Исследования в области масс-спектрометрии DART и её сочетания с планарной хроматографией. Быстрый скрининг лекарственных средств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Чернеиова Елена Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ DART И ЕЁ СОЧЕТАНИЯ С ПЛАНАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ. БЫСТРЫЙ СКРИНИНГ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

1 7 ОКТ 2013

Москва-2013

005535213

Работа выполнена в Центре коллективного пользования (Научно-образовательном центре) и в Управлении по науке и инновациям Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (РУДН)

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Калабнн Геннадий Александрович

Официальные оппоненты: Буряк Алексей Константинович

доктор химических наук, профессор ФГБУН «Институт физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина», заведующий лабораторией «Физико-химические основы хроматографии и хромато-масс-спектрометрии»

Лебедев Альберт Тарасович

доктор химических наук, профессор Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, лаборатория физической органической химии кафедры органической химии, профессор

Рыбальченко Игорь Владимирович

доктор химических наук, профессор

Научный центр ФГКУ «33 ЦНИИИ Минобороны РФ»,

ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт нефтехимического синтеза имени А.В.Топчиева Российской академии наук

Защита состоится «23» декабря 2013 г. в 15 час. 00 мин. в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1 стр. 3, ГСП-1, Химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова С авторефератом можно ознакомиться на сайте ВАК России: http//vak.ed.еоv.ru

Автореферат разослан «ЯЯ> G.cA^SU. 2013 г.

/

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Актуальной является разработка универсальных и экспрессных подходов к анализу лекарственных средств (ЛС) для обеспечения высокой производительности анализов, необходимой как для проведения быстрого скрининга фармацевтических препаратов для обнаружения фальсификатов, так и для контроля качества JIC. Различают несколько видов фальсификации JIC: препараты, не содержащие активное вещество; препараты, содержащие недостаточное количество активного вещества; препараты, содержащие другое активное вещество (не соответствующее указанному в маркировке); а также препараты, содержащие загрязняющие или токсические вещества. Содержание активного вещества в JIC чаще всего определяют методом ВЭЖХ (после предварительной экстракции), титриметрией или другими аналитическими методами, требующими использования специальных условий селективного определения. Во всех этих случаях необходимы соответствующие образцы сравнения определяемых соединений.

Для экспрессного анализа ряда фармацевтических субстанций и таблеток определенными преимуществами обладает метод инфракрасной спектроскопии в ближнем диапазоне (БИКС), для которой пробоподготовка минимальна и не требуется использование растворителей. При этом для однозначной интерпретации регистрируемых спектров, состоящих из широких полос, необходимо иметь библиотеку спектров сравнения, что приводит к затруднениям в случае отсутствия необходимого спектра в базе данных. Методы масс-спектрометрии (МС) более привлекательны с точки зрения однозначности интерпретации данных. Существует необходимость разработки новых подходов к качественному и количественному анализу таких объектов, как субстанции лекарственных веществ, таблетки, капсулы, мази, суппозитории и различные виды природных JIC. Интерес представляет не только контроль заданных аналитов, но и идентификация неизвестных компонентов, а также рассмотрение сигналов соединений-маркеров в качестве «отпечатков пальцев» для классификации и исследования состава объектов.

Одним из новых способов ионизации для масс-спектрометрии является «прямой анализ в режиме реального времени» (Direct Analysis in Real Time, DART), появившийся в 2005 году1, и название которого подобрано специально для ассоциации со словом «дротик» (dart - англ.), чтобы подчеркнуть экспрессность метода. Во второй половине 2013 года ионизацию DART попытались описать названием, описывающим суть метода — «химическая ионизация при атмосферном давлении, индуцированная термодесорбцией и ионизацией Пеннинга» (thermal desorption Penning ioni-zation-induced atmospheric pressure chemical ionization, или TDP1IAPCI)2, которое представляется не вполне удачным. В связи со сложностью и недостаточной изученностью механизмов DART и для однозначности сопоставления с литературными данными, в данной работе придерживаемся устоявшегося в литературе названия.

1 Cody R.B., Larumee JA., Durst H.D. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions H Anal. Chem. 2005. V. 77. № 8. P. 2297 - 2303.

2 J.H. Gross. Direct analysis in real time - a critical review on DART-MS // Anal. Bioanal. Chem, статья опубликована lia странице журнала в Интернет 15 сентября 2013 г. DOI: 10.1007/s00216-013-7316-0.

Особенностью масс-спектрометрии DART является возможность анализа жидких и твердых объектов без пробоподготовки и хроматографирования, что делает масс-спектрометрию DART привлекательной для идентификации и определения состава органических компонентов различных объектов, в том числе для анализа ЛС. В связи с новизной метода его достоинства и ограничения малоизвестны, а способы улучшения аналитических возможностей малоизучены. Для DART важна эффективная десорбция аналитов, поэтому свойства матрицы образца и особенности его поверхности влияют на факторы откликов аналитов. Описанные в первых работах о DART возможности анализа любых твердых и жидких образцов в отсутствие пробоподготовки в действительности не так широки, как это представлялось в первых публикациях. Они зависят от типа матрицы, конфигурации масс-спектрометра, а также от способа подачи образца и его позиционирования по отношению к источнику DART и входу в масс-анализатор. До начала данного исследования практически все опубликованные данные были получены с использованием одной и той же модели времяпролетного масс-спектрометра. Ограничением масс-спектрометрии DART является сравнительно невысокая чувствительность, но возможности преодоления этого ограничения за счет использования простых быстрых способов концентрирования были мало изучены. Отсутствовали литературные данные о возможностях повышения селективности идентификации компонентов сложных смесей за счет сочетания DART с масс-анализатором на основе орбитальной ионной ловушки и с тонкослойной хроматографией (ТСХ). Не были изучены достоинства и ограничения сочетания масс-спектрометрии DART и ТСХ в режиме сканирования пластин. Возможность экспрессной идентификации активного компонента фармацевтических субстанций была показана только на небольшом числе примеров - на наркотических субстанциях и антималярийных препаратах. При этом проводили качественный анализ, и не предложен способ, который позволил бы проводить следующую стадию скрининга для быстрого определения содержания активного компонента в отсутствие образцов сравнения - в чем, с нашей точки зрения, органический элементный анализ (ОЭА) может хорошо дополнить метод масс-спектрометрии DART.

Актуальным являлось исследование возможностей и ограничений масс-спектрометрии DART и поиск способов минимизации ограничений, в том числе снижение пределов обнаружения по концентрации. Особый интерес представляло изучение возможности повышения селективности идентификации компонентов сложных смесей за счет сочетания масс-спектрометрии DART с ТСХ online и offline, а также за счет сочетания с орбитальной ионной ловушкой. Большой практический интерес представляла разработка новых подходов для решения различных задач фармацевтического анализа, основанных на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ и ОЭА.

Цель и задачи работы

В связи с этим, целью работы являлась разработка новых подходов к экспрессному анализу лекарственных средств, основанных на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ, а также на органическом элементном анализе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить масс-спектры DART широкого круга органических соединений различных классов и выбрать критерии оптимизации условий анализа методом масс-спеюрометрии DART.

2. Разработать способ обнаружения следовых концентраций органических соединений методом масс-спектрометрии DART, основанный на концентрировании аналитов с удалением растворителя из раствора (экстракта) и анализе всего концентрата.

3. Разработать способ межлабораторного анализа, основанный на концентрировании аналитов на подложке и анализе концентрата методом масс-спектрометрии DART.

4. С целью обеспечения возможности сочетания масс-спектрометрии DART и ТСХ, разработать способ визуального определения точки фокусирования ионизирующего потока из источника DART на поверхности объекта исследования для повышения воспроизводимости результатов анализа за счет улучшения позиционирования пробы в области ионизации.

5. Разработать способ сканирования различных подложек и ТСХ-пластин методом масс-спектрометрии DART, исследовать возможности и ограничения сочетания масс-спектрометрии DART с ТСХ online и offline.

6. Разработать быстрый и универсальный способ определения содержания активного компонента лекарственных препаратов и субстанций при использовании ОЭА, в целях дополнения возможностей масс-спектрометрии DART для количественного анализа.

7. Разработать методологию быстрого контроля проб лекарственных препаратов на фальсификаты, основанную на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и ОЭА, и методологию анализа природных ЛС, основанную на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ.

Научная новизна

1. Изучены масс-спектры DART широкого круга органических соединений различных классов (алифатические и ароматические углеводороды, спирты, карбоновые кислоты, аминокислоты, сахара, гетероциклические соединения) и показана зависимость их состава от условий эксперимента. Выбраны критерии оптимизации условий анализа в зависимости от аналитов и параметров эксперимента.

2. На основании проведенных исследований предложен способ снижения пределов обнаружения по концентрации для масс-спектрометрии DART на 2 порядка и более. Способ основан на концентрировании аналитов из больших проб органических растворов и анализе концентрата, свободного от растворителя, методом масс-спектрометрии DART.

3. Исследована возможность и разработаны способы использования подложек, изготовленных из различных материалов, для анализа методом масс-спектрометрии DART с предварительным удалением растворителя для обеспечения отбора проб на месте контроля и транспортировки к анализатору.

4. Разработаны способы визуального определения точки фокусирования (визуализации) ионизирующего потока из источника DART на поверхности объекта исследования. Эти способы позволили впервые разработать способ сканирования поверхностей методом масс-спектрометрии DART и существенно увеличить воспроизводимость анализа методом масс-спектрометрии DART и при его сочетании с ТСХ.

5. Разработанные новые способы анализа, основанные на сочетании масс-спектрометрии DART с ТСХ online и offline позволяют проводить одновременную регистрацию десятков соединений в идентичных условиях и увеличить достоверность идентификации компонентов сложных смесей.

6. Показана возможность быстрого обнаружения активного компонента в лекарственных препаратах (субстанции, капсулы, таблетки, суппозитории, мази) при анализе методом масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения.

7. Разработан быстрый и универсальный способ определения содержания активного компонента в различных лекарственных препаратах (субстанции, капсулы, таблетки, растворы в ампулах), основанный на ОЭА. Показана высокая точность определения, соответствующая или превосходящая общепринятые методы. Способ не требует использования образцов сравнения аналитов, как и способ обнаружения активных компонентов JIC методом масс-спектрометрии DART.

8. С использованием разработанных подходов, основанных на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и его сочетании с ТСХ, исследован состав примесей, характеризующих качество таких природных JIC, как прополис, бадан и мед. Показана возможность быстрого контроля качества проб благодаря одновременной регистрации десятков соединений, в отличие от общепринятых методов анализа.

9. Разработана методология экспрессного определения качества лекарственных препаратов и субстанций, основанная на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и органическом элементном анализе, позволяющая решить проблему быстрого обнаружения фальсификатов, а также методология быстрого контроля качества природных JIC, основанная на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ.

Практическая значимость

1. Полученные данные о составе масс-спектров DART и их зависимости от условий эксперимента для широкого круга органических соединений различных классов позволяют сделать выводы о возможностях и ограничениях масс-спектрометрии DART и выявить критерии выбора условий анализа различных объектов.

2. Разработанные способы концентрирования растворов (экстрактов) расширяют возможности масс-спектрометрии DART для обнаружения аналитов на уровне следов и перспективны для решения ряда задач в фармацевтическом анализе, контроле качества лекарственных препаратов и продуктов питания и в идентификации компонентов других объектов сложного состава.

3. Предложен способ анализа, обеспечивающий возможность осуществления оперативного контроля благодаря отбору проб на месте контроля и транспортировке к анализатору, основанный на анализе концентратов с различных подложек методом масс-спектрометрии DART.

4. Разработанные способы визуализации ионизирующего потока из источника DART на объекте исследования и основанный на них способ сканирования объектов позволяют расширить существующие способы подачи пробы в масс-спектрометрии DART, исследовать ограничения ее сочетания с ТСХ online и существенно увеличить воспроизводимость анализа методом масс-спектрометрии DART.

5. Разработанный подход к скринингу мёда на 5-оксиметилфурфурол позволяет повысить производительность анализов в 10-15 раз, что важно для эффективного контроля качества.

6. На основании анализа более 100 образцов прополиса, собранных в различных регионах, разработан новый подход к классификации образцов прополиса, основанный на обнаружении фенольных соединений при совместном использовании масс-спектрометрии DART и ТСХ.

7. Благодаря масс-спектрометрии DART и ее сочетанию с ТСХ получены новые данные о составе экстрактов прополиса и бадана, имеющие значение для оценки качества и их целебных свойств. Показана перспективность разработанных подходов для быстрой характеристики качества природных лекарственных средств и их составляющих.

8. Разработанная методология скрининга активного вещества в лекарственных препаратах и субстанциях методами масс-спектрометрии DART и ОЭА обеспечивает быстрый контроль на фальсификаты и некачественные образцы в отсутствие образцов сравнения аналитов.

9. Разработанная методология анализа природных JIC, основанная на масс-спектрометрии DART и ТСХ, обеспечивает возможность быстрого сопоставления объектов исследования по многомерным признакам и обнаружения примесей, определяющих качество продукции. Разработанные подходы к классификации и идентификации ключевых компонентов растительного сырья перспективны для быстрого установления его происхождения, что важно для контроля качества препаратов на его основе и для быстрого анализа неизвестного растительного сырья, например, при криминалистической экспертизе.

Положения, выносимые на защиту

1. Данные изучения состава масс-спектров и критерии оптимизации условий анализа методом масс-спектрометрии DART в зависимости от аналитов и параметров эксперимента.

2. Способ снижения пределов обнаружения по концентрации для масс-спектрометрии DART на 2 порядка и более. Способ основан на концентрировании больших проб органических растворов и прямом анализе всего концентрата аналитов методом масс-спектрометрии DART.

3. Способ анализа методом масс-спектрометрии DART органических растворов (экстрактов), нанесенных на подложки из различных материалов, обеспечивающий возможность оперативного контроля благодаря отбору проб на месте контроля и транспортировке к анализатору.

4. Способы увеличения воспроизводимости анализа благодаря визуализации ионизирующего потока из источника DART на поверхности объекта исследования.

5. Новые способы анализа, основанные на сочетании масс-спектрометрии DART с ТСХ online и offline, включая впервые разработанный способ сканирования поверхностей.

6. Способ быстрого обнаружения активного компонента в органических субстанциях и лекарственных препаратах при использовании подходов, основанных на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения.

7. Способ быстрого определения содержания активного компонента в различных лекарственных препаратах (субстанции, капсулы, таблетки, растворы в ампулах), основанный на ОЭА, не требующий использования образцов сравнения аналитов.

