glycosyl phosphate // The Carbohydrate Workshop 2003, 27-30 March 2003, Giistrow, Germany -Book of abstracts -p. P20.

6. Shpirt A. M., Kononov L. O., Shibaev V. N. // New synthesis of sialic acid glycosyl phosphate // EGC-5: Synthesis of Biologically Important Carbohydrates and Analogues, virtual conference (http://www.netconferences.net/eurotron/), 2-6 June 2003, http://www.netconferences.net/eurotron/egc-5/abstracts/kononov.pdf.

7. Shpirt A.M., Kononov L.O., Shibaev V. N. // New synthesis of sialic acid glycosyl phosphate // 12th European Carbohydrate Symposium (Eurocarb XII), 6-11 July 2003, Grenoble, France -Book of abstracts -p. P343.

8. Шпирт A.M., Кононов JI.O., Шибаев B.H. // Новый синтез гликозилфосфата сналовой кислоты // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 21-26 сентября 2003 г., Казань -т. 2 -с. 436.

9. Шпирт А. М., Кононов Л. О., Шибаев В. II. // Новый синтез гликозилфосфата сиаловой кислоты // Молодежная научная школа по органической химии «Актуальные проблемы органической химии», 29 сентября-3 октября 2003 г., Новосибирск -http://w\v\v.nioch.nsc.ru/school/03/file/85.pdf.

10. Kulikova N. Yu., Shpirt A. M., Kononov L. O. // A facile synthesis of N-acetylneuraminic acid glycal 11 The Carbohydrate Workshop 2004, 17-20 March 2004, Borstel, Germany -Book of abstracts.

11. Shpirt A. M., Kononov L. O., Torgov V. I., Shibaev V. N. // Stereoselective synthesis of key intermediate of biosynthesis of bacterial polysialic Acid // 22nd Carbohydrate Symposium, 23-27 July 2004, Glasgow, UK -Book of abstracts -p. P324.

12. Шпирт A. M„ Кононов Л. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Стереонаправленный синтез ключевых интермедиатов биосинтеза бактериальных полинейраминовых кислот // III Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», 9-11 сентября 2004 г., Саратов -Сборник тезисов докладов -с. 61.

13. Шпирт А. М., Кононов Л. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Подходы к синтезу полипренилфосфатов ^-ацетилнейраминовой кислоты - предполагаемых интермедиатов биосинтеза бактериальных полинейраминовых кислот //1 молодежная конференция ИОХ РАН, 31 марта-1 апреля 2005 г., Москва -Сборник тезисов докладов -с. 55-56.

14. Shpirt А. М., Kononov L. О., Torgov V. I., Shibaev V. N. // Chemical synthesis of sialic acid polyprenyl phosphate, a probable biosynthetic intermediate of bacterial polysialic acid // XVIII International Symposium on Glycoconjugates (GLYCO XVIII), September 49,2005, Firenze, Italy -Abstract P064, Glycoconj. J. -2005 -vol. 22 -p. 257-258.

15. Шпирт A. M., Кононов Л. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Гликозилхлорид Л^-диацетилнейраминовой кислоты - новый гликозга-донор для стереоселективного синтеза гликозилфосфатов // II Молодежная конференция ИОХ РАН, 13-15 апреля 2006 г., Москва -Сборник тезисов докладов -с. 36-37.

16. Орлова А. В., Куликова Н. Ю., Шпирт А. М., Кононов Л. О. // Новый гликозил-донор - гликозилхлорид А^-диацетилнейраминовой кислоты // II Молодежная конференция ИОХ, 13-15 апреля 2006 г., Москва -Сборник тезисов докладов -с. 160-161.

17. Shpirt A. M., Kononov L. 0., Torgov V. I., Shibaev V. N. // Total synthesis of sialic acid polyprenyl phosphate, a probable biosynthetic intermediate of bacterial polysialic acid // 2nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, 4-8 October 2006, Rostock, Germany -Book of abstracts - p. 9.

18. Orlova A. V., Kulikova N. Yu„ Shpirt A. M„ Kononov L. O., Torgov V. I. // A novel glycosyl donor — ATJV-diacetylneuraminic acid glycosyl chloride // 2nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, 4-8 October 2006, Rostock, Germany -Book of abstracts-p. 10.

19. Орлова А. В., Куликова H. Ю., Шпирт А. М., Кононов Л. О. // Сравнение гликозилирующей способности гликозилхлоридов Лг-ацетил- и N,N-диацетил-нейраминовых кислот// IX научная школа-конференция по органической химии, 2-15 декабря 2006 г., Звенигород -Сборник тезисов докладов -с. 276

20. Шпирт А. М., Кононов Л. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Полный синтез полипренилгликозилфосфатов TV-ацетилнейраминовой кислоты — возможных интермедиатов биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот// IX научная школа-конференция по органической химии, 2-15 декабря 2006 г., Звенигород -Сборник тезисов докладов -с. 334.

21. Shpirt A.M., Orlova А. V., Kulikova N. Yu., Kononov L. О., Torgov V. I., Shibaev V. N. // jV,jV-diacctyl-neuraminic acid glycosyl chloride — a novel glycosyl donor // 14th European Carbohydrate Symposium (Eurocarb XIV), 2-7 September 2007, Liibeck, Germany -Book of abstracts -p. РО-ОЗЗ.

22. Шпирт A. M., Орлова А. В., Куликова H. Ю., Кононов Л. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Гликозилхлорид ДЛ'-диацетилнейраминовой кислоты — новый сиалил-донор // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 23-28 сентября 2007 г., Москва -Сборник тезисов докладов -с. 62.

23. Назарова JI. А., Шпирт А. М., Кононов Л. О. // Синтез гликозилфосфатов с помощью ионообменной смолы // XV Международная конференция по химии соединений фосфора (ICCPC-XV), 25-30 мая 2008 г., Пушкин (Царское село) -Сборник тезисов докладов -с. 404.

Ваш отзыв в одном экземпляре, заверенный гербовой печатью, просим направлять по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинский проспект, д. 47, ИОХ РАН, Ученому секретарю совета ИОХ РАН, тел.: +7(495)-1372944, факс: +7(499)-1355328, электронная почта: kononov@ioc.ac.ru.

Подписано в печать 17.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1201 Тираж: 200 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Список сокращений

1. Введение

2. Литературный обзор 13 2.1 Общие сведения о спектроскопии ЯМР 31Р

2.2. Спектры ЯМР 31Р фосфотриэфиров

2.2.1. Спектры ЯМР 31Р фосфотриэфиров со сложноэфирными защитными группами в углеводном остатке

2.2.2. Спектры ЯМР 31Р фосфотриэфиров с бензильными защитными группами в углеводном остатке

2.2.3. Спектры ЯМР 31Р фосфотриэфиров с защитными группами разного типа в углеводном остатке

2.2.4. Спектры ЯМР 31Р дифенилгликозилфосфатов (фосфотриэфиры с феннльными защитными группами на фосфатной группе)

2.2.5. Спектры ЯМР 31Р фосфотриэфиров с разными заместителями на фосфатной группе

2.3. Спектры ЯМР 31Р фосфодиэфиров

2.3.1. Спектры ЯМР 31Р фосфодиэфиров с защитными группами в углеводном остатке

2.3.2. Спектры ЯМР 31Р фосфодиэфиров с углеводным остатком без загцитных групп

2.3.3. Спектры ЯМР 31Р фосфодиэфиров, в которых фосфатная группа имеет два углеводных заместителя

