Малогабаритные масс-спектрометры для космических исследований, экологического и технологического мониторинга тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛЫСЕНКО Алла Викторовна

ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ ПЕПТИДОВ НА АДАПТАЦИЮ ОРГАНИЗМА К ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ

14.00.53 — геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт- Петербург — 2006

Работа выполнена в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Институте физической культуры ГОУ ВПО «Ростовский государственный педагогический университет»

Научный консультант;

доктор биологических наук,

профессор Арутюнян Александр Вартанович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Малинин Владимир Викторович

доктор биологических наук,

профессор Алексеев Николай Петрович

доктор медицинских наук,

профессор Клименко Виктор Матвеевич

Ведущая организация:

ГУ «Институт физиологии им. И.П. Павлова» РАН

2006 г. в

Защита состоится 1У~у> ' ^ 2006 г. в часов на заседании

диссертационного Совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д.З).

тлкриур!, пр. динами, ^ у У

Автореферат разослан ¿У--Ч * ' /

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук, доцен^^иХ,^-7/ ' Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В начале XXI века наметились два основных аспекта проблемы глобального старения населения. Во-первых, следует обеспечить дальнейшее улучшение качества жизни людей пожилого и старческого возраста (т.е. перешагнувших 60-летний рубеж и стареющих так называемым физиологическим способом). Во-вторых, необходимо если не искоренить такое явление как ускоренное старение части населения, то максимально возможно уменьшить риск его развития вследствие хронического стрессогенного действия неблагоприятных эколого-профессиональных факторов внешней среды [Хавинсон В.Х. и соавт., 2003]. Следовательно, на современном этапе развития биологии и медицины проблема стресса становится важнейшей проблемой геронтологии и гериатрии, т.к. чрезмерная реакция на экстремальное воздействие в молодом возрасте может стать причиной старческой немощи на более поздних этапах онтогенеза.

Поскольку на сегодняшний день для профилактики и коррекции индуцированных стрессом и старением нарушений наиболее успешно используются биорегуляторы на основе пептидов [Коркушко О-В. и соавт., 2002; Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н., 2003; Хавинсон В.Х. и соавт., 2005], подойти к решению указанной проблемы, по нашему мнению, возможно с помощью повышения эффективности применения данных препаратов.

В этой связи актуальной теоретической и практической задачей становится изучение возрастных особенностей влияния биологически активных пептидов на развитие адаптационных реакций организма. Актуальность выбранной проблемы обусловлена тесной взаимосвязью стресс- и геропротекторных эффектов пептидов, причем одной из главных причин этого является известный факт о том, что адаптационные возможности с возрастом снижаются, а тревожность растет [Смирнова Т.М. и соавт., 1999; De Benedictis G. et al., 2001].

В литературе имеются сведения, что тревожность является одним из важнейших свойств, которое определяет стратегию и эффективность адаптации организма, взаимодействующего с внешней средой [Данилова Н.Н. и соавт., 1995; Середенин С.Б. и соавт., 2001].

Оценка ситуации при бодрствовании зависит от баланса тормозных и возбуждающих взаимодействий в структурах головного мозга, и у тревожных испытуемых проявления тормозных процессов выражены меньше, чем проявления процессов возбуждения [Вейн A.M. и соавт., 2001; Вербицкий Е.В., 2003]. Это имеет как положительные, так и отрицательные последствия. Положительные проявляются в том, что состояние оптимальной

ситуативной тревожности делает человека более чувствительным к признакам опасного развития событий и тем самым позволяет вовремя локализовать источник опасности, мобилизовать ресурсы организма для его нейтрализации и выстраивания адекватной линии поведения [Каплан Л.Я., 2003]. Отрицательные выражаются в большей чувствительности к неблагоприятным воздействиям внешней среды, что по нашему мнению может проявляться в более частом выборе самого расточительного варианта резистентной стратегии адаптации - стресс-реакции и приводить к преждевременному старению преимущественно особей с избыточно высоким уровнем личностной тревожности.

Поскольку изменить генетически детерминированные различия в индивидуальных реакциях на внешние воздействия невозможно, мы предположили, что с помощью введения пептидов удастся воздействовать на степень прироста ситуативной тревожности и тем самым повлиять на выбор организмом типа адаптационной стратегии, что позволит замедлить процесс ухудшения адаптационных возможностей с возрастом и предотвратить ускоренное старение даже в условиях экстремальных воздействий.

Повышение уровня тревожности является одним из основных симптомов ассоциированных с возрастом патологий наподобие болезни Альцгеймера, паркинсонизма, климактерического синдрома, а также таких распространенных стресс-индуцированных нарушений как синдром хронической усталости, астенический синдром [Александровский Ю.А., 1994; Колыхалов И.В., Селезнева Н.Д., 2001; Стрижова Н.В., Шарапова О.В., 2002], Доказана тесная взаимосвязь между ухудшением качества жизни и избыточной тревожностью [Кравченко А .Я. и соавт., 2004].

С другой стороны известно [Макаров В.И., 1979; Hurd М. and Ralph М., 1998], что и стресс, и старение сопровождаются не только повышением уровня тревожности, но и дестабилизацией циркадианных ритмов (и чем выше тревожность, тем сильнее выражена дестабилизация).

Вероятно, пептиды способны адекватно осуществлять ритмоорганизуюгцую регуляцию адаптационных реакций в онтогенезе, что позволяет им превосходить непептидные анксиолитические препараты по силе стресс- и гсропротекторного действия.

Особый практический интерес в этой связи представляет возможность использования пептидов для управления ритмогенезом поведения при стрессе и старении. Поведение во всей сложности его проявлений является продуктом непрерывных взаимоотношений организма с окружающей средой [Батуев A.C., 1986], поэтому существует тесная взаимосвязь поведенческих реакций со сдвигами гомеостаза, ускоренным старением и гибелью клеток при неблагоприятных внешних воздействиях [Хавинсон В.Х. и соавт., 1999; Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001].

На основании изложенного нами было выдвинуто положение о том, что эффективность стресс- и геропротекторного действия пептидных препаратов можно повысить путем направленного влияния на выбор организмом адаптационной реакции на экстремальное воздействие посредством изменения уровня ситуативной тревожности.

Цель и задачи исследования

Целью работы явилось изучение механизмов участия некоторых пептидов в адаптации организма к стрессорным воздействиям и обоснование концепции пептидной ритмоорганизующей и анксиогенно-анксиолитической регуляции адаптационных процессов у молодых и старых животных.

В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Установить выбор организмом адаптационной реакции в ответ на экстремальное воздействие в зависимости от генетически детерминированного уровня тревожности и возможность изменить этот выбор путем введения пептидных препаратов (на примере НКТ и ГВС-111).

2. Установить по анализу лейкоцитарной формулы крови зависимость типа адаптационной реакции организма крыс на введение пептидных препаратов (эпиталамин, эпиталон, вилон, кортаген, ДСИП, КТ, НКТ и ГВС-111) в нормальных физиологических условиях и при экстремальных воздействиях от характера их влияния на поведенческие проявления тревожности.

3. Изучить влияние исследуемых пептидных препаратов на циркадианную ритмику (соотношение основных форм) поведения в нормальных физиологических условиях и при экстремальных воздействиях у молодых и старых крыс.

4. Исследовать возрастные особенности влияния экстремальных воздействий на фоне введения пептидных препаратов с различной анксиолитической активностью и без них на интенсивность старения на основании определения показателей СРО, фагоцитарной активности лейкоцитов, активности ферментов аптиоксидантной защиты и уровня хромосомных аберраций в тканях высокотревожных крыс.

5. Установить возрастные особенности влияния исследуемых пептидов на моноаминергические механизмы нейрогуморалыюй регуляции гомеостаза в процессе развития реакции организма на экстремальное воздействие.

6. Сравнить эффекты исследуемых пептидов с пирацетамом, традиционно применяемым в клинике для коррекции ряда возрастных функциональных и метаболических нарушений, и разработать алгоритм определения возрастных особенностей эффективности и последствий применения пептидных препаратов с различной анксиолитической активностью в

-' условиях неблагоприятных внешних воздействий.

Научная новизна работы

Показано, что ускоренное старение преимущественно характерно для крыс с высоким генетически детерминированным уровнем тревожности. При этом впервые выявлено, что гипокинезия по силе негативного влияния на процесс старения превосходит стрессорную физическую нагрузку и гипоксию.

Впервые у высокотревожных особей зарегистрированы достоверные обратные корреляции между влиянием исследованных пептидных препаратов на уровень ситуативной тревожности (основные индикаторы Я6+Я7) и показателем адаптированности интактных крыс ШО/Ш1, количеством фагоцитирующих клеток, активностью нейтрофильных лейкоцитов. Обнаружены и положительные корреляционные взаимосвязи 116+117 с интенсивностью старения, определенную по уровню продуктов СРО (в головном мозге и плазме крови) и количеству аберраций хромосом в костном мозге. Продемонстрировано значение влияния пептидов на уровень тревожности в реализации их антистрессорного и геропротекторного эффекта. На основании проведенных исследований впервые сформулирована концепция о важной роли ритмоорганизующего влияния пептидов на структуру поведения в повышении эффективности адаптивного ответа.

Практическая значимость работы

Полученные в данной работе новые факты об анксиогенно-анксиолитической и ритмоорганизующей регуляции пептидами адаптационных реакций и зависимости ее величины и направленности от возраста и генетически-детерминированного уровня тревожности позволяют специалистам в области медицины и спортивной фармакологии осуществлять дифференцированный подход к выбору дозы и пептидного препарата в целях управления эффективностью адаптации и темпами старения в нормальных и экстремальных условиях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В зависимости от направления и величины сдвига уровня ситуативной тревожности в результате инъекции пептидного препарата повышается или снижается эффективность адаптационной реакции и это в первом случае препятствует ускоренному старению и способствует ему во втором.

2. Общими (вне зависимости от возраста и индивидуально-типологических особенностей) механизмами участия пептидов в управлении эффективностью адаптации является их влияние на интенсивность СРО и процессы центральной регуляции ГТАК-оси.

3. Предопределить выбор наилучшей для каждой конкретной ситуации адаптационной стратегии возможно путем введения животным пептидного

препарата с таким анксиолитическим (у высокотревожных) или анксиогенным эффектом (у низкотревожных), который обеспечит сдвиг ситуативной тревожности в оптимальный для каждого возраста интервал. При этом вклад в стресс- и геропротекторное действие пептидов вносят их антимутагенный и иммуностимулирующий эффекты.

4. Чрезмерное снижение или повышение ситуативной тревожности (за пределы оптимального интервала) после инъекции пептидного препарата отрицательно влияет на адаптационные возможности, в связи с чем в условиях последующего стрессорного воздействия дезорганизация циркадианной ритмики поведения и усиление мутационного процесса будут сохраняться и даже усугубляться.

5. Способность пептидов с анксиолитической активностью препятствовать стресс-индуцированной инверсии цикла «активность-покой» у высокотревожных животных обеих возрастных групп и снижать вероятность дссинхронизации, развивающейся в процессе старения, позволяет управлять поведением в нормальных и экстремальных условиях на основе ритмоорганизующей регуляции адаптационных реакций.

Апробация и реализация результатов исследования

Материалы диссертации докладывались 2-ом Международном конгрессе всемирной федерации обществ по изучению сна (Нассау, Багамы, 1995), 10-й конференции Американского общества по изучению сна (Вашингтон, США, 1996), 8-м Международном конгрессе нейрохимического общества Чехии и Словакии (1996), 2-м конгрессе Европейской ассоциации по нейронаукам (Страсбург, Франция, 1996), 12-й конференции Европейского нейрохимического общества (Санкт-Петербург, Россия, 1998), 3-м конгрессе Европейской ассоциации по нейронаукам (Берлин, Германия, 1998), 5-й международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, Россия, 1998), XXX совещании по проблемам ВНД (Санкт-Петербург, Россия, 2000), 5-м конгрессе Европейской ассоциации по нейронаукам (Брайтон, Великобритания, 2000), XVIII съезде физиологов России (Казань, 2001), Международной конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в развитии и функционировании ЦНС: от плода к старению» (Санкт-Петербург, Россия, 2001), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (2004), конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), 2-м Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 4-й Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005).

Материалы работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий в Ростовском государственном педагогическом '"университете по курсам: «Физиология: общая, возрастная, спортивная»,

«Спортивная фармакология», «Спортивная медицина», «Физиология регуляторных пептидов», а также на курсах повышения квалификации специалистов по физиологии, спортивной медицине.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 50 работ, в том числе 1 монография.

Связь с научно-исследовательской работой Института. Работа выполнена в соответствии с заданиями: единого Заказа-наряда Минобразования РФ (1998-2005) и грантов Конкурсного центра фундаментального естествознания Санкт-Петербургского государственного университета (1998-2002).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 244 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель диссертации содержит 374 источника, из них 253 работы отечественных и 121 работа зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 83 таблицами и 14 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные.

В первом разделе работы, посвященном изучению адаптивных возможностей крыс с различным уровнем тревожности, исследование проведено на 180 белых беспородных половозрелых крысах-самцах разного уровня тревожности в возрасте 3-х месяцев, массой 120-160 г.

Последующие эксперименты проводились на молодых (3 месяца, что соответствует возрасту начала половозрелого цикла развития) и старых (18 — 20 месяцев, когда цикл половозрелости завершается) крысах-самцах с высоким уровнем тревожности (всего 1215 животных). В качестве контрольных использовались 2 группы животных: содержащиеся в условиях вивария; с введением 0,9%-го NaCl, поскольку пептиды разводились в физиологическом растворе.

Исследуемые препараты. В работе применяли:

1. Полученные в Санкт-Петербургском НИИ Биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН методом целенаправленного конструирования короткие пептиды кортаген (Ala-Glu-Asp-Pro), вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), которые вводили пятикратно с интервалом 24 часа в дозе 2,5 мкг/кг и комплексный полипептидный препарат эпифиза эпиталамин, который вводили пятикратно в дозе 150 мкг/кг массы животного.

2. Дипептидный ноотроп ГВС-111 (ноопепт, этиловый эфир N-фенилацетил- L-пролилглицина), синтезированный в НИИ фармакологии РАМН г. Москва. Препарат вводили животным однократно в дозе 0,5 мг/кг массы.