8. Новые способы изучения состава природных ЛС при использовании подходов, основанных на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ.

9. Методология экспрессного определения качества лекарственных препаратов и субстанций, основанная на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и органическом элементном анализе, а также методология быстрого контроля качества природных ЛС, основанная на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ.

Апробация работы и публикации

Работа частично выполнена в рамках следующих научных проектов:

проект Международного научно-технического центра №2829 "Investigation of analytical approaches to determine the authenticity/quality of pharmaceutical products to improve the public health by identifying counterfeit and ineffective products" (20042006); грант Президента Российской Федерации МК-594.2010.3 «Масс-спектромет-рия DART: новый метод определения органических соединений в различных объектах без пробоподготовки и сопоставительная оценка возможности его использования для анализа лекарственных препаратов и биологических объектов» (20102011); совместный проект №2.2.2.3/9055 «Новые подходы к анализу препаратов природного происхождения, основанные на использовании плоскостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией» аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)" и программы Немецкой службы академических обменов (Deutscher Akademischer Austausch Dienst, DAAD) «Михаил Ломоносов» (2010-2011); совместный проект №15112 «Сочетание плоскостной хроматографии с масс-спектрометрией: новые подходы к анализу биологических образцов» аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)" и программы DAAD «Михаил Ломоносов» (2011); проект №C-2011b-xl Немецко-российского междисциплинарного научного центра (German-Russian Interdisciplinary Science Center, G-RISC) "Ion Formation in DART Mass Spectrometry"

(2011); проект «New hyphenated approaches for determination of phytochemicals in medicinal herbs using HPTLC/UV/Vis/FLD/HPLC/MS and bioassay-based detection» программы международного обмена между Россией и странами Евросоюза "Erasmus Mundus Action 2 - Partnerships // Project IAMONET-RU (Lot 5)" (20112012), и проект №2.1.2.1. Программы стратегического развития РУДН на 2012-2016 г.г. «Инновационные технологии мониторинга экзогенных веществ, биомаркеров и супертоксикантов в объектах окружающей среды и биофлюидах человека и животных».

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в более чем 50 тезисах докладов. Результаты исследований представлены на следующих международных и российских конференциях и симпозиумах, в том числе сделано 4 выступления в качестве приглашенного докладчика (выделены подчеркиванием"):

28-м Международном симпозиуме по капиллярной хроматографии и электрофорезу (Лас Вегас, США, 2005); 1-й Конференции ВВВВ по фармацевтическим наукам (Сиофок, Венгрия, 2005); Международном конгрессе ICAS-2006 (Москва, Россия, 2006); Международной конференции «Biocatalysis-2007: Fundamentals and Applications» (Москва - Санкт-Петербург, Россия, 2007); Всероссийском научно-практическом семинаре «Методы и приборное обеспечение для агропромышленного комплекса и пищевой промышленности» (Москва, Россия,

2009); III Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009» (Санкт-Петербург, Россия, 2009);

II Международном симпозиуме по сорбции и экстракции с заочным участием (Владивосток, Россия, 2009); III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2009); 11-й Международной конференции ISMAS по масс-спекгрометрии (Хайдерабад, Индия, 2009);

III Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2009); Съезде аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (Москва, Россия, 2010); Всероссийской конференции «Хроматография - народному хозяйству» (Дзержинск, Россия, 2010) 11-м Международном симпозиуме по гибридным методам в хроматографии и гибридным хроматографическим анализаторам НТС-11 (Брюгге, Бельгия, 2010); 4-й Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Звенигород, Россия, 2010); Международной научной конференции по аналитической химии и экологии (Алматы, Казахстан,

2010); 28-м Международном симпозиуме по хроматографии (Валенсия, Испания,

2010); Съезде Британского сообщества по масс-спектрометрии (Кардифф, Великобритания, 2010); 1-й Международной академической конференции молодых ученых "Chemistry and Chemical Technology 2010" (Львов, Украина, 2010); Съезде пищевых химиков Германии "Deutscher Lebensmittelchemikertag" (Халле, Германия,

2011); Съезде немецкого сообщества специалистов по пищевой химии "Lebensmittelchemische Gesellschaft. Fachgruppe in der Gesellschaft Deutscher Chemiker. Regionalverbände Nord & Süd-West. Gemeinsame Arbeitstagung 2011" (Кассель, Германия, 2011); Конференции "ANAKON 2011" (Цюрих, Швейцария, 2011); 13-м Весеннем симпозиуме молодых химиков Немецкого химического сообщества 2011 (Эрланген, Гермнаия, 2011); 36-м Международном симпозиуме "HPLC 2011" (Будапешт, Венгрия, 2011); 9-й Международной конференции по

масс-спектрометрии "PETROMASS 2011" (Москва, Россия, 2011); 5-м Международном симпозиуме по анализу продуктов питания "RAFA-2011" (Прага, Чехия, 2011); 2-м научном семинаре FCUB-ERA "Food chemistry and biotechnology" (Белград, Сербия, 2011); Европейской конференции по аналитической химии "EuroAnalysis XVI" (Белград, Сербия, 2011); IV-й Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2011); Международном симпозиуме по высокоэффективной тонкослойной хроматографии (Базель, Швейцария, 2011); XXXIV симпозиуме "Chromatographic Methods of Investigating the Organic Compounds" (Катовице -Шчырк, Польша, 2011); Европейской зимней конференции по спектрохимии плазмы (Сарагоса, Испания, 2011); 1-м Европейском научном семинаре "European Workshop on Ambient Mass Spectrometry and Related Mass Spectrometry-Based Techniques in Food / Natural Products Control; Safety, Authenticity, Forensics, Metabolomics" (Прага, Чехия, 2012); 8-м Зимнем симпозиуме по хемометрике "Modern Methods of Data Analysis" (Дракино, Россия, 2012); Российско-Немецком коллоквиуме общества Гумбольдта "Die Rolle der Grundlagenwissenschaften in der Gesellschaft" (Москва, Россия, 2012); Международной конференции по масс-спектрометрии NVMS - BSMS (Ролдук, Нидерланды, 2012); XVI Международном конгрессе "PHYTOPHARM 2012" (Санкт-Петербург, Россия, 2012); Совместной конференции немецкого и польского сообществ по масс-спектрометрии (Познань, Польша, 2012); 9-й Всероссийской конференции «Химия фтора» (Москва, Россия, 2012); 13-й Европейской конференции по химии объектов окружающей среды (Москва, Россия, 2012).

По материалам работы опубликовано 30 статей в рецензируемых журналах, в том числе б обзоров.

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включённые в диссертацию, состоит в формулировании направления исследования и общей постановке задач, непосредственном участии в экспериментальных исследованиях и апробации их результатов, творческом участии на всех этапах исследований, в обсуждении, интерпретации, обработке, обобщении и оформлении результатов исследований, а также в подготовке основных публикаций по теме диссертации.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5-и глав с обсуждением полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 192 страницах текста, содержит 24 таблицы и 44 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 305 наименований.

1. Основное содержание работы

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы её цель и задачи, решение которых необходимо для достижения цели. Обоснована целесообразность развития способов быстрого анализа JIC методом масс-спектрометрии DART. Развитие этих работ актуально как для снижения длительности пробоподготовки и затрат на проведение анализов при контроле качества, так и для увеличения достоверности и полноты получаемой информации при исследовании образцов неизвестного состава.

В первой главе проведен критический обзор имеющихся литературных данных о масс-спектрометрии DART и ее применениях в анализе лекарств и биоматёриалов. На основании обзора выявлен ряд возможностей и ограничений метода, особое внимание уделено однозначности состава масс-спектров, возможности определения следовых концентраций аналитов, и существующим способам концентрирования для масс-спекгрометрии DART. В этой же главе обсуждается влияние на состав масс-спектров DART различных условий эксперимента. Обсуждаются возможности сочетания масс-спекгрометрии DART с различными хроматографическими методами, особенно с планарной хроматографией.

Во второй главе обсуждаются результаты исследования масс-спектров DART разных соединений при использовании различных масс-анализаторов и конфигураций вакуумного интерфейса между источником DART и входом в масс-анализатор. Показана зависимость состава масс-спектров DART, полученных с использованием разных масс-анализаторов, от условий эксперимента, на примере различных соединений, в том числе типичного вещества-стандарта для калибровки шкалы массовых чисел в масс-спектрометрии DART - полиэтиленгликоля. На ряде примеров обсуждается влияние на состав масс-спектров DART состава и скорости потока газа-носителя, давления в вакуумном интерфейсе, температуры и состава атмосферы в области ионизации, присутствия добавки неона в гелии, параметров керамической трубки вакуумного интерфейса, и напряжения на входе в масс-анализатор. Сформулированы критерии выбора условий регистрации масс-спектров DART.

Третья глава посвящена разработке и изучению способов ввода проб для DART. Рассматриваются ограничения прямого анализа ряда матриц. Описан способ снижения пределов обнаружения масс-спектрометрии DART по концентрации на 2 порядка и более за счет предварительного концентрирования анализируемых растворов (экстрактов) и анализе всего концентрата. Обсуждаются его перспективы с точки зрения определения различных аналитов на уровне следов. Обсуждается преимущества разработанных способов концентрирования растворов (экстрактов) и их анализа методом масс-спектрометрии DART на различных поверхностях. Такое предварительное концентрирование позволяет облегчить транспортировку образцов и расширить возможности их межлабораторного анализа.

В четвертой главе рассмотрены способы визуального определения точки фокусирования (визуализации) ионизирующего потока из источника DART на поверхности объекта исследования offline и online, позволившие впервые разработать способ сканирования поверхностей методом масс-спектрометрии DART. Благодаря этим способам осуществлена разработка условий сканирования различных плоских поверхностей, включая пластины для ТСХ, путем десорбции и ионизации DART аналитов с этих поверхностей. Предварительный выбор условий сканирования путем визуализации позволил существенно увеличить воспроизводимость площадей пиков на хронограммах DART по сравнению с существующим подходом. Благодаря обеспечению условий воспроизводимого сканирования впервые изучены ограничения сочетания масс-спектрометрии DART с ТСХ.

В пятой главе представлены результаты разработки способа быстрого обнаружения основного компонента в органических субстанциях и лекарственных препаратах методом масс-спекгрометрии DART низкого и высокого разрешения и быстрого определения содержания основного компонента в фармацевтических субстанциях и лекарственных препаратах при использовании ОЭА. Разработанный способ анализа методом ОЭА рассматривается как комплементарный к масс-спек-трометрии DART, так как позволяет быстро определять содержание действующего вещества в ряде JIC, тогда как масс-спектрометрия DART позволяет проводить быстрое обнаружение этого компонента и получать данные о присутствии других низкомолекулярных компонентов в образце. Способ определения содержания основан на расчете количества азота в навеске анализируемого препарата при использовании для градуировки стандартного вещества для элементного анализа. При использовании такого подхода разработаны способы анализа субстанций и различных лекарственных форм. Проведено сопоставление результатов быстрого определения содержания разработанными способами и общепринятыми методами и показано, что значимого различия нет. На основании разработанных подходов предложена методология быстрого скрининга фармацевтических препаратов и субстанций на фальсификаты и некачественные образцы, основанная на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и ОЭА.

В шестой главе описаны разработанные новые подходы к быстрому анализу природных JIC, основанные на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ. В качестве примеров практического применения рассмотрены результаты анализа различных природных ЛС с использованием разработанных новых подходов: пчелиного меда, прополиса и бадана (Bergenia crassifolia L.). Разработан способ быстрого скрининга пчелиного меда на 5-оксиметилфурфурол (ОМФ) методом масс-спектрометрии DART и ТСХ. На примере анализа более 100 различных образцов прополиса рассмотрены новые экспрессные подходы к изучению состава природного лекарственного сырья при сочетании данных масс-спектрометрии DART и ТСХ. Разработанные подходы позволили получить новые данные о составе ряда компонентов бадана, потенциально определяющих его целебные свойства.

2. Изучение закономерностей образования масс-спектров DART

2.1. Изучение состава масс-спектров при сочетании источника DART с времяпролетным масс-спектрометром «AccuTOF»

Механизм ионизации DART схож с механизмом химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД), но в DART, в связи с образованием ионов в условиях открытой атмосферы, в ион-молекулярных реакциях могут участвовать любые компоненты внешней среды. Поэтому процесс новообразования значительно сложнее ХИАД, а данные о закономерностях образования масс-спектров трудно поддаются обобщению. На момент начала данного исследования доступные в литературе данные масс-спекгрометрии DART были получены преимущественно при сочетании источника DART с времяпролетным масс-спектрометром «AccuTOF» фирмы «JEOL», но даже для этого типа масс-спектрометра данные о составе масс-спектров были изучены недостаточно. Так, даже для полиэтиленгликоля (ПЭГ), используемого в качестве стандартного

вещества для калибровки шкалы масс такого масс-спектрометра при ионизации DART, отсутствовали данные о стабильности состава масс-спектров DART. В этой главе на примере ПЭГ приведены данные о неоднозначности состава масс-спектров DART даже при использовании наиболее изученного с DART масс-спектрометра «AccuTOF». Обсуждается зависимость состава масс-спектров от условий эксперимента и момента регистрации на протяжении всего времени ввода образца в область ионизации, что связано с термодесорбцией компонентов в разное время, в зависимости от летучести и молекулярной массы этих компонентов.

2.2. Изучение состава масс-спектров при сочетании источника DART с масс-аиализаторами других типов

Как установлено в результате проведенных исследований, составом масс-спектров DART можно частично управлять путем варьирования условий эксперимента. Представляло интерес проведение исследования влияния различных факторов на состав масс-спектров DART для разных масс-анализаторов при использовании вакуумного интерфейса модели «Vapur» (IonSense, США), разработанного для сочетания источников DART с масс-спектрометрами, отличающимися от «AccuTOF». В результате комплексного исследования масс-спектров DART органических соединений различных классов (алифатические и ароматические углеводороды, карбонилсодержащие соединения, углеводы, гетероциклические соединения, фенольные соединения, карбоновые кислоты, аминокислоты) при сочетании DART с масс-анализатором посредством вакуумного интерфейса установлены зависимости состава масс-спектров DART от следующих изученных параметров объектов анализа и эксперимента: состав матрицы образца, состав окружающей атмосферы, температура, состав и скорость потока газа-носителя для DART, размеры керамической трубки, давление в вакуумном интерфейсе, напряжение на входе в масс-анализатор. В данной главе при обобщении накопленных данных, полученных при исследованиях разных аналитов в различных матрицах и в различных условиях, приведены способы влияния на долю кластерных или фрагментных ионов в масс-спектрах различных аналитов. Выбраны условия эксперимента, которые можно использовать в качестве исходных и затем оптимизировать далее в зависимости от аналита и задачи исследования.