2.3.3.1 Спектры ЯМР 31Р гликозилированных нуклеотидов с защитными группами

2.3.3.2 Спектры ЯМР31Р гликозилированных нуклеотидов без защитных групп

2.3.3.3 Спектры ЯМР 31Р защищенных очигосахаридов, соединенных между собой с помощью фосфатного мостика

2.3.3.4 Спектры ЯМР 31Р незащищенных очигосахаридов, соединенных между собой с помощью фосфатного мостика

2.4 Спектры ЯМР 31Р фосфомоноэфиров

2.4.1. Спектры ЯМР 31Р фосфомоноэфиров с защитными группами в углеводном остатке

2.4.2. Спектры ЯМР 31Р фосфомоноэфиров без защитных групп

2.5 Спектры ЯМР 31Р циклических гликозилфосфатов

2.5.1. Спектры ЯМР 31Р циклических гликозилфосфатов с защитными группами

2.5.2. Спектры ЯМР 31Р циклических гликозилфосфатов без защитных групп

Сиаловые кислоты - девятиуглеродные сахара, имеющие карбоксильную группу у аномерного центра. Они образуют группу нон-2-улозоновых кислот. К настоящему времени известно более 40 различных сиаловых кислот. JV-Ацетилнейраминовой кислотой (Neu5Ac) называют сиаловую кислоту, у которой аминогруппа у С-5 атома ацетилирована1. Сложные углеводные молекулы, содержащие jV-ацетилнейраминовую кислоту, являются важнейшими природными соединениями, определяющими протекание целого ряда иммунологических, нейробиологических, онкологических и других биологических процессов . В природе известны полимерные формы N-ацетилнейраминовой кислоты - полисиаловые кислоты (ПСК), состоящие из повторяющихся блоков со связями: а(2—>8)-, а(2—>9)- или чередующимися а(2->8)/а(2->9)-гликозидными связями. ПСК являются полианионами, обладающими набором уникальных физико-химических свойств. ПСК встречаются в гликопротеинах (Neural Cell Adhesion Molecule (N-CAM)) эмбриональных нервных клеток позвоночных, в том числе и у человека. Изменение содержания ПСК в N-CAM в ходе развития нервных клеток модулирует межклеточную адгезию нервных клеток, позволяя им передвигаться и способствуя росту аксонов, что напрямую связано с организацией нервных клеток в ткани зрелого головного мозга. Наличие ПСК в составе N-CAM необходимо для нормального морфогенеза и психического развития3. Бактериальная ПСК защищает клетки от фагоцитоза, является рецептором для связывания с бактериофагами. Защитные капсулы ряда возбудителей менингита, таких как, например, Escherichia coli Kl, fC92, Neisseria meningitidis типов В и С, состоят из ПСК. Они определяет иммунологическую специфичность этих бактерий и их способность поражать нервные ткани, являясь, таким образом, одним из важнейших факторов вирулентности. По своей структуре ПСК бактерий близки ПСК человека. До настоящего времени вакцина против бактериального менингита, вызванного бактериями Neisseria meningitidis типов В и С, не Найдена?. В то время как биосинтез ПСК млекопитающих (в том числе человека) довольно хорошо изучен, в биосинтезе бактериальных ПСК остается ряд неясностей5. Бибсинтез бактериальных ПСК подробно изучался на примере Escherichia coli Kl. Установлено, что в биосинтезе бактериальных ПСК гликозил-донором является цитидинмонофосфат N-ацетилнейраминовой кислоты. Однако природа первичного гликозил-акцептора в биосинтезе бактериальных ПСК до сих пор окончательно не выяснена. В настоящее время предполагается, что роль первичного гликозил-акцептора выполняет полипренилсиалилфосфат, образование которого инициирует биосинтез ПСК у бактерий. Это соединение образовано из остатка А^-ацетилнейраминовой кислоты и ундекапренола (аллильный спирт, состоящий из одиннадцати изопреноидных звеньев), соединенных между собой фосфодиэфирной связью. Полипренилсиалилфосфат не удалось выделить из природного источника, и его структура была определена косвенными методами, поэтому, в частности, неизвестна конфигурация аномерного центра. В то же время, точное знание В то же время точное знание строения первичного сиалил-акцептора позволило бы разработать новые подходы к синтезу селективных ингибиторов биосинтеза бактериальных ПСК. Такие ингибиторы могли бы блокировать биосинтез ПСК в клетках бактериальных патогенов и не влиять на биосинтез ПСК в клетках мозга человека, который протекает иначе, чем в бактериях и не включает упомянутый ундекапренилфосфат №и5Ас. Для окончательного прояснения вопроса о его структуре требуется провести синтез полипренилсиалилфосфата и проверить экспериментально, является ли он субстратом сиалилтрансфераз — ферментов ответственных за биосинтез ПСК. Химический синтез этого соединения ранее не был осуществлен и является актуальной задачей в химии углеводов. Поскольку конфигурация аномерного центра в природном полипренилсиалилфосфате неизвестна, необходимо разработать методы, приводящие к получению как а-, так и р-фосфатов Ыеи5Ас, и в том числе соответствующих полипренилсиалилфосфатов.

Подходы к синтезу Р-фосфатов Ыеи5Ас простого строения разработаны достаточно хорошо, тогда как направленный синтез а-фосфатов Ыеи5Ас в литературе не описан. Процесс получения сиалилфосфатов является частным случаем реакции сиалилирования — гликозилирования производными №и5Ас. Разработка новых методов эффективного введения остатков сиаловых кислот является одной из фундаментальных проблем современной биоорганической химии. Недавно показано, что на результат сиалилирования существенно влияет характер замещения атома азота нейраминовой кислоты. Большинство успешных препаративных синтезов сиалоконъюгатов было осуществлено с применением производных нейраминовой кислоты, содержащих один ацетильный остаток у атома азота. В то же время в последние годы появились сообщения о том, что использование для синтеза сиалоолигосахаридов тиогликозидных производных А^-диацетилнейраминовой кислоты имеет значительные преимущества: реакции гликозилирования идут значительно быстрее, продукты гликозилирования образуются с большими выходами и высокой стереоселективностыо. Однако причины влияния удаленного заместителя у атома азота на результат реакции гликозилирования до сих пор оставались невыясненными. Поэтому необходим поиск новых сиалил-доноров с модифицированными заместителями у атома азота и исследование их реакционной способности в сравнении с известными /^-ацетильными производными.

Данная диссертационная работа посвящена исследованию реакционной способности гликозилхлоридов нейраминовой кислоты (сиалилхлоридов) с одной и двумя ацетильными группами у атома азота и их применению для синтеза ранее неизвестных полипренилсиалилфосфатов — предполагаемых интермедиатов биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот.

Работа состоит из трех основных частей: обзора литературы (глава 2), обсуждения полученных результатов (глава 3), выводов (глава 4), экспериментальной части (глава 5), а также списка литературы и приложения.

В главе 2 рассмотрены литературные данные по спектрам ЯМР 31Р гликозилмонофосфатов, к которым относятся и синтезируемые нами полипренилсиалилфосфаты. В литературе неизвестны обзорные статьи по спектрам ЯМР 31Р гликозилмонофосфатов, поэтому в этой главе обсуждаются общие тенденции положения сигналов атомов фосфора в спектре ЯМР 31Р в зависимости от строения сахара. Выявленные в результате анализа литературные закономерности были использованы нами при интерпретации спектров ЯМР 31Р соединений, синтезированных в данной работе.

В главе 3 описаны синтез и исследование реакционной способности известного гликозилхлорида Neu5Ac и нового гликозилхлорида нейраминовой кислоты с двумя ацетильными группами у атома азота с нуклеофилами, в том числе с различными фосфатными реагентами. На основе выявленных закономерностей предложен первый синтез полипренилсиалилфосфатов, предполагаемых интермедиатов биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот.

