Лазерное детектирование пикоколичеств вещества по изменению показателя преломления тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ик^ТЙТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И АТОМНОЙ ФИЗИКИ

УДК 535.314,535.417, 543.45

КАСЮТИЧ Василий Леонтьевич

ЛАЗЕРНОЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЕ ПИКОКОЛИЧЕСГВ ВЕЩЕСТВА ПО ИЗМЕНЕНИЮ ПОКАЗАТЕЛЯ ПРЕЛОМЛЕНИЯ

01.04.05 - Оптика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Минск-1998

Работа выполнена в Институте молекулярной и атомной физики Национальной Академии Наук Беларуси.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

академик HAH Беларуси, доктор физико-математических наук, профессор Бураков B.C.

доктор физико-математических наук, профессор Кононенко В.К.

доктор физико-математических наук, профессор Фомин H.A.

Оппонирующая организация - Белорусский государственный

университет

Защита состоится "¿яl9 " ^MUULii 199/ ;едании совета по защите диссертаций Д G 1.01.01 m

СО

г. в на

заседании совета по защите диссертацйй Д 01.01.01 при Институте молекулярной и атомной физики HAH Беларуси (220072, г. Минск, пр. Ф. Скорины, 70; тел. 284-23-41).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной и атомной физики HAH Беларуси.

Автореферат разослан " / у " ¿гЮ,.<и/1Л 1998 г.

Учёный секретарь совета по защите диссертаций, кандидат физ.-мат. наук

В.А. Кузьмицкий

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации

Оптические методы получили широкое распространение в исследованиях и контроле различных процессов и объектов в физике, химии, медицине, экологии и других областях. Особенно эффективны оптические методы в сочетании с методами разделения и анализа веществ на основе капиллярного электрофореза и в системах проточно-инжекционного анализа. Многообразие анализируемых веществ, необходимость проведения экспресс-анализов требуют разработки приборов, позволяющих проводить исследование и определение полного состава микрообъёмов проб вещества за короткое время, что возможно с помощью оптических детекторов в составе приборов на основе высокоэффективного капиллярного электрофореза, микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа.

В оптических методах регистрации и исследовании веществ на основе тепловой линзы, в оптических детекторах для микроколоночной жидкостной хроматографии и приборов капиллярного электрофореза, при анализах физических свойств жидкостей широко применяются кюветы цилиндрической формы (капилляры). В настоящее время в высокоэффективном капиллярном электрофорезе разделение веществ и их детектирование проводится, в основном, в капиллярах диаметром от десятков до нескольких сотен микрометров. В микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии используются кварцевые капилляры с диаметром в несколько сотен микрометров. Однако с целью уменьшения расходов реактивов, повышения эффективности разделения веществ предпочтительны колонки с меньшим диаметром, что соответственно ведёт к уменьшению размеров кювет оптических детекторов.

При анализе неизвестных проб важно зарегистрировать все вещества, содержащиеся в образце. Единственным из известных принципов оптического детектирования, удовлетворяющих этому требованию, является детектирование по изменению показателя преломления или рефрактометрическое детектирование.

Развитие капиллярного электрофореза, миниатюризация жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа, требуют развития метода детектирования по показателю преломления в ультрамалых объёмах порядка единиц и долей нанолитров. Исследования по рефрактометрическому детектированию в таких объёмах были начаты во второй половине 80-х годов. Однако до настоящего времени серийно выпускаемых приборов с рефрактометрическими детекторами в ультрамалых объёмах не существует, что обусловлено рядом причин. К основным из них относятся: отсутствие однозначных критериев по выбору оптимальных условий, обеспечивающих достижение минимальных пределов рефрактометрического детектирования вещества в капиллярах; сложность юстировки и

эксплуатации предлагаемых оптических схем; недостаточное понимаш физических процессов и факторов, ограничивающих достижение мин мальных пределов рефрактометрического метода детектирования вещест Рассмотрение указанных вопросов является актуальной задачей. Связь с крупными научными программами, темами Результаты, положенные в основу настоящей диссертации, были п< лучены при проведении работ в рамках Республиканской государственнс научно-технической программы "Здоровье" по х/д 236-93 "Разработать изготовить два опытных образца прибора для капиллярного электрофор за с лазерным рефрактометрическим детектором для контроля качестп пищевых продуктов, лекарств, витаминов и других биологически активнь: веществ" (1993-1995 г.г.) и темы Белорусского республиканского фон/ фундаментальных исследований (№ М96-11 от 17.02.1997 г.) "Комплексно применение методов спектроскопии и капиллярного электрофореза для » следований продуктов реакций в лазерной плазме". Цель и задачи исследования Целью диссертационной работы являлось выяснение основных закс номерностей и определение характеристик процессов, происходящих пр лазерном детектировании веществ по изменению показателя преломленн в жидкой фазе и ультрамалых объёмах, для оценки потенциальных во: можностей создания рефрактометрических детекторов для приборов кг пиллярного электрофореза, микроколоночной жидкостной хроматографи и проточно-инжекционного анализа.

Для выполнения поставленной цели исследования требовалось решит следующие задачи:

♦ выяснить особенности распространения лазерного пучка через кювет цилиндрического вида, провести оценку влияния характеристик кюветь свойств анализируемого вещества в жидкой фазе и параметров лазернс го источника излучения на минимальный предел детектирования веще ства по показателю преломления;

♦ исследовать оптимальные способы стабилизации температуры кюветь оценить влияние градиентов температуры в капилляре на эффективност разделения и чувствительность детектирования при разделении вещест методом высокоэффективного капиллярного электрофореза;

♦ оптимизировать метод рефрактометрического детектирования веществ последующей разработкой и созданием автоматизированного прибор для разделения веществ методом капиллярного электрофореза и их де тестирования по показателю преломления, провести апробацию прибо ра для контроля и определения ультрамалых количеств веществ;

♦ разработать рефрактометрический детектор на основе лазерного ис точника инфракрасного излучения для высокоэффективной жидкостно] хроматографии и проточно-инжекционного анализа, апробировать де

тектор для определения веществ в растворе, контроля скорости потоков, флуктуации давления и температуры в ультрамалых объёмах; ♦ определить дальнейшие пути и методы повышения чувствительности рефрактометрического детектирования веществ в ультрамалых объёмах.

