Капиллярное электрофоретическое разделение энантиомеров при использовании олиго- и полисахаридных хиральных селекторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Буданова Наталья Юрьевна

КАПИЛЛЯРНОЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ЭНАНТИОМЕРОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ОЛИГО- И ПОЛИСАХАРИДНЫХ ХИРАЛЬНЫХ СЕЛЕКТОРОВ

Специальность - 02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2005

Работа выполнена в лаборатории хроматограф ических методов анализа кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Шаповалова Елена Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Руценко Борис Антонович кандидат химических наук Комарова Наталья Викторовна

Ведущая организация:

Центр химии лекарственных средств - Всероссийский научно-исследовательский химико-фармацевтический институт

Зашита состоится 22 декабря 2005 года в 16 ч. 15 мин. в аудитории 344 на заседании диссертационного совета Д.501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан ноября 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

/

¿33€<f

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важным направлением аналитической химии являются исследования в области разделения оптических изомеров биологически активных соединений. Определение оптически активных соединений имеет принципиальное значение для органической химии, медицины, фармакологии. Благодаря исключительно высокой разделяющей способности и экспрессности разделения капиллярный электрофорез (КЭ) -один из наиболее подходящих методов для решения этой сложной задачи.

Разделение хиралъных соединений принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор, т.е. оптически активное соединение, распознающее пространственную конфигурацию энантиомеров. Вследствие сложности явления хирального распознавания «универсального» хирального селектора, который позволил бы решить все проблемы разделения энантиомеров, не существует, каждый селектор имеет свою область применения, свои преимущества и недостатки. К настоящему времени уровень понимания процессов энантиораспознавания не позволяет выбрать a priori наилучший хиральный селектор для индивидуального рацемата, и успех энантиоразделения в КЭ основывается на методе проб и ошибок. Для создания эффективного метода разделения энантиомеров необходимы систематические исследования, предполагающие изучение закономерностей энантиоразделения как функции структуры хирального селектора, что позволит представить механизм энантиораспознавания. В связи с этим работы, направленные на исследование новых хиралъных селекторов методом КЭ, являются крайне актуальными, поскольку позволяют не только определять энантиомерный состав соединений, но и проводить тестирование хиралъных свойств селекторов для последующей рекомендации селекторов для создания хиралъных неподвижных фаз в ВЭЖХ.

О лито- и полисахаридные хиральные селекторы являются наиболее эффективными и перспективными соединениями для энантиоразделения различных классов хиралъных соединений. Каждое новое сочетание катионных, анионных или нейтральных групп, гидроксигрупп, их количества и расположения в молекуле хирального селектора определяет характерную вторичную структуру нециклических олиго- и полисахаридных селекторов, или приводит к различной гадрофобности и асимметрии полости циклических олигосахаридных хиралъных селекторов, что и является источником уникальной энантиораспознавательной Автор выражает искреннюю благодарность проф., д.х.н. O.A. Шпигуну за постоянное внимание, поддержку, помощь в работе и

способности каждого хирального селектора. В качестве новых селекторов в работе использованы: хитозан, ^-(З-сульфо-З-карбокси)пропиопилхитозан и гептакис(6-шяно-в-дезокси)-р -циклодекстрин.

Цель работы состояла в изучении энантиораспознавательной способности хиральных селекторов на основе олиго- и полисахаридов к различным классам соединений и выборе условий разделения энантиомеров. Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

оценка возможности использования хитозана и сульфатов хитозана в качестве хиральных селекторов в КЭ;

исследование энантиоразделения аминов и аминоспиртов при использовании хирального селектора нового типа - хирально модифицированного полисахаридного селектора ^-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана;

изучение особенностей энантиоразделения аминов при использовании высокомолекулярного сульфата декстрана;

исследование закономерностей хирального разделения ряда органических кислот и производных аминокислот при использовании нового хирального селектора - гептакис(6-амино-6-дезокси)-р-циклодскстрина;

сравнение энантиораспознавания производных аминокислот гептакис(6-што-6-дезркси)-Р-циклодекстрином в КЭ и ВЭЖХ.

Научная новизна. Исследовано влияние структуры полисахаридов (хитозана, сульфатов хитозана, #-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана) на их энавтиоселективность. Предложен новый хиральный селектор - #-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозан. Систематическое исследование влияния рН, состава фонового электролита, концентрации селектора позволило выявить основные закономерности и выбрать условия разделения энантиомеров ряда биологически активных аминов при использовании Лг-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана. Изучено влияние инструментальных факторов (напряжения, температуры термостагирования) на энантиоселективность при использовании Л^-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана. Проведена оценка температуры внутри капилляра. Впервые в КЭ использован гептакис(6-амино-6-дезокси)-р-циклодекстрин и выявлены основные факторы, определяющие разделение энантиомеров кислот н производных аминокислот. Сопоставлена энантиораспознавательная способность ге/готакис(б-амино-6-дезокси)-Р-циклодекстрина и аминированных производных Р -циклодекстрина.

Практическая значимость работы. Выбраны условия разделения энантиомеров флуоксетина и пиндолола, являющихся активными компонента ами лекарственных препаратов, и определен энантиомерный состав препаратов при использовании #-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана. Выбраны условия разделения энантиомеров профенов (кетопрофена, фенопрофена, ибупрофена) при использовании геляикис(б-амино-б-дезокси)-Р -циклодекстрина. Впервые проведено одновременное разделение энантиомеров семи карбоксибензильных производных аминокислот. Показано, что метод КЭ позволяет быстро и экономично оценить энантиорагаюзнавательную способность новых хиральных селекторов и рекомендовать их для создания хиральных неподвижных фаз в ВЭЖХ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Данные по изучению влияния хитозана на электрофорстическое поведение и энантиоразделение ряда ароматических кислот.

2. Результаты исследования и особенности разделения энантиомеров аминов и аминоспиртов при использовании #-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана и сульфата декстрана.

3. Данные по влиянию температуры и приложенного напряжения на разделение энантиомеров при использовании ^-(3-сульфо, 3-харбокси)пропионилхитозана и сравнение возможностей систем для КЭ «BioRad HFE100» и «Капель-105».

4. Данные по энантиоразделению ряда органических кислот и производных аминокислот при использовании в качестве хирального селектора гептакис(6-шиао-6-дезокси)-(5-циклодексгрина.

5. Условия и результаты определения энантиомерного состава некоторых лекарственных препаратов.

Апробация работы. Основное содержание работы изложено в 11 публикациях. Результаты исследований доложены на Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург - Репино, 2003), Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004), ll" International Symposium "Advances and applications of chromatography in industry" (Bratislava, Slovak Republic, 2001), International Congress on Analytical Sciences (Tokyo, Japan, 2001), Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 2000), 10-th Russian-Japan Joint Symposium on Analytical Chemistry (Moscow and St. Petersburg, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 статей и 6 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 161 странице машинописного текста, содержит 44 рисунка и 27 таблиц, 24 формулы, в списке цитируемой литературы 121 наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ . Обзор литературы

Обсуждены основы теории хирального КЭ, проанализированы принципиальные особенности КЭ при использовании заряженных хиральных селекторов для разделения энантномеров.

Рассмотрены возможности применения хиральных селекторов на основе олиго- и полисахаридов для разделения энантномеров. Систематизированы сведения о типах данных хиральных селекторов.

Экспериментальная часть

Исходные растворы 0.4-0.6 мг/мл рацемических смесей прометазина, тербуталина, хлорциклизина, окспренолола, карбиноксамина, тетрагидрозолива, хлорфенирамина, гидроксизина, орфенадрина, изопротеренола, доксиламина, альпренолола, метопролола, хлорокина, дилтиазема, лабеталола, надолола, пиндолола, атенолола, флуоксетина, эпинефрина, миндальной кислоты, а-метоксифенилуксусной кислоты, 2-фенилпропановой кислоты, 3-фенилбутановой кислоты, кетопрофена, фенопрофена, ибупрофена в воде или смеси вода/пропанол-2 готовили по точным навескам.

Исходные растворы карбоксибензильных (КБЗ), бензоильных (Б), дансильных, Ы-трет-бутоксикарбонильных (БОК) производных аминокислот 0.5 мг/мл в смеси вода/ацетонитрил (1/1) готовили по точным навескам: КБЗ-БЬ-аспарагииа, КБЗ-ОЬ-аспарагиновой кислоты, КБЗ-ЭЬ-метионина, КБЗ-ОЬ-норлейцина, КБЗ-ОЬ-лейципа, КБЗ-ИЬ-валина, КЕЗ-ЭЬ-фенилаланина, КБЗ-ОЬ-тирозина, КБЗ-Ь-тирозина, КЪЗ-ОЬ-тринтофана, бензоил-ПЬ-валина, бензоил-ОЬ-фенилаланина, бензоил-Ш^аланина, бензоил-БЬ-метиошша, дансил-В1^асп арагиновой кислоты, дансил-О!^ лейцина, дансил-БЬ-фенилаланина, дансил-ОЬ-метиошша, дансил-БЬ-треонина, БОКЛЭЬ-фенилаланина, БОК-Ь-фенилаланина, БОК-БЬ-триптофана, БОК-Ь-тригггофана. Исходный раствор 10.0 мг/мл аспарагиновой кислоты в воде готовили по точной навеске.

В работе использовали прибор для КЭ «BioRad НРБ-100» (BioRad, США), оснащенный спектрофотометрическим детектором (195-360 нм). 1 mAU детектора соответствует 10 mV на электрофоре граммах. Для введения образцов в капилляр использовали гидростатический ввод пробы (5-10 см, 3-10 с). Приложенное напряжение составляло 12 кВ. Данные записаны и обработаны при использовании программного обеспечения «Winpeak» (Eppendorf-Biotronic, Германия). В работе также была использована система КЭ «Капель-105» (НПФ АП «Люмэкс», Санкт-Петербург, Россия) со спектрофотометрическим детектором (195-360 нм). Образцы вводили при использовании ввода давлением (30 мбар, 3-5 с). Приложенное напряжение составляло 12-25 кВ, капилляр термостатировали при 20°С. Данные записаны и обработаны при использовании программного обеспечения «Мультихром» (ЗАО «Амперсенд», Москва, Россия). В работе применяли кварцевые капилляры с различным внутренним диаметром, длиной (Polymicro Technologies, Phoenix, США).