Глава 5 содержит описание методик эксперимента и физико-химические характеристики полученных соединений.

В приложении в таблицах собраны литературные данные, опубликованные до февраля 2008 г. по спектрам ЯМР 31Р гликозилмонофосфатов.

Основные результаты научного исследования опубликованы в виде статей и докладов на конференциях.

Статьи:

1. Шпирт А. М., Кононов JT. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Превращение гликозилхлорида Лг-ацетилнейраминовой кислоты в гликозилдибензилфосфат: О-гликозилирование в отсутствие промотора // Изв. АН. Сер. хим. -2004, -с. 684-686.

2. Шпирт А. М., Кононов JI. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Селективное образование а-гликозилфосфата из гликозилхлорида iV-ацетилнейраминовой кислоты // Изв. АН. Сер. хим. -2005 -с. 470-472.

3. Kulikova N. Yu., Shpirt A. M., Kononov L. О. // A facile synthesis of JV-acetylneuraminic acid glycal // Synthesis -2006 -p. 423-424.

1. Шпирт A. M., Кононов JI. О., Шибаев В. H. // Синтез ß-дибензилфосфата Лг-ацетшшейраминовой кислоты // Синтезы органических соединений; ред. Егоров М. П. -М. «МАКС Пресс» -2008 -с. 262-265.

2. Orlova А. V., Shpirt A. M., Kulikova N. Yu., Kononov L. О. Il N,M-diacetylneuraminic acid glycosyl chloride - a novel readily accessible sialyl donor in reactions with charged nucleophiles and alcohols // -2008 -направлено в печать.

3. Shpirt A. M., Kononov L. O., Maltsev C. D., Shibaev V. N. // Chemical synthesis of sialic acid polyprenyl phosphate, a probable biosynthetic intermediate of bacterial polysialic acid. 1. Synthesis of protected neuraminic acid moraprenyl glycosyl phosphate // -2008 -направлено в печать.

Конференции:

1. Shpirt A.M., Kononov L.O., Shibaev V. N. // New synthesis of sialic acid glycosyl phosphate // The Carbohydrate Workshop 2003, 27-30 March 2003, Güstrow, Germany -Book of abstracts -p. P20.

2. Shpirt A. M., Kononov L. O., Shibaev V. N. // New synthesis of sialic acid glycosyl phosphate // EGC-5: Synthesis of Biologically Important Carbohydrates and Analogues, virtual conference (http://www.netconferences.net/eurotron/), 2-6 June 2003, http://www.netconferences.net/eurotron/egc-5/abstracts/kononov.pdf.

3. Shpirt A.M., Kononov L.O., Shibaev V. N. // New synthesis of sialic acid glycosyl phosphate // 12th European Carbohydrate Symposium (Eurocarb XII), 6-11 July 2003, Grenoble, France -Book of abstracts -p. P343.

4. Шпирт A.M., Кононов JI.O., Шибаев B.H. // Новый синтез гликозилфосфата сиаловой кислоты // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 2126 сентября 2003 г., Казань -т. 2 -с. 436.

5. Шпирт А. М., Кононов JL О., Шибаев В. Н. // Новый синтез гликозилфосфата сиаловой кислоты // Молодежная научная школа по органической химии «Актуальные проблемы органической химии», 29 сентября-3 октября 2003 г., Новосибирск -http://www.nioch.nsc.ru/school/03/file/85.pdf.

6. Kulikova N. Yu., Shpirt А. М., Kononov L. О. // A facile synthesis of N-acetylneuraminic acid glycal // The Carbohydrate Workshop 2004, 17-20 March 2004, Borstel, Germany -Book of abstracts.

7. Shpirt A. M., Kononov L. O., Torgov V. I., Shibaev V. N. // Stereoselective synthesis of key intermediate of biosynthesis of bacterial polysialic Acid // 22nd Carbohydrate Symposium, 23-27 July 2004, Glasgow, UK -Book of abstracts -p. P324.

8. Шпирт A. M., Кононов JI. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Стереонаправленный синтез ключевых интермедиатов биосинтеза бактериальных полинейраминовых кислот // III Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», 911 сентября 2004 г., Саратов -Сборник тезисов докладов -с. 61.

9. Шпирт А. М., Кононов Л. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Подходы к синтезу полипренилфосфатов iV-ацетилнейраминовой кислоты — предполагаемых интермедиатов биосинтеза бактериальных полинейраминовых кислот // I молодежная конференция ИОХ РАН, 31 марта-1 апреля 2005 г., Москва -Сборник тезисов докладов -с. 55-56.

10. Shpirt А. М., Kononov L. О., Torgov V. I., Shibaev V. N. // Chemical synthesis of sialic acid polyprenyl phosphate, a probable biosynthetic intermediate of bacterial polysialic acid // XVIII International Symposium on Glycoconjugates (GLYCO XVlII), September 4-9, 2005, Firenze, Italy -Abstract P064, Glycoconj. J. -2005 -vol. 22 -p. 257-258.

11. Шпирт A. M., Кононов Л. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Гликозилхлорид N,N-диацетилнейраминовой кислоты - новый гликозил-донор для стереоселективного синтеза гликозилфосфатов // II Молодежная конференция ИОХ РАН, 13-15 апреля 2006 г., Москва -Сборник тезисов докладов -с. 36-37.

12. Орлова А. В., Куликова Н. Ю., Шпирт А. М., Кононов Л. О. // НоЬый гликозил-донор - гликозилхлорид N, yV-диацетилнейраминовой кислоты // II Молодежная конференция ИОХ, 13-15 апреля 2006 г., Москва -Сборник тезисов докладов -с. 160-161.

13. Shpirt А. М., Kononov L. О., Torgov V. I., Shibaev V. N. // Total synthesis of sialic acid polyprenyl phosphate, a probable biosynthetic intermediate of bacterial polysialic acid //

2nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, 4-8 October 2006, Rostock, Germany -Book of abstracts - p. 9.

14. Orlova A. V., Kulikova N. Yu., Shpirt A. M., Kononov L. O., Torgov V. I. // A novel glycosyl donor — A^V-diacetylneuraminic acid glycosyl chloride // 2nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, 4-8 October 2006, Rostock, Germany -Book of abstracts -p. 10.

15. Орлова А. В., Куликова H. Ю., Шпирт А. М., Кононов JI. О. // Сравнение гликозилирующей способности гликозилхлоридов //-ацетил- и Аг,Лг-диацетил-нейраминовых кислот// IX научная школа-конференция по органической химии, 2-15 декабря 2006 г., Звенигород -Сборник тезисов докладов -с. 276

16. Шпирт А. М., Кононов JI. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Полный синтез полипренилгликозилфосфатов jV-ацетилнейраминовой кислоты — возможных интермедиатов биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот// IX научная школа-конференция по органической химии, 2-15 декабря 2006 г., Звенигород -Сборник тезисов докладов -с. 334.

17. Shpirt А. М., Orlova А. V., Kulikova N. Yu., Kononov L. О., Torgov V. I., Shibaev V. N. // iV.jV-diacetyl-neuraminic acid glycosyl chloride — a novel glycosyl donor // 14th European Carbohydrate Symposium (Eurocarb XIV), 2-7 September 2007, Lubeck, Germany -Book of abstracts -p. РО-ОЗЗ.

