Магнитный захват клеток и модельных агрегатов клеточных мембран тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.11 ВАК РФ

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Физический факультет

Рг* ОН

На правах рукописи УДК 537.634

ШАЛЫГИН Александр Николаевич

МАГНИТНЫЙ ЗАХВАТ КЛЕТОК И МОДЕЛЬНЫХ АГРЕГАТОВ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

(01.04.11 — фиоика магнитных явлений)

Диссертация на соискание ученой степени доктора фиоико-математических наук в форме научного доклада

Москва — 1994

Работа выполнена на хафедре магнетизма физического факультета Московского государственного университета им.М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор К. П. Бедов

доктор физико-математических наук, профессор В. И. Ожогин

доктор физико-математических наук, профессор Д. С. Чернавский

Ведущая организация:

ИТЭБ РАН, г. Пущино Московской области

Защита состоится " ^О " 1994 г. в ^ часов о мик.

на заседании специализированного Совета Д.053.05.40 отделения физики твердого тела физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, физический факультет, аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Доклад разослан " ^-о "/X 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор физико-математических на; профессор

С. А. Никитин

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Изучение индивидуальных физических свойств биологических микрообъектов: клеток, клеточных фрагментов и органелл, а также их модельных аналогов, типа бислойных агрегатов лиотропных меоофао, является фундаментальной проблемой современной статистической физики и таких ее разделов, как биофизика и физика магнитных явлений [1-6]. Практически все известные экспериментальные методы физики привлекаются сегодня к изучению того состояния вещества, которое составляет суть живого. Методически наиболее важны те работы, которые направлены на получение информации относительно материальных констант молекулярных и надмолекулярных структур клетки, на установление взаимосвязи между физическими и специфическими, функциональными свойствами, изучаемых биосистем. Именно эти работы, имеющие фундаментальный характер, способствуют выявлению "биофизической сущности" объектов живой природы, стимулируют развитие таких разделов физики, как физика малых объектов, структурные и фазовые переходы, ренорм группы и флуктуирующие среды, среды пониженной размерности и физика дефектов, тепловые флуктуации при разных симметриях, математическое моделирование и др. Существенный вклад в изучение таких объектов следует ожидать и от их исследования методами магнетизма, поскольку именно физика магнитных явлений накопила значительный опыт в исследовинии различных видов конденсированного состояния через изучение таких материальных постоянных как магнитный момент и магнитная восприимчивость.

В активные центры ряда ферментов входят парамагнитные ионы переходных металлов (Ге3+, Си2+ и др.). Парамагнитной частицей галяется и кислород в основном тршшетном состоянии. В некоторых случаях, при патологиях, наблюдается повышенное содержание тонов переходных элементов в биосистемах. Свойства таких йотов отличны от свободных и и от встречающихся в неживой природе. Магнитные свойства молекулярных систем, содержащих ио-ш переходных металлов весьма чувствительны к изменению спинового состояния металлсодержащего комплекса и позволяют установить связь между его магнитными и биофизическими свойствами.

Экспериментальные исследования приобретает о,десь особое значение, поскольку рассмотрение ио общих принципов для таких систем ¡затруднено: смешиваются олектронные.и ядерные взаимодей-

• ствия. что делает невозможным применение адиабатического приближения; возникает необходимость учитывать влияние соседей по-•оедством введения цолей. типа внутрикристаллического определенной симметрии; в виду сильногоспин-орбитальног-йвоаимодействия возникает изменение д-факторов и изменяется порядок, следования термов.

Молекулярная организация-биомембран и многих клеточных ор-ганелл близка к структуре,жидких кристаллов. Изучение диамаг-■ • нитных свойств таких систем — один из наиболее простых путей получения информации, отражающей широкий спектр особенностей их коллективного поведения. Анизотропия диамагнитной восприимчивости отдельной молекулы, определяемая флуктуациями таз: называемого директора, по разному, проявляет себя в зависимости от способа упаковки, окружения и температуры в различных агрегатах. Экспериментальные же данные относительно диамагнитных .. с .ойств лиотропных нематиков либо, отсутствуют, либо чреавьгчай-но скудны. л .•

Исследования индивидуальных магнитных свойств биологических клеток имеет практическое значение для биологии и медицины. Развитие техники и технологии производства-высокоградиентных маг-

• нитных фильтров представляет возможность прямого разделения клеток по индивидуальным маднитным свойствам, усиление эффектов разделения за счет оптимизации их единичных элементов, изменения свойств буферной среды, оа счет изменения магнитных свойств самих клеток. .. .

Одной из актуальных проблем современной медицины является -проблемма направленного транспорта лекарственных препаратов, . в том числе и магнитоуправляемого. Наиболее эффективный путь создания таких препаратов лежит через конструирование дипосом-ных и клеточных суспензий, содержащих лекарственные и магнито-активные вещества. Особое значение для этих работ приобретает разработка способов введения в носитель требуемых магнитоактив-Ных ионов, контроль качества носителей, их индивидуальных маг-1 нитных свойств, контроль способности носителя адсорбировать на

поверхность ионы и молекулы из раствора.

С раовнтием современной техники воорастает влияние на экосистему статических и динамических электромагнитных воодействий (теле- и радиовещательные системы, высоковольтные линии электропередач, МГД-генераторы, магнитные подушки и т.д.). Масса публикаций последних лет касается нетепловых воодействий магнитного поля, неионизирующего облучения организма. Очевидно, что бурно развивающиеся исследования по влиянию электромагнитных полей и излучений на ткани и организмы не будут иметь глубокого понимания без изучения материальных констант молекулярных и надмолекулярных структур клетки.

Исследования индивидуальных диамагнитных свойств биологических микрообъектов предъявляют ряд требований к технике и методике измерений. Исследуемый объект требует для поддержания своего функционального состояния определенной буферной среды, восприимчивость которой близка к восприиимчивости самого объекта. Известные способы исследований магнитных свойств вещества, как магнитные весы Фарадея, ЭПР или, развитая в последнее время, сверхчувствительная квантовая СКВИД-магнитометрия не могут быть использованы для измерения столь малого магнитного момента, как индуцированный внешним полем диамагнитный момент отдельной биологической клетки или ее модельного аналога. Использование этих традиционных методов становится тем более невозможным, если необходимо выделение какой либо части клетки, составляющей несколько процентов от ее массы или объема. Определенные трудности при работе с этими методами необходимо преодолевать даже при работе с любым числом клеток, что свяоано с необходимостью выделения собственного сигнала клеток из общего сигнала, включающего сигнал от ампулы, клеточной суспензии, эуферной среды, ее примесей и побочных включений в клеточную :успенвию.

Чрезвычайно высокой чувствительностью, достаточной для измерений магнитной восприимчивости одиночных клеток с индуци-эованным магнитным моментом любого знака относительно среды порядка 104-105 магнетонов Бора в поле 1 кЭ, обладает выносимая 1а защиту техника измерений, использующая сильно неоднородные толя рассеяния, возникающие вблизи поверхности тонкой магнит-

Рис. 1. Схематическое изображение проволочки и частицы в эксперименте по магнитному захвату (а); проекции траекторий движения цастиц в плоскости (г, у) при диа- и парамагнитном захвате (б) [33*].

ной проволочки при ее поперечном намагничивании [33*]. В отих экспериментах исследуют параметры движения клетки, обусловленного взаимодействием индуцированного внешним полем магнитного комента клетки с полем рассеяния от поперечно намагниченной тем же полем тонкой магнитной проволочки (рис. 1, а). При этом существенным окапываются величина и онак раоности х = Хя~ХбуФ между магнитивши восприимчивостями частицы Хч и буферной среды У Хбуф- Так для частиц с х > 0 наблюдается явление парамагнитного оахвата — притяжение частиц в область наибольшей напряженности поля вблиои поверхности проволочки, а для частиц с ^ < 0 наблюдается диамагнитный оахват — притяжение частиц (более диамагнитных, чем среда) в область наименьшей напряженности поля у поверхности проволочки (рис. 1,6). Высокая чувствительность при отих измерениях обусловлена оначительным увеличением произведения Н дсвАН оа счет испольоования тонких проволочек, диаметр которых сравним с диаметром исследуемых клеток или частиц, а также компенсационным характером иомерения: магнитный оахват — единственный ио известных в практике магнитных измерений компенсационный способ: восприимчивость объекта одесь определяется по отношению к восприимчивости буферной среды, которая считается определенной оаранее и, как правило, имеет одинаковый или близкий порядок величины с восприимчивостью исследуемой ча-

стицы.

Именно ота техника и раовитые на ее основе методы исследований клеток и бислойных агрегатов лиотропных меоофао [33*,35*] позволили начать целенаправленное изучение физических и специфических свойств биологических клеток и бислойных липидных мем-эран бео нарушения их целостности и равновесия с окружающей их эуферной средой.

Начальное состояние проблемы. Укажем работы, которые 1 наибольшей степени оказали влияние на разработанные в диссертации подходы и методы исследования индивидуальных магнитных •дюйств биологических клеток и бислойных липидных везикул.

В 1963 г. в [9] была отмечена возможность диамагнитного притяжения частиц и наблюдался парамагнитный захват поперечно на-гаггпгтенпым стержнем диаметром 1 мм полистирольных частиц >азмером 25-50 мкм.

В 1973 г. в [7] было получено аналитическое выражение силы, ¡ействуюшей на немагнитную частицу вблизи поперечно намагпи-[енного цилиндра, которое затем было использовано [8,10] для опи-ания процессов высокоградиентного магнитного разделения частил | потоке жидкости.

В 1975 г. в [13] с помощью высокоградиентного фильтра в виде ^ [учка тонкой проволоки было проведено отделение парамагнитных ритропитов человека из цельной крови.

В 1979 г. в экспериментах по высокоградиентной магнитной се-ерации [11] наблюдался диамагнитный захват парамагнитных ча-тиц А1 из потока жидкости, в которой необходимые для захвата словия создавались искусственно, посредством растворения в жид-ости значительно более парамагнитной соли МпСЬ-

В 1976 г. в [41] посредством поворота в магнитном поле цилип-рических везикул была определена анизотропия диамагнитной вос-риимчивости бислойной мембраны яичного лецитина.

В 1980 г. на СКВЙД-магнитометре [29] была исследована в от-осительных единицах температурная зависимость магнитной вос-риимчивости водной суспензии мультислойных везикул дипальми-оиллецитина.

Научная значимость и новизна результатов. Научное зна-епие и новизну работы определяют разработанные в диссертации

принципиально новые подходы и методы, проведенные с их помощью исследования индивидуальных магнитных свойств некоторых биологических клеток и бислойных липидных мембран,ио которых наиболее важными, полученными впервые, можно указать следующие:

- обпаружено явление диамагнитного оахвата эритроцитов, содержащих гемоглобин в оксиформе, в водной буферной среде в область редукции магнитного поля вблиои поверхности поперечно намагниченной проволочки;

— похаоано, что характер движения эритроцитов при магнитном оахвате однозначно определяется состоянием внутриклеточного гемоглобина;

- определены условия при которых параметры оахвата близки расчетным, полученным в приближении идеальной жидкости; предложен способ измерения индуцированных магнитных моментов одиночных клеток, позволяющий измерять рекордно малые индуцированные моменты любого знака порядка 104-105

:. магнетонов Бора в поле 1 кЭ; предложен способ, позволяющий проводить многократные измерения с одной выбранной клеткой;

— проведены исследования магнитных состояний гемов эритроцитов человека в зависимости от температуры, кислотно-щелочных свойств буферной среды, при процессах диссоциации-связывания внутриклеточного гемоглобина с кислородом. Установлено, что:

- внутриклеточный оксигемоглобин диамагнитен; эффективный магнитный момент ионносвязывающего комплекса Ре-Ог равен нулю;

- найдено резкое увеличение термической деоксигенации внутриклеточного гемоглобина при температуре выше 35 °С;

- обнаружено отклонение от закона Кюри магнитной восприимчивости внутриклеточного нитритного метгемоглобина;

- на основе магнитного оахвата отдельных эритроцитов показана возможность определения для внутриклеточного гемоглобина параметра кооперативности Хилла и точки Р50

— парциального давления кислорода, при котором насыщено 50% участков связывания;

- исследована устойчивость внутриклеточного окси- и метге-

моглобина к изменениям рН среды в интервале от 5,5 до 9'5' " ' "'

- покапана возможность наблюдения и проведено исследование магнитного захвата мультислошгых сферических фосфолипид-ных везикул — липосом; показана возможность определения числа концентрических бислоев, образующих каждую конкретно исследованную липосому; предложен 'способ определения средней магнитной восприимчивости бислойной липидной мембраны— х = 1/3(ха+2хл.);

- предложен способ определения диамагнитной анизотропии (хц~ Х±) и компонент тензора диамагнитной восприимчивости липидной бислойной мембраны:

- исследованы диамагнитные свойства бислойных мембран синтетических (дипальмитоиллецитин и димиристоиллецитин) и природных (яичный лецитин, общие лшшды эритроцит арных мембран) фосфолипидов. Установлено, что:

- магнитные восприимчивости синтетических фосфолипидов в ж/к состоянии близки значениям расчитанным по схеме Паскаля;

- фазовый переход гель-жидкий кристалл в дипальмитоилле-цитине обратим по температуре; изменение восприимчивости при переходе не объясняется одним лишь изменением молекулярного объема; ■

- в бислоях природных фосфолипидов обнаружены температурные области с аномальным поведение диамагнитной восприимчивости; указанные особенности восприимчивости необратимы по температуре и носят характер неравновесных структупных переходов;

- характер изменения компонент тензора диамагнитной восприимчивости показывает, что структурные иоменения в бислоях природных фосфолипидах сопровождаются увеличением объема, приходящегося на молекулу фосфолшшда в бислое;

- изменение магнитной восприимчивости бислоев природных фосфолипидов, подвергнутых перекисному окислению, соответствует "отвердению" жидкокристаллического бислоя;

- путем расчетов и «экспериментальных исследований определены оптимальные параметры прямоточных высокоградиентных фильтров для магнитного разделения клеток;

- обнаружено резкое изменение диамагнитных свойств лимфоцитов человека при хранении и под действием УФ-иолучения;

- предложен и реализован способ измерения внутриклеточной физиологической концентрации метгемоглобина в эритроцитах;

- исследованы связывание различного рода лигандов (ионов, белков) клетками с предельной чувствительностью порядка 1 фем-томоля для белков с молекулярным весом порядка 30-50 тысяч дальтон; показана возможность определения числа мест связывания и констант связывания.

Разработанные в диссертации принципиально новые подходы и методы позволяют начать целенаправленное изучение биологических клеток, молекулярных и надмолекулярных структур клетки без нарушения их целостности, в состояниях, максимально приближенных тем, в которых они существуют в живой природе, изучая их через измерения таких материальных констант, как магнитный момент и магнитная восприимчивость. Это позволяет использовать для интерпретации результатов исследований хорошо развитый аппарат современной статистической физики, способствуя, в свою очередь, и его развитию. Таким образом, результаты работы ложатся в основу нового направления — магнетизм биологических микрообъектов, молекулярных и надмолекулярных структур клетки, способствуют развитию таких дисциплин, как физика малых объектов, биофизика и биохимия клетки, физика бислойных пленок, синергетика, медицинская биофизика и др.