В качестве хиральных селекторов использовали: хитозан (7 кДа, степень дезацетилировавия 85%), сульфаты хитозана: 63 (7% S) и 100 кДа (13.5% S), сульфат декстрана (получен из декстрана ММ 500 кДа), ^-(З-сульфо-З-карбокси)пропионилхитозан (СКПХ, получен из хитозана ММ 14, 60, 200 кДа), геилмкис(6-амино-6-дезокси)-Р-циклодекстрин (пер-6-амино-Р-ЦД), 2-тдроксш1ропил-Р-циклодекстрин (TTI-ß-ЦЦ). Хитозан, сульфат хитозана, сульфат декстрана предоставлены Центром «Биоинженерия» РАН, ГП-Р-ЦЦ получен из Sigma, США.

Новые хиральные селекторы для КЭ - СКПХ и пер-6-амино-Р-ЦД - синтезированы С.А. Лопатиным (Центр «Биоинженёрия» РАН).

Фоновые электролиты (ФЭ) были приготовлены из ацетатных или фосфатных буферных растворов, СКПХ, nep-6-амино-р-ЦД или хитозан добавляли по точной павеске и затем pH доводили до нужного значения 0.05 М NaOH, или точную навеску СКПХ растворяли в воде и доводили pH до 4.8 или 5.3 0.05 М NaOH. Сульфат декстрана, сульфаты хитозана и ГП-Р-ЦД добавляли по точной навеске в фосфатный или ацетатный буферные растворы. Пропанол-2 или вода были использованы как маркеры электроосмотического потока (ЭОП). Относительное стандартное отклонение времен миграции (п=3, Р=0.95) не превышало 0.01.

Методология исследования энантиораспознавательной способности новых хиральных селекторов

Энантиоселективность разделения в КЭ определяется различным взаимодействием энантиомеров с хиральным селектором. Главными факторами, влияющими на энантиоселективность, являются природа хиралъного селектора и рН ФЭ. Эти факторы определяют процесс хиралъного распознавания, поскольку они влияют как на взаимодействие хиралъного селектора с энантиомерами, так и на их подвижности. Исследование любого нового хиралъного селектора предполагает, прежде всего, исследование влияния и правильный выбор рН, т.е. значения рН, при котором для данного хиралъного селектора и данной пары энантиомеров наблюдается максимальное значение энантиоразрешения, затем оптимизацию концентрации хиралъного селектора, напряжения, температуры термостатирования капилляра, исследование влияния природы буферного раствора, органических модификаторов на энантиоселективность. Для достижения более высокой селективности разделения желательно, чтобы энавтиомер и хиральный селектор были заряжены противоположно, и, таким образом, для разделения энантиомеров анионных соединений предпочтительнее использовать катиоиные хиралыше селекторы, а для энантиомеров катионных соединений - анионные хиральные селекторы.

Исследование энантиораспознавательной способности полнсахарвдных хиральных селекторов

Для исследования разделения энантиомеров выбраны следующие полисахаридиые хиральные селекторы: хитозан, СКПХ, сульфаты хитозана и сульфат декстрана.

Хитозан является полимером 2-амино-2-дезокси-0-ппокозы, т.е. поликатионом, и при введения в капилляр необратимо обращает направление ЭОП. Для получения стабильного покрытия поверхности капилляра необходимо (и достаточно) использовать ФЭ с концентрацией хитозана 0.01%.

Стратегия выбора рН при использовании хитозана основана на его кислотно-основных свойствах (рКа аминогруппы хитозана 6.5), растворимости (хитозан растворим в воде только в протонированной форме) и возможности гидролиза в кислой среде. Интервал рН 4.7-5.4 является наиболее подходящим для работы с хитозаном в КЭ. Времена миграции и селективность разделения некоторых кислот при использовании ФЭ, содержащих 0.011.35% хитозана, рН 5.4, приведены в табл. 1.

Таблица 1. Влияние концентрации хитозана на времена миграции и селективность разделения*' кислот: 1 - миндальной, 2 - а-метоксифенилуксусяой, 3 - 2-фенидпропановой, 4 - 3-фенилбутановой и фенопрофена.

Соединение Концентрация хитозана, %

0.01 0.10 0.45 1.35

(ыжр, мин а 1мятр» мин а 1иигр, МИН а ^мигр. МИН а

1 5.53 6.22 7.35 8.46

2 5.75 1.040 6.43 1.034 7.54 1.026 8.66 1.024

3 5.85 1.017 6.51 1.012 7.62 1.011 8.72 1.007

4 6.17 1.055 6.84 1.051 7.97 1.046 9.08 1.041

Фенопрофен 6.40 1.037 7.14 1.044 8.54 1.072 9.98 1.099

Пропанол-2 9.94 10.38 10.59 11.55

ФЭ: 10 мМ ацетатный буферный раствор, рН 5.4. Капилляр: 51.9 см (44.4 см)х75 мкм. и -12 кВ. X 200 нМ. Ввод пробы гидростатический. Концентрация кислот (1.8-2.6)10"5 М.

- коэффициент селективности определен для двух последовательно мигрирующих кислот как отношение времен миграции.

Обращение ЭОП при модифицировании капилляра хитозаном позволяет сократить время разделения смеси миндальной, а-метоксифенилуксусной, 2-фенилпропановой, 3-фенилбутановой кислот и фенопрофена по сравнению с немодифицированным капилляром. Разделение энантиомеров кислот отсутствует, что, по-видимому, связано с недостаточным для хирального распознавания количеством точек связывания энантиомеров с хиралыгам селектором.

Для изменения участков хирального взаимодействия структуру селектора необходимо химически модифицировать. Один из вариантов химического модифицирования структуры селектора заключается во введении в его структуру дополнительных хиральных центров. Особенностью нового хирального ■ селектора, СКПХ, является наличие дополнительного хирального центра в боковой цепи, отсутствующего в природной структуре хитозана. Необходимо отметить, что синтез СКПХ не позволяет четко определить, является ли новый хиральный центр рацематом или отдельным энантиомером: хотя синтез и не является энантиоселективным, структура полимера, по-видимому, может привнести изменения как в сторону предпочтительного образования одного из энантиомеров, так и образования оптически чистого СКПХ.

Исследование энантиораспознавательной способности ЛЦЗ-сульфо-З-карбоксн)пропионилхитозана как анионного хирального селектора проводили на примере ряда аминов и аминоспиртов, большинство из которых является лекарственными препаратами. Для изучения факторов, влияющих на хиральное распознавание, использован СКПХ, полученный из хигозана ММ 200 кДа. Тестирование позволило выявить соединения, определяющие энантиораспознавательную способность СКПХ: флуоксетин, пиндолол, хлорцшслизин, гидроксизин, тербуталин и тетрагидрозолин.

Влияние рН на энантиоразделение изучено в интервале 4.4-5.3 при использовании 2% СКПХ, 10 мМ ацетатного буферного раствора (табл. 2). При уменьшении рН для всех соединений наблюдается увеличение времени миграции, связанное с уменьшением ЭОП, и одновременное увеличение эффективных подвижностей энантиомеров. Это отчетливо

Рис. 1. Влияние рН на энантиоразделение тербуталина. ФЭ: 10 мМ ацетатный буферный раствор, 2 % СКПХ; А рН 5.3, В рН 4.8, С рН 4.4. Капилляр: 59.8 см (51.3 см)х75 мкм. V12 кВ. X 200 нМ. Ввод пробы гидростатический, 3-5 с. Концентрация тербуталина «100 мкг/мл.

Таблица 2. Влияние рН ацетатного фонового электролита на времена миграции и энантиораэделение веществ при использовании высокомолекулярного Лг-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана.

Соединение рН фонового электролита

4.4 4.8 5.3

^мнгр, МИН а (цигрз МИН а и<н1р» МИН а

Пиндолол 15.24/15.40 1.1 1.010 13.09 - 1.000 11.95/12.08 1.2 1.011

Флуоксетнн нд" 11.91/12.11 1.6 1.017 10.60/10.76 1.1 1.015

Хлорциклизин 14.47/14.64 1.1 1.012 12.73/12.88 1.1 1.012 11.74/11:88 0.9 1.012

Гидроксизин 14.49/14.61 0.7 1.008 12.56/12.66 0.8 1.008 10.76/10.84 0.4 1.007

Тербуталин 13.60 - 1.000 12.32/12.38 0.3 1.005 11.58/11.66 0.6 1.007

Тетрагидрозолин 11.22/11.30 0.4 1.007 10.06/10.11 0.3 1.005 9.33 - 1.000

Пропанол-2 12.9 10.8 9.6

ФЭ: 10 мМ ацетатный буферный раствор, 2% СКПХ. Остальные усл. см. рис. 1. Концентрация соединений -100 мкг/мл. - нд: не продетектировано (одновременная миграция флуоксетина и маркера ЭОП).

Данная особенность энантиоразделеннй при использовании СКГТХ свидетельствует об ослаблении взаимодействий хирального селектора и энантиомеров при уменьшении рН, что проявляется также и в уменьшении энантиоразрешения. Принимая во внимание, чгго рКа карбоксильной группы СКПХ составляет 5.5, можно констатировать, что уменьшение взаимодействий с хиральным селектором связано с ослаблением ионных взаимодействий.

Природа буферного раствора может оказывать заметное влияние на энантиораспознавагельную способность полисахаридов. Кроме ацетатного буферного раствора, в работе в качестве ФЭ были использованы: фосфатный буферный раствор, обычно используемый в хиральных разделениях в КЭ (2% СКПХ, рН 4.0, 5.0), раствор СКПХ в воде и в 10 мМ нитрате натрия, использованном для создания ионной силы (рН доведен до 4.8 1М ЫаОН, 2% СКПХ) (табл. 3).

Сравнивая разделение энантиомеров, полученное при использовании ФЭ различного состава, можно заключить, что ФЭ, содержащие ацетатный буферный раствор и раствор СКПХ в воде сопоставимы между собой по результатам, ФЭ, содержащий нитрат натрия, менее эффективен для энантиоразделения, а фосфатный буферный раствор оказался самым неэффективным, что связано, отчасти, с ухудшением эффективности разделения.

Наиболее ярко данный эффект проявляется для энантиомеров флуоксетина: эффективность разделения в ФЭ, содержащих ацетат-ион (рН 4.8) и фосфат-ион (рН 5.0,4.0) 126700, 82790, 23930 т.т., соответственно. Вероятно, ухудшение эффективности разделения является причиной полученного наименьшего разрешения пиков энантиомеров флуоксетина (Яв 0.8) в фосфатном ФЭ, рН 4.0, при максимальной энантиоселективности (а 1.024), которая может быть достигнута при использовании СКПХ. Отрицательный эффект фосфат-ионов на энантиоразделение связан, возможно, с конкурирующим влиянием с хиральным селектором за взаимодействие с разделяемыми энантиомерами.