2.3. Критерии выбора условий регистрации масс-спектров DART

В результате проведенного исследования установлены следующие обобщенные закономерности образования масс-спектров при сочетании ионизации DART с различными масс-анализаторами:

1) Масс-спектры DART положительных ионов большинства классов соединений (в т.ч. карбонилсодержащие соединения, углеводы, аминокислоты, гетероциклические соединения), в зависимости от состава аналитов и условий эксперимента, содержат такие ионы, как [М+Н]~, [иМ+Н]+, [M+NHj]"1", [/¡M+NH4]+, [М+Н-Н20]+, [M+H->!HiO]+, аддукты с молекулами растворителя и др.

2) Чем выше концентрация аналитов в образце, тем выше доля кластерных ионов в масс-спектрах DART положительных (например, [2М+Н]+, [ЗМ+Н]+ и др.) и отрицательных (например, [иМ-Н] ~) ионов.

3) Алифатические и ароматические углеводороды образуют сложные серии ионов, в которых присутствуют Мк, [М+Н]+, [М-Н]', [М+иО-/иН]', алкильные фрагменты и др.

4) Масс-спектры DART многих спиртов характеризуются особо сложным составом (множество ионов-адцуктов и фрагментных ионов).

5) В режиме регистрации отрицательных ионов соединения-кислоты (фенольные соединения, карбоновые кислоты, аминокислоты) часто образуют интенсивные ионы [М-Н]~, а галогенированные соединения образуют ионы [М-На1]~. Возможна также регистрация ионов состава [jcM+nO—Н]~. В большинстве случаев для соединений-кислот воспроизводимость масс-спектров DART отрицательных ионов выше воспроизводимости масс-спектров положительных ионов, предположительно, из-за снижения влияния матрицы за счет избирательной ионизации.

В качестве обобщенных оптимальных значений для условий эксперимента в начале любого исследования методом масс-спектрометрии DART с различными масс-анализаторами выбраны следующие параметры источника ионизации и области вакуумного интерфейса:

• газ-носитель - чистый гелий, если иное не требуется по условиям эксперимента, со скоростью потока около 3 л/мин;

• температура в источнике ионов - от 100 до 300°С, в зависимости от термостабильности аналитов и матрицы;

• длина керамической трубки — минимальная возможная для данной конфигурации масс-спектрометра, а ее диаметр - максимальный из доступных;

• скорость откачивания вакуумного интерфейса масс-спектрометра -минимальная (12 л/мин);

• значение фрагментирующего напряжения, равное 70 В (для системы ввода, включающей стеклянный капилляр);

• для соединений-кислот - режим регистрации отрицательных ионов.

Поскольку часто ионизация DART происходит с образованием масс-спектров

сложного состава, в общем случае для интерпретации масс-спектров неизвестных смесей необходимы предварительные знания о закономерностях ионизации DART предполагаемых компонентов, которые не всегда доступны. На основании выявленных закономерностей можно заключить, что масс-спектрометрия DART хорошо подходит для скрининга путем обнаружения заданных аналитов в различных объектах, в том числе смесях сложного состава (при использовании масс-анализа-тора высокого разрешения). В связи с отсутствием единых для всех аналитов и матриц условий для обеспечения однозначной интерпретаций масс-спектров DART, для изучения состава сложных смесей и проверки результатов первичной идентификации неизвестных компонентов, проведенной методом масс-спектроме-трии DART, следует сочетать ее с другими аналитическими методами, обеспечивающими увеличение селективности и дополнительную информацию для идентификации компонентов образцов - например, ТСХ. Проведенное исследование масс-спектров DART и выявление обобщенных оптимальных условий эксперимента позволило перейти к разработке способов сканирования поверхностей объектов методом масс-спектрометр™ DART.

3. Разработка способов сканирования поверхностей объектов методом масс-спектрометрии DART

3.1. Разработка условий сканирования поверхностей объектов методом масс-спектрометрии DART

Ранее во всех источниках DART подача газа по отношению к образцу и входу в масс-анализатор осуществлялась строго горизонтально, поэтому развитие способов сканирующего анализа поверхностей было затруднительно, так как объекты исследования могли блокировать поток газа-носителя. Источник DART с изменяемым углом наклона был разработан недавно, но для него отсутствовала методология сканирования поверхностей. Необходимо было разработать способы визуального определения точки фокусирования (визуализации) газового потока из источника DART на поверхности объекта исследований для его точного позиционирования при сканировании методом масс-спектрометрии DART и безошибочного определения координат сканируемого участка для правильного соотнесения регистрируемых масс-спектрометрических данных с областями анализируемой поверхности. Эти способы должны были быть универсальны и не зависеть от типа масс-спектрометра, сочетаемого с источником DART, конфигурации используемого вакуумного интерфейса и размеров объектов исследования, так как должны были обеспечивать оптимизацию для каждого индивидуального случая. Нами впервые введено понятие «визуализации» в масс-спектрометрии DART и разработаны способы визуализации газового потока на анализируемой поверхности.

3.1.1. Разработка способов визуализации offline

Разработанные способы визуализации газового потока offline включали определение оптимальных координат для сканирования объекта до начала непосредственной регистрации масс-спектров. При разработке способов визуализации изучены различные реагенты, обеспечивающие образование окрашенного продукта в результате термохимических реакций. Например, рис. 1 иллюстрирует визуализацию при перемещении ТСХ-пластины, обработанной раствором сахара и реагентом 2-нафтола и серной кислоты, в области ионизации DART.

Chernetsova ES., Rcvelsky A.I., Morlock G.E. Some new features of Direct Analysis in Real Time mass spectrometry witil dcsorplion at an angle option ¡1 Rapid Commun. Mass Spectrom. 2011. V. 25. № 16. P. 2275 -2282.

Рис. 1. Визуализация ионизирующего потока при сканировании ТСХ-пластины в области ионизации DART, основанная на термохимической реакции3

Разработанный подход является общим, так как для визуализации offline можно подбирать реагенты в зависимости от требуемой температуры и скорости

окрашивания при сканировании. Достоинством такой визуализации является возможность документировать ее результаты в виде фотоснимков и точно подбирать условия, обеспечивающие попадание ионизирующего потока в точку на поверхности объекта исследования, что важно, например, для сочетания DART и ТСХ online. Однако сам анализ объекта необходимо проводить отдельно, после визуализации, так как в результате применения реагентов для визуализации происходит изменение химического состава образца. В связи с этим актуальна была разработка способов визуализации online, обеспечивающих контроль позиционирования образца в ходе анализа, в режиме реального времени и без искажения его состава.

3.1.2. Разработка способов визуализации online

Нами впервые исследована возможность использования эффекта свечения газа-носителя для масс-спектрометрии DART в условиях затемнения для визуализации online. Исследования проводили при использовании чистого гелия или гелия с 10% добавкой неона (объемн.) в качестве газа-носителя для DART. Разрабатывали условия, обеспечивающие увеличение точности измерений при сканировании плоских поверхностей методом масс-спектрометрии DART за счет размещения и точного позиционирования объектов исследования в ходе анализа в области ионизации DART с адаптируемыми координатами. Как установлено, в результате тлеющего разряда в DART возникает, в зависимости от состава газа-носителя, красное (для смеси гелия с неоном) или лиловое (для чистого гелия) свечение в потоке газа, регистрируемое при затемнении в виде цветного светового пятна на сканируемой поверхности. Интенсивность свечения не зависит от температуры проведения анализа в DART и определяется составом газа-носителя. Более яркое свечение обеспечивает использование в качестве газа-носителя гелия с добавкой неона, однако использование чистого гелия также позволяет наблюдать свечение плазмы, интенсивность которого достаточна для наблюдения за фокусом ионизирующего потока в ходе сканирования поверхности методом масс-спектрометрии DART и регистрации видеозаписи наблюдений для документирования данных. Установленное свечение газа при ионизации DART является единственным на сегодняшний день способом отслеживания точки фокусирования потока газа из источника DART при сканировании поверхностей в реальном времени. Его использовали для последующих исследований и разработки условий сканирования поверхностей, в том числе пластин ТСХ, а также для разработки подходов к концентрированию аналитов и их хранению на различных подложках.

3.2. Разработка условий сочетания масс-спектрометрии DART и ТСХ

3.2.1. Изучение сочетания масс-спектрометрии DART с планарной хроматографией online

На основании предварительных исследований установили, что во избежание загрязнения системы ввода в масс-анализатор перед анализом методом масс-спектрометрии DART следует готовить ТСХ-пластины к вводу в область ионизации путем удаления неплотно прилегающих к поверхности частиц. Анализ затрудняет проводимость тепла по пластине, в результате чего происходит термодесорбция аналитов не только из анализируемой зоны, но и из соседних к ней зон, что влияет на регистрируемые масс-спектры и хронограммы. Как было установлено, в целом выявленные в результате изучения масс-спектров DART обобщенные

оптимальные температуры подходят и для анализа ТСХ-пластин, но при сканировании ТСХ-пластин следует также учитывать эффекты, связанные с термодесорбцией аналитов из анализируемой и соседних зон, поэтому требовался индивидуальный подбор условий, в зависимости от аналитов. Для изучения сочетания масс-спектрометрии DART и ТСХ online необходимо было оценить воспроизводимость сканирования ТСХ-пластин и оценить степени термодесорбции и способы увеличения аналитического сигнала.

3.2.1.1. Оценка воспроизводимости сканирования ТСХ-пластин

В результате исследования, проведенного на основании разработанных способов визуализации путем варьирования пространственного расположения пластин ТСХ и источника DART по отношению к входу в масс-анализатор, выбрали оптимальные условия сканирования ТСХ-пластин при их точном позиционировании в области ионизации при анализе. Для этого использовали разработанный гот/ме-подход к визуализации, включавший одновременное наблюдение за свечением ионизирующего потока в условиях затемнения и анализ объекта. На рис. 2 приведена хронограмма DART, полученная в режиме сканирования пластины ТСХ с нанесенными на нее зонами 5-оксиметилфурфурола (ОМФ).

Иитеысмностц от ед

Рис. 2. Хронограмма ТСХ-пластины с зонами, содержащими по 1 и 10 мкг ОМФ, зарегистрированная в режиме сканирования методом масс-спектрометрии DART4

Пять зон размером 5x3 мм содержали по 1 мкг ОМФ, и пять зон такого же размера содержали по 10 мкг ОМФ. Зоны аналитов наносили с помощью автодозатора для ТСХ фирмы CAMAG, что обеспечивало высокую точность воспроизведения их размеров и распределения аналита внутри сорбента. Относительные стандартные отклонения .sr при проведении пяти параллельных измерений составляли 17 и 12% для зон, содержащих 1 мкг и 10 мкг аналита, соответственно. Таким образом, при сочетании ТСХ и масс-спектрометрии DART были впервые достигнуты улучшенные показатели воспроизводимости сигналов аналитов с ниже 20% в отсутствие внутреннего стандарта, обеспечиваемые оптимизированными условиями сканирования. Вместе с тем, относительные интенсивности сигналов, регистрируемых при прямом сочетании ТСХ и масс-спектрометрии DART, были значительно ниже интенсивностей сигналов тех же аналитов при их детектировании с поверхностей стекла. Необходимо было

1 Chernetsova E.S., Morlock G. Assessing the capabilities of Direct Analysis in Real Time mass spectrometry for 5-hydroxymethylfurfural quantitation in honey. Int. J. Mass Spectrom. 2012. V. 314. № 4. P. 22 - 32.

исследовать влияние термодесорбции аналитов с сорбента и пространственных ограничений при сканировании методом масс-спектрометрии DART на интенсивности сигналов аналитов.

3.2.1.2. Оценка возможности оптимизации аналитического сигнала при сочетании масс-спектрометрии DART с ТСХ

Нами показано, что не только состав и состояние матрицы, но и особенности состава и формы поверхности образца влияют на результаты анализов методом масс-спектрометрии DART. Предполагалось, что проблемой, ограничивающей возможности прямого сочетания DART с ТСХ, является малая степень десорбции аналитов из слоя сорбента (силикагеля). Кроме того, предполагалось, что при направлении потока газа под углом к анализируемой поверхности снижается степень переноса ионов в масс-анализатор за счет их рассеивания при отражении от поверхности.

На рис. 3 приведены хронограммы четырех зон по 600 и 60000 нг арбутина площадью 5 мм х 3 мм, нанесенных на поверхность стекла и на ТСХ-пластину, зарегистрированные в идентичных условиях сканирования со скоростью 0.2 мм/с. Расстояние между соседними зонами составляло 6 мм, что соответствовало интервалу около 30 секунд между краями соседних зон.

Интенсивность, ОТН.

ьоооо -

6ОО нг арбутине на поверхности ствкла i

Интенсивность, ОТН. ед.

5DOOO

к

60000 нг вр&утино нанесенные не пластину ТСХ с толщиной слоя силикагеля около 200 мкм

f\

Рис. 3. DART-хронограммы четырех зон арбутина, нанесенных на стеклянную поверхность (600 нг, слева) и на ТСХ-пластину (60000 нг, справа), зарегистрированные в идентичных условиях сканирования5

Путем оценки базовой линии между зарегистрированными сигналами с пластины установили, что расстояние между соседними пиками на хронограмме в случае анализа со стеклянной пластины составляло 21+4 секунды, что свидетельствовало о начале термодесорбции и ионизации аналитов раньше, чем соответствующая зона попадала в фокус ионизирующего потока. Наблюдаемые ранние термодесорбция и ионизация DART аналитов объяснялись нагреванием соседних с зоной анализа участков пластины вследствие проводимости тепла через сорбент и соответствующим переходом аналитов из соседних к анализируемому участку зон в область ионизации. Видно, что относительные интенсивности сигналов с пластины ТСХ ниже относительных интенсивности сигналов со стеклянной пластины, хотя коли-

5 Chernetsova E.S., Mor/ock G.E. Surface analysis by direct analysis in real time mass spectrometry employing plasma glow visualization. Тез. докл. 13-й Европейской конференции по химии объектов окружающей среды (ЕМЕС13). Москва, Россия, 2012, 05-08 декабря. С. 27.