18. Шпирт A. M., Орлова А. В., Куликова H. IO., Кононов JI. О., Торгов В. И., Шибаев В. Н. // Гликозилхлорид iV.iV-диацетилнейраминовой кислоты — новый сиалил-донор // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 23-28 сентября 2007 г., Москва -Сборник тезисов докладов -с. 62.

19. Назарова JI. А., Шпирт А. М., Кононов JI. О. // Синтез гликозилфосфатов с помощью. ионообменной смолы // XV Международная конференция по химии соединений фосфора (ICCPC-XV), 25-30 мая 2008 г., Пушкин (Царское село) -Сборник тезисов докладов -с. 404.

2. Литературный обзор

2.1 Общие сведения о спектроскопии ЯМР 31Р

Спектроскопия ЯМР 31Р находит широкое применение для изучения строения биомолекул (белков, липидов, нуклеиновых кислот), их конформационных изменений, реакций комплексообразования с металлами6. Преимуществом данного метода является то, что атомов фосфора в молекулах содержится меньше, чем атомов других элементов, таких как углерод, водород, азот, кислород. Спектры ЯМР на ядрах 31Р обычно регистрируют с подавлением спин-спинового взаимодействия с протонами, и поэтому чаще всего спектр представляет собой набор синглетов, что облегчает его расшифровку. В литературе имеется обширный материал по спектрам фосфорсодержащих белков, фосфолипидов, нуклеиновых кислот6, но отсутствуют обзорные работы, в которых бы обсуждались спектры фосфатов углеводов. В диссертационной работе (см. раздел 3) обсуждается синтез сиалилмонофосфатов, поэтому задачей данного литературного обзора является анализ известных данных по спектрам ЯМР 31Р с целью выявления закономерностей влияния строения молекул гликозилмонофосфатов на химический сдвиг атома фосфора в спектре ЯМР 31Р.

Изотоп 31Р - единственный природный изотоп фосфора, его ядро имеет спин 1А. Свойства его таковы, что для получения сигналов одинаковой интенсивности необходимо иметь концентрацию фосфорсодержащего соединения приблизительно в 15 раз более высокую, чем для получения спектра ЯМР 'Н (6.64% чувствительности метода ЯМР 'Н). it 1-7

Теоретически спектроскопия ЯМР Р чувствительнее, чем спектроскопия ЯМР 1JC ч f приблизительно в 400 раз . На практике разница не столь велика из-за того, что ширина линий в спектрах ЯМР 13С заметно меньше, чем в спектрах ЯМР 31Р.

В спектроскопии ЯМР 31Р принято использовать в качестве внешнего стандарта 85%-ный водный раствор Н3РО4, химический сдвиг которой принимается равным нулю. В 1976 о году, по рекомендации ИЮПАК, было принято, что химический сдвиг сигнала, находящегося в более слабом поле, чем стандарт, считается положительным.

Несколько авторов предпринимали попытки разработать унифицированный подход для расчета химических сдвигов атома фосфора (см. книгу6). Наиболее удачный теоретический метод предложили Летчер (J. Н. Letcher) и Ван Вазер (J. R. Van Wazer). На основании квантово-механических расчетов они предложили формулу:

А5 = -СЬ^Хх + ^«я- + ЛД0, в которой учтены три фактора, главным образом определяющие разницу химических сдвигов атома фосфора: А%х - разница в электроотрицательностях атомов в связи Р — X, АпТ - разница в тг-перекрывании, А© разница в углах (в том числе торсионных) между а - связями, а С, к, А- константы.

В книге Горенштейна6 (Б. О. Оогег^ет) говорится о том, что влияние растворителя на химический сдвиг 31Р мало по сравнению с выше перечисленными факторами и, главным образом, связано со способностью растворителя к образованию водородных связей с фосфатом. Было показано, что на положение сигналов сказывается изменение температуры, что может сместить положения сигнала на ~ 0.5 м.д. Влияние температуры объясняется тем, что при повышении температуры .изменяется конформация в молекулах заместителей у атома фосфора, при этом изменяются торсионные углы Р-О-С-Ни, следовательно, изменяется химический сдвиг. Небольшое влияние также оказывает изменение конформации циклов и наличие водородных связей (например, для V нуклеиновых кислот от ~0.4 м.д. до 0.6 м.д.). Для гликозилмонофосфатов исследовании, связанных с влиянием среды на положение сигналов атома фосфора проведено не было.

В данном литературном обзоре представлены выборочные данные спектров ЯМР 31Р, призванные проиллюстрировать существующие тенденции и закономерности, полные

11 данные, опубликованные до февраля 2008 г., спектрам ЯМР Р гликозилмонофосфатов находятся в приложении. Все величины химических сдвигов приведены с точностью, указанной в оригинальных публикациях. Для исключения дублирования ссылки на литературу приведены на схемах, а не в тексте обзора.

2.6 Заключение

Данные, представленные в этом обзоре, демонстрируют эффективность применения спектроскопии ЯМР 31Р для изучения строения гликозилфосфатов. Было показано, что положение сигнала атома фосфора определяется не только стереоэлектронными факторами, но и пространственным окружением фосфатной группы. Спектроскопия ЯМР 31Р позволяет определять строение веществ, которые сложно выделить в индивидуальном состоянии, так как для регистрации спектров применим любой растворитель. Необходимо отметить, что положение сигнала атома фосфора зависит не только от соседщих с фосфатной группой заместителей, но и от удаленных, что говорит о конформационных изменениях в пиранозных циклах. Впрочем, этот вопрос требует дополнительного изучения. Образование супрамолекулрных агрегатов оказывает значительнЬе влияние на спектры ЯМР 31Р, причем это влияние иногда превышает влияние внутримолекулярный электронных факторов.

3. Обсуждение результатов

3. Обсуждение результатов

В настоящее время актуальной задачей химии углеводов является поиск подходов к синтезу интермедиатов биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот (ПСК), в первую очередь полипренилгликозилфосфата iV-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac), которые имеют большое значение в медико-биологических исследованиях. Основная сложность заключается в том, что в настоящее время отсутствуют методы стереоконтролируемого синтеза гликозилфосфатов (Neu5Ac) с а-конфигурацией аномерного центра. Для окончательного выяснения структуры природного полипренилсиалилфосфата необходимо синтезировать полипренилфосфаты Neu5Ac с различными конфигурациями аномерного центра. Полученные соединения могут быть в дальнейшем использованы в качестве модельных гликозил-акцепторов в ферментативных системах. Результаты работы послужат прояснению неизвестных в настоящее время деталей начальных стадий биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот. Синтез таких молекул предоставит возможность для создания на их основе лекарств нового поколения.

Большинство успешных препаративных синтезов сиалогликонъюгатов было осуществлено с использованием производных JV-ацетилнейраминовой кислоты, содержащих один ацетильный остаток у атома азота (см. обзоры82,83'84). Йедавно было показано, что на результат реакции сиалилирования значительно влияет природа заместителей у атома азота остатка нейраминовой кислоты (Схемы 1, 2, 3). Как было

Of * продемонстрировано в работах Бунса (G.-J. Boons) и сотр., в реакциях метилтиогликозидов la,b с гликозил-акцептором 2 выход и время реакции зависели от заместителя у атома азота (см. Схему 1).