Введение органических добавок я модификаторов в ФЭ может значительно изменять энантиоселективность разделения в КЭ. При введении 0.6% (об.) триэтиламина в ФЭ (2% СКПХ, рН 5.3) селективность разделения энантиомеров увеличивается, однако не для всех соединений разделение является оптимальным по эффективности разделения. Улучшение энантиоразделения достигнуто дня пиндолола (Из, соответственно, 1.4 и 1.2), рис.2, и тербуталина (11$, соответственно, 0.7 и 0.6). Энантиоразделение пиндолола и тербуталина также незначительно улучшается при добавлении в ФЭ 5% метанола (2% СКПХ, рН 4.8), флуоксетина, хлорциклизина и гидроксизина - ухудшается по сравнению с ФЭ, не содержащим метанол.

Таблица 3. Влияние состава фонового электролита на энантиоразделение веществ при использовании высокомолекулярного Лг-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана.

Соединение №ОН" 10 мМ N31^03, ИаОН" 10 мМ фосфатный буферный раствор

^ а а а

Пиндолол 1.2 1.011 1.1 1.010 0.9 1.010

Флуоксетин 1.3 1.017 0.8 1.015 0.8 1.012

Хлорциклизин 1.1 1.011 1.0 1.011 <0.3 1.008

Гидроксизин 0.7 1.008 0.7 1.008 <0.3 1.005

Тербуталин 0.5 1.007 <0.3 1.005 0.0 1.000

Тетрагидрозолин 0.0 1.000 <03 1.006 0.0 1.000

ФЭ: 2% СКПХ, рН 4.8. ' - рН доведен 1М КаОН. Остальные усл. см. рис. 1.

мБ 60

50.

40.

30.

20

10.

11.0

Рис. 2. Разделение энантиомеров пиндолола. ФЭ: 2% СКПХ, 0.6% (об.) триэтиламина, рН 5.3. Остальные усл. см. рис. 1.

13.0 МП

Оптимизация инструментальных факторов: температуры термостатирования капилляра и приложенного напряжения также позволяет улучшить энантиоразделение. В работе при использовании системы КЭ «Капель-105» исследовано влияние напряжения и температуры, установленной для термостатирования капилляра, на времена миграции и энантиоразделение пиндолола, а также при использовании маркера ЭОП (пропанола-2) проведена оценка температуры внутри капилляра при различных значениях напряжения.

Увеличение напряжения в интервале 12-25 кВ (температура термостатирования 20°С) уменьшает время миграции и незначительно улучшает энантиоразделение пиндолола. Выполнение закона Ома в исследуемом интервале напряжений свидетельствует об эффективности системы жидкостного термостатирования капилляра при использовании «Капели-105». Увеличение температуры термостатирования в интервале 15-50°С (при напряжении 12 кВ) приводит к последовательному уменьшению времени миграции энантиомеров пиндолола и ухудшению энантиоразделения. Время миграции пиндолола при использовании «ВюЯас! НРБ-100» (термостатирование отсутствует) совпадает с временем миграции на «Капель-105» при температуре термостатирования капилляра приблизительно 38-39°С.

Рассчитаны значения температуры внутри капилляра для различных значений напряжения при использования термостатирования, они приведены в табл. 4.

Таблица 4. Рассчитанные значения температуры внутри капилляра при различных значениях приложенного напряжения. Температура жидкостного термостатирования 20°С.

и, кВ 12 15 18 21 25

СС 23.9 25.2 26.5 28.0 30.2

Необходимость термостатирования подтверждают результаты всех энантиоразделеняй, полученных на приборе «Капель-105» (жидкостное термостатирование, 20°С) и на приборе «Вю11ас1 НРБ-100» (термостатирование отсутствует) (табл. 5). Выполнение анализа в оптимизированных условиях на приборе «Капель-105» позволило получить разделение энантиомеров р-блокаторов атенолола и надолола, отсутствующее при использовании системы КЭ «ВюКас! НРЕ-100».

Электрофореграммы разделения энантиомеров пиндолола и флуоксетина в оптимизированных условиях приведены на рис. 3.

Полученные данные по исследованию хирального распознавания при использовании СКТТХ показывают, что за исключением пары хлорциклизин и гидроксизин, особенностью которых является то, что хиральный атом углерода соединен с двумя фенильными кольцами и пиперазиновым кольцом, все рацематы, к которым СКПХ проявляет энантиораспознавательную способность, принадлежат к разным классам соединений. Это позволяет заключить, что хиральная структура СКПХ предоставляет разные участки («сайты») для образования водородных связей и гидрофобных взаимодействий.

Таблица 5. Влияние оптимизации инструментальных факторов, приложенного напряжения и температуры термостатирования, на энантиоразделение тестовых соединений.

Соединение «Капель-105» г/25 кв, t 20°С) "BioRad НРЕ-100" С/12кВ6)

tiunp, МИН Rs а tygfpj МИН Rs а

Пицдолол 9.75/9.91 2.5 1.016 12.68/12.82 1.2 1.011

Флуоксетин1' 11.56/11.82 4.2 1.022 11.26/11.45 1.6 1.017

Хлорциклизин 9.88/10.08 2.0 1.020 12.21/12.35 1.1 1.011

Гидроксизин 9.40/9.52 2.0 1.013 11.79/11.88 0.7 1.008

Тербугалин 9.23/9.31 1.4 1.009 11.70/11.78 0.5 1.007

Тетрагидрозолин'4 15.86/15.96 0.3 1.006 9.61 - 1.000

Надолол 9.07/9.12 <0.3 1.006 11.43 - 1.000

Атенолол 9.11/9.17 0.9 1.007 11.43 - 1.000

ФЭ: 2% СКПХ, рН 4.8. X 200 им.а) Капилляр 60 см (52 см)х75 мкм. Ввод пробы 30 мбар, 3-5 с. ® Капилляр: 59.8 см (51.3 см)х75 мкм. Ввод пробы гидростатический, 3-5 с. "бПвкВ.^ШгкВ.

5.79 тАи

27mAU

10 инк

И 8

12 а

Рис. 3. Разделение энантиомеров пиндолола (а) и флуоксетина (б). ФЭ: 2% СКПХ, рН 4.8. Капилляр: 60 см (52 см)х75 мкм. U25 кВ (a), U18 кВ (б), 120°С, X 200 нм.

Для хирального распознавания при использовании СКПХ важную роль играет включение энантиомеров в полимерную сетку с хиральными полостями. О вкладе этого фактора свидетельствуют данные по влиянию ММ СКПХ на энантиоразделение. Установлено, что энантиоселективность немонотонно изменяется при увеличении ММ и

характер зависимости определяется природой разделяемых энантиомеров. СКПХ с ММ 60 кДа является наилучшим с точки зрения хирального разделения энантиомеров.

Энантиораспознававательная способность высокомолекулярного сульфата декстрана проявляется к флуоксетину, тетрагидрозолину, доксиламину, карбиноксамину, орфенадрину и хлорфенирамину. Разделение энантиомеров флуоксетина приведено на рис. 4. Сравнение с данными по энантиоразделению при использовании низкомолекулярного аналога показывает, что энантиоселекгавность высокомолекулярного декстран сульфата, также как и в случае СКПХ, зависит от природы разделяемых энантиомеров и молекулярной массы хирального селектора. Немонотонная зависимость энантиоселективпости ионных хиральных селекторов от ММ свидетельствует о более сложном влиянии вторичной структуры селектора на энантиоразделение, чем при использовании нейтральных полисахаридов, для которых разделение энантиомеров, как правило, улучшается при увеличении ММ.

Рис. 4. Разделение энантиомеров флуоксетина. ФЭ: 10 мМ фосфатный буферный раствор, 2% сульфата декстрана, рН 6.8. Капилляр 60 см (52 см)х75 мкм. 1/20 кВД 200 нм, 120°С.

10 11 5 13 14 15 1« 17шт

Таким образом, уникальность хиральной структуры рассмотренных полисахаридов (СКПХ и декстран сульфата) определяет свой характерный круг разделяемых энантиомеров. Полученные результаты позволяют сделать благоприятный прогноз для использования СКПХ и декстран сульфата в создании хиральных сорбентов для ВЭЖХ.

Протестированные образцы сульфатов хитозана не проявили энантиораспознавательную способность по отношению к исследованным аминам и аминоспиртам, энантиомеры которых могут быть разделены при использовании СКПХ, но, возможпо, они могут быть эффективными хиральными селекторами для энантиоразделений других соединений.

Определены содержание и энантиомерный состав флуоксетина и пиндолола в фармацевтических препаратах «Флуоксетин» и «Вискен» (действующая форма -пиндолол) при использовании СКПХ, полученного из хитозана ММ 14 кДа. В качестве внутреннего стандарта использовали лабеталол. Результаты определения приведены в табл. 6, электрофореграммы представлены на рис. 5. Содержание флуоксетина и пиндолола в анализируемых препаратах соответствует указанному производителем, в обоих случаях активное вещество содержится в препарате в виде рацемата.

Таблица 6. Результаты определения содержания флуоксетина и пиндолола в лекарственных препаратах (п=5, Р=0.95).

Анализируемый Содержание активного вещества, мг Энантиомерный

препарат вычисленное номинальное состав, %

Флуоксетин 20±2 20 51±2

(мг/на капсулу) 50±2

Вискен 5.3±0.6 5 49±1

(мг/на таблетку) 51±1

12 5 <60 17-6 20.0 мж

176 200

а б

Рис. 4. а - электрофореграмма препарата «Флуоксетин». 1 - флуоксетин, 2 - лабеталол. б -электрофореграмма препарата «Вискен». 1 - Пиндолол, 2 - лабеталол. ФЭ: 14 мМ ацетатный буферный раствор, 2% СКПХ (14 кДа), рН 4.8. Остальные усл. см. рис.1.

Исследование энантиораспозиавательной способности гептакис(6-ямиво-6-/хеюкси)-Р-циклодекстрина для разделения энантиомеров кислот и производных аминокислот

В настоящей работе исследован новый в КЭ хиральный селектор пер-6-амино-(3-ЦД. Для изучения энантиораспозиавательной способности пер-6-амино-($-ЦЦ выбран ряд ароматических кислот и производных аминокислот. Важной особенностью пер-6-амино-($-ЦД как гептазамещенного аминиро ванного циклодекстрина является обращение ЭОП, что приводит к сложному влиянию концентрации хирального селектора на энантиоразделение. ЭОП зависит от концентрации хирального селектора в ФЭ и, таким образом, несмотря на «неэнантиоселективность», будет по-разному влиять на полученное разделение при разных концентрациях хирального селектора.