чество аналита, нанесенного на ТСХ-пластину, выше в 100 раз. Проведенная оценка позволила заключить, что в приведенном примере степень десорбции аналитов с ТСХ-пластины составляла менее 10%, что объясняет сравнительно невысокие относительные интенсивности сигналов аналитов при прямом сочетании ТСХ с масс-спектрометрией DART online и ограничения применимости такого сочетания.

Пример анализа идентичных количеств аналитов, нанесенных на одинаковый материал (стекло), иллюстрирует влияние угла подачи газа на чувствительность детектирования аналитов (рис. 4). Интенсивность, отн. ед.

600 нг арбутина, горизонтальная подача газа : по направлению к сконцентрированным анапитам и входу в масс-анализатор

' время, мин

Рис. 4. DART-хронограмма четырех проб 600 нг арбутина, нанесенных на стеклянные капилляры, зарегистрированная при сканировании этих капилляров при условии горизонтальной подачи газа из источника DART5

При сравнении DART-хронограммы четырех стеклянных капилляров с нанесенными 600 нг арбутина, зарегистрированной при сканировании этих капилляров с горизонтальной подачей газа из источника DART с DART-хронограммой четырех зон идентичного количества арбутина на поверхности стекла (рис. 3, слева) видно, что интенсивность сигналов при горизонтальной подаче газа из источника выше в 4 раза. Таким образом, установлено, что помимо малых степеней десорбции аналитов с ТСХ-пластин, другим фактором, ограничивающим развитие масс-спектрометрии DART для прямого детектирования аналитов, нанесенных на различные поверхности, является неполный перенос ионов аналитов в масс-анализатор. При прямом анализе поверхностей поток газа из источника DART направляется под углом к поверхности, отражается от нее и вместе с ионами аналитов частично рассеивается в окружающую среду, не попадая во входное отверстие вакуумного интерфейса масс-анализатора.

Установленные ограничения при детектировании аналитов, нанесенных на различные поверхности, методом масс-спектрометрии DART, приводящие к снижению относительных интенсивностей сигналов аналитов, позволяют прийти к следующему заключению. В ряде случаев, в зависимости от образца и аналитической задачи, целесообразно проведение простой пробоподготовки, способствующей переводу образца в состояние, подходящее для анализа методом масс-спектрометрии DART с горизонтальной подачей газа по отношению к поверхности и входу в масс-анализатор. Для детектирования следовых количеств привлекательно сочетание offline, позволяющее проводить концентрирование аналитов и их анализ в оптимальных условиях, а для детектирования сравнительно больших количеств аналитов на пластине возможно сочетание ТСХ и масс-спектрометрии DART online при сканировании пластины в потоке нагретого газа из источника DART.

3.2.2. Достоинства и ограничения разных способов сочетания масс-спектрометрии DART с планарной хроматографией

В силу выявленных ограничений прямого (online) сочетания ТСХ с масс-спек-трометрией DART, можно заключить, что выбор оптимального способа сочетания в каждом случае индивидуален и зависит от постановки задачи исследования. В зависимости от задачи, исходя из целесообразности той или иной стратегии, возможные следующие способы реализации сочетания ТСХ и масс-спектрометрии: сочетание online, сочетание offline, и сочетание информации, полученной независимо методами масс-спектрометрии DART и ТСХ. В результате проведенных исследований сформулированы рекомендации для обоснования выбора сочетания ТСХ с масс-спектрометрией DART в зависимости от целей исследования. При необходимости обнаружения аналитов на уровне следов, как следовало из проведенных исследований, необходимо сочетать ТСХ с масс-спектрометрией DART offline, используя подходы к детектированию низких концентраций аналитов, разработанные в следующем разделе.

4. Разработка новых подходов в масс-спектрометрии DART

для детектирования аналитов на уровне следов и межлабораторного анализа

В результате проведенных исследований установлено, что подбор условий эксперимента в масс-спектрометрии DART необходимо осуществлять индивидуально для каждой матрицы и типа аналитов, обеспечивая оптимальное сочетание условий.

4.1. Ограничения прямого анализа некоторых матриц методом масс-спектрометрии DART

При анализе разбавленных растворов десорбция и ионизация аналитов преимущественно происходит уже после испарения растворителя с поверхности носителя, т.е. фактически из малого количества сухого остатка. При анализе вязких растворов и твердых объектов десорбция и ионизация аналитов происходит непосредственно из матрицы образца, при этом важно исключить загрязнение системы ввода масс-спектрометра частицами этой матрицы. В результате проведенных исследований установлено, что условия анализа методом масс-спектрометрии DART следует отрабатывать индивидуально, в зависимости от состава матрицы образца, требуемой производительности анализов и возможности проводить периодическую очистку системы ввода масс-анализатора. В связи с этими ограничениями, актуальными являлись разработка и развитие новых способов ввода проб для DART, позволяющих перевести аналиты в наиболее подходящую для анализа форму.

4.2. Разработка новых способов ввода проб в масс-спектрометрии DART, основанных на концентрировании аналитов на различных подложках и анализе всего концентрата

4.2.1. Быстрое предварительное концентрирование аналитов из растворов (экстрактов) для обнаружения следовых количеств органических соединений

Актуальной являлась разработка подходов к снижению пределов обнаружения масс-спектрометрии DART по концентрации. Была изучена возможность анализа больших проб органических растворов с предварительным удалением растворителя

из контейнера (лодочки) путем испарения и анализа всего концентрата методом масс-спектрометрии DART. В стеклянные лодочки наносили растворы кумафоса в метаноле (состав приведен в табл. 1).

Таблица 1. Способ приготовления серий проб кумафоса в стеклянных лодочках6

№ серия А (пробы одинакового малого объема) серия Б (пробы с одинаковыми концентрациями, объемы 1 - 100 мкл) Количество кумафоса в нанесенном объеме раствора, нг

1 5 мкл, 0.4 мкг/мл 1 мкл, 2 мкг/мл 2

2 5 мкл, 4.8 мкг/мл 12 мкл, 2 мкг/мл 24

3 5 мкл, 40 мкг/мл 100 мкл, 2 мкг/мл 200

Для обеспечения идентичных условий пробоподготовки растворитель удаляли за счет его испарения и анализировали сухие концентраты при их позиционировании в области ионизации DART и анализе путем направления ионизирующего потока газа под углом 30° к поверхности лодочек. Анализ двух серий образцов позволил сопоставить сигналы, соответствующие одним и тем же количествам аналита, нанесенным в фиксированном малом объеме (5 мкл) и в различных по объему пробах растворов (в диапазоне от 1 до 100 мкл). Из данных табл. 2 о высотах пиков кумафоса в зависимости от его количества, полученных при вводе в лодочку проб объемом 5 мкл и от 1 до 100 мкл, следует, что в пределах погрешности эксперимента для одного и того же количества кумафоса сигнал был одинаковым и не зависел от объема анализируемой пробы раствора. Эти же данные подтверждают отсутствие потерь аналита в процессе концентрирования с удалением растворителя, а также отсутствие дрейфа интенсивностей сигнала в течение всего времени эксперимента в результате возможного изменения состава воздуха лаборатории.

Таблица 2. Зависимость высот пиков кумафоса на хронограмме DART (SIM, m/z 380) от количества аналита в стеклянной лодочке для серий А и Б6_

№ Количество кумафоса, Высота пика кумафоса (п = 3)*

нг серия А серия Б

1 2 1.2Х104 1.2x104

2 24 4.7Х104 4.9Х104

3 200 4.7x10° 3.7x10"

* Относительное стандартное отклонение составляло в среднем 40 - 50%

Низкая воспроизводимость сигналов объяснялась неопгимальной формой используемых стеклянных лодочек с плоским дном. Улучшение воспроизводимости возможно при использовании стеклянных лодочек с коническим дном и меньшего объема. Недостатком описанного способа концентрирования на стеклянной поверхности является необходимость подачи газа из источника DART под углом, что приводит к потере сигнала.

При развитии данного подхода и сравнении ряда возможных подложек нами была изучена возможность быстрого анализа растворов (экстрактов) путем пробоподготовки, включающей нанесение анализируемых растворов (экстрактов) на подложку-сетку малого диаметра, и последующего анализа этих подложек с горизонтальной подачей газа-носителя из источника DART. Для этого метанольные

6 Ревельский И.Л.. Черпецова Е.С., Ревелъскии А.И., Мор.юк Г.Е. Масс-спеетрометрия DART: определение следов органических соединений в органических растворах // Масс-спектрометрия. 2011. Т. 8. № 3. С. 23 5 -255.

растворы аналитов (в данном примере, нарингенина) в диапазоне концентраций 1 -100 мкг/мл наносили на специальные картриджи с металлической сеткой-вкладышем из нержавеющей стали. Объемы наносимых растворов составляли 1, 5, 50 и 100 мкл, в зависимости от концентрации. При дозировании таких растворов и нанесении их на сетку установили, что оптимальным является однократное нанесение и высушивание 5-10 мкл раствора, поскольку капли большего объема не удерживаются металлической сеткой такого картриджа (рис. 5).

р....... н ||||тцщ|игг1 Пгюи^адь пика на хронограмме. отм е&.

ШЗь

g

Рис. 5. Нанесение растворов на металлическую сетку картриджа (слева) и сравнение площадей пиков на хронограмме DART модельных растворов, содержащих 50, 100 и 500 нг нарингенина при нанесении на сетку различных объемов раствора (справа; п = 6. Р = 0.95)7

100 мг 500 нг

Относительное стандартное отклонение (sv) плошадей пиков на хронограммах DART нарингенина в диапазоне 50 — 500 нг составляло около 60 - 70% и не зависело от наносимого объема (рис. 2, справа), что подтверждает принципиальную возможность анализа как малых (1-10 мкл), так и больших объемов (50 - 100 мкл) растворов или экстрактов методом масс-спектрометрии DART с предварительным концентрированием этих растворов на вкладышах с металлической сеткой-вставкой. Зарегистрированные высокие значения sr в данном исследовании объяснялись использованием опытной партии картриджей для DART, воспроизводимость позиционирования которых в области ионизации была низкой. Полученные данные свидетельствуют о перспективности совершенствования способов изготовления таких картриджей для хорошо воспроизводимых количественных измерений и детектирования следовых количеств аналитов в растворах (экстрактах). Ввод проб растворов объемом 100 мкл и выше позволяет на 2 порядка и более снизить пределы обнаружения метода масс-спектрометрии DART по концентрации по сравнению со стандартным вводом малой части раствора. Объем пробы анализируемого раствора может быть увеличен дополнительно при последовательном повторении циклов нанесения на сетку и удалении растворителя.

Таким образом, предложены новые подходы к анализу растворов (экстрактов) на содержание следов органических соединений, которые позволяют на 2 порядка и более снизить пределы обнаружения метода масс-спектрометрии DART по концентрации, что расширяет ее возможности в анализе следовых концентраций. Предлагаемые подходы целесообразно использовать для определения следов среднелетучих и малолетучих органических соединений в растворах (экстрактах). Кроме того, их использование представляется перспективным для сочетания ТСХ с

7 Chernelsova E.S.. Crawford H.A., Shikov A.N., Pozhantskaya O.N., Makarox V.G., Morlock G.E. ID-CUBE Direct Analysis in Real Time high resolution mass spectrometry and its capabilities in the identification of phenolic components from the green leaves of Bergenia crassifolia L. it Rapid Commun. Mass Spectrom. 2012. V. 26. № 11. P. 1329- 1337.

масс-спектрометрией DART offline путем экстрагирования аналитов из силикагеля и последующего анализа экстрактов, поскольку при таком подходе возможно обеспечение анализа всего концентрата аналитов, что невозможно при online-подходе из-за низких степеней десорбции аналитов из слоя силикагеля на пластине.

Разработанные подходы позволяют расширить возможности масс-спекгрометрии DART с точки зрения определения различных аналитов на уровне следов и решить ряд важных задач в фармацевтическом анализе, контроле качества JIC и продуктов питания и идентификации компонентов сложных смесей.

4.2.2. Анализ концентратов аналитов из органических экстрактов

Перспективным направлением в масс-спектрометрии DART является прямой анализ сухих концентратов экстрактов и других жидкостей на носителе. Он особенно привлекателен при необходимости анализа образцов, хранение которых в жидком состоянии затруднительно, например, из-за ограничений при транспортировке. Изучали особенности ионизации DART при предварительном концентрировании на следующих носителях и анализ сухих остатков: стеклянные капилляры, стеклянные лодочки и пластины, ТСХ-пластины, металлические спирали, картриджи с металлической сеткой-вкладышем из нержавеющей стали. Как было установлено, наиболее подходящими носителями для анализа концентратов картриджи с сеткой, позволяющие транспортировать или хранить пробы и затем производить их анализ методом масс-спектрометрии DART при горизонтальной подаче газа (через сетку).

Путем анализа сухих пятен экстрактов прополиса с использованием ионизации DART и масс-спектрометра на основе орбитальной ионной ловушки и сопоставления с данными анализа соответствующих жидких экстрактов, подтвердили возможность обнаружения аналитов из сухих пятен после их авиаперевозки из одной лаборатории в другую, что подтверждает целесообразность предлагаемого подхода с точки зрения хранения и транспортировки жидкостей. В масс-спектрах DART высокого разрешения сухих пятен экстрактов прополиса (табл. 3) зарегистрированы те же характеристичные сигналы фенольных компонентов, которые зарегистрированы и при анализе жидких экстрактов.

Таблица 3. Характеристичные сигналы компонентов с фенольной структурой, обнаруженные в масс-спектрах DART отрицательных ионов экстрактов прополиса8_

tn/Z-леп. Элементный состав иопа 6m. а.е.м. П ред по латаемое название компонента Предполагаемая структура Число пнтаровапий в литературе о присутствии в составе прополиса

151.0393 СкНтСЬ -1.2M0"4 ванилин 91

163.0393 CJItO, -1.3* Ю-1 кумаровая кислота Н0 \ У—\ /он \> 211

но \

179.0343 СцНтОч -1.1*10^ кофейная кислота чо 263

8 Cherneisova E.S., Bromirski M., Scheibner O., Morlock G. DART-benclitop Orbitrap MS: a novel mass spectrometric approach for the identification of phenolic compounds in propolis. Anal. Bioana!. Chem. 2012. V. 403. №10. P. 2859-2867.