Схема 1

А^-Ацетилметилтиогликозид 1а реагировал с галактопроизводным 2 в течение 6 у, давая дисахарид а-За с выходом 61%. При использовании ДЛ^-диацетилметилтиогликозида 1Ь реакция завершилась через 5 мин с выходом 72%, причем потребовалось меньше гликозил - донора85 (1.7 экв. для 1а и 1.1 экв. для 1Ь). х X

1а,b (а:р = 1:1) 2

За: 2-6 ч, только а, 61% ЗЬ: 5 мин, только а, 72%

3м X — И b: X = Ас Условия реакции: /': NIS/TfOH, 3 A, MeCN, -40 °С

Магнуссон86 (О. Мадпшяоп) и сотр. (Схема 2) синтезировали гликозилфосфиты 4а,Ь. Аномерная конфигурация продуктов гликозилирования определялась стереоконтролирующей группой у С-3 атома, выход продуктов 6а,Ь и скорость реакции гликозирования зависели от заместителя у атома азота при С-5.

Схема 2

ОАс

ОАс

ОАс ОР(ОЕ02

07 'С02Ме ЭеРЬ

4а,Ь

АсО'' • - АсЫ

ОАс С02Ме а: X = Н

Ь: X = Ас 6а: 80 мин, только а, 76% 6Ь: 40 мин, только а, 50%

Условия реакции: /': ТМБСПТ, А\Л/ 300, МеСЬ!, -40 °С

Как показано в экспериментах в группе Фукасе87 (К. Биказе) сиалил-донор 7Ь реагирует быстрее, чем соответствующее производное 7а с одной ацетильной группой у атома азота, однако стереоселективность и выход реакции ниже, чем при использовании 7а (Схема 3).

Схема 3

ОАс НО ОАс

-С1-ОАС С02Ме ^С^ОАс С02Ме гр + □ ~ ---»- АсО''-^—Т^-О-^А^,

Асы-/*Т</ [Г" 9а: 6 ч, 93%, а:Р = 3.3:1

Л АсО Д ' АсО 9Ь: < 5 мин, 75%, а:р = 2.5:1

7а,Ь 8 ВгОЛ^А

ВгО|

О ^^

Условия реакции: //': ТМвСИТ, 4 А, ЕГСЫ, -78 °С

Причины влияния удаленного заместителя на результат реакции гликозилирования до

ОО ОЛ о/) сих пор неясны ' • . Представляет интерес поиск новых сиалил-доноров с двумя ацетильными группами у атома азота и исследование их реакционной способности в сравнении с известными моноацетильными производными.

Данная диссертационная работа посвящена исследованию реакционной способности гликозилхлоридов нейраминовой кислоты (сиалилхлоридов) с одной и двумя ацетильными группами у атома азота и их применению для синтеза полипренилсиалилфосфатов - предполагаемых интермедиатов биосинтеза полисиаловых кислот.

3.1. Синтез гликозилхлорида 7У,Л^диацетилнейраминовой кйслот£1

Гликозилхлорид91 11а с одной ацетильной группой у атома азота был впервые синтезирован в 1965 г. (Схема 4). В литературе описано несколько способов синтеза а: X = н

Ь: X = Ас

82 сиалилхлорида 11а , наиболее распространенным является использование газообразного HCl в АсС1. В данной работе гликозилхлорид 11а с одной ацетильной группой у атома азота был получен по модифицированной методике из известного ацетата92 10а. Мы разработали удобную методику получения 11а в CH2CI2, основанную на генерировании хлорирующего реагента (HCl) in situ из AcCl и МеОН (Схема 4). После завершения реакции, процесс выделения продукта сводится к простому упариванию реакционной смеси. Выход гликозилхлорида 11а на -18% превышает теоретический, что обусловлено координацией HCl с амидной группой в /V-ацетилнейраминовой кислоте93. Спектры ЯМР *Н и 13С совпали с литературными94.

Схема 4 о-/-со2ме сн,С1, achnZZÄ/ COzMe

11а

ОАс Ж

TsOH • н2о

-100%

ОАс

ОАс HCl Ас0, ^ '

2 q 2 2 aco acu 1qb

-100%

Интересующий нас гликозилхлорид lib с двумя ацетильными группами у атома азота в литературе описан не был, и нам предстояло разработать метод его синтеза. Мы получили гликозилхлорид lib с количественным выходом из известного перацетйлированнного производного85 10b, используя те же условия, что и для синтеза гликозилхлорида 11а (Схема 4). Было найдено, что новое соединение lib достаточно стабильно и может храниться в течение месяцев при низкой температуре. Строение lib было доказано с помощью спектроскопии ЯМР *Н и 13С. Так, например, в спектре ЯМР *Н хлорка lib V присутствуют необычно слабопольные сигналы H-3eq (5н 2.89 м.д.) и Н-4 (5н 5.89 м.д.) (ср. для 11а: H-3eq (8Н 2.78 м.д.) и Н-4 (8Н 5.35 м.д.)). В то же время, в спектре ЯГу1Р 13С хлорида lib сигнал С-5 (5с 56.1 м.д.) сдвинут в слабое поле по сравнению с сигналом С-5 в спектре 11а (5с 48.5 м.д.), что однозначно указывает на присутствие дополнительной электроноакцепторной группы у атома азота C(5)N.

3.2. Реакции гликозилхлоридов нейраминовой кислоты с нуклеофилами

Далее мы исследовали реакционную способность гликозилхлорида N,N-диацетилнейраминовой кислоты lib в сравнении с известным гликозилхлоридом N-ацетилнейраминовой кислоты 11а в реакциях с различными нуклеофилами.

3.2.1. Реакции с незаряженными О-нуклеафилами (спиртами)

На первом этапе нашей работы мы решили оценить реакционную способность гликозилхлоридов 11а,Ь в реакциях с незаряженными О-нуклеофилами, простыми спиртами. В качестве модельных реакций мы выбрали реакции с МеОН и А110Н. Все реакции хлоридов 11а,Ь со спиртами проводили в отсутствие промотора, т.к. ранее было показано, что гликозилхлорид 11а с одной ацетильной группой у атома азота реагирует с метанолом за 1 ч без добавления промотора, давая с высоким выходом исключительно а-метилгликозид95 (Схема 5, таблица 1, опыт 1). Мы ожидали, что, как и в случае с N,N-диацетилтиогликозидами85'88, гликозилхлорид lib будет более реакционноспособен, чем хлорид 11а. И действительно, реакция хлорида lib с чистым метанолом завершилась через 0.5 ч, давая метилгликозид 12Ь с высоким выходом -100% в качестве единственного продукта. К нашему удивлению, реакция сиалилхлорида lib с метанолом дала существенные количества ß-изомера наряду с а-метилгликозидом 12Ь (схема 5, таблица 1, опыт 2).

Стереоселективность реакции уменьшается, если проводить ее в смеси МеОН — MeCN (1:1). При этом гликозилхлорид 11а давал смесь аномеров a:ß = 12:1 (таблица 1, опыт 3), а гликозилхлорид lib с двумя ацетильными группами у атома азота прйводил к еще большему падению стереоселективности (a:ß = 3:1, таблица 1, опыт 4). Спектры ЯМР 'Н и 13С для соединений 12а95 и 12Ь96 совпали с известными в литературе.

Схема 5 а, с: X = Н b: X = Ас

ОАс

ОАс CI

C02R'

11а: R' = Me 11b: R' = Me 11c: R" = H

OAc

ROH

OAc C02R'

OR

OAc

AcO' AcN 'AcO

12a,b: R = R" = Me 13a: R' = Me, R = All 13b: R1 = Me, R = All 13c: R' = H, R = All

AcO"

COzMe

1. Angata Т., VarkiA. Chem. Rev. -2002 -Vol. 102 -p. 439-469

2. Schauer R. In Carbohydrates in Chemistry and Biology (Eds.: B. Ernst, G. W. Hart, P. Sinay), Wiley-VCH, Weinheim -2000 -part II -Vol. 3 -p. 227-244.