Объект и предмет исследования

Объектом исследования являлось вещество, находящееся в жидкой фазе и прозрачное на длине волны зондирующего оптического излучения, а предметом исследования - распространение лазерного пучка через кювету цилиндрического вида, заполненную анализируемым веществом, и особенности детектирования веществ по изменению показателя преломления в условиях применения методов капиллярного электрофореза, микроколоночной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа.

Методология и методы проведенного исследования

Проведено комплексное исследование по оптимизации метода детектирования веществ по показателю преломления в кювете цилиндрического вида с размерами, сравнимыми с диаметром зондирующего лазерного пучка. Оценки чувствительности разработанных рефрактометрических детекторов выполнялись в сочетании с методами разделения и определения веществ на основе высокоэффективного капиллярного электрофореза, микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа.

Научная новизна и значимость полученных результатов

Научная новизна и значимость полученных результатов состоит в следующем:

♦ Впервые определено, что максимальные чувствительность и динамический диапазон лазерного рефрактометрического детектирования вещества в капилляре достигаются при распространении лазерного пучка вне оси капилляра и регистрации смещения образованной интерференционной полосы, имеющей максимальные интенсивность и угол отклонения, причём показатель преломления материала капилляра должен быть больше показателей преломления вещества и среды, окружающей капилляр.

♦ Впервые выяснено, что при рефрактометрическом детектировании веществ в капилляре путём регистрации смещения интерференционной по-пгосы, имеющей максимальные интенсивность и угол отклонения, минимальный предел количества детектируемого вещества уменьшается с уве-пичением отношения внутреннего радиуса канала капилляра к его внешнему радиусу, увеличением отношения показателя преломления анализируемой жидкости к показателю преломления материала капилляра, а также определяется соотношением поперечных размеров лазерного пучка и капилляра.

♦ Впервые показано, что различие условий отвода тепла от участков сапилляра ухудшает эффективность разделения и чувствительность детек-гирования в высокоэффективном капиллярном электрофорезе, особенно

для веществ с коэффициентами диффузии порядка 10"10 м2/с, а повышение чувствительности рефрактометрического детектирования вещества в к а пилляре обеспечивается при жидкостном термостатировании капилляра i зондировании капилляра пучком лазерного полупроводникового диода генерирующего в одномодовом реж1ше и имеющего гауссов профша пучка в плоскости, перпендикулярной оси капилляра.

♦ Разработан прибор для капиллярного электрофореза с лазерные рефрактометрическим детектором, юстировка, настройка и работа кото poro выполняются в автоматическом режиме как при замене капилляра т новый, так и при переводе фотоприёмного устройства в точку максимальной чувствительности рефрактометрического детектирования веществ пр> смене электролитов и включении высокого напряжения.

♦ Впервые предложено для повышения чувствительности рефрактометрического детектирования веществ в капиллярном электрофорезе регистрировать изменение показателя преломления жидкости в капилляре с помощью двух пространственно совпадающих лазерных пучков с различными длинами волн, а концентрацию вещества в жидкости определять после исключения из результатов измерений приращений показателя преломления, обусловленных флуктуациями температуры зондируемого объёма.

Практическая значимость полученных результатов

Практическая значимость полученных результатов исследований определяется возможностью их использования для разработки и создания компактных автоматизированных детекторов по показателю преломления в ультрамалых объёмах с лазерными источниками излучения для приборов капиллярного электрофореза, микроколоночной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа. Результаты расчётов имеют практическое значение для оптимизации и повышения чувствительности рефрактометрических детекторов.

На основании результатов исследований создан автоматизированный прибор для капиллярного электрофореза с рефрактометрическим детектором на основе полупроводникового лазера. По сравнению с существующими аналогами данный прибор характеризуется следующими особенностями: возможностью разделения методом капиллярного электрофореза:« регистрации простых и сложных веществ без их дериватизации и подготовки проб с инжектируемым объёмом на уровне десятка нанолит-ров, концентрационной чувствительностью ЮМ О4 моль/л и зондируемым объёмом около 0,1 нл.

Экономическая значимость результатов проведенных исследований и экспериментов заключается в том, что разработанные детектор по показателю преломления на основе полупроводникового лазера, прибор капиллярного электрофореза с рефрактометрическим детектором являются полностью автоматизированными и могут использоваться для анализа ве-

ществ в жидкой фазе объёмом в несколько десятков нанолитров. Применение юовет с внутренним диаметром меньше сотни микрометров позволит уменьшить количество используемых химических реактивов при проведении анализов и исследований, снизить расходы на проведение мероприятий по охране окружающей среды.

Разработанное устройство для визуализации инфракрасного излучения на основе жидкокристаллической плёнки позволяет проводить настройку и юстировку детекторов с источниками оптического излучения в ИК области без привлечения дорогостоящих тепловизоров и фоточувствительных матриц с переносом заряда.

На основе проведенных исследований возможно дальнейшее развитие приборов доя капиллярного электрофореза с одновременным применением метода рефрактометрического детектирования и других оптических методов регистрации вещества, таких, как абсорбционное и флуоромет-рическое детектирование, что позволит повысить чувствительность регистрации и расширить спектр их применения для разделения и определения малых количеств веществ в объектах окружающей среды, выполнения анализов в химии, физике, биологии, фармацевтике, пищевой промышленности и других областях науки и техники.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

♦ При распространении вне оси капилляра оптического пучка полупроводникового лазера с гауссовым распределением интенсивности в плоскости, перпендикулярной оси капилляра, образующаяся за капилляром интерференционная картина определяется положением и размером лазерного пучка, внутренним и внешним радиусами капилляра, показателями преломления материала капилляра и жидкости в нём, и на этой основе возможно автоматизированное определение изменений показателя преломления жидкости с помощью рефрактометрического детектора, чувствительность детектирования веществ которого улучшается при генерации лазерного диода в одномодовом режиме.