Элементный состав иона 5т, а.е.м. Прелполагаемое название компонента Предполагаем ая структура Число щггировашщ в литератл'ре 0 присутствии в составе прополиса

193.0501 СщНвОч 0.7x10-* феруловая кислота —о чо 203

метиловый эфир кофейной кислоты но "-Ь-ч^г чо 11

247.0973 С,<Н,,04 2.8*10*« премиловый эфир кофейной кислоты но 33

253.0508 С|<Нд04 7-2х1<г* ХрНЗИН но о 327

253.0868 СцН,..0, 3.7x10^ изомеры ыетокси-флаванона например. - 6-метокснфлаванон 18

255.0661 С|Л|04 4.4 х Ю"4 пннопембрия но О 253

и з о.тикв ирнген }Ш (или ликвиригения) 13

269.0820 ЫхКГ1 бензиновый тфир кофейной кислоты 42

пиностробнн но о 74

271.0611 С13Н„Оз 4.4*10"4 нарингеннн но о 95

шшобанксив НО 0 137

283.0974 с17н,504 3.8*10""* фенетиловыи эфир кофейной кислоты но II ^ ^о 393

Элементный состав иона 6m. а.е.м. Предполагаемое название компонента Предполагаемая структура Число датировании в литературе о присутствии в составе прополиса

iTV0-

эрманин цХХ 13

313.0716 CplbO« 4.3* НГ* но о I

пинобанксин-3-ацетат но о I 44

За счет возможности анализа сухих концентратов экстрактов прополиса методом масс-спектрометрии DART была проведена идентификация ряда фенольных компонентов при использовании масс-анализатора на основе орбитальной ионной ловушки (табл. 3) в лаборатории, удаленной от места нанесения экстрактов на носитель. Сигналы тех же аналитов в жидких экстрактах прополиса были зарегистрированы в исходной лаборатории с использованием масс-спектрометра низкого разрешения. Таким образом, возможно следующее сочетание подходов: предварительный отбор проб, подлежащих анализу, с использованием масс-спектрометрии DART низкого разрешения, и последующий анализ концентратов отобранных проб в другой лаборатории с использованием масс-анализатора высокого разрешения.

Путем анализа концентратов аналитов, нанесенных на различные поверхности, расширяются возможности межлабораторного анализа образцов и полевого контроля проб, в которых минимизировано влияние матрицы. Осуществление разработки новых подходов в масс-спектрометрии DART, основанных на различных сочетаниях масс-спектрометрии DART с ТСХ и способах ввода проб и концентрирования и позволяющих повысить селективность обнаружения компонентов и расширить возможности детектирования в масс-спектрометрии DART, позволило перейти к анализу различных лекарственных средств при использовании разработанных подходов.

5. Новые подходы к анализу лекарственных препаратов и субстанций, основанные на масс-спектрометрии DART и ОЭА

5Л. Быстрый скрининг — идентификация компонентов органических субстанций, капсул, таблеток методом масс-спектрометрии DART

5ЛЛ. Идентификация компонентов некоторых органических субстанций

В результате оптимизации условий анализа методом масс-спектрометрии DART для органических субстанций установлено, что во избежание загрязнения системы ввода масс-анализатора необходима минимальная пробоподготовка, включающая растворение небольшого количества субстанции в подходящем растворителе и последующий ввод полученного раствора в область ионизации. Проводили идентификацию ряда гетероциклических соединений - продуктов органического синтеза -методом масс-спектрометрии DART с использованием оптимизированных условий. Для всех изученных субстанций наблюдали интенсивные сигналы [М+Н]+. Благодаря возможности использования режима высокого разрешения у времяпролетного

масс-анализатора соответствие состава аналитов ожидаемому подтверждали за счет точных значений miz и расчета возможного элементного состава соответствующего иона (табл. 4). Шкалу масс прибора калибровали с использованием раствора ПЭГ в метаноле с учетом предварительно полученных данных исследований его состава.

о

Таблица 4. Результаты расчета элементного состава анализируемых ионов

№ соединения Предполагаемая структурная формула продукта синтеза m/z (экспери ментальное) Элементный состав miz (теоретическое) Отклонение экспериментального значения m/z от теоретического, а.е.м.

1 О 320.1070 CUHISNJOJS 320.1069 0.0001

2 381.1388 C20H2IN4O,S 381.1385 0.0003

3 Vttf 11 ССьМе 348.1403 C17H22N3O3S 348.1382 0.0021

4 11 сох» 410.1554 C^H^NjOjS 410.1538 0.0014

5 N J гТ' Т f О CO,M« 390.1668 C,9H24N,Os 390.1665 0.0003

В результате проведенного исследования на примере продуктов органического синтеза, принадлежащих к классу гетероциклических соединений, показана возможность экспрессного определения молекулярных масс таких продуктов и их элементного состава. Предлагаемый подход быстрее и проще общепринятых способов идентификации органических субстанций, так как не требует больших временных затрат и высокой чистоты анализируемых веществ. При наличии в полученном веществе побочных продуктов синтеза или исходных реагентов их элементный состав можно установить тем же способом, что и для основного продукта. Предложенный подход перспективен, в том числе, для контролирования хода реакций синтеза фармацевтических субстанций в режиме online путем отбора проб по ходу синтеза и их немедленного анализа методом масс-спектрометрии DART.

5.1.2. Идентификация активных компонентов твердых лекарственных препаратов (таблетки, капсулы) при прямом анализе методом масс-спектрометрии DART

Изучали возможность быстрого обнаружения активных компонентов ряда препаратов, ранее не исследованных методом масс-спектрометрии DART. Анализ таблеток без оболочки осуществляли при внесении в область ионизации пинцетом. Таблетки в оболочке предварительно разламывали для последующего анализа. Капсулы вскрывали, и порошок из капсул анализировали аналогично тому, как

9 4epueijoea Е.С., Овчаров МЛ., Бочков П.О., Хомяков Ю.Ю., Варламов A.B., Абрамович P.A. Масс-спектрометрия DART: новый подход к установлению состава органических соединений // Вестн. КазНУ. Сер. хим. 2010. Т. 60. № 4. С. 286 - 291.

описано для анализа органических субстанций. В масс-спектрах изученных лекарственных препаратов зарегистрированы характеристичные ионы активных компонентов (табл. 5).

Таблица 5. Характеристичные сигналы компонентов изученных лекарственных препаратов в масс-спектрах DART10_

Название Низкомолекулярные miz наблю- Интерпретация состава ионов

препарата компоненты даемых

ионов

«Анапршшн» пропранолол, 10 мг 260 [М+НГ

«Аспирин» ацетилсалициловая кислота, 121, 163, [M-OAc+Hf, [М-18+НГ,

100 мг 181 ГМ+Hf

«Бисептол» сульфаметаксазол, 100 мг 254 [М+Н]

триметоприм, 20 мг 291 [М+Н]*

пропиленгликоль 77,94 [М+Н]*, [М+18]+

метил-л-гидроксибскзоат 153 [М+Н]*

пропил-и-гидроксибензоат 181 [М+Н]*

«Глицин» глицин, 100 мг 76, 151 [М+НГ, [2М+НГ

«Ноотропил» пирацетам, 800 мг 143.285 [М+Н]*, 12М+НГ

«Мексидсш» этилметилгидроксипири- 138,275 [М+Н]*, [2M+HJ*

дина (М) сукцинат, 125 мг

«Эрсспал» фенспирид, 80 мг 261 |М+НГ

«Эрссфурил» нифуроксазид, 200 мг 276 [М+Н]*

капсулы

«Фурашшин» ыитрофурал, 20 мг 199, 397 [М+НГ, [2М+Н]*

Помимо действующего вещества, методом масс-спектрометрии DART можно идентифицировать в лекарственных препаратах и другие их низкомолекулярные компоненты, что показано на примере масс-спектра таблетки «Бисептол» (рис. 6).

Irtsrsfly ¡31$

С«, сульфаметоксато.1

пропнленгляколь

9411

т

он

[м+нг

мегнл-л-гидрокснбеизоат «¿к

"o-OVcf

х^/ ochs протшл-л-гшрокхпбензоат

[М+НГ

та is

[М+Н]' "8112

трпнетоприм

. у.

[М+Н]' 29121

Рисунок 6. Масс-спектр DART таблетки «Бисептол»

В масс-спектрах DART всех изученных лекарственных препаратов наблюдались интенсивные сигналы протонированных молекул действующих веществ, благодаря которым можно было мгновенно подтвердить наличие искомого аналита в препарате. Высокомолекулярные или неорганические компоненты матрицы не оказывали мешающего эффекта, так как не ионизировались в источнике DART, поэтому образующиеся масс-спектры были просты и удобны для интерпретации. На наш взгляд,

0 Чернецова Е.С., Бочков П.О., Овчаров М.В., Затонский Г.В., Абрамович РЛ. Сверхбыстрая идентификация нгокомолекулярных компонентов лекарственных препаратов методом масс-спектрометрии DART // Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7. № 2. С. 147 - 149.

весьма эффективным может быть скрининг на фальсификаты по аптекам, который будет производиться путем выборочного изъятия контрольных упаковок препаратов из аптек и последующего анализа таблеток из этих упаковок в лаборатории, оснащенной масс-спектрометром DART. Такой скрининг не требует создания баз данных, а обнаружение, основанное на определении молекулярной массы, более достоверно. Для быстрой оценки содержания действующего вещества в лекарственных препаратах и субстанциях в качестве второй стадии скрининга представляло интерес рассмотреть возможность использования ОЭА.

5.2. Органический элементный анализ - метод скрининга, дополняющий масс-спектрометрию DART: быстрая оценка содержания действующего вещества в лекарственных средствах

Быстрое определение содержания активного вещества является актуальным для быстрого обнаружения фальсификатов и при контроле качества фармацевтических субстанций, применяемых для приготовления ЛС. Общепринятые методы контроля качества, основанные в основном на ВЭЖХ, ТСХ и титриметрии, не позволяют быстро определять содержание основного компонента в связи с большими затратами времени на пробоподгототку, градуировку и проведения определения и требуют наличия образцов сравнения для каждого вещества. Разработанными нами способами обнаружения активного компонента лекарственных препаратов и субстанций методом масс-спектрометрии DART можно, как нам представляется, сократить выборку контролируемых лекарственных препаратов, подлежащих анализу, за счет быстрого отбраковывания из нее фальсификатов, не содержащих активного компонента. Однако для выявления фальсификатов, содержащих активный компонент в количествах, отличающихся от специфицированных, актуальной являлась разработка быстрого способа определения содержания активного компонента в отсутствие образцов сравнения.

Органический элементный анализ используют в органической химии для подтверждения элементного состава субстанций — продуктов органического синтеза. Об использовании ОЭА для анализа готовых лекарственных препаратов и субстанций и определения в них содержания активного вещества не было упоминаний в литературе, и не было известно, какие условия эксперимента необходимо обеспечить для определения количеств азота в таких лекарственных препаратах методом ОЭА. По проведенным оценкам, около 75% всех известных фармсубстанций содержат в молекуле азот. В связи с этим, мы разработали способы определения содержания азота в лекарственных препаратах и субстанциях, позволившие оценивать степень чистоты субстанций и количество активного компонента в лекарственных препаратах на основе полученных данных ОЭА о содержании азота в них.

5.2.1. Определение степени чистоты азотсодержащих субстанций

Для контроля качества фармацевтических субстанций, а также чистоты других органических веществ, содержащих азот, нами разработан способ определения степени чистоты таких веществ методом ОЭА. Пробоподготовка субстанций состоит только в их капсулировании и взвешивании капсул. Время анализа, состоящее из времени взвешивания образца, его сожжения и получения конечных результатов, составляет около 7 минут. Путем проведенных исследований нами установлено, что наименьшая погрешность определения содержания азота обеспечивалась в том случае, когда массы азота, полученные после конверсии соответствующих

навесок фармсубстанции и азотсодержащего вещества-вещества, были близки друг к другу и составляли не менее 0.2 мг. Для обеспечения высокой точности анализа необходимо было строить градуировку с использованием вещества-стандарта строили в узком диапазоне (0.2-0.3 мг). По этой причине в дальнейших исследованиях выбранной навеске фармсубстанции или лекарственного препарата всегда подбирали такие массы вещества-стандарта, чтобы количества азота, полученные после конверсии навески аналита, были в узких пределах градуировочного графика.

Содержание азота в анализируемой субстанции определяли по формуле (1):

= К-

т.

■Sr

Я* * (1).

где т^х - масса азота, поступившего в детектор после сожжения навески анализируемой пробы; К — коэффициент чувствительности; т^, - масса азота, поступившего в детектор после сожжения навески стандартного образца; — площадь пика азота, зарегистрированного для навески стандартного образца после вычитания площади пика холостого опыта; - площадь пика азота, зарегистрированного для навески анализируемой пробы за вычетом площади пика азота холостого опыта.

Расчет процентного содержания основного компонента в исследуемых субстанциях, используемого как показатель их чистоты, проводили по формуле (2):

С. = %ДГ»" ■100%

где Са

(2),

концентрация основного компонента;

%NTC

экспериментальное и теоретическое содержание азота в его молекуле.

С использованием формул (1) и (2) определяли содержание азота и основного компонента в фармацевтических субстанциях (табл. 6), и таким образом определяли их степень чистоты. В состав молекул анализируемых соединений азот входил в качестве различных функциональных групп: соединения принадлежали классам амидов, гетероциклических соединений, аминов. Сопоставление данных, полученных традиционными методами оценки чистоты фармацевтических субстанций и данных, полученных методом элементного анализа с определением азота, позволяет заключить о возможности определения чистоты субстанций методом ОЭА. Данные анализа соответствующих субстанций методами ВЭЖХ, титриметрии, и потенциометрии предоставлены Food and Drug Administration (FDA), США.

Таблица 6. Результаты определения активного компонента в фармацевтических

Субстанция (название соответствующего фармпрепарата) Чистота субстанции, %

специфицируемая производителем (метод определения) найденная с использованием элементного анализа

Триамтерен (Триамтерен/Гидрохлортиазид или Триампур Композитум), партия № 1 100.3 (титриметрия) 100.0 + 0.3

11 Ревельский ИЛ., Чернецошл Е.С., Лузятт П.П., Глазков И.Н., Шнайдер Л.А. Быстрый контроль качества фармацевтических препаратов, основанный на определении азота // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2007. Т. 73. № 7. С. 20 - 26.