3. Синтезированные в лаборатории Химии пептидов Института Биоорганической химии им. М.М. Шемякина РАН, г. Москва: ДСИП (Тгр-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu), MKT (Thr-Ser-Lys-Tyr-Arg) и КТ (Tyr-Arg), которые вводили однократно в дозе 120, 500 и 50 мкг/кг, соответственно.

4. Пирацетам (ноотропил, Polfa), который вводили трехкратно с интервалом 24 часа в дозе 30 мг/кг массы животных.

Пептиды вводили внутрибрюшинно в 9 часов утра: при однократной инъекции за час до начала стрессорного воздействия, при многократном введении — последнюю инъекцию делали за 24 часа до начала 3-часовой гипоксии или 24-часовой гипокинезии, или непосредственно перед началом 30-минутного плавания. Дозы и интервалы времени для изучения действия препаратов отработаны в предыдущих исследованиях [Менджерицкий A.M. и соавт., 1994; Зиганшин Р.Х. и соавт., 1994; Менджерицкий A.M. и соавт., 1995; Лысенко А.В. и соавт., 1997; Малинин В.В., 2001].

Модели экспериментального стресса. Выбор моделей экстремального воздействия был обусловлен следующими причинами:

1. Гипокинезия в совокупности с нарастанием нервно-психического напряжения человека в современных условиях является патогенетическим фактором развития многих заболеваний [Банин В.В. и соавт., 1994], в первую очередь сердечно-сосудистых и церебро-васкулярных [Marby T. et al., 1995], что может способствовать преждевременному старению. Кроме того, гипокинезия относится к группе основных симптомов паркинсонизма [Charlton С., Crowell В., 1995]. Гипокинезию моделировали путем помещения крыс в тесные пластиковые пеналы из оргстекла [Федоров И.В., 1987].

2. Систематическая и оптимальная по продолжительности и интенсивности физическая нагрузка является антистрессорным фактором, способствующим повышению адаптационных возможностей организма и замедлению возрастных нарушений структуры и функции органов и тканей [Paffenbarger R. et al., 1993; Коркушко О.В., Ярошенко Ю.Т., 1996]. Оптимальные физические нагрузки - наиболее надежный способ профилактики избыточной массы тела, которая наряду с гипокинезией является основным фактором риска развития многих заболеваний и сокращения продолжительности жизни [North T. et al., 1990; Caspersen С et al., 1991]. С другой стороны, чрезмерные физические нагрузки приводят к развитию стресс-реакций [Вовк С.И., 2001]. Вынужденное плавание проводили при температуре воды 28-30°С [Усик C.B., Ленкова Н.В., 1981].

3. Гипоксия является одним из стрессорных факторов, приводящих к ускоренному старению, и важным компонентом не только гипокинезии и физической нагрузки, но и практически любого неблагоприятного внешнего воздействия [Агаджанян Н.А., 1987; Елизаров А.Н. и соавт., 1998]. Гипоксия мозга также играет важную роль в реализации генетической предрасположенности к болезни Альцгеймера [Iqbal К. et al., 1997], а возникающая с возрастом органо-тканевая гипоксия служит причиной прогрессирования возрастных изменений [Коркушко О.В., Лишневская В.Ю., 2002]. С другой стороны, повышение устойчивости к гипоксии (использование интервальной гипоксической тренировки и антигипоксических средств) сопровождается неспецифическим повышением резистентности к другим экстремальным воздействиям и тормозит процесс старения [Меерсон Ф.З. и соавт., 1989; Горанчук В.В. и соавт., 2003]. Гипоксическую гипоксию в течение 3 часов моделировали в барокамере проточно-вытяжного типа при давлении 0,029 МПа, что соответствует подъему на высоту 9000 м над уровнем моря [Вальдман А.В. и соавт., 1989].

Физиологические методы исследования. Разделение экспериментальных животных на группы с высоким и низким уровнем тревожности проводили в условиях стандартной методики открытого поля [Буреш Л. и соавт., 1991], затем — вынужденного плавания [Арушанян Э.Б. и соавт., 1990]. Животных помещали в индивидуальные плексигласовые камеры (0,4x0,5x0,7 м) для непрерывного наблюдения за поведением при естественном освещении (ночью использовали фотофонарь) с применением модифицированного теста - открытого поля [Вербицкий Е.В., 2003]. Эксперимент проводили в весенне-летний период. Каждая серия экспериментов начиналась в 9 часов утра после 3 суток адаптации в экспериментальной камере. Данные, полученные на третьи сутки адаптации, принимали за контроль. Суммарная продолжительность вертикальных и горизонтальных локомоций, груминга, мелкой двигательной активности, потребления воды и пищи отражала состояние активного бодрствования (R9). Оценку состояния (Rl, R8, R9), поведения (R2, R3, R4, R5, R6, R7), отношения представленности целенаправленного (R10) к

нецеленаправленному (R11) поведению (R10/R11- показатель адаптированности организма) проводили для выявления особенностей формирования адаптационной стратегии.

Биофизические и биохимические методы исследования. Для изучения влияния пептидов на фагоцитарную активность лейкоцитов измеряли интенсивность люминолзависимой ХЛ цельной крови [Фролова В.М. и соавт, 1992] на хемилюминометре «Victor-2» (Wallac, Финляндия).

Интенсивность СРО оценивали по количеству МДА (ТБЬС-активных продуктов), ДК и ШО, а также по показателям ЦОг-индуцированной

люминолзависимой ХЛ в плазме крови и водорастворимой фракции коры головного мозга [Арутюнян A.B. и соавт., 2000; Камышников B.C., 2004]. Определяли активность ферментов антиоксидантной защиты супероксиддисмутазы [Арутюнян A.B. и соавт., 2000] и каталазы [Королюк М.А. и соавт., 1988] в мозге, плазме крови и эритроцитарном лизате, а также содержание белка плазмы крови ЦП [Камышников B.C., 2000]. О состоянии эритроцитарных и лейкоцитарных мембран судили по количеству ВЭГ [Меньшиков В.В. и соавт., 1987] и СПА [Внуков В.В., 1979]. Измерения проводили на биохимическом анализаторе "Roki" (Olyvex Diagnosticum, Санкт-Петербург, Россия), спектрофотометре "DU-7" (Beckman, США).

Содержание биогенных аминов определяли, применяя обращенно-фазный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии на установке Liquochrom 312/1 (Венгрия) с колонкой Nucleosil С18 фирмы "SERVA" [Krstulovic А„ Powell А., 1979]. В качестве детектора использовали флуоресцентный спектрофотометр (Hitachi F-4010, Япония). Расчет концентраций моноаминов в образцах производили, используя стандартные растворы фирмы "SERVA" с 3.4 - дигидро-бензиламин гидрохлоридом в качестве внутреннего стандарта.

Выделение субклеточных фракций проводили методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [de Robertis Е., 1971] на ультраценгрифуге VAC-602. Анализ структурных нарушений хромосом проводили на установке «ВидеоТест-Карио» (Санкт-Петербург, Россия).

Определение лейкоцитарной формулы. Фиксацию мазков крови проводили раствором эозинметиленового синего по Маю - Гргонвальду, окраску - по Романовскому - Гимзе [Меньшиков В.В., 1987]. Количество форменных элементов в лейкоцитарной формуле подсчитывали при помощи светового микроскопа «Микмед-1» (ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия) и выражали в процентах от общего количества лейкоцитов. Гаркави Л.Х. и соавторами (1990) для определения типа адаптационной реакции предложена шкала количества лимфоцитов: 0-45% - стресс (при уменьшении происходит переход от стадии тревоги острого стресса к стадии истощения или к состоянию хронического стресса), 45-60% - тренировка, более 60% -спокойная активация с последующим развитием повышенной активации и переактивации. Границы перехода от одного типа адаптационной реакции к другому по шкале лимфоцитов и соотношению Л/СЯ имеют вид интервала. Коэффициент Л/СЯ введен авторами на основании того, что при развитии адаптационных реакций у крыс наибольшие изменения регистрируются в уровне лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов. Значения коэффициента минимальны при стрессе, максимальны — при реакции активации (спокойной, повышенной и переактивации).

Лабораторная база для проведения исследований была предоставлена лабораторией иммуноферментного анализа НИИ Биологии РГУ (зав. лаб. д.б.н., проф. Шкурат Т.П.) и сотрудниками клинико-диагностической лаборатории «Наука».

Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработке с помощью компьютерной программы с^айБйса» 6.0. Использовали метод Фишера-Стыодента, корреляционный тест Спирмена и регрессионный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние пептидов на адаптивные возможности крыс с различным

уровнем тревожности (на примере НКТ и ноотропа ГВС-111)

Исследования, проведенные на интактных животных разного возраста, подтвердили имеющиеся в литературе сведения [Вербицкий Е.В., 2003] о различиях в суточной динамике состояния и поведения животных с высокой тревожностью по сравнению с низкотревожными особями:

- повышение количества экстремумов на кривых суточной динамики состояния (Ш, 118,119) и несовпадение экстремумов для Ш и 119;

менее выраженная зависимость между освещенностью и продолжительностью сна, активного и релаксированного бодрствования (нет преобладания сна днем и активного бодрствования ночью);

в структуре активного бодрствования преобладают нецеленаправленные формы поведения;

- продолжительность пищевого и питьевого поведения увеличена.

При использовании модели 24-часовой гипокинезии было установлено, что животные, отличающиеся по индивидуально-типологическим особенностям, используют различные по нейрофизиологическим механизмам стратегии адаптации к этому экстремальному воздействию внешней среды: высокотревожные - реакцию стресса, низкотревожные - более выгодную в энергетическом плане реакцию повышенной активации. При этом в условиях ограничения подвижности высокотревожные крысы были более склоны к развитию структурно-функциональных нарушений по сравнению с низкотревожными особями. Об этом свидетельствует более выраженное изменение у них поведенческих реакций, интенсивности СРО, числа хромосомных аберраций и формулы белой крови (рис. 1). Профилактическое введение ГВС-111 в условиях экстремального воздействия способствовало (наряду с антимутагенным эффектом) развитию более экономичной стратегии адаптации — реакции спокойной (низкотревожные) и повышенной (высокотревожные) активации, вероятно, за счет способности препарата влиять на поведенческие проявления тревожности и создавать оптимальный

баланс между интенсивностью ПОЛ и активностью антиоксидантных ферментов (рис.2). Это также наглядно проявлялось после введения ноотропного дипептида интактным животным. Активация ПОЛ в мозге и крови низкотревожных крыс сопровождается повышением до оптимального уровня таких проявлений ситуативной тревожности как груминг и мелкая двигательная активность без снижения соотношения R10/R11 как показателя адаптированности организма (рис.2) и способствует развитию адаптационной реакции активации (через час - спокойной, через 24 часа - повышенной), для которой характерно ускорение окислительных процессов и умеренное физиологическое возбуждение. Сдвиг баланса про- и антиоксидантных процессов в сторону активации ферментов АОС в коре головного мозга у животных с высоким уровнем тревожности после введения дипептида, способствовал снижению ситуативной тревожности до оптимального уровня, увеличению в 1,5 раза соотношения R10/R11 и развитию адаптационной реакции повышенной активации (сохраняется в течение 24 часов после инъекции ГВС-111). Известно, что ноотропный и анксиолитический эффекты ГВС-111 разнесены по дозовому диапазону: при увеличении дозы препарата наблюдается переход ноотропного эффекта в анксиолитический [Островская Р.У. и соавт., 2001]. Поэтому особенности «преадаптивного» и стресс-протекторного действия ГВС -Illy животных с различными индивидуально-типологическими особенностями можно объяснить тем, что на низкотревожных животных он действует как типичный ноотропный препарат (усиливает снабжение тканей кислородом, интенсифицирует пластический и энергетический метаболизм), тогда как у крыс с высоким уровнем тревожности проявляются его анксиолитические свойства. Это объяснение подтверждается характером реализации антистрессорного эффекта ГВС-111 в головном мозге: у высокотревожных — преимущественно на уровне синаптических структур, а у крыс с низким уровнем тревожности на уровне энергообмена, что проявлялось в различной степени накопления ДК и ШО в соответствующих фракциях (рис. 2).

Введение НКТ перед началом 24-часовой гипокинезии отрицательно повлияло на выбор ответной реакции организма животных с различной чувствительностью к стрессорным воздействиям, что, вероятно, было обусловлено довольно существенным анксиогенным эффектом, который в отличие от ГВС-111 проявился у крыс обеих типологических групп и был гораздо более выраженным (рис.2).

В отдельной серии экспериментов было показано, что независимо от индивидуально-типологических особенностей у интактных старых крыс, в отличие от молодых, усиливались поведенческие проявления тревожности и снижалась интенсивность горизонтальной локомоторной активности.

Высокотревожные (у интактных ШО/Ш 1=0,53) Низкотревожные (у интактных КЛО/КЛ 1=1,05)

ПОВЕДЕНИЕ

У 90% крыс в конце воздействия -подергивание мышц морды и дрожание хвоста, который был поднят вверх и/или прижат к голове До 95 % времени наблюдения за поведением при ограничении подвижности составляло Кб - Ш5.

ИНТЕНСИВНОСТЬ СРО '% к контрольному уровню)

% АБЕРРАЦИИ ХРОМОСОМ ОТ ОБЩЕГО ЧИСЛА АНАФАЗ

контроль гипокинезия

контроль

гипокинезия

ТИП АДАПТАЦИОННОЙ РЕАКЦИИ ПО ШКАЛЕ ЛИМФОЦИТОВ (М±т)

39,40 ±2,53* (п=15) 81,38 ± 1,29* (п=10)

Рис. 1. Влияние 24-часовой гипокинезии на молодых крыс с разным уровнем тревожности (*- р<0,05 по сравнению с уровнем контроля). Очередность столбцов в диаграмме: 1- ДК, синаптосомы, 2- ШО, синаптосомы, 3- МДА, мозг, 4- - ВЭГ, 5- СПА, плазма крови.