Энантиоразделение кислот. Энантиомеры всех исследуемых кислот (миндальной, а-метоксифенилуксусной, 2-фенилпропановой, 3 -фенилбутано вой кислот, кетопрофсна, фенопрофена и ибупрофена) могут быть полностью или частично разделены при использовании пер-6-амино-р-ЦД.

Влияние рН ФЭ на времена миграции и энантиоразделение изучено в интервале 4.86.7 при концентрации 3 мМ пер-6-амино-Р-ЦД. Для всех соединений зависимость времени миграции от рН одинакова: времена миграции минимальны при рН 5.8 и возрастают при уменьшении рН до 4.8 и увеличении до 6.7 (табл. 7). Такой вид зависимости связан с изменением ионного состояния хирального селектора и энантиомеров в исследуемом интервале рН: при более низких значениях рН кислоты лишь частично диссоциированы и обладают невысокой собственной электрофоретической подвижностью (большими временами миграции), при увеличении рН степень диссоциации и подвижность увеличиваются, а при рН~6-7 депротонирование хирального селектора приводит к уменьшению ЭОП и, следовательно, к повторному увеличению времени миграции энантиомеров. Таким образом, рН ФЭ оказывает влияние и на константы взаимодействия энантиомеров кислот с хиральным селектором, и на их подвижности.

Разрешение пиков энантиомеров максимально при рН 5.8 для миндальной, 2-фенилпропановой и 3-фенилбутановой кислот, т.е. в условиях проявления наибольших электростатических взаимодействий. Для хирального распознавания энантиомеров а-метоксифенилуксусной кислоты, содержащей эфирную группу при хиральном атоме углерода, по-видимому, существенным является образование водородных связей, и максимальное энантиоразделение получено при наименьшем значении рН.

Таблица 7. Влияние рН фонового электролита на времена миграции и энантиоразделение кислот при использовании гептакис(6-амино-6-дезокси)-р-циклодекстрина. 1 - миндальная кислота, 2 - а-метоксифенилуксусная кислота, 3 - 2-фенштпропановая кислота, 4-3-фенилбутановая кислота.

Соединение рН фонового электролита

3.8 4.8 5.8 6.7

1ццгр) МИН Й5 а {тигр, МИН а 1мнгр) МИН 1*8 а ^мигр> МИН Ив а

1 32.34/32.94 0.7 1.019 10.26/1051 1.7 1.024 9.38/9.53 2.0 1.016 1036/10.48 1.5 1.012

2- 15.62/16.03 2.0 1.026 9.62/9.71 1.3 1.009 9.02/9:05 <0.3 1.003 10.50 0.0 1.000

3 10.91/11.39 1.0 1.044 9.80/9.92 1.6 1.012 10.66/10.72 0.4 1.006

4 15.05 0.0 1.000 10.97/11.04 0.7 1.006 11.84 0.0 1.000

Кетопрофен 11.51/11.90 1.6 1.034 10.66/10.76 1.1 1.009 13.21/13.26 <0.3 1.004

Фенопрофен 15.35/16.33 4.3 1.064 11.82/12.12 3.0 1.025 13.82/14.02 1.5 1.014

Ибупрофен нд" 14.03/14.75 4.0 1.051 14.98/15.35 1.3 1.025

Пропанол-2 -55 -30 -28 -60

ФЭ: 3 мМ пер-6-амино-р-ЦД, 50 мМ ацетатный буферный раствор, рН 3.8 и 4.8, или 50 мМ фосфатный буферный раствор, рН 5.8 и 6.7. Концентрация кислот 50 мкг/мл. Капилляр 60 см (52 см)х50 мкм. V -20 кВ. 120°С. X 200 нм. Ввод пробы 30 мбар, 3-5 с. - одновременная миграция второго энантиомера ибупрофена и маркера ЭОП.

Профены (кетопрофен, фенопрофен, ибупрофен) обладают общей тенденцией к увеличению энантиоразделения при уменьшении рН. Анализ полученных результатов позволяет предположить, что механизм энантиораспознавания пер-6-амино-(5-ЦД основан, главным образом, на стерически контролируемом включении в полость пер-6-амино-(3-ЦД и водородных связях: ибупрофен, имеющий одно фенильное кольцо, лучше соответствует полости пер-6-амино-р-ЦД, чем кетопрофен и фенопрофен. При высоких значениях рН, вызывающих диссоциацию карбоксильных трупп профенов, электростатические взаимодействия между сильными точечными зарядами амино групп пер-6-амино-р-ЦЦ и карбоксильными группами профенов, по-видимому, недостаточны для осуществления энантиоразделения, в то время как протонирование кислот, происходящее при более низких значениях рН, благоприятствует образованию водородных связей и, таким образом, улучшает энантиораспознавание.

Для энантиоразделения профенов пер-6-амипо-р-ЦД предпочтительнее, чем моноаминированный аналог, моно-6-амино-р-ЦЦ, а для кислот наблюдается противоположная тенденция, т.е. в данном случае сильные электростатические взаимодействия и отсутствие гидроксильных групп на более узком кольце Р-ЦД не благоприятствуют хиральному разделению.

Влияние концентрации пер-6-амино-§-ЦЦ на времена миграции и энантиоразделение кислот исследовано в интервале 0.07-10 мМ при рН 5.8. Разрешение пиков энантиомеров и энантиоселективность возрастают для всех соединений при увеличении концентрации пер-6-амино-{5-ЦД.

Энантиоразделение производных аминокислот. В работе изучено энантиоразделение карбоксибензильных (КБЗ), бензоил-, /ире/ибутоксикарбонильных (БОК) и дансил-производных аминокислот. Поскольку энантиоразделение при использовании циклодекстринов основано на образовании комплексов включения, структура дериватизирующего агента и аминокислоты существенно влияет на его успех. Энантиомерьт исследованных дансил-производных аминокислот при использовании пср-6-амино-(3-ЦД разделить не удалось. По-видимому, отталкивание заряженных амино групп, присутствующих в структуре энантиомеров и селектора, делает невозможным даже частичное включение дансил-производных в полость пер-6-амино-(5-ЦД. Энантиомеры исследованных КБЗ- и БОК-производных аминокислот могут быть полностью или частично разделены при использовании пер-6-амино-Р-ЦД. Особенно высока энантиоселективность разделения производных триптофана, КБЗ-аспарагиновой кислоты, КБЗ-аспарагина и КБЗ-

валила. Разрешение энантиомеров различных производных триптофана и фенилаланина сопоставимо между собой (табл. 8).

Влияние рН на энантиоразделение изучено в интервале рН 4.8-6.7, при концентрации пер-6-амино-р-ЦД 3 мМ. Времена миграции всех соединений минимальны при рН 5.8 и возрастают при уменьшении и увеличении рН, как и для ароматических кислот. Селективность разделения увеличивается при уменьшении рН (табл. 8).

Влияние концентрации пер-6-амино-р-ЦД на энантиоразделение КБЗ-аспарагина, фенилаланина, триптофана и тирозина изучено в интервале 2-10 мМ пер-6-амино-р-ЦД. Энантиоразрешепие производных всех аминокислот возрастает при увеличении концентрации хирального селектора. Энантиомеры КБЗ-триптофана разделяются при использовании пср-6-амино-р-ЦД с наиболее высоким значением равным 11.2. Особо следует отметить возможность одновременного энантиоразделения смеси КБЗ-аминокислот, оптимального при концентрации 4 мМ пер-6-амино-(}-1 Щ, электрофореграмма смеси показана на рис. 5.

Установлено, что введение в ФЭ (3 мМ пер-6-амино-Р-ЦЦ, рН 5.8) 5% метанола улучшает энантиоразделение профенов и КБЗ-производных аминокислот и ухудшает разделение энантиомеров гидроксикислот, БОК- и бензоил-производных аминокислот.

Сравнение результатов энантиораспознаваиия производных аминокислот в КЭ с данными, полученными ранее в ВЭЖХ, показывает, что ряд закономерностей сохраняется. Максимальное число разделений энантиомеров КБЗ-, БОК-, бензоил- и дансил-производных аминокислот в ВЭЖХ достигнуто для КБЗ- и БОК-производных, в КЭ эти производные аминокислот также разделяются лучше всего. Как в КЭ, так и в ВЭЖХ энантиоселективность разделения производных аминокислот выше при рН 4-5.

Однако есть и различия, которые могут быть связаны с изменением вклада различных взаимодействий (гидрофобных, электростатических) в разделение энантиомеров при закреплении селектора на силикагелевой матрице и при нахождении в ФЭ как псевдостационарной хиральной фазы. Во-первых, в ВЭЖХ получена достаточно высокая селективность для разделения энантиомеров дансил-лейцина и дансил-фенилаланина, в КЭ не удалось разделить ни одного даисильного производного. Во-вторых, при одинаковом порядке увеличения времен миграции и удерживания КБЗ-производных ароматических аминокислот, порядок выхода энантиомеров противоположный. Так, например, Ь-изомер КБЗ-тирозина с хроматографической колонки элюируется первым, а в КЭ он мигрирует после О-изомера. Интересно отметить, что если разрешение пиков энантиомеров различных

Таблица 8. Влияние рН фонового электролита на времена миграции и энантиоразделение карбоксибензил-, бензоил и Л'-тре/п-б утоксикарбонильных аминокислот при использовании гептакис(6-амино-б-дезокси)-Р-цшслодекстрина.

Соединение рН

4.8 5.8 6.7

КБЗ-аминокислота ^мигр? МИН а МИН а 1*1 игр, МИН а

Аспарагин 11.96/12.31 2.9 1.029 11.07/11.22 1.8 1.014 13.89/14.01 1.4 1.009

Лейцин 12.16/12.35 1.3 1.016 11.58/11.61 <0.3 1.003 14.14 - 1.000

Норлейцин 12.68/12.84 1.1 1.013 11.65/11.72 0.5 1.006 14.24/14.28 0.3 1.003

Фенилаланин 13.21/13.53 1.6 1.024 12.01/12.15 1.1 1.012 14.76/14.87 0.8 1.007

Триптофан 13.64/14.35 5.2 1.052 12.25/12.59 3.6 1.028 16.36/16.82 2.4 1.028

Тирозин*' 14.95/15.29 2.2 1.023 12.85/13.01 1.4 1.012 16.52/16.68 1.1 1.010

Аспарагиновая кислота 14.19/15.16 3.3 1.068 16.24/16.53 1.4 1.018

БОК-фенилаланин*' 13.88/14.17 1.5 1.021 12.59/12.78 1.2 1.015 15.34/15.48 0.7 1.009

Бензоил-фенилаланин 12.86/13.04 1.0 1.014 11.70/11.78 0.7 1.007 14.47 - 1.000

БОК-триптофан*-1 14.87/15.83 5.4 1.065 13.07/13.61 3.8 1.041 18.80/19.39 2.0 1.031

ФЭ: 3 мМ пер-6-амино-Р-ЦЦ, 50 мМ ацетатный буферный раствор, рН 4.8 или 50 мМ фосфатный буферный раствор, рН 5.8 и 6.7. Капилляр 60 см (52 см)х50 мкм. I/ -20 кВ. 120°С. X 200 нм. Ввод пробы 30 мбар, 3-5 с. а) - Э-энантиомер мигрирует первым.

