Макроциклические модификаторы для повышения селективности электрофоретического разделения энантиомеров органических кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Прохорова Александра Федоровна

МАКРОЦИКЛИЧЕСКИЕ МОДИФИКАТОРЫ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОСТИ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ ЭНАНТИОМЕРОВ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2010

4843429

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Шаповалова Елена Николаевна

Официальные доктор химических наук, профессор оппоненты: Даванков Вадим Александрович

Учреждение Российской академии наук Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

кандидат химических наук Назимов Игорь Владимирович

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Ведущая

Санкт-Петербургский государственный университет

организация:

Защита состоится 22 декабря 2010 г. в 15 ч 00 мин в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 19 ноября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

Торочешникова И. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ'

Актуальность темы. Метод хирального капиллярного электрофореза (КЭ) относится к современным методам разделения энантиомеров, отличается высокой разрешающей способностью. Он является альтернативой хроматографическим методам, его преимущества — малый расход реагентов, в том числе хирального селектора, короткое время анализа, высокая эффективность. КЭ позволяет проводить быструю оценку (скрининг) энантиоселективных свойств хиральных селекторов (ХС).

В большинстве случаев сложная матрица реальных объектов (биологического, природного и промышленного происхождения) требует весьма высокой селективности разделения аналитов из-за значительного количества сопутствующих компонентов. Повышение селективности возможно за счет создания оптимальных условий взаимодействия между компонентами фонового электролита и разделяемыми соединениями, например, в результате изменения заряда аналитов при выборе подходящего буферного раствора. Однако, в некоторых случаях невозможно достичь высокоселективного разделения, изменяя такие параметры как рН, ионная сила фонового электролита и напряжение. В этом случае селективного разделения сложных смесей можно достичь, только используя т.н. модификаторы фонового электролита, среди которых разнообразные по строению спирты, полимеры, ион-парные и мицеллообразующие реагенты, макроциклические соединения ( краун-эфиры, циклодекстрины, антибиотики и др.). В присутствии модификаторов изменяются типы взаимодействий между аналитами и компонентами фонового электролита, что позволяет достигать нужной селективности разделения. Очень часто использование макроциклических модификаторов с большим числом ионизируемых и/или гидрофобных групп оказывается более эффективным по сравнению с низкомолекулярными добавками. Поэтому макроциклические соединения являются перспективными для управления селективностью разделения, и поиск среди них новых модификаторов фонового электролита является важной задачей аналитической химии.

В некоторых случаях введение модификатора позволяет просто улучшить разделение и повысить его селективность, тогда как в других случаях только его присутствие обеспечивает успешное решение задачи. В частности, только использование модификаторов, т.н. хиральных селекторов, позволяет разделить оптические изомеры.

Большинство лекарственных препаратов являются оптически активными соединениями, и многие из них выпускаются в виде рацемической смеси, хотя известно, что лишь один из энантиомеров обладает необходимой активностью (эутомер), в то время как второй (дистомер) или не обладает активностью или может оказывать негативное воздействие. В последнее время наблюдается тенденция к увеличению доли препаратов, действующим началом которых является активный энантиомер. Развитие методов разделения и определения чрезвычайно важно для контроля состава и энантиомерной чистоты синтезируемых и внедряемых в медицинскую практику лекарственных средств, а также для фармакологических и фармакокине-тических исследований.

Автор выражает благодарность чл.-корр. РАН O.A. Шпигуну за помощь и внимание к работе, д.х.н. С М. Староверову и к.х.н. М.А. Кузнецову за предоставленные хиральные селекторы, НПО Люмэкс за предоставленное оборудование.

В настоящее время механизм энантиораспознавания изучен недостаточно, еще не разработаны математические методы достоверного прогнозирования энантио-распознавательной способности хирального селектора, поэтому задача аналитико-экспериментального поиска новых высокоселективных по отношению к структурно различным соединениям хиральных селекторов является актуальной.

Цель работы заключалась в выявлении возможности использования макроцик-лического гликопептидного антибиотика эремомицина в КЭ и выборе условий электрофоретического разделения энантиомеров биологически активных соединений кислотного характера; повышении селективности разделения многокомпонентных смесей (на примере ароматических кислот и фенолов) в присутствии ахи-ральной добавки - лигнинов. Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:

• изучения электрофоретических свойств макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и лигнинов в качестве модификаторов фонового электролита;

• изучения влияния содержания эремомицина в фоновом электролите на разделение тестовых соединений (Ы-производпыс и свободные аминокислоты, профе-пы, а-гидроксикислоты и др.) в различных режимах КЭ;

• исследования свойств капилляров, модифицированных динамически (хито-заном или эремомицином) или ковалентно (3-аминопропилтриметоксисиланом, 3-глицидилоксипропилтриэтоксисиланом и эремомицином) и особенностей энантио-разделения тестовых соединений в этих капиллярах с использованием эремомицина в качестве хирального селектора;

• сравнения характеристик хирального разделения профенов в КЭ и ВЭЖХ в присутствии эремомицина;

• изучения влияния лигнинов на селективность разделения ароматических кислот.

Научная новизна. Показана эффективность макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина в качестве хирального селектора в КЭ. Установлен характер влияния эремомицина на величину и направление электроосмотического потока. Получены количественные характеристики адсорбции эремомицина на поверхности кварцевого капилляра, что позволило разработать способ динамического модифицирования капилляра эремомицином. Выбраны условия модифицирования капилляров хитозаном и 3- аминопропилтриметоксисиланом. Показана эффективность эремомицина для энантиоселективного разделения энантиомеров различных классов соединений и выбраны условия (состав и рН фонового электролита, концентрация ХС, напряжение, условия модифицирования поверхности капилляра) их определения. Выполнена иммобилизация эремомицина на поверхности капилляра через 3- глицидилоксипропилтриэтоксисилан. Показаны перспективы использования предложенных модифицированных капилляров для быстрого и чувствительного определения энантиомеров профенов и варфарина в лекарственных препаратах.

Впервые установлена эффективность добавки диоксанлигнина ели и лигно-сульфоната для улучшения электрофоретического разделения смесей органических соединений кислотного характера. Установлено влияние типа лигнина и состава ФЭ на селективность разделения фенолов, и выбраны условия разделения их смесей.

Практическая значимость. Предложены новые способы динамического и ко-валентного модифицирования капилляров, позволяющие уменьшить адсорбцию эремомицина на поверхности капилляра. Разработаны методики электрофоретиче-ского разделения и определения энантиомеров ибупрофена, флурбипрофена, кето-профена и варфарина с использованием кварцевого и модифицированных капилляров. Предложенные методики использованы для определения ибупрофена, флурбипрофена, кетопрофена и варфарина в фармацевтических композициях (таблетках, гелях). Предложен экспрессный способ электрофоретического определения фенолов в загрязненных водах и фармацевтических композициях с использованием диоксанлигнина ели в качестве модификатора фонового электролита.

Автор выносит на защиту:

1. Результаты исследования влияния эремомицина на электроосмотический поток, а также на электрофоретическое поведение и энантиоразделение ряда ароматических кислот в варианте капиллярного электрофореза под давлением.

2. Результаты исследования адсорбции эремомицина на кварцевом и модифицированных гидрофильными соединениями капиллярах.

3. Данные по разделению энантиомеров ароматических кислот в динамически и ковалентно модифицированных гидрофильными соединениями капиллярах.

4. Условия эффективного определения энантиомеров некоторых биологически активных соединений в лекарственных препаратах в присутствии эремомицина в различных вариантах капиллярного электрофореза.

5. Особенности и параметры разделения некоторых ароматических кислот, в том числе фенолов, в присутствии различных типов лигнинов и условия определения фенола и его производных в воде и лекарственных препаратах.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на II Всероссийской конференции «Аналитика России» по аналитической химии с международным участием (к юбилею академика Ю.А.Золотова) (Краснодар, 2007), Всероссийском симпозиуме « Хроматография и хромато-масс-спектрометрия (К 100-летию со дня рождения профессора A.B. Киселева)» (Москва, 2008), 16 th International Symposium on Capillary Electrosepar ation Techniques (Catania, Italy, 2008), 5 lh Conference by Nordic Separation Science Society (Tallinn, Estonia, 20 09), III Всероссийской конференции " Аналитика России" с международным участием ( к 175-летию со дня рождения Д.И. Менделеева) (Краснодар, 2009), I Всероссийской конференции «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, 2009), «Ломоносов - 2009» (Москва, 2009), «Ломоносов - 2010» ( Москва, 2010), 17th I nternational Symposiu m on Capillary Electroseparation Techniques (Baltimore, USA, 2010), I Всероссийской конференции " Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез" (Краснодар, 2010).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 17 печатных работах: в 5 статьях и 12 тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав экспериментальной части, выводов, списка литературы (110 наименований). Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 69 рисунков и 46 таблиц, имеется 2 приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

Обсуждены основы капиллярного электрофореза, в том числе хирального. Рассмотрены модификаторы фонового электролита, используемые для управления селективностью разделения в капиллярном электрофорезе, при этом особое внимание уделено использованию макроциклических антибиотиков как хиральных селекторов. Систематизированы опубликованные данные по использованию макроциклических гликопептидных антибиотиков для разделения энантиомеров биологически активных соединений анионного и нейтрального характеров. Рассмотрены подходы к выбору условий их разделения и повышению чувствительности их определения в различных объектах. Приведены примеры их определения в объектах различной природы.

Экспериментальная часть

Приборы, реактивы и техника эксперимента. Исходные растворы (0,5-1 мг/мл) дансильных (дансил), карбоксибензильных (КБЗ) производиых аминокислот: дансил-ОЬ-фенилаланина ( дансил-Phe), дансил-ОЬ-лейцина ( дансил-Leu), дансил-йЬ-треонина ( дансил-Thr), КБЗ-ОЬ-аспарагиноной кислоты ( КБЗ-Asp), KB3-DL-anaHHHa ( КБЗ-Ala); растворы аминокислот (D L-триптофана, D-триптофана, DL-тирозина, DL-аспарагиновой кислоты, DL-глутаминовой кислоты, DL-гистидина), миндальной, 2- феноксипропионовой, 3- фенилмасляной, а-метоксифенилуксусной, 2- фенилпропионовой кислот, 1, 1'-бинафтил-2,2'-диилгидрофосфата (БНДГФ) (1-7 мг/мл), пиндолола и окспренолола (0,5-1 мг/мл); варфарина и кумахлора (0,75 мг/мл); кетопрофена, 8-(+)-кетопрофена, фенопрофе-на, ибупрофена, 8-(+)-ибупрофена, флурбипрофена, индопрофена (0,5-1 мг/мл) готовили растворением в воде или в смеси (1:1) метанол : вода точных навесок соединений.

Исходные растворы фенола, 2- хлорфенола, 3- хлорфенола, 4- хлорфенола, 2,4-дихлорфенола, о- и .м-крезола, резорцина, гваякола, пентахлорфенола, п-нитрофенола, динитрофенола, салициловой и никотиновой кислот (1 мг/мл) готовили растворением в воде точных навесок.

Рабочие растворы готовили соответствующим разбавлением стандартных растворов водой или смесью метанол : вода (1:1).

В качестве хиральных селекторов использовали эремомицина сульфат и ванкомицина гидрохлорид (98 %). Оба хиральных селектора предоставлены д.х.н. Староверовым С.М. ( ЗАО « БиоХимМак С&Т», Москва, Россия). Использовали препараты лигнинов ( диоксанлигнин ели и лигносульфонат), предоставленные лабораторией проф. Боголицына К.Г. (АГТУ, Архангельск, Россия).

Использовали уксусную кислоту, соляную кислоту, гидроксид калия («Germed», Дрезден, Германия), ацетата натрия тригидрат квалификации ч.д.а. («Лабтех», Россия), дигидрофосфат калия, гидрофосфата калия тригидрат, гидрофосфат натрия, тетрабората натрия декагидрат квалификации ч.д.а. («Реахим», Россия), фосфорную кислоту, триэтиламин, трибутиламин (99 %, «Acros Organics», США), метанол, изопропанол, ацетонитрил «для хроматографии» (Россия), MES моногидрат и TRIS («Fluka», Швейцария).

Для модифицирования поверхности кварцевого капилляра использовали низкомолекулярный хитозан ( степень дезацетилирования 75-85 %), 3-глицидилоксипропилтриэтоксисилан (9 7 %) ( оба« Sigma-Aldrich», США), 3-аминопропилтриметоксисилан (95 %, «Acros Organics», США), глутаровый аль-

дегид (25 %) («Fluka», Швейцария). Раствор хитозана (1 %) готовили, растворяя точную навеску хитозана в 0,5 % уксусной кислоте при перемешивании. Раствор З-глицидилоксипропилтриэтоксисилана (эпоксисилана, ЭС-1) готовили, смешивая 1 мл реагента с 10 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора (pH 5,3), к полученной эмульсии добавляли этиловый спирт до полного растворения (~3 мл). Раствор эре-момицина для модифицирования капилляра готовили, растворяя точную навеску эремомицина (0,1252 г) в 15 мл депонированной воды и доводя pH до 8,5 прибавлением 1 М КОН (~70 мкл). Раствор 3-аминопропилтриметоксисилана (аминосила-на) готовили, растворяя 0,1 мл аминосилана в 25 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора (pH 6,5).

Фоновые электролиты (ФЭ) готовили из соответствующих буферных растворов, добавляя точную навеску хирального селектора, лигнин предварительно растворяли в 1 мл 1 М раствора гидроксида натрия.

В работе использовали системы для капиллярного электрофореза« Капель-103Р», « Капель-105» и « Капель-105М» ( НПФ АП « Люмэкс», Санкт-Петербург, Россия) со спектрофотометрическим детектором (254 нм и 190-380 нм). Использовали кварцевые капилляры различной длины с внутренним диаметром 50 и 75 мкм (Polymicro Technologies, Phoenix, США). Образцы вводили гидродинамически, приложенное напряжение составляло ±(5-2 5) кВ. Исследования проводили при термостатировании капилляра при 20°С (системы «Капель-105» и «Капель-105М»).

Определение констант связывания методом КЭ основано на измерении элек-трофоретической подвижности раствора энантиомера в зависимости от содержания ХС в ФЭ. Для оценки адсорбции эремомицина на поверхности капилляра строили зависимость среднего значения трех параллельных измерений электрофоретиче-ской подвижности от концентрации ХС. Поскольку в работе использовали различные давления и время ввода пробы, то вместо концентрации учитывали количество введенного вещества в капилляр, которое рассчитывали по формуле Пуазейля: &pnrAtc

~ —8~r\L—' ГДе ^ ~ Разность Давлений при вводе пробы, г - радиус капилляра, t - время ввода пробы, с - концентрация вещества, т| - вязкость пробы, L - длина капилляра.

Методика нанесения хитозана (№1). Новый капилляр, подготовленный стандартным способом, промывали дважды 0,02 % раствором хитозана в уксусной кислоте в течение 10 минут, затем заполняли 0,02 % раствором хитозана и оставляли на ночь, опустив концы в 1 % уксусную кислоту. Методика нанесения сшитого хитозана (№1а). Подготовленный к модифицированию капилляр промывали 1 % раствором хитозана в течение 10 мин и оставляли на 10 мин. Далее капилляр промывали 12,5% раствором глутарового альдегида (5 мин) и оставляли на 15 мин. После этого капилляр снова промывали 1 % раствором хитозана (10 мин) и оставляли на 10 мин.

Методика иммобилизации эремомицнна через 3-

глицидилоксипропилтриэтоксисилан (№2). Новый капилляр с раскрытыми си-ланольными группами промывали раствором ЭС-1 в течение 10 часов, заполняли раствором и оставляли на ночь, опустив концы капилляра в этиловый спирт. После этого промывали капилляр этиловым спиртом в течение 5 минут, затем водой в течение 20 минут до нейтральной реакции (контроль по индикаторной бумаге). Полученный капилляр промывали раствором эремомицина в течение 8,5 часов и

оставляли на ночь с данным раствором. После этого капилляр промывали водой (5 мин) и ФЭ (50 мМ фосфатный буферный раствор (рН 6,3)) в течение 30 мин.

Методика нанесения 3-аминопропилтриметоксисилана (№3). Новый капилляр, подготовленный стандартным способом, промывали под напряжением 10 кВ раствором 3-аминопропилтриметоксисилана в течение 3 часов. После этого промывали 100 мМ ацетатным буферным раствором (рН 6,5) (30 мин), затем 10 мМ фосфатным буферным раствором (рН 7,0) (30 мин). Процедуру покрытия проводили дважды. Методика №3а. Для повышения стабильности слои аминосилана сшивали глутаровым альдегидом. Капилляр, заполненный раствором аминосиланом в ацетатном буферном растворе, помещали в муфельную печь при температуре 90°С на 3 часа, затем остатки реагента выдували воздухом. Через капилляр пропускали 25 % раствор глутарового альдегида в течение 7 мин, выдерживали 15 мин и промывали водой (10 мин). Активированный таким образом капилляр промывали аминосиланом в течение 10 мин, выдерживали 10 мин, затем промывали водой (2 мин).

Свойства использованных хиральных селекторов. Ванкомицин- вещество белого цвета; эремомицин - вещество от белого до бледно-розового цвета. Они хорошо растворимы в воде и некоторых полярных апротонных растворителях, таких как ДМСО, ДМФА, мало растворимы в метаноле, практически нерастворимы в ацетонитриле и высших спиртах, хорошо растворимы в воде.

Эремомицин, также как и ванкомицин, не поглощает в видимом диапазоне света. В диапазоне длин волн 260-300 нм наблюдается слабое УФ-поглощение с небольшим максимумом примерно 280 нм. В области менее 240 нм поглощение эре-момицина значительно возрастает. Установлено, что поглощение зависит от значения рН, поскольку ионное состояние антибиотика меняется в зависимости от кислотности среды. Основные отличия наблюдаются в коротковолновой области спектра. При рН 6,2 эремомицин заряжен преимущественно положительно (спектр имеет ярко выраженный максимум при 195 нм), при рН 9,2 имеет отрицательный заряд (максимум при 195 нм отсутствует), а при рН 7,1, около изоэлектрической точки, в растворе присутствуют две формы (имеются максимумы при 200 и 280 нм). Детектирование проводили при длинах волн, где наблюдалось максимальное отличие в поглощении макроциклических антибиотиков и исследуемых соединений (КБЗ-аминокислоты - 240 нм, дансил-аминокислоты - 254 нм, профены - 230/254 нм, варфарин - 305 нм).

Кислотно-основные свойства являются очень важными при выборе хирально-го селектора для разделения того или иного типа соединений. Из зависимости электрофоретической подвижности эремомицина в 50 мМ фосфатном ФЭ от рН определена изоэлектрическая точка, которая составила 7,65. Поскольку наилучшее разделение достигается, когда ХС и разделяемые соединения заряжены разноименно, то для разделения анионных соединений целесообразно использовать буферные растворы с рН<7,65.

Данные об устойчивости эремомицина также важны, поскольку состояние селектора влияет на энантиоселективность, воспроизводимость времен миграции и чувствительность определения. Свежеприготовленный рабочий раствор эремомицина - это прозрачная бесцветная жидкость, которую следует хранить в холодильнике (4°С). Для изучения стабильности селектора в условиях проведения анализа в капилляре регистрировали спектры поглощения эремомицина (2,5 мМ) в зависимости от времени, температуры и рН буферного раствора. Из сравнения полученных спектров можно сказать, что данный ХС достаточно стабилен при хранении его в

течение рабочего дня при 20°С и лишь по прошествии недели в коротковолновой части спектра наблюдаются некоторые отличия в интенсивности поглощения; при этом общий вид спектра остается неизменным. В диапазоне рН 6,0—9,2 наименее стабильным оказался раствор селектора при рН 9,2. Визуальные изменения, свидетельствующие о разложении эремомицин, наблюдаются менее чем через сутки, при этом раствор приобретает светло-розовую окраску. При температурах 20-25°С спектры практически идентичны, изменения в коротковолновой части спектра, связанные с разложением селектора, происходят при нагревании свыше 30°С.

Свойства лигнинов. Лигнин состоит из продуктов полимеризации ароматических спиртов; основной мономер - конифериловый спирт. В зависимости от способа его получения различают ряд видов лигнинов. В работе использовали диоксан-лигнин ели (ДЛЕ, средняя молекулярная масса 6100) и лигносульфонат (ЛСТ, средняя молекулярная масса 24200). ДЛЕ - вещество кремового цвета, ЛСТ - вещество коричневого цвета. По данным элементного анализа, ЛСТ содержит 9,0 % серы, а ДЛЕ серы не содержит. Оба лигнина плохо растворимы в низших спиртах. ДЛЕ хорошо растворяется в 0,1М КаОН, ДМФА, ДМСО и ацетоне; ЛСТ растворяется в воде и щелочных растворах, поэтому в качестве фонового электролита наиболее удобно использовать боратные буферные растворы.

УФ-спектры лигнинов имеют примерно одинаковый вид, наблюдаются максимумы поглощения около 210 и 284 нм. Ни один из растворов лигнинов не обладал оптической активностью.

Эремомицин как хиральный селектор в капиллярном электрофорезе

По результатам, полученным хиральной ВЭЖХ, эремомицин обладает высокой энантиоселективностью к немодифицированным а-аминокислотам и карбоновым кислотам. Главными факторами, наряду с типом и концентрацией ХС определяющими селективность хирального КЭ, являются рН и состав ФЭ. На основе литературных данных выбраны начальные условия разделения — 100 мМ фосфатный буферный раствор (рН 7,1), содержащий 5 мМ антибиотика, +5 кВ. Даже тщательная промывка (водой и щелочью) капилляра между анализами не позволила добиться воспроизводимых электрофореграмм, что связано с адсорбцией ХС.

Возможно несколько подходов к достижению энантиоразделения в условиях сильной адсорбции ХС. Самый простой прием заключается в разделении с приложением внешнего давления. Этот способ, хотя и приведет к получению уширенных пиков, позволит, тем не менее, оценить степень влияния тех или иных факторов на энантиоразделение тестовых соединений и сделать вывод о целесообразности дальнейших исследований предлагаемого ХС. Также решением проблемы могло бы стать динамическое или ковалентное модифицирование поверхности гидрофильными соединениями (например, замещенными силанами). Интересным способом является получение динамически модифицированного эремомицином капилляра. Все подходы изучены в работе.

Разделение энантиомеров производных аминокислот и профенов с использованием эремомицина в варианте капиллярного электрофореза под давлением. В этом варианте изучено влияние основных факторов (состава и рН фонового электролита, концентрации хирального селектора, добавки органических модификаторов в фоновый электролит, длины капилляра и приложенного напряжения) на энантиоразделение тестовых соединений (ибупрофена, индопрофена, кетопрофена,

фенопрофена и флурбипрофена, дансил-ТЬг, дансил-Ьеи, дансил-РЬе, КБЗ-Агр и КБЗ-А1а).

Показано, что оптимальная величина Абс.тАи рН для ПрофвНОВ И ПРОИЗВОДНЫХ

аминокислот различна и составляет 6,2 и 7,1, соответственно. Наилучшее разделение энантиомеров достигается при содержании эремомицина 2,5 мМ в 100 мМ (для дансил-аминокислот) или 50 мМ (для про-фенов) фосфатном буферном растворе; разделение КБЗ-аминокислот происходит уже при концентрации эремомицина I мМ. Добавление в ФЭ различных по природе органических модификаторов (метанола, аце-тонитрила, 18-краун-6) не приводит к улучшению разделения по совокупности параметров (длительности

30 35 <0 45 50 56 60 65 70 г г . _

I. мия анализа, разрешения пиков). Приме-

нение коротких капилляров (£0бш=35 Рис. 1. Энантиоразделение профенов (0,5 см) вместо длинных (/,о6ш=60 см) це-мг/мл): а - индопрофен; Ь - кетопрофен; с - лесообразно для уменьшения времен флурбипрофен. Условия разделения: 50 мМ миграции, но приводит к получению фосфатный буферный раствор, 2,5 мМ эремо- более шир0ких и менее разрешенных мицин, +10 кВ, внеш. давл. 10 мбар, 230 нм. пиков Определены константы

связывания эремомицин-профены, и и рассчитаны теоретические значения оптимальных концентраций ХС. Показано, что они меньше экспериментальных, что объясняется снижением количества эремомицина, доступного для связывания в диастереомерный комплекс с профеном, из-за адсорбции ХС на стенках капилляра. Определен порядок миграции ибупро-фена и кетопрофена: 11-(-)-энантиомер движется быстрее, чем 8-(+)-энантиомер. Проведено сравнение параметров разделения, полученных методами ВЭЖХ и КЭ, и показано, что закономерности разделения профенов обоими методами фактически одинаковы. Это позволяет заключить, что механизмы энантиораспознавания в ВЭЖХ и КЭ близки. При этом селективность хроматографического разделения выше электрофоретического, а разрешение пиков в КЭ заметно больше. Показано, что в сравнении с ванкомицином эремомицин обладает более высокой энантиосе-лективностью (табл. 1). Эремомицин разделяет энантиомеры исследованных соединений до базовой линии при меньших (1-2,5 мМ) концентрациях в ФЭ. В целом, в варианте КЭ под давлением время анализа велико (до 70 мин), а эффективность (ТТ/м) не превышает 20 тысяч.

Таблица 1. Сравнение характеристик энантиораспознавания производных амино-

кислот в присутствии ванкомицина и эремомицина

Соединение Ванкомицин (5 мМ) Эремомицин (2,5 мМ)

а я, а к.

Дансил-лейцин 1,26 1,42 2,78 2,22

Дансил-треонин 1,34 1,20 1,42 4,84

Дансил-фенилаланин 1,41 1,73 2,01 1,07

КБЗ-аланин 1 0 1,36а) 3,19а)

КБЗ-аспарагиновая кислота 1 0 1,20а) 2,59а)

Условия разделения: 100 мМ фосфатный буферный раствор (рН 7,1), содержащий 2,5 мМ (а)1 мМ) хирального селектора, капилляр (58,5/50 см, 75 мкм), внеш. давл. 15 мбар, +10 кВ, 254 нм. Концентрация аналитов 0,5 мг/мл.

Разделение энантиомеров анионных соединений в модифицированных капиллярах. Плохая форма пиков и низкая эффективность как следствие адсорбционных взаимодействий со стенками капилляра характерны для энантиоразделений с участием гликопептидных антибиотиков. Количественно оценить адсорбцию достаточно сложно. Для оценки количества адсорбирующегося на поверхности капилляра эремомицина использовали зависимости подвижности антибиотика и ЭОП от концентрации ХС в буферном растворе. В 20 мМ ацетатном буферном растворе (рН 5,5) молекула эремомицина имеет положительный заряд, поэтому ХС мигрирует до ЭОП. Исследована адсорбция в диапазоне концентраций от 0,01 мМ до 0,75 мМ, что соответствует 0,001^0,092 нмоль антибиотика (рис. 2).

Тангенс угла наклона линейного участка зависимости (константа А) пропорционален степени заполнения поверхности капилляра молекулами введенного вещества: чем он больше, тем быстрее поверхность капилляра заполняется ХС. Показано, что введение не менее 0,8 мМ раствора эремомицина в капилляр обращает ЭОП. В этой связи модифицирование стенок различным соединениями представляется оправ-Рис. 2. Зависимость подвижности эремомицина данным, причем предпочтительно, от его концентрации в фоновом электролите (А чтобы процесс модифицирования - весь диапазон концентраций, Б - линейный был прост в осуществлении. Таким участок). 20 мМ ацетатный буферный раствор способом является динамическое (рН 5,5); ввод пробы (30 мбар, 30 с), +25 кВ, I модифицирование поверхности. =20°С, 210 нм.

В качестве модифицирующих агентов выбраны эремомицин и природный полисахарид хитозан. Динамическое модифицирование эремомицином осуществляли промывкой капилляра 50 мМ фосфатным буферным раствором (рН 6,1), содержащим 2,5 мМ эремомицина, в течение 30 мин. Полученное покрытие более стабильно при использовании ФЭ с 5 мМ добавкой антибиотика. Разделение следует про-

9

0 02 О.ОЭ 0.04 0 05 0 01)

водить при обратной полярности. Влияние состава ФЭ на энантиоразделение показано при использовании фосфатных буферных растворов, приготовленных из солей калия, 2-(Т4-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) и трис(гидроксиметил)аминометана (TRIS). В случае двух последних буферных растворов (в отличие от К-фосфатного буферного раствора) возможно использование напряжения до -18 —20 кВ. Показано, что наилучшая воспроизводимость ЭОП наблюдается в TRIS-фосфатном буферном растворе (s, = 0,008). Этот ФЭ обеспечивает высокую эффективность и отличное разделение (Rs>2,3) большего числа соединений.

Таблица 2. Разделение энантиомеров тестовых соединений с использованием TRIS- и MES-фосфатного буферных растворов

Соединение TRIS-фосфатный БР MES-фосфатный БР

1мщр,1,МИН а Us tumrp.l ,МИ H а Rs

Индопрофен 13,9 1,58 10,9 11,1 1,54 12,9

Флурбифпрофен 12,3 1,52 17,1 11,4 1,73 15,5

2-феноксипропионовая кислота 9,0 1,11 3,3 15,3* 1,13 2,6

БНДГФ 14,5 1,48 4,3 14,0 1,62 11,5

Миндальная кислота 17,4 1,17 4,6 7,1 1,06 1,5

Кетопрофен 14,5 1,54 4,8 12,4 1,62 4,7

Фенопрофен 12,3 1,19 5,0 11,9 1,24 4,5

2-фенилпропионовая кислота 12,3 1,52 17,1 - - -

3-фенилмасляная кислота 29,3* 1,08 2,3 - - -

Ибупрофен 22,6* 1,22 9,9 - - -

Условия разделения: 50 мМ буферный раствор (БР) (рН 6,1), содержащий 5 мМ эремоми-цина, -10 кВ, *-5 кВ, 254 нм. Концентрация профенов 0,5 мг/мл, ароматических кислот 1 мг/мл.

Показано, что снижение концентрации ФЭ уменьшает времена миграции исследованных соединений, но неоднозначно влияет на энантиоразделение разных соединений. Например, разбавление ФЭ до 20 мМ в три раза ускоряет миграцию варфарина и повышает разрешение, в то время как энантиоразделение флурбипро-фена и кетопрофена ухудшается (Л5 1,3 и 1,0, соответственно). Влияние рН фонового электролита исследовали в диапазоне 3,6-7,1 на примере индопрофена, кетопрофена, флурбипрофена и БНДГФ. Зависимость времен миграции тестовых соединений от рН имеет вид кривой с минимумом при рН 5,1. Лучшая энантиоселек-тивность наблюдается в интервале 5,1-6,1 в зависимости от природы разделяемых соединений. Принимая во внимание, что р/ эремомицина составляет 7,7, можно заключить, что ухудшение разделения при рН 7,2 вызвано ослаблением ионных взаимодействий между ХС и силанольными группами капилляра.

При вводе пробы, разбавленной буферным раствором в соотношении 1:1, повышается разрешение и эффективность пиков. Например, для флурбипрофена величина изменилась от 9,9 до 12,2 (рН 5,1) и от 11,9 до 16,1 (рН 6,1). А число ТТ/м для неразбавленного и разбавленного образца флурбипрофена при рН 5,1 составило 40800 и 63000, соответственно (величины приведены для первого пика). В отличие от разделения в варианте КЭ под давлением в динамически модифицированном эремомицином капилляре возможно одновременное разделение нескольких профенов (например, флурбипрофена и кетопрофена).

Достигнутая хорошая воспроизводимость ЭОП и времен миграции, стабильная базовая линия позволили предположить успех разделения энантиомеров недерива-тизированных аминокислот. Однако удалось разделить только энантиомеры аминокислот с двумя карбоксильными группами, что подчеркивает их важность для энантиораспознавания. Разделение проводили, используя косвенное детектирование, причем поглощающим компонентом ФЭ являлся собственно хиральный селектор. Для этого содержание эремомицина в ацетатном буферном растворе (рН 5,1) увеличили до 10 мМ, а длину волны детектирования установили равной 280 нм, соответствующей максимуму поглощения эремомицина. Достигнуто энантио-разделение глутаминовой кислоты (tMHrp 29,6 и 31,6 мин, Rs= 1,5) и аспарагиновой кислоты (tMIirp26,l и 27,8 мин, Rs = 1,90).

Динамическое модифицирование поверхности кварцевого капилляра хито-заном позволило создать на ней положительный заряд за счет протонирования аминогрупп модификатора. Учитывая кислотно-основные свойства хитозана и его растворимость (хитозан растворим в воде только в протонированной форме), а также склонность к образованию ионных пар с многозарядными анионами, в качестве начальных условий выбрали 20 мМ ацетатный буферный раствор (рН 5,5). Однократная обработка поверхности капилляра раствором хитозана из-за неполного покрытия не обеспечивает полной перезарядки поверхности и обращения ЭОП, и необходимо проведение повторного модифицирования. Без добавления в ФЭ хитозана происходит его частичная десорбция и, как следствие, увеличение времен миграции аналитов. Поэтому для улучшения стабильности покрытия и повышения воспроизводимости использовали ФЭ с добавкой 0,005 % хитозана. При такой концентрации модификатора относительное стандартное отклонение времен миграции маркера ЭОП равно 0,02 (t„Hrp 10,5 мин). Исследование зависимости подвижности эремомицина и ЭОП от концентрации ХС в покрытом капилляре свидетельствует о меньшей адсорбции ХС по сравнению с немодифицированным капилляром. Однако при выборе условий разделения энантиомеров ароматических кислот наблюдали невоспроизводимость времен миграции и общего вида электрофореграмм, связанную с конкурентной адсорбцией положительно заряженных хитозана и антибиотика. Для повышения стабильности покрытия использовали сшивание двух слоев хитозана глутаровым альдегидом. Разделение аналитов проводили в 20 мМ буферных растворах с рН 4,5-6,2. Обнаружено, что в присутствии эремомицина во всем исследованном диапазоне рН (4,5-6,2) ЭОП был обращен, что требовало смены полярности напряжения. Оказалось, что оптимальные условия для разделения энантиомеров профенов и кислот значительно зависят от структуры аналита. Например, для ибупрофена изменение рН от 4,4 до 6,0 значительно улучшило энантиоразде-ление, в то время как на миграцию энантиомеров фенопрофена рН буферного раствора не оказал такого сильного влияния. Увеличение концентрации эремомицина от 0,75 до 1,6 мМ привело к увеличению времен миграции. Всего лишь 0,75 мМ оказалось достаточно для разделения до базовой линии энантиомеров индопрофена и флурбипрофена, при этом разрешение кетопрофена составило 1,4. Присутствие хитозана не повлияло значительно на энантиораспознавательную способность эремомицина: в обоих случаях он наиболее селективен именно к индопрофену, флур-бипрофену и кетопрофену, но уменьшило коэффициент селективности. По сравнению с разделением в кварцевом капилляре под давлением модифицирование капилляра сшитым хитозаном позволило использовать более разбавленные ФЭ с гораздо меньшей добавкой ХС. Отсутствие внешнего давления и, как следствие, бо-

5

6 min 5 6 7 min

лее плоский поток в капилляре уменьшили размывание зоны и привели к большей эффективности (ТТ/м). Обращение ЭОП позволило разделить энантиомеры ароматических кислот за 7-8 мин. Времена миграции могли быть еще меньше при наличии аппаратурной возможности вводить пробу с короткого конца капилляра.

Более устойчивыми по сравнению с динамическими покрытиями являются ковалентно закрепленные покрытия, они не требуют возобновления путем добавления модификатора в ФЭ для промывки или во время анализа. Желательно получить поверхность, заряженную положительно в рабочем диапазоне рН (4,56,5). Получение таких покрытий аналогично синтезу модифицированных сорбентов для хроматографии и обычно требует проведения реакций в осушенных неводных растворителях при нагревании. Из ряда предлагаемых в литературе выбраны способы с использованием водно-органических сред при комнатной температуре, что с большей вероятностью обеспечивает сохранение структуры антибиотика. Также осуществлена не просто функционализация (например, прививка аминогруппы) поверхности кварца, но и иммобилизация самого хирального селектора. Модифицирование стенок капилляра З-аминопропилтриметоксисиланом проводили по аналогии с аминированием силикагеля. Для повышения плотности покрытия процедуру повторяли дважды, слои аминосилана сшивали глутаровым альдегидом. Это позволило также значительно улучшить стабильность получаемого покрытия. По сравнению с немодифицированным капилляром скорость ЭОП оказалась ниже (0,31 и 0,08 см2/кВ*с, соответственно). В аминированном капилляре молекула эремомицина мигрирует до ЭОП при положительной полярности.

Непосредственное закрепление антибиотика на поверхности капилляра невозможно, поэтому в качестве сшивающего агента использовали 3-глицидилоксипропилтриэтоксисилан. В результате модифицирования капилляра поверхность не перезарядилась. По сравнению с немодифицированным капилляром скорость ЭОП оказалась ниже (0,31 и 0,10 см2/кВ*с, соответственно). Исследование адсорбции эремомицина показало, что данный капилляр по степени экранирования силанольных групп поверхности кварца уступает капилляру, модифицированному сшитым аминосиланом.

В табл. 3 приведены параметры адсорбции на стенках капилляров, исследованных в работе. Для этих капилляров с увеличением концентрации эремомицина наблюдается уменьшение эффективности и увеличение ассиметрии пика ХС, связанное с адсорбцией эремомицина на поверхности капилляра.

Рис. 3. Влияние концентрации эремомицина на энантиоразделение кетопрофена (0,5 мг/мл). Условия разделения: 20 мМ ацетатный буферный раствор (pH 4.5), 0,005 % хитозана, а - 0,75 мМ, Ъ - 1,6 мМ раствор эремомицина, -10 кВ, 230 нм.

Таблица 3. Параметры адсорбции зремомицина на стенках исследованных капилляров

Капилляр Диапазон концентраций зремомицина V, нмоль Диапазон линейности изотермы, нмоль СМ ё, мкм А, см2/(кВнмольс) шах ц Эфср, см2/кВ-с

№ 1 0,001-0,092 0,001-0,012 64/56 75 0,45 0,11

№2 0,001-Ю,092 0,001-0,092 64/56 75 0,40 -0,16

№3 0,007-М),295 0,007-0,06 44/35 50 0,32 0,20

№4 0,011-0,295 0,011-0,09 44/35 50 0,71 0,21

№ 1 - немодифицированный кварцевый капилляр, № 2 - капилляр, покрытый хитозаном, № 3 - капилляр, покрытый 3-аминопропилтриметоксисиланом, № 4 - капилляр, модифицированный эремомицином через 3-глицидилоксипроиилтриэтоксисилан.

За максимальную подвижность выбрано среднее значение электрофоретической подвижности при больших концентрациях зремомицина. Чем она больше, тем меньше взаимодействие зремомицина со стенкой капилляра. Максимальная элек-трофоретическая подвижность зремомицина получена в капиллярах, модифицированных амино- и эпоксисиланом. Изменение значения эффективной подвижности Дцэфф также характеризует изменение поверхности при пропускании ХС. В модифицированных капиллярах величина Дцэф меньше, чем в немодифицированном кварцевом капилляре. При этом в случае капилляра, модифицированного аминоси-ланом, ДЦэф составляет 0,04 см2/кВ*с, что в 1,75 раз меньше, чем в капилляре с иммобилизованным эремомицином через эпоксисилан. Таким образом, прививка 3-аминопропилтриметоксисилана позволила в большей степени снизить адсорбцию,

Рис. 4. Разрешение знантиоме-ров некоторых профенов в различных капиллярах (1 - капилляр, динамический модифицированный хитозаном, 1,6 мМ зремомицина; 2 - капилляр с иммобилизованным эремомицином, 0,25 мМ зремомицина; 3 - капилляр с привитым 3-аминопропилтриметоксисила-ном, 0,75 мМ зремомицина; 4 -капилляр, динамически модифицированный эремомицином, 5 мМ эремомицин; 5 - немодифицированный кварцевый капилляр, 2,5 мМ зремомицина).

Сравнение использованных капилляров показывает, что модифицирование поверхности позволяет значительно уменьшить времена миграции аналитов и повы-

чем покрытие эремомицином через эпоксисилан.

сить эффективность. Также к достоинствам таких капилляров относится лучшая воспроизводимость времен миграции. Сравнение разрешения пиков энантиомеров представлено на рис. 4. К сожалению, количества иммобилизованного через эпоксисилан эремомицина оказалось недостаточно для разделения энантиомеров исследованных соединений, и необходима добавка ХС в фоновый электролит. Показано, что содержание ХС 0,10-0,75 мМ в ФЭ достаточно для хотя бы частичного энантиоразделения профенов.

Лигнин как модификатор фонового электролита

Лигнин - второй по распространенности в природе биополимер, уступающий по запасам только целлюлозе. Как продукт ферментативной радикальной дегидроге-низационной полимеризации кониферилового, синапового и л-кумарового спиртов природный лигнин обладает очень сложной хаотической трехмерной структурой, основу которой составляют и-замещенные производные 2-метоксифенола и 2,6-диметоксифенола. Наличие большого количества различных функциональных групп и способность взаимодействовать с различными по природе соединениями представляет интерес для изучения лигнинов в качестве компонента фонового электролита в капиллярном электрофорезе.

Совместное присутствие лигнинов (ДЛЕ и ЛСТ) и эремомицина (0-1000 мкМ эремомицин, 0-10 мкМ лигнина), хотя и изменяет собственные электрофоре-тические подвижности тестовых соединений, не приводит к разделению энантиомеров профенов ни при использовании фосфатного ФЭ (рН 7,1), ни боратного ФЭ (РН 9,2).

Добавление лигнина в ФЭ снижает электрофоретическую подвижность фенолов и карбоновых кислот (бензойная, никотиновая, салициловая кислоты, фенил-аланин, индопрофен, кетопрофен, ибупрофен) (рис. 6).

Рис. 6. Влияние добавки 10 мкМ ДЛЕ на времена миграции фе-нилаланина (1), - никотиновой кислоты (2), салициловой кислоты

(3), бензойной кислоты

(4). Условия разделения: 2,5 мМ боратный буферный раствор (рН 9,2), +10 кВ.

ДэвЕв«дДЛ£. и««

Вещество

Порядок миграции зависит от структуры соединения: быстрее мигрируют фенолы, затем кислоты, содержащие в свой структуре атом азота (фенилаланин и никотиновая кислота), наименьшая электрофоретическая подвижность у салициловой кислоты, особенно в присутствии ДЛЕ. Это может быть обусловлено наличием в структуре ОН-группы, которая вносит важный вклад во взаимодействие с лигнином. Для всех соединений времена миграции уменьшились при разбавлении ФЭ, что согласуется с основными закономерностями КЗЭ. Величину напряжения изменяли в интервале +10- +20 кВ, с ростом напряжения увеличивалась величина

14

ЭОП и подвижность аналитов, что позволило уменьшить время разделения. Хорошая селективность разделения была получена по отношению к фенолам с 2,5 мМ боратным буферным раствором (рН 9,2) в качестве фонового электролита.

Порядок миграции фенолов зависит от состава ФЭ. При добавлении ЛСТ времена миграции увеличиваются в ряду: фенол (9,86) <4- хлорфенол (9,47) < 3-хлорфенол (9,00) < 2-хлорфенол (8,50) < пентахлорфенол (4,68) < 2,4-дихлорфенол (8,05). Полученный ряд хорошо согласуется с изменением рКа фенолов, они приведены в скобках. Исключение составляет пентахлорфенол, который должен был бы иметь максимальное время миграции, но в этой молекуле ОН-группа экранирована атомами хлора.

При добавлении к боратному буферному раствору ДЛЕ ряд изменяется: фенол < 4-хлорфенол < 3-хлорфенол < пентахлорфенол < 2,4-дихлорфенол < 2-хлорфенол. Это, очевидно, связано с различиями в составе лигнинов. Оба лигнина в щелочной среде несут отрицательный заряд, но у лигносульфоната натрия он обусловлен диссоциацией сульфо-групп, а макромолекула ДЛЕ отрицательно заряжена за счет

Более заметное влияние на времена миграции оказывает ДЛЕ, что важно для фенола: в этом случае его пик отстоит дальше от пика, соответствующего ЭОП. Также в присутствии ДЛЕ выше селективность разделения фенолов. Таким, образом, проведенное исследование показало, что добавки лигнинов в ФЭ полезны для разделения фенолов капиллярным электрофорезом. Лучшие характеристики разделения получены при использовании в качестве ФЭ 2,5 мМ боратного буферного раствора (рН 9,2) с добавкой 5 мкМ ДЛЕ (рис.7). ДЛЕ, +20 кВ, 254 нм.

Определение фенолов в искусственных смесях и модельных растворах.

Возможности практического определения фенолов в загрязненных водах с предварительным концентрированием на патронах «Диапак-П» показаны на примере модельного образца водопроводной воды. Изучена зависимость площади пика на электрофореграмме фенолов от их концентрации в интервале 1-20 мкг/мл. Смеси с более высокими содержаниями фенолов не исследовали т.к. при этом разделение 2-хлорфенола, пентахлорфенола и 2,4- дихлорфенола не достигается. Следует отметить, что использование лигнинов в качестве добавок в ФЭ при определении фенолов обеспечило высокую воспроизводимость времен миграции (я, не более 0,006) и площадей пиков фенолов (вг не более 0,003). Для фенола ст„ (по Зэ-критерию) составил 0,4 мкг/мл, для 2-, 3-, 4-хлорфенолов 0,2 мкг/мл, для 2,4-дихлорфенола 0,3 мкг/мл, а для пентахлорфенола 0,1 мкг/мл. Результаты определения фенолов пред-

диссоциации фенольных гидроксилов.

2

л_

Рис.7. Электрофореграмма смеси фенолов(10 мкг/мл): 1 - ЭОП; 2 - фенол; 3-4- хлорфенол; 4 -3-хлорфенол; 5 - пентахлорфенол; 6 - 2,4-дихлорфенол; 7-2- хлорфенол; Условия разделения^^ мМ боратный буферный раствор, 5 мкМ

ставлены в табл. 4. Они свидетельствуют о правильности и достаточно хорошей воспроизводимости результатов.

Таблица 4. Результаты определения фенолов в модельном растворе на основе во-

Соединение

Введено, мкг/50 мл Найдено, мкг Sr

0 0

5,0 5,4±0,3 0,03

0 0

5,0 5,3±0,3 0,03

0 0

5,0 5,1±0,2 0,02

0 0

5,0 5,2±0,3 0,03

0 0

5,0 5,1 ±0,2 0,02

0 0

5,0 5,0±0,2 0,02

Фенол 4-хлорфенол 3-хлорфенол 2-хлорфенол пентахлорфенол 2,4-дихлорфенол

Условия разделения: 2,5 мМ боратный буферный раствор, 5 мкМ ЛСТ, +20 кВ.

В выбранных условиях проведено определение фенола и .и-крезола в препарате «Веррукацид», используемом для наружных участков кожи. В данном препарате содержание фенолов высоко, поэтому градуировочные зависимости строили в диапазоне 150-600 мкг/мл для фенола и 70-280 мкг/мл для крезола. Они хорошо описываются прямо пропорциональной зависимостью (R=0,99). В препарате найдено 590±30 мг фенола и410±20 мг .«-крезола (п =3, Р=0,95). Определенное содержание фенолов согласуются с данными, заявленными производителем.

Применение эремомицина для практического определения энантиомеров

Практическое применение разработанных подходов для разделения энантиомеров продемонстрировано на примере определения активных компонентов (и соотношения их энантиомеров) фармацевтических средств (таблеток и гелей) в варианте капиллярного электрофореза под давлением, в варианте КЭ с динамически модифицированным эремомицином капилляре, а также в варианте капиллярной электрохроматографии с капиллярами, ковалентно модифицированными 3-аминопропилгриметоксисиланом и эремомицином через 3-глицидилоксипропилтриэтоксисилан. Определению активного компонента наполнители не мешают. Все исследованные препараты являются рацемическими смесями. Характеристики разработанных методик показаны в табл. 5.

Определение ибупрофена в таблетках «Ибупрофен» проводили методом капиллярного электрофореза под давлением (50 мМ фосфатный буферный раствор (pH 6,2), 2,5 мМ эремомицин). Содержание активного компонента - (200±30) мг/табл. (п=5, Р=0,95), что совпадает с заявленными производителем данными.

Для определения варфарина в капилляре, динамически модифицированном эремомицином, строили зависимость суммы площадей пиков энантиомеров от концентрации, полученных при Х=254 и 305 нм, во втором случае лучше чувствительность определения.

Таблица 5. Определение анионных соединений в фармацевтических композициях с использованием эремомицина как хиралыюго селектора

Объект Соединение Концентрация ХС, мМ Диапазон линейности градуировочного графика, мг/мл Времена миграции, мин1'3 площади пика2'3 Сщт, мг/мл Капилляр Метод расчета

Таблетки Ибупрофен 2,5 0,2-1 27±2 31±2 0,14 0,10 6,6*10"2 1 Метод внешнего стандарта

Таблетки для рассасывания Флурбипрофен 5 0,005-0,5 11,7±0,4 17,0±0,7 0,11 0,11 1,6*10"3 2 Метод внешнего стандарта

0,25 - 9,3±0,4 9,7±0,4 0,02 0,04 - 3 Метод добавок

Таблетки Варфарин 5 0,001-0,15 9,5±0,2 10,1±0,3 0,04 0,05 3,3*10"' (305 нм) 2 Метод внешнего стандарта

Гель Кетопрофен 0,25 0,035-0,2 мг/мл 10,6±0,5 11,2±0,5 0,04 0,06 1,4*10"2 4 Метод внешнего стандарта

Времена миграции первого и второго энантиомера, соответственно. Воспроизводимость между днями. Р=0,95, п=5. 1 - Кварцевый капилляр, 2 - капилляр, динамически модифицированный эремомицином, 3 - капилляр, модифицированный 3-глицидилоксипропилтриэтоксисиланом и эремомицином, 4 - капилляр, модифицированный 3-аминопропилтриметоксисиланом.

Найденное содержание варфарина -2,3±0,3 мг/табл. (п=5, Р=0,95)-совпадает с заявленным производителем (2,5 мг).

Определение флурбипрофена в таблетках для рассасывания «Стрепфен» проводили в капилляре динамически и ковалентно модифицированном эремомици-ном. Во втором случае концентрация ХС в ФЭ в 20 раз меньше. Длина волны детектирования 254 нм. Объем вводимой пробы(25 мбар, 5 с). В табл. 5 представлены метрологические характеристики предлагаемой методики. Найденное содержание флурбипрофена 9±1 мг/табл. (п=5, Р=0,95) в коммерческом фармацевтическом препарате «Стрепфен» совпадает с заявленным производителем.

С использованием капилляра, модифицированного 3-аминопропилтриметоксисиланом, определено содержание кетопрофена (230±20 мг/г) (п=5, Р=0,95) в коммерческом фармацевтическом препарате «Быструм гель». Полученная электро-

фореграмма представлена на рис. 9. Применение модифицированных капилляров не только сокращает время анализа, но также улучшает воспроизводимость площадей пиков и времен миграции.

ВЫВОДЫ

1. Показано влияние добавки эремомицина на величину и направление электроосмотического потока. Проведена оценка параметров адсорбции эремомицина на поверхности кварцевого капилляра. Установлено, что при содержании эремомицина в фоновом электролите более 0,8 мМ происходит обращение электроосмотического потока, а при с>5 мМ образуется устойчивое динамическое покрытие капилляра.

2. Установлено, что эремомицин обладает высокой энантиораспознавательной способностью по отношению к органическим анионным соединениями (профенам, производным аминокислот, глутаминовой и аспарагиновой кислотам, варфарину, кумахлору). Выбраны условия разделения энантиомеров (состав и рН фонового электролита, концентрация хирального селектора, добавка органических модификаторов, длина капилляра и напряжение).

3. Предложены способы модифицирования поверхности кварцевого капилляра хитозаном, 3- аминопропилтриметоксисиланом, 3- глицидилоксипропилтриэтокси-

Рис. 8. Электрофореграмма препарата « Варфа-рин». Условия разделения: 20 мМ Т11 Ш-фосфатный буферный раствор (рН 6,1), 5 мМ эремомицин, -10 кВ, капилляр 35(27) см*75 мкм, 305 нм.

0 Сире!

Рис. 9. Электрофореграмма препарата «Стрепфен». Условия разделения: 20 мМ ацетатный буферный раствор (рН 6,1), содержащий 0,25 мМ эремомицина; -20 кВ, капилляр 44/35 см, 50 мкм, 254 нм.

силаном и эремомицином. Показано, что модифицирование капилляра уменьшает адсорбцию эремомицина и улучшает воспроизводимость параметров электрофоре-тического разделения.

4. Показано, что при использовании модифицированных капилляров увеличивается эффективность, и в 5-20 раз уменьшается необходимая концентрация хи-ралыюго селектора и значительно сокращается время миграции исследованных кислот ( профенов и миндальной, 2- феноксипропионовой, 3- фенилмасляной, а-метоксифенилуксусной, 2-фенилпропионовой кислот).

5. Разработаны методики и проведено определение ибупрофена, кетопрофена, флурбипрофена и варфарина и их энантиомерного состава в лекарственных препаратах.

6. Обнаружено значительное улучшение эффективности, селективности, а также воспроизводимости параметров разделения смеси фенолов при использовании лигнинов в качестве модифицирующей добавки фонового электролита. Разделение фенола, 2- хлорфенола, 3- хлорфенола, 4- хлорфенола, 2, 4-дихлорфенола, пен-тахлорфенола достигается за 10 минут.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Prokhorova, A.F., Shapovalova, E.N., Shpak, A.V., Staroverov, S.M., Shpigun, O.A. Enantioreeognition of profens by capillary electrophoresis using a novel chiral selector eremomycin // J. Chromatogr. A. 2009. V. 1216. №. 17. P. 3674-3677.

2. Prokhorova, A.F., Kuznetsov, M. A., Shapovalova, E. N., Staroverov, S.M., Shpigun, O.A. Enantioseparations of aro matic carboxylic acid by capillary electrophoresis using eremomycin as a chiral selector in a chitosan-modified capillary // Proceedi a Chemistry. 2010. №. 2. P.9-13.

3. Прохорова, А.Ф., Кузнецов, M.A., Шаповалова, E.H., Староверов, C.M., Шпигун, O.A. Разделение энантиомеров Л^-производных аминокислот методом капиллярного электрофореза с использованием макроциклических антибиотиков // Вест. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2010. Т. №5. С. 359-363.

4. Прохорова, А.Ф., Буданова, Н.Ю., Шаповалова, E.H., Шпигун, O.A. Разделение профенов и их энантиомеров методом капиллярного электрофореза // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. Т.76. №11. С. 7-19.

5. Prokhorova, A.F., Shapovalova, E.N., Shpigun, O.A. Chiral analysis of pharmaceuticals by capillary electrophoresis using antibiotics as chiral se lectors // J. Pharm. Bi-omed. Anal. 2010. V.53. №5. P. 1170-1179.

6. Шаповалова, E.H., Прохорова, А.Ф., Кузнецов, M.A., Шпак, A.B., Староверов, С.М., Шпигун, O.A. Энантиоразделение TV-производных аминокислот и профенов с использованием ванкомицина и эремомицина методом капиллярного электрофореза/11 Всероссийская конференция «Аналитика России» с международным участием (к юбилею академика Ю.А.Золотова). Краснодар. 7-12 октября 2007. Тезисы докладов. С.66.

7. Прохорова, А.Ф., Шаповалова, E.H., Староверов, С.М., Шпигун, O.A. Энантиоразделение профенов методом капиллярного электрофореза в присутствии эремомицина / Всероссийский симпозиум« Хроматография и хромато-масс-спектрометрия ( К 100-летию со дня рождения профессора A.B. Киселева)». Москва. 14-18 апреля 2008. Тезисы докладов. С. 123.

8. Prokhorova, A.F., Shapovalova, E.N., Staroverov, S.M., Shpak, A.V., Shpigun,

0.A. Enantiorecognition of profens using novel chiral selector ere momycin in capillary electrophoresis/ 16th International Symposium on Capillary Electr oseparation Techniques. Catania, Italy. 2008. August 31-September 04. P.58.

9. Попов, Д.С., Прохорова, А.Ф. Использование лигнинов в качестве компонентов фонового электролита в капиллярном электрофорезе / Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2009». Москва. 13-18 апреля 2009. Тезисы докладов.

10.Prokhorova, A.F., Shapovalova, E.N. , Staroverov, S.M., Shpigun, O.A. Enanti-oseparations of aromatic carboxylic acids by capillary electrophoresis using eremomycin as a chiral selector in a chitosan-modified capillary. / 5th Conference by Nordic S eparation Science Society. Tallinn, Estonia. 2009. August 26-29. P.128.

П.Прохорова, А.Ф., Шаповалова, E.H., Шпигун, O.A. Электрофоретическое разделение энантиомеров профенов в капилляре, модифицированном хитозаном. / III Всероссийская конференция «Аналитика России» с международным участием. Краснодар. 27 сентября-2 октября 2009. Тезисы докладов. С.66.

12. Шпигун, O.A., Прохорова, А.Ф., Буданова, Н.Ю., Ананьева, И.А., Шаповалова, E.H. Разделение энантиомеров профенов хиральной высокоэффективной хроматографией и капиллярным электрофорезом /1 Всероссийская конференция «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции». Москва. Россия. 1-4 декабря 2009. Тезисы докладов. С. 175.

13. Михалюк, А.Н., Ларин, A.B., Прохорова, А.Ф. Влияние pH фонового электролита на миграцию и разделение энантиомеров в условиях капиллярного электрофореза/ Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2010». Москва. 12-15 апреля 2010. Тезисы докладов.

14. Лебедева, М.В., Прохорова, А.Ф. Электрофоретическое разделение органических кислот в присутствии эремомицина на модифицированных капиллярах/ Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2010». Москва. 12-15 апреля 2010. Тезисы докладов.

15. Prokhorova, A.F., Lebedeva, М. V., Shapovalova, Е. N., Staroverov, S.M., Shpigun, O.A. Enantioseparation of anionic compounds using eremomycin as chiral selector by different variants of capillary electro phoresis / 17lh International Symposium on Capillary Electroseparation Techniques. Baltimore, USA. 2010. August 20- September

01. P.128.

16. Прохорова, А.Ф., Лебедева, M.B., Шаповалова, E.H., Староверов, C.M., Кузнецов, М.А. Определение некоторых лекарственных средств и их энантиомеров в фармацевтических композициях в присутствии эремомицина методом капиллярного электрофореза /1 всероссийская конференция по аналитической хроматографии и капиллярному электрофорезу. Краснодар, 27 сентября-01 октября 2010. Тезисы докладов. С.264.

17. Шаповалова, E.H., Прохорова, А.Ф., Ананьева, И.А. Катионные хиральные селекторы в капиллярном электрофорезе и высокоэффективной жидкостной хроматографии /1 всероссийская конференция по аналитической хроматографии и капиллярному электрофорезу. Краснодар. 27 сентября-01 октября 2 010. Тезисы докладов. С.224.

Заказ№ 170-i/l 1/2010Подписано в печать 18.11.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 \ i^f)} www. cfr. ru; e-mail:info@cfr. ru

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Модификаторы фонового электролита в капиллярном электрофорезе для разделения соединений катионного характера и их энантиомеров.8*

1.1. Основные понятия капиллярного электрофореза.

1.2. Управление селективностью в капиллярном электрофорезе.9"

1.3. Разделение энантиомеров методом капиллярного электрофореза.

1.3.1. Теоретические основы хирального КЭ.

1.3.2. Макроциклические антибиотики как ХС.18*

1.3.3. Влияние основных факторов на энантиоразделение.

1.3.4. Приемы улучшения характеристик разделения и чувствительности определения

1.3.5. Использование гликопептидных антибиотиков для разделения и определения энантиомеров.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. Исходные вещества, аппаратура, техника эксперимента.

2.1. Исходные реактивы и растворы.

2.2. Техника эксперимента.

2.3. Методики получения модифицированных капилляров.

2.4. Свойства использованных хиральных селекторов.

2.5. Исследование физических и физико-химических свойств лигнинов.

Некоторые общие замечания по методологии исследования разделения энантиомеров в присутствии эремомицина.60'

Глава 3. Разделение энантиомеров в режиме капиллярного электрофореза под давлением

3.1. Разделение энантиомеров производных аминокислот и профенов с использованием эремомицина в качестве хирального селектора.

3.1.1. Влияние состава и рН фонового электролита.

3.1.2. Влияние концентрации хирального селектора на разделение энантиомеров.

3.1.3. Влияние добавки органических модификаторов.

3.1.4. Влияние напряжения и геометрии капилляра.

3.1.5. Определение порядка миграции энантиомеров профенов.

3.1.6. Сравнение характеристик энантиораспознавания эремомицина методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза.

3.2. Разделение энантиомеров производных аминокислот с использованием ванкомицина в качестве хирального селектора.76'

Сравнение характеристик энантиораспознавания ванкомицина и эремомицина.

Глава 4. Разделение энантиомеров в динамически модифицированных капиллярах.

4.1. Предварительные исследования.

4.2. Динамическое модифицирование поверхности кварцевого капилляра эремомицином .814.2.1. Влияние концентрации эремомицина.

4.2.2. Выбор условий разделения энантиомеров кислот.

4.2.3. Энантиоразделение недериватизированных аминокислот.

4.3. Динамическое модифицирование поверхности кварцевого капилляра хитозаном.

4.3.1. Влияние состава и рН фонового электролита.'.

4.3.2. Влияние концентрации эремомицина.

4.3.3. Влияние концентрации хитозана.

Глава 5. Разделение энантиомеров в ковалентно модифицированных капиллярах в режиме капиллярной электрохроматографии.

5.1. Получение капилляра, модифицированного 3-аминопропилтриметоксисиланом, и изучение его свойств.

5.2. Получение капилляра, модифицированного эремомицином через 3-глицидилоксипропилтриэтоксисилан, и изучение его свойств.

5.3. Сравнение параметров адсорбции эремомицина в исследованных капиллярах.

5.4. Разделение смеси ароматических карбоновых кислот.

5.5. Разделение оптических изомеров карбоновых кислот в модифицированных капиллярах.

Глава 6. Миграция анионных соединений в присутствии лигнинов как модификаторов фонового электролита.

6.1. Электрофоретическое поведение лигнинов.

6.2. Влияние совместного присутствия лигнина и хирального селектора на миграцию карбоновых кислот.

6.3. Разделение соединений различной природы при добавлении лигнинов в фоновый электролит.

6.3.1. Оптимизация условий разделения.

6.3.2. Разделение фенолов при добавлении лигнинов в фоновый электролит.

6.3.3. Определение фенолов в искусственных смесях и модельных растворах.

6.3.4. Определение фенолов в растворе для наружного применения «Веррукацид».

Глава 7. Практическое применение для определения энантиомерного состава лекарственных препаратов.

ВЫВОДЫ.

Актуальность темы. Метод хирального капиллярного электрофореза (КЭ) относится к-современным методам разделения энантиомеров, он отличается высокой разрешающей способностью. КЭ является альтернативой хроматографическим методам, его преимуществами являются» малый расход реагентов, в том числе хирального селектора, короткое время анализа. КЭ" позволяет проводить быструю оценку (скрининг) энантиоселективных свойств хиральных селекторов (ХС).

В большинстве случаев сложная матрица реальных объектов (биологического, природного и промышленного происхождения) требует весьма высокой селективности разделения аналитов из-за значительного количества сопутствующих компонентов. Повышение селективности возможно за счет создания оптимальных условий взаимодействия между компонентами фонового электролита и разделяемыми соединениями, например, в результате изменения заряда аналитов при выборе подходящего буферного' раствора. Однако, в некоторых случаях невозможно достичь высокоселективного разделения, изменяя такие параметры как рН, ионная сила фонового электролита и приложенное напряжение. Селективного разделения сложных смесей можно достичь, только используя т.н. модификаторы фонового электролита, среди которых разнообразные по строению спирты, полимеры, ион-парные и мицеллообразующие реагенты, макроциклические соединения (краун-эфиры, циклодекстрины, антибиотики и др.) [1,2].

В присутствии модификаторов изменяются типы взаимодействий между аналитами и компонентами фонового электролита, что позволяет достигать нужной селективности разделения. Очень часто использование макроциклических модификаторов с большим числом ионизируемых и/или гидрофобных групп оказывается более эффективным по сравнению с низкомолекулярными добавками. Поэтому макроциклические соединения являются перспективными соединениями для управления селективностью разделения, и поиск среди них новых модификаторов для управления селективностью является важной задачей аналитической химии.

Часто введение модификатора позволяет просто улучшить разделение и повысить его селективность, тогда как в других случаях только его присутствие обеспечивает успешное решение задачи. В частности, только использование модификаторов, т.н. хиральных селекторов, позволяет разделить оптические изомеры [3].

Большинство лекарственных препаратов являются оптически активными соединениями и выпускаются в виде рацемической смеси, хотя известно, что лишь один из энантиомеров обладает необходимой активностью (эутомер), в то время как второй (дистомер) или не обладает активностью или может оказывать негативное воздействие. В последнее время наблюдается тенденция к увеличению доли препаратов, действующим началом которых является активный; энантиомер. Развитие методов разделения и определения чрезвычайно важно для контроля состава, и энантиомерной чистоты синтезируемых и внедряемых в медицинскую практику лекарственных средств, а* также их фармакологических и фармакокинетических исследований.

В настоящее время'механизм энaнтиopacпoзнaвaнияv является недостаточно изученным, еще не разработаны, математические методы достоверного прогнозирования энантиораспознавательной-способности хирального селектора, поэтому задача аналитико-экспериментального поиска новых высокоселективных по отношению к структурно различным соединениям хиральных селекторов является актуальной.

Цель работы заключалась в выявлении возможности использования макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина в КЭ и выборе условий электрофоретического разделения энантиомеров биологически активных соединений кислотного характера; повышении селективности разделения многокомпонентных смесей (на примере ароматических кислот и фенолов) в присутствии ахиральной добавки - лигнинов. Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:

• изучения электрофоретических свойств макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и лигнинов в качестве модификаторов фонового электролита;

• изучения влияния содержания эремомицина в фоновом электролите на разделение тестовых соединений (Ы-производные и свободные аминокислоты, профены, а-гидроксикислоты и др.) в различных режимах КЭ;

• исследования свойств капилляров, модифицированных динамически (хитозаном или эремомицином) или ковалентно (3-аминопропилтриметоксисиланом, 3-глицидилоксипропилтриэтоксисиланом и эремомицином) и особенностей энантиоразделения тестовых соединений в этих капиллярах с использованием эремомицина в качестве хирального селектора;

• сравнения характеристик хирального разделения профенов в КЭ и ВЭЖХ в присутствии эремомицина;

• изучения влияния лигнинов на селективность разделения ароматических кислот.

Научная новизна. Показана эффективность макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина в качестве хирального селектора в КЭ. Установлен характер влияния эремомицина на величину и направление электроосмотического потока. Получены количественные характеристики адсорбции эремомицина на поверхности кварцевого-капилляра, что позволило разработать способ динамического модифицирования капилляра эремомицином. Выбраны условия модифицирования капилляров хитозаном и 3-аминопропилтриметоксисиланом. Показана эффективность эремомицина для энантиоселективного разделения энантиомеров различных классов соединений и выбраны 5 условия (состав и рН фонового электролита, концентрация ХС, напряжение, условия модифицирования поверхности капилляра) их определения. Выполнена иммобилизация эремомицина на поверхности капилляра через 3-глицидилоксипропилтриэтоксисилан. Показаны перспективы, использования« предложенных модифицированных капилляров для быстрого и чувствительного определения энантиомеров профенов и варфарина в лекарственных препаратах.

Впервые установлена эффективность добавки диоксанлигнина ели и лигносульфоната для улучшения электрофоретического разделения смесей органических соединений кислотного характера. Установлено влияние типа лигнина и состава на селективность разделения фенолов, и выбраны условия разделения их смесей.

Практическая значимость. Предложены новые способы динамического и ковалентного модифицирования капилляров, позволяющие уменьшить адсорбцию эремомицина на поверхности капилляра. Разработаны методики электрофоретического разделения и определения энантиомеров ибупрофена, флурбипрофена, кетопрофена и варфарина с использованием кварцевого и модифицированных капилляров. Предложенные методики использованы для определения ибупрофена, флурбипрофена, кетопрофена и варфарина в фармацевтических композициях (таблетках, гелях). Предложен экспрессный способ электрофоретического определения фенолов в загрязненных водах и фармацевтических композициях с использованием диоксанлигнина ели в качестве модификатора фонового электролита.

Автор выносит на защиту:

1. Результаты исследования влияния эремомицина на электроосмотический поток, а также на электрофоретическое поведение и энантиоразделение ряда ароматических кислот в варианте капиллярного электрофореза под давлением.

2. Результаты исследования адсорбции эремомицина на кварцевом и модифицированных гидрофильными соединениями капиллярах.

3. Данные по разделению энантиомеров ароматических кислот в динамически и ковалентно модифицированных гидрофильными соединениями капиллярах.

4. Условия эффективного определения энантиомеров некоторых биологически активных соединений в лекарственных препаратах в присутствии эремомицина в различных вариантах капиллярного электрофореза.

5. Особенности и параметры разделения некоторых ароматических кислот, в том числе фенолов, в присутствии различных типов лигнинов и условия определения фенола и его производных в воде и лекарственных препаратах.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на II Всероссийской конференции «Аналитика России» по аналитической химии с международным участием (к юбилею академика Ю.А.Золотова) (Краснодар, 2007),

Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия (К 100-летию th со дня рождения профессора A.B. Киселева)» (Москва, 2008), 16 International Symposium on tb

Capillary Electroseparation Techniques (Catania, Italy, 2008), 5 Conference by Nordic Separation Science Society (Tallinn, Estonia, 2009), III Всероссийской конференции "Аналитика России" с международным участием (к 175-летию со дня рождения Д.И. Менделеева) (Краснодар, 2009), I Всероссийской конференции «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, 2009), «Ломоносов - 2009» (Москва, 2009), «Ломоносов - 2010» (Москва, 2010), 17th International Symposium on Capillary Electroseparation Techniques (Baltimore, USA, 2010), I Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез" (Краснодар, 2010).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 17 печатных работах: в 5 статьях и 12 тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав экспериментальной части, выводов, списка литературы (110 наименования). Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 69 рисунков и 46 таблиц, имеется 2 приложения.

выводы

1. Показано влияние добавки эремомицина на величину и направление электроосмотического потока. Проведена оценка параметров адсорбции эремомицина на поверхности кварцевого капилляра. Установлено, что при содержании эремомицина в фоновом электролите более 0,8 мМ происходит обращение электроосмотического потока, а при с>5 мМ образуется устойчивое динамическое покрытие капилляра.

2. Установлено, что эремомицин обладает высокой энантиораспознавательной способностью по отношению к органическим анионным соединениями (профенам, производным аминокислот, глутаминовой и аспарагиновой кислотам, варфарину, кумахлору). Выбраны условия разделения энантиомеров (состав и рН фонового электролита, концентрация хирального селектора, добавка органических модификаторов, длина капилляра и напряжение).

3. Предложены способы модифицирования поверхности кварцевого капилляра хитозаном, 3-аминопропилтриметоксисиланом, 3-глицидилоксипропилтриэтоксисиланом и эремомицином. Показано, что модифицирование капилляра уменьшает адсорбцию эремомицина и улучшает воспроизводимость параметров электрофоретического разделения.

4. Показано, что при использовании модифицированных капилляров увеличивается эффективность, и в 5-20 раз уменьшается необходимая концентрация хирального селектора и значительно сокращается время миграции исследованных кислот (профенов и миндальной, 2-феноксипропионовой, 3-фенилмасляной, а-метоксифенилуксусной, 2-фенилпропионовой кислот).

5. Разработаны методики и проведено определение ибупрофена, кетопрофена, флурбипрофена и варфарина и их энантиомерного состава в лекарственных препаратах.

6. Обнаружено значительное улучшение эффективности, селективности, а также воспроизводимости параметров разделения смеси фенолов при использовании лигнинов в качестве модифицирующей добавки фонового электролита. Разделение фенола, 2-хлорфенола, 3-хлорфенола, 4-хлорфенола, 2,4-дихлорфенола, пентахлорфенола достигается за 10 минут.

1. Карцова, JI.A., Сидорова, А.А., Иванова, А.С. Электрофоретическое определение биогенных аминов в биологических жидкостях // Журн. аналит. химии. 2007. Т.62. С. 106671.

2. Chankvetadze, В. Separation selectivity in chiral capillary electrophoresis with charged selectors //J. Chromatogr. A. 1997. V.792. P.269-95.

3. Soga, Т., Ross, G.A. Simultaneous determination of inorganic anions, organic acids, amino acids and carbohydrates by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1999. V.837. P.231-9.

4. Jorgenson, J.W., Lukacs, K.D. Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries // Anal. Chem. 1981. V.53. P.1298-302.

5. Liu, X., Frank, H. Separation of chlorophenols by capillary zone electrophoresis. The influence of pH of the electrophoretic buffer on selectivity // J. High Resol. Chromatogr. 1998. Y.21. P.309-14.

6. Fanali, F., Cartoni, C., Desiderio, C. Chiral separation of newly synthesized arylpropionic acids by capillary electrophoresis using cyclodextrins or a glycopeptide antibiotic as chiral selectors // Chromatographia. 2004. V.54. P.87-92.

7. Desiderio, C., Polcaro, C.M., Padiglioni, P., Fanali, F. Enantiomeric separation of acidic herbicides by capillary electrophoresis using vancomycin as chiral selector // J. Chromatogr. A. 1997. V.871. P.503-13.

8. Okada, T. Non-aqueous capillary electrophoretic separation of Bronsted acids as heteroconjugated anions // J. Chromatogr. A. 1997. V.771. P.275-84.

9. Riekkola, M.-L., Wiedmer, S.K., Valko, I.E., Siren, H. Selectivity in capillary electrophoresis in the presence of micelles, chiral selectors and non-aqueous media // J. Chromatogr. A. 1997. V.792. P.13-35.

10. Kang, J.-W., Yang, Y.-T., You, J.-M., Ou, Q.-Y. Fast chiral separation of amino acid derivatives and acidic drugs by co-electroosmotic flow capillary electrophoresis with vancomycin as chiral selector// J. Chromatogr. A. 1998. V.825. P.81-7.

11. Ong, C.P., Ng, C.L., Chong, N.C., Lee, H., Li, S.F.Y. Retention of eleven priority phenols using micellar electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 1990. V.516. P.263-7.

12. Пирогов, A.B., Степанов, K.B., Шпигун, O.A. Изменение электрофоретической подвижности фенолов при использовании) добавок ионенов в буферный электролит // Журн. аналит. химии. 2003. Т.58. С.478-84.

13. Horvath, J., Dolnik, V. Polymer wall coatings for capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2001. Y.22. P.644-55.

14. Cifuentes, A., Canalejas, P., Ortega, A., Diez-Masa, J.C. Treatments of fused-silica capillaries and their influence on the electrophoretic characteristics of these columns before and after coating // J. Chromatogr. A. 1998. V.823. P.561-71.

15. Towns, J.K., Bao, J., Regnier, F.E. Synthesis and evaluation of epoxy polymer coatings for the analysis of proteins by capillary zone electrophoresis // J. Chromatogr. 1992. V.599. P.227-37.

16. Regnier, F., Noel, R. Glycerolpropylsilane bonded phases in the steric exclusion chromatography of biological macromolecules // Chromatogr. Sci. 1976. V.14. P.316-20.

17. Shao, X., Shen, Y., O'Neill, K., Lee, M.L. Capillary electrophoresis using diol-bonded fused-silica capillaries // J. Chromatogr. A. 1999. V.830. P.415-22.

18. Cobb, K.A., Dolnik, V., Novotny, M. Electrophoretic separations of proteins in capillary with hydrolitically-stable surface structure // Anal. Chem. 1990. V.62. P.2478-83.

19. Nakatani, M., Skibukawa, A., Nakagawa, T. Preparation and characterization of a stable polyacrylamide sieving matrix-filled capillary for high-performance capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1994. V.661. P.315-21.

20. Guo, Y., Imahori, G., Colon, L. Hydrolytically stable amino-silica glass coating material for manipulation of the electroosmotic flow in capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1996. V.744. P. 17-29.

21. Hjerten, S. High-performance electrophoresis elimination of electroendosmosis and solute adsorption. // J. Chromatogr. 1985. V.347. P.191-8.

22. Wang, Z., Wang, J., Hu, Z., Kang, J. Enantioseparation by CE with vancomycin as chiral selector: Improving the separation performance by dynamic coating of the capillary with poly(dimethylacrylamide) // Electrophoresis. 2007. V.28. P.938-43.

23. Giibitz, G., Schmid, M.G. Chiral separation by capillary electromigration techniques // J. Chromatogr. A. 2008. V.1204. P. 140-56.

24. Chankvetadze, B. Separation of enantiomers with charged chiral selectors in CE // Electrophoresis. 2009. V.30. P.S211-21.

25. Ycspalec, R., Bocek, P. Chiral separations in. capillary electrophoresis // Chem. Rev. 2000. V.100. P.3715-53.

26. Комарова, H.B., Каменцев, Я.С. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза "Капель". СПб.: ООО "Веда", 2006. 212 с.

27. Armstrong, D.W., Rundlett, K.L., Reid; III G.L. Use of a macrocyclic antibiotic, rifamycin B, and indirect detection for the resolution of racemic amino alcohols by CE // Anal. Chem. 1994. V.66. P.1690-5.

28. Ward, T.J., Dann, III C., Blaylock, A. Enantiomeric resolution using tlir macrocyclic antibiotics rifamycin В and rifamycin SV as chiral selectors in capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1995. V.715. P.337-44.

29. Armstrong, D.W., Tang, Y., Chen, S., Zhou, Y., Bagwill, C., Chen, J.-R. Macrocyclic antibiotics as a new class of chiral selectors for liquid chromatography // Anal. Chem. 1994. V.66. P.1473-84.

30. Nishi, H., Nakamura, K., Nakai, H., Sato, T. Enantiomer separation by capillai-y electrophoresis using DEAE-Dextran and aminoglycosidic antibiotics // Chromatographia. 1996. V.43. P.426-30.

31. Chen, В., Du, Y., Wang, H. Study on enantiomeric separation of basic drugs by NACE in methanol-based medium using erythromycin lactobionate as a chiral selector // Electrophoresis. 2010. V.31. P.371-7.

32. Hou, J., He, Т., Han, X., Du, X., Мао, X., Deng, H., Gao, J. Chiral Separation of Erythromycin as a New Chiral Selector on CE. // Chin. Chem. Lett. 2003. V.14. P.280-2.

33. Chen, В., Du, Y., Li, P. Investigation of enantiomeric separation of basic drugs by capillary electrophoresis using clindamycin phosphate a a novel chiral selector // Electrophoresis. 2009. V.30. P.2747-54.

34. Rundlett, K.L., Gasper, M.P., Zhou, E.Y., Armstrong, D.W. Capillary electrophoretic enantiomeric separations using the glycopeptide antibiotic, teicoplanin. // Chirality. 1996. V.8. P.88-107.

35. Gerhard, U., Mackay, J.P., Maplestone, R.A., Williams, D.H. The role of the sugar and chlorine substituents in the dimerization of vancomycin antibiotics // J. Am, Chem. Soc. 1993. V.l 15. P.232-7.

36. Slama, I., Dufresne, C., Jourdan, E., Fahrat, F., Villet, A., Ravel, A., Grosset, C., Peyrin, E. Vancomycin Dimerization and Chiral Recognition Studied by High-Performance Liquid' Chromatography // Anal. Chem. 2002. V.74. P.5205-11.

37. Slama, I., Jourdan, E., Grosset, C., Ravel, A., Villetm A., Peyrinm E. Role of the vancomycin-ristocetin heterodimerization on the enantioselectivity of D,L-tryptophan and D,L-dansyl tryptophan // J. Chromatogr. B. 2003. V.795. P. 115-21.

38. Armstrong, D.W., Rundlett K.L., Chen, J.-R. Evaluation of the macrocyclic antibiotic vancomycin as a chiral selector for capillary electrophoresis // Chirality. 1994. V.6. P.496-504.

39. Armstrong, D.W., Gasper, M.P., Rundlett, K.L. Highly enantioselective capillary electrophoretic separations with dilute solutions of the macrocyclic antibiotic ristocetin A // J. Chromatogr. A. 1995. V.689. P.285-304.

40. Armstrong, D.W., Rundlett, K.L. CE resolution of neutral and anionic racemates with glycopeptide antibiotics and micelles // J. Liq. Chrom. 1995. V.18. P.3659-74.

41. Rundlett, K.L., Armstrong, D.W. Effect of micelles and mixed micells on efficiency and selectivity of antibiotic-based capillary electrophoretic enantioseparations // Anal. Chem. 1995. V.67. P.2088-95.

42. Vespalec, R., Corstjens, H., Billiet, H.A.H., Frank, J., Luyben, K.C.A.M. Enantiomeric separation of sulfur- and selenium-containing amino acids by capillary electrophoresis using vancomycin as a chiral selector // Anal. Chem. 1995. Y.67. P.3223-8.

43. Arai, T., Nimura, N., Kinoshita, T. Investigation of enantioselective separation of quinolonecarboxilic acid by capillary zone electrophoresis using vancomycin as chiral selector // J. Chromatogr. A. 1996. V.739. P.303-11.

44. Fanali, F., Desiderio, C. Use of vancomycin as chiral selector in capillary electrophoresis. Optimization and quantitation of loxiglumide enantiomers in pharmaceuticals // J. High Resol. Chromatogr. 1996. V.19. P.322-6.

45. Strege, M.A., Huff, B.E., Risley, D.S. Evaluation of macrocyclic antibiotic A82846B as a chiral selector for capillary electrophoresis separations // LC-GC. 1996. V.14. P. 144-50.

46. Vespalec, R., Billiet, H.A.H., Frank, J., Bocek, P. Vancomycin as a chiral selector in capillary electrophoresis: An appraisal of advantages and limitations // Electrophoresis. 1996. V.17. P.1214-21.

47. Wan, H., Blomberg, L.G. Enantioseparation of amino acids and dipeptides using vancomycin as chiral selector in capillary electrophoresis // Electrophoresis. 1996. V.17. P. 193844.

48. Wan,* H., Blombeig, L. Enantiomeric separation by capillary electrophoresis of di- and tri-peptides derivatized with' 9-fluorenylmethyl chloroformate using vancomycin as chiral selector//J. Micro. SeP.l996. V.8. P.339-44.

49. Ward, T.J., Dann, III C., Brown, A.P. Separation of enantiomers using vancomycin in a countercurrent process by supression of electrosmosis // Chirality. 1996. V.8. P.77-83.

50. Fanali, S., Desiderio, C., Aturki, Z. Enantiomeric resolution study by capillary electrophoresis. Selection of the appropriate chiral selector // J. Chromatogr. A. 1997. V.772. P. 185-94.

51. Sharp, V.S., Risley, D.S., McCarthy, A., Huff, B.E., Strege, M.A. Evaluation of a new macrocyclic antibiotic as a chiral selector for use in capillary electrophoresis // J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 1997. V.20. P.887-98.

52. Ekborg-Ott, K.H., Zientara, G.A., Schneiderheinze, J.M., Gahm, K., Armstrong D.W. Avoparcin, a new macrocyclic antibiotic chiral run buffer additive for capillary electrophoresis // Electrophoresis. 1999. V.20. P.2438-57.

53. Fanali, S., Aturki, Z., Desiderio, C., Righetti, P.G. Use of MDL 63 246 (Hepta-Tyr) antibiotic in capillary zone electrophoresis II. Chiral resolution of a-hydroxy acids // J. Chromatogr. A. 1999. V.838. P.223-35.

54. Oswald, T.M., Ward, T.J. Enantioseparations with the macrocyclic antibiotic ristocetin A using a countercurrent process in CE // Chirality. 1999. V.l 1. P.663-8.

55. Risley, D.S., Trelli-Seifert, L., McKenzie, Q.J. Enantiomeric separations of dansyl amino acids using the macrocyclic antibiotic A35512B as a chiral selector in capillary electrophoresis // Electrophoresis. 1999. V.20. P.2749-53.

56. Bednar, P., Aturki, Z., Stransky, Z., Fanali, S. Chiral analysis of UV nonabsorbing compounds by capillary electrophoresis using macrocyclic antibiotics: 1. Separation of aspartic and glutamic acid enantiomers // Electrophoresis. 2001. V.22. P.2129-35.

57. Fanali, F., Cartoni, C., Aturki, Z. Enantioseparation of S-carboxymethylcysteine and N-acetamidocarboxymethylcysteine by capillary electrophoresis using vancomycin // J. SeP.Sci. 2001. V.24. P.789-94.

58. Ha, P., Van Schepdael, A., Roets, E., Hoogmartens, J. Investigating the potential of erythromycin and derivatives as chiral selector in capillary electrophoresis // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. V.34. P.861-70.

59. Jiang, Z., Kang, J., Bischoff, D., Bister, Bi, Sussmuth, R.D., Schurig, V. Evaluation of balhimycin as ai chiral selector for enantioresolution by capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2004. V.25. P.2687-92.

60. Fantacuzzi, M., Bettoni, G., D'Orazio, G., Fanali, S. Enantiomeric separation of some demethylated analogues of clofibric acid by capillary zone electrophoresis and', nano-liquid chromatography // Electrophoresis. 2006. V.27. P. 1227-36.

61. Ward, T.J., Oswald, T.M. Enantioselectivity in capillary electrophoresis using the macrocyclic antibiotics // J. Chromatogr. A. 1997. V.792. P.309-25.

62. Desiderio, C., Fanali, S. Chiral analysis by capillary electrophoresis using antibiotics as chiral selector//J. Chromatogr. A. 1998. V.807. P.37-56.

63. Fanali, S., Aturki, Z., Desiderio, C., Bossi, A., Righetti, P.G. Use of a Hepta-tyr glycopeptide antibiotic as chid selector in capillary electrophoresis // Electrophoresis. 1998. V.19. P. 1742-51.

64. LeTourneau, D.L., Allen, N.E. Use of capillary electrophoresis to measure dimerization of glycopeptide antibiotics // Anal. Biochem. 1996. V.246. P.62-6.

65. Gasper, M.P., Berthod, A., Nair, U.B., Armstrong, D.W. Comparison and modeling study of vancomycin, ristocetin A, and teicoplanin for CE enantioseparations // Anal. Chem. 1996. V.68. P.2501-14.

66. Fanali, S., Crucianelli, M., De Angelis, F., Presutti, C. Enantioseparation of amino acid derivatives by capillary zone electrophoresis using vancomycin as chiral selector // Electrophoresis. 2002. V.23. P.3035-40.

67. Fanali, S., Desiderio, C., Schulte, G., Heitmeier, S., Strickmann, D., Chankvetadze, B., Blaschke G. Chiral capillary electrophoresis-electrospray mass spectrometry coupling using vancomycin as chiral selector // J. Chromatogr. A. 1998. V.800. P.69-76.

68. Du, Y., Chen, B. Evaluation of the enantioseparation capability of the novel chiral selector clindamycin phosphate towards basic drugs by micellar electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 2010. V.1217. P.1806-12.

69. Huang, X., Wang, Q., Huang, B. Preparation and evaluation of stable coating for capillary electrophoresis using coupled chitosan as coated modifier // Talanta. 2006. V.69. P.463-8.

70. Liu, Z., Otsuka, K., Terabe, S. Chiral separation by open tubular capillary electrochromatography with adsorbed avidin as a stationary phase // J. Sep. Sci. 2001. V.24. P. 17-26.

71. Giibitz, G., Schmid, M.G. Recent advances in chiral separation principles in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography // Electrophoresis. 2004. V.23. P.3981-96.

72. Du, Y.X., Honda, S., Taga, A., Liu, W.Y., Suzuki, S. A novel polybrene/chondroitin sulfate C double coated capillary and its application in capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2002. V.23. P.456-61.

73. Du, Y., Taga, A., Suzuki, S., Liu, W., Honda, S. Colominic acid: a novel chiral selector for capillary electrophoresis of basic drugs // J. Chromatogr. A. 2002. V.962. P.221-31.

74. Lu, H.-J., Ou, Q.-Y. Preparation and evaluation of open tubular electrochromatography column with derivated polysiloxane as stationary phase // Chem. J. Chin. Univ. 2002. V.23. P.30-3.

75. Wang, Y., Zeng, Z., Guan, N., Cheng, J. Sol-gel technique for the preparation of cyclodextrin derivative stationary phase in open-tubular capillary electrochromatography // Electrophoresis. 2001. V.22. P.2167-72.

76. Valtcheva, L., Mohammad, J., Pettersson, G., Hjerten, S. Chiral separation of beta-blockers by high-performance capillary electrophoresis based on nonimmobilized cellulase as enantioselective protein//J. Chromatogr. 1993. V.638. P.263-7.

77. Poinsot, V., Bayle, C., Couderc, F. Recent advances in amino acid analysis by capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2003. V.24. P.4047-62.

78. Gong, X.Y., Kuban, P., Scholer, A., Hauser, P.C. Determination of a-hydroxybutyric acid in clinical samples using capillary electrophoresis with contactless conductivity detection // J. Chromatogr. A. 2008. V.1213. P. 100-4.

79. Pormsila, W., Gong, X.Y., Hauser, P.C. Determination of the enantiomers of a -hydroxy-and a-amino acids in capillary electrophoresis with contactless conductivity detection // Electrophoresis. 2010. V.31. P.2044-8.

80. Ali, I., Kumerer, K., Aboul-Enein, H.Y. Mechanistic principles in chiral separations using liquid chromatography and capillary electrophoresis // Chromatographic 2006. V.63. P.295-307.

81. Armstrong, D.W., Nair, U.B. Capillary electrophoretic enantioseparations using macrocyclic antibiotics as chiral selectors // Electrophoresis. 1997. V.18. P.2331-42.

82. Ward, T.J., Farris, III A.B., Woodling, K. Synergistic chiral separations using the glycopeptides ristocetin A and vancomycin // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V.48. P. 16374.

83. Trelli-Seifert, L.A., Risley, D.S. Capillary Electrophoretic Enantiomeric Separations of Nonsteroidal Antiinflammatory Compounds Using the Macrocyclic Antibiotic Actaplanin A and 2-Methoxyethanol//J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 1998. V.21. P.299-313.

84. Maier, V., Petr, J., Knob, R., Horakova, J., Sevcik, J. Electrokinetic partial filling technique as a powerful tool for enantiomeric separation of DL-lactic acid by CE with contactless conductivity detection // Electrophoresis. 2007. V.28. P.1815-22.

85. Hu, C.-q., Hong, J.-w. Investigation on the chiral recognition site of enantioselective separation of ofloxacin by capillary electrophoresis using vancomycin as a chiral selector // Acta Pharm Sin. 2009. V.44. P.905-10.

86. Gao, W., Kang, J. Separation of atropisomers of anti-hepatitis drug dimethyl diphenyl bicarboxilate analogues by capillary electrophoresis with vancomycin as the chiral selector // J. Chromatogr. A. 2006. V.1108. P.145-8.

87. Fang, N., Zhang, H., Li, H.-W., Yeung, E.S. Mobility-based wall adsorption isotherms for comparing capillary electrophoresis with single-molecule observations // Anal. Chem. 2007. V.79. P.6047-54.

88. Berdnikova, T.F., Shashkov, A.S., Katrukha, G.S., Lapchinskaya, O.A., Yurkevicha, N.V., Grachev, A.A., Nifant'ev, N.E. The structure of antibiotic eremomycin В // Rus. J. Bioorg. Chem. 2009. V.53. P.497-503.

89. Gause, G.F., Brazhnikova, M.G., Lomakina, N.N., Berdnikova, T.F., Fedorova, G.B., Tokareva,- N.L., Borisova, V.N., Batta, G.Y. Eremomycin new glycopeptide antibiotic: Chemical properties and structure // J. Antibiot. 1989. V.XLII. P.1790-9.

90. Ward, T.J., Farris, III A.B. Chiral separations using the macrocyclic antibiotics: a review //J. Chromatogr. A. 2001. V.906. P.73-89.

91. Good, N., Winget, G., Winter, W., Connolly, Т., Izawa, S., Singh, R. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research // Biochemistry. 1966. V.5. P.466-77.

92. Буданова, Н.Ю., Шаповалова, E.H., Шпнгун, О.А. Изучение возможности использования хитозана в капиллярном электрофорезе // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2006. V.47. Р. 177-81.

93. Sun, P., Landman, A., Hartwick, R.A. Chitosan coated capillary with reversed electroosmotic flow in capillary electrophoresis for the separation of basic drugs and proteins // J. Microcol. SeP.1994. V.6. P.403-7.

94. Боголицын, К.Г., Резников, В.М. Химия сульфитных методов делигнификации древесины. М.: Экология, 1994. 289 с.

95. Hamoudova, R., Pospisilova, M. Determination of ibuprofen and flurbiprofen in pharmaceuticals by capillary zone electrophoresis // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. V.41. P.1463-7.

96. Blanco, M., Coello, J., Iturriaga, H., Maspoch, S., Perez-Maseda, C. Chiral and nonchiral determination of ketoprofen in pharmaceuticals by capillary zone electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1998. V.799. P.301-7.