Высокотревожные Низкотревожные

ПОВЕДЕНИЕ (% от времена наблюдения в течение суток)

□ ГВС-111 24 ч

И контроль

□ ГВС-111 24ч □НКТ24Ч

ИНТЕНСИВНОСТЬ СРО через сутки после введения ГВС-111

интактным крысам (% к контрольному уровню)

КОЛИЧЕСТВО ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ при гипокинезии на фоне _И НЪЕКЦИИ ГВС-111 (% к уровню при стрессе)

□ костный мозг ■ эпителий роговицы

ТИП АДАПТАЦИОННОЙ РЕАКЦИИ ПО ШКАЛЕ ЛИМФОЦИТОВ

при введении ГВС-111 интактным крысам -реакция повышенной активации

при введении ГВС-111 интактным крысам-спокойная (через час) и повышенная (через _24 ч) активация_

при гипокинезии на фоне инъекции НКТ-стресс-реакция с признаками перехода в _стадию истощения_

при гипокинезии на фоне инъекции НКТ-стадия тревоги острого стресса

Рнс. 2. Влияние ГВС-111 и НКТ на молодых крыс с разным уровнем тревожности (*-р<0,05 по сравнению с уровнем контроля или стресса). Очередность столбцов в диаграмме: 1- ДК- синаптосомы, 2- ШО- синаптосомы, 3- ДК, митохондрии, 4- ШО, ''митохондрии, 5- СОД, мозг.

Характерной чертой изменения поведения у старых животных с низким уровнем тревожности было увеличение доли сна, груминга и потребления воды, снижение длительности пищевой активности и вертикальной локомоции в дневной и ночной период (рис.3). Наряду с этим, у старых крыс с высоким уровнем тревожности наблюдалось уменьшение продолжительности поведенческого сна и питьевого поведения по сравнению с молодыми особями (рис. 3). Необходимо отметить большое сходство между структурой поведения в цикле «бодрствование-сон» и характером циркадной ритмики изученных форм поведения у молодых интактных крыс с высоким уровнем тревожности и старых низкотревожных особей. Это (вместе с более высоким уровнем хромосомных аберраций) подтверждает нашу гипотезу о том, что ускоренное старение преимущественно характерно для индивидов с высоким уровнем тревожности (рис.2,3).

Исходя из полученных данных, можно предположить, что в зависимости от направления и величины сдвига уровня ситуативной тревожности в результате инъекции пептидного препарата повышается или снижается эффективность адаптационной реакции и это в первом случае препятствует ускоренному старению и способствует ему во втором. Данное предположение было решено проверить у животных разного возраста на более широком спектре пептидов и экстремальных воздействий. Для этого был проведен скрининг пептидных препаратов и экстремальных воздействий по их влиянию на поведенческие проявления тревожности и интенсивность старения у молодых и старых высокотревожных крыс (т.к. они оказались не только менее стрессустойчивы, но и более чувствительны к стресс-протекторному действию ГВС-111).

Кроме того, высокотревожные крысы отличаются более выраженной интенсивностью пероксидации липидов и высоким содержанием продуктов ПОЛ до и после стресса (по сравнению с низкотревожными) и низкой активностью СОД, что свидетельствует о слабости антиоксидантной защиты у особей данного типа [Бондаренко H.A. и соавт., 1981; Воскресенский О.Н. и соавт., 1982; Коркушко О.В. и соавт., 2002]. С другой стороны, индукция преждевременного старения и формирование возрастной патологии связаны с нарастанием молекулярных повреждений, вызываемых иммунодепрессией и сдвигом баланса про- и антиоксидантных процессов в сторону снижения интенсивности последних [Harman D., 1996 ; Yu В., 1996].

МОЛОДЫЕ

СТАРЫЕ

IШЗКОТРЕВОЖНЫЕ

ВЫСОКОТРЕВОЖНЫЕ

I

1

Всего

Рис.З. Возрастные особенности суточной динамики состояния (Н.1, Я8,119) и поведения (Д2 - 117) крыс с различным уровнем тревожности. Темное время суток с 20.00 до 5.00 (п=15-20; % от времени наблюдения).

Взаимосвязь между влиянием пептидов на выбор адаптационной реакции и уровнем поведенческих проявлений тревожности у интактных крыс разного возраста с низкой устойчивостью к стрессорным

воздействиям

При тестировании препаратов обнаружено, что по своему преимущественному влиянию они разделились на 3 группы (табл. 1):

- проявившие анксиогенный эффект у молодых и старых высокотревожных крыс (НКТ, пирацетам) и способствовавшие снижению ШО/Ш1;

- не влиявшие на уровень тревожности (КТ- у молодых и старых, ГВС-111 — у старых), причем введение КТ способствовало снижению 1110/1111, а инъекция ГВС-111, напротив, увеличению данного показателя;

обладавшие анксиолитическим действием различной степени выраженности (эффект эпиталамина, кортагена, вилона, эпиталона и ДСИП проявился у крыс обеих возрастных групп, а ГВС-111 — только у молодых) и способствовавшие увеличению ШО/Ш 1.

Установлено, что имеется обратная корреляция между уровнем ситуативной тревожности (основные индикаторы 116+117) и показателем адаптированности интактных крыс ШО/Ш 1, причем данная взаимосвязь более четко выражена у молодых животных (табл. 1). Обнаружена также положительная корреляционная взаимосвязь между типом адаптационной реакции но шкале лимфоцитов и степенью поведенческих проявлений тревожности при введении изученных препаратов (у молодых особей г=0,64 при р<0,01, у старых г=0,73 при р<0,002). На основании результатов, представленных в таблице 1 и данных литературы о том, что главная антистрессорная функция принадлежит реакции активации [Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., 1996] можно предположить, что существует диапазон оптимального уровня ситуативной тревожности (специфичный для каждого возраста), в котором осуществляется выбор наилучшей для каждой конкретной ситуации адаптационной стратегии.

На наличие такого оптимального интервала и различные механизмы анксиолитического и анксиогенного влияния изученных препаратов указывают следующие результаты:

• Наибольший стимулирующий эффект на фагоцитарную активность лейкоцитов молодых животных оказал вилон, что проявилось при анализе латентного периода (отражает степень подготовленности фагоцитирующей системы к ответу на чужеродный агент), светосуммы (определяет уровень метаболической активности иммунокомпетентных клеток) и высоты медленной вспышки (показатель количества фагоцитирующих клеток) ХЛ цельной крови, взятой сразу после декапитации.

Таблица 1

Взаимосвязь между уровнем тревожности, степенью адаптированное™ и типом адаптационной реакции (определенной по лейкоцитарной формуле) на введение пептидных препаратов и пирацетама (здесь и далее цифрами около названия обозначен день после начала введения, р- достоверность отличий по сравнению с уровнем контроля, п=8-15).

МОЛОДЫЕ высокотревожные СТАРЫЕ высокотревожные

Препарат 1*6+1*7 Мин/ сутки ШО Ш1 Л С-Я Шкала лимфоцитов % Препарат К6+К7 Мин/ сутки Ело ЯП Л СЯ Шкала лимфоцитов %

Эгштала -мин 5 185,5 р<0,05 0,64 1,11 45-60 Корта-ген 8 305,3 р<0.05 0,51 2,16 45-60

Корта-ген 8 243,5 р<0,05 0,64 5,39 60-75 о 45 Вилон 8 321,0 р<0,05 0,49 7,14 60-75

ДСИП 1 250,6 0,81 4,34 Эпита-лон 5 321,1 р<0,05 0,30 7,27 75-79

ГВС 1 251,3 р<0.05 1,24 8,78 о 1 и-) Эпитала-мин 5 333,8 р<0,05 0,42 2,67

Вштон 5 267,4 р<0,05 0,49 7,61 Эпита-лон 6 335,2 р<0,05 0,56 7,33

Вилон 8 276,2 р<0,1 0,69 7,72 Вилон 5 356,3 р>0,1 0,41 7,05 60-75

Корта-ген 5 286,9 р<0,1 0,48 4,95 о чо ДСИН 1 374,3 р<0,1 0,21 7,08

Эпита-лон 8 307,1 р<0,1 0,68 4,95 Корта-ген 5 415,2 р>0,1 0,33 6,16

Эпита-лон 5 329,3 р>0,1 0,63 4,87. Контроль 416,8 0,43 5,30

Контроль 334,0 0,53 2,68 ГВС 1 434,5 р>0,1 0,44 9,83

КТ 1 346,8 Р>0,1 0,27 2,14 КТ 1 465,3 р>0,1 0,18 8,16

Пираце -там 3 376,4 р>0,1 0,27 4,04 >79 НКТ 3 479,6 р>0,1 0,30 7,74 >79

НКТ 3 ' 382,4 р<0.05 0,49 8,52 НК'Г 1 490,6 р<0,05 0,33 7,98

НКТ 1 406,0 р<0,05 0,44 8,80 Пираце-там 3 494,3 р<0,05 0,40 8,85

Пираце -там 5 415,7 р<0,05 0,41 14,2 Пираце-там 5 513,0 р<0,05 0,35 10,67

г -0,72 р<0,002 г -0,44 0,05<р<0,1

На старых животных максимальный иммуностимулирующий эффект оказал эпиталон, хотя и с некоторым запаздыванием, что отражалось в величине показателей XJI цельной крови, исследованной через сутки после декапитации.

Обнаружена взаимосвязь между влиянием вилона, кортагена и эпиталона на уровень ситуативной тревожности и количеством фагоцитирующих клеток (у молодых особей г= -0,89 при р<0,002, у старых г= -0,81 при р<0,015), а также между Rl 1 и активностью нейтрофильных лейкоцитов (у молодых г= -0,88 при р<0,004, у старых i= -0,74 при р<0,037).

Анксиолитическое действие пептидных препаратов у молодых (эпиталамин, ГВС, ДСИП, вилон, кортаген, эпиталон) и старых крыс (эпиталон, эпиталамин, вилон, ДСИП, кортаген) сопровождалось повышением степени адаптированности организма, антимутагенным эффектом (только у молодых), угнетением интенсивности СРО и активацией АОС до уровня на 20-60% превышающего контрольные показатели; по мере усиления анксиогенного эффекта наблюдалось увеличение числа хромосомных аберраций, накопление продуктов СРО при падении активности СОД в эритроцитах и ее «сверхактивация» в ткани головного мозга (рис. 4, 5, табл. 1,2).

Анксиогенный эффект сопровождался (рис.6) сверхактивацией либо серотонин- либо норадренергической системы в головном мозге (судя по значительному отклонению от контрольного уровня НА/Сер в гипоталамусе у молодых от КТ до НКТ включительно, у старых - от ГВС до пирацетама), что согласуется с представлениями о роли данных систем в генезе тревожных расстройств [Каплан Г.И., 1994], в реализации ноотропного и терморегуляторного эффектов перечисленных препаратов, а также с сообщениями о способности избытка L-аргинина и киоторфина в ЦНС имитировать стрессовый ответ путем увеличения выброса окситоцина и активации симпатической нервной системы [McEntee W., Crook Т., 1991; Агаджанян Н.А. и соавт., 2001].

Результаты, представленные на рисунке 6, согласуются с данными литературы о положительной корреляции активности норадреналин- и дофаминергической систем головного мозга и отрицательной связи активности холин- и серотониергической систем с подвижностью в открытом поле [Гуляева Н.В., Степаничев М.Ю., 1997; Умрюхин А.Е., Ландграф Р., 2002]. Преимущественная активация дофаминергической системы в мозге животных обеих возрастных групп при введении вилона позволяет рассматривать данный препарат в качестве перспективного средства при лечении болезни Паркинсона.

-Эт •

- СОД, эритроциты

•МДА

- А- СОД

-20 -40

1 "Л -V Г 1

А -А * щ Л ' и I ■

V | к •

10 X 5 с с 5: сс я и Л 1 /ю \§ / I \ • г ° п 2 л 1»" Ё

Г 5 ш \й/ « й Ё а «9 О. I1-

с О С

140 120 100 80 Б0 40 20 О -20 -40 -60

4

* а « в

а ' ■ «

а * А | «

Д » Д

» * Л » / • и

ш I с /о & ^ х 1п/ % 1 1 £ ^ Л £ со г ь

г га с; те ч/ ш (0 н сх аз н X Уф 3" 03 I

¿г О X С

СТАРЫЕ, кровь

СТАРЫЕ, мозг

—®—Эт •

- СОД, эритроциты

■МДА

А- СОД |

Рис.4. Влияние пептидов и пирацетама на интенсивность наиболее информативных показателей СРО интактных крыс. По шкале абсцисс расположены препараты в порядке усиления поведенческих проявлений тревоясности при их введении, по шкале ординат - % изменений к контрольному уровню; *- р<0,05.

МОЛОДЫЕ

СТАРЫЕ

30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20

й! * ' ' I В'

1

1 2 3 4 5 6

гипоксия гипокинезия

гипоксия гипокинезия

200

150

100

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 5. Количество аберраций хромосом в эпителии роговицы (темный столбик) и костном мозге (светлый) у интактных крыс (А), при стрессе (Б) и введении препаратов в условиях гипокинезии (В). Обозначения: 1- кортаген 5, 2- вилон 5, 3- эпиталон 5, 4- пирацетам 3, 5- ГВС 1, б- ДСИП 1, 7-эпиталамин 5; % к контролю; *-р<0,05.

-НА/А

-О — Гистамин

—О—НА/Сер_-О-ДА

СТАРЫЕ, кровь

СТАРЫЕ, мозг

-О-ДА

НА/Сер, правая шкала

700

Рис.6. Влияние пептидов н пирацетама на наиболее информативные показатели моноаминергических механизмов нейрогуморальной регуляции гомеостаза гаггактных крыс. По шкале абсцисс расположены препараты в порядке усиления поведенческих проявлений тревожности при их введении, по шкале ординат - % изменений к контрольному уровню; *- р<0,05.

Таблица 2

Корреляционные взаимосвязи между уровнем поведенческих проявлений тревожности, степенью адаптированности организма, интенсивностью СРО и количеством аберраций хромосом у интактных крыс после введения изученных препаратов (*-р<0,05, **- 0,05<р<0,1)

Sm, н, Sm, МДА СОД, СОД, Аберрации,

плазма плазма мозг эритроциты мозг костный мозг

МОЛОДЫЕ

R6+R7 0,68* 0,92* 0,47** 0,49** -0,65* 0,46** 0,62**

R10/R11 -0,86* -0,60* -0,28 -0,41** 0,19 -0,57* -0,29

СТАРЫЕ

R6+R7 0,86* 0,82* 0,71* 0,81* -0,30 0,71* 0,32

R10/R11 -0,18 -0,28 0,40** -0,48** 0,58* -0,37 -0,14

Более или менее выраженное снижение соотношения НА/А в плазме крови крыс обеих возрастных групп при введении большинства изученных препаратов с анксиолитическим действием указывало на некоторое преобладание гормонального звена регуляции симпато-адреналовой системы [Тигранян P.A., 1990], что согласуется с повышением резистентности организма до уровня, соответствующего по шкале лимфоцитов реакции активации (табл. 1, рис.6). Заслуживает внимания накопление гистамина в плазме крови молодых крыс при инъекции пирацетама и антигистаминовый эффект вилона, зарегистрированный у молодых и старых животных.

Полученные данные позволяют предполагать, что у высокотревожных крыс анксиолитическое действие пептидов должно сопровождаться повышением, а анксиогенное- снижением порога чувствительности к неблагоприятным внешним воздействиям.

Гипокинезия как стрессорньш фактор, способствующий ускоренному старению Крысы с высоким уровнем тревожности воспринимали использованные в нашем эксперименте гипокинезию, гипоксию и физическую нагрузку как чрезвычайное воздействие и отвечали на него развитием стресс-реакции, о чем свидетельствовало обнаруженное падение количества лимфоцитов ниже 45%-го уровня и минимальные значения Л/СЯ. Негативное влияние стресса было более выражено у молодых животных во время гипокинезии, у старых — во время плавания, тогда как результаты при гипоксии занимали промежуточное место (рис.5, 7-9):

МОЛОДЫЕ

СТАРЫЕ

24-часовая гипокинезия

О о 8 8 Ц

§ 3 § §

о О о гч

Первые сутки после окончания гипокинезии

Первые сутки после окончания физической нагрузки

т- ч— СЧ

Всего

ч- т- ГЧ

Всего

Рис.7. Возрастные особенности суточной динамики состояния и поведения крыс с высоким уровнем тревожности при гипокинезии и плавании. Темное 'время суток с 20.00 до 5.00 (п=10; % от времени наблюдения).

Рис.8. Влияние пептидов на фагоцитарную активность лейкоцитов по показателям ХЛ цельной крови: А- латентный период (мм, показатели через сутки — по правой шкале), Б- светосумма (количество импульсов), В- высота медленной вспышки (мм). 1- контроль, 2 - гипокинезия, 3 — кортаген + гипокинезия, 4 — вилон + гипокинезия, 5 — эпиталон + гипокинезия.

- у старых крыс во время плавания продолжительность активной горизонтальной локомоции была в 2 раза меньше, а доля R6 и степень интенсификации СРО в 1,5-2 раза выше, чем у молодых;

- у молодых животных по сравнению со старыми во время гипокинезии наблюдалось более сильное снижение фагоцитарной активности лейкоцитов, более высокий уровень продуктов ПОЛ и хромосомных аберраций.

У старых особей во время восстановительного периода после указанных воздействий отмечались большее количество пробуждений, более выраженная и длительная (минимум 3 суток) дезорганизация циркадианных ритмов поведения и меньший показатель адаптированности (рис.7). Дезорганизация выражалась не только в смещении акрофаз и перераспределении различных форм двигательной активности между дневным и ночным временем суток, но и в увеличении продолжительности сна ночью и его уменьшении днем. Индуцированные гипокинезией нарушения поведения во время восстановительного периода (особенно у старых крыс) были намного существеннее по сравнению с таковыми после физической нагрузки (рис.7). Это можно представить, исходя из того, что двигательные реакции (особенно преобладание RIO над поведенческими проявлениями тревожности) непосредственно направлены на уменьшение напряжения вегетативных гомеостатирующих систем (кровообращения, дыхания и др.) и снижение отрицательного влияния неспецифических проявлений стресса [Батуев A.C., 1986; Голубев В.Л., 1999].

Рис.9. Интенсивность СРО в тканях высокотревожных крыс при стрессорных „ воздействиях (% к контрольному уровню).

Сопоставляя полученные нами результаты поведенческих реакций, интенсивности СРО, уровня хромосомных аберраций и фагоцитарной активности у животных разного возраста, можно заключить, что:

- гипокинезия по силе негативного влияния на интенсивность старения превосходит стрессорную физическую нагрузку и гипоксию;

- старые животные лучше переносят гипокинезию, хотя ее отрицательные последствия сохраняются более длительно по сравнению с молодыми, а молодые крысы намного лучше старых переносят физическую нагрузку.

Механизмы влияния некоторых пептидов на адаптивные возможности высокотревожных крыс при экстремальных воздействиях

Способность к стресспротекторному действию изученных препаратов была связана с характером их влияния на ситуативную тревожность и тип адаптационной реакции интактных крыс (табл. 1, 3). Взаимосвязь между антистрессорным эффектом препарата и его действием на интактных животных объясняется тем, что тип развивающейся адаптационной реакции на раздражитель зависит от состояния, предшествовавшего действию этого раздражителя (в нашем эксперименте от состояния, полученного путем профилактической инъекции изучаемого препарата).

Все пептиды с анксиолитической активностью в нормальных физиологических условиях приводили к повышению резистентности организма высокотревожных крыс, а при использовании различных моделей экспериментального стресса способствовали замене стресс-реакции на более эффективные и экономичные адаптационные стратегии. На молодых крыс наиболее выраженное и положительное влияние оказали вил он и ГВС-111, на старых — эпиталон и эпиталамин. Это произошло результате формирования такого баланса между интенсивностью про- и антиоксидантных процессов, который обеспечивал у крыс обеих возрастных групп наивысшие показатели адаптированности (ШО/ГШ), максимальный антимутагенный и иммуностимулирующий эффект (рис. 5, 8, 10, табл. 3).

Особенностью влияния вилона и ГВС-111 на молодых крыс было сочетание реакции повышенной активации (уровень лимфоцитов >75% и <80%) с уменьшением уровня МДА в ткани мозга и стабилизирующим действием на мембраны эритроцитов и лейкоцитов. У старых после инъекции эпиталона и эпиталамина уровень лимфоцитов (75-79% у интактных и 6077% у стрессированных) соответствовал реакции спокойной и повышенной активации и сопровождался ингибированием образования радикальных и молекулярных продуктов ПОЛ за счет оптимизации работы каталазы, СОД и церулоплазмина.

Таблица 3

Взаимосвязь между степенью адаптированное™ и типом адаптационной реакции на введение препаратов высокотревожным животным в условиях стрессорного воздействия (п=8-15)._

МОЛОДЫЕ СТАРЫЕ

Условия ЮО Ш1 Л ся Лимфоциты, % Условия Ш0 ЯП Л СЯ Лимфоциты, %

НКТ + Гипокинезия 0,28 0,49 <45 Вилон +Гипокииезия 0,44 1,38 45-60

1 с после ВИЛОН+ гипокинезия

1 с после НКТ+ Гипокинезия гве + Гипокинезия 0,40 1,88

ЭпиталамшИ-гипокинезия - 1,21 45-60 1 с после ГВС+ Гипокинезия

КТ + Гипокинезия 0,39 2,67 Эпиталам ин+ Гипокинезия 0,82 7,87 60-77

1 сутки после КТ+ гипокинезия Сутки после эпиталамин + гипокинезия

ДСИП+ Гипокинезия 0,50 2,69 60-75 Эпиталон +Гипокинезия 0,68 2,53

1 сутки после ДСИП+Гипокинезия 1 с после этп'аЛ011+ гипокинезия

Эпиталон +Гипокинезия 0,70 2,76 Вилон+ гипоксия - 5,28

1 с после эпиталош-Гипокинезия Эпиталамин+ Плавание 0,97 12,90

Кортаген + Гипокинезия 0,78 5,23 Эпиталон+ гипоксия - 2,26

1 с после кортаген + Гипокинезия Кортаген+ Гипокинезия 0,57 14,3 >77

Пирацетам + гипокинезия 0,81 3,81 1 с после кортаген+ Гппокинеэия

1 сутки после пирацетам+ Гипокинезня Пирацетам+ Гипокинезия 0,34 13,90

Эпиталамин+ Плавание 3,68 6,71 75-80 1 с после пирааетам + гипокинезия

ГВС+Плавание 11,23 4,57 КТ+ Гипокинезия 0,11 21,40

Вилон + гипокинезия 1,06 5,28

1 с после вилон+ Гипокинезия НКТ+ Гипокинезия 0,23 7,28

Г'ВС+ Гипокинезия 8,90 ДСИ11 + Гипокинезия 0,13 8,60

Пирацетам+ гипоксия 11,56 >80 1 с после ДСИП+ гипокинезия

ГВС+Г1лавание 1,23 12,20

МОЛОДЫЕ, кровь при гипокинезии

МОЛОДЫЕ, мозг при гипокинезии

-вт -СПА

» СОД, эритроциты

-МДА

-сод

СТАРЫЕ, кровь при гипокинезии

СТАРЫЕ, мозг при гипокинезии

-ЦП

]

-МДА

- СОД — — каталаза

МОЛОДЫЕ, кровь при плавании

МОЛОДЫЕ, мозг при плавании

швэг

ОСПА

ИЗ МДА

□ СОД

Эпигаламин

ГВС

Эпиталамин

ГВС

Рис.10. Влияние препаратов на интенсивность СРО при стрессорных воздействиях. По шкале абсцисс расположены препараты в порядке усиления поведенческих проявлений тревожности при введении интаткным животным. По шкале ординат- % изменений к уровню при стрессе, *-р<0,05

Пептиды, создававшие оптимальный уровень ситуативной тревожности, не только препятствовали стресс-индуцированному повышению количества пробуждений и перераспределению двигательной активности и сна между дневным и ночным временем суток у животных обеих возрастных групп, но и способствовали приближению характера динамики состояния и поведения высокотревожных крыс через сутки после окончания стрессорного воздействия к таковому у низкотревожных особей. Это позволяет говорить о пептидной ритмоорганизующей регуляции адаптационных реакций организма.

Эффект остальных исследованных пептидов с анксиолитической активностью был выражен слабее, а чрезмерное снижение поведенческих проявлений тревожности сопровождалось значительным ингибированием СРО и переходом к менее эффективной адаптационной реакции тренировки. Однако способность замедлять стресс-индуцированное увеличение скорости старения (судя по количеству аберраций хромосом, влиянию на фагоцитарную активность лейкоцитов и интенсивность процессов СРО) указывает не только на стресспротекторные, но и на геропротекторные свойства изученных пептидов с анксиолитической активностью, поскольку согласно теории соматических мутаций старение является результатом взаимодействия эндогенных и экзогенных повреждающих агентов (в т.ч. АФК) с генетическим материалом клетки и накопления случайных мутаций в геноме соматических клеток [Розенфельд C.B., 2001].

Если в результате введения пептидов поведенческие проявления ситуативной тревожности не изменялись и даже усиливались, происходило следующее:

• Повышение резистентности организма при использовании НКТ и ГВС-111 (у старых животных), а также киоторфина и пирацетама у крыс обеих возрастных групп достигается при гораздо более выраженных сдвигах метаболизма и циркадианной ритмики поведения, степень которых граничит с изменениями, наблюдаемыми при стрессе или при запредельпом торможении. Учитывая низкую функциональную активность антиокислительных систем крыс с высоким уровнем тревожности, необходимо иметь в виду, что максимальное среди исследованных препаратов усиление образования свободнорадикальных продуктов ПОЛ при введении НКТ и пирацетама «эмоциональным» крысам может привести к истощению мощности их защитных систем и срыву адаптационных процессов. Действительно, при инъекции НКТ молодым крысам перед началом гипокинезии использование препарата не предотвращало развитие эозинофилии в сочетании с лимфопенией, что является признаком перехода к стадии истощения.

Сопоставление изученных показателей позволило сделать заключение, что чрезмерное снижение ситуативной тревожности (при использовании эпиталамина у молодых крыс перед началом гипокинезии и плавания) также как и чрезмерное ее повышение (в результате использования НКТ и пирацетама) отрицательно влияет на адаптационные возможности в связи с чем сохраняется и усугубляется стресс-индуцированная дезорганизация циркадианной ритмики поведения и усиление мутационного процесса.

Следовательно, полученные результаты являются подтверждением того, что для каждого возраста существует оптимальный диапазон ситуативной тревожности, в котором происходит выбор наилучшей для данной ситуации адаптационной стратегии и этот диапазон различается у особей с различными индивидуально-типологическими особенностями поведения (генетически детерминированный высокий и низкий уровень тревожности). Важно отметить, что благодаря правильному подбору пептидного биорегуолятора данному диапазону ситуативной тревожности соответствует и определенный оптимальный баланс между интенсивностью про- и антиоксидантных процессов. Это дает возможность АФК выполнять свои функции без окислительного повреждения тканей и органов и участвовать в оптимизации ответных реакций организма на внешние воздействия и выгодно отличает изученные пептиды с анксиолитической активностью от непептидных препаратов, в частности, пирацетама.

В оптимизации адаптационной стратегии на фоне введения изученных препаратов, помимо изменения интенсивности про- и антиоксидантных реакций участвуют процессы центральной регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси через поддержание такого баланса моноаминов, который обеспечивает оптимальную активацию «стресс-лимитирующих» систем (не позволяя реакции перейти как в сверхактивацию и стресс, так и в запредельное торможение). Так, например, продолжительность пищевого поведения отрицательно коррелировала с содержанием ДА в гипоталамусе. Обнаружена и прямая корреляция между продолжительностью 112, КЗ и накоплением гистамина в таламической области головного мозга. Сдвиг баланса моноаминов мозга в сторону увеличения соотношения НА/Сер способствовал формированию адаптационной реакции активации и увеличению продолжительности «активного» бодрствования в структуре поведения. Уровень МДА, светосуммы и быстрой вспышки ХЛ в плазме крови изменялась однонаправлено с К2, Кб, К7 и в обратном направлении с Ю, К8, а активность СОД в коре головного мозга и гемолизате эритроцитов, напротив, изменялась однонаправленно с 1^1, К8 и противоположно с К2, Кб, К7.

Редукция пищевого поведения у интактных крыс подтверждает наличие геропротекторных свойств эпиталамина, вилона, кортагена и

эпиталона, поскольку известно, что ограничение калорийности питания способствует уменьшению скорости старения и увеличению средней продолжительности жизни [Мавого Е., 2000]. При использовании пирацетама (в обеих возрастных группах), ДСИП и ГВС-111 (у молодых особей) для увеличения адаптационного потенциала высокотревожных животных потребление пищи увеличивалось, что может способствовать накоплению избыточной массы тела, особенно опасному в пожилом и старческом возрасте. Нежелательность избыточного снижения ситуативной тревожности при использовании пептидных препаратов доказывает и обнаруженное нами усиление продолжительности сна в дневной и ночной период, что не только ухудшает адаптационные возможности, но и небезопасно для организма.

Пептиды, проявляющие анксиолитическую или анксиогенную активность, могут оказаться перспективными фармакологическими средствами, оптимизирующими физическую и умственную деятельность человека. В этом направлении нами было проведено исследование по использованию аналога тетрапептида эпиталона (в виде биологически активной добавки к пище) с целью упреждающей коррекции метаболических и функциональных нарушений при интенсивной физической нагрузке у спортсменов. Оказалось, что эффективность эпиталона как средства, повышающего спортивную работоспособность и снижающего степень утомления, была значительно выше у испытуемых с высоким уровнем тревожности по сравнению с низкотревожными (оценка личностной тревожности проводилась с использованием теста Спилбергера-Ханина).

Известно, что адаптационные возможности организма с возрастом снижаются, а неблагоприятные эколого-профессиональные внешние воздействия приобретают хронический характер. Часто повторяющиеся стрессовые ситуации способствуют развитию признаков преждевременного старения, которые (как показали наши данные) более выражены у индивидов с высоким уровнем тревожности. В связи с этим новым подходом к решению проблемы профилактики ускоренного старения может стать разработка пептидных биорегуляторов для получения контролируемого уровня тревожности у особей с различными индивидуально-типологическими особенностями. Возможно, такой подход позволит управлять эффективностью адаптации и чувствительностью человека и животных к внешним воздействиям и фармакологическим препаратам в зависимости от меняющегося с возрастом уровня тревожности.

выводы

1. Выбор организмом адаптационной стратегии в ответ на экстремальное воздействие зависит от генетически детерминированного уровня тревожности: в условиях 24-часовой гипокинезии у высокотревожных крыс развивается реакция стресса, а у низкотревожных — менее энергозатратная реакция повышенной активации.

2. Гипокинезия по силе негативного влияния на процесс старения превосходит стрессорную физическую нагрузку и гипоксию, что выражается в более существенной иммунодепрессии и дезорганизации циркадианных ритмов поведения при более значительном увеличении частоты хромосомных аберраций и накоплении продуктов СРО.

3. С помощью введения пептидов (показано на примере НКТ и ГВС-111) можно изменить адаптационную стратегию организма как в худшую, так и в лучшую сторону, причем высокотревожные особи обладают большей чувствительностью к такому воздействию.

4. Развитие состояния «преадаптации» в нормальных физиологических условиях и замена стресс-реакции при экстремальных воздействиях на более эффективную и экономичную возможны, если вводить животным пептидный препарат с таким анксиолитическим (у высокотревожных) или анксиогенным (у низкотревожных) эффектом, который обеспечивает сдвиг ситуативной тревожности в оптимальный для каждого возраста интервал, предопределяющий выбор наилучшей для данной ситуации адаптационной стратегии.

5. Преадаптивный и стресс-протекторный эффект (при гипокинезии, гипоксии и физической нагрузке) у высокотревожных животных наблюдался при введении пептидов с анксиолитическим действием и был максимальным в случае вилона и ГВС-111 у молодых крыс, а эпиталона и эпиталамина — у старых. Величина данного эффекта соответствовала способности этих пептидов у молодых оказывать стабилизирующее влияние на состояние эритроцитарных и лейкоцитарных мембран (о чем можно судить по величине ВЭГ и СПА), у старых - влиянию на уровень МДА и активность церулоплазмина. Это позволяет использовать указанные показатели в качестве критериев эффективности и направленности действия пептидов.

6. Составной частью стресс-протекторного действия исследованных пептидных препаратов является антимутагенный и иммуностимулирующий эффекты, что подтверждает целесообразность их использования в качестве геропротекторов.

7. Эффекты пептидов, влияющих на уровень ситуативной тревожности, во многом определяются их участием в механизмах нейрогуморальной регуляции защитных функций организма через модулирующее воздействие на соотношение биогенных аминов в головном мозге и плазме крови. Это свидетельствует о влиянии препаратов на центральные и периферические механизмы развития адаптационных и воспалительных реакций. Все короткие пептиды и пирацетам после инъекции крысам разного возраста вызывали изменения уровня серотонина и гистамина крови - важнейших вазоактивных веществ, относящихся к системе регуляции микроциркуляции.

8. Управление поведением в нормальных и экстремальных условиях возможно на основе пептидной ритмоорганизщующей регуляции адаптационных реакций, проявляющейся в способности пептидов препятствовать стресс-индуцированной инверсии цикла «активность-покой» у животных обеих возрастных групп и снижать вероятность десинхронизации циркадианной ритмики поведения, развивающейся в процессе старения.

9. Полученные результаты позволяют рассматривать ДСИП, эпиталамин, ГВС-111, вилон, эпиталон и кортаген в качестве перспективных препаратов для управления эффективностью адаптации и темпами старения индивидов с высоким уровнем тревожности в условиях экстремальных воздействий, тогда как использование НКТ и гшрацетама, широко применяемого в настоящее время в клинике, в этих случаях нежелательно. Это особенно важно учитывать в гериатрической практике, так как старение сопровождается повышением уровня тревожности и предрасположенности к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для решения вопроса об эффективности и возможных последствиях применения биологически активных пептидов и не пептидных препаратов в условиях неблагоприятных внешних воздействий мы предлагаем следующий алгоритм:

- испытать эффект препарата на поведение животных в «открытом поле», уделяя особое внимание поведенческим проявлениям тревожности и интенсивности потребления пищи (особенно важно у старых особей);

- исследовать влияние препарата на уровень хромосомных аберраций в костном мозге (особенно важно у молодых особей);

- протестировать влияние препарата на интенсивность реакций СРО, учитывая выявленные возрастные особенности.

2. При использовании пептидных препаратов в качестве фармакологических средств, обладающих антистрессорным действием, необходимо учитывать уровень личностной тревожности пациентов, что позволит прогнозировать последствия и эффективность их применения в клинике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Адаптивные возможности крыс разного возраста в условиях гипокинезии/ A.B. Лысенко, Г.В. Карантыш, C.B. Демьяненко, A.M. Менджерицкий //Матер. XVIII съезда физиологов России, Казань,- 2001. - С. 77.

2. Алъперович Д.В. Мембраноспецифичный механизм протекторного действия ДСИП и пирацетама при гипоксии/ Д.В. Альперович, A.B. Лысенко, A.M. Менджерицкий // Всерос. конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва, 2-4 декабря 1997,- С. 5.

3. Альперович Д.В. Перспективы использования ДСИП для коррекции сдвигов в системе перекисного окисления липидов при гипокинезии/ Д.В. Альперович, A.B. Лысенко, И.И. Михалева // В сб.: «Биоантиоксидант: материалы международного симпозиума Медицина и охрана здоровья», Тюмень, 1997,-С.181-183.

4. Взаимосвязь интенсивности ПОЛ и поведения у крыс разного возраста при введении пептидов/А.В. Лысенко, A.M. Менджерицкий, H.A. Краснова, Н.К. Елфимова // Известия Вузов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Спецвыпуск- 2005.- С. 34-41.

5. Возрастные особенности влияния физической нагрузки па развитие адаптационных реакций крыс с высоким уровнем тревожности/ A.B. Лысенко, Р.Г. Шейхова, Т.Н. Рудснко, Е.В. Моргуль, Л.Г. Менджерицкая// Известия Вузов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Приложение.- 2005,-С. 30-39

6. Действие пирацетама на интенсивность свободнорадикальных процессов как механизм реализации антимутагенного и антистрессорного эффекта/ A.B. Лысенко, A.M. Менджерицкий, Л.Г. Менджерицкая, Л.В. Фатеева, C.B. Демьяненко, Т.Н. Руденко//Нейрохимия,- 2003,- Т.20, №2,- С. 127-132.

7. Дипептидный ноотроп ГВС-111 предотвращает накопление продуктов перекисного окисления липидов при иммобилизации/ Р.У. Островская, Т.И. Гудашева, A.B. Лысенко, H.H. Ускова// Экспериментальная и клиническая фармакология,- 1997,-№ 5,- С. 15-18.

8. Коррекция ДСИПом интенсивности ПОЛ в тканях крыс при плавании/А.В. Лысенко, Д.В. Альперович, В.И. Бондин, A.M. Менджерицкий// V Межд. конф. «Биоантиоксидант»,-1998.-С. 105-106.

9. Лысенко A.B. Аргументы «за» использование биологически активных пептидов в практике спортивной фармакологии//Теория и практика физической культуры,- 2004,- №10.- С. 25-28.

10. Лысенко A.B. Влияние ДСИП на проницаемость лизосомальных мембран в опытах in vitro/A.B. Лысенко, A.M. Менджерицкий // Известия СЮ1ЦВШ,-1994,-№3,- С. 66-68.

11. Лысенко A.B. Применение пептидов для коррекции нарушений в системе крови при стрессе/ A.B. Лысенко, H.A. Краснова, A.M. Менджерицкий// Наука и образование.- 2003, №2.- С. 253-257.

12. Лысенко A.B. Свойства и механизмы реализации биологических эффектов пептида, индуцирующего дельта-сон / A.B. Лысенко, A.M. Менджерицкий // Успехи современной биологии,- 1995.-№ 6,- С. 729-739.

13. Лысенко A.B. Участие моноамкнов в изменении представленности основных форм поведения крыс разного возраста при гипокинезии/ A.B. Лысенко, Г.В. Карантыш, A.M. Менджерицкий// Нейрохимия.- 2001.- Т.18.- №2,- С.132-141.

14. Лысенко A.B. Пептидная регуляция адаптации организма к стрессорным воздействиям/ A.B. Лысенко, A.B. Арутюпяп, Л.С. Козина. - С.Пб : ВМедА, 2005. -207 с.

15. Межсистемные закономерности адаптивной саморегуляции состояния и поведения организма к изменениям внешней среды/ A.B. Лысенко, Е.В. Вербицкий, A.M. Менджерицкий, И.А. Чигринов// Матер. XVII Всерос. Физиологического съезда. - Ростов-на-Дону, 1998,- С. 359.

16. Менджерицкий А.М. Протеолитические процессы в мозге и сыворотке крови крыс при гипокинезии и адаптивном влиянии ДСИП / A.M. Менджерицкий, A.B. Лысенко, Н.И. Ускова// Биохимия,- 1995,- № 4,- С. 585-592

17. Механизмы антистрессорных и геропротекторных эффектов нейропептидов/ A.B. Лысенко, Л.В. Фатеева, Е.В. Моргуль, H.H. Килинкарова// Наука и образование,- 2002,- №3.- С. 183-196.

18. Некоторые биохимические механизмы нейропротекторного эффекта ДСИП при гипоксии/ Д.В. Альперович, A.B. Лысенко, А.Э. Мационис, Л.Г. Менджерицкий // Hypoxia Medical J.- 1997.- № 4 - С. 3 - 7.

19. Нейромедиаторы в механизмах развития адаптивного поведения при введении ГВС-111 /A.B. Лысенко, A.M. Менджерицкий, Н.К. Елфимова, Р.У. Островская.// Нейрохимия,- 2004,- Т. 21, № 2.- С. 13 8-146.

20. Нейромедиаторные механизмы адаптивного действия ДСИП при экспериментальной аудиогенной эпилепсии, вызванной гипокинезией/ A.M. Менджерицкий, A.B. Лысенко, Н.И. Ускова, Ю.В. Ревииский// Экспериментальная и клиническая фармакология.- 1996.- № 1.- С. 8-10.

21. Нейрохимические механизмы влияния киоторфина на развитие адаптационных реакций крыс с высоким уровнем тревожности/А.В. Лысенко, И.И. Михалева, A.M. Менджерицкий, Г.Л Волошина// Нейрохимия.- 2004,Т. 21, №3,- С. 217-224.

22. Нейропептиды и формирование поведения в цикле бодрствование-сон/ A.B. Лысенко, Е.В. Вербицкий, Н.Ф. Колнакова, Н.И.// XXX совещание по пробл. ВНД, Санкт-Петербург, 2000. - С. 661-662.

23. Особенности метаболического обеспечения адаптогенных эффектов ДСИП и пирацетама при гипероксии /A.B. Лысенко, Н.И. Ускова, Д.В. Альперович, A.M. Менджерицкий// Биохимия,- 1999,- Т.64 - № 6. - С. 62-69.

24. Оценка степени функционально-метаболических сдвигов в организме спортсменов-пловцов по показателям кислотно-щелочного равновесия слюны/ A.B. Лысенко, Д.В. Альперович, В.И. Бондин, Н.И. Ускова,// Валеология.-1998,- №2,- С. 28-31.

25. Преадаптация организма к действию неблагоприятных факторов путем введения эндогенного адаптогена - ДСИП/А.В. Лысенко, Д.В. Альперович, A.M.Менджерицкий,И.И. Михалева//Нейрохимия- 1999.- Т.16.- № 1 - С. 2936.

26. Применение пептидов для коррекции структурно-функциональных нарушений при гипокинезии/ A.B. Лысенко, H.H. Килинкарова, Л.В. Фатеева, Т.Н. Руденко, A.M. Менджерицкий// Нейрохимия,- 2003,- Т.20, №3,- С. 218227.

27. Процессы перекисного окисления липидов в коре больших полушарий головного мозга и плазме крови молодых крыс с высоким уровнем тревожности при эмоциональном стрессе: защитный эффект ноотроппого дипептида ГВС-111/А.В. Лысенко, С.В. Демьяненко, В.Н. Прокофьев, Р.У. Островская, A.M. Менджерицкий// Нейрохимия,- 2003,- Т.20, №4,- С. 281-286.

28. Роль протеолитических ферментов в механизме действия ДСИП в норме и в условиях гипокинезии/ A.M. Менджерицкий, А.В. Лысенко, Н.И. Ускова, А.Э. Мационис// Нейрохимия,- 1996.- № 1,- С. 23-31.

29. Совместное действие ДСИП и пирацетама на интенсивность перекисного окисления липидов в различных типах мембран головного мозга крыс при гипоксии/ A.M. Менджерицкий, А.В. Лысенко, Н.И. Ускова, А.Э. Мационис, Е.А. Самецкий, Л.Г. Менджерицкая // Нейрохимия,- 1995.-№1,- С. 58-63.

30. Соотношение нейромедиаторных аминокислот при сравнительном анализе стресспротекторных эффектов ДСИП и пирацетама/ A.M. Менджерицкий, А.В. Лысенко, Н.И. Ускова, А.Э. Мационис, Е.А. Самецкий// Вопр. мед химии,- 1995,-№5,- С. 16-19.

31. Сравнительное изучение эффективности применения ДСИП для коррекции функционально-метаболических сдвигов в условиях гипоксии н физической нагрузки/А.В. Лысенко, Д.В. Альперович, Н.И. Ускова, И.И. Михалева, Л.Г. Менджерицкая // Нейрохимия,- 1999.-Т. 16, N 1.- С. 37-44.

32. Старение организма - механизмы и коррекция/А.В. Лысенко, Л.В. Фатеева, Е.В. Моргуль, Н.Н. Килинкарова// Наука и образование,- 2002,- №3,-

C. 177-183.

33. Цитомедины и их роль в регуляции физиологических функций организма в онтогенсзс/А.В. Лысенко, Н.А. Краснова, Т.Н. Рудснко, Л.Г. Менджерицкая // Наука и образование,- 2003,- №2. - С. 247-252.

34. A comparative investigation of the behavioral effects of DSIP and neokiotorphin/ A.V. Lysenko, D.V. Alperovich, E.V. Verbitzky, N.F. Kolpakova, I.A. Topchiy.// 3d ENA Congress, Berlin-European J of Neuroscience- 1998,- V.10, Suppt. 10,- P. 424.

35. DSIP and neokiotorphin influence on body temperature and rat brain monoaminergic system under hypothermia and autowarming/ A.V. Lysenko,

D.V. Alperovich, I.Y. Pavlov, A.M Mendzeritsky. // Abstr. Of 12th ESN Meeting.-J. of Neurochemistry 1998,- V. 71,- Suppl 1.- P. S 47.

36. DSIP as a high-effective neuroprotector/N. Uskova., A. Mendzeritsky, I. Mikhaleva, A. Lysenko//Acta Biologiae et Medicinae Experimentalis.- 1996.-V.21.-N 1,- P. 46.

37. DSIP influence on the rat sleep-wakefulness cycle under extreme conditions/ N. Uskova, A. Mendzeritsky., A. Lysenko, E. Sametsky// Sleep Research.- 1995,-V.24A.- P. 416.

38. DSIP regulate neuronal plasticity in brain cortex of stressed rats/ A. Lysenko, P. Povilaitite, A. Matsionis, A. Mendzeritsky// Folia Anatomica.- 1996,- V.24.-Suppl.2.- P. 81.

39. Lysenko A. Neuropeptide and nootropic drugs regulation of synaptic plasticity/A. Lysenko, I. Pavlov, A. Matsionis Abstr. 8 International congress of the Czech and Slovak neurochemical society.- Martin, Slovakia, 1996.- P. 30.

40. Lysenko A. The role of DSIP in calpain activity regulation under hypoxia/A. Lysenko, A. Mendzeritsky, A Matsionis// In: «Neurochemistry: Cellular, Molecular and Clinical Aspects». - Eds. Teelken and Korf.- Plenum Press, 1997.- P. 419-422.

41. Mendzeritsky A. DSIP protective effect under hypokinetic conditions/A. Mendzeritsky, A Matsionis, A Lysenko. //Abs of 11th ESN Meeting, Groningen.- J. Neurochem.- V. 66, Suppl. 2.- 1996,- S.81

42. Mendzeritsky A. Role of DSIP in neural plasticity processes under hypoxia / A. Mendzeritsky., A. Lysenko, E. Sametsky //Proceedings of 2d ENA Congress, Strasbourg.- European J of Neuroscience.- 1996.- Suppl.9.- P. 35.

43. Mendzeritsky A. Study of proteolytic processes role in mechanism of biological action of DSIP//A. Mendzeritsky, N. Uskova, A. Lysenko// Symp dedicated Bechtereva's 70 anniver «Physiological and biochemical basis of brain activity».-S-Petersburg. -1994,- P.54.

44. Neurophysiology of relationships between the sleep-wakefulness cycle and the behaviour of the organism/ E.Verbitzky, I. ChigrinovJ. Topchiy, N. Kolpakova, A. Lysenko, A. Mendzeritsky// Abstr. of 10 Annual Meeting of American Sleep Research Society - Washington, 1996,- P.235.

45. The correction of exercise-induced metabolic disorders with DSIP in rats/ A.V. Lysenko, D.V. Alperovich, N.I. Uskova, L.G. Mendzeritskaya // Abstr. Of 12 th ESN Meeting. - J. of Neurochemistry-1998 - V.71. - Suppl. 1.- P. S 46.

46. The influence of the immobilization on old and young rats behavior / A.V. Lysenko, A.M. Mendzeritsky, N.I. Uskova, G.V Karantysh. A.V. Lysenko, A.M. Mendzeritsky, N.I., Uskova G.V Karantysh.// EJN - 2000.- V. 12, Suppl. 1.- P.48.

47. The influence of kyotorphin on lipid peroxidation in brain and blood of different age rats in hypokinesia conditions/Lysenko A., Mendzeritsky A., Karantysh G // Advances in Gerontology.- 2001.- V.6- P.61.

48. The neurophysiological aspects of relationships between behaviour and the peptide influence on sleep-wakefulness cycle / A.V., Lysenko E.V. Verbitsky, N.F. Kolpakova, I.A. Topchy, N.I. Uskova, D.V. Alperovich, A.M. , Mendzeritsky// In: Basic and clinical aspects of the theory of functional systems.- Eds. Lazetic, Sudakov, Novi Sad, 1998,- P.133-139.

49. The neuropeptidal influence on structural-functional changes in rat brain cortex under hypothermia/ A.V. Lysenko, D.V. Alperovich, I.Y Pavlov., P.E. Povilaitite, A.E., Matsionis N.I Uskova., A.M Mendzeritsky// In: Basic and clinical aspects of the theory of functional systems.- Eds. Lazetic and Sudakov, Novi Sad, 1998.-P.287-295.

50. The protective effect of DSIP under hypokinetic conditions/ A. Mendzeritsky, N. Uskova, A. Matsionis, P. Povilaitite, A. Lysenko// In: «Neurochemistry: Cellular, Molecular and Clinical Aspects».- Eds. Teelken and Korf.- Plenum Press, 1997.-P.419-422.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А — адреналин

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

ВЭГ- внеэритроцитарный гемоглобин

ГГАК — гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная ось

ДА — дофамин

ДК — диеновые конъюгаты

ДСИП — дельта-сои индуцирующий пептид

КТ - киоторфия

Л/СЯ - соотношение лимфоциты/сегментоядерные нейтрофилы

МДА - малоновый диальдегид

НА - порадреналин

НКТ - неокиоторфин

ПОЛ- перекисное окисление липидов

Сер- серотонин

СОД - суиероксиддисмутаза

СПА- суммарная пероксидазиая активность

СРО- свободнорадикальное окисление

ХЛ-хемилюминисценц[1Я

ЦП- церулоплазмин

ШО - шиффовы основания

Ш -поведенческий сон

1*2 - горизонтальная локомоторная активность КЗ - вертикальная локомоторная активность К4 - потребление воды

- пищевое поведение Кб - мелкая двигательная активность И7 — груминг

И8 — релаксированное бодрствование

К9 - активное бодрствование (К2+КЗ+К4+К5+1*6+К7)

ШО — целенаправленное поведение (локомоции, потребление воды и пищи) М1- нецеленаправленное поведение (Я6+Я7) Н - высота быстрой вспышки ХЛ Б т - светосумма ХЛ Лысенко А.В. Возрастные особенности влияния пептидов на адаптацию организма к экстремальным воздействиям // Автореф.....док. биол.. наук: 14.00.53 - СПб., 2006. - 40 с.

Подписано в печать 01.11.2006. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 2,0.

_Тираж 150 экз. Заказ ._

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ «ЛЭТИ» Издательство СПбГЭТУ «ЛЭТИ» 197376, С.-Петербург, ул. Проф. Попова, 5

Введение.

Глава 1. Масс-спектрометрическое определение состава природных и техногенных образцов в масштабе реального времени.

Ы.Основные способы, используемые для in-situ, on-line мониторинга.

1.2.Применение масс-спектрометрии.

1.2.1 .Гибридные методы.

1.2.2.Тенденции развития. ф 1.3. Масс-спектрометрические системы для in-situ, on-line анализа.

1.3.1 .Масс-анализаторы.

1.3.2. Ионные источники.

1.3.3.Устройства ввода и экстракция исследуемых компонентов из пробы.

1.3.4. Системы регистрации.

1.4. In-situ, on-line мониторинг, требования к портативной аппаратуре.

1.4.1.Масс-энергоанализаторы для исследования ионов космической и лабораторной плазмы.

1.4.2.Приборы для экологического мониторинга и контроля технологических процессов в промышленности.

1.5.Выводы первой главы.

Глава 2. Ионная оптика портативных масс-спектрометров.

2.1. Масс-спектрометры для прямого масс- и энерго- анализа ионов в потоковых структурах.

2.1.1.Статические масс-спектрометры с несмещенными магнитным и электрическим полями. а. анализаторы призменного типа:

-масс-энергоанализатор с большой площадью входного окна, полученной за счет общей независимой координаты электростатических и магнитной линз.

-масс-энергоанализатор с возможностью проведения масс-анализа ионов вне зависимости от исходной энергии. б. анализаторы секторного типа:

-масс-энергоанализатор с двойной фокусировкой по углу и по энергии и осесимметричной функцией пропускания.

-масс-энергоанализатор с фокусировкой по комбинации параметров: угол-энергия.

2.1.2. Динамический времяпролетный масс-энергоанализатор.

2.2.Секторные магнитные масс-спектрометры со скрещенными магнитным и электрическим полями (для изучения состава газообразных, жидких или твердых образцов).

2.2.1.с радиальными границами однородного поля.

2.2.2. со скошенной выходной границей однородного поля.

2.2.3.С криволинейной выходной границей магнитного поля.

2.3 .Выводы второй главы.

Глава 3. Введение пробы в масс-спектрометр.

3.1 Системы ввода газообразных и жидких проб.

3.1.1 Ввод пробы через отверстие в диафрагме.

3.1.2 Мембранные системы ввода. а)Мембранный ввод, его возможности и особенности. Одиночная мембрана. б) Ввод пробы левеллиновского типа. в)Циклический нестационарный режим введения пробы в масс-спектрометр через многомембранную систему.

3.1.3 Струйная система ввода.

3.2.Ввод потока заряженных частиц в энерго- и масс-анализаторы в плазменных исследованиях. Электростатический фильтр.

3.3.Выводы третьей главы.

Глава 4. Определение состава потоков заряженных частиц в режиме реального времени.

4.1. Масс-энергоанализатор в эксперименте по исследованию солнечного ветра в программе «ИНТЕРШОК».

4.2. Применение портативного масс-энергоанализатора призменного типа для исследования элементного и зарядового состава частиц в потоке лазерной плазмы.

4.3.Выводы четвертой главы.

Глава 5. Портативные приборы для мониторинга газов и летучих веществ в режиме реального времени в экологии, геофизике и при технологическом контроле.

5.1. Масс-спектрометры для определения состава газов и летучих веществ в пробах газа. Их применение.

5.1.1 Экологический контроль.

5.1.2. Геофизические исследования и технологический контроль.

5.2. Приборы для определения растворенных в воде газов и летучих органических веществ. Их применение в экологии.

5.3.Выводы пятой главы.

Глава 6. Мобильный масс-спектрометр для определения солей # металлов в морской воде. Ионно-оптическая схема. Численное моделирование и экспериментальная проверка.

6.1. Система ввода и экстракции пробы. Ионный источник.

6.2. Масс-анализатор.

6.3. Система детектирования.

6.4. Обсуждение результатов расчета и эксперимента.

6.5. Выводы шестой главы.

Основные результаты работы.

Актуальность темы диссертации. Задача определения состава веществ является ключевой как для фундаментальной и прикладной науки, так и для большинства высокотехнологичных производств. Причем, понятие "состав", в зависимости от конкретной задачи, означает химический, элементный, изотопный или зарядовый состав частиц: ядер, ионов, атомов и/или молекул, ансамбли которых и являются предметом изучения в различных областях науки. Так состав частиц в межпланетном пространстве, увязанный с их потоковой структурой, содержит информацию о строении атмосферы Солнца и о процессах, протекающих в межпланетной плазме. Знание химического и изотопного состава компонентов окружающей среды и их вариаций позволяет успешно прогнозировать как глобальные, так и локальные климатические изменения. Сведения о химическом и изотопном составе продуктов биохимических процессов помогают решать вопросы диагностики и профилактики заболеваний, обнаруживать патологии в организме человека. Прогресс в области физики атмосферы и гидросферы, сейсмологии, гляциологии, а также в геофизических методах разведки полезных ископаемых зависит от возможности определения химического и изотопного состава веществ, связанных с изучаемыми явлениями.

Осуществление контроля технологических процессов в металлургии, газо-и нефтеперерабатывающей, топливной, машиностроительной и других отраслях промышленности тесно связано с необходимостью определения количественного состава вовлеченных в производство веществ и динамику их изменения, а также с определением состава продуктов и отходов производства.

При всем многообразии и существенности различий исследуемых веществ и контролируемых процессов, применение универсальных аналитических методов оказывается наиболее эффективным. Одним из них является масс-спектрометрия. Высокие точность и чувствительность масс-спектрометрической аппаратуры, стабильность и воспроизводимость результатов, возможность полной автоматизации процесса измерения дают большие преимущества этому способу по сравнению с другими при определении элементного, химического и изотопного состава веществ.

Важнейшей задачей физики, химии, экологии и ряда прикладных наук является количественное определение состава исследуемых проб в масштабе реального времени. Прежде всего, это относится к космическим исследованиям. Так при изучении атмосфер планет и межпланетной плазмы лишь прямые спутниковые эксперименты позволяют обеспечить полноту и точность получаемой информации. Прямые измерения часто оказываются единственно возможным источником информации при мониторинге состава проб в атмосфере и гидросфере Земли в случаях, когда перенос образца к стационарному прибору невозможен, или связан с разбавлением, загрязнением, протеканием химических реакций, а также при изучении изменяющихся во времени процессов. Значительная часть таких задач вышла на первый план в экологии, геофизике, геохимии, а также при проведении технологического контроля в промышленности. Для их решения необходимо создать масс-спектрометры, которые обладали бы высокой чувствительностью и, одновременно, отвечали ряду дополнительных требований: малые размеры и вес, малая потребляемая мощность, автономность работы при полной автоматизации процесса измерения, простота управления, высокая надежность, простота конструкции, невысокая стоимость.