♦ Максимальные чувствительность и динамический диапазон рефрактометрического детектирования вещества в капилляре достигаются при комплексном выполнении следующих условий: регистрации смещения интерференционной полосы,- образованной при распространении лазерного пучка вне оси капилляра и имеющей максимальные интенсивность и угол отклонения; увеличении отношений внутреннего радиуса канала капилляра к его внешнему радиусу и показателя преломления анализируемой жидкости к показателю преломления материала капилляра; компенсации ламинарных потоков, возникающих в результате различных условий отвода тепловой мощности от участков капилляра.

♦ Измерения изменений показателя преломления жидкости в капилляре с помощью двух пространственно совпадающих лазерных пучков с различными длинами волн обеспечивает возможность исключения из ре-

зультатов измерений приращений показателя преломления, обусловленны флуктуациями температуры зондируемого объёма, и повышени чувствительности лазерного рефрактометрического детектирования bi ществ в условиях флуктуаций температуры жидкости в капилляре.

Личный вклад соискателя

Содержание диссертации отражает личный вклад автора в пост; новке совместно с научным руководителем B.C. Бураковым задач исследс ваний, в выполнении экспериментальных и теоретических исследований, обсуждении и анализе результатов работ. Другие соавторы публикаци занимались изучением вопросов, не вошедших в настоящую диссертацию.

Апробация результатов диссертации

Результаты диссертации представлялись на следующих конференвд ях: Международной конференции "Refractometry" (Варшава, Польшг 1994); Республиканской конференции молодых учёных по квантовой эле» тропике (Минск, 1994); 7-ом Международном симпозиуме по высокоэс] фективному капиллярному электрофорезу (Вюрцбург, Германия, 1995; Республиканской конференции "Научное и аналитическое приборострос ние" (Минск, 1995); Европейской конференции по аналитической хими "Euroanalysis-IX" (Болонья, Италия, 1996); Международной конференцм "Laser application to chemical and environmental analysis" (Орландо США,1998); на конференции "European Materials Research Society Sprinj Meeting E-MRS'98 (Страсбург, Франция, 1998).

Опубликованпость результатов

Основные результаты диссертации опубликованы в 16 научных ра ботах, среди которых 7 статей, 9 тезисов докладов. Общее количестве опубликованных материалов составляет 65 страниц.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы четырёх глав, заключения и списка использованных источников.

Объём диссертации составляет 150 страниц, в том числе 97 страши текста, 46 иллюстраций на 41 странице, 2 таблицы, 11 страниц списка ис пользованных источников, включающего 177 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении кратко рассмотрено состояние исследуемой проблемы.

В общей характеристике обоснована актуальность проблемы, сфор мулирована цель работы, поставлены задачи, указаны объект и методы исследования, определена научная новизна и практическая значимость работы, приведены защищаемые положения и сведения о публикациях по тем( диссертации.

В главе 1 дан обзор современного состояния экспериментальных и теоретических работ по оптическому детектированию вещества в высокоэффективном капиллярном электрофорезе, микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционном анализе. Рассмотрены различные оптические схемы абсорбционных, флуоромет-рических, рефрактометрических детекторов и детекторов вещества на основе термооптических эффектов, использующих кюветы цилиндрического вида. Среди рефрактометрических выделены интерферометрические детекторы и детекторы на основе эффекта отклонения пучка продольным градиентом показателя преломления. Несмотря на наилучшую концентрационную чувствительность флуорометрических детекторов (Ю-14 - Ю-10.моль/л) область их применения весьма ограничена из-за отсутствия флуоресценции у многих исследуемых веществ. Использование непрямого флуоромет-рического детектирования расширяет анализируемые классы соединений, но при этом чувствительность регистрации ухудшается до 107-10 8 моль/л. Абсорбционные детекторы позволяют проводить анализ многих классов веществ с чувствительностью (10-5-10-7 моль/л), хотя при этом часто приходится использовать химически присоединяемые, селективно-поглощающие метки. По величине минимальных концентрационных пределов детектирования ( 10-М О 5 моль/л) рефрактометрические детекторы несколько уступают абсорбционным. Однако этот недостаток может компенсироваться существенным снижением стоимости эксплуатации рефрактометрических детекторов при использовании долговечных и более дешевых лазерных источников света в видимой и ближней инфракрасной областях спектра. Отмечено, что к моменту проведения исследований рефрактометрический метод детектирования веществ не использовался в приборах капиллярного электрофореза, микроколоночной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционном анализе, что обусловлено рядом причин. Предлагаемые рефрактометрические детекторы были сложны в эксплуатации и требовали участия оператора в юстировке источника оптического излучения относительно капилляра при его замене и смене раствора в нём, а также в настройке детектора на максимальную чувствительность. Отсутствовали рекомендации по выбору капилляра, раст~вбра7источгшка оптического излучения и ряда других условий, при которых достигаются максимальные чувствительность и динамический диапазон рефрактометрического детектирования. Не были определены факторы, ограничивающие минимальный предел рефрактометрического детектора в ультрамалых объёмах, пути развития и перспективы универсального метода регистрации веществ.

В главе 2 рассматриваются особенности метода рефрактометрического детектирования веществ в кювете цилиндрического вида.

В разделе 2.1 приводится методика расчёта интерференционной картины, образующейся в результате прохождения.когерентного лазерного пучка через капилляр, заполненный жидкостью и расположенный в возду-

хе. Распространение лазерного пучка через капилляр описывается исход; из закона преломления на поверхностях капилляра, а образование интер ференционной картины за капилляром рассчитывается из принципа Гюй генса-Френеля. Комплексная амплитуда волны А(0) в направлении набшо дения 0 определяется как результат суперпозиции сферических волн, ис пускаемых из точек на поверхности капилляра и пропорциональна ве личине:

А(0)= +2п2Ьг )] |-(1+соз (в~т/(Ь4

где Ае - амплитуда в точке с координатами (х£,у£), определяемая чере произведение амплитуды падающей на капилляр волны и амплитудноп коэффициента пропускания капилляром, определяемого по формула} Френеля; % - длина волны лазерного излучения; 1л , \л , Ьз, Ь4 - оптически длины путей до передней поверхности капилляра, внутри передней стеню капилляра, в жидкости и внутри задней стенки капилляра, соответственно Ьз - расстояние между осью капилляра и точкой наблюдения; Р - направле ние выхода оптического луча в точке хе,Уе; пь т, пз - показатели прелом ления окружающей капилляр среды, материала капилляра и жидкости, со ответственно; сНе- элемент поверхности капилляра.