Субстанция (название соответствующего фармпрепарата) Чистота субстанции, %

специфицируемая производителем (метод определения) найденная с использованием элементного анализа

Гидрохлоротиазид (Триамтерен/Гидро-хлортиазид, Триампур Композитум): партия № 1 партия № 2 100.2 (ВЭЖХ) 100.0 (ВЭЖХ) 101.1 ±0.4 101.1 ±0.5

Фозиноприл (Моноприл): партия № 1 партия № 2 98.9, 99 (ВЭЖХ) 98.4 (ВЭЖХ) 99.4+ 0.4 99.9 ± 0.4

Каптоприл (Капотен): партия № 1 партия № 2 99.1 (титриметрия) 99.23 (ВЭЖХ) 98.64 (титриметрия) 99.1 ±0.3 100.2 ±0.6

Соталола гидрохлорид (Соталекс): партия № 1 партия № 2 99.5 (потенциометрня) 99.7 (ВЭЖХ) 100.3 (титриметрия) 99.9 (ВЭЖХ) 103.1 (титриметрия) 99.9 ± 0.5 99.6 + 0.5

Ставудин (Зерит): партия № 1 партия № 2 99.3 (ВЭЖХ) 103.21 (ВЭЖХ) 99.9 + 0.3 100.3 ±0.4

Метоклопрамида гидрохлорид (Метоклопрамид), партия №1 99.6 (титриметрия) 99.2 + 0.6

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан новый способ быстрого прямого определения степени чистоты фармацевтических субстанций и любых твердых органических веществ, содержащих в молекуле азот, основанный на определении азота путем элементного анализа. Разработанный способ является быстрым, универсальным, пригодным для веществ различного строения, не требующим пробоподготовки и градуировки по основному компоненту и в связи с этим — использования стандартных образцов аналитов, и отличается высокой производительностью и точностью. Правильность определения при таком подходе либо превосходит, либо соответствует правильности общепринятых методов анализа.

5.2.2. Определение действующего вещества в твердых ЛС

Содержание активного компонента в лекарственных препаратах, как правило, определяют методами ВЭЖХ (после проведения предварительной экстракции), титриметрии, потенциометрии, или другими аналитическими методами, требующими использования специальных условий селективного определения. В таких случаях необходимы соответствующие образцы сравнения для построения отдельной градуировочной зависимости для каждого аналита.

Для капсулированных, таблетированных или ампулированных лекарственных препаратов исследовали расширение разработанного подхода к контролю чистоты фармацевтических субстанций. Анализ капсул сводился к анализу субстанций, так как большинство капсулированных лекарственных препаратов содержит активный

компонент в полимерной оболочке. Для определения содержания действующего вещества в таблетированных ЛС пробоподготовка заключалась в измельчении таблеток, их растирании, взятии навески и ее капсулировании. После проведения элементного анализа на содержание азота в навеске расчет содержания активного вещества в таблетке проводили по формуле:

т. =-

тк

%N„,

т„

(3),

где mN- экспериментально найденная масса азота в навеске; %Nme„p - рассчитанное содержание азота в молекуле активного вещества; тто6л - средняя масса таблетки; т„— масса навески.

При использовании разработанного подхода провели анализ твердых фармпрепаратов (таблеток и капсул) на содержание активного вещества. Экспериментальные данные сопоставляли с результатами (табл. 7), полученными при использовании ВЭЖХ (данные предоставлены FDA). Как и при исследовании фармсубстанций, для обеспечения наиболее высокой точности определения содержания азота в твердых лекарственных препаратах требовалось, чтобы массы азота, полученные после конверсии соответствующих навесок препарата и вещества-стандарта, были близки между собой.

Таблица 7. Сопоставление результатов определения содержания активного компонента в таблетированных и капсулированных J1C с использованием ОЭА и общепринятого метода ВЭЖХ (п = 7, Р = 0.95)"

Название и Специфициро- Допустимый Резуль- Найденное с

происхождение ванное содержание разброс тат использованием

препарата активного результатов опреде- элементного

компонента в определения ления анализа

таблетке или методом методом содержание

капсуле, мг ВЭЖХ, мг ВЭЖХ, мг активного компонента, мг

Соталекс (РФ):

аптека № 1 160 — — ¡60 ±4

аптека № 2 160 — — 156 + 2

Соталекс (США) 160 152-168 157.9 158 ± 3

Капотен (РФ):

56 шт., аптека № 1 25 — - 24.1+0.3

40 шт., аптека № 2 25 — — 23.9 ± 0.3

Калотен (США):

40 шт. 25 23.1 -26.9 24.6 24.4 ± 0.7

30 шт. 25 — 25.8 24.9 ± 0.6

28 шт. 25 23.1 -26.9 24.4 24.3 ± 0.5

Триампур композиту«, 37.5 (= 12.5+25) — — 40 ±1

А\\Ш

(аптека № 2, РФ)

Триамтсрен/ 62.5 (=25+ 37.5) — — 63 ± 1

гидрохлортиазид, Р^уа

(США)

Название и Специфициро- Допустимый Резуль- Найденное с

проп схождение ванное содержание разброс тат использованием

препарата активного результатов опреде- элементного

компонента в определения ления анализа

таблетке или методом методом содержание

капсуле, мг ВЭЖХ, мг ВЭЖХ, активного

мг компонента, мг

Зерит, капе, (аптека № 30 — — 30.4 ±0.9

2. РФ)

Зерит, капе. (США) 30 28.50-31.50 29.45 29.5 ± 0.7

40 38.00-42.00 39.54 41.4 ±0.9

Сопоставление данных определения активного компонента методами ВЭЖХ и органического элементного анализа, а также другие накопленные нами экспериментальные данные по анализу таблеток и капсул позволяют заключить, что разработанный подход с использованием ОЭА не уступает методу ВЭЖХ, но обладает преимуществами с точки зрения производительности, универсальности, простоты проведения анализов и отсутствия необходимости в образцах сравнения аналитов. Таким образом, разработан новый подход к быстрому определению содержания действующего вещества в твердых ЛС, основанный на ОЭА.

5.2.3. Определение действующего вещества в ампулнрованных ЛС

Нами разработан также подход к быстрому определению содержанию действующего вещества в ампулированных ЛС, соблюдая необходимое требование о необходимости близости содержания азота в навесках, содержащих анализируемые препараты, и в навесках вещества-стандарта, используемых для градуировки по азоту. В табл. 8 приведены результаты определения содержания активного вещества в ряде ампулированных лекарственных препаратов.

Таблица 8. Результаты определения содержания активного вещества в ампулированных ЛС (водныерастворы) (п = 5,Р= 0.95)12_

Препарат Содержание активного вещества в ампуле, мг

CvnpacTim 20 17.8 ±0.2

Димедрол 10 9.5 ±0.3

Дшшофенак 75 74.1 ±0.6

Ортофен 75 69 ±2

Анальгии 500 392 ±7

Согласно Государственной Фармакопее, отклонение массы содержимого одной ампулы при массе активного вещества 100 мг и менее составляет ± 10%, а при массе 300 мг и более — ± 5%. Из приведенных данных следует, что содержание активного вещества в анальгине занижено, что может быть показателем несоответствия препарата технологическим требованиям.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработаны способы быстрого определения содержания активного вещества в фармпрепаратах в таких

12 Revelsty 1.Л., Chemelsova E.S., Luzyanin В.P., Fedoseeva M. Г., Glazkov I.N., Rewlsky A.I. Organic elemental analysis: a new universal approach to authenticity/quality control of pharmaceuticals // Drug Test. Anal. 2010. V. 2. № 9. P. 452 - 454.

JIC, как таблетки, капсулы и ампулы с водными растворами. Достоинствами предложенных подходов по сравнению с существующими являются минимизированная пробоподготовка и исключение использования стандартных образцов ана-литов. Это открывает новые возможности в скрининге для обнаружения фальсификатов, производственном контроле и внеочередном контроле качества фармацевтической продукции. Разработанные новые подходы, основанные на элементном анализе, обеспечивают высокую производительность анализов, необходимую для действенного контроля качества JIC и проведения их быстрого скрининга на фальсификаты. Они хорошо дополняют масс-спектрометрию DART в скрининге J1C, так как позволят для препаратов, в которых методом масс-спектрометрии DART активный компонент обнаружен, быстро определять его содержание, тем самым завершая задачу отбора из выборки некачественных препаратов, в которых содержание активного компонента не соответствует заданному.

5.3. Анализ мягких JIC (мази, суппозитории) методом масс-спектрометрии DART высокого разрешения

Обнаружение аналитов по масс-спектрам DART мягких лекарственных средств, таких, как мази и суппозитории, осуществлять сложнее, так как в состав их матрицы входит много низкомолекулярных компонентов.

При анализе мазей и суппозиториев возможна регистрация сигналов полимерной матрицы соответствующих лекарственных препаратов, что приводит к образованию масс-спектров сложного состава. Была изучена возможность сочетания источников DART с масс-спектрометрами высокого разрешения для анализа мазей и суппозиториев. Изучали условия анализа и масс-спектры мазей «Тетрациклин», «Линимент Синтомицина», «Левомеколь» и «Ацикловир», а также суппозиториев на основе твердого жира типа А. Представляло интерес изучение возможности обнаружения действующих веществ в изученных препаратах с целью контроля их качества методом масс-спектрометрии DART.

В результате проведенного исследования впервые получены масс-спектры DART ряда мазей и суппозиториев и установлено, что масс-спектрометрию DART можно успешно использовать для быстрой идентификации их низкомолекулярных компонентов. Для большинства действующих веществ изученных препаратов в масс-спектрах наблюдались интенсивные сигналы ионов [М+Н]~, по которым подтверждали наличие искомого действующего вещества в соответствующих препаратах. Использование масс-анализатора высокого разрешения обеспечивало более высокую достоверность идентификации аналитов. Показано, что при этом возможна калибровка шкалы масс-прибора с использованием в качестве внутреннего стандарта сигналов, соответствующих основе мази, что увеличивает производительность анализов. Предлагаемый подход может быть использован для быстрого скрининга мягких лекарственных форм на фальсификаты, основанного на обнаружении действующего вещества.

5.4. Методология быстрого скрининга лекарственных препаратов и субстанций, основанная на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и ОЭА

В результате проведенного исследования впервые разработана методология скрининга лекарственных препаратов и субстанций на фальсификаты и некачественные препараты, основанная на масс-спектрометрии DART низкого и высокого

разрешения и ОЭА. Представляется актуальным выборочный анализ препаратов методами масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения для быстрого обнаружения активного компонента. Так как анализ методом масс-спектрометрии DART длится несколько секунд, возможен контроль большого числа проб. Для некоторых из этих проб предлагается в качестве второй стадии скрининга использовать ОЭА для быстрого определения содержания действующего вещества. Такой подход позволит однозначно выявить большинство типов фальсификатов: препараты, не содержащие активного вещества; препараты, содержащие недостаточное количество активного вещества, и препараты, в которых активное вещество заменено на другое, не соответствующее указанному в маркировке.

6. НОВЫЕ ПОДХОДЫ К АНАЛИЗУ ПРИРОДНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ,

ОСНОВАННЫЕ НА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ DART И ЕЕ СОЧЕТАНИИ С ТСХ

Результаты исследования по оптимизации метода масс-спектрометрии DART для прямого обнаружения аналитов и в сочетании с ТСХ позволили приступить к разработке новых подходов к анализу проб в сложных матрицах, таких, как природные ЛС, для обнаружения соединений-маркеров, определяющих качество этих ЛС. Анализ природных ЛС (например, лекарственных растений, пчелиного меда, прополиса), как показало наше исследование, осуществлять при использовании прямого ввода в масс-спектрометрии DART сложнее, чем анализ других лекарственных препаратов, так как в состав их матрицы входит много низкомолекулярных компонентов. В связи с этим, такие объекты требуют более индивидуального подхода при их анализе методом масс-спектрометрии DART. Оптимальные условия и стратегия анализа зависят от состава объекта и поставленной задачи (обнаружение заданных или идентификация неизвестных компонентов). Нами исследован ряд способов анализа природных ЛС, основанных на масс-спектрометрии DART.

6Л. Изучение состава прополиса при сочетании масс-спектрометрии DART и ТСХ

Перспективным подходом к определению качества природного лекарственного сырья является анализ многомерных данных. Для определения подлинности сырья важно не только подтверждение присутствия нескольких основных компонентов, но и определение происхождения сырья путем идентификации характерных соединений-маркеров (примесей), так как состав природного сырья зависит от места его сбора. Проводили исследования состава фенольных компонентов прополиса, используя различные подходы, основанные на масс-спектрометрии DART и ТСХ.

6ЛЛ. Экспрессная классификация экстрактов прополиса при сочетании данных ТСХ и масс-спектрометрии DART низкого разрешения

Масс-спектры DART низкого разрешения представляется целесообразным использовать в качестве «отпечатков пальцев», характеризующих образец. Изучали возможность использовать для экстрактов прополиса масс-спектры DART отрицательных ионов низкого разрешения в качестве «отпечатков пальцев», характеризующих распределение фенольных соединений в соответствующих образцах. Исследовали масс-спектры 112 экстрактов прополиса, собранных в различных регионах. Масс-спектры DART получали при усреднении сигнала

соответствующего экстракта по ширине пика на хронограмме на полувысоте и анализировали для классификации образцов прополиса и определения характеристичных значений miz фенольных соединений-маркеров. Результаты классификации образцов прополиса методом главных компонент на основании их масс-спектров DART на 87% совпадали с результатами их визуальной классификации методом ТСХ. Предварительный анализ данных ТСХ средствами хемометрики обеспечивал увеличение надежности классификации образцов по масс-спектрам DART (рис. 7).

. A ¡rc-'l'...

■—г; _ . - , • % , -

г г' г, » - У3'®5 а

»X.

V.

Рисунок 7. Классификация образцов прополиса тремя независимыми средствами хемометрики13: кластеризация на основе трехмерной диаграммы главных компонент (слева), построение дендрограмм (в середине), и линейная оценка дискриминант (справа) для образцов прополиса с оранжевым и голубым профилем фенольных маркеров. Сверху представлена классификация по изображениям ТСХ-пластин, а снизу - по сигналам в масс-спектрах DART низкого разрешения.

Используя ТСХ и различные способы дериватизации, получали информацию о функциональных группах соединений, тогда как масс-спектры DART в режиме регистрации отрицательных ионов позволяли предположить о возможных молекулярных массах этих маркеров на основании идентификации сигналов их депрото-нированных молекул. Таким образом, масс-спектры DART предоставляли информацию о соединениях-маркерах, дополнительную к информации, получаемой ТСХ.