3. Mühlenhoff M., Eckhardt M, Gerardy-Schahn R. Curr. Biol, in Struc. Biol -1998 -Vol. 8 -p. 558-564.

4. Jydar L., Feavers I. M, Salisbury D., GranoffD. M The Lancet -2002 -Vol. 359 -p. 14991508.

5. Troy II F.A. Glycobiology -1992 -Vol. 2 -p. 5-23.

6. Gorenstein D. G. Phosphurs 31 NMR, principles and applications (Ed by Gorenstein D. G.). -Academic Press, 1984. -604 p.

7. КорбриджД. Фосфор. Основы химии, биохимии, технологии. -М. «Мир», 1982. -с. 644.

8. Правила ИЮПАК: Pure Appl. Chem. -1976 -Vol. 45 -p. 217-219.

9. Martin T.J. Dissertation Dr. rer. nat., , Universität Konstanz, Deutschland. Hartung-Gorre-Verlag 1994.

10. Tai V. W.-F., Imperial В. J. Org. Chem. -2001 -No 19 -p. 6217-6228.

11. Rulschow S„ Thiem J., Kranz С., Marquardt Т. Bioorg. Med. Chem. -2002 -Vol. 10 -No. 12 -p. 4043-4050.

12. Ravida A., LiuX., Kovacs L., SeebergerP. II. Org. Lett. -2006 -Vol. 9 -p. 1815-1818.

13. Soldaini G.,Cordana F. Goti A. Org. Lett. -2005 -Vol. 4, -p. 725 728.

14. Montoya-Peleaz P. J., Riley J. G., Szarek W. A., Valvano M. A„ Schutzbach J. S„ Brockhausen I. Bioorg. Med. Chem. Lett. -2005 -Vol. 15 -No. 4 -p. 1205-1212.

15. Flitsch S. L, Pinches H. L., Taylor J. P., Turner N. J. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 -1992 -No. 16 -p. 2087-2094.

16. Zamyatina A., Gronow S., Puchberger M., Graziani A., Hofinger A., Kosma P. Carbohydr. Res. -2003 Vol. 338 -No. 23 -p. 2571-2590.

17. Schmidt R. R., Wegmann В., Jung К.-H. Liebigs Ann. Chem. -1991 -No. 2 -p. 121-124.

18. Zhang Q., Liu H.-w. J. Am. Chem. Soc. -2001 -Vol. 123 -No. 28 -p. 6756-6766.

19. Zhang Q., Liu H.-w. J. Am. Chem. Soc. -2000 -Vol. 122 -No. 38 -p. 9065-9070.

20. Tsvetkov Y. E., Nikolaev A. V. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 -2000 -Vol. 6 -p. 889-892.21. de Lederkremer R. M., Nahmad V. B. Varela O. J. Org. Chem. -1994 -Vol. 59 -No. 3 -p. 690-692.

21. Pale P., Whitesides G. M. J. Org. Chem. -1991 -Vol. 56 -No. 14 -p. 4547-4549.

22. Jiang J., Biggins, J. В., Thorson J. S. J. Am. Chem. Soc. -2000 -Vol. 122 -No. 28 -p. 6803-6804.

23. Ott A.-J., Brackhagen M., Davtyan A., Nolting В., Boye H, Schoknecht A., Vogel С. J. Carbohydr. Chem. -2001 -Vol. 20 -No. 7-8 -p. 611-636.

24. Veeneman G. H., Broxterman H. J. G., Marel G. A. van, der Boom J. H. van Tetrahedron Lett. -1991 -Vol. 32 -No. 43 -p. 6175-6178.

25. Melean L. G. Love K. R. Seeberger P. H. Carbohydr. Res. -2002 -Vol. 337 -No. 21-23 -p. 1893-1916.

26. Plante О. J., Palmacci E. R„ Andrade К В., Seeberger P. H. J. Am. Chem. Soc. -2001 -Vol. 123 -No. 39 -p. 9545-9554.

27. Plante О. J., Andrade R. В., Seeberger P. H. Org. Lett -1999 -Vol. 1 -No. 2 -p. 211-214.

28. Timmers С. M., van Straten N. С. R., van der Marel G. A., van Boom J. H. J. Carbohydr. Chem. -1998 -Vol. 17 -No. 3 -p. 471-488.

29. Love K. R., Seeberger P. H. Synthesis -2001 -No. 2 -p. 317-322.

30. HochM., Heinz E., Schmidt R. R. Carbohydr. Res. -1989 -Vol. 191 -p. 21-28.

31. Hartman M. С. Т., Coward J. K. J. Am. Chem. Soc. -2002 -Vol. 124 -No. 34 -p. 1003610053.

32. Понтер X. Введение в курс спектроскопии ЯМР. -М. «Мир», 1984 -с. 82.

33. Hunt D. К., Seeberger P. Н. Org. Lett. 2002 -No. 16 -p. 2751-2754.

34. Sabesan S., Neira S. Carbohydr. Res. -1992 -Vol. 223 -p. 169-186.

35. Vincent S. P., Burkart M. D. Tsai C.-Y., Zhang Z., Wong C.-H. J. Org. Chem. -1999 -Vol. 64 -No. 14 -p. 5264-5279.

36. Tai V. W.-F., O'Reilly M. K„ Imperiali B. Bioorg. Med. Chem. -2001 -Vol. 9 -No. 5 -p. 1133-1140.38. lllarionov P. A., Torgov V. 1., Hancock I. C., Shibaev V. N. Tetrahedron Lett. -1999 -Vol. 40 -No. 22 -p. 4247-4250.

37. Илларионов П. А., Торгов В. И., Ханкок И. И., Шибаев В. Н. Изв. АН. Серия хим. -2001 -№ 7 -с. 1242-1247.

38. GranataA., Perlin A. S. Carbohydr. Res. 1981 -Vol. 94 -p. 165-172.41 .Majumdar D., Elsayed G. A., Buskas Т., Boons G.-J. J. Org. Chem. -2005 -Vol. 5 -p. 1691-1697.

39. El-Abadla N., Lampilas M., Hennig L., Findeisen M„ Welzel P. Tetrahedron -1999 -Vol. 55 -No. 3 -p. 699-722.

40. Riedel S„ Donnerstag A., Hennig L., Welzel P., Richter J. Tetrahedron -1999 -Vol. 55 -No. 7-p. 1921-1936.

41. Higson А. P., Ross А. ./., Tsvetkov Y. Е., Routier F. К, Sizova О. V., Ferguson М. A. J., Nikolaev А. V. Chem. Europ. J. -2005 -Vol. 11 -No. 7 -p. 2019-2030.

42. Nikolaev A. V., Rutherford T. J., Ferguson M. A. J., Brimacombe J. S. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 -1996 -No. 13 -p. 1559-1566.

43. Ross A. J., Ivanova I. A., Ferguson M. A. J., Nikolaev A. V. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 -2001 -No. 1 -p. 72-81.

44. Ruhe la D., Chatterjee P., Vishwakarma R. A. Org. Biomol. Chem. -2005 -Vol. 6 -p. 1043-1048.

45. Лебедев А. В., Резвухин А. И. Биоорган. Хим. -1983 -Т. 9 -с. 149-185.

46. Martin Т. J., Schmidt R. R. Tetrahedron Lett. -1993 -Vol. 34 -No. 11 -p. 1765-1768.

47. Kajihara Y., Ebata Т., Koseki K, Kodama H„ Matsushita H„ Hashimoto H. J. Org. Chem. -1995 -Vol. 60 -No. 17 -p. 5732-5735.

48. ChappellM. D., Halcomb R. L. Tetrahedron Lett. -1999 -Vol. 40 -No. 1 -p. 1-4.

49. Kajihara Г., Ebata Т., Kodama H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. -1998 -Vol. 37 -No. 22 -p. 3166-3169

50. Simon E. S., Bednarski M. D., Whitesides G. M. J. Am. Chem. Soc. -1988 -Vol. 110 -p. 7159-7163.

51. Liu J. L., Shen G. J., Ichikawa Y„ Rutan J. F., Zapata G., Vann W. F., Wong С. H. J. Am. Chem. Soc. -1992 -Vol. 114 -p. 3901-3910.

52. Hermans J. P. G., de Vroom E., Elie C. J. J., van der Marel G. A., van Boom J. H. Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 1986 -Vol. 105 -p. 510-512.

53. Salam M. A., Behrman E. J. Carbohydr. Res. -1981 -Vol. 90 -p. 83-90.

54. Елисеева Г. К, Иванова И. А., Николаев А. В., Шибаев В. Н. Биоорган. Хим. -1991 -Т. 17 -№ 10-е. 1401-1411.

55. Nikolaev А. V., Ivanova I. A., Shibaev V. N. Kochetkov N. К. Carbohydr. Res. -1990 -Vol. 204 -No. 1 -p. 65-78.

56. Nikolaev A. V., Ivanova I. A., Shibaev V. N. Carbohydr. Res. -1993 -Vol. 242 -p. 91-108.

57. Berkin A., Coxon В., Pozsgay V. Chem. Europ. J. -2002 -Vol. 8 -No. 19 -p. 4424-4433.

58. Nikolaev A. V., ChudekJ. A., Ferguson M. A. J. Carbohydr. Res. -1995 -Vpl. 272 -No. 2 -p. 179-190.

59. Ogawa Т., Seta A. Carbohydr. Res. -1982 -Vol. 110 -p. C1-C4.

60. Николаев А. В., Иванова И. А., Шибаев В. Н. Биоорган. Хим. -1992 -Т. 18 -№ 1 -с. 126-141.

61. Ruda К., Lindberg J., Garegg P. J., Oscarson S., Konradsson P. Tetrahedron -2000 -Vol. 56 -No. 24 -p. 3969-3976.

62. Shibaev V. N„ Danilov L. L. in Studies in Natural Products Chemistry (ed by Atta Ur -Rahman). -A.: Elsevier, 1991 -p. 63-113.

63. Cozzone P. J., Jardetzky O. Biochemistry -1976 -Vol. 15 -No. -22 -p. 4853-4859.

64. Gokhale U. В., Hindsgaul O., Palcic M. M. Can. J. Chem. -1990 -Vol. 68 -No. 7 -p. 1063-1071.

65. Percival M, D., Withers S. G. Can. J. Chem. -1988 -Vol. 66 -p. 1970-1972.

66. Hanessian S., Lu P.-P., Ishida H. J. Am. Chem. Soc. -1998 -Vol. 120 -No. 51 -p. 1329613300.

67. Costello A. J. R., Glonek Т., van WazerJ. R. Inorg. Chem. -1976 -Vol. 15 -p. 972-974.

68. В erne t В., Wyss C. Helv. Chim. Acta -1988 -Vol. 71 -p. 818-821.

69. Zhao Y., ThorsonJ. S. J. Org. Chem. -1998 -Vol. 63 -No. 21 -p. 7568-7572.

70. Miles J. A. L„ Mitchell L., Percy J. M., Singh K., Uneyama E. J. Org. Chem. -2007 -Vol. 72-No. 5-p. 1575-1587.

71. Euzen R., Ferrieres V., Plusquellec D. J. Org. Chem. -2005 -Vol. 70 -No. 3 -p. 847-855.

72. Marino K., Marino C., Lima C., Baldoni L„ Lederkremer R. M. de Eur. J. Org. Chem. -2005 -No. 14 -p. 2958-2964.

73. Hariprasad V., Singh G., Tranoyl. Chem. Commun. -1998 -No. 19 -p. 2129-2130.

74. VankayalapatiH., Singh G., Tranoyl. Tetrahedron: Asymmetry -2001 -Vol. 12 -No. 9 -p. 1373-1382.

75. Zamyatina A., Gronow S., Oertelt C., Puchberger M., Brade H., Kosma P. Angew. Chem. Int. Ed. -2000 -Vol. 39 -No. 22 -p. 4150-4153.

76. FathiR., Jordan F. J. Org. Chem. -1986 -Vol. 51 -No. 22 -p. 4143-4146.

77. FathiR., Jordan F. J. Org. Chem. -1988 -Vol. 53 -No. 9 -p. 1997-2001.

78. Marlow A. L., KiesslingL. L. Org. Lett. -2001 -Vol. 3 -No. 16 -p. 2517 2520.

79. Boons G.-J., DemchenkoA. V. Chem. Rev. -2000 -Vol. 100 -p. 4539-4565.

80. RessD. K., Linhardt R. J. Curr. Org. Synth. -2004 -Vol. 1 -p. 31-46.

81. De Meo C. in Frontiers in Modern Carbohydrate Chemistry (Ed by A. V. Demchenko), ACS symposium series 960, Washington DC -2007 -p. 118-129.

82. DemchenkoA. V., Boons G.-J. Eur. J. Chem. Org. -1999 -Vol. 5 -p. 1278-1283.

83. Ercegovic Т., Nilsson U. J., Magnusson G. Carbhydr. Res. -2001 -Vol. 331 -p. 255-263.

84. TanakaK., Goi Т., Fukase K. Synlett -2005 -p. 2958-2962.

85. De Meo C„ Priyadarshani U. Carbohyd. Res. -2008 -Vol. 343 -p. 1540-1552.89., Кононов JI. О., Малышева Н. Н., Кононова Е. Г., Гаркуша О. Г. Изв. АН, Сер. Хим -2006 -№7 -с. 1263-1265.

86. Kononov L. О., Malysheva N. N. Kononova E. G„ Orlova A. V. Eur. J. Chem. Org. -2008 -No. 19-p. 3251 -3255.

87. TuppyM. Monatsh. Chem. -1965 -Vol. 96 -p. 802-814.

88. Marra A., Sinay P. Carb. Res. -1989 -Vol. 190 -p. 317-322.

89. ByramovaN. E., TuzikovA. В., BovinN. V. Carbohydr. Res. -1992 -Vol. 237 -p. 161-175.

90. SharmaM. N. EbyR. Carbohydr. Res. -1984 -Vol. 127 -p. 201-210.

91. Kononov L. O., Magnusson G. Acta. Chem. Scand. -1998 -Vol. 52 -p. 141-144.

92. Crich D., Li W. Org. Lett. -2006 -Vol. 8 -p. 959-962.

93. Allanson N. M, Davidson A. H., Floyd C. D., Martin F M. Tetrahedron: Asymmetry -1994-Vol. 5-p. 2061-2076.

94. Tanaka Т., Ozawa M„ Miura Т., Inazu Т., Tsuji S., Kajimoto T. Synlett -2002 -p. 14871490.

95. TropperF. D., Andersson F. O., Braun S., Roy R. Synthesis -1992 -p. 618-620.

96. Cao S., Meunier S. J., Andersson F. O., Letellier M„ Roy R. Tetrahedron: Asymmetry -1994 -Vol. 5 -p. 2303-2312.

97. Marra A., Sinay P. Carbohydr. Res. -1989 -Vol. 187 -p. 35-42.

98. Martichonok V., Whitesides G. M. J. Org. Chem, -1996 -Vol. 61 -P. 1702-1706

99. Tropper F. D., Andersson F. O., Cao S., Roy R. J. Carbohydr. Chem. -1992 -Vol. 11 -P. 741-750.

100. Makosza M. Pure Appl. Chem. -2000 -Vol. 72 -p. 1399-1403.

101. Ando #., Koike Y., Ishida #., Kiso M. Tetrahedron Lett. -2003 -Vol. 44 -p. 68836886.

102. Xia J., Alderfer J. L„ Piskorz C. F, Locke R. D„ Matta K. L. Carbohyd. Res. -2000-Vol. 328 -p. 147-163.

103. Gokhalaen U. В., Hindsgaul O., Palcic M. M. Can. J. Chem -1990 -Vol. 68 -p. 1063-1071.

104. Sim M. M., Kondo H., Wong С. Я J. Am. Chem. Soc. -1993 -Vol. 115 -p. 22602267.

105. Hori Я, Nakajima Т., Nishida Y., Ohrui H„ Meguro H. Tetrahedron Lett. -1988 -Vol. 29-p. 6317-6320.

106. Tsvetkov Y. E., Nifantiev N. E. -Synlett -2005 -№ 9 -p. 1375-1380.

107. Ходж П., Шеррингтон Д. Реакции на полимерных подложках в органическом синтезе -М.: Мир, 1983 -604 с.

108. Tzschucke С. С., Markert С., Bannwarth W., Roller S., Hebel A., Haag R. Angew. Chem. Int. Ed. -2002 -Vol. 41 -p. 3964-4000.

109. Лемъе Р. У. Методы химии углеводов, под ред. Кочеткова Н. К. -М. «Мир» -1967 -с. 123-125.

110. Roy R., Tropper F., Grand-Maitre С. Can. J. Chem. -1991 -Vol. 69 -p. 14621467.

111. Baisch G„ Ohrlein R. Bioorg. Med. Chem. -1997 -Vol. 5 -№. 2 -p. 383-391.

112. Hennen W.J., Sweers H.M., Wang Y.-F., Wong C.-H. J. Org. Chem. -1988 -53 -p. 4939-4945.

113. Niggemann J., Thiem J. Liebigs Ann. Chem. -1992 -p. 535-538.

114. Bock K., Guzman J. F.- В., Norrestam R. Carbohydr. Res. -1988 -Vol. 179 -p. 97124.

115. Хортон Д. Методы исследования углеводов, под ред. Хорлина А. Я. -М. «Мир»-1975 -с. 221-224.

116. Байрамова Н. Э., Бакиновский Л. В., Кочетков Н. К. -Изв. АН. Сер. хим. -1985 -т. 5-с. 1140-1145.

117. Chambers D.J., Evans G.R. Tetrahedron -2004 -Vol. 60 -p. 8411-8419.

118. MisraA. K, Agnihotri G. Carbohydr. Res. -2004 -Vol. 339 -p. 885-890.

119. Okamoto K, Kondo Т., Goto T. Bull. Chem. Soc. Jpn. -1987 -Vol. 60 -p. 631-636.

120. Bagget В., Marsden N. Carb. Res. -1982 -Vol. 110 -p. 11-18.125. von Itzstein M. Nature Rev. Drug disc. -2007 -Vol. 2 -p. 961-91 A.

121. Meindl P, Tuppy tf Monatsh. Chem. -1969 -Vol. 100 -p. 1295- 1306.

122. Claesson A., Luthman K. Acta Chem. Scand., Ser. B. -1982 -Vol. В 36 -p. 719720.

123. Schmid W., Christian R, Zbiral E. -Tetrahedron Lett. -1988 -Vol 29 -p. 36433646.

124. Ercegovic Т., Magnusson G. J. Chem. Soc. Chem. Commun. -1994 -p. 831-832.

125. Kok G. В., Mackey B. L, von Itzstein M. -Carbohydr. Res. -1996 -Vol. 289 -p. 6775.

126. Кононов Л. О., Комарова Б. С., Нифантьев Н. Э. -Изв. АН. Сер. хим. -2002 -р. 644-648.

127. Ikeda, К.; Konishi, К.; Sano, К.; Тапака, К. Chem. Pharm. Bull. -2000 -Vol. 48 -p. 163-165.

128. Ichikawa Y., Sim M. M. Wong C.-H. J. Org. Chem. -1997 -57 -p. 2943-2946.

129. Gotoh Т., Koyama Т., Ogura K. J. Biochem. -1992 -Vol. 122 -p. 20-27.

130. Smith M. В., March J. March's Adv. Org. Chem 5ed -Wiley: New Yorck -2001 -2083 p.

131. Kiss J Z, Rougon G. Curr. Opin. Neurobiol. -1997 -Vol. 640-646.

132. Glick M. C. Livingston B. D„ Shaw G. W, Jacobs G. L. Troy F. A. Adv. in Neurobl. Res. (in Evans A. E., Knudson A. G., Seeger R. C., D' Angio G. J. Ed), Willey-Liss, New York -1991 -Vol. 3 -p. 267-274.

133. Heitz P. U., Komminoth P., Lackie P. M., Zuber C., Roth J. Verh. Dtsch. Ges. Pathol. -1990 -Vol. 74 -p. 376-377.

134. Moolenaar С. E., Muller E. J., Schol D. J., Figdor C. G., Bock E. Cancer Res. -1990-Vol. 50-1102-1106.

135. Ito F., Inoue S., Inoue Y., Troy F. A. Glycoconjugate J. -1991 -Vol. 8 -p. 153.

136. Colino J., Outschoorn I. Infect. Immun. -1997 -Vol. 66 -p. 505-513.

137. Vogel U., Weinberger A., Frank R., Muller A., Kohl J., Atkinson J. P., Frosch M. -Infect. Immun. -1997 -Vol. 65 -p. 4022-4029.

138. Jarvis G. A. Trends Microbiol. -1995 -Vol. 3 -p. 198-201.

139. Vimr E., Steenbergen S., Cieslewicz M. J. Indust. Microbiol. -1995 -Vol. 15 -p. 352-360.

140. VionnetJ, Vann W F. Glycobiology -2007 -Vol. 17 -p. 735-743.

141. Gaudino J. J., Paulson J. C. J. Am. Chem. Soc. -1994 -Vol. 116 -p. 1149-1150.

142. Кусов Ю. Ю., Киселева E. В., Данилов JI. Л., Шибаев В. Н., Кочетков Н. К, Рожнова С. Ш., Килессо В. А. Биорг. хим. -1979 -т. 5 -с. 1863-1872.

143. Warren С. D„ Jeanloz R. W -Biochemistry -1973 -12 -p. 5031-5037.

144. Yamazaki Т., Laske D. W, Herscovics A., Jeanloz R. W. -Carb. Res. -1983 -120 -p. 159-170.

145. Zhou G. P., Troy IIF. A Glycobiology -2005 -Vol. 4 -p. 347-359.

146. Гордон А., Форд P. Спутник химика -M. «Мир» -1976 -с.440.

147. Фрумииа Н. С., Лисенко Н. Ф., Чернова М. А.Хлор. -М.: Наука -1983 -с. 19.

148. Leaback D., Heath Е„ Roseman S. -Biochemistry -1969 -Vol. 8 -№4 -p. 13511359.

149. Franzyk H., Meldal M., Paulsen H., Bock K. J. Chem. Soc., Perkin Tran.l -1995 -Vol. 22 -p. 2883-2898.

150. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. -Справочник биохимика -М. «Мир», 1991 -с. 359.1. Оглавление к Приложению