I-1-1-1-1-1-1-1-1

10 12 14 16 18 20 22 24 hw

Рис. 5. Разделение энантиомеров КБЗ-аминокислот. ФЭ: 4 мМ пер-6-амино-Р-ЦД, 50 мМ фосфатный буферный раствор, pH 5.8. Остальные усл. см. табл. 8.

КБЗ-производных аминокислот в ВЭЖХ при элюировании подвижной фазой метанол/1% ацетат триэтиламина, рН 4.1 (20/80) изменяется от 0.84 до 1.15, в КЭ оно различается значительно более существенно (от <0.3 до 3.6). В КЭ удалось с высоким разрешением разделить энантиомеры КБЗ-аспарапша ((Rs 7.3, 10 мМ пер-6-амино-Р-ЦД, рН 5.8) и КБЗ-аспарагиновой кислоты (Rs 2.9, 3 мМ nep-6-амино-р-ЦД, рН 4.8), которые в ВЭЖХ разделить не удалось. Этот факт и отсутствие энантиоразделения дапсильных производных аминокислот связан с увеличением вклада электростатических взаимодействий в образование и стабилизацию комплексов включения с nep-6-амино-р-ЦЦ, которые и обеспечивают успех энантиораспознавания.

ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние низкомолекулярного хитозана на времена миграции и энантиоразделение ряда ароматических кислот. Показано, что обращение электроосмотического потока при модифицировании капилляра хитозаном позволяет сократить время разделения смеси миндальной, а-метоксифенилуксусной, 2-фенилпропановой, 3-фенилбутановой кислот и фенопрофена. Разделение энантиомеров кислот отсутствует, что, по-видимому, связано с недостаточным для хирального распознавания количеством точек связывания энантиомеров с хиральным селектором.

2. Показано, что введение дополнительного хирального центра в структуру хитозана увеличивает его энантиоселективность. Предложен новый хиральный селектор - N-(3-сульфо-3 -карбокси)пропионилхитозан для разделения энантиомеров ряда аминов и аминоспиртов.

3. Систематически исследовано влияние рН, состава фонового электролита, концентрации хирального селектора на селективность разделения энантиомеров модельных соединений при использовании в качестве хирального селектора N-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана. Определены условия энантиоразделения пиндолола, атенолола, надолола, флуоксетина, хлорциклизина, гидроксизина, орфенадрина, тербуталина и тетрагидрозолина.

4. Изучено влияние молекулярной массы #-(3-сульфо-3-карбокси)пропиопилхитозана и высокомолекулярного сульфата декстрана на энантиоселективность разделения модельных соединений. Установлено, что для данных анионных полисахаридных хиральных селекторов энантиоселективность разделения немонотонно изменяется

при увеличении молекулярной массы и зависит от природы разделяемых энантиомеров.

5. Изучено влияние инструментальных факторов, температуры термостатирования капилляра и приложенного напряжения, на энантиоразделение при использовании ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана. Установлено, что понижение температуры термостатирования и увеличение напряжения улучшает хиральные разделения.

6. Исследовано влияние рН и концентрации хирального селектора на разделение энантиомеров кислот и производных аминокислот при использовании нового хирального селектора в капиллярном электрофорезе - геюяакис(б-амино-б-дезокси)-Р-циклодекстрина. Установлено, что исследуемый хиральный селектор обладает высокой энантиораспознавательной способностью к профенам Из карбоксибензильных, №трет-бутоксикарбонильных и бензоильных производных аминокислот наибольшая энантиоселективность проявляется к карбоксибензильным производным аминокислот.

7. Обсуждены закономерности энантиораспознавания с исследованными селекторами. Показано, что взаимодействие хиральных селекторов с энантиомерами определяется образованием водородных связей, гидрофобными и электростатическими взаимодействиями. Для энантиораспознавания геитякис(6-амино-6-дезокси)-Р-циклодекстрином особую роль играет включение энантиомеров в полость хирального селектора.

8. Установлено, что введение метанола в фоновый электролит ухудшает разделение энантиомеров при использовании Я-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана, при использовании геитж«с(6-амино-6-дезокси)-Р-циклодекстрина наблюдается улучшение энантиоразделения профенов и карбоксибензильных производных амино кислот и ухудшение энантиоразделения гидроксикислот, И-трет-бутоксикарбонильных и бензоильных производных аминокислот.

9. Определен энаятиомерный состав лекарственных препаратов «Флуоксетин» и «Висксн».

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам Центра «Биоинженерия» РАН д.х.н., проф. В. П. Варламову и к.х.н. С. А. Лопатину за предоставленные хиральные селекторы, д.х.н., проф. В. А. Даванкову за консультации по теории хиральных разделений и фирме «Люмэкс» (г. Санкт-Петербург) за возможность использования оборудования этой фирмы.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Budanova N., Shapovalova Е., Lopatin S., Varlamov V., Shpigun О. Hcptakis(6-amino-6-deoxy)-P-cyclodextrin as a chiral selector for the separation of anionic analytes enantiomers by capillary electrophoresis. // Electrophoresis. 2004. V. 25. № 16. P. 2795-2800.

2. Budanova N., Shapovalova E., Lopatin S., Varlamov V., Shpigun 0. JV-(3-Sulfo, 3-cart»oxy)-propionylchitosan as new chiral selector for enantioresolution of basic drugs by capillary electrophoresis. // Chromatographia. 2004. V. 59. №. 11-12. P. 709-713.

3. Шпигун O.A., Ананьева И.А., Буданова Н.Ю., Шаповалова Е.Н. // Использование циклодекстринов для разделения энантиомеров. // Успехи химии. 2003. Т. 72. № 12. С. 1167-1189.

4. Буданова Н.Ю., Шаповалова Е.Н., Лопатин С.А., Варламов В.П., Шпигун О.А. Изучение удерживающей и разделяющей способности силикагелей, модифицированных новым хиральным селектором - низкомолекулярным хитозаном. // Вестаик МГУ. Сер. 2. Химия. 2000. V. 42. №2. С. 112-115.

5. Буданова Н.Ю., Шаповалова Е.Н., Лопатин С.А., Варламов В.П., Шпигун О.А. Сульфированный хитозан - новый хиральный селектор для разделения энантиомеров методом капиллярного электрофореза. / Материалы 7 Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Санкт-Петербург -Репино. 2003.15 - 18 сентября. С. 282-285.

6. Буданова Н.Ю., Шаповалова Е.Н., Лопатин С.А., Варламов В.П., Шпигун О.А. Некоторые аспекты применения низкомолекулярного хитозана в капиллярном электрофорезе. / Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы». Москва. 2004.15-19 марта. С. 239.

7. Budanova N.Yu., Shapovalova E.N., Lopatin S.A., Varlamov V.P., Shpigun O.A. Chitosan as a chiral selector in high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. /IIй International Symposium "Advances and applications of chromatography in industry". Bratislava. Slovak Republic. 2001. August 27-31.104.

8. Shpigun O.A., Spivakov B.Ya., Davankov V.A., Shapovalova E.N., Ananieva I.A., Budanova N.Yu., Armstrong D.W. Separation of some biologically active amines and acids by HPLC and CE. / International Congress on Analytical Sciences. Tokyo. Japan. 2001. August 6-10. P. 308.

9. Ананьева И.А., Буданова H. Ю., Шаповалова Е.Н., Лопатин С.А., Шпигун О.А., Варламов В.П., Даванков В.А. Оценка хроматографических свойств силикагеля, модифицированного хитозаном и его производными. / Материалы Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов». Москва. Апрель 2000. С. 378.

10. Shapovalova E.N., Anan'eva I.A., Chernobrovkin M.G., Budanova N.Yu., Shpigun O.A. Chitosan-coated silica as a support for the separation of amines and aminoacids. / 10-th Russian-Japan Joint Symposium on Analytical Chemistry. Moscow and St. Petersburg. 2000. August 20-28. P. 132.

11. Буданова Н.Ю. Изучение сорбции хитозана с различной молекулярной массой на силикагеле для получения хиральных сорбентов. / Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-99". Москва. 1999.20-23 апреля. С. 8.

Принято к исполнению 18/11/2005 Исполнено 21/11/2005

Заказ № 1325 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

«23598

РНБ Русский фонд

2006z4 23361

ВВЕДЕНИЕ 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Теория хирального капиллярного электрофореза

1.1. Принципы разделения энантиомеров методом капиллярного 9 электрофореза

1.1.1. Основные определения

1.1.2. Природа энантиоселективности в капиллярном электрофорезе

1.1.3. Факторы, влияющие на энантиоселективность

1.1.4. Некоторые особенности использования заряженных 19 хиральных селекторов

1.2. Хиральные селекторы

1.2.1. Циклодекстрины и их производные

1.2.1.1. Тип хирального селектора

1.2.1.2. Органические модификаторы фонового электролита

1.2.1.3. Неводный хиральный капиллярный электрофорез

1.2.1.4. Мицеллярная электрокинетическая хроматография

1.2.2. Полисахаридные хиральные селекторы

1.2.2.1. Нейтральные moho-, олиго- и полисахариды

1.2.2.2. Ионные полисахариды 43 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Исходные вещества, аппаратура, техника эксперимента

2.1. Исходные реактивы и растворы

2.2. Хиральные селекторы

2.3. Аппаратура

2.4. Техника эксперимента 56 Некоторые общие замечания по методологии исследования 57 энантиораспознавательной способности новых хиральных селекторов

Глава 3. Влияние хитозана на разделение энантиомеров кислот

3.1. Изучение энантиораспознавательной способности хитозана

3.1.1. Влияние рН фонового электролита на подвижность 60 энантиомеров

3.1.2. Влияние концентрации хитозана на разделение исследуемых 61 соединений и их энантиомеров

3.1.3. Некоторые возможности применения капилляра, 64 модифицированного хитозаном

Глава 4. Разделение энантиомеров при использовании анионных 70 полисахаридных хиральных селекторов

4.1. Исследование энантиораспознавательной способности нового 70 хирального селектора - ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана

4.1.1. Влияние рН и структуры соединений на 72 энантиораспознавательную способность ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана

4.1.2. Влияние состава ФЭ на энантиоразделение при 82 использовании ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана

4.1.3. Влияние концентрации ЛГ-(3-сульфо-3- 90 карбокси)пропионилхитозана на времена миграции и энантиоразделение веществ

4.1.4. Влияние метанола на энантиоразделение при использовании 91 ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана

4.1.5. Влияние температуры и напряжения на энантиоразделение 94 при использовании высокомолекулярного ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана

4.1.6. Влияние молекулярной массы ЛГ-(3-сульфо-3- 105 карбокси)пропионилхитозанов на энантиоразделение

4.1.7. Определение содержания и энантиомерного состава 109 флуоксетина и пиндолола в фармацевтических препаратах

4.2. Использование сульфатов хитозана и декстран сульфата в качестве 112 хиральных селекторов

Глава 5. Исследование энантиораспознавательной способности гептакие(6амино-6-дезокси)-{5-циклодекстрина для разделения энантиомеров кислот и производных аминокислот

5.1. Разделение энантиомеров кислот при использовании гептакис(6- 126 амино-6-дезокси)-|3-циклодекстрина

Актуальность темы. Важным направлением аналитической химии являются исследования в области разделения оптических изомеров биологически активных соединений. Определение оптически активных соединений имеет принципиальное значение для органической химии, медицины, фармакологии. Благодаря исключительно высокой разделяющей способности и экспрессности разделения капиллярный электрофорез (КЭ) - один из наиболее подходящих методов для решения этой сложной задачи.

Разделение хиральных соединений принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор, т.е. оптически активное соединение, распознающее пространственную конфигурацию энантиомеров. Вследствие сложности явления хирального распознавания «универсального» хирального селектора, который позволил бы решить все проблемы разделения энантиомеров, не существует, каждый селектор имеет свою область применения, свои преимущества и недостатки. К настоящему времени уровень понимания процессов энантиораспознавания не позволяет выбрать a priori наилучший хиральный селектор для индивидуального рацемата, и успех энантиоразделения в КЭ основывается на методе проб и ошибок. Для создания эффективного метода разделения энантиомеров необходимы систематические исследования, предполагающие изучение закономерностей энантиоразделения как функции структуры хирального селектора, что позволит представить механизм энантиораспознавания. В связи с этим работы, направленные на исследование новых хиральных селекторов методом КЭ, являются крайне актуальными, поскольку позволяют не только определять энантиомерный состав соединений, но и проводить тестирование хиральных свойств селекторов для последующей рекомендации селекторов для создания хиральных неподвижных фаз в ВЭЖХ.

Олиго- и полисахаридные хиральные селекторы являются наиболее эффективными и перспективными соединениями для энантиоразделения различных классов хиральных соединений. Каждое новое сочетание катионных, Автор выражает искреннюю благодарность проф., д.х.н. O.A. Шпигуну за постоянное внимание, поддержку, помощь в работе и обсуждении результатов. анионных или нейтральных групп, гидроксигрупп, их количества и расположения в молекуле хирального селектора определяет характерную вторичную структуру нециклических олиго- и полисахаридных селекторов, или приводит к различной гидрофобности и асимметрии полости циклических олигосахаридных хиральных селекторов, что и является источником уникальной энантиораспознавательной способности каждого хирального селектора. В качестве новых селекторов в работе использованы: хитозан, Аг-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозан и гептакис(6-амино-6-дезокси)-Р-циклодекстрин.

Цель работы состояла в изучении энантиораспознавательной способности хиральных селекторов на основе олиго- и полисахаридов к различным классам соединений и выборе условий разделения энантиомеров. Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач: оценка возможности использования хитозана и сульфатов хитозана в качестве хиральных селекторов в КЭ; исследование энантиоразделения аминов и аминоспиртов при использовании хирального селектора нового типа - хирально модифицированного полисахаридного селектора ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана; изучение особенностей энантиоразделения аминов при использовании высокомолекулярного сульфата декстрана; исследование закономерностей хирального разделения ряда органических кислот и производных аминокислот при использовании нового хирального селектора - гелтакмс(6-амино-6-дезокси)-|3-циклодекстрина; сравнение энантиораспознавания производных аминокислот гептакис(6-амино-6-дезокси)-р-циклодекстрином в КЭ и ВЭЖХ.

Научная новизна. Исследовано влияние структуры полисахаридов (хитозана, сульфатов хитозана, ЛГ-(З-сульфо-З-карбокси)пропионилхитозана) на их энантиоселективность. Предложен новый хиральный селектор - ]У-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозан. Систематическое исследование влияния рН, состава фонового электролита, концентрации селектора позволило выявить основные закономерности и выбрать условия разделения энантиомеров ряда биологически активных аминов при использовании ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана.

Изучено влияние инструментальных факторов (напряжения, температуры термостатирования) на энантиоселективность при использовании ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана. Проведена оценка температуры внутри капилляра. Впервые в КЭ использован геитякис(6-амино-6-дезокси)-р-циклодекстрин и выявлены основные факторы, определяющие разделение энантиомеров кислот и производных аминокислот. Сопоставлена энантиораспознавательная способность геитякнс(6-амино-6-дезокси)-|3-циклодекстрина и аминированных производных (3-циклодекстрина.

Практическая значимость работы. Выбраны условия разделения энантиомеров флуоксетина и пиндолола, являющихся активными компонентами лекарственных препаратов, и определен энантиомерный состав препаратов при использовании ]У-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана. Выбраны условия разделения энантиомеров профенов (кетопрофена, фенопрофена, ибупрофена) при использовании геитя/шс(6-амино-6-дезокси)-(3-циклодекстрина. Впервые проведено одновременное разделение энантиомеров семи карбоксибензильных производных аминокислот. Показано, что метод КЭ позволяет быстро и экономично оценить энантиораспознавательную способность новых хиральных селекторов и рекомендовать их для создания хиральных неподвижных фаз в ВЭЖХ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Данные по изучению влияния хитозана на электрофоретическое поведение и энантиоразделение ряда ароматических кислот.

2. Результаты исследования и особенности разделения энантиомеров аминов и аминоспиртов при использовании ^-(З-сульфо-З-карбокси)пропионилхитозана и сульфата декстрана.

3. Данные по влиянию температуры и приложенного напряжения на разделение энантиомеров при использовании ]У-(3-сульфо, 3-карбокси)пропионилхитозана и сравнение возможностей систем для КЭ «ВюКас! НРЕ100» и «Капель-105».

4. Данные по энантиоразделению ряда органических кислот и производных аминокислот при использовании в качестве хирального селектора гептакис{в-амино-6-дезокси)-р-циклодекстрина.

5. Условия и результаты определения энантиомерного состава некоторых лекарственных препаратов.

Апробация работы. Основное содержание работы изложено в 11 публикациях. Результаты исследований доложены на Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург - Репино, 2003), Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004), 11th International Symposium "Advances and applications of chromatography in industry" (Bratislava, Slovak Republic, 2001), International Congress on Analytical Sciences (Tokyo, Japan, 2001), Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 2000), 10-th Russian-Japan Joint Symposium on Analytical Chemistry (Moscow and St. Petersburg, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 статей и 6 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 161 странице машинописного текста, содержит 44 рисунка и 27 таблиц, 24 формулы, в списке цитируемой литературы 121 наименование.

выводы

1. Изучено влияние низкомолекулярного хитозана на времена миграции и энантиоразделение ряда ароматических кислот. Показано, что обращение электроосмотического потока при модифицировании капилляра хитозаном позволяет сократить время разделения смеси миндальной, а-метоксифенилуксусной, 2-фенилпропановой, 3-фенилбутановой кислот и фенопрофена. Разделение энантиомеров кислот отсутствует, что, по-видимому, связано с недостаточным для хирального распознавания количеством точек связывания энантиомеров с хиральным селектором.

2. Показано, что введение дополнительного хирального центра в структуру хитозана увеличивает его энантиоселективность. Предложен новый хиральный селектор - Л^-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозан для разделения энантиомеров ряда аминов и аминоспиртов.

3. Систематически исследовано влияние рН, состава фонового электролита, концентрации хирального селектора на селективность разделения энантиомеров модельных соединений при использовании в качестве хирального селектора АГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана. Определены условия энантиоразделения пиндолола, атенолола, надолола, флуоксетина, хлорциклизина, гидроксизина, орфенадрина, тербуталина и тетрагидрозолина.

4. Изучено влияние молекулярной массы Л^-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана и высокомолекулярного сульфата декстрана на энантиоселективность разделения модельных соединений. Установлено, что для данных анионных полисахаридных хиральных селекторов энантиоселективность разделения немонотонно изменяется при увеличении молекулярной массы и зависит от природы разделяемых энантиомеров.

5. Изучено влияние инструментальных факторов, температуры термостатирования капилляра и приложенного напряжения, на энантиоразделение при использовании Л^-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана. Установлено, что понижение температуры термостатирования и увеличение напряжения улучшает хиральные разделения.

6. Исследовано влияние рН и концентрации хиралыюго селектора на разделение энантиомеров кислот и производных аминокислот при использовании нового хирального селектора в капиллярном электрофорезе -геятд/«/с(6-амино-6-дезокси)-|3-циклодекстрина. Установлено, что исследуемый хиральный селектор обладает высокой энантиораспознавательной способностью к профенам. Из карбоксибензильных, ./У-трет-бутоксикарбонильных и бензоильных производных аминокислот наибольшая энантиоселективность проявляется к карбоксибензильным производным аминокислот.

7. Обсуждены закономерности энантиораспознавания с исследованными селекторами. Показано, что взаимодействие хиральных селекторов с энантиомерами определяется образованием водородных связей, гидрофобными и электростатическими взаимодействиями. Для энантиораспознавания гея/ядкмс(6-амино-6-дезокси)-|3-циклодекстрином особую роль играет включение энантиомеров в полость хирального селектора.

8. Установлено, что введение метанола в фоновый электролит ухудшает разделение энантиомеров при использовании ^-(З-сульфо-З-карбокси)пропионилхитозана, при использовании гептакис(6-штю-6-дезокси)-|3-циклодекстрина наблюдается улучшение энантиоразделения профенов и карбоксибензильных производных аминокислот и ухудшение энантиоразделения гидроксикислот, ЛГ-т/гет-бутоксикарбонильных и бензоильных производных аминокислот.

9. Определен энантиомерный состав лекарственных препаратов «Флуоксетин» и «Вискен».

1. Chankvetadze B. Separation selectivity in chiral capillary electrophoresis with charged selectors. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 792. P. 269-295.

2. Wren S.A.C., Rowe R.C. Theoretical aspects of chiral separation in capillary electrophoresis. I. Initial evaluation of a model. // J. Chromatogr. 1992. V. 603. P. 235241.

3. Vespalec R., Bocek P. Calculation of stability constants for the chiral selector-enantiomer interactions from electrophoretic mobilities. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 431-445.

4. Bellini M.S., Deyl Z., Manetto G., Kohlickova M. Determination of apparent binding constants of drugs by capillary electrophoresis using p-cyclodextrin as ligand and three different linear plotting methods. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 924. P. 483-491.

5. Rizzi A.M., Kremser L. pKa shift-associated effects in enantioseparations by cyclodextrin-mediated capillary zone electrophoresis. // Electrophoresis. 1999. V. 20. P. 2715-2722.

6. Lelievre F., Gareil P., Jardy A. Selectivity in capillary electrophoresis: application to chiral separations with cyclodextrins. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 385-392.

7. Nardi A., Eliseev A.V., Bocek P., Fanali S. Use of charged and neutral cyclodextrins in capillary zone electrophoresis: enantiomeric resolution of some 2-hydroxy acids. // J. Chromatogr. 1993. V. 638. P. 247-253.

8. Williams B.A., Vigh G. Dry look at the CHARM (charged resolving agent migration) model of enantiomer separations by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 777. P. 295-309.

9. Lelievre F., Gareil P., Bahaddi Y., Galons H. Intrinsic selectivity in capillary electrophoresis for chiral separations with dual cyclodextrin systems. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 393-401.

10. Chankvetadze B., Schulte G., Blaschke G. Reversal of enantiomer elution order in capillary electrophoresis using charged and neutral cyclodextrins. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 732. P. 183-187.

11. Schulte G., Chankvetadze B., Blaschke G. Enantioseparation in capillary electrophoresis using 2-hydroxypropyltrimethylammonium salt of P-cyclodextrin as a chiral selector.//J. Chromatogr. A. 1997. V. 771. P. 259-266.

12. Fanali S. Separation of optical isomers by capillary zone electrophoresis based on host-guest complexation with cyclodextrins. // J. Chromatogr. 1989. V. 474. P. 441-446.

13. Fanali S. Enantioselective determination by capillary electrophoresis with cyclodextrins as chiral selectors. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 89-122.

14. Blanco M., Valverde I. Choice of chiral selector for enantioseparation by capillary electrophoresis. //Trends in Anal. Chem. 2003. V. 22. P. 428-439.

15. Koppenhoefer B., Zhu X., Jakob A., Wuerthner S., Lin B. Separation of drug enantiomers by capillary electrophoresis in the presence of neutral cyclodextrins. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 135-161.

16. Giibitz G., Schmid M.G. Chiral separation principles in capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 792. P. 179-225.

17. Kodama S., Yamamoto A., Matsunaga A., Soga T., Minoura K. Direct chiral resolution of lactic acid in food products by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 371-377.

18. Chankvetadze B., Endresz G., Blaschke G. About some aspects of the use of charged cyclodextrins for capillary electrophoresis enantioseparation. // Electrophoresis. 1994. V. 15. P. 804-807.

19. Fillet M., Hubert Ph., Crommen J. Enantioseparation of nonsteroidal antiinflammatory drugs by capillary electrophoresis using mixtures of anionic and uncharged p-cyclodextrins as chiral additives. // Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 1013-1018.

20. Fanali S., Camera E. Use of methylamino-|3-cyclodextrin in capillary electrophoresis. Resolution of acidic and basic enantiomers. // Chromatographia. 1996. V. 43. P. 247-253.

21. Galaverna G., Paganuzzi M.C., Corradini R., Dossena A., Marchelli R. Enantiomeric separation of hydroxy acids and carboxylic acids by diamino-(3-cyclodextrins (AB, AC, AD) in capillary electrophoresis. //Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 3171-3177.

22. O'Keeffe F., Shamsi S.A., Darcy R., Schwinte P., Warner I.M. A persubstituted cationic p-cyclodextrin for chiral separations. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 4773-4782.

23. Haynes J.L., Shamsi S.A., O'Keefe F., Darcey R., Warner I.M. Cationic |3-cyclodextrin derivative for chiral separations. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 803. P. 261271.

24. Cucinotta V., Giuffrida A., Grasso G., Maccarrone G., Vecchio G. Hemispherodextrins, a new class of cyclodextrin derivatives, in capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. A. 2001. V. 916. P. 61-64.

25. Egashira N., Mutoh O., Kurauchi Y., Ohga K. Chiral separation of a-amino acid derivatives by capillary electrophoresis using 6-amino-6-deoxy-|3-cyclodextrin and its N-hexyl derivative as chiral selectors. // Anal. Sci. 1996. V. 12. P. 503-505.

26. Galaverna G., Corradini R., Dossena A., Marchelli R., Vecchio G. Histamine-modified |3-cyclodextrins for the enantiomeric separation of dansyl-amino acids in capillary electrophoresis. // Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 905-911.

27. Cucinotta V., Giuffrida A., Grasso G., Maccarrone G., Vecchio G. Ligand exchange chiral separations by cyclodextrin derivatives in capillary electrophoresis. // Analyst. 2003. V. 128. P. 134-136.

28. Rawjee Y.Y., Vigh G. A peak resolution model for the capillary electrophoretic separation of the enantiomers of weak acids with hydroxypropyl-P-cyclodextrine-containing background electrolytes. // Anal. Chem. 1994. V. 66. P. 619-627.

29. Belder D., Schomburg G. Chiral separations of basic and acidic compounds in modified capillaries using cyclodextrin-modified capillary zone electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1994. V. 666. P. 351-365.

30. Dong Y.Y., Sun Y. L., Sun Z. P. Influence of the buffer organic cation on the chiral separation of some basic drugs by capillary zone electrophoresis. // J. High Resolut. Chromatogr. 1998. V. 21. P. 445-449.

31. Quang C.Y., Khaledi M.G. Extending the scope of chiral separation of basic compounds by cyclodextrin-mediated capillary zone electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 692. P. 253-265.

32. Jira T., Bunke A., Karbaum A. Use of chiral and achiral ion-pairing reagents in combination with cyclodextrins in capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 281-288.

33. Huang W.X., Fazio S.D., Vivilecchia R.V. Achievement of enantioselectivity of nonpolar primary amines by a non-chiral crown ether. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 781. P. 129-137.

34. Valko I. E., Siren H., Riekkola M.-L. Chiral separation of dansyl-amino acids in a nonaqueous medium by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 737. P. 263-272.

35. Wang F., Khaledi M. G. Chiral separations by nonaqueous capillary electrophoresis. //Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 3460-3467.

36. Wang F., Khaledi M.G. Enantiomeric separations by nonaqueous capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 277-293.

37. Nishi H., Fukuyama T., Terabe S. Chiral separation by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. 1991. V. 553. P. 503-516.

38. Wan H., Andersson P.E., Engstrom A., Blomberg L.G. Direct and indirect chiral separation of amino acids by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. 1995. V. 704. P. 179-193.

39. Schmitt Ph., Garrison A.W., Freitag D., Kettrup A. Application of cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography to the separations of selected neutral pesticides and their enantiomers. //J. Chromatogr. 1997. V. 792. P. 419-429.

40. Flurer C.L., Lin L.A., Satzger R.D., Wolnik K.A. Determination of ephedrine compounds in nutritional supplements by cyclodextrin-modified CE. // J. Chromatogr. B: biomedical sciences and applications. 1995. V. 669. P. 133-139.

41. Lantz A.W., Rozhkov R.V., Larock R.C., Armstrong D.W. Enantiomeric separation of neutral hydrophobic dihydrofuroflavones by cyclodextrin-modified micellar capillary electrophoresis. // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 2727-2734.

42. Aumateil A., Wells R.J. Enantiomeric differentiation of a wide range of pharmacologically active substances by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic capillary chromatography using a bile salt. // J. Chromatogr. 1994. V. 688. P. 329-337.

43. Dzygiel P., Wieczorek P., Jonsson J.A. Enantiomeric separation of amino acids by capillary electrophoresis with a-cyclodextrin. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 793. P. 414418.

44. Yang L.-l., Zhang D.-q., Yuan Z.-b. Enantioseparation of o-phthaldiadehyde derivatized amino acids using ß-CD-modified micellar electrokinetic chromatography in the mixed aqueous-organic media. // Anal. Chim. Acta. 2001. V. 433. P. 23-30.

45. Simó C., Gallardo A., San Román J., Barbas C., Cifuentes A. Fast and sensitive capillary electrophoresis method to quantitatively monitor ibuprofen enantiomers released from polymeric drug delivery systems. // J. Chromatogr. B. 2002. V. 767. P. 3543.

46. Huang W.X., Xu H., Fazio S.D., Vivilecchia R.V. Enhancement of chiral recognition by formation of a sandwiched complex in capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 361-369.

47. Wan H., Blomberg L.G. Enantiomeric separation of small chiral peptides by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 792. P. 393-400.

48. Armstrong D.W., Chang L.W., Chang S.S.C. Mechanism of capillary electrophoresis enantioseparations using a combination of an achiral crown ether plus cyclodextrins. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 793. P. 115-134.

49. Wedig M., Thunhorst M., Laug S., Decker M., Lehmann J., Holzgrabe U. Enantioseparation of linear and cyclic chiral bis(phenethyl)amines by means of cyclodextrin-modified capillary electrophoresis. // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. V. 371. P. 212-217.

50. Chankvetadze B., Schulte G., Bergenthal D., Blaschke G. Comparative capillary electrophoresis and NMR studies of enantioseparation of dimethindene with cyclodextrins. //J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 315-323.

51. Christians T., Holzgrabe U. New single-isomer chiral selector for capillary electrophoresis: the highly water-soluble heptakis(2-AyV-dimethylcarbamoyl)-ß-cyclodextrin. //J. Chromatogr. A. 2001. V. 911. P. 249-257.

52. Wind M., Hoffmann P., Wagner H., Thormann W. Chiral capillary electrophoresis as predictor for separation of drug enantiomers in continuous flow zone electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 895. P. 51-65.