Разработанный подход, основанный на сочетании данных ТСХ и масс-спектро-метрии DART низкого разрешения, позволил классифицировать образцы прополиса тремя разными способами и получить информацию о возможном составе функциональных групп главных соединений-маркеров, а также об их возможных молекулярных массах. Такой подход к экспрессной классификации образцов, сочетающий ТСХ и масс-спектрометрию DART, может быть использован для решения различных задач по классификации образцов и поиску соединений-маркеров в них, в том числе при поиске низкомолекулярных биомаркеров различных заболеваний, а также при оценке подлинности или происхождения продуктов питания и ЛС.

13 E.S. C.herneisova, P. Ristivojevic, G.E. Morlock. Characterization of propolis using planar chromatography. Direct Analysis in Real Time mass spectrometry and multivariate data analysis. Тез. докл. 8-го Зимнего симпозиума по хемометрике "Modern Methods of Data Analysis". Дракино, Россия. 2012.27 февраля - 02 марта. С. 16-17.

6.1.2. Быстрая идентификация фенольных соединений-маркеров в экстрактах прополиса методом масс-спектрометрии DART высокого разрешения при сочетании режимов регистрации отрицательных и положительных ионов

Для установления элементных формул компонентов возможен выборочный анализ соответствующих экстрактов методом масс-спектрометрии DART высокого разрешения. Как нами обнаружено, возможна быстрая идентификация фенольных соединений-маркеров лекарственного сырья (например, прополиса) методом масс-спекгрометрии DART высокого разрешения в режиме регистрации отрицательных ионов. За счет увеличения селективности ионизации соединений — доноров протона в этом режиме обеспечиваются снижение влияния матрицы образца и упрощение обнаружения соответствующих соединений по масс-спектрам DART.

В исследовании использовали три разных способа ввода образцов в область ионизации DART - образцы экстрактов прополиса вводили на кончиках стеклянных капилляров; в виде сухих пятен, нанесенных на пористый субстрат (объем нанесенного экстракта 20 мкл); а также при нанесении на подложку-сетку (объем экстракта 5 и 100 мкл). При использовании подложки-сетки возможно многократное увеличение наносимого объема пробы, что является достоинством такого подхода при определении следовых количеств. После формирования списка потенциальных соединений-маркеров за счет анализа масс-спектров DART отрицательных ионов, дополнительную проверку наличия таких соединений осуществляли путем быстрой регистрации масс-спектров DART тех же экстрактов в режиме регистрации положительных ионов. Такой способ идентификации соединений, основанный на сочетании данных масс-спектров отрицательных и положительных ионов, предложен в масс-спектрометрии DART впервые.

Для образцов прополиса определили возможные элементные формулы потенциальных фенольных соединений-маркеров (табл. 3). Разница между экспериментальными и теоретическими значениями mlz для найденных соединений-маркеров составляла в среднем 0.3x10 3 а.е.м., что находилось в пределах допустимой погрешности с использованием орбитальной ионной ловушки.

За счет высокого разрешения можно было различать сигналы соединений с одинаковым целочисленным значением молекулярной массы. Например, в экстрактах прополиса был предварительно обнаружен хризин, сигнал депротонированной молекулы которого в масс-спектрах DART высокого разрешения с mlz 253.0508 можно было достоверно отличить от сигнала с mlz 253.0868, принадлежащего метокси-флаванону (рис. 8А). Анализ масс-спектров DART положительных ионов, позволивших также обнаружить сигналы хризина и метоксифлаванона (сигналы прото-нированных молекул с mh 255.0646 и 255.1006; рис. 8Б), позволил повысить степень достоверности идентификации этих соединений в экстрактах прополиса.

5 "

i »t

метсжсифлавзнон. tlW-rH]"

Рисунок 8. Идентификация хризина по масс-спектрам DART отрицательных (А) и положительных (Б) ионов в присутствии метоксифлаванона8

Таким образом, были получены новые данные о составе фенольных компонентов изученных типов прополиса и разработан новый способ анализа лекарственного сырья, основанный на масс-спектрометрии DART высокого разрешения и разработанных подходах к пробоподготовке и анализу образца.

6.1.3. Идентификация феиольных соединений в экстрактах прополиса методом ТСХ-МС с ионизацией DART

Изучали возможность повышения селективности при идентификации компонентов прополиса путем сочетания масс-спектрометрии DART с ТСХ (рис. 9).

289 [М+С1]"

Р-Н]-

253

он 6

■ Д ,1.

Рисунок 9. Идентификация компонентов по ТСХ-масс-хроматограммам DART экстрактов прополиса: слева - масс-хроматограммы DART при сканировании ТСХ-пластин в режиме селективного детектирования депрогонированных молекул хризина и кофейной кислоты и соответствующие им изображения ТСХ-пластин14; в центре - масс-спектр DART для зоны хризина на ТСХ-пластине14; справа - изображение того, как осуществляется сканирование целых ТСХ-пластин методом масс-спектрометрии DART4

При сканировании ТСХ-пластин методом масс-спектрометрии DART низкого разрешения (рис. 9) можно получать масс-хроматограммы, построенные селективно по характеристичным ионам заданных соединений, и регистрировать соответствующие характеристичные масс-спектры низкого разрешения с зон ТСХ. Идентификацию аналитов проводили при сопоставлении Rf и изображений ТСХ-пластин, ТСХ-хроматограммам DART, и масс-спектров DART для компонентов экстрактов и образцов сравнения. Прямое сочетание ТСХ с масс-спектрометрией

E.S. Chernetsova, G.E. Morlock. The coupling of I1PTLC with DART mass spectrometry. Тез. докл. Международного симпозиума по высокоэффективной тонкослойной хроматографии «HPTLC 2011». Базель, Швейцария, 2012, 06 - 08 июля. С. 60.

позволяет воспользоваться достоинствами масс-спектрометрии при детектировании аналитов из представляющих интерес зон на ТСХ-хроматограмме. При таком сочетании возможно использование разных масс-анализаторов для получения максимальной информации о составе аналитов в экстрактах, в том числе используя изученные ранее возможности межлабораторного анализа образцов.

6.2. Быстрый скрининг проб пчелиного меда на содержание

5-оксиметилфурфурола при сочетании масс-спектрометрии DART и ТСХ

Представлялась актуальной разработка новых экспрессных подходов к анализу меда. Важным показателем качества пчелиного меда является содержание 5-оксиметилфурфурола (ОМФ). При обнаружении ОМФ на уровне 25 мг/кг и выше образец меда относят к фальсификату или меду низкого качества. Разрабатывали новые подходы к скринингу меда на ОМФ, основанные на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ.

6.2.1. Оценка возможности использования масс-спектрометрии DART для быстрого скрининга пчелиного меда на ОМФ

Для анализа меда методом масс-спектрометрии DART проводили простую пробоподготовку, включающую приготовление водных растворов меда (1 г меда/10 мл воды). Анализ растворов меда осложнялся термическим разложением Сахаров в области ионизации. Разработали способ скрининга ОМФ в меде методом масс-спектрометрии DART, основанный на использовании двух растворов сравнения. Для неизвестных образцов, сигналы которых превышали сигналы образцов сравнения, считали содержание ОМФ превышающим пороговое значение, и эти результаты скрининга этих образцов считали «положительными». Для уточнения результатов скрининга меда на ОМФ методом масс-спектрометрии DART разработали независимый способ быстрого скрининга меда на ОМФ методом ТСХ.

6.2.2. Быстрый скрининг пчелиного меда на ОМФ методом ТСХ

Разработанный нами способ быстрого обнаружения ОМФ в меде методом ТСХ позволял хроматографически отделить ОМФ от Сахаров и произвести его обнаружение. Для разработанного способа скрининга меда методом ТСХ предел обнаружения составлял 7 мг/кг, что отвечало требованиям к чувствительности методов определения ОМФ в меде. При использовании предлагаемого подхода возможен одновременный анализ до 20 образцов, при этом длительность хромато-графирования составляет 5 минут. Достоинствами предлагаемого подхода являются повышение производительности и снижение затрат на проведение одного анализа. Разработанный способ скрининга не уступает общепринятым методам, но позволяет повысить производительность анализов в 10 - 15 раз по сравнению с определением ОМФ в меде методом ВЭЖХ в пересчете на один образец.

Скрининг, основанный на масс-спектрометрии DART, позволяет отобрать образцы меда высокого качества до проведения анализа образцов методом ТСХ или другим способом. Длительность анализа водных растворов меда методом масс-спектрометрии DART составляет менее 1.5 мин в пересчете на образец. Использование разработанного подхода к быстрому скринингу образцов меда методом масс-спектрометрии DART позволяет существенно повысить производительность анализов меда за счет отбраковывания образцов, в которых нет необходимости точного установления содержания ОМФ. Быстрый анализ

остальных образцов для уточнения содержания ОМФ можно проводить ТСХ или другими методами.

6.3. Изучение состава фенольных компонентов листьев бадана методом масс-спектро.метрии DART высокого разрешения

Растения рода Bergenia (Saxifragaceae) используются в традиционной медицине России, Китая, Монголии, Индии и ряда других стран Азии. В России чаще всего используют вид Bergenia crassifolia L. (Saxífraga crassifolia) - бадан, или Сибирский чай. Представляло интерес изучение состава листьев бадана с использованием подходов, основанных на масс-спектрометрии DART. Нами впервые проведены исследования состава компонентов зеленых и черных (ферментированных) листьев бадана методом масс-спектрометрии DART при сочетании с масс-анализатором на основе орбитальной ионной ловушки. Для анализа бадана использовали подходы, разработанные при анализ экстрактов прополиса и включающие сочетание информации из масс-спектров DART высокого разрешения отрицательных и положительных ионов. Для характеристичных сигналов в масс-спектре отрицательных ионов экстракта зеленых листьев бадана, зарегистрированном с использованием сочетания источника DART с орбитальной ионной ловушкой, рассчитывали возможные элементные формулы (рис. 10).

X

J34 >>'■■'.. .1, ll,. 11..

Рисунок 10. Масс-спектр DART экстракта зеленых листьев бадана'

По точным значениям m/z были идентифицированы депротонированные молекулы известных из литературы соединений-маркеров бадана: галловой и эллаговой кислоты, арбутина, бергенина и гидрохинона. Также была проведена предварительная идентификация других фенольных компонентов бадана (табл. 9). Рассчитывали возможный элементный состав ионов и предлагали структурные формулы соответствующих компонентов на основании поиска, осуществленного в базе научной информации ScíFinder. Критерием поиска являлось упоминание соединений заданного состава в качестве компонентов растительных экстрактов. Среднее расхождение между экспериментальным и теоретическим значениями m/z для потенциального компонента составляло 0.0002 а.е.м., что соответствовало точности используемого метода. Таким способом провели отнесение 34% всех зарегистрированных ионов с относительной интенсивностью 1% и более.

Таблица 9. Интерпретация сигналов-маркеров, обнаруженных в масс-спектре листьев бадана (п = 2)7 _____

# "?/Гэксп. 5т, а.е.м. Элементная фор- Возможный состав иона Предполагаемый компонент Число цитирований в литературе (как компонент

хЮ* мула, ион растительных экстрактов)

Сигналы, относительная интенсивность которых составляла более 5%

1 115.0024 -0.2 С4Н,04 гм-нг фумаровая кислота 43

■у 125.0230 -0.3 оно, гм-нг пирогаллол 20

3 133.0128 -0.3 С4Н,0, ГМ-НГ малевая кислота 108

4 191.0551 0.2 с,н„о6 гм-нг хинная кислота 38

5 193.0133 0.2 С,Н505 [М-Н]" тригидрокси-кумарин 2

6 261.0404 1.2 С„Н906 - - -

7 361.0779 1.4 СиН^Ои - - - -

Сигналы, относительная интенсивность которых составляю более 1 %, но менее 5%

8 211.0242 0.5 с<>н70б [М-нг ацетилсалициловая кислота 98

9 215.0322 -1.7 С12Н704 ГМ-нг бергаптен 16

10 235.0244 0.8 СцНтОб - - -

11 247.0246 0.9 с12н7о6 [М-нг фуранкарбоновая кислота 4

12 259.0248 1.1 с„н7о6 гм-нг норатириол 6

13 261.0404 1.2 СЦН9ОЙ - - -

14 275.0200 1.2 с^шэ. - - -

15 277.0354 1.0 С„Н,07 - - -

16 283.0073 1.2 с,,н,о» - - -

17 287.0774 1.2 с,,н„о8 - - -

18 303.0359 1.3 С„нп0,о - - -

19 307.0591 1.0 С^НпО, - - -

20 313.0568 0.9 СцН]<;09 [м-нг норбергенин 5

21 317.0878 1.1 С^НпОо - - -

22 325.0567 1.6 СцН^Оч - - -

23 327.0360 1.3 СрНцОю - - -

24 339.0359 1.1 СнНпО.о - - -

25 345.0828 1.3 С14Н17О10 [м+н2о-нг бергенин 10

26 371.1196 1.3 С13Н2Ч012 - - -

27 383.1197 1.1 С14Н23012 - - -

28 385.0777 1.2 С16Н17011 - - -

29 395.0621 1.3 СрНк^Оц - - -

30 421.0992 1.6 С[бН210[з - - -

31 435.0571 1.4 С14Н15О12 - - -

32 453.1042 1.3 С->„Н210|2 - - -

33 459.0786 1.6 С18Н190и - - -

34 463.1461 1.6 С]9Нч?Оп - - -

35 475.1306 7.1 Сг-Н,,0„ - - -

36 479.1046 1.0 С|?Н2}0|5 - - -

Произведенная идентификация фумаровой, хинной, ацетилсалициловой, фуранкарбоновой и малевой кислоты, пирогаллола, тригидроксикумарина, бергаптена, норатириола и норбенгенина, основанная на частоте упоминания соответствующих компонентов растительных экстрактов в литературе, является

предварительной. Для дальнейшего подтверждения их наличия в бадане необходимы образцы сравнения соответствующих компонентов и использование дополнительных методов, которые позволили бы различить не только соединения с разными молекулярными массами, но и соединения, одинаковые по элементному составу, и являющиеся изомерами.

6.4. Методология быстрого анализа природных лекарственных средств, основанная на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ

Проведенные исследования возможностей масс-спектрометрии DART и ее сочетаний с ТСХ позволили разработать методологию быстрого анализа природных ЛС. Повышение селективности обнаружения компонентов в сложной матрице обеспечивается за счет масс-анализаторов высокого разрешения или за счет осуществления ТСХ-разделения и идентификации компонентов по значениям Rf и соответствующим сигналам в масс-спектрах. Такой подход позволяет исследовать состав соответствующих многокомпонентных образцов и быстро проводить контроль качества проб благодаря одновременной регистрации десятков соединений, в отличие от общепринятых методов анализа. Для ключевых компонентов (как, например, при скрининге меда на ОФМ) возможна быстрая оценка содержания методом ТСХ, производительность которой значительно выше, чем для анализов с использованием общепринятых методов.