На рис.1 представлены экспериментальные (1,2) и расчётные (3,4 интерференционные картины за капилляром для боросиликатного капил ляра (внутренний диаметр 100 мкм, внешний - 200 мкм), заполненного вс дой (1,3) и этанолом (2,4^ для пучка излучения полупроводникового лазер с длиной волны 780 нм и радиусом гауссова пучка 13 мкм при расстояни между осями капилляра и пучка 45 мкм. Очевидно, что изменение показа теля преломления жидкости, заполняющей капилляр, однозначно може быть связано с величиной смещения интерференционных полос. Наблюдг ется удовлетворительное соответствие расчётных и экспериментальных ш терференционных картин для различных капилляров.

Влияние геометрических размеров капилляра, показателя преломлю ния материала на чувствительность детектирования изменений показател преломления жидкости оценивается в разделе 2.2. Регистрация смещени интерференционного полосы с максимальными интенсивностью и угло] отклонения осуществляется с помощью фотоприёмника с установленно вплотную к его фоточувствительной поверхности щелевой диафрагмой Расчётные данные сравнимы с экспериментальными по величине отноа тельного изменения сигнала на выходе фотоприёмника при изменении пс казателя преломления жидкости на 104 в капилляре из боросиликатног стекла (внутренний диаметр 100 мкм, внешний 200 мкм). Относительнс изменение сигнала на выходе фотоприёмника может уменьшаться с значений З-Ю 2 при оптимальных значениях гауссова радиуса т (около 2( 25 мкм) лазерного пучка и расстояния уо (около 45 мкм) между осями л;

зерного пучка и капилляра до зиачеиий 3«10 3 вне оптимальных значений уо И №0.

угол,градус

Рис. 1. Экспериментальные и расчётные интерференционные картины.

Из анализа экспериментальных и расчётных данных даются рекомендации по юстировке лазерного пучка относительно капилляра для достижения максимальных значений линейного динамического диапазона и отношения сигнал/шум, а также по выбору капилляра для достижения максимальной чувствительности в зависимости от показателя преломления самой жидкости. Показано, что предложенная методика расчёта интерфе-ренциопной картины за капилляром позволяет проводить оценку чувствительности лазерного рефрактометрического детектора и его оптимизацию в зависимости от показателя преломления исследуемой среды, параметров капилляра и зондирующего лазерного пучка.

Влияние изменения температуры и давления анализируемой жидкости на показатель преломления рассматривается в разделе 2.3. Исходя из известных значений удельной рефракции вещества, его плотности, коэффициента объёмного расширения, проводится оценка величины изменения показателя преломления от приращения температуры. Величина изменения показателя преломления от приращения давления определяется из значений коэффициента сжимаемости, удельной рефракции, плотности жидкости. Так как давление в жидкости связано со скоростью потока, то флуктуации скорости потока жидкости по капилляру также могут вызывать флуктуации показателя преломления в зондируемой области жидкости. Показано, что флуктуации температуры около 10 2 °С и давления порядка 104 Па в области жидкости, зондируемой лазерным пучком, ограничивают достижение минимального предела рефрактометрического детектирования в водных растворах на уровне Ю-6 единиц показателя преломления.

Относительные флуктуации интенсивности лазерного пучка порядка Ю-4 ограничивают минимальный предел детектирования по показателю

преломления на уровне Ю-6 в капиллярах с внутренним диаметром около 100 мкм. Поэтому для достижения максимальной чувствительности рефрактометрического детектирования необходимо выбрать источник лазерного излучения с минимальными флуктуациями интенсивности. В разделе 2.4 приводятся измеренные шумовые характеристики различных лазерных источников излучения: Не-Ые лазера ЛГН-208А (Х,=632,8 нм) , полупроводникового лазера ИЛПН-212 (1=780 нм) и полупроводникового лазера видимого диапазона 1Л1>М135 (>.=670 нм). Полупроводниковый лазерный диод ИЛПН212 с предложенной схемой стабилизации мощности имеет наименьший уровень относительных флуктуации интенсивности (0,01%), обусловленных флуктуациями мощности и положения пучка, по сравнению с Не-1\'с лазером (0,31 %) и лазерным диодом 1Л>М135 (0,047 %). Исходя из анализа спектральных и поляризационных характеристик полупроводниковых лазеров, даются рекомендации по выбору лазерного диода в рефрактометрическом детекторе. Для повышения чувствительности лазерного рефрактометрического детектора за счёт уменьшения шумов лазерного диода, обусловленных конкуренцией спектральных мод, предложено использовать лазерные диоды, генерирующие в одномодовом режиме и имеющие гауссов профиль пучка в плоскости, перпендикулярной оси капилляра.

В главе 3 описаны экспериментальные исследования по применению метода рефрактометрического детектирования в приборах для капиллярного электрофореза и микроколоночной жидкостной хроматографии.

В разделе 3.1 приводятся изменения физических характеристик электролита, полученные на экспериментальной установке для разделения веществ в капилляре методом капиллярного электрофореза. Отвод тепловой мощности от капилляра обеспечивался предложенным устройством стабилизации температуры капилляра в воздухе и жидкости. Так, при воздушном термостатировании капилляра в диапазоне +10^-50°С величина случайных отклонений температуры составляет ±0,01°С, а при термостатировании жидкостью - около ±0,005 °С. Наиболее предпочтительные условия для снижения флуктуаций температуры при капиллярном электрофорезе достигаются при жидкостном термостатировании капилляра. На основании расчётных и экспериментальных результатов, полученных при использовании устройства стабилизации температуры, определены зависимость коэффициента удельной электропроводности от температуры и температура электролита на участках с различными условиями отвода тепла при разделении веществ методом капиллярного электрофореза. Выяснено, что при разделении методом капиллярного электрофореза в некоторых случаях температура электролита на участках капилляра, находящихся вне термостата в воздухе, может быть на 20-40 °С выше температуры электролита в капилляре, помещённом в жидкостной термостат.

Влияние перепадов температур вдоль капилляра на эффективность разделения веществ методом капиллярного электрофореза и чувствительность рефрактометрического детектирования рассматривается в разделе 3.2. Наличие участков капилляра с различными режимами отвода тепла приводит к возникновению в областях перепада температур повышенного и пониженного гидростатического давления и, следовательно, к появлению ламинарных потоков, величина и влияние которых на эффективность разделения веществ при различных условиях и параметрах капилляра могут быть оценены на основе предложенной методики расчёта, учитывающей температурные зависимости относительной диэлектрической постоянной и динамической вязкости электролита, 1Р-потенциала материала капилляра.

Определено, что эффективность разделения веществ с различными коэффициентами диффузии и их концентрация в зоне зависят от скорости электроосмотического потока, коэффициента диффузии разделяемого вещества, соотношения длин участков капилляра с различными температурами электролита. Наиболее сильно этот эффект проявляется для веществ с коэффициентами диффузии порядка 10"10 м2/с, причём для капилляров с внутренним диаметром 50 и 100 мкм влияние перепадов температур начинает проявляться при длине участков с повышенной температурой свыше 10 и 5 см соответственно. В условиях наличия ламинарного потока, наведенного в результате различий температур электролита вдоль капилляра, можно обеспечить повышение чувствительности детектирования и эффективности разделения веществ с коэффициентами диффузии около 1040 м2/с за счёт создания дополнительного перепада гидростатического давления на концах капилляра.

В разделе 3.3 описывается разработанный автоматизированный прибор "КАПЭЛ" для капиллярного электрофореза с лазерным рефрактометрическим детектором. Модуль управления прибором разработан на основе однокристального микропроцессора КР1830ВЕ31. На основе структурных схем оптико-механического и электронного блоков прибора излагаются алгоритмы работы лазерного рефрактометрического детектора при юстировке пучка лазерного диода относительно капилляра и установке фотоприёмника в точку максимальной чувствительности, устройств подачи и смены кювет с пробами, рабочим электролитом и промывочными растворами.

Структурная схема лазерного рефрактометрического детектора для случаев его применения в составе приборов микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа приводится в разделе 3.4. Стабилизация температуры кюветы в детекторе осуществляется с помощью нагревательного элемента в виде мощного транзистора. Настройка и юстировка рефрактометрического детектора с лазерным источником излучения в ИК области выполняются с помощью

предложенного устройства для визуализации ИК излучения на основ* жидкого кристалла холестерического типа. Рабочая температура жидкоп кристалла (36 °С) поддерживается схемой управления на основе термоэлек трического элемента Пельтье.

В главе 4 рассматриваются возможности практического применени: рефрактометрического детектора в капиллярном электрофорезе, микроко лоночной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционном анализе а также шумы, которые ограничивают достижение минимальных теоре тических значений пределов рефрактометрического детектирования и обу словлены дробовым шумом фотоприёмника и избыточным шумом ис точника излучения. Определены перспективные направления дальнейшей развития метода рефрактометрического детектирования веществ в услови ях флуктуаций температуры зондируемого объёма жидкости в капилляре.

В разделе 4.1 рассмотрены конкретные применения разработанной прибора "КАПЭЛ" с лазерным рефрактометрическим детектором. Приве дены электрофореграммы разделения и анализа углеводов (рис.2а), карбо новых кислот (рис.2б), недериватизированных аминокислот (гистидин, ме тионин, аланин), лекарственных препаратов (панадол), порошка, по лученного при лазерной абляции графитовой мишени. Методы разделена веществ различны и выбираются исходя из свойств проб.

Минимальный предел детектирования углеводов в боросиликатнои капилляре (внутренний диаметр 100 мкм, внешний - 200 мкм ) определяет ся путём измерения сигнала при введении в капилляр растворов с извест ной концентрацией и составляет для глюкозы 4,7» 10 5 г/мл, фруктозы 4» 10-г/мл, сахарозы 3,6«105 г/мл при отношении сигнала к среднеквадра тическому значению шума равным трём и постоянной времени 0,1 с.

Результаты испытаний разработанного лазерного рефрактомет рического детектора в составе микроколоночного жидкостного хромато графа "Милихром-4" для определения спиртов, а также для определение содержания примесей в потоках жидкости излагаются в разделе 4.2. Пр! использовании кварцевого капилляра (внутренний диаметр 100 мкм внешний 170 мкм) и постоянной времени низкочастотного фильтра 1 с по лучен минимальный предел детектирования глицерина 5,2 мкг/г при отно шении сигнала к среднеквадратическому значению шума равном трём, чт< соответствует при зондируемом объёме около 0,2 нл возможности регист рировать около 1 пг глицерина в воде. Минимальная регистрируемая пре дельная концентрация метанола в дистиллированной воде такого же по рядка.

В разделе 4.3 проводится оценка факторов, играющих основную рол! в ограничении чувствительности рефрактометрического детектирование веществ в капиллярах. Теоретический минимальный предел рефрактомет рического детектирования в капилляре, обусловленный дробовым шумо\ фотодиода при регистрации лазерного излучения, может быть снижен дс

значений порядка Ю-9 единицы показателя преломления. Однако избыточные шумы лазерных источников излучения с величиной относительных флуктуации интенсивности на уровне Ю-4 и флуктуации температуры зондируемого объёма около 102 °С не позволяют достичь такой чувствительности и ограничивают её величиной в 106 единиц показателя преломления. Использование схемы подавления избыточных шумов источника оптического излучения может улучшить минимальный предел регистрации изменений показателя преломления в капиллярах с внутренним диаметром порядка 100 мкм до величин 10 е - 10"7 единиц показателя преломления. Однако в этом случае начинают проявляться шумы, обусловленные неконтролируемыми флуктуациями показателя преломления из-за флуктуацией температуры около 103 °С. Поэтому для дальнейшего улучшения чувствительности рефрактометрического детектирования в капиллярном электрофорезе необходимо исключить влияние флуктуаций температуры на измерение концентрации веществ.

Рис.2. Электрофореграммы разделения углеводов (а) и карбоновых кислот (б): а) I - проба мёда, содержащая фруктозу (1), глюкозу (2), II -смесь фруктозы (1) и глюкозы (2), III - проба фруктозы (1), IV - проба глюкозы (2); б) I - проба винной кислоты (1), II - проба янтарной кислоты (2), III - смесь винной (1) и янтарной (2) кислот.

Предлагаемый в разделе 4.4 рефрактометрический детектор на осно ве двух лазерных диодов с различными длинами волн излучения (рис.3) по зволяет улучшить чувствительность детектора в условиях флуктуаций тем пературы. Концентрация вещества в жидкости определяется после ис ключения из результатов измерений приращений показателя преломления обусловленных флуктуациями температуры зондируемого объёма.

16

15

. 13

tó h У ¿......

7----- - С £ Э-i

11

Рис.3. Оптическая схема рефрактометрического детектора веществ на двух дайнах волн излучения: 1,3 - лазерные диоды с длиной волны излучения Xi и кг соответственно; 2,4 - фокусирующая линза; 5, 15, 17- поляризатор; 6,7,18,19 - подвижная каретка; 8,10 - полупрозрачное зеркало; 9-капилляр; 11, 12 - фотодиод; 13, 14 - щелевая диафрагма; 16 -интерференционный фильтр на д лину волны 20 - держатель капилляра.

В детекторе использовались полупроводниковые лазеры ИЛПН 212 (мощность излучения 3 мВт, 780 нм ) и TOLD 9211 (мощность излучения 3 мВт, 670 нм ). При уровне флуктуаций температуры жидкости в пределах 1°С среднеквадратическая величина минимальной регистрируемой концентрации сахарозы составила около 10 мкг/г, что эквивалентно величине показателя преломления примерно 2*10"6, и была обусловлена избыточными шумами используемых лазерных диодов.

Отмечено, что принцип рефрактометрического детектирования веществ на двух различных длинах волн излучения с последующей обработкой измерений и исключением влияния на результаты измерений флуктуаций температуры может быть применим в сочетании с другими оптическими схемами рефрактометрических детекторов на основе обратно отраженных пучков или ряда других эффектов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментальных и теоретических исследований развиты подходы по повышению чувствительности, дина-

мичсского диапазона метода лазерного рефрактометрического детектирования малых количеств вещества в жидкой фазе в кюветах цилиндрического вида. На этой основе предложены принципы разработки и создания рефрактометрических детекторов в ультрамалых объёмах и соответствующей аналитической аппаратуры. Конкретные полученные результаты могут быть сформулированы следующим образом:

1. Максимальные чувствительность и динамический диапазон лазерного рефрактометрического детектирования в капилляре достигаются при регистрации смещения интерференционной полосы, образованной при распространении зондирующего пучка вне оси капилляра и имеющей максимальные интенсивность и угол отклонения. Чувствительность детектирования возрастает с увеличением отношения внутреннего радиуса канала капилляра к его внешнему радиусу и с увеличением отношения показателя преломления анализируемой жидкости к показателю преломления материала капилляра, причём показатель преломления материала капилляра больше показателей преломления вещества и окружающей капилляр среды [3,7,8,16].

2. При зондировании капилляра пучком лазерного диода, генерирующего в одномодовом режиме и имеющего гауссов профиль, и рефрактометрическом детектировании вещества в капилляре по смещению интерференционных полос достижение минимальных регистрируемых значений изменений показателя преломления (порядка 10 б) ограничивается относительными флуктуациями интенсивности лазерного источника излучения (около Ю-4), флуктуациями температуры (порядка 10 2 °С ) и флуктуациями давления (порядка 104 Па) жидкости в капилляре [3,7,8,9,16].

3. Различие температур электролита в капилляре, вызванное различием условий отвода тепловой мощности от различных участков капилляра при капиллярном электрофорезе, приводит к возникновению ламинарных потоков в капилляре, что сопровождается дополнительным расширением зон вещества, уменьшением эффективности разделения и чувствительности рефрактометрического детектирования. Наиболее значительно влияние перепадов температуры электролита в капилляре на эффективность разделения для веществ с малыми коэффициентами диффузии ( порядка 10-'° м2/с). Показано, что влияние перепадов температур на расширение разделённых зон вещества начинает проявляться при достижении длины участков с повышенной температурой свыше 5-10 см при общей длине капилляра около метра [11,14]. •

4. В разработанном приборе "КАПЭЛ" капиллярного электрофореза с лазерным рефрактометрическим детектором процесс юстировки, настройки и работы при замене капилляра на новый, при установке фотоприёмного устройства в точку максимальной чувствительности после смены электролитов и включении высокого напряжения выполняются автоматически. Прибор позволяет проводить на основе метода капиллярного электрофо-

реза разделение веществ (углеводов, органических кислот, недериватизи рованных аминокислот, лекарственных препаратов, веществ слабо раство римых или вообще нерастворимых в воде) и их детектирование по показа тешо преломления с минимальной концентрационной чувствительностьн Ю-5-10 4 моль/л в объёме порядка десятых долей нанолитра. В прибор! обеспечивается жидкостное термостатирование капилляра с флуктуациям! температуры теплоотводящей жидкости в пределах ±0,005 °С в диапазон! от +10 °С до +50 °С [2,3,6,10,12].

5. Достижение чувствительности рефрактометрического детектирован® веществ, ограниченной дробовым шумом фотодиода при регистрации ла зерного излучения, обеспечивается при использовании ИК излучателей, a i целях визуализации их излучения предложено использовать разработанно! устройство для визуализации ИК излучения на основе жидкого кристалл; холестерического типа с разрешающей способностью около 10 линийУм\ и диапазоном регистрируемых плотностей мощности от 100 мкВт/см до 1 Вт/см2.

6. Минимальное теоретически регистрируемое изменение показателя пре ломления жидкости обусловлено дробовым шумом фотодиода и составля ет около 8,5-10 9 при лазерном рефрактометрическом детектировании и ти пичных параметрах капилляра ( внутренний диаметр 100 мкм, внешний 200 мкм), мощности лазерного потока ( около 1 мкВт на длине волны 78( нм), квантовой эффективности фотодетектора (около 0,7) и полосе пропус кания 1 Гц. Для достижения минимального теоретического предела обна ружения веществ при рефрактометрическом детектировании за счёт ис кшочения шумов, обусловленных флуктуациями температуры жидкости 1 зондируемой области, необходимо осуществлять регистрацию измененш показателя преломления на двух различных длинах волн оптического из лучения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Касютич В.Л., Лобазов А.Ф., Нечаев С.В. Лазерный рефрактомет рический детектор для высокоэффективной микроколоночной жидкост ной хроматографии и капиллярного электрофореза // Лазерная и оптико электронная техника: Межвуз. сб. науч. тр. Минск:Белгосуниверситет,1992. -Вып.2. -С.197-201.

2. Касютич В.Л., Коляда Ю.В. Регулирующее устройство для термоэлек трической стабилизации температуры IIПТЭ. -1995,-№1. -С.203-207.

3. Kasyutich V.L., Mahnach I.I. Intelligent refractive index for capillar; electrophoresis // Proc. SPIE. -1995. -Vol.2208. -P.94-102.

4. Касютич В.Л., Нечаев С.В. Оптические детекторы в приборах для капил лярного электрофореза И Лазерная и оптико-электронная техника: Меж вуз. сб. науч. тр. -Минск: Белгосуниверситет, 1995. -Вып.З.-С.171-185.

5. Kasyutich V.L., Manak I.S., Zhuravskii Yu.L., Klokova M.T. Polarization properties of light emission of AlGaAs double heterostructure injection lasers // Proc SPIE. -1997. -Vol.3094. -P. 18-24.

6. Касютич В.Л., Бураков B.C. Установка "КАПЭЛ" для разделения и анализа веществ методом капиллярного электрофореза с лазерным рефрактометрическим детектором//ПТЭ.- 3997.-№6. -С.116-120.

7. Касютич В.Л. Особенности лазерного рефрактометрического детектирования в кювете цилиндрического вида // Журн. прикл. спектр. -1998. -Т.65, №6. -С.894-899.

8. Kasyutich V.L., Mahnach I.I.. An intelligent laser diode refractive index detector for capillary electrophoresis H International conferencc "Refractometry": Book of abstr. - Warsaw, 1994. -P.46.

9. Касютич В.Л. Влияние флуктуации на чувствительность лазерного рефрактометрического детектора II Республиканская конференция молодых учёных по квантовой электронике: Тез. докл. - Минск, 1994. -С. 38-39.

10. Kasyutich V.L. Automatic laser diode refractive index detector for capillary electrophoresis // Seventh International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis: Book of Absr. - Wurzburg, 1995. -P.l69.

П. Kasyutich V.L. Separation efficiency and detection sensitivity in extended light path capillaries in HPCE H Seventh International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis: Book of abstr. - Wurzburg, 1995. -P. 170.

12. Касютич В.Л., Нечаев C.B. Прибор для капиллярного электрофореза с лазерным рефрактометрическим детектором // Республиканская конференция "Научное и аналитическое приборостроение": Тез. докл. -Минск, 1995. - С.87-88.

13. Kasyutich V.L., Nechaev S.V. Application of capillary electrophoresis instrument with refractive index detector for analysis of food additives and drugs // European conference of analytical chemistry "EUROANALYSIS IX": Book of abstr. - Bologna, 1996. -Tu PI 56.

14. Kasyutich V.L. Effect of the capillary longitudinal temperature differences on the separation efficiency in high performance capillary electrophoresis // European conference of analytical chemistry "EUROANALYSIS IX": Book of abstr. - Bologna, 1996. -Fr P61.

15. Laser ablation plasma deposition of cluster-assembled powders / Burakov V.S., Bokhonov A. F., Kasyutich V.L. e.a. // Proceedings of European research Society E-MRS'98 -Strasburg, 1998. -K-VI/P14.

16. Kasyutich V.L. Laser diode refractive index detection in capillary // Laser application to chemical and environmental analysis; Technical digest -Washington, 1998. -Vol.3. -P. 37-39.

18

РЭЗЮМЭ

КАСЮЦ1Ч ВасшШ Лявонцьев1ч

ЛАЗЕРНАЕ ДЭТЭКТЫРАВАННЕ ШКАКОЛЬКАСЩ РЭЧЫВА ПА ЗМЯНЕННЮ ПАКАЗЧЫКА ПЕРАЛАМЛЕННЯ

Ключавыя словы: капшяр, рэфрактаметрычнае дэтэктыраванне, лазерны дыёд, паказчык пераламлення, кашлярны электрафарэз, мисракалоначная вадкасная храматаграф!я, праточна-шжэкцыйны анагиз.

Праведзена даследванне праходжання лаз ер нага пучка праз катляр цьшндрычнага тыпу, ям мае унутраны дыяметр 50-100 мкм i запоунень: празрыстай вадкасцю. Мэтай працы з'яулялася аптым1зацыя лазернагг дэтэктыравання рэчывау па змяненню паказчыка пераламлення прь раздзяленш 1 анал1зу рэчывау метадам1 капшярнага электрафарэзу мшракалоначнай вадкаснай храматаграфл 1 праточначнжэкцыйнагг анал1зу. Утварэнне штэферэнцыйных палое за капшярам апюана на пад-ставе прынцыпу Гюйгенса-Фрэнеля.

Вызначана, што макамальныя адчувальнасць I дынам1чны дыяпазон лазернага рэфрактаметрычнага дэтэктыравання рэчыва у капшяры зале-жаць ад папярочных памерау лазернага пучка 1 капшяра, рэжымау адводу цяпла ад участкау капшяра у капшярным электрафарэзу 1 дасягаюцца пры наступных умовах: распаусюджанш лазернага пучка м^ма вoci капшяра; рэпстрацьп зрушэння штэрферэнцыйнай паласы, якая мае макамальные ¡нтэнаунасць \ вугал адхшення; павел1чэшп адносш унутранага дыяметра капшяра да знешняга 1 паказчыка пераламлення вадкасщ да паказчыка пераламлення матэрыялу капшяра. Паказана, што для павышэнпя адчувальнасщ дэтэктыравання рэчыва ва умовах флуктуацый тэмпературы вадкасщ найлепш выконваць рэфрактаметрычнае дэтэктыраванне з дапамогай дзвух сувосевых лазерных пучкоу з розныки даужынам1 хваляу выпраменьвання.

Распрацаваны аутаматызаваньш рэфрактаметрычныя дэтэктары для мперакалоначнай вадкаснай храматаграфп I праточна-шжэкцыйнага анал1зу, прыбор для капшярнага электрафарэзу з рэфрактаметрычным дэ-тэктарам. Канцэшрацыйная адчувальнасць дэтэктыравання вугляводау, карбонавых к5слот, амшакшлот, лекавых прэпаратау 1 шшых рэчывау - каля 105 -10"4 М/л у аб'еме парадку 0,1 нл.

19

РЕЗЮМЕ

КАСЮТИЧ Василий Леонтьевич

ЛАЗЕРНОЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЕ ПИКОКОЛИЧЕСТВ ВЕЩЕСТВА ПО ИЗМЕНЕНИЮ ПОКАЗАТЕЛЯ ПРЕЛОМЛЕНИЯ

Ключевые слова: капилляр, рефрактометрическое детектирование, лазерный диод, показатель преломления, капиллярный электрофорез, микроколоночная жидкостная хроматография, проточно-инжекционный анализ

Проведено исследование прохождения лазерного пучка через капилляр цилиндрического вида, имеющий внутренний диаметр 50-100 мкм и заполненный прозрачной жидкостью. Целью работы являлась оптимизация лазерного детектирования веществ по изменению показателя преломления при разделении и анализе веществ методами капиллярного электрофореза, микроколоночной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа. Образование интерференционных полос за капилляром описано исходя из принципа Гюйгенса-Френеля.

Определено, что максимальные чувствительность и динамический диапазон лазерного рефрактометрического детектирования вещества в капилляре зависят от поперечных размеров лазерного пучка и капилляра, режимов отвода тепла от участков капилляра при капиллярном электрофорезе и достигаются при следующих условиях: распространении лазерного пучка вне оси капилляра; регистрации смещения интерференционной полосы, имеющей максимальные интенсивность и угол отклонения; увеличении отношений внутреннего диаметра капилляра к внешнему и показателя преломления жидкости к показателю преломления материала капилляра. Показано, что для повышения чувствительности детектирования вещества в условиях флуктуации температуры жидкости предпочтительно выполнять рефрактометрическое детектирование веществ с помощью двух :оосных лазерных пучков с различными длинами волн излучения.

Разработаны автоматизированные рефрактометрические детекторы хля микроколоночной хроматографии и проточно-инжекционного анали-5а, прибор для капиллярного электрофореза с рефрактометрическим детектором. Конценграционная чувствительность детектирования углеводов, <арбоновых кислот, аминокислот, лекарственных препаратов и других ве-цеств - около 10"5 -10'4 М/л в объеме порядка 0,1 нл.

20

ABSTRACT

KASYUTICH Vasilii Leontievich

LASER DETECTION OF PICOQUANTTTIES OF SUBSTANCE BY REFRACTIVE INDEX CHANGES

Key words: capillary, refractive index detection, laser diode, refractive index, capillary electrophoresis, microcolumn liquid chromatography, flow injection analysis

Investigation of laseT beam propagation through cylindrical cross-sectio capillary which has an inner diameter 50-100 nm and is filled by transparent lie uid. A work objective was an optimization of laser detection of substance by n fractive index changes for separation and analysis of substances by methods c capil-lary electrophoresis, microcolumn liquid chromatography and flow injection analysis. Generation of interference fringes behind the capillary was de scribed on base of Huygens-Fresnel principle.

It was defined that maximal sensitivity and dynamic range of the laser re fractive index detection depend on cross sizes of the laser beam and the capillar) regimes of heat removal from the capillary parts in capillary electrophoresis am are achieved under following conditions: propagation of the laser beam out o the capillary axis; registration of displacement of the interference fringe whicl has maximal intensity and deflection angle; increase of ratios of the capillary in ner diameter to outer one and refractive index of the liquid to refractive index o the capillary material It was shown that to improve the sensitivity of substanc detection under conditions of temperature fluctuations of the liquid it is pre ferred to accomplish the refractive index detection by two coincidental lase beams with different wavelengths.

Automatic refractive index detectors for microcolumn liquid chromatog raphy and flow-injection analysis, device for capillary electrophoresis with re fractive index detector were designed. Concentration detection sensitivity of car bohydrates, carbon acids, aminoacids, drugs and other substances was abou 10"5-10-4 M in volume around 0,1 nl.

КАСЮТИЧ Василий Леонтьевич

ЛАЗЕРНОЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЕ ПИКОКОЛИЧЕСТВ ВЕЩЕСТВА ПО ИЗМЕНЕНИЮ ПОКАЗАТЕЛЯ ПРЕЛОМЛЕНИЯ

Подписано к печати №. // 199$ г. Формат 60x90 1/16 Тип бумаги - офисная. Печать офсетная. Печ. л. 16 Уч. изд. л. 1.2. . Тираж 100 экз. Заказ 116 .

Институт молекулярной и атомной физики HAH Беларуси 220072, Минск, пр. Ф. Скорииы, 70.

Отпечатано на ризографе Института физики им. Б.И. Степанова HAH Беларуси

Лицензия ЛП № 20 от 20.08.97 г.