Цель работы: Развитие нового направления приборостроения -малогабаритной масс-спектрометрии, заключающегося в разработке принципов построения малогабаритных масс-спектрометрических систем для определения химического, элементного, изотопного и ионного состава объектов в режиме • реального времени.

Для её достижения необходимо решить следующие проблемы:

1. Обосновать выбор типа масс-анализатора и его ионно-оптической схемы при создании портативных приборов для определения химического, элементного и/или изотопного состава образца, а для ионов - и сведения об их зарядовом составе. Выбор схемы и конструкции должен учитывать особенности объекта исследования и обеспечивать эффективное введение пробы в малогабаритный масс-спектрометр как в виде нейтральных частиц из различных фазовых состояний, так и в виде заряженных частиц, а также обеспечивать возможность проведения работы в жёстких условиях эксплуатации.

Разработать алгоритм расчета ионно-оптических схем.

2. Предложить пути кардинального снижения пределов определения и повышения точности измерений при изучении состава образцов портативными масс-спектрометрами.

3. В соответствии с предложенным алгоритмом провести расчет оптимальных ионно-оптических схем. Основываясь на этом расчете, построить и испытать приборы для:

- определения состава потоков заряженных частиц лабораторной и космической плазмы,

- экологического мониторинга летучих веществ и газов из воздушных и водных образцов.

Научная новизна. Следующие результаты получены впервые в настоящей диссертации.

1. Разработан алгоритм расчета малогабаритных магнитных масс-спектрометров высокой чувствительности для измерения состава лабораторной и космической плазмы.

2. Предложен и разработан алгоритм расчета малогабаритных магнитных масс-спектрометров секторного типа для быстрого анализа образцов сложного химического состава в экологических исследованиях и при контроле технологических процессов в промышленности.

3. Предложены и разработаны способы введения большой группы газов и летучих органических компонентов из воздушных и водных проб в масс-спектрометр через многомембранные системы, обеспечивающие обогащение проб целевыми соединениями до миллиона раз в режиме стационарного и нестационарного напуска.

4. Разработан уникальный полетный масс-спектрометр для прямого исследования солнечного ветра, с помощью которого впервые была получена информация о распределении тяжелых компонентов от гелия до железа внутри отдельных потоковых структур.

5. Разработаны и созданы первые в России малогабаритные автоматизированные масс-спектрометры для мониторинга токсичных соединений в режиме реального времени.

Научная и практическая значимость результатов работы

В соответствии с разработанным в диссертации алгоритмом создан портативный масс-спектрометр для анализа элементного и зарядового состава солнечного ветра в широком диапазоне измеряемых масс. В составе комплекса измерительной аппаратуры на спутнике "Прогноз-Ю-ИНТЕРКОСМОС" прибор позволил определять состав заряженных частиц в нестационарных потоках в межпланетном пространстве. В результате эксперимента, проведенного в рамках программы «ИНТЕРШОК», с его помощью впервые были уверенно зарегистрированы ионы элементов от гелия до железа включительно в потоках с различными характеристиками.

Разработаны малогабаритные секторные магнитные масс-спектрометры для изучения химического и элементного состава газообразных проб и растворенных в жидкостях веществ, обеспечивающие быстрый анализ сложных многокомпонентных # смесей в режиме реального времени. В соответствии с предложенным алгоритмом, созданы масс-спектрометры для анализа воздушных и водных образцов в экологических исследованиях, прошедшие испытания в России, в ФТИ им. А.Ф.Иоффе, и в США, в Constellation Technology Corporation, в 1996 и 1997 годах.

Приборы позволили проводить прямые измерения состава сложных газовых смесей в автоматическом режиме и в этом классе являлись одними из первых в мире. Опытные образцы испытаны при каротажных работах на буровых установках в Новом Уренгое и при проведении экологического контроля. Разработаны способы избирательного введения в масс-спектрометр большой группы летучих соединений и газов, прежде всего, ароматических углеводородов и их галогенпроизводных, а также нормальных алканов и других соединений из воздушных и водных проб. Оснащение малогабаритных приборов такими устройствами, позволило довести пределы определения по этим компонентам до уровня единиц мкг/кг, превзойдя по чувствительности зарубежные аналоги.

Положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1. Алгоритм расчета малогабаритных магнитных масс-спектрометров высокой чувствительности для определения состава ионов в потоках низкой плотности и обоснование выбора их параметров.

2. Разработка новой ионно-оптической схемы малогабаритного магнитного масс-спектрометра для быстрого анализа образцов сложного состава в режиме реального времени, алгоритм расчета её параметров.

3. Новые способы введения летучих органических компонентов и газов из газообразных и жидких сред в масс-спектрометр через многомембранную систему, обеспечивающие избирательное обогащение проб исследуемыми компонентами в миллион раз по сравнению с прямым вводом образца, как в дискретном, так и в непрерывном режимах измерения.

4. Разработка и испытание оригинальных систем ввода газообразных и жидких проб, оснащенных электрическими, тепловыми или механическими затворами и обеспечивающих автоматизированную подачу образца в малогабаритный масс-спектрометр.

5. Разработка высокочувствительного масс-спектрометра для исследования солнечного ветра в прямом космическом эксперименте на аппарате Прогноз-10. Результаты впервые выполненных измерений распределения тяжелых элементов до железа включительно внутри отдельных потоковых структур солнечного ветра. и

Разработка первых в России малогабаритных масс-спектрометров для определения состава воздушных проб и растворенных в воде компонентов, обеспечивающих чувствительность на уровне 1мкг/кг, более высокую, чем у современных зарубежных аналогов. Результаты испытаний.

Основные результаты работы;

1. Разработана ионно-оптическая схема и алгоритм расчета портативного статического масс-спектрометра высокой чувствительности для исследования потоков заряженных частиц с низкой плотностью и широкой функцией распределения. Схема позволила в десятки раз увеличить чувствительность прибора за счет разделения частиц по массе в пространстве скоростей, а не координат, как в традиционных анализаторах.

2. Получены аналитические соотношения, позволяющие формализовать алгоритм расчета статических портативных масс-спектрометров секторного типа с разнесенными электрическим и магнитным полями, конструкции которых позволяют определять состав пробы в широком диапазоне масс без сканирования. В схеме масс-спектрографа использована магнитная линза с малой величиной секторного угла, позволяющая за счет выбора оптимальной формы выходной границы, с одной стороны, обеспечить широкий динамический диапазон измерений, а с другой стороны, при малом весе и размерах, сохранить высокую разрешающую способность прибора.

3. Разработан высокочувствительный портативный масс-спектрометр для исследования состава нестационарных потоков солнечного ветра в программе «ИНТЕРШОК». Впервые получена информация о концентрации ионов от железа до гелия в отдельных потоковых структурах солнечного ветра, в прямом спутниковом эксперименте на аппарате «Прогноз-10».

4. Разработаны малогабаритные масс-спектрометры для анализа состава воздушных образцов и растворенных в воде веществ в экологических исследованиях и при технологическом контроле, превосходящие зарубежные аналоги по чувствительности и обеспечивающие пределы определения ~1 мкг/кг для большой группы летучих органических компонентов без предварительного обогащения.

5. Предложены и разработаны способы введения газов и летучих органических соединений из воздушных и водных проб в масс-спектрометр с помощью многомембранных систем ввода, в которых осуществляется: а) циклическое введение пробы и нестационарный режим перетекания её через последовательно расположенные, однотипные полидиметилсилоксановые мембраны, б) стационарный режим перетекания компонентов пробы через систему ввода, включающую как полидиметилсилоксановые мембраны, так и регулируемое отверстие в диафрагме.

Применение многомембранных систем обеспечивает обогащение пробы летучими компонентами до шести порядков величины по сравнению с прямым вводом, на примере н-алканов, ароматических углеводородов и их галогенопроизводных, и позволяет существенно снизить пределы определения анализатора и уменьшить доступ в вакуумную камеру основных малоинформативных компонентов пробы.

6. Предложены, разработаны и испытаны новые системы ввода образца диафрагменного, мембранного и струйного типов в портативный масс-спектрометр. Они позволяют автоматизировать дозировку потоков образца из

4 8 атмосферы в вакуумную камеру в широких пределах (10" -10") л-торр/с.

7. Рассчитан, разработан и испытан ионный источник, обеспечивающий высокую эффективность определения состава солей в водных растворах. Малогабаритный масс-спектрометр, оснащенный таким источником, позволяет обеспечить чувствительность определения солей тяжелых металлов в водных растворах на уровне десятков мкг/л.

1. Р .Драго. Физические методы в химии.: М. Мир. 1981. Т. 1. 423 с.

2. К. Хайвер. Высокоэффективная газовая хроматография.: М. Мир.1993. 288 с.

3. W.H. McFadden. Techniques in Combined Gas Chromatography/Mass Spectrometry: Application in Organic Analysis.: New York. Wiley Inter science. 1973.451 p.

4. R.E.Honig. Laser induced emission of electrons and positive ions from metals and semiconductors.// Appl. Phys. Lett., 1963,vol.3, p.8.

5. Г.А.Максимов, Н.В.Ларин. Масс-спектрометрический анализ твердых тел с помощью лазерного источника ионов. //Успехи химии. 1976, т.45, с.2121-2143.

6. В.С.Летохов, В.П.Чеботарев. Принципы нелинейной лазерной спектроскопии.: М. Наука, 1975. 279 с.

7. М.Е.Акопян, А.В.Головин, А.А.Родин. Фотоионизационная спектроскопия молекул. С.Петербург, Изд. С.Петербургского Университета, 1996, 316 с. 8.0.А.Быковский, В.Н.Неволин. Лазерная масс-спектрометрия. М, Энергоатомиздат, 1985, 128 с.

8. R. Knochenmuss, F.Dubois, M.J.Dale, R. Zenobi. The Matrix Suppression Effect and Ionization Mechanisms in MALDI.//Rap.Commun.Mass Spectr., 1996. v. 10, 871-877.

9. T. Katiaho, R.Frants et. al. Membrane Introduction Mass Spectrometry. //Analytical Chemistry, vol.63, N0.18. 1991, p.875-883

10. G.Hoch, B.Kok. A Mass Spectrometer Inlet System for Sampling Gases Dissolved in Liquid Systems. // B. Arch. Biochem. Biophys. 1963.V.101, p. 160-170.

11. J.S.Brodbelt, R.G.,Cooks, J.C.Tou, G. J.Kallos, M. D. Dryzga. In viva mass spectrometric determination of organic compounds in blood with a membrane probe.//Anal.Chem.l987, 59, 454-458.

12. P. M. Llewellyn, D.P. Littlejohn. US Patent, 3 429 105, 1969.

13. R.M.Caprioli. Continuous-flow fast atom bombardment mass spectrometry. //Anal. Chem. 1990.V. 62. P. 477 A 485 A.

14. E.R.Badmanand, R.G.Cooks. Miniature mass analyzers.//J.Mass Spectrom. 2000, 35,659-671.

15. G.Matz, W. Schroder, and T.Kotiaho. Mobile Mass Spectrometry used for On-site/In situ Environmental Measurements. Encyclopedia of Analytical Chemistry. //John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2000,.3783-3804.

16. Nier A.O. Mass Spectrometry in Planetary Research. // International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 1985. V.66. P.55-73.

17. Кельман B.M., Родникова И.В., Секунова JI.M. Статические масс-спектрометры. Алма-Ата : Наука. 1985. 263 С.

18. Mattauch J., Herzog R. Uber einen neuen Massenspectrographen.// Z.Phys. 1934. Bd.89. S.786-795.

19. F.A.White, G.M.Wood. Mass Spectrometry. Application in Science and Engineering. Willey and Suns. 1986, 860p.

20. Montaser, A. Inductively coupled plasma mass spectrometry. New York, Wiley. 1998.

21. M. Yamashita, J. B. Fenn, "Electrospray ion source. Another variation on the free-jet theme". // J. Phys. Chem., 1984, 88, 4451-4459.

22. С.Ф.Тимашев Физико-химия мембранных процессов.: М.Химия. 1988, 237 С.

23. Т. Шервуд, Р.Пигфорд, Ч.Уилки. Массопередача.: М. Химия. 1982.696 с.

24. Р.Берд, В.Стьюарт, Е. Лайтфут. Явления переноса. : М.Химия. 1974.688 с.

25. П.Кофстад. Отклонение от стехиометрии, диффузия и электропроводность в простых окислах металлов.: М.Мир.1975. 396 С.

26. A. A. Scheidemann, R. B. Darling, F. J. Schumacher, and A. Isakharov. //J. Vac. Sei. Tech. 2001, B, 1-32

27. M.P.Sinha, et al. // Int.J.Mass Spectr. 1998,176, 99.

28. A.O. Nier. // Intern.J. of Mass Spectr. and Ion Proc. 1985, 66, 55.

29. J.H. Hoffman, J. Hedgecock, T Neinaber, B. Cooper, C. Allen, D. Ming. Regolith Evolved Gas Analyzer for Asteroid Mineralogy Studies, Near-Earth Asteroid Sample Return Workshop, LPI, TX, December, 2000.

30. G.Matz, et al. A compact non-scanning magnet MS, for highly resolved analyses of gas mixtures. Proceedings of the 50th Pittsburg Conference, Orlando (USA), 621,1999.

31. A.Scheidemann, M.Sinha. Miniaturizing a Mattauch-Herzog Magnetic Sector Mass Spectrometer. Proceedings of the 3rd Workshop on Harsh-Environment Mass Spectrometry. Pasadena (USA), 85, 2002.

32. G.Gloecker, P.Bedini, L.A.Fisk et.al. Investigation of the composition of solar wind and interstellar matter using solar wind and pickup ion measurements with SWICS and SWIMS on the ACE spacecraft. Space Sei. Rev., preprint, 1999.

33. K.W.Ogilvie et.al. SWE, A comprehensive plasma instrument for the WIND spacecraft. //Space Sci.Rev., 1995, v.71, p.55.

34. P.Bochsler, H.Balsiger, R.Bodmer et.al. Limits of the efficiency of isotope fractionation processes in the solar wind derived from the magnesium isotopic composition as observed with the WIND/MASS experiment.// Phys.Chem. Earth, 1997, v.22,401-404.

35. M.B.Wise, C.V.Thompson. Evaluation of Direct Sampling Ion Trap Mass Spectrometry for In-Field Analysis of VOCs in Air, Water, and Soil. Proceeding of the 44th Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Portland, OR, May 12-16, 1996.

36. M.E.Cisper, L.E.Townsend, P.H.Hemberger et.al. Monitoring Airborne VOCs by Membrane Introduction Ion Trap Mass Spectrometry. Proceeding of the 42th Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Chicago, IL,May 29-June 3, 1994, p.287.

37. T.Kotiaho, M.J.Hayward, T.K.Choudhury et.al. Monitoring and Control of Bioprocesses Using Membrane Introduction Mass Spectrometry. Proceeding of the 39th Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Nashville TN, May 1924, 1991, 1065-1066.

38. P.R.Mahaffy, H.Niemann, D.Harold. Mass Spectrometrs in deep space missions. Proceedings of the 3rd Workshop on Harsh-Environment Mass Spectrometry, Pasadena (USA), 23-24, 2002.

39. A.Ottens, W.Harrison, T.Griffin, W.Helms. Quadrupole Ion Trap Mass Spectrometry for Space Shuttle Ground Support. Proceedings of the 3rd Workshop on Harsh-Environment Mass Spectrometry, Pasadena (USA), 25-26, 2002.

40. R.T.Short, D.Fries, G.Kibelka. Microfabrication of cylindrical ion trap mass spectrometer arrays. Proceedings of the 3rd Workshop on Harsh-Environment Mass Spectrometry, Pasadena (USA), 43-44,2002.

41. Л.С.Горн, Б.И.Хазанов. Спектрометрия ионизирующих излучений на космических аппаратах. М.: Атомиздат,1979,248 с.

42. J.S.Bame, J.P.Glore, D.J. Мс Comas et.al. The IPSM Solar Wind Plasma Experiment. //ESA Special Publication SP-1050,1983, p.49-73.

43. H.Moestue. The electric field and geometrical factor of an annular curved plate electrostatic analiser. //Rev.Sci.Instr., 1973, v.44, p.1709-1713.

44. G.L.Withbroe, J.L.Kohl, H.Weiser, R.H.Munro. Probing the solar wind acceleration region using spectroscopic techniques. //Space Sci.Rev. 1982.v.33, p. 1752.

45. О.Л.Вайсберг, Ю.И.Ермолаев, Г.Н.Застенкер, А.Н.Омельченко. Потоки тяжелых ионов в солнечном ветре и их использование для диагностики солнечной сороны. В кн.: Исследование солнечной активности и космическая система "Прогноз".//М.: Наука, 1984, с.73-80.

46. K.W.Ogilvie, N.Mc Iewraith, T.D.Wilkerson. Mass-Energy spectrometer for Space Plasmas. // Rev.Sci.Instr.,1968, v.39, p. 441-451.

47. K.W.Ogilvie, L.F.Burlaga, T.D.Wilkerson. Plasma observation on "Explorer-34". // J.Geophys. Res., 1968, v.73, p.6809-6824.

48. H.Balsiger, P.Eberhardt, J.Geiss et. al. A satellite borne ion mass spectrometer for the energy range 0 to 16 keV. // Space Sci.Instr., 1976, v.2, p.499-513.

49. E.G.Shelley, R.D.Sharp, R.G.Johnson et.al. Plasma composition experiment on ISEE-A. //IEEE Trans.Geosci.Electronics., 1978, v.GE-16, p.266-270.

50. J.Geiss, H.Balsiger, P.Eberhardt, et. al. Dynamics of Magnetospheric ion composition as observed by the GEOS mass spectrometer. // Space Sci.Rev., 1978, v.22, p.537-566.

51. G.Gloeckler, J.Geiss, H.Balsiger et.al. The ISPM Solar-Wind Plasma Experiment. //ESA Special Publication SP-1050,1983, p.77-103.

52. G.Gloeckler, L.A.Fisk, S.Hefti et.al. Unusual composition of the solar wind in the 2-3 May 1998 CME observed with SWICS on ACE. // Geophys.Res.Lett. 1999, v.26, 2, p. 157-160.

53. Х.Хора. Физика лазерной плазмы. М.: Энергоиздат. 1986. 272 с.

54. M.B.Wise, C.V.Thompson, M.V.Buchanan et.al. "Direct Sampling Ion Trap Mass Spectrometry". //Spectroscopy, 1995, v.2, N.5, p. 14-22.

55. D.M.Chambers, H.R.Gregg, and B.D.Andresen. Studies of Reducing The Scale of a Double Focusing Mass Spectrometer. Proceeding of the 41st Conference on

56. Mass Spectrometry and Allied Topics, Washington, DC, San Francisko, CA, May 31-June 4, 1993, 934a-934b.

57. T.Kotiaho. On-Site Environmental and In-Situ Process Analysis by Mass Spectrometry. //Journal of Mass Spectrometry, 1996, v.31, p. 1-15.

58. J.Workman,Jr. And H.Mark. Matrix Algebra and Multiple Linear Regression Part

59. Spectroscopy, 1993, 8(9), p.16-20.

60. J.Workman,Jr. And H.Mark. Matrix Algebra and Multiple Linear Regression Part

61. Spectroscopy, 1994, 9(1), p.16-19.

62. J.Workman,Jr. And H.Mark. Matrix Algebra and Multiple Linear Regression Part

63. Spectroscopy, 1994, 9(4), p.18-19.

64. В.Г.Истомин, К.В.Гречев, В.А.Кочнев.// Космические исследования. 1983. Т.21. С.410.

65. M.B.Wise and M.R.Guerin. Direct Sampling MS for Environmental Screening. //Analytical Chemistry, 1997, v.69, 26A-32A.

66. S.H.P.Wong, R.G.Cooks, M.E.Cisper and P.H.Hemberger. On-line, On-situ Analysis with Membrane Introduce MS. //Environmental Science and Technology. 1995, v.29, 5, p.215A-218A.

67. S.Bauer and D.Solyon. Determination of Volatile Organic Compounds at the Part-per -Trillion Level in Complex Aqueous Matrices Using Membrane Introduction Mass Spectrometry. //Analytical Chemistry, 1994, v.66, p.4422-4431.

68. G.M.Reimer, Helium increase. //Nature, (1990). 347, 342.

69. В.Н.Гартманов, В.Т.Коган, А.К.Павлов, А.А.Харченко, Масс-спектрометр. Авторское свидетельство №1173465. 1985. Бюллетень №30.

70. В.Т.Коган, А.П.Корниенко, Б.В.Кошевенко, А.К.Павлов, Ю.В.Чичагов. Масс-спектрометр для исследования состава солнечного ветра. // ЖТФ. Т.59. в.1. 1989. С.176-180.

71. В.М.Кельман, С.П.Карецкая, Л.В.Федулина, К.М.Якушев. Электронно-оптические элементы призменных спектрометров заряженных частиц.: Алма-Ата, Наука, 1979,232 с.

72. В.Н.Гартманов, В.Т.Коган, Б.В.Кошевенко, А.К.Павлов. Масс-спектрометр. Авторское свидетельство №1061193. 1983. Бюллетень изобретений №46.

73. Г.Е.Кочаров, В.Н.Гартманов, В.Т.Коган, Б.В.Кошевенко, А.К.Павлов, А.А.Харченко, Ю.В.Чичагов. Эксперимент по определению состава солнечного ветра. В кн. : Энергичные частицы и фотоны от солнечных вспышек. Л.: Изд. ЛИЯФ. 1984. С.105-117.

74. В.Н.Гартманов, В.Т.Коган, Б.В.Кошевенко, А.К.Павлов, А.А.Харченко, Ю.В.Чичагов. Масс-спектрометры для исследования солнечного ветра. В кн. Научное космическое приборостроение. М.: Металлургия. 1985. Вып.4. С.63-71.

75. В.П.Афанасьев, С.Я.Явор, Электростатические анаализаторы для пучков заряженных частиц. М.: Наука. 1978. 224 с.

76. К.Бейнбридж. Динамика и оптика заряженных частиц. В кн.: Экспериментальная ядерная физика.: // М.Иностранная литература. 1955. Т.1. С.495-592.

77. Л.Г.Гликман, В.М.Кельман, Е.М.Якушев. Электронно-оптические параметры двухэлектродных иммерсионных цилиндрических линз. // ЖТФ. 1967. Т. 37. С.1028-1034.

78. P.Decreau, P.Prange, J.J.Berthelier. Optimization of toroidal electrostatic analyzers for measurements of low energy particles in space. //Rev.Sci.Instr. 1975. V.46. p.995-1007.

79. В.В.Зашквара, М.И.Корсунский, В.С.Редькин. Фокусирующие свойства тороидального электростатического поля.//ЖТФ. 1968. Т.38.С. 1336-1343.

80. H.Wollnic, T.Matsuo, H.Matsuda. The electrostatic potential in a toroidal condenser. //Nucl.Instr.Meth. 1972.v.l02.p.l3-17.

81. H.Moestue. The electric field and geometrical factor of an annular curved plate electrostatic analyser.//Rev.Sci.Instr.l973. v.44.p.l709-1713.

82. В.Т.Коган, А.К.Павлов. Расчет электростатических полей и фокусирующих свойств тороидальных конденсаторов.//ЖТФ. 1985.т.55.с.2079-2082.

83. В.Т.Коган, Б.В.Кошевенко, А.К.Павлов, А.А.Харченко, Ю.В.Чичагов. Масс-энергоанализатор. Авторское свидетельство №1185430. 1983. Бюллетень изобретений №38.

84. В.Т.Коган, А.К.Павлов, А.Д.Казанский и С.Г.Буцев. Способ определения характеристик ионов космической плазмы. Авторское свидетельство №1723601. 1992. Бюллетень изобретений №12.

85. Ю2.В.М.Кельман, С.Я.Явор. Электронная оптика. 3-е изд.: Л.Наука. 1968. 488 с.

86. В.Т.Коган, Г.Ю.Гладков, О.С.Викторова. Ионно-оптическая схема портативного масс-спектрометра. // ЖТФ.2001. т.71(4).с.130-132.

87. В.Т.Коган, А.К.Павлов, Г.Ю.Гладков. Магнитный масс-спектрометр с двойной фокусировкой. ВНИИГПЭ. Заявка № 2000103834/09, от 15.02.2000.

88. LaPack M. A., Tou J. С., Enke С. G., McGuffin V.L. The correlation of membrane permselectivity with Hildebrand solubility parameters.//Journal of Membrane Science. 1990. 86.263-280.

89. Ю8.В.Т.Коган, О.С.Викторова, Г.Ю.Гладков, Ю.В.Чичагов, Ю.В.Тубольцев. Мембранный инжектор для портативного масс-спектрометра.// ПТЭ.2001 .т.44( 1 ).с. 129-132.

90. Kotiaho T., Lauritsen F. R., Choudhury Т. К., Tsao G. T., Cooks R.G. Membrane Introduction Mass Spectrometry.//Anal. Chem. 1991. V. 63. P. 875A-883A.

91. С.Дэшман. Научные основы вакуумной техники. M.: Мир. 1964. 715с.

92. Lauritsen F. R., Kotiaho T. Advances in Membrane Inlet Mass Spectrometry.// Rev. Anal. Chem. 1996. V.15. P.237-264.

93. Kotiaho T., Kostiainen R., Ketola R.A., Ojala M., Mattila I., Mansikka T. Membrane Inlet Mass Spectrometry in the Past and in the Future.// Advance in Mass Spectrometry. 1998.V.14.P.501-527.

94. LaPack M. A., Tou J. C., Enke C. G. Membrane mass spectrometry for the direct trace analysis of volatile organic compounds in air and water.//Anal. Chem. 1990. V. 62. P.1265-1271.

95. LaPack M. A., Tou J. C., Enke C. G. Membrane extraction mass spectrometry for on-line analysis of gas or liquid process streams.//Anal. Chem. 1991. V. 63. P.1631-1637.

96. Cisper M. E., Gill C.G., Townsend L.E., Hemberger P.H. On-line detection of volatile organic compounds in air at part-per-trillion levels by Membrane introduction Mass Spectrometry.//Anal.Chem. 1996. V.68. P.2097-2101.

97. Ketola R. A., Ojala M., Sorsa H., Kotiaho T., Kostainen R. Development of a membrane inlet mass spectrometer method for analysis of air samples.// Anal.Chim.Acta. 1997. V. 349. P. 359-365.

98. Ketola R. A., Mansikka T., Ojala M., Kotiaho T., Kostainen R. Analysis of volatile organic sulfer compounds in air by membrane inlet MS.// Anal.Chem. 1997. V. 69. P.4536-4539.

99. Cisper M. E., Garret A. W., Cameron D., Hemberger P. H. Analysis of polar organic compounds using charge exchange ionisation and MIMS.// Anal.Chem. 1996. V.68. P.2097-2101.

100. Kotiaho T., Lauritsen F. R., Choudhury T. K., Tsao G. T., Cooks R.G. // Anal. Chem. 1991. V. 63. P. 875A.

101. D.P. Lucero, F.C. Haley. // J. Gas Chromatogr. 1968.V. 6. p. 477.

102. P.M. Llewellyn, D.P. Littlejohn, Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy, Pittsburgh, PA USA, 1966.

103. A.G. Vitenberg, M.I. Kostkina, B.V. Ioffe, Anal.Chem. 1984. V. 56. P. 2496.

104. Maden, A.J.; Hayward, M.J. Sheet materials for use as membranes in membrane introduction mass-spectrometry.// Anal. Chem. 1996, 68, 1805-1811.

105. Ketola, R. In Method development in membrane inlet mass spectrometry. Air analysis and desorption techniques; Technical Research Centre of Finland, VTT Publications 364, 1998.

106. Degn, H.J. Membrane inlet mass spectrometry in pure and applied microbiology.// Microbiol. Methods 1992,75, 185-197.

107. Lauritsen,F.R.; Lloyd, D. Mass Spectrometry for the Characterization of Microorganisms; Fenselau.C., Ed.;ACS Symposium Series 541; American Chemical Society: Washington DC, 1994; pp. 91-106.

108. Cooks, R.G.; Kotiaho, T.; Pollution prevention in industrial processes; Breen, J.J.; Dellarco, M.J., Eds.; ACS Symposium Series 508; American Chemical Society: Washington DC, 1994; pp. 126-154.

109. Bauer, S.J.; Cooks, R.G. MIMS for Trace-level determination of organic analytes in on-line process monitoring and environmental analysis.//Am.Lab.l993,V.25. P.36-51.

110. D.R.Black, R.A.Flath, and R.Teranishi, Membrane Molecular Separators for Gas-Chromatographic