Практическая значимость результатов работы. Разработанные в диссертации методы исследования магнитных свойств отдельных клеток и бислойных лишщных мембран и проведенные исследования составляют методическую основу для идентификации магнитных и физиологических свойств клеток, изучения процессов

lx функционирования, разделения по магнитным свойствам, исполь-ювания для целей медицинской диагностики, магнитного тестиро-1ания процессов адсорбции ионов, больших и малых молекул на по-(ерхность клеток и липосом, для тестирования иммунологического вязывания. Результаты работы расширяют наши знания о транс-юртных свойствах бислойных липидных мембран, изменениях ли-гидов в мембранах при окислении, позволяют определять предель-:ые дозы различного рода излучений на клетки и мембраны, про-одить анализ качества липосомных суспензий, применяемых в био-огии и медицине. Результаты работы могут быть испольоованы ля целенаправленного изучения липид-липидных, липид-белковых и елок-белковых взаимодействий, при разработке новых технологий а основе ленгмюровских пленок, новых двумерных магнитных си-гем и материалов на основе бислойных полимерных пленок.

Апробация работы. Результаты диссертации докладывались а: 15-ой (Тула, 1981, приглашенный доклад), 16-ой (Тула, 1983, при-ташенный доклад), 18-ой (Калинин, 1988 ) Всесоюзных конферен-иях по физике магнитных явлений, Международных конгресах по агнетизму ICM'82 ( Kyoto. Япония. 1982 ), ICM'88 ( Paris, Фран-ия, 1988), конференции "Intermag" ( Hamburg, 1984 ), 32 конфе-енции "Magnetism and Magnetic Materials" ( Chicago, США, 1987 ), •ей ( Montreal, 1984 ) и 4-ой (Vancouver, 1984) объединенных конфе-енциях "Intermag" и "МММ", 12-ом Всесоюзном совещании по маг-атной гидродинамике ( Саласпилс, 1987), 1-ом советско-болгарском шпооиуме по магнитобиологии и магнитотерапии ( София, 1989), 1-ом Всесоюзном совещании по магнитным фазовым переходам и эитическим явлениям" ( Махачкала, 1989 ), конференциях "Ломо-эсовские чтения" ( Москва, МГУ, 1981, 1985, 1991 ), семинарах ручных институтов ( Кристаллографии, Цниичермет, Химфизики, 'олекулярной биологии), была заслушана и одобрена Бюро Отделе-1Я общей физики и астрономии АН СССР.

»сновное содержание

первой главе рассмотрены результаты исследований магнитофо-:тической подвижности эритроцитов человека вблизи торца или жерхности соответственно продольно или поперечно намагничен-

ной тонкой магнитной проволочки; рассмотрены: схема и расчетные соотношения эксперимента по магнитному захвату, возможности использования эритроцитов в качестве модельной клеточной системы. движения этих клеток в диа- и парамагнитной модах, условия адекватного описания их движений в приближении идеальной жидкости, влияние конечных размеров клеток и их пристеночного торможения при захвате, рассмотрена возможность использования магнитного захвата для определения магнитной восприимчивости любой отдельно взятой биологической клетки.

Во второй главе изложены результаты исследований магнитной восприимчивости эритроцитов, содержащих гемоглобин основных форм: окси-, деокси- и нитритной метформы; результаты исследований магнитных состояний их гемов в зависимости от температуры, кислотно-щелочных свойств окружающей их среды, при процессах диссоциации-связывания кислорода внутриклеточным гемоглобином отдельной клетки.

В третьей главе изложены результаты исследований магнитного захвата бислойных липидных агрегатов - мультислойных сферических и цилиндрических липосом. Рассмотрена связь магнитной восприимчивости отдельной липосомы с её мультислойностью и с магнитной воприимчивостью и диамагнитной анизотропией липид-ного бислоя.

В четвертой главе рассмотрены результаты исследований диамагнитной восприимчивости и диамагнитной анизотропии бислоёв некоторых синтетических (дипальмитоиллецитин, димеристоилле-цитин) и природных (яичный лецитин, общие липиды оритроцитар-ных мембран) фосфолипидов, рассмотрено поведение диамагнитных свойств с изменением температуры.

В пятой главе рассмотрено влияние магнитного поля на поверхностное натяжение бислойных липидных пленок, на процесс формирования однослойных липосом.

В шестой главе рассмотрены некоторые приложения магнитного захвата: рассмотрены оптимальные условия работа прямоточного тонкопроволочного фильтра, изменение диамагнитных свойств лимфоцитов человека при хранении и под действием УФ излучения, показана возможность определения внутриклеточной концентрации гемоглобина в отдельных эритроцитах человека и определе-

ние внутриклеточной физиологической концентрации метгемоглоби-на в эритроцитах, возможность изучения адсорбции ионов, больших и малых молекул на поверхность клеток, позволяющая определять предельное число мест связывания и константы связывания.

I. Магнитный оахват и магнитная восприимчивость модельных клеток — эритроцитов человека

1. Схема эксперимента по магнитному захвату клеток [33*] представлена на рис. 1 а. Магнитная проволока и исследуемая частица помещены в жидкость. Магнитное поле, поперечно намагничивающее проволочку, направлено вдоль оси ОХ. Интересующие нас проекции траекторий частицы лежат в плоскости (х. у), перпендикулярной оси проволочки и силе тяжести. Движение частицы в этой плоскости определено действием пондеромоторной силы, уравновешенной (в пренебрежении инерциального вклада) силой сопротивления, которая при небольших скоростях движения клеток может быть представлена формулой Стокса.

Уравнение движения однородной сферической частицы радиуса /? (й < а. а — радиус проволочки) в координатах г,<р с учетом магнитных потенциалов, удовлетворяющих уравнению Лапласа, имеют вид [7, 8]

Г - Ум. (+ =252$)

Гаф = ütssae

__г (1)

а г» '

где га = г/а, Vm = х^^Яо/бт^аДеИ. М, — индукция насыщения материала проволочки, r¡ — вязкость буфера, V — объем частицы, Но — напряженность внешнего магнитного поля, ñ^ff — эффективней гидродинамический радиус частицы.

Семейство траекторий получается (рис. 2) посредством интегри-эования системы уравнений (1)

Дд = с sin 2(íp — а) (2)

'Де

с = (г^ + 2kr-al cos 2Vi + fc2)1/2(sin2<pi)~\

к sin 2tpi . „

tg 2a = , sin 2Vl ф 0;

rjj + к cos 2y>i

Рис. 2. Семейства траекторий ыагяитного захвата точечных частиц для случаев к = 1 (а) и к = 0 (б) [Т].

го1, — начальные координаты частицы- При зт2<^1 = 0 частица движется по одной из "прямых" траекторий — вдоль одной из осей х или у. Форма траекторий и характер магнитного захвата определяются величиной параметра к — М,/2Но. На рис. 2 представлены семейства траектории для к = 1 и к = 0. Как видно, характер траекторий двух предельных случаев сильно отличается: при к = 1 семейство исходит ио одной точки на поверхности проволочки, соответствующей <р = 7г/2, а при А: = О симметрично располагается относительно образующей, соответствующей </з = тг/4. При к = 1, т.е. в слабых, но намагничивающих проволочку до насыщения полях Но, область диамагнитного захвата на поверхности проволочки, к которой притягиваются частицы с х < 0, вырождается в линию вдоль образующей, соответствующей у> — 7г/2. При этом почти вся поверхность проволочки представляет собой область захвата парамагнитных частиц, для которых х > 0- С ростом Но зона диамагнитного о госвата на поверхности проволочки увеличивается и в предельно большом поле стремится сравняться с зоной парамагнитного захвата (к = 0).

Разделение пространства вокруг проволочки на области магнит-

Рис. 3. Зависимость критических углов <f,p(ra) при различных значениях параметра fe = М,/2Нц [7].

ных оахватов разных онаков, определяется значениями критических углов ¡рхр, при которых радиальная компонента, действующей на частицу силы

= М,а2Н0 г'3

меняет онак. т.е. при

¥>ip - arctg

1 +(АЛ2)

1 -Wrl)

(4)

На рис. 3 представлена зависимость ift?(ra) при различных к [10]. В области 0 < <р < ipZp следует ожидать притяжения частиц с х > 0 и выталкивания с х < 0, а в области <ptp < <р < 7г/2, наоборот, притяжение с х < 0 и выталкивание с х > 0.

Выражение для х получается интегрированием (1) по траектории на интервале [»ai, Wa2> <^2]; га2, <Р2 — конечные координаты частицы:

_ 2irriReffa2 F(ral,ra2,<pi,4b,k) Х H0MsV t К '

где t — время прохождения частицей указанного отрезка траектории t < 0, а

F{raUra2,^Uip2,k) = 2c2[sin(^i + V2 - 4а) х

xsin(W-ft) + |sml2e.ln^] ^ }

Ф1. Р'асггределегше нормальных эритроцитов. содержащих 95-97% оксигемоглоби-ва, вблизи торца тонкой ферромагнитной проволоки диаметром 20 мкм при её продольном намагничивании однородным внешним магнитным полем а — // = 0; б — II = 8 • 11Г А/м; разбавление эрптроцитоп 1:40 [1ж|.

при эт.

О и для '"прямых" траекторий, т.е. при sin — 0

F(ral)rai,k) = - r<s) =F kirl, - r%) + kHn ~

'al

2. Семейство траекторий (2) и расчетные соотношения (5) получены для часишы с й < о в приближении обтекания невяоким потоком. Возможность их использования для определении магнитной восприимчивости клеток научалась в основном на красных клетках крови — орпдрогштах человека. Эритроциты — легко доступные безъядерные клетки крови [12]. дискоидного тина, диаметром

8 мкм, однородные по составу (содержат ~ 71 % возы и

28";

гемоглобина (НЬ). Как оказалось, эритроциты в зависимости от состояния содержащегося в них гемоглобина проявляют различную по знаку магнитофоретическую подвижность [1*].

Клетки, содержащие деокси- и метгемоглобин. оказываются более, парамагнитными, чем буферная среда, восприимчивость которой близка восприимчивости воды: хн2о — —0,72- 10~б ед. С ГС/см3. Эти клетки притягиваются к торцу или поверхности соответственно продольно или поперечно намагниченной проволочки (см. фото Ф1).

Клетки же с оксигемоглобшюм оказываются слегка диамагнитное буфера и выталкиваются ио области максимальной редукции поля

Ф2. Распределение эритроцитов, содержащих 85-97% метгемоглоблна, а — вблизи поверхности тонкой ферромагнитной проволоки диаметром 20 мкм при • :о-перечном намагничивании; б — вблизи торца той же проволоки при продо.;., ¡ом вамагнлчпвалии.

В обоих случаях поле однородно, Я = 8 ■ 105 А/м, ралбавленпе эритроцитов 1:160 (Г|.

вблизи торца намагниченной вдоль оси проволочки (см. фото Ф2). Оценка магнитной восприимчивости эритроцитов [2*] показала. что X здоровых клеток однозначно определяется состоянием содержащегося в лих гелюглобипа. которое можно контролировать спектрофо-тометрически. Это позволило использовать эритроциты в качестве удобной клеточной модельной системы при обработке спосооа измерения магнитной восприимчивости отдельных клеток.

3. Наблюдение и регистрацию параметров траекторий движения клеток вблизи поверхности поперечно намагниченной проволочки при магнитном захвате проводили в герметичных кюветах объемом от нескольких десятых мл. и до нескольких мл. Кювету с закрепленной в ней проволочкой помещали на предметном столике микроскопа между полюсными наконечниками электромагнита так, чтобы обеспечить указанное на рис. 1 расположение проволочки, частицы и направление намагничивающего поля Но-

Луч подсветки, распространяясь вдоль оси проволочки (рис. 4), передает изображение поперечного сечения проволочки и находящихся в поле зрения микроскопа клеток на видикон видеокамеры, сопряженной с видеомагнитофоном. Движение клеток при магнитном захвате фиксировалось посредством видеозаписи, обработка ко-

5

~т~

% %

5-п-

Рис. 4.- Схема экспериментальной установки для наблюдения и регистрации траекторий магнитного захвата. 1 — термостатируемая кювета, 2 -— полюсные наконечники электромагнита. 3 — тонкая магнитная проволочка, 4 — видеокамера, 5 — видеомагнитофон, 6 — телемонитор, .7—-- термостат, 8 — термопара, 9 — перистальтический насос [33*].

торой пооволяла определить начальную и конечную координаты частицы и время ее движения между ними. На рис. 5 представлены типичные траектории диамагнитного захвата эритроцитов, содержащих ~ 99% оксигемоглобина и парамагнитного оахвата эритроцитов, содержащих дезокси- и метгемоглобин [3*,4*]. Там же штриховой линией даны подогнанные под эксперимент траектории, рассчитанные согласно (2) с учетом реальных параметров эксперимента. Наилучшее согласие наблюдалось для клеток двигавшихся при захвате по "прямым" или близким к ним траекториям.

4. Как следует из (5), отношение F/t с точностью до постоянного коэффициента определяет магнитную восприимчивость частицы относительно среды. Величина этого коэффициента зависит от отношения Reg/V. которая в случае клеток является эффективной ио-оа локальных искажений формы, наличия поверхностного заряда и ионной оболочки, а также вследствие неабсолютной упругости и гладкости мембраны клетки, проявляющихся при ее движении в жидкости. Что касается эритроцитов, то их недостатком как модельных клеточных частиц является отсутствие сферической симметрии формы клетки и чрезмерная эластичность, что сказывается на точности определения Д.s/V. Однако ввиду дискоидной формы

но а Hoj

'ис. 5. Экспериментальные (I) и расчётные (2) траектории клеток при диамагнит-гам захвате (о = 10 мхм к, = 0,18) (а) и при парамагнитном захвате (а = 55 мкм ; = 0,23) (б) [4*].

три седиментации и магнитном оахвате в сильно раобавленной сус-1еноии оритропит движется в плоскости своего диска. Определение зтношения Ra/V проводили в отдельных экспериментах по оседа-шю клеток в поле сил тяжести. Таким обраоом, с точностью до >тношения Refi/V распределение клеток по F/t соответствует их распределению по магнитной восприимчивости. Определение от-юшения F/t клетки проводили следующим обраоом. Траекторию магнитного оахвата частицы разбивают на отреоки. Для каждого >треока определяют координаты начала и конца и время прохожде-шя его частицей, после чего строят оависимость F(t). Типичный шд таких оависимостей, полученных при магнитном оахвате эритроцитов, содержащих гемоглобин основных форм, а также лимфо-датов человека при их движении по "прямым" или близким к ним траекториям, представлен на рис. 6. Как видно из рисунка, F ли-гейно изменяется со временем, что находится в согласии с (5) и юзволяет использовать ото обстоятельство для определения х кле-[чж [8*,9*,10*].

Отклонение от линейной зависимости F{t) наблюдается либо вда-ш от проволочки при больших радиусах оахвата, что обусловлено

Х-Ю°СГС/с»з

1,0

1 ; -I . - •

I • _ о А

о-1

• -2

0,5 1,01,с

Рис. 6. Примеры зависимостей для эритроцитов, содержащих метге-моглобин (1), деокигемоглобпн (3), и лимфоцитов человека (4) [10*]

Рис. 7. Относительная магнитная восприимчивость эритроцита в зависимости от расстояния его до проволочгп (измеренная в различные моменты времени магнитного захвата), рассчитанная по данным захвата без учёта (1) и с учётом (2), тормозящего действия поверхности проволочки [13].

неопределенностью в установлении времени прохождения частицей удаленных отреоков траекторий [10*], либо в непосредственной бли-оости к проволочке [9*,10*], за счет торможения, обусловленного несжимаемостью жидкости. В последнем случае в силу Стоксова сопротивления вооможно введение корректирующего параметра Л [15], "компенсирующего" тормозящее действие стенки (рис. 7): Л - 4дЬа Г п("+1) , [ 2»Ь(2п+1)а-К2п+1)»Ь2а Л

~ З®11"^ (2п-1)(2п-3) \4вЬ [п+(1/2)1а-(2л+1)зЬ а ' (ц)

а = агссЬ^^ .

Отклонения от линейной зависимости наблюдались также и для тех клеток, для которых наблюдалась худшая подгонка расчетных траектории к экспериментально наблюдаемым (см. рис. 5), т.е. для клеток, двигавшихся по "кривым" траекториям, причем тем большее отклонение, чем большей кривизной обладала траектория движения клетки. Оба обстоятельства, возможно, связаны с необходимостью учета вязкостных поправок и конечных раомеров клеток, проявляющихся при их движении по "кривым" траекториям.

Учет конечных раомеров частиц, имеющих форму диска и двигающихся по прямым траекториям, ведет к незначительным поправкам,

проявляющимся у поверхности проволочки и для частиц с й = 5 мкм у проволочек с ф 20 мкм оказывается меньше ошибки измерения параметров захвата [9*].

5. Анализ траекторий эритроцитов при захвате показал [Ю*], что клетки, проходящие через одну и ту же точку координатной плоскости (г, <р), далее, до момента захвата, двигаются по одной и той же траектории независимо от магнитной восприимчивости клетки. Это позволяет считать, что различие во времени прохождения близкими по размеру клетками одного и того же отрезка траектории обусловлено различной величиной их магнитной восприимчивости.

Магнитная восприимчивость исследуемой группы клеток определяется с помощью вероятных значений скоростей их оседания величин Р/Ь, определяемых из соответствующих гистограмм, полученных из данных наблюдений "прямых" или близких к ним траекторий магнитного захвата клеток. Примеры гистограмм величин Р/1 эритроцитов, содержащих гемоглобин основных форм и лимфоцитов, приведены на рис. 8 [6*, 10*]. Положение максимумом гистограмм и их форма отражают однородность состава каждой исследованной группы эритроцитов и позволяют определить величины их средней магнитной восприимчивости. Значение .Р/* весьма чувствительно к содержанию в клетках различных примесей. к, при тех же, что и на рис. 8 условиях эксперимента, разница расчетного времени прохождения идеализированной клеткой, содержащей весь гемоглобин в оксиформе, и такой же клеткой с примесью 0,5% метгемоглобина одинакового отрезка траектории при захвате, равного диаметру клетки, составляет ~ 2,5 с [11*]. Информация о содержании метгемоглобина в здоровых эритроцитах и его изменениях при патологии в пределах 0,3-2,0 % представляется весьма важной [48]. Известные спектрофотометрические способы определения метгемоглобина позволяют обнаружить наличие метгемоглобина в , клетках на уровне 0,8-1,0%, причем непременным является осво-^ бождение вещества клетки и удаление мембран. На том же рисун-А ке 8 представлена гистограмма распределения Р/£ лимфоцитов-че-ловека, подтверждающая чрезвычайно широкий спектр магнитных свойств этих клеток. При исследовании клеток с малым индуцированным магнитным моментом, как например, окснгенированные

10 -

рс£_.Тг[п>р

2 Г/Т, С-'

Рис. 8. Типичные гистограммы величин эритроцитов, содержащих метгемо-глобин (а), деохсигемоглобин (б), оксигемоглобин (в), и лимфодитов (г) [10*].

эритроциты или свежевыделенные лимфоциты человека необходимо добиваться наибольшей чувствительности по моменту. Величина grad Н, определяющая действующую на частицу силу, ограничена кривизной источника градиентного поля, которая должна несколько превышать размер исследуемой клетки, с тем чтобы ее дрейф при захвате составлял по крайней мере несколько ее диаметров (обычно 3-5), необходимых для измерения Р/Ь. Таким образом, чувствительность по моменту при заданной индукции насыщения материала проволочки, диаметр которой выбран, исходя из размеров клетки, определяется только величиной внешнего магнитного поля. Наименьшая измеренная величина момента составила ~ 105 магнетонов Бора в поле 1 кЭ у оксигенированных эритроцитов человека [1*. 4*].

6. При необходимости многократных измерений магнитнй восприимчивости одной и той же клетки следует использовать несколь-

Рис. 9. Взаимное расположение проволочки, частицы и направлений7 намагничивающего поля Но в эксперименте по магнитному захвату, позволяющее производить многократные измерения магнитного захвата отдельной клетки с диамагнитной (а) и парамагнитной (б) восприимчивостью относительно буферной среды [34*|.

ко иное взаимное расположение проволочки по отношению к направлению намагничивающего поля и силе тяжести [34*]. Схема такого эксперимента будет также отличаться от описанного выше ориентацией намагничивающего поля по отношению к направлению силы тяжести для клеток с разным знаком восприимчивости по отношению к буферу (рис. 9). Поскольку плотность клеток слегка превышает плотность буфера (плотность эритроцитов 1,096 г/см3), то для условий оахвата, представленных на рис. 9, и клеток с любым знаком х> манипулируя включением и выключением магнитного поля (не допуская оахвата клетки) можно переводить клетку с одной траектории захвата на другую (при выключении поля, за счёт силы тяжести) до тех пор, пока она не станет двигаться вдоль вертикальной оси. В дальнейшем можно проводить многократные измерения вертикальных перемещений данной клетки при захвате, измеряя при включении поля параметры оахвата, а при выключении — величину эффективного гидродинамического радиуса. В уравнение движения частицы при этом следует ввести силу тяжести, что приведет к тому, что выражения для х клетки не будет иметь аналитического вида и будет определяться путем простых численных расчетов, также зависящих от начальных и конечных координат клетки и времени её прохождения между ними.

II. Магнитные состояния гемов эритроцитов человека

1. Эритроциты считаются сравнительно простыми клетками. Основная их функция — перенос кислорода к тканям органиома, которую они выполняют с помогцью гемоглобина [16]. Активными центрами молекулы НЬ являются четыре атома желеоа, обеспечивающие кооперативный характер связывания НЬ с кислородом. В стереохимической модели гемоглобина [17] основой кооперативного связывания НЬ с кислородом является взаимосвязь четвертичной структуры белка и спинового состояния гемового желеоа. Магнитная восприимчивость всегда служила средством исследования свойств гемоглобинов в растворах. Поотому исследования магнитных свойств отдельных эритроцитов, содержащегося в них гемоглобина и его производных, чье состояние обусловлено спиновым состоянием желеоа, его изменением при обмене лигандами, а также изменением условий функционирования белка представляют как самостоятельный интерес, так и в сравнении со свойствами растворов гемоглобина.

Измерения магнитной восприимчивости растворов гемоглобина [18] показали, что оксигемоглобин (окси НЬ) диамагнитен и эффективный момент комплекса гемового желеоа с кислородом равен нулю. Существует несколько моделей [19, 20, 21], объясняющих диамагнетизм НЬОг. некоторое предпочтение отдается модели [21], в которой обратимое кислородное связывание осуществляется по схеме

НЬ (Heme d«) +02 ^ НЬ (Heme d?/2) О • 0~ , (9)

деогси НЬ окси НЬ

предполагающей перенос заряда в НЬОг от иона желеоа Fe2+ к молекуле кислорода с образованием ионосвязанного комплекса (Fe'+Oj )• Отсутствие магнетизма здесь объясняется существованием антиферромагнитной связи между спинами металла и лиганда. Развитые представления ставились под сомнение исследованием[22], проведенным с помощью СКВИД-магнетометрии и обнаружившим наличие парамагнетизма у окси НЬ. Эти измерения не согласовывались с измерениями магнитной восприимчивости, выполненными на отдельных оксигенированных эритроцитах, методом магнитного оахвата [1*, 4*] и из которых так же следовало нулевое значение

мкм/с)'

го

—|-г-

40 о г. "с

90

80

70

о " О т О

Г

- о о о о

20

40

Рис.10. Температурная зависимость Рис. 11. Температурная зависимость

сюростп магнитного захвата Ф/Х ок- \ftyv,) эритроцитов, седиментирую-

сигенированных эритроцитов, (рН ~ щих в буфере, (рН ~ 7,4)

7,4)

магнитного момента комплекса Ге-Ог- Впоследствии [20] оказалось, что данные работы [19] вызваны методической погрешностью и нестабильностью окси НЬ, особенно нестабильностью его природных форм в эритроцитах [24] сильно зависящей от температуры, и от свойств окружающей среды, индивидуальных свойств самих клеток.

2. Исследование магнитной восприимчивости внутриклеточного гемоглобина проводились на отдельных клетках в разбавленной суспензии способом магнитного захвата в интервале температур 255 °С и при измерении рН буферной среды от 4,5 до 9,5 [20*, 21*, 33*]. На рис. 10 представлена температурная зависимость отношения Г/Ь, пропорционального магнитной восприимчивости исследованных клеток. Каждая точка — среднее значение, полученное из гистограмм 50-100 клеток близкого размера по величинам Видно, что зависимость имеет немонотонный характер со слабо выраженными особенностями в области температур 7-12, 20-25 и 35-37 °С. При ~ 42,5 °С происходит смена знака магнитного захвата. Магнитная восприимчивость клетки становится более "парамагнитной", чем восприимчивость среды, и их движение переходит из диамагнитной в парамагнитную моду. Как отмечалось, отношение с точностью до iZeff/V соответствует магнитной восприимчивости клетки. Полагая, что эритроцит содержит раствор гемоглобина с концен-

о оо

о

О

О

а

о

Рис. 12. Температурная зависимость магнитной восприимчивости внутриклеточного окси-НЬ-О (рН ~ 7,4). 1 — изменение восприимчивости после барботирования кислородом в течение 30 мин при 45 °С, 2 — изменение восприимчивости при изменениях температуры в направлениях, указанных стрелками

трациеи

с?»

ио соотношения

Рис. 13. Восприимчивость отдельных эритроцитов относительно буфера (25 °С, рН ~ 7,4) от времени диффузии кислорода через газопроницае-му мембрану. 1 — диффузия кислорода из суспензии при обдувании ячейки аргоном, 2 — диффузия в деоксиге-нированную суспензию при обдувании ячейки воздухом

бтгГ^ДеЯ- = д{р\1Ъ ~ Рбуф)с]

,нь

(10)

при неизменном количестве внутриклеточного НЬ, т.е. • V видно, что величина 1 где V, — скорость седиментации клетки, пропорциональна Дя- На рис. 11 представлена зависимость 1/у,т} той же разбавленной суспензии клеток от температуры. На отой зависимости также в областях 7-12; 20-25 и 35-37 °С видны особенности оседания эритроцитов, которые коррелируют с особенностями их магнитного захвата: построенная по (5) из данных рисунков 10 и 11 магнитная восприимчивость внутриклеточного НЬ относительно буфера (рис. 12) имеет уже монотонный характер от температуры [18*, 19*]. Особенности, наблюдаемые на зависимостях 1 /(у,г]) от температуры, обусловлены, по-видимому, особенностями

термотропных свойств эритроцитарных мембран, приводящих к изменениям Reiг клеток.

Магнитная восприимчивость внутриклеточного НЬ, как окапалось, практически не зависит от температуры в области 2-30 °С и составляетх = -(0,774±0;005)-10_а СГС/см3. Выше 35 0С наблюдается резкое увеличение восприимчивости внутриклеточного окси-НЬ (см. рис. 12) [15*, 19*]. Измерения, выполненные после бар вотирования суспензии кислородом в течение 30 мин при 45 °С, показали, что возрастание восприимчивости обусловлено изменением парциального давления растворенного кислорода с увеличением температуры и термической деоксигенацией НЬ, приводящим к сдвигу равновесия присоединения кислорода к НЬ в сторону исходных реагентов. Обратимость восприимчивости при многократных изменениях температуры от 20 до 40 °С характеризует термическую деоксигенацию, а наличие гистерезиса — метгемоглобичеоащпо, т.е. необратимость окисления НЬ с переходом Fe2+ в Fe3+.

Высокая чувствительность магнитного захвата, превышающая чувствительность спектрофотометрических методов при измерении растворов, позволяет исследовать устойчивость эритроцитов от времени и при различных условиях функционирования. Так, при инкубировании эритроцитов в течение трех часов в буфере с рН от 6,0 до 9,5 при 20 °С показало, что изменение восприимчивости клеток соответствует накоплению ими за это время менее 1% мет НЬ.

3. Методом магнитного захвата исследованы кислород-обменные процессы на отдельных клетках по измерению их магнитной восприимчивости в зависимости от парциального давления кислорода в суспензии [33*]. Зависимость восприимчивости отдельных эритроцитов относительно буфера от времени диффузии кислорода через газопроницаемую мембрану при обдувании измерительной ячейки аргоном представлена на рис. 13 (рН = 7,4; 25°С). На том же рисунке дана зависимость восприимчивости клеток от времени диффузии кислорода в суспензию при обдувании ячейки воздухом (Рог = 150 мм рт.ст.). Представленные зависимости характеризуют изменение магнитной восприимчивости отдельных клеток при диссоциации и связывании внутриклеточного гемоглобина с кислородом. Из рисунка видно, что деоксигенация суспензии в течение ~ 1 часа приводит к "насыщению" восприимчивости, при которой

внутриклеточный НЬ полностью деоксигенируется. Трижды проводимые диссоциация — связывание одной и той же суспензии в пределах точности дают одинаковые результаты восприимчивости, что указывает на отсутствие необратимых изменений, в частности, метгемогло бинезации.

Степень насыщения кислородом внутриклеточного НЬ (У) связана с магнитной восприимчивостью эритроцита относительно буфера х> при условии аддитивного вклада в восприимчивость окси- и деоксигемоглобина, соотношением

•у _ .деоки-НЬ

У =—-5п- (и)

-^охси-НЬ _^аеокн-НЬ 4 '

где х°кси~НЪ и хАТО1СИ-НЬ — магнитные восприимчивости полностью оксигенированных и деоксигенированных клеток относительно буфера. Используя определяемую из эксперимента зависимость концентрации растворенного кислорода в области магнитного захвата от времени газообмена и зависимость на рис. 13, можно построить графики Хилла (см. рис. 14) для оксигенации и деоксигенации внутриклеточного НЬ. Поскольку время измерений магнитного оахва-та ~ 10 с, а время связывания (и освобождения) кислорода с гемом ~ 50 мс [25], то зависимости на рис. 13 имеют равновесный характер. Из данных, приведенных на рис. 14, видно, что сродство внутриклеточного НЬ к кислороду Р50 (парциальное давление кислорода, при котором насыщено 50% участков связывания) и параметр ко-оперативности Хилла п (характеризует крутизну при У = 0,5) при уменьшении парциального давления кислорода в суспензии (п = 2,4; До = 0,68 ст3 Оз/л) отличаются от п и До при увеличении давления кислорода (п = 2,8; Р50 = 0,45 ст3 СЬ/л). Отмеченная необратимость кривых диссоциации и связывания, вероятно, обусловлена изменением проницаемости мембраны эритроцита при обмене кислородом [26].

4. Для некоторых Ре3+-комплексов гемоглобина различие в энергиях высоко- и низкосшшовых состояний при комнатных температурах настолько мало, что между ними становятся возможны взаимные равновесные переходы. Измерения магнитной восприимчивости показали, что Ре3+-ион имеет эффективный момент, равный 4,5 рв при рН 9,5 и 5,8 рв при рН 7,0. Эти оначения являются про-

Рис. 14. График Хилла для диссоциации (1) и связывания (2) внутриклеточного гемоглобина с кислородом (25 °С, рН ~ 7,4)

Рис. 15. Температурная зависимость мо-лярпой магнитной восприимчивости нитратного гемоглобина. 1 — внутриклеточного, 2 — в растворе [27], 3 — расчётная зависимость по (12) и (13) при АН = 5,9 ккал/моль и Д5 = 15 ккал град/моль

межуточными между значениями, найденными для высокосшшового Ге3+ в НЪГ (5,9 /хв) и ниокосшшового — в НЪСИ (2,3-2,5 цв) [27].

Анализ температурной зависимости магнитной восприимчивости Ре3+ иона в четвертичных Л- и Т-структурах между 300 и 90 К показал [27], что при низких температурах (90-250 К) восприимчивость изменяется согласно закону Кюри и Ре3+-ион остается в низкоспиновом состоянии. В области 200-250 К наблюдались заметные отклонения от закона Кюри, отражающие сдвиг равновесия в сторону образования высокоспиновых состояний. При всех температурах магнитный момент в Т структуре был выше, чем в К-структуре. В области температур от 0 до 30 °С магнитная восприимчивость отражает наличие зависящего от температуры спинового равновесия и может быть представлена в виде

1 А^+Мь

8Т Аг + 1

(12)

где к — константа равновесия между высоко и низкоспиновыми состояниями, /ли и рь — соответственно магнитные моменты этих состояний. Подгонка экспериментальных данных дает наилучшее согласие для х согласно (12) при к, выраженном через энергию Гиббса

(АС):

( АС\ ( АН-ТАБ\ „ .

к = ехр(-вт) = ехр[--вт—) (13>

с эмпирически подобранными значениями АН и Д5.

На рис. 15 представлена температурная зависимость молярной магнитной восприимчивости внутриклеточного нитритного мет НЬ, полученная с помощью магнитного захвата отдельных эритроцитов [14*, 33*]. Для сравнения там же приведены результаты измерений Хы, полученные на растворах нитритного мет НЬ [27], удовлетворительно описываемые (12) и (13) с подгоночными значениями энтальпии ^АН = 2,6 ккал/моль и энтропии АБ = 5,7 ккал • град/моль. Как видно, восприимчивость нитритного мет НЬ имеет тот же па-клон, что и восприимчивость раствора, но несколько превышает ее по абсолютным значениям. Попытка описать поведение внутриклеточного мет НЬ выражениями (12) и (13) дала наилучшее согласие при АН = 5,9 ккал/моль, А5 = 15 ккал - град/моль (штриховая линия через экспериментальные точки), но с меньшей, чем эксперимент крутизной. Отмеченные количественные несоответствия между поведением х(-0 нитритного мет НЬ в растворах и в клетках могут быть обусловлены чрезвычайно высокой чувствительностью НЬ к действию окислителя (в качестве окислителя использовался 23мМ раствор МаГЮг- Наличие метформы контролировалось по спектрам поглощения гемолизатов и составляло 97-99%), приводящему к изменению спинового состояния гемового железа [17]: при присоединенном Ре—(ЖО преобладает высокоспиновое состояние, а при Ре—N02 — низкоспиновое. По-видимому, в клетках при повышении температуры равновесие смещается в сторону низкоспиновых состояний. Спиновое равновесие нитритного мет НЬ в клетках наблюдается и при титровании. На рис. 16 приведена рН зависимость магнитной восприимчивости эритроцитов, содержащих нитритный мет НЬ относительно буфера при 20 °С, полученная способом магнитного захвата [33*]. Увеличение восприимчивости при протони-ровании связано со стабилизацией высокоспиновой Т-формы.

Рис. 16. Магнитная восприимчивость эритроцитов, содержащих гаггрптный метге-моглобнн относительно буфера при различных рН (20 °С)

III. Магнитный «захват бислойных липидных агрегатов — мультислойных липосом

1. В системе липид — вода при малой концентрации липида самопроизвольно могут образовываться мультислойные сферические или цилиндрические агрегаты -— липосомы (рис. 17). Каждый би-слой — два монослоя Гиббса амфифилов с обращенными друг другу олеофильными "хвостами" в виде одной или двух углеводородных цепей [28]. Толщина бислоя ~ 50 Á. Такая бислойная пленка представляет собой простейшую искусственно созданную надмолекулярную структуру, и является моделью остова биологической мембраны.

Нами удалось наблюдать и исследовать магнитный захват мультислойных сферических [15*-17*] и цилиндрических [22*,23*] липосом синтетических фосфолипидов: дипальмитоиллецитина (ДПЛ) и димеристоиллецитина (ДМЛ) фирмы Serva, ФРГ, а также природных фосфолипидов: ЯЛ и общих лнпидов оритроцитарных мембран (ЛЭМ) Харьковского предприятия по производству бактерийных препаратов. Суспензии липосом готовили из спиртовых растворов ЯЛ и ЛЭМ и растворов ДПЛ и ДМЛ в хлороформе методом [30], при котором получаются крупные, радиусом 3-4 мкм, липосомы, близкие к сферической форме и имеющие небольшое число бислоев. Концентрация липида в суспензии не превышала 0,5%. Ми-кроолектронные исследования таких липосом [31] покапывают, что в целом они соответствуют модели — образованы концентрическими бислоями с небольшим числом дефектов. Магнитный захват липосом из ДПЛ, ДМЛ и ЯЛ исследовали в дистиллированной воде,а

Вода

щшшшшшшяа

гаязшшшшшш

а

Полярная головка

.Углеводородные : -

хвосты

Рис. 17. Схематическое изображение бвслойных агрегатов, образуемых фосфоли-ппдами в водных средах: а — фрагмент ламеллярной структуры, 6 — однослойной ив — мультислойной сферических липосом. г — мультислойвой цилиндрической везикулы. Показаны параметры фориы цилиндрической везикулы, подлежащие измерениям

липосом ио ЛЭМ в 50 мМ трис-буфере, при рН 7,2. Специальных мер по предотвращению перекисного автоокисления природных ли-пидов не предпринимали, но степень их окисленности контролировали спектрофотометрически на спектрометре "иШСАМ". Критерием степени перекисного окисления липидов (ПОЛ) служил индекс Клейна [32] — Л(233)/Л(215)-отношение интенсивности поглощения водно-спиртовым раствором липосом излучения с длиной волны 233 нм к интенсивности поглощения тем же раствором излучения с длиной волны 215 нм. Этиловый спирт использовался как для остановки реакции ПОЛ, так и для предотвращения светорассеяния при фотометрии — 1 мл спирта на 0,002 мл 0,5% водной липосомной суспензии полностью растворяет липосомы в смеси вода-спирт. Различная степень ПОЛ достигалась либо спонтанным окислением сус-

пеноий в течении 1-4 суток, либо инкубированием их при 50 °С в течении 0,5-5 часов, либо инициированием окисления посредством облучения светом кварцевой лампы.

Как видно ио (5), магнитная восприимчивость частицы относительно среды с точностью до постоянной величины определяется отношением F/t. Величина же этой постоянной оависит от отношения hR^g/V, которое в случае липосом является эффективным и должно быть определено для каждой липосомы при каждой исследованной температуре. Вязкие и магнитные свойства трис-буфера в виду малости солевых добавок считали близкими свойствам воды. При определении магнитной восприимчивости липосом по данным их магнитного оахвата при разных температурах, в (5) учитывали изменение с температурой вяоких свойств среды — воды [33] и не учитывали иоменений с температурой ее магнитных свойств. Магнитную восприимчивость воды считали равной — (-0,718) ■ 10~в ед. СГС/см3 [34]. Величину эффективного гидродинамического радиуса сферической липосомы считали равной величине ее геометрического радиуса, которую определяли путем намерения на экране монитора. Предельное разрешение величины оптического изображения при этом было менее 1 мкм.

2. Магнитная восприимчивость i-й липосомы Xi относительно буфера связана с восприимчивостью среды Хбуф и лили да Ха очевидным соотношением [15*,31*]

Х< = (Хл -Хбуф)^ » (14)

где V{ — объем измеряемой t-й везикулы, и, — объем ее лшщдной части. Полагая, что липосома состоит из целого числа концентрических бислоев п одинаковой толщины I, при nl Ri (что легко выполнимо при небольших п), получим, что произведение Xif$ Для каждой г-й липосомы пропорционально числу бислоев в ней щ, т.е.

Xi§ = "¿(Хл - Хбуф) • (15)

Коэффициент пропорциональности (хл — Хбуф) равен магнитной восприимчивости бислойной упаковки липидных молекул относительно среды. Таким образом, экспериментально определяемые величины

каждой исследуемой веоикулы должны совпадать с дискретным рядом значений п*(хл~ Хбуф), соответствующим целочисленным значениям щ. Значения толщин бислоев исследованных фосфолипидов принимали равными: 42,8 А и 47,5 А для ДПЛ соответственно выше и ниже Тс, 46,6 А для ДМЛ при 25 °С [35], и 45 А для ЯЛ и ЛЭМ во всем исследованном интервале температур [36].

На рис. 18 представлены типичные гистограммы распределения липосом из ЯЛ и ДПЛ по величинам х<На гистограммах хорошо видны несколько максимумов. Обработка гистограмм показала, что действительно можно найти такие значения (хл — Хбуф) Для которых положения максимумов будут совпадать или будут близкими дискретному ряду (хл — Хбуф)п, с целочисленными значениями го,. Именно эти целочисленные значения щ и трактовались как ламеллярность, т.е. как число концентрических бислоев в измеренной липосоме, а коэффициент пропорциональности (хл — Хбуф) — как магнитная восприимчивость бислойной упаковки липидных молекул относительно буфера.

" На гистограммах отсутствуют данные о распределении липосом с малым числом бислоев. В экспериментах наблюдались и медленно перемещающиеся веоикулы, однако, времена магнитного захвата таких липосом определяются с большой ошибкой, поэтому их восприимчивость не определялась. Отсутствие максимумов, соответствующих везикулам с большим числом слоев обусловлено как дефектами, число которых нарастает с увеличением лини да в липосомах с большим щ (нарушение концентрической упаковки,включение сухого вещества липида и др.), так и нарушением условия п«С . Средние значения величин относительной магнитной восприимчивости Дх = (Хл _ Хбуф) бислоев ДПЛ, ДМЛ, ЯЛ и ЛЭМ, полученные из гистограмм распределения липосом этих лшшдов по величи-

р „

нам х^ при температурах выше температур переходов гель-жидкии кристалл приведены в таблице 1.

IV. Диамагнитная восприимчивость и диамагнитная анизотропия БЛМ

1. На рис. 19 представлена температурная зависимость магнитной восприимчивости бислоя ДПЛ [32*]. Слева по оси ординат отложе-

Мультислойнасть

5 10 15 20 п -1-1-1-1—

||

О 1,00 2,00

Х{ А 1-ГО5, СГС/см 5

в)

У1

1,00 2,00 3,00 -X; £>¿/31 • 10в, СГС/см7

4.00

ламеллярность

п.гППп

Г]

шм мё пп

42°С

7 3 9 10 11

12

ламеллярность

____П____ПI

п гь

т

71ггШПГЬ1гН

гтт

ПН

пгыТ

зз°с

П.

Рис. 18. Ткдичные гистограммы распределения лнпосом из ЯЛ (а) и ДПЛ (б, в) по величинам х^'/Зе

Таблица 1: Величины относительной Л\ и удельной \ магнитной восприимчивости бпслоев исследаванных фосфолпдидов.

липид температура измерения, "С

ДХ • Ю7 ед. СГС/см3 X • Ю7 ед. СГС/см3

ДПЛ

: 45,5

1,06 ±0,02 6,12 ± 0,02

дмл

25

0,68 ± 0,1 6,50 ±0,1

ЯЛ 19

1,30 ±0,1 5,88 ±0,1

ЛЭМ 9

0.48 ± 0,06 6,70 ± 0,06

0,60

0,70

50

i-г

40 50 Г. °С -1-г

• •• •

JL10\ ед.СГС/с^

Рис. 19. Температурная зависимость магнитной восприимчивости бислоя ДПЛ.

ны значения восприимчивости относительно буферной среды, полученные методом магнитного оахвата мультислойных сферических везикул. а справа — значения удельной магнитной восприимчивости. С понижением температуры от 53 °С наблюдается практически температурно-независимое поведение хдпл вплоть до Гс ~ 41 °С — температуры основного перехода. Движение липосом в этом температурном интервале при магнитном захвате наблюдалось в парамагнитной моде, т.е. везикулы притягивались к проволочке в область с максимальным значением ¡«¡гас! Н. При Т ~ Ус наблюдалась смена знака магнитного оахвата — липосомы становились более диамагнитны, чем среда и притягивались к проволочке в область с максимальной редукцией магнитного поля. Наблюдаемое изменение знака магнитного захвата при Тс, а вместе с ним и значения величин магнитной восприимчивости, были обратимы по температуре, т.е. наблюдались всякий раз при переходе черео Хс независимо от того, повышалась или понижалась температура в процессе измерения. Ниже Тс значение магнитной восприимчивости бислоя ДПЛ составило —7,6 • Ю-' ед. СГС/см3. При этом мы учитывали изменение толщины бислоя ДПЛ при переходе через Тс от 42,8 Ав £„ фазе до 47,5 А в Рь-фазе [35]. Измерений восприимчивости в области температур существенно меньших Гс нами не проводилось.

2. Оценка величин магнитных восприимчивостей ДПЛ и ДМЛ по схеме Паскаля, по которой восприимчивость молекулы предста-

вляется в виде суммы восприимчивостей составляющих ее атомов и их связей, дает для этих липидов, отличающихся только наличием у ДПЛ двух дополнительных СНг-групп в каждой ацильной цепи, соответственно значения —520 • 10~в и —470 • Ю-8 ед. СГС/моль.

Необходимые для расчета величины атомных восприимчивостей и межатомных связей, брали из [38]. Расчетные значения восприимчивостей обоих липидов несколько превышают их эксперимен-

тальные значения, равные Хдпл — —450 • 10~® и хдмл = —420 •

10~6 ед. СГС/моль. Последние получены путем пересчета данных из таблицы 1, с учетом соответствующих значений молекулярного веса и, близких к условиям нашего эксперимента, значений плотности: рдпл = 0,995 г/см3 и к рдмл = 1,067 г/см3 [39]. Отношение экспериментальных значений хдпл/хдмл всего на 3% отличается от отношения их расчетных значений,несмотря на то что сравнивае-

0,40

0,50

0,60

20 —1—

20 40 Г."С

••• *•

/10*ед. сгс/см-

Рис. 20. Температурная зависимость магнитной восприимчивости бислоя ЯЛ, полученная при повышении температуры.

мые лшшды находились в разных фаоовых состояниях.

При охлаждении бислой ДПЛ при 41 °С претерпевает переход ио Ьа в Р^-фазу, сопровождающийся уменьшением молекулярного объема чуть более 5% [39]. Величина восприимчивости при этом по нашим данным (см. рис. 19) поменяется от —6,12 • 10"' до оначения -7,60- Ю-7 ед. СГС/см3, которое по сравнению с хдпл в фазе. напротив, несколько превышает восприимчивость, рассчитанную по схеме Паскаля. Таким образом, наблюдаемый в ДПЛ при 41 °С скачек восприимчивости нельзя объяснить одним лишь изменением молекулярного объема. Необходимо учитывать изменение характера межмолекулярных связей и, обусловленное им, изменение в Рь' фаое характера флуктуации так называемого директора, квадрат среднего оначения которого определяет величину анизотропной магнитной восприимчивости отдельной молекулы.

3. Температурная зависимость магнитной восприимчивости бислоя ЯЛ [32*], полученная при повышении температуры от 17 до 47 "С, представлена на рис. 20. Здесь так же слева по оси ординат даны значения относительной, а справа — удельной магнитной восприимчивости. Скорость повышения температуры между измерениями была около 0,5 °С/мин. При каждой исследованной температуре измерялся магнитный захват 50-200 лилосом. Можно отметить,

0,50

0,60

20 30 40 Т. °С

\ % о -2

о**

0,70

ХЮ*ед.СГС/с„3

Рис. 21. Температурная зависимость магнитной восприимчивости бислоя ЛЭМ, полученная при повышении (1) и при понижении (2) температуры.

в целом, температурыо-неоависимый ход диамагнитной восприимчивости бислоя ЯЛ, на котором видны области ее аномального поведения. Так, в области температур 22-23, 32-34 и 38-43 °С наблюдалось уменьшение абсолютных оначений магнитной восприимчивости бислоя. причем внутри областей 22-23 и 32-34 °С величины восприимчивости неопачительно превышая погрешность измерений, отличались от величины ее температурно-неоависимого фона, а в интервале 38-43 °С наблюдалось значительное, по сравнению с фоновым, изменение восприимчивости.

Нами была обнаружена тенденция к сдвигу областей аномального поведения восприимчивости в сторону более высоких температур при умелыпении скорости нагревания липосомной суспензии. Детально этот вопрос, однако, не исследовался. Все результаты температурных измерений, приведенные в этой работе, получены при постоянной, указанной выше, скорости нагревания исследуемой суспензии.

На рис. 21 представлены результаты измерений температурной зависимости магнитной восприимчивости бислоя ЛЭМ [32*], полученные при повышении температуры от 17 до 38 °С. Здесь также,как и в ЯЛ, наблюдается в целом диамагнитный, температурно-незави-симый ход восприимчивости, на котором видны области аномального поведения хлэм? сходные по форме с найденными в ЯЛ.но при иных температурах: 25-26 и 29-30 "С.

20 30 40 Т,°С

0,63 0,65 0,67

_/•/<?,6 ед. СГС/с

Рис. 22. Температурная зависимость магнитной восприимчивости 15% водной суспензии ЯЛ,полученная посредством измерений на весах Фараде* (1) — при повышении и (2) — при понижении температуры.

Области аномального поведения х{Т) и в ЯЛ, и в ЛЭМ проявляясь только при повышении температуры. С понижением температуры в ЯЛ от 47 до 17 °С, а в ЛЭМ от 38 до 17 °С, отмеченные при нагревании особенности не наблюдались и восприимчивость бислой-ной упаковки этих липидов оставалась практически независящей от температуры.

Водные суспензии липосом, которые мы исследовали содержали менее 1% фосфолипидов. Измерить, с целью проверки, лшшдную часть магнитной восприимчивости такой суспензии каким либо другим способом в настоящее время довольно сложно. Тем не менее, исходя из величины самой яркой особенности, наблюдаемой в ЯЛ при 41 °С, можно предположить, что эта особенность будет разрешена при исследовании 15%-й водной суспензии ЯЛ с помощью магнитных весов Фарадея. Результаты исследований х(Т) такой суспензии [32*], полученные при нагревании, в которой, как мы полагали, ЯЛ находился в упорядоченной магнитным полем ламеллярной фазе, представлены на рис. 22. Как следует из сравнения рисунков 20 и 22 в целом зависимость Хял{Т) в ламеллярной фазе коррелирует с Хял{Т), полученной методом магнитного захвата и в области 30 и в области 40 °С. Измерения на магнитных весах также показали температурную необратимость хял(Т) исследованной ламеллярной фазы: особенности, проявлявшиеся при повышении температуры,

•

° -2

О О °

•••• о

О °

при понижении температуры не наблюдались.

4. В суспензии везикул подготовленных к измерениям, обычно, всегда присутствуют удлиненные липосомы. Форма каждой такой ¿-и везикулы может быть апроксимированна (рис. 17) цилиндрической поверхностью длины Ь{ с замыкающими на ее торцах полусферами радиуса Я*. Такие цилиндрические везикулы в постоянном однородном магнитном поле претерпевают поворот — изменение ориентации длинной оси липосомы, что может быть использовано для определения анизотропии магнитной восприимчивости липид-ного бислоя [2]. Разность (хц — Х±) между продольной и поперечной компонентами тензора х, характеризующая диамагнитную анизотропию бислоя, может быть определена при этом из соотношения:

(Х|| - Х±) = Щ1п tg <7о - 1п (16)

Здесь к — постоянная Больцмана, Т — температура, <1 — п(1 — толщина липидного слоя липосомы, п,- — число бислоев в ней. Выражение (16) полученно из условия равенства действующих на липосому моментов сил: магнитной и силы торможения, препятствующей повороту. Этим способом нами была определена диамагнитная анизотропия бислоев ДПЛ при Т > Тс и ЯЛ в зависимости от температуры. В эксперименте измерялись: до и — углы между направлением поля и длинной осью липосомы в момент включения поля Но и через время £ соответственно. Коэффициент вращательной диффузии ли-посом .О; определялся для каждой липосомы по ее спонтанному движению в отсутствии поля с помощью соотношения = [37]. При этом оказалось, что Д ~ 1 /г4, (см. рис. 23, [23*, 29*]), где г — "приведенный" параметр, а

Г4 = Д(| Д3 + §Д2 + + Ь3) (17)

что подтверждает возможность рассмотрения таких линосом, кале ограниченных полусферами цилиндров с малой толщиной липидного слоя.

Таким способом было исследовано около 50 цилиндрических везикул ДПЛ. Из гистограмм их распределения по величинам (хц — полученным согласно (15), было определено средпее значение коэффициента пропорциональности (хц — Х±) — диамагнитной

Рис. 23. Экспериментальная зависимость коэффициента вращательной диффузии мультислойных цилиндрических везикул Д- от 1 /г4, (/-"приведешшй" параметр, см. пояснение в тексте).

анизотропии бислоя ДПЛ, которое при температуре 45,5 °С составило (-0,54 4- 0,05) • 10~7 ед. СГС/см3.

Магнитный захват цилиндрических везикул также позволяет определить величину диамагнитной анизотропии липидного бислоя. Процесс захвата цилиндрической липосомы начинается с фазы ее поворота в поле, который происходит гораздо быстрее собственно захвата частицы проволочкой. Измерение параметров поворота и захвата такой липосомы позволяет не только определить диамагнитную анизотропию бислоя, но и значительно упростить оту процедуру, поскольку число бислоев в такой липосоме можно определить из величины ее магнитной восприимчивости, измеренной в процессе захвата, и восприимчивости бислоя, известной по измерениям сферических везикул. Оба способа: и магнитный захват цилиндрических липосом и их поворот в однородном магнитном поле в пределах точности измерений дают одинаковый результат.

5. Величину диамагнитной анизотропии бислоя ДПЛ в Ьа фазе уместно сопоставить с анизотропией в кристаллическом состоянии [40], полученной посредством измерения параметров поворота

§ «о

. 0,20 -

х

а,40 ■

20

10 —I—

40

• • «V. ••• »• ••

• а • •

Рас. 24. Температурные зависимости анизотропии магнитной восприимчивости (Х|| —Хх) бислоя ЯЛ, полученной при нагревании суспензии

микрокристаллов ДПЛ в магнитном поле. Как отмечалось в [40], величина диамагнитной анизотропии микрокристаллов ДПЛ при 22 "С, т.е. в Ьа-фаое,составляла —0,9 • Ю-7 ед. СГС/см3 и несколько уменьшалась по абсолютной величине с повышением температуры до 30 °С. При этом наблюдалось почти полное исчезновение оптической анизотропии в плоскости. По нашим данным, переход в изотропную ¿„-фазу не приводит к исчезновению диамагнитной анизотропии. но уменьшает ее до —0,54-10~7 ед. СГС/см3, т.е., в сравнении с [40], в 1,7 раза. Величина анизотропии в Ьа фазе составляет 9% от среднего значения х? вместо 12% в 2,с-фазе и в 5 раз превышает анизотропию кристаллического полиэтилена, состоящего только из углеводородных цепей.

Сопоставление наших данных с данными работы [40], позволяет считать, что диамагнитная анизотропия бислоя ДПЛ в £,а-фазе обусловлена транс- конфигурацией ацильных цепей, жестко связанных, согласно [41], с глицериновым остовом в виде верхней части прописной русской буквы "У" и совершающих движения вокруг длинной оси молекулы. Фосфатно-холиновая головная группа, лежащая в плоскости бислоя и соединенная с ацильными цепочками в виде выходящего из плоскости нижнего хвостика этой же буквы "У", в £с-фазе дает температурно-оависимый вклад в анизотропию, который примерно на —0,35 • 10~7 ед. СГС/см3 в Хс-фазе увеличивает величину диамагнитной анизотропии. Этот же вклад обуславливает и появление оптической анизотропии в плоскости микрокристаллов ниже 30 °С.

6. На рис. 24 представлены результаты измерений температур-

ной оависимости диамагнитной анизотропии бислоя ЯЛ [31*,32*], полученные посредством намерения параметров поворота мульти-слойных цилиндрических.липосом в однородном магнитном поле. Существенным при проведении зтих измерений было то, что они проведены на 5-ти различных везикулах, так что: на одной липо-соме проходили один температурный интервал, на другой другой и т.д., причем следили, чтобы интервалы перекрывались. Таким же образом проводили и повторные измерения. Получить же всю температурную зависимость на одной липосоме не удавалось — любая неосторожность приводила к потере липосомы" из поля зрения микроскопа.Как видно из рис. 24 температурная зависимость (х|| ~ Хх) ЯЛ, имеет особенности при тех же температурах, что и х(^0 этого липида, проявляющиеся в увеличении абсолютных значений диамагнитной анизотропии.

Диамагнитная анизотропия бислоя ЯЛ, измеренная нами, в области температур 18-20 °С составила (-0,23 ±0,05) • Ю-7 ед. СГС/см3 и, более чем в 4 раза, превысила максимальное значение анизотропии, полученное в работах [42, 43], в которых наблюдали сильный разброс величин анизотропии и полагали, что при этих температурах ЯЛ находится в £а-фаое. Полученное при комнатной температуре значение анизотропии определяет величину температурно-независимого фона, на котором видны особенности, которые можно связать с изменением характера как внутримолекулярных, так и межмолекулярных связей. Следует обратить внимание на поведение анизотропии в области 40 °С. В отой области, от 39,5 °С наблюдается резкий рост анизотропии, которая достигает максимального значения при Т ~ 41 °С, а затем так же резко спадает до значения,близкого значению температурнонезависимого фона. От 42 °С вновь наблюдается резкий рост анизотропии, величина которой при 45 °С достигает значения —0,43 • Ю-7 ед. СГС/см3, близкого значению анизотропии бислоя ДПЛ в жидкокристаллической фазе.

Несмотря на то, что система стабилизации температуры (±0,25) была недостаточной для разрешения тонких температурных эффектов, у нас нет оснований считать измерение при 42 °С "выпавшей" . точкой. Эта точка выявляет пик в области 41 °С, совпадающий с пиком магнитной восприимчивости, наблюдаемым при той же температуре (см. рис. 20). Принимая во внимание необратимый харак-

тер восстановления свойств ЯЛ при охлаждении-нагревании, именно этот пик, вероятно, определяет верхнюю температурную границу области биологической устойчивости модельных бислойных систем из ЯЛ.

Обнаруженные в бислоях ЯЛ и ЛЭМ особенности аномального поведения магнитной восприимчивости и ее анизотропии, имеют сходный характер [30*]. Они имеют горбообразную или пикообрао-ную форму и необратимы по температуре, т.е. не проявляются при охлаждении исследуемой суспензии.В области же особенностей би-слон становятся "менее" диамагнитными и "более" анизотропными.

Другим важным обстоятельством является то, что величина тем-пературнонезависимого фона диамагнитной аниоотропии бислоя ЯЛ, на котором в области температур до 42 °С проявляются упомянутые особенности, существенно меньше тех значений, на которые анизотропия бислоя стремится выйти выше 42 °С. Такой характер температурной зависимости диамагнитной аниоотропии бислоя ЯЛ, близость ее величин при температурах выше 42 °С величинам анизотропии бислоя ДПЛ в 1,а-фазе молекулярное строение которого близко молекулярному строению ЯЛ, позволяют нам считать, что истинный переход в жидкокристаллическую Ьа-фазу ЯЛ претерпевает при температуре ~42°С.

Существенно меньшую (по сравнению с £а-фазой) величину тем-пературнонезависимого фона анизотропии в ЯЛ в области температур до 42 °С следует объяснять существованием некоторой дополнительной межмолекулярной связи. В этом случае, наблюдаемые особенности следует рассматривать как перестройки структуры бислоя, происходящие в результате актов распада молекулярных связей. Освобождение связей может происходить, например, в результате "плавления" сосуществующих фаз — кластерных образований, состоящих из молекул "одного" сорта. Кавычки здесь означают что взятые в них понятия не следует понимать буквально. Такой акт может оказаться и смешиванием липидных молекул друг в друге, происходящем при критической температуре смешивания, которая определяется количественным отношением составляющих бислой ли-пидов.

Как отмечалось,особенности — области аномального поведения магнитной восприимчивости не проявляются при охлаждении. На-

20

30

■40 Г,°С

* 0.50

I

е о, во

V* о0*»

- ..оо.«0

Рис. 25. Расчётные значения продольной \ц и поперечной Хх компо-- нент тензора магнитной проницаемости бислоя ЯЛ в зависимости от температуры

ми наблюдалось восстановление характера х{Т), соответствующего структурным перестройкам, при повторном нагревании липосомной суспензии после ее нефиксированного по времени хранения в холодильном шкафу. В связи с этим, мы связываем проявляющийся при охлаждении неравновесный характер структурных превращений в ЯЛ с переходом из ¿а-фаоы в метастабильную жидкокристаллическую фазу, из которой происходит восстановление в стабильную фазу, структурированную межмолекулярной связью. Измерений времен жизни этого метастабильного состояния нами не проводилось.

7. Из измерений диамагнитной анизотропии (хц — Х±)и средней магнитной восприимчивости, которая в силу радиального расположения молекул липида в липосоме равна х = |(Х|| + 2Х-0> можно оценить продольную хц и поперечную х± компоненты тензора с липидного бислоя в жидкокристаллическом состоянии. Для бислоя ДПЛ эти величины составили: Х|| — —6)40 • Ю-7 и х± = -5,85 • Ю-7 ед. СГС/см3.

Используя данные рис. 20 и 24, можно определить зависимости от температуры компонент тензора х ЯЛ. Характер этих зависимостей оказался (см. рис. 25) даже более выразительным по сравнению с зависимостями х и (хц — Хх) от температуры. Как видно из рис. 25, обе компоненты тензора синхронно изменяются с температурой: уменьшаются в областях отмеченных структурных перестроек, причем заметнее уменьшается х±-

Такое поведение компонент теноора с согласуется с предположением об ослаблении межмолекулярных свяоей в процессе перестройки структуры бислоя, приводящем к увеличению молекулярного объема [30*]. В этом случае в области структурной перестройки можно ожидать уменьшение упругих свойств и вооникновение флуктуации концентрации или флуктуаций плотности, если рассматривается однокомпонентный липид при основном переходе. Это может привести к аномальному увеличению диффузионно-транспортных свойств, увеличению ионной проводимости. Не исключено и изменение формы бислойной поверхности, появление рипплов.

Сходные термотропные изменения структуры, вероятно, существуют и в реальных биологических мембранах. В [20*] в узких температурных областях наблюдались особенности ,Р/£ — скорости магнитного захвата одиночных оксигенированных эритроцитов человека. При определении магнитной восприимчивости клетки методом магнитного захвата, эти особенности компенсировались при подстановке в (5), наблюдаемыми при тех же температурах, особенностями /¿.{г и, в целом, обуславливали независящую от температуры магнитную восприимчивость всей клетки. Это и позволяло рассматривать упомянутые особенности, как возникающие вследствие термотропной перестройки лшшдного остова оритроцитарной мембраны, приводящей к изменению приповерхностного слоя клетки и ее Дд за счет изменения при перестройке констант различного рода связывания. О возможном изменении приповерхностного слоя клетки и ее Я^-ц при структурной перестройке говорит,например, наблюдаемое в ¡З-лецитине при Ьъ —Ьа переходе значительное увеличение числа молекул связанной воды, приходящихся на молекулу пипида [36].

7. Как отмечалось, суспензия лило сом природных лшгадов при храпении подвержена спонтанному окислению. В связи с этим, воо-аикал вопрос о влиянии ПОЛ на магнитную восприимчивость фос-|>олипидного бислоя, которое могло оказаться существенным, особенно при температурных измерениях.Как оказалось, такая зависимость между с и ПОЛ действительно существует. Однако, автооки-:ление липосом из ЯЛ и ЛЭМ даже при самых длительных температурных измерениях не вносило сколь нибудь заметных изменений в измеряемые величины с и находилось в пределах погрешности изме-

А<215)

Рис. 26. Зависимость величин относительных магнитных восприимчивостеи ЯЛ (1) и ЛЭМ (2) от степени перекисного окисления. (Д — автоокисление в процессе проведения измерений температурной зависимости магнитной восприимчивости ЯЛ, ■ — автоокисление при комнатной температуре в течении 1-72 часов, О — инкубирование при 50 "С в течении 0,5-5 часов, * — облучение УФ-светом.)

рений. На рис. 26 представлены результаты измерений относительной магнитной восприимчивости бислоев ЯЛ и ЛЭМ, полученные по данным магнитного захвата липосом этих литтидов, подверженных различной степени ПОЛ. Как видно, относительные восприимчивости обоих липидов уменьшаются почти прямо пропорционально степени их окисленности и стремятся сравняться с восприимчивостью буферной среды практически при одном и том же для обоих липидов значении индекса Клейна [24*]. Сопоставляя поведение диамагнитной восприимчивости и анизотропии ЯЛ в области особенностей можно заметить, влияние ПОЛ приводит к более диамагнитному, и потому более "твердому" бислою. Причем, характер этого "отвердения" нарастает пропорционально степени окисленности липида. Эти выводы согласуются с результатами работы [36], в которой отмечалось снижение подвижности как полярных головок, так и ацильных цепей фосфолипидов из предварительно окисленных липопротеинов низкой плотности крови человека.

V. Влияние магнитного поля на БЛМ

L. Удельная магнитная энергия липидного бислоя ничтожна по сравнению с характерной энергией поверхностного натяжения вследст-зии малой величины диамагнитной восприимчивости бислоя. Это эбстоятельство a priori обуславливает суждения об отсутствии влия-шя магнитного поля на бислойную липидную пленку. Однако, достаточную магнитную энергию, сравнимую с поверхностной, мож отучить при учете кваоижидкокристалличности объемных фа,- 2*] а, оа счет их изменения, получить вполне ощутимую оценку влияния магнитного поля на изменение площади, занимаемой черной частью эислойной мембраны:

= Sn=o — Н2 (18)

4/ <та

Эффект окаоьнзается квадратичным по магнитному полю. Здесь AS — изменение площади черной части, оа = сгц — а± — анизотропия поверхностного натяжения, к — модуль Озейна-Франка, / — магнитная энергия бислоя. При планарной ориентации "молекул" на поверхности объемной фазы площадь, занимаемая черной частью, должна уменьшаться. Значительное изменение площади черной ча-:ти мембраны наблюдалось в магнитном поле в [47].

2. Озвучивание водной суспензии многослойных липидных везикул — распространенный метод получения мицеллярных растворов [1]. Как правило, при этом образуются мицеллы больших размеров сферической формы и малых размеров, которые остаются цискотическими. Спонтанное превращение формы дискотической памеллы при "озвучивании" ультразвуком, рассматривалось в [46], где была дана оценка критического размера сферической мицеллы. Можно заметить [13*], что магнитное поле может ограничить размер мицелл сверху и доля сферических мицелл в озвученной смеси должна уменьшиться. Озвучивание приводит к разбиению концентрических бислоев на бислойные фрагменты, оамыкающиеся в малые везикулы. Устойчивость спонтанных форм (см. рис. 27) определяется знаком производной свободной энергии по кривизне :

dF - .^.(_вг+12|е_^д) (19)

9Д-1 2 R

Рис. 27. Возможное изменение формы дискотической ламешгы

где к — модуль упругости, ае — коэффициент линейного натяжения, х ~~ диамагнитная восприимчивость. Г — свободная энергия Гельмгольда изогнувшейся ламеллы, определяемая суммой энергий: энергией границы иогибной энергией ^ и магнитной энергией образовавшегося сегмента Если < 0, то образуются везикулы в области радиусов ^ < г < ^¡¡1, которые для реальных величин имеют оценку: 10 < г < 103 нм.

3. Проверку возможного эффекта влияния магнитного поля на процесс образования липосом осуществляли с помощью малоуглового рассеяния лазерного света (Л = 0,63 мкм), проходящего через кювету с исследуемой суспензией помещённую между полюсами о/магнита во время воздействия на нее ультразвука частотой 22 кгц [27*], при включении магнитного поля и без него. На рис. 28 представлена зависимость отношения /н//н=о интенсивностей рассеянного в интервале углов 0,5-2° света от времени озвучивания суспензии липосом при 37 °С соответственно в магнитном поле 1ц и без него 1н=о- Пунктиром отмечено значение отношения равное единице, соответствующее интенсивности рассеяния при озвучивании в отсутствии поля; сплошной линией — при действии магнитного поля 6 кэ. Ослабление действия поля со временем обусловлено окончанием процесса озвученных везикул. Как видно, магнитное поле изменяет кинетику образования озвученных везикул, и в начале процесса способствует более быстрому образованию более мелких липосом.

0,9

0,8

О 2 4 6 8 10 Л*

Рис. 28. Зависимость относительной интенсивности рассеянного в интервале углов

0.5-2° света от времени озвучивания суспензии липосом при 37 °С.

VI. Некоторые применения магнитного оахвата

1. Для разделения частил биологической природы вследствие малости их магнитного момента необходимы высокоградиентны : магнитные (ВГМ) фильтры с узкими каналами, в которых захват частиц происходит вблизи поверхности ферромагнитных проволок, в зонах максимальных градиентов магнитного поля. Рассмотрим оптимальный режим одиночного элемента прямоточного фильтра с узкими каналами — фильтрующий элемент аксиальной симм- оют в поперечном магнитном поле [25*]. Траектория и закон дви. шя частипы определяются равновесием магнитной силы и силы вязкого сопротивления Стокса и зависят от двух параметров: отношения к = М,/2Н и, так называемой, магнитной скорости Ут

где Г2 — объем частицы. Контур области захвата — области вокруг проволоки, из которой за данное время будут притянуты к проволоке все частицы, — определяется решением уравнения движения частицы в магнитном поле (1). На рис. 29 представлены ближайшие к проволоке контуры области захвата для случая А; = 0 для различных времен Т = 1Ут(а. Для к < 0,3 контуры слабо отличаются от приведенных на рисунке (границы зоны парамагнитного захвата на поверхности проволоки вс несколько расширяются). Под площадью оахвата обычно понимают площадь области, ограниченной конту-

V + т = О/а, Б = хШ^/^На)

(20)

Рис. 29. Границы областей захвата в цилиндрических координатах для Г = 1... 3 в плоскости, перпендикулярной оси проволоки, 2 = 0. Характерные точки границ: при 0 = 0 имеем ро = \/4Т + 1, а при р0 = 1 угол вс = 1/2 arceos (1 - jl + 47^/2Т). При Т = О имеем 9С = ±)г/4, а по мере увеличения Г граничные точки линий захвата смещаются от ±ir/4 к ±7г/2.

ром захвата р(0) (р — г/а). Для малых Т п к эта площадь может быть определена с помощью приближенного соотношения

¡г/2

5ЗМВ(Г) = 4о2 I ^р7 <13 = 2а2р2 (21)

о

где ро — максимально удаленная точка контура при 0 = 0:

Р1 = к + ^4Т + (1-ку (22)

Эффективность прямоточного однопроволочного фильтра определяется его производительностью — количеством жидкости, полностью фильтруемой в единицу времени:

J = VSФ = {Ь/^ (23)

где Ь и Яф — длина и площадь сечения фильтра; ¿о — минимальное время, необходимое для фильтрации объема ¿5ф; V = ¿/¿о — средняя скорость потока потока жидкости. Производительность фильтра максимальна, если форма сечения фильтра повторяет форму области захвата. Тогда, так как из (21), (22) следует, что время полной фильтрации ¿о ~ 5захв2 = 5ф2, то производительность такого фильтра растет с уменьшением площади его сечения, J ~ 1/5ф (23). Отсюда следует, что функция J{Sф) (или J{ta)) должна иметь максимум, определяющий оптимальные размеры 5ф (и ро) и скорость протекания жидкости V. Эти оптимальные характеристики можно оценить, если уточнить формулу для площади захвата, приняв во внимание, что часть сечения захвата занята сечением проволоки. Используя (21) и (23), имеем

I = (¿/«о)[5(*о) - 2До2] (24)

Рис. 30. Двухпроволочный сплюснутый ВГМ-фильтр: вид сбоку (слева), поперечный разрез (справа); 1 — ферромагнитная проволока, 2 — мягкая лиоксиновая трубка, 3 — плексигласовая пластинка, 4 — полюс электромагнита, 5 — исследуемая жидкость или буферный раствор, б — пробирка.

Здесь Д — численный коэффициент, учитывающий долю сечения проволоки, входящую в область оахвата. При Т > 2,5 вычитается почти полное сечение проволоки, Д « тг/2 (см. рис. 30). Для рассм-стриваемого случая к = 0,25, ио уравнения dl/dT = 0 находим Т* и Pq, обеспечивающие максимум производительности:

Г* Ä Д2 = 7Г2/4 » 2,5, PÔ** г « 1,8 (25)

При этом скорость протекания фильтруемой жидкости должна быть не больше

«S Т*а Т*а2 { '

а максимальная производительность такого фильтра

Г = (4/w)DI. (27)

Видно, что J* для однопроволочного сплюснутого фильтра не зависит от диаметра проволоки: одну и ту же производительность можно получить на подобных по форме сечения фильтрах с ро — pj. При этом уменьшение радиуса проволоки в п раз приводит к возрастанию в п2 раз максимально допустимой скорости.

2. Экспериментальная проверка изложенных соображении была проведена с элементом фильтра, с геометрией внутреннего сечения близкой по форме области оахвата парамагнитных частиц с малым значением ро (см. рис. 29). Фильтр представлял собой ферромагнитную проволоку радиусом ai = 2,6 • Ю-2 см или ач = 3,9 • Ю-2 см и длиной 10 см (равной диаметру полюсов электромагнита), помещенную

Рис. 31. Коэффициент экстинкции Е для капли с порядковым номером N (по мере вытекания исследуемой жидкости из фильтра). Остальные пояснения в тексте.

в тонкую линоксиновую трубку. С двух сторон трубка сдавливалась пластинками ио плексиглаоа, рщ равнялась 1,5 и ро2 — 1,46. (Были сделаны фильтры также с двумя и тремя проволоками с такими же значениями ро (рис. 30). В фильтрах с несколькими проволоками нет опасности нарушения параллельности сдавливающих пластинок и пережима каналов фильтра.) Фильтруемой жидкостью была 2- или 4-процентная суспеноия парамагнитных эритроцитов с гемоглобином в метформе в фиоиологической буферной среде. Схема эксперимента представлена на рис. 30а. Жидкость после прохождения черео фильтр собиралась в пробирки по одной капле в каждую пробирку. Концентрация эритроцитов в каждой капле определялась по поглощению света гемолизатом этой капли на длине волны 500 нм на спектрофотометре "Спекол-20". (Гемолизат был получен добавлением к капле 0,4... 0,5 мл дистиллированной воды.) Типичная кривая фильтрации представлена на рис. 31а. Первые капли — исходная суспеноия. Точка А на рисунке соответствует моменту включения магнитного поля. Уменьшение Е обусловлено уменьшением концентрации эритроцитов в каплях и оседанием их на проволоке. Точка Б — выключение поля. Пик на кривой соответствует процессу отлипания эритроцитов от проволоки и выходу их из фильтра. Площадь пика примерно равна площади "ямы" между точками А и Б. Это означает, что после выключения поля фильтр очищается от эритроцитов.

Рис. 32. Зависимости степени фпльграшш у от V"1'2 (Г -скорость течения жидкости черео фильтр) при радиусе проволоки, мм: I — 0,26: 2 — 0.39.

Для характеристики фильтров изучалась ¡зависимость степени фильтрации от средней скорости жидкости черео фильтр. Степень фильтрации у (в процентах) определялась как (Е2 — Е\)/Е2 ■ 100 (см. рис.31а). Проводили фильтрацию суспензии парамагнитных эритроцитов с различными скоростями V — 0.034. . .0.57 см/с. Так как зависимость у от V определяется отношением у — 5захв/5/, то с уменьшением V, когда 5захв увеличивается, у возрастает и достигает значения 100% при ^ф — -^захв- Согласно уточненной формуле для площади захвата (24) и соотношению (21) имеем

г = (5оа>:в - 2Аа2)/Бл, ~ Р,ЫУ - СА (28)

где Р и С — постоянные. Поэтому экспериментально полученные зависимости у(У) представлены в координатах утл V"1 2 на рис. 32. Полученный вид кривых соответствует формуле (28) и подтверждает правильность формулы (24) для определения площади захвата в фильтрах с малыми каналами. Значения скоростей, при которых достигается максимальная фильтрация. Ц = 0,11 и \\ = 0,68 см/с близки .-значениям оптимальных скоростей вычисленным но формуле (26): V} = 0,14 и V,* = 0,066 см/с. Для расчета использовались значения напряженности магнитного поля в зазоре электромагнита Я = 19,5 кЭ. индукции насыщения проволоки Мз1 = 10780 Гс или Л/52 = 10500 Гс. вязкости физраствора г] = Ю-2 П, восприимчивости X = 2.98 • Ю-7 ед. СГС/см3, объема П = 92 • 1012 см3 и аффективного гидродинамического радиуса эритроцита = 3.3 • Ю-4 см [10*].

Таким образом, сплюснутая форма прямоточного фильтра позволяет реализовать оптимальные условия работы одиночного фильтрующего элемента ВГМ-сепаратора с аксиальной симметрией.

3. Исследуемая конструкция сплюснутого фильтра, в отличие от

коаксиального, позволяет улавливать парамагнитные частит,I. не захватывая диамагнитные, и наоборот. Для осуществления отой последней возможности фильтр поворачивается (относительно положения. показанного на рис. 306) на 90; вокруг вертикальной оси. так что сечение фильтра становится областью диамагнитного захвата.. Результаты работы такого фильтра иллюстрируются кривой рис. 316. Через фильтр с а — 0.026 см. поверцутый на 90% пропускается буферная смесь: 70% физиологического раствора и 30% изотонического раствора МпСЬ в дистиллированной воде (20 г/л). При включенном магнитном поле в фильтр с помощью шприца вводится 0.1 мл 4-пропентной суспензии эритроцитов в оксиформе в той же смеси. В отой буферной среде эритроциты в оксиформе проявляют диамагнитный момент, сравнимый по величине с парамагнитным моментом в суспензии эритроцитов в метформе в физиологическом растворе. Практическое отсутствие эритроцитов в каплях буферной смеси, вышедших из фильтра при включенном магнитном поле (с 1 по 10-ю каплю), и выход их в форме пика после выключения поля (с 11 по 23-ю)свидетелъствуют о том. что в этом режиме происходит захват диамагнитных частиц. Концентрация диамагнитных эритроцитов в капле определялась спектрофотометрическл на длине волны 577 им.

4. С целью расширения числа исследованых клеток и изучения возможности их идентификации по магнитным свойствам, нами был исследован магнитный захват эритроцитов, пораженных а-талассе-мией, а также, по просьбе Всесоюзного онкоцентра в связи с проводимыми ими исследованиями влияния облучения на иммунные свойства. предоставленных онкоцентром лимфоцитов человека.

Результаты измерений эритроцитов, переведенных в метформу, нормальных и пораженных, представленые на рис. 33 показывают значительный сдвиг распределения пораженных клеток по сравнению с контрольной кривой в "диамагнитную" сторону и, по крайней мере, согласуются с представлением об уменьшении внутриклеточного гемоглобина при отой патологии. Сравнение обеих кривых распределения показывает возможность разделения пораженных клеток по их магнитным свойствам, разумеется без утверждения, что "здоровые" по магнитной восприимчивости клетки одновременно являются таковыми в действительности.

сь.

01

г

Щ-

2 ц Д|ИС* сгс/сл1

"л

г <1 {О^сгс/с^

1';ч-. 33.

[исто! раммы распределения ■магии I ной восприимчивое! и .»ркгроггптов че.гопега. содержащих ширит ныл гемоглобин. о I пост рльно оуфеоной среды (20 :С. рН ~ 7.-1):

а) — клегкп. поражённые гетерозиготной а-галассемпеп.

б) — кле г\и ¡здорового донора

И

{О

л

а

и

10

Шп.

3

1

3

т«")

Змс. 3-1.Гистограммы распределения лимфоцитов человека по аелпчпнам (г"1): 1; — контрольные клетки. 6) — кле гки. облученные спетом Не-Хе лазера с А.= >.63 мь*м

Другой тип исследованных клеток — лимфоциты, ядерные клетей, у которых ядро занимает основной ооьем. Исследовались свеже-»ыделеные клетки, клетки после суточного хранения и клетки, подверженные лазерному облучению (А = 0.63 мкм) дозами, не пре-зышаюшимн физиологических норм. Буферной средой был раствор \енкса с восприимчивостью близкой восприимчивости физраствора. Гвежевыделенные клетки (рис. 3-1) имеют довольно узкое распределим е по /-у? с разбросом значений восприимчивости тю уровню 1/2 гг (-0.37 до -0.46) • 10" * ел. СГС'. В облученной пробе был зарегистрирован (см. таблицу 2 к рис. 3-1) рост числа парамагнитных ю отношению к раствору клеток и сдвиг в о ту же сторону кривой

Таблица 2

проба общее число диамагнитные парамагнитные нейтральные

клеток % % %

контроль 100 62 5 33

облученные 100 36 15 49

МетШ

% о

О*

Рис. 35. Схема, поясняющая (см. текст) определение физиологической концентрации метгемоглобина в эритроцитах с помощью гистограмм их распределения по величинам (с-1).

распределения. Аналогичное, но более ярко выраженное смещение в парамагнитную область обнаружено у клеток, подвергнутых хранению: одесь оначительное увеличение числа парамагнитных клеток, с величиной восприимчивости достигавшей 20 • Ю-8 ед. СГС. Мы не беремся объяснять наблюдаемое "превращение" лимфоцитов, относя его к ряду "интересных наблюдений", которое требует специального рассмотрения. Однако, выявленный разброс величин магнитной восприимчивости показал возможность идентификации и магнитного разделения отих клеток.

5. Эритроциты здорового человека содержат в основном оксиге-моглобин и ничтожно малую, физиологическую концентрацию метгемоглобина, около 0,3%. Определение физиологической концентрации метгемоглобина осуществляется с помощью сложных фотометрических измерений и требует предварительного гемолиза клеток и удаления мембран. Информация же о содержании метгемоглобина в эритроцитах и изменение этой концентрации при патологиях от 0,3 до 2,0%, является чрезвычайно важной [47]. Магнитный захват позволяет осуществлять измерения физиологической концентрации метгемоглобина в эритроцитах без нарушения их целостности с достаточной точностью [11*]. Суть способа заключается в следующем (см. рис. 35). По оси ординат отложена концентрация метгемоглоби-

Рис. 36. Относительная магнитная восприимчивость эритроцитов, содержащих оксигемоглобин в зависимости от концентрации растворённых в буфере ионов марганца (а) и молекул оксигемоглобияа (б)

на в клетке, а по оси абсцисс — модуль величины магнитной восприимчивости эритроцитов относительно буфера. Концентрация мет-гемоглобина в эритроците, обуславливающая смену онака магнитного оахвата, определяется равенством: стешъХтешь - СохуньХохуНЪ = О и определяется по известным из эксперимента по захвату клеток величинам ХтеШЬ? ХохуНЬ) величине внутриклеточной концентрации НЬ и составляет величину 2,75% метгемоглобина в среднестатистической клетке. Это значение откладывается по оси ординат. На оси абсцисс откладывается значение восприимчивости, соответствующее клетке содержащей весь гемоглобин в окси- форме. Прямая, проходящая через отмеченные таким образом точки на осях абсцисс и ор- } динат, будет градуировочной прямой, ордината точки пересечения которой с вертикальной прямой, проходящей через максимум ги- ^ стограммы распределения эритроцитов, построенной в тех же осях, соответствует средней физиологической концентрации метгемоглобина в исследуемой группе клеток.

6. Способом магнитного захвата восприимчивость частицы измеряется относительно восприимчивости буфера, которая считается известной. Возможно и обратное: измерение восприимчивости среды при захвате частицы с известной восприимчивостью. В качестве пробного тела с известными гидродинамическими и магнитными свойствами использовались эритроциты человека [49,33*]. На рис. 36 а приведена зависимость магнитной восприимчивости окси-генированных эритроцитов относительно буфера в зависимости от I/ концентрации растворенных в нем ионов марганца, Мп2+, при рас-

Рис. 37. Относительная магнитная восприимчивость эритроцитов, содержащих оксигемоглобин в зависимости от концентрации растворённых в буфере ионов марганца в буфере;

• — свежевыделенные клетки; ■ — трёхдневные, ▼ — месячного хранения

творении в буфере соли МпБО^ а на рис. 36 б — восприимчивость эритроцитов в зависимости от концентрации белка - оксигемогло-бина. В последнем случае измерения проводились до концентраций меньших 2 мМ, поскольку при больших концентрациях белка наблюдалось изменение формы клеток. В буферной среде с примесью, концентрация которой а, молярная восприимчивость Хл! при равновесии, в предположении аддитивных вкладов, восприимчивость клетки относительно буфера будет

ДХ = АХо + гХл - схл (29)

здесь Дхо — восприимчивость клетки относительно буфера без примеси, г и с концентрации связанного и свободного лиганда соответственно, г + с = а. Концентрации сиг связаны с числом мест связывания N на поверхности клетки уравнением [50]:

кс = г/с^ - г) (30)

где кс — константа связывания. Молярная восприимчивость лиганда определяется тангенсом угла наклона и для приведенных зависимостей, в принебрежешш связыванием, составляет: (1,50 ± 0,05) • 10_2(СГС/моль и (—0,18 ±0,01) • Ю-2 СГС/моль для ионов марганца и молекул оксигемоглобина соответственно. Для случая на рис. 36 б точка пересечения экстраполированной зависимости с осью абсцисс соответствует концентрации оксигемоглобина внутри клетки.

При малых концентрациях растворенных в буфере ионов и молекул наблюдается отклонение от линейной оависимости измеряемой восприимчивости клетки, обусловленное связыванием лиганда с клеткой. На рис. 37 приведены оависимости Ах/Ахо, соответствующие малым концентрациям ионов марганца, для трех проб эритроцитов, содержащих оксигемоглобин и отличающихся временем хранения: свежевыделенных, трехдневного и месячного хранения. В соответствии с (30), уменьшение восприимчивости обусловлено связыванием, причем связывание ионов марганца возрастает с мембранами клеток более длительного хранения. Рис. 37 и (30) позволяют оценить число мест связывания и константу связывания, которые при условии непроникновения ионов в клетку, составили: 107 и (1 -т- 2) • 107 моль соответственно.

Определяемый нами возможный порог чувствительности магнитного захвата к наличию примеси лиганда в растворе составляет величину порядка фемтомоля для белков с молекулярным весом порядка 30-50 тыс. дальтон. При этом, измерения проводятся без смены среды (отмывки) и без применения специальных меток.

Основные результаты и выводы

1. Исследовано поведение эритроцитов человека в буферной среде, в сильно неоднородных магнитных полях от намагниченных тонких магнитных проволочек. Установлено, что движение клеток происходит преимущественно в плоскости диска клетки, со слабо отличающимися от клетки к клетке величинами гидродинамических радиусов; характер движения клеток однозначно определяется состоянием внутрикле- точного гемоглобина, которое можно контролировать спектрофотометрически. Обнаружено явление диамагнитного захвата эритроцитов, содержащих оксигемоглобин в область редукции магнитного поля у поверхности поперечно намагниченной проволочки. Полученная совокупность данных позволила использовать эритроциты в качестве модельной системы при разработке универсального метода измерения магнитной восприимчивости одиночных биологических клеток.

2. Исследовано влияние эффектов торможения стенок кюветы и поверхности намагниченной проволочки при магнитном захвате

эритроцитов. Определено влияние конечных размеров клеток и определены ооны захвата, в которых параметры оахвата близки расчетным, полученным в приближении идеальной жидкости. На основании магнитного оахвата предложен и реализован способ измерения индуцированных магнитных моментов одиночных биологических микрообъектов и немагнитных микрочастиц, плавающих в жидкой буферной среде, объемом Ю-10 см3 бео нарушения их целостности, позволяющий измерять рекордно малые магнитные моменты любого онаха порядка 104—105 магнетонов Бора в поле 1 кЭ. Способ позволяет выделять и проводить многократные измерения восприимчивости одной, какой-либо выделенной клетки из числа клеток, находящихся в поле зрения микроскопа.

3. Разработаны методики и проведены исследования магнитных восприимчивостей эритроцитов, содержащих гемоглобин основных форм, в зависимости от температуры, кислотно-щелочных свойств буферной среды, при гаоообменных процессах клетки с растворенным в буферной среде кислородом.

Покаоано, что клетки с оксигемоглобином имеют температурно-неоависимую диамагнитную восприимчивость в области от 2 до 30 °С, с нулевым эффективным магнитным моментом комплекса Ре-02. Выше 35 °С наблюдается резкое увеличение магнитной восприимчивости клеток, обусловленное термической деохсигеналией внутриклеточного гемоглобина при этих температурах.

Обнаружено отклонение от закона Кюри температурной зависимости внутри- клеточного нитритного метгемоглобина в области 2-55°С. Полученная зависимость, также как и зависимость на растворах, объясняется сосуществованием двух неэквивалентных положений гемового железа в матрице белка, но с другими, чем для растворов, величинами разности термодинамических потенциалов Д5 и АН этих состояний. Величина восприимчивости при 20 °С остается неизменной в магнитных полях вплоть до 20 кЭ.

Показана устойчивость внутриклеточного гемоглобина к изменениям рН среды в интервале изменения рН от 5,5 до 9,5. Найдено частично обратимое резкое воорастание магнитной восприимчивости при рН <5,5.

Показана возможность изучения кислород- обменных процессов на отдельных эритроцитах. Определена степень насыщения кисло-

юдом внутриклеточного гемоглобина при процессах диссоциации-вязывания, отмечена их необратимость на клетках и определены гараметры кооперативности Хилла и точки рзо — парциального да-шения кислорода, при котором насыщено 50% участков связывания.

Проведенные исследования магнитных состояний гемов оритро-щтов человека помимо самостоятельного значения показывают воа-шосвязь индивидуальных магнитных свойств клетки с процессами ее жизнедеятельности, ее физиологического состояния, возраста, войств буферной среды и др., т.е. позволяют изучать и коптролиро-1ать состав, строение и жизнедеятельность клетки по ее магнитным гараметрам.

4. На основании исследований магнитного захвата мультислой-шх сферических и цилиндрических фосфолипидных везикул — ли-осом, предложен и разработан способ измерения диамагнитной осприимчивости и диамагнитной анизотропии бислойной лшшдной сембраны, а так же компонент тензора диамагнитной восприимчи-ости бислойной липидной мембраны.

5. Проведены исследования диамагнитной восприимчивости би-лоев синтетических фосфолипидов — ДПЛ и ДМЛ в ж/к ¿а-фаяе, ДПЛ и в области основного фазового перехода гель-ж/к. Найдено, то оначения восприимчивости ДПЛ и ДМЛ в ж/к состоянии близки асчетным, полученным по схеме Паскаля, но требуют количествен-ого уточнения. Определена величина изменения восприимчивости ислоя ДПЛ при основном переходе, которая не может быть объясне-а одним лишь, известным из независимых измерений, изменением еличины молекулярного объема при этом переходе.

6. Измерена диамагнитная анизотропия бислоя ДПЛ в ж/к со-гоянии. Посредством анализа экспериментальных данных выявлен емпературно-зависимый вклад в анизотропию от фосфатно-холи-овой головной группы молекул лецитина, составляющий третью асть от анизотропии в кристаллическом состоянии.

7. Проведено исследование бислоев природных фосфолипидов: Епптого лецитина и общих липидов оритроцитарных мембран в ж/к азе. Найдено, что восприимчивость природного ЯЛ в бислое блио-а восприимчивости сходного по составу и строению синтетическо-э ДПЛ. Обнаружено существование характерных для каждого при-одного фосфолипида узких температурных областей аномального

поведения восприимчивости, положение которых зависит от скорости изменения температуры при нагревании, необратимо по температуре и носит характер неравновесных изменений структуры би-слоя.

8. Измерена температурная зависимость диамагнитной анизотропии бислоя ЯЛ. Обнаружены области аномального поведения анизотропии, имеющие сходный характер с особенностями, наблюдаемыми на зависимости восприимчивости от температуры. Обнаружено существование двух областей ж/к состояния бислоя ЯЛ: выше и ниже 42 °С, в которых бислой существует в метастабильной и стабильной фазах.

9. Определены диагональные компоненты тензора диамагнитной восприимчивости бислоя ЯЛ и их зависимость от температуры. Обнаружен сходный характер изменения компонент тензора в областях аномального поведения восприимчивости, который соответствует представлению об увеличении объема, приходящегося на молекулу фосфолипида в бислое.

10. Рассмотрены некоторые возможные механизмы влияния магнитного поля на бислойные пленки. Показана возможность влияния поля на процесс формирования черной пленки на капилляре и на процесс формирования липосом в магнитном поле. Обнаружено увеличение скорости образования озвученных везикул в магнитном поле.

11. Определены оптимальные параметры работы единичного элемента прямоточного высокоградиентного магнитного фильтра, способ заполнения фильтра элементами и показана возможность разделения клеток с моментом любого, по отношению к буферной среде, знака; показано, что производительность фильтра возрастает с уменьшением диаметра проволочки фильтрующего элемента.

12. Найдено изменение индивидуальных магнитных свойств лимфоцитов человека при их хранении и при облучении светом Не^е лазера с длиной волны 0,63 мкм., проявляющееся в уменьшении абсолютных значений моментов некоторых клеток, размывании гистограммы их распределения и ее сдвиге в парамагнитную сторону.

13. Предложен способ определения физиологической концентрации метгемоглобина в отдельных эритроцитах человека без нарушения целостности клеток.

14. Покаоана вооможность изучения методом магнитного захва-I взаимодействия клеток с ионами и молекулами из раствора; по-юана вооможность измерения числа мест связывания и константы 1язывания. Определен порог чувствительности магнитного захва-а к адсорбции белковых молекул на уровне фемтомоля для молекул молекулярным весом 30-50 тыс. дальтон.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор всегда будет благодарен профессору Е.И.Кондорскому, ко-эрый решительно поддерживал эту работу. Автор благодарен сво-u коллегам и друзьям, бывшим студентам и аспирантам за много-:тнюю совместную работу, дискуссиии и критику, за дружескую эстановку, способствовавшую этой работе.

Цитированная литература

1] Веденов A.A., Левченко Е.Б.//УФН. 1983. Т.141. С.З.

2] Сонин А.С.//УФН. 1987. Т.153. С.273.

3] Biophysical Effects of Steady Magnetic Fields: Proceeding of the Workshop. Les Houches, France.- Berlin a.o.: Springer-Verlag, 1987.

4] Белов К.П., Бочкарёв H.Г., Магнетизм на Земле и в космосе, М., Наука, 1983.

5] Введенский В.Л., Ожогин В.И., Сверхчувствительная магнитометрия и биомагнетизм, М., Наука, 1986.

6] Романовский Ю.М., Степанова Н.В., Чернавский Д.С., Математическая биофизика, М., Наука, 1984.

7] Watson J.H.Р.//J.Appl.Phys. 1973. V.44. P.4209.

8] Uchiama S., Kondo S., Takayasu M., Eguchi I.//IEEE Trans. Magn. 1976. V.MAG-12. P.895.

9] Gill S.J., M alone C.P.//Rev.Sci.Instr. 1963. V.34. P.788.

0] Birss R.R., Parker M.R.//IEEE Trans. Magn. 1979. V.MAG-15. P. 1523.

1] lin) Friedlaender J.F., Takayasu M., Nakano T., McNeese W.H.// IEEE Trans. Magn., 1979, v. MAG-15, p. 1526.

[12] Каро К., Педли Т., Шротер Р., Сид У. Механика кровообращения. -М., Мир, 1981.

[13] Melville D.// Natura, London, 1975, v. 268, p. 706.

[14] Плявинь Ю.А., Блум Э.Я.// Магн. гидродинамика. 1983. №4. С.З. .

[15] Хаппель Ж., Бреннер X.// Гидродинамика при малых числах Рейнольдса.-М.: Мир, 1976. С.630.

[16] Нормальное кроветворение и его регуляция// Под ред. М.А. Федорова. - М.: Медицина, 1976.

[17] Perutz M.F.//Ann. Rev. Biochem. 1979. V.48. P.327.

[18] Pauling L., Coryell C.D.// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1936. V.22. P.210.

[19] Pauling L.//Nature, London, 1964. V.203. P.182.

[20] Griffit J.S.//Proc. Roy. Soc. Ser. A. 1956. V.235. P.23.

[21] Wittenberg J.B., Wittenberg B.A., Peisach J., Blumberg W.E. // Proc. Nat. Ac. Sci. USA. 1970. V.67. P.1846.

[22

[23

[24

[2 [26

[27

[28

[29

Bacci M., Cerdonio M., Vitale S.//Biophys. Chemistry. 1979. V.10. P.113.

Cerdonio M., Morate S., Torresani D., Vitale S., De Yong A., Noble R.W.//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V.82. P.102.

Пируоян JI.A., Куонецов А.А., Чиков B.M., Плотникова И.Т. //

Иов. АН СССР. Сер. биол. 1984. №6. С.894.

Vandergriff K.D., Olson J.S.// J.Diolog. Chem. 1984. V.259. P.1269.

Фок M.B., Зарицкий A.P., Прокопенко Г.А.//Биофиоика. 1988. Т.ЗЗ. С.622.

MessanaC., Cerdonio М., Chenkin P., Noble P.W., Fermi G., Perutz P.N., Perutz M.F.//Biochemistry. 1978. V.17. P.3652. Де Же В. Физические свойства жидкокристаллических веществ. М., Мир. 1982.

Kunze R.K., Но J.J.T., Day Е.Р.// Biophys.J., 1980, v. 30, p. 359354.

Helfrich W., Harbich W., Servuss R.M.// Phys. Lett. 1976, v. 57 A, p.294-296.

И] Klein R.A.// Biochim.et biophys.acta.,1970, v. 210, p.486-489.

52] Кононенко E.B., Варшавская О.А.// Биофиоика, 1982, т. 27, с.399-403

Kononenko E.V.,Varshavskaya О.A.// Biofisika,

33] Гатчек Э., Вяокость жидкостей., M.-JI.; ОНТИ, 1934, с. 77. Gatchek Е.,

34] Philo J.S., Dreyer V., Schuster Т.М.// Biochem. 1984, v:23, p.865.

35] Lvov J.M., Mogilevskij L.J., Feigin L.A., Gyorgyi S., Ronto G.Y., Thompson K.K., Sugar I.P.// Mol. Crist. Liq. Crist. 1986, v.133, p.65-73.

36] Handbook of lipid Research. The physical chemistry of lipids/ Ed. by D. M. Small. N.Y,; L.; Plenum Press, 1986. p.p.511-512.

37] Ландау Л.Д., Лифшиц E.M., Теор. фио. т.5, Стат. фио., М. Наука, 1976, с.583.

$8] Калинников В.Т., Ракитин Ю.В., Введение в магнетохимию. Метод статической магнитной восприимчивости в химии., М., Наука, 1980

19] Nagle J.F., Wilkinson D.A.// Biophys. J., 1-978, v.23, p.159

Ю] Kamamura Y., Sakurai I., Ikegami A., Iwayanagi S.// Mol. Cryst. Liq. Crist., 1981, v.67, p.77-88.

U] Hitchcock P.B., Mason R., Thomas K.M., Shipley G.G.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 1974, v.71, p.3036-3040.

2] Boroske E., Helfrich W.// Ibidem. 1976, v.24, p.863-868.

3] Sholz F., Boroske E., Helfrich W.// Ibidem. 1984, v.45, p.589-592.

4] Вышенская Т.В., Пасечник В.И.// Биофиоика, 1986, т.31, с.43-47.

Vyshenskaya T.V.,

5] Панасенко О.М., Вольнова Т.В., Аоиоова О.А., Владимиров Ю.А. // Биол. мембраны., 1988, т.5, с.1186-1192, Panasenko О.М., Vol'nova T.V., Azizova О.А., Vladimirov Yu.A.,

6] Helfrich W., Phys.Lett. 50A, №2, 1974, 115-116.

7] Симонов A-H., Вышенская T.B., Лифшиц B.A., Куонецов А.Н. Биофиоика. 1983. Т.29. С.610.

[48] Кушаковсхий М.С.// Клинические формы повреждения гемогло бина. -JI., Медицина, 1968. С.325.

[49] Норина С.Б., Кротов К.А.// Матер. 18 Всесоюзн. конф. по фи оихе магнитных явлений, 1988, Калинин, стр. 1029-1030.

[50] Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е.// Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран, М., Наука, 1980.

Список работ по теме диссертации

[1*] Е.И.Кондорский, С.Б.Норина, А.Н.Шалыгин., Влияние магнитного поля на эритроциты человека, Биофизика, 1980, т.25, с.353-356.

[2*] Е.И.Кондорский, С.Б.Норина, Н.В.Литвинчук, А.Н.Шалыгин., Магнитная восприимчивость одиночных эритроцитов человека, Биофизика, 1981, т.26, с.1104-1107.

[3*] А.Н.Шалыгин, С.Б.Норина, Е.И.Кондорский., Eritrocytes Мо-ution in Singl Wire Abstr., 3 Joint Intermag Confer., Montreal, 1982, DP-23.

[4*] А.Н.Шалыгин, С.Б.Норина, Е.И.Кондорский., Behavior of Er-itrocites in High Gradient Magnetic Field, J. of МММ, 1983, v.31-34, p.555-556.

[5*] Е.И.Кондорский, А.Н.Шалыгин., Магнетизм биологических микрообъектов, Матер. 15-й Всесоюзн. конфер. по физике магнитных явлений, Пермь, 1981, с.144-145.

[6*] А.Н.Шалыгин, С.Б.Норина, А.В.Иванов, В.И.Купин., Магнитная восприимчивость лимфоцитов, Матер. 16-й Всесоюзн. конфер. по физике магнитных явлений, Тула, 1983, с.263-264.

[7*] Е.И.Кондорский, А.Н.Шалыгин., Магнетизм биологических микрообъектов, Матер. 16-й Всесоюзн. конфер. по физике магнитных явлений, Тула, 1983, с.74-75.

[8*] А.Н.Шалыгин, С.Б.Норина, Е.И.Кондорский., Способ измерения магнитной восприимчивости, Авторское свидетельство №1163724 от 26.07.1982.

[9*] А.Н.Шалыгин, С.Б.Норина, Е.И.Кондорский., Magnetic Susceptibility and Magnetic Cupture of Limphocytes, Abstr. of Intermag

. Confer;,, Hamburg,„1984, GD-07. .. .

3*] А.Н.Шалыгин, С.Б.Норина. Е.И.Кондорский., Магнитная восприимчивость и магнитный захват клеток, Биофизика, 1984, т.29, ВЫП.5.' с.845-852.

1*] А. Н. Шалыгин, С- Б. Норина, В. Г. Гинзбург, А. М.Чекаев. С.В.Рыков.. Способ определения концентрации метгемоглоби-на и оксигемоглобина в эритроцитах, Авторское свидетельство No 1198431, Бюл. изобр. СССР, №46, сД72.

2*] В.Иванов, Е.И.Кондорский, А.Н.Шалыгин., Изменения в структуре бислойных липидных мембран в магнитном поле, Биофизика, 1987, т.31, с.51-53. '. ' .

• .1

3*] А.Н.Шалыгин, В.Иванов., Теоретическая оценка влияния магнитного поля на формирование липосом,. Биофизика, 1987, т.32, с.344-345.

4*] К. А.Кротов, А.Н.Шалыгин., Магнитные состояния гема в эритроцитах человека, Материалы 12 BcecoipoH. совещан. по магнитной гидродинамике, Саласпилс, 1987, т.4, с.99-102.

5*] А.Н.Шалыгин, Т.В.Вышенская, Е.В.Переведенцева., Магнит-• ная восприимчивость и структура липосом, Биофизика, 1987, т.32, с.683-684.

6*} Е.В.Переведенцева, А.Н.Шалыгин, Т.В.Вышенская., Магнитная восприимчивость и структуралипосом. Материалы 12 Все-союзн. совещ. по магнитной гидродинамике, Саласпилс, 1987, т.4, с.95-98.

7*] А.Н.Шалыгин, Е.В.Переведенцева,, Magnetic Suseptibility of Lipid Molecules, Abstr. 32nd, Annual Confer, on Magnetism and Magn. Materials, Chicago, 1987, p.152.

8*] А.Н.Шалыгин, Е.И.Кондорский, К.А.Кротов., Temperature and pH-dependence of Human Erytrocites Magnetic Properties, Abstr. 32nd Annual Confer. on Magnetism and Magn. Materials, Chicago, 1987, p.152-153. ,

9*] А-Н-Шалыгин, К.А.Кротов., Влияние температуры и рН среды на магнитные свойства эритроцитов человека, Биофизика, 1988, т.33, с.529-530. .

0*] А.Н.Шалыгин, К.А.Кротов., Temperature Peculiarities of Ery-

trocites Magnetic Cupture, Abstr. 4th Joint MMM-Intermag Coi fer., Vancouver, 1988, BA-10.

[21*] А.Н.Шалыгин, К.А.Кротов, Е.И.Кондорский., Influence of Oxj gen-Exchange Processes on the Erytrocites Magnetic Suseptibilit} Abstr. ICM'88, Paris, 1988, p.256.

[22*] А.Н.Шалыгин, Е.В.Переведенцева, Т.В.Тяжелова., Magnetic Su septibility of Liposomes and Phase Transition in Lipid Bilayers Abstr. ICM'88, Paris, 1988, p.256.

[23*] А.Н.Шалыгин, Е.В.Переведенцева, Т.В.Тяжелова., Анизотро пия магнитной восприимчивости липидов в ламеллярной фа ое, Материалы 18-й Всесоюон. конфер. по физике магнитны} явлений, Калинин, 1988, с.1021-1022.

[24*] Е.В.Переведенцева, Т.В.Вышенская, А.Н.Шалыгин., Влияние перекисного окисления на магнитную восприимчивость лило сом, Материалы 18-й Всесоюон. конфер. по фиоике магнитны? явлений, Калинин, 1988, с.1023.

[25*] М.И.Турчинская, А.Н.Шалыгин, Л.М.Раппопорт, П.П.Золота рев., Об оптимизации параметров прямоточных ВГМ-фильт-ров, Магнитная гидродинамика, 1988, №3, с.109-113.

[26*] А.Н.Шалыгин, К.А.Кротов, Е.И.Кондорский., Влияние кисло род-обменных процессов на магнитную восприимчивость ори троцитов, Материалы 18-й Всесоюон. конфер. по фиоике магнитных явлений, Калинин, 1988, с.1017-1018.

[27*] А.Н.Шалыгин, И.В.Лопатина, С.Б.Норина, В.А.Иванов., Фор мирование липосом в магнитном поле, Материалы 18-й Всесо юон. конфер. по физике магнитных явлений, Калинин, 1988 с.1019.

[28*] К.А.Кротов, А.Н.Шалыгин., Магнитная восприимчивость от дельных эритроцитов при деоксигенации, Тезисы 1-го совет ско-болгарского симпоз. по магнитобиологии и магнитотера пии, София, 1989, с.36.

[29*] Е.В.Переведенцева, А.Н.Шалыгин., Анизотропия диамагнит ной восприимчивости фосфолшшдов в ламеллярной фазе, Те зисы 1-го советско-болгарского симпоз. по магнитобиологии i магнитотерании, София, 1989, с.50.

30*] А.Н.Шалыгин., Структурные фаоовые переходы в бислойных лшшдных пленках, Теоисы II Всесоюон. семинара "Магнитные фаоовые переходы и критические явления", Махачкала, 1989, с.132-133.

[31*] А.Н.Шалыгин, Е.В.Переведенпева, Т.В.Тяжелова., Аниоотро-пия диамагнитной восприимчивости фосфолипидов в ламел-лярной фаое, ЖФХ, 1990, т.64, с.1337-1341.

[32*] А.Н.Шалыгин, Е.В.Переведендева, М.В.Барышев., Магнитные свойства и особенности структурной организации фосфоли-пидных бислоев, ЖФХ, 1990, т.64, с.1623-1629.

33*] А.Н.Шалыгин, К.А.Кротов., Магнитный оахват биологических клеток и модельных агрегатов клеточных мембран, УФН, 1990, т.160, с.83-104.

34*] К. А. Кротов, А. Н. Шалыгин., Способ измерения магнитной восприимчивости мижрообъектов, Патент №1833691 от 18.12.1989г. Зарегистрировано 13.10.1992г.

35*] А.Н.Шалыгин, Е.В.Переведенцева, Об исследованиях диамагнитных свойств бислойных этшидных мембран методом магнитного захвата сферических и цилиндрических мультислой-ных фосфолипидных липосом, Биофизика, т.39, вып.4., 1994.

Оглавление

Общая характеристика работы..................................2

Основное содержание..............................................10

I. Магнитный оахват и магнитная восприимчивость мо-

дельных клеток — эритроцитов человека................12

II. Магнитные состояния гемов эритроцитов человека ... 23

III. Магнитный оахват бислойных лшшдных агрегатов —

мультислойных липосом..................30

IV. Диамагнитная восприимчивость и диамагнитная анизо-

тропия БЛМ.........................33

V. Влияние магнитного поля на БЛМ.............48

VI. Некоторые применения магнитного захвата.......50

Основные результаты и выводы................60

Цитированная литература....................64

Список работ по теме диссертации...............67