53. Jin L.J., Li S.F.Y. Comparison of chiral recognition capabilities of cyclodextrins for the separation of basic drugs in capillary zone electrophoresis. // J. Chromatogr. B: biomedical sciences and applications. 1998. V. 708. P. 257-266.

54. Blanco M., Coello J., Iturriaga H., Maspoch S., Perez-maseda C. Separation of profen enantiomers by capillary electrophoresis using cyclodextrins as chiral selectors. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 793. P. 165-175.

55. Li G., Lin X., Zhu C., Hao A., Guan Y. New derivative of p-cyclodextrin as chiral selectors for the capillary electrophoretic separation of chiral drugs. // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 421. P. 27-34.

56. Zerbinati O., Trotta F., Giovannoli C. Optimization of the cyclodextrin-assisted capillary electrophoresis separation of the enantiomers of phenoxyacid herbicides. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 423-430.

57. Karbaum A., Jira T. Chiral separations of 1,3,4-thia- and 1,3,4-selenadiazine derivatives by use of non-aqueous capillary electrophoresis. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 48. P. 155-162.

58. Yanes E.G., Gratz S.R., Sutton R.M. C., Stalcup A.M. A comparison of phosphated and sulfated P-cyclodextrins as chiral selectors for capillary electrophoresis. // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. V. 369. P. 412-417.

59. Zhu W., Vigh G. Enantiomer separations by nonaqueous capillary electrophoresis using octakis(2,3-diacetyl-6-sulfato)-y-cyclodextrin. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 892. P. 499-507.

60. Soini H., Stefansson M., Riekkola M.-L., Novotny M.V. Maltooligosaccharides as chiral selectors for the separation of pharmaceuticals by capillary electrophoresis. // Anal. Chem. 1994. V. 66. P. 3477-3484.

61. D'Hulst A., Verbeke N. Chiral separation by capillary electrophoresis with oligosaccharides. // J. Chromatogr. 1992. V. 608. P. 275-287.

62. D'Hulst A., Verbeke N. Chiral analysis of basic drugs by oligosaccharide-mediated capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. A. 1996. V. 735. P. 283-293.

63. Stefansson M., Novotny M.V. Electrophoretic resolution of monosaccharide enantiomers in borate-oligosaccharide complexation media. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 11573-11580.

64. Kano K., Minami K., Horiguchi K., Ishimura T., Kodera M. Ability of non-cyclic oligosaccharides to form molecular complexes and its use for chiral separation by capillary zone electrophoresis. //J. Chromatogr. 1995. V. 694. P. 307-313.

65. Nishi H., Kuwahara Y. Enantiomer separation by capillary electrophoresis utilizing noncyclic mono-, oligo- and polysaccharides as chiral selectors. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 48. P. 89-102.

66. Chankvetadze B., Saito M., Yashima E., Okamoto Y. Enantioseparation using selected polysaccharides as chiral buffer additives in capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 773. P. 331-338.

67. Nishi H. Separation of binaphthyl enantiomers by capillary zone electrophoresis and electrokinetic chromatography. // J. High Resolut. Chromatogr. 1995. V. 18. P. 659-664.

68. Nakamura H., Sano A., Sumii H. Chiral separation of (i?,S)-l,l'-Binaphthyl-2,2'-diyl hydrogenphosphate by capillary electrophoresis using monosaccharides as chiral selectors. // Anal. Sci. 1998. V. 14. P. 375-378.

69. Nishi H. Enantiomer separation of basic drugs by capillary electrophoresis using ionic and neutral polysaccharides as chiral selectors. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 735. P. 345-351.

70. Stalcup A.M., Agyei N.M. Heparin: a chiral mobile-phase additive for capillary zone electrophoresis. // Anal. Chem. 1994. V. 66. P. 3054-3059.

71. Agyei N.M., Gahm K.H., Stalcup A.M. Chiral separations using heparin and dextran sulfate in capillary zone electrophoresis. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 307. P. 185-191.

72. Nishi H., Nakamura K., Nakai H., Sato T. Enantiomeric separation of drugs by mucopolysaccharide-mediated electrokinetic chromatography. // Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 2334-2341.

73. Gotti R., Cavrini V., Andrisano V., Mascellani G. Dermatan sulfate as useful chiral selector in capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. A. 1998. V. 814. P. 205-211.

74. Gotti R., Cavrini V., Andrisano V., Mascellani G. Semisynthetic chondroitins as chiral buffer additives in capillary electrophoresis. // J Chromatogr. A. 1999. V. 845. P. 247-256.

75. Du Y., Taga A., Suzuki S., Liu W., Honda S. Effect of structure modification of chondroitin sulfate С on its enantioselectivity to basic drugs in capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. A. 2002. V. 947. P. 287-299.

76. Phinney K.W., Jinadu L.A., Sander L.C. Chiral selectors from fruit: application of citrus pectins to enantiomer separations in capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 857. P. 285-293.

77. Du Y., Taga A., Suzuki S., Liu W., Honda S. Colominic acid: a novel chiral selector for capillary electrophoresis of basic drugs. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 962. P. 221231.

78. Phinney K.W., Sander L.C. Enantioselective separations in capillary electrophoresis with dextrane sulfate as the chiral selector. // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 375. P. 763768.

79. Wang X., Lee J.-T., Armstrong D.W. Separation of enantiomers by capillary electrophoresis using pentosan polysulfate. // Electrophoresis. 1999. V. 20. P. 162-170.

80. Nishi H., ,Nakamura K., Nakai H., Sato T. Enantiomer separation by capillary electrophoresis using DEAE-dextran and aminoglycosidic antibiotics. // Chromatographia. 1996. V. 43. P. 426-430.

81. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия. 1979. 480с.

82. Рогожин С. В., Гамзазаде А. И., Скляр А. М., Леонова Е. Ю., Насибов С. М. Полимеры на основе хитозана и их сульфопроизводные. // Производство и применение хитина и хитозана из криля и других ракообразных. Владивосток: Дальрыбфтуз. 1985. С. 58-68.

83. Ashton P.R., Koniger R., Stoddart J.F., Alker D., Harding V.D. Amino acid derivatives of p-cyclodextrin. // J. Org. Chem. 1996. V. 61. P. 903-908.

84. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука. 2002. 368 с.

85. Горбачева И.Н., Скорикова Е.Е., Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С., Бабиевский К.К. Строение и свойства сульфата хитозана. // Высокомолекулярные соединения. 1991. Т. 33. С. 1899-1903.

86. Horvath J., Dolnik V. Polymer wall coatings for capillary electrophoresis. // Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 644-655.

87. Kezic S., Jakasa I., Wenker M. Determination of mandelic acid enantiomers in urine by gas chromatography and electron-capture or flame ionisation detection. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 738. P. 39-46.

88. Varadharaj G., Hazell K., Reeve C.D. An efficient preparative scale resolution of 3-phenylbutyric acid by lipase from Burkholderia cepacia (Chirazyme LI). // Tetrahedron: Asymmetry. 1998. V. 9. P. 1191-1195.

89. Patel B.K., Hanna-Brown M., Hadley M.R., Hutt A.J. Enantiomeric resolution of 2-arylpropionic acid nonsteroidal anti-inflammatory drugs by capillary electrophoresis: methods and applications. // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 2625-2656.

90. Wolbach J.P., Lloyd D.K., Wainer I.W. Approaches to quantitative structure-enantioselectivity relationship modeling of chiral separations using capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. A. 2001. V. 914. P.299-314.

91. Handbook of capillary electrophoresis applications. / Eds. H. Shintani, J. Polonsky. London, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras: Blackie academic & professional. 1997. 737 P.

92. Maichel В., Kenndler E. Recent innovation in capillary electrokinetic chromatography with replaceable charged pseudostationary phases or additives. // Electrophoresis. 2000. V. 21. P. 3160-3173.

93. Ohga K., Oyama H., Muta Y. Chromatographic optical resolution on phenylcarbamates of ЛГ-arylidenechitosans. //Anal. Sci. 1991. V. 7. P. 653-656.

94. Kuraushi Y., Yoshida A., Kuroda K., Inoue T., Ohga K. Chiral HPLC of amino acids using chemically modified chitosan as the stationary phase. // Chem. J. Chinese Universities. 1999. V. 5. P. 239.

95. Zhang H., Li Q., Hu Z., Wang R., Chen X. Recalculation of the temperature inside capillaries using high buffer concentrations. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 907. P. 353356.

96. Cross R. F. Joule heating calculations in capillary zone electrophoresis. Reply to "Recalculation of the temperature inside capillaries using high buffer concentrations" by Zhang et al. // J. Chromatogr A. 2001. V. 907. P. 357-360.

97. Lane R. M., Baker G. B. Chirality and Drugs Used in Psychiatry: Nice to Know or Need to Know? // Cellular and Molecular Neurobiology. 1999. V. 19. P. 355-372.

98. Kitae T., Nakayama T., Kano K. Chiral recognition of a-amino acids by charged cyclodextrins through cooperative effects of Coulomb interaction and inclusion. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1998. V. 2. P. 207-212.

99. Ivanyi R., Jicsinszky L., Juvancz Z. Permethyl monoamino p-cyclodextrin a new chiral selective agent for capillary electrophoresis. // Chromatographia. 2001. V. 53. P. 166-172.

100. Kitae T., Takashima H., Kano K. Chiral Recognition of Phenylacetic Acid Derivatives by Aminated Cyclodextrins. // J. Incl. Phenom. Macrocyclic Chem. 1999. V. 33. P. 345-359.

101. Tanaka Y., Terabe S. Enantiomer separation of acidic racemates by capillary electrophoresis using cationic and amphoteric P-cyclodextrins as chiral selectors. // J. Chromatogr. 1997. V. 781. P. 151-160.

102. Abushoffa A. M., Fillet M., Hubert P., Crommen J. Prediction of selectivity for enantiomeric separations of uncharged compounds by capillary electrophoresis involving dual cyclodextrin systems. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 948. P. 321-329.

103. Fanali S., Aturki Z. Use of cyclodextrins in capillary electrophoresis for the chiral resolution of some 2-arylpropionic acid non-steroidal anti-inflammatory drugs. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 694. P. 297-305.

104. Bunke A., Jira T. Use of cationic cyclodextrin for enantioseparation by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 275-280.

105. Wan H., Blomberg L. G. Chiral separation of amino acids and peptides by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 43-88.

106. Yowell, G.G., Fazio, S.D., Vivilecchia R.V. Enantiomeric separation of N-tert.-butoxycarbonyl amino acids by capillary electrophoresis using hydroxypropyl-substituted cyclodextrins. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 745. P. 73-79.