Заключение

В результате проведенных исследований возможностей и ограничений масс-спектрометрии DART сформирована система новых экспрессных подходов к анализу J1C, основанных на различных сочетаниях масс-спектрометрии DART и ТСХ, а также ОЭА. Впервые разработана методология быстрого обнаружения фальсифицированных или некачественных лекарственных препаратов и субстанций в отсутствие их образцов сравнения, основанная на масс-спектрометрии DART и ОЭА. Эта методология включает выборочный анализ препаратов методами масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения для быстрого обнаружения активного компонента и последующий анализ части этих препаратов методом ОЭА для быстрого определения содержания активного компонента. Для классифицирования образцов более сложного состава (природных лекарственных средств) и обнаружения в них примесей разработана методология быстрого анализа, основанная на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ, позволяющая исследовать состав многокомпонентных образцов и быстро проводить контроль качества проб благодаря одновременной регистрации десятков соединений, в отличие от общепринятых методов анализа. Таким образом, на основании обобщения полученных результатов и накопленного опыта с литературными данными сформирована система практических рекомендаций и принципы выбора подходов к экспрессному анализу различных типов ЛС при использовании масс-спектрометрии DART, а также ТСХ и органического элементного анализа.

На основании проведенных экспериментальных исследований и литературного поиска, следующие направления исследований в области масс-спектрометрии DART и ее сочетания с другими методами представляются нам особенно перспективными для развития в будущем:

• совершенствование методов концентрирования и стандартизация условий ввода образцов в масс-спектрометрии DART для обеспечения более высокой воспроизводимости;

• развитие сочетания масс-спектрометрии DART с ТСХ online и offline, основанного на анализе всего концентрата из больших проб растворов (экстрактов);

• разработка новых способов практического применения и развития разработанных подходов при анализе различных объектов, особенно:

— анализ природного лекарственного сырья;

— скрининг продуктов питания для обнаружения экотоксикантов;

— быстрая диагностика заболеваний путем обнаружения биомаркеров на фоне сложной матрицы (например, слюны, плазмы крови и др.)

— контроль примесей в высокочистых веществах (например, полимерах);

— криминалистика (например, обнаружение следов наркотических веществ);

— судебная медицина (например, анализ слюны или крови для обнаружения причины отравления).

Выводы

1. Изучено влияние условий эксперимента на масс-спектры DART широкого круга органических соединений различных классов и выбраны критерии оптимизации условий анализа методом масс-спектрометрии DART.

2. Разработан способ обнаружения органических соединений на уровне следов методом масс-спектрометрии DART, основанный на концентрировании аналитов с удалением растворителя из раствора (экстракта) и анализе всего концентрата.

3. Разработан новый способ анализа, основанный на концентрировании аналитов на подложке и анализе концентрата методом масс-спектрометрии DART, обеспечивающий возможность межлабораторного анализа.

4. Разработаны способы визуализации ионизирующего потока из источника DART для повышения воспроизводимости результатов анализа за счет улучшения позиционирования пробы в области ионизации. Этот способ позволил изучить возможность сочетания ТСХ с масс-спектрометрией DART в режиме сканирования.

5. Разработан способ сканирования различных подложек, в том числе ТСХ-пластин, методом масс-спектрометрии DART. Исследованы возможности и ограничения ее сочетания с ТСХ online и offline.

6. Разработан быстрый и универсальный способ определения содержания активного компонента в лекарственных препаратах и фармацевтических субстанциях при использовании ОЭА. Как и способ обнаружения активных компонентов ЛС методом масс-спектрометрии DART, которую он дополняет, он не требует образцов сравнения соответствующих аналитов.

7. Разработаны методология быстрого скрининга лекарственных препаратов и субстанций на фальсификаты и некачественные образцы, основанная на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и ОЭА, а также

методология анализа природных JIC, основанная на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ, позволяющая одновременно регистрировать десятки соединений.

8. Основываясь на данных проведенных исследований, выбраны оптимальные условия и проведен анализ ряда J1C, в том числе природных, методом масс-спектрометрии DART для экспрессного обнаружения ряда компонентов изученных объектов, определяющих их качество.

9. Рассмотрены перспективы развития масс-спектрометрии DART как аналитического метода и его практических применений, представлены предложения по совершенствованию метода и рекомендации по использованию и развитию разработанных в данной работе методологий быстрого анализа в химическом и фармацевтическом анализе.

Публикации по теме работы

По теме работы опубликовано 30 статей и более 50 тезисов докладов.

1. Ревельский И.А., Чернецова Е.С., Лузянин Б.П., Глазков И.Н., Шнайдер A.A. Быстрый контроль качества фармацевтических препаратов, основанный на определении азота // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2007. Т. 73. №7. С. 20-26.

2. Ревельский И.А., Косенко В.В., Чернецова Е.С., Федосеева М.В., Митькина Л.И., Лузянин Б.П., Ревельский А.И. Быстрый скрининг проб лекарственных средств на содержание действующего вещества // Вестник Росздравнадзора. 2009. №3. с. 27-31.

3. Чернецова Е.С., Ковалева A.C., Корякова А.Г. Стабильность работы тройных квадрупольных масс-спектрометров с ионизацией электрораспылением в исследованиях фармакокинетики и метаболизма лекарственных веществ // Масс-спектрометрия. 2009. Т. 6. № 4. С. 238 - 240.

4. Чернецова Е.С., Бочков П.О., Овчаров М.В., Затонский Г.В., Абрамович P.A. Сверхбыстрая идентификация низкомолекулярных компонентов лекарственных препаратов методом масс-спектрометрии DART // Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7. № 2. С. 147 - 149.

5. Чернецова Е.С., Абрамович P.A. Масс-спектрометрия DART: быстрый скрининг таблетированных лекарственных препаратов на наличие действующего вещества // Вестник Росздравнадзора. 2010. № 2. С. 51 - 54.

6. Чернецова Е.С., Овчаров М.В., Бочков Л.О., Хомяков Ю.Ю., Варламов A.B., Абрамович P.A. Масс-спектрометрия DART: новый подход к установлению состава органических соединений // Вестник КазНУ. Серия химическая. 2010. Т. 60. №4. С. 286-291.

7. Чернецова Е.С., Корякова А.Г. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией в исследованиях новых лекарственных веществ // Журнал аналитической химии. 2010. Т. 65. № 14. С. 1436 - 1445.

8. 4epneifoea E.C., Овчаров M.B., Хомяков Ю.Ю., Бочков Л.О., Варламов А.В. Использование масс-спектрометрии DART для экспрессного подтверждения брутто-формул гетероциклических соединений // Известия Академии наук. Серия химическая. 2010. Т. 57. № 10. С. 2014-2015.

9. Чернецова Е.С,., Овчаров М.В., Затонааш Г.В., Абрамович Р.А., Ревельскии И.А. Уточнение состава ионов [М+18]+ в масс-спектрах DART полиэтиленгликоля при использовании масс-спекгрометрии высокого разрешения // Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7. № 4. С. 299 - 302.

10. Chernetsova E.S., Khomyakov Yu.Yu., Goryainov S.V., Ovcharov M.V., Bochkov P.O., Zatonsky G.V., Zhokhov S.S., Abramovich R.A. Capabilities of direct analysis in real time mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry in the mint oil test // Mendeleev Communications. 2010. V. 20. № 5. P. 299 - 300.

11. Chernetsova E.S., Bochkov P.O., Ovcharov M.V., Zhokhov S.S., Abramovich R.A. DART mass spectrometry: a fast screening of solid pharmaceuticals for the presence of an active ingredient, as an alternative for IR spectroscopy // Drug Testing and Analysis. 2010. V. 2. № 6. P. 292 - 294.

12. Revelsky LA., Chernetsova E.S., Luzyanin B.P., Fedoseeva M. V., Glazkov I.N., Revelsky A.I. Organic elemental analysis: a new universal approach to authenticity/quality control of pharmaceuticals // Drug Testing and Analysis. 2010. V. 2. №9. P. 452-454.

13. Чернецова E.C., Морлок Г.Е. Масс-спектрометрический метод прямого анализа проб в режиме реального времении (DART) и его применение в фармацевтическом и биологическом анализе // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2011. Т. 77. № 8. С. 10- 19.

14. Чернецова Е.С., Морлок Г.Е., Ревельскии И.А. Масс-спектрометрия DART и ее применение в химическом анализе// Успехи химии. 2011. Т. 80. № 3. С. 249-271.

15. Ревельский И.А., Чернецова Е.С.., Ревельскии А.И., Морлок Г.Е. Масс-спектрометрия DART: определение следов органических соединений в органических растворах // Масс-спектрометрия. 2011. Т. 8. № 3. С. 235 - 255.

16. Чернецова Е.С., Ревельский И.А., Морлок Г.Е. Быстрый скрининг оксиметилфурфурола в меде методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии // Аналитика и контроль. 2011. Т. 15. № 1. С. 19 - 22.

17. Chernetsova E.S., Revelsky I.A., Morlock G.E. Fast quantitation of 5-hydroxymethylfurfiiral in honey using planar chromatography // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011. Vol. 401. № 1. P. 325 - 332.

18. Chernetsova E.S., Revelsky A.I., Morlock G.E. Some new features of Direct Analysis in Real Time mass spectrometry with desorption at an angle option // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2011. V. 25. № 16. P. 2275 - 2282.

19. Chernetsova E.S., Morlock G.E. Ambient desorption ionization mass spectrometry (DART, DESI) and its bioanalytical applications // Bioanalytical Reviews. 2011. V. 3. № i.p. 1-9.

20. Chernetsova E.S., Morlock G.E. Determination of drugs and drug-like compounds in different samples with Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry // Mass Spectrometry Reviews. 2011. V. 30. № 5. P. 875 - 883.

21. Чернецова Е.С., Абрамович Р.А., Ревелъский И.А. Масс-спектрометрия DART: быстрый анализ мягких лекарственных форм // Химико-фармацевтический журнал. 2011. Т. 45. № 11. С. 49-51.

22. 4epneijoea Е.С., Бочков П.О., Затонскни Г.В., Абрамович Р.А. Новый способ скрининга таблетированных лекарственных препаратов на фальсификаты с использованием масс-спектрометрии DART // Химико-фармацевтический журнал. 2011. № 5. С. 92 - 94.

23. Чернецова Е.С., Хомяков Ю.Ю., Затонский Г.В., Абрамович Р.А. О возможностях использования ГХ-МС и масс-спектрометрии DART для обучающих практических занятий по масс-спектрометрии // Масс-спектрометрия. 2011. Т. 8. № 1. С. 61 -62.

24. Chernetsova E.S., Crawford Е.А., Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarov V.G., MorlockG.E. Phytochemical analysis using direct analysis in real time high resolution mass spectrometry // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2012. Т. 10. № 2. С. М40.

25. Чернецова Е.С., Лабъщина А.Т., Овчаров М.В., Бочков П.О., Ревелъский И.А. Экспресс-анализ комбикормов и пчелиного меда методом масс-спектрометрии DART // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2012. Т. 78. № 7. С. 23 - 25.

26. Morlock G.E., Chernetsova E.S. Coupling of planar chromatography with direct analysis in real time mass spectrometry (DART-MS). Central European Journal of Chemistry. 2012. V. 10. № 3. P. 703 - 710.

27. Chernetsova E.S., Crawford E.A., Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarov V.G., Morlock G.E. ID-CUBE Direct Analysis in Real Time high resolution mass spectrometry and its capabilities in the identification of phenolic components from the green leaves of Bergenia crassifolia L. // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2012. V. 26. № 11. P. 1329 - 1337.

28. Chernetsova E.S., Morlock G. Assessing the capabilities of Direct Analysis in Real Time mass spectrometry for 5-hydroxymethylfurfural quantitation in honey. International Journal of Mass Spectrometry. 2012. V. 314. №4. P. 22-32.

29. Chernetsova E.S., Bromirski M., Scheibner O., Morlock G. DART-benchtop Orbitrap MS: a novel mass spectrometric approach for the identification of phenolic compounds in propolis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2012. V. 403. № 10. P. 2859 - 2867.

30. Чернецова E.C., Старостин А.Б., Калабин Г.А. Быстрая классификация образцов прополиса путем анализа многомерных данных (масс-спектров DART) методом главных компонент в программе Excel. Аналитика и контроль. 2012. Т. 16. №2. С. 210-217.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность

научному консультанту данной работы, профессору кафедры системной экологии Экологического факультета Российского университета дружбы народов (г. Москва, Россия), доктору химических наук Калабииу Г.А. за консультирование и всецелую поддержку автора при участии в программах международного обмена и при подготовке диссертации к защите;

зав. отделом планарной хроматографии Института пищевой химии Университета Хойэнхайм (г. Штутгарт, Германия) Морлок Г.Е. за обмен опытом, благоприятную атмосферу для проведения исследований и сотрудничества и плодотворные дискуссии об исследованиях, выполненных в рамках программ международного обмена, результаты которых вошли в данную работу;

своим учителям с кафедры аналитической химии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (г. Москва, Россия), докторам химических наук Ревельскому А.И. и профессору Ревельскому И.А., оказавшим всестороннюю помощь, консультирование и содействие на всех этапах данного диссертационного исследования;

директору Центра коллективного пользования (Научно-образовательного центра) Российского университета дружбы народов (г. Москва, Россия), кандидату фармацевтических наук Абрамович P.A. за приглашение провести первые в России исследования в области масс-спектрометрии DART и обеспечение необходимой материальной базы для проведения этих исследований;

всем соавторам публикаций по теме данного диссертационного исследования и всем коллегам, кто своим участием, поддержкой и советом на каком-то этапе помогли выполнению данной работы.

Чернецова Елена Сергеевна Исследования в области масс-спекгрометрии DART и ее сочетания с Планерной хроматографией. Быстрый скрининг лекарственных средств Автореф. дисс. на соискание ученой степени доктора хим. наук. 02.00.02 - Аналитическая химия

Подписано в печать 23.09.2013 г.

Формат 60x90/16. У сл.пл. - 2.0 Заказ №16359 Тираж: 200 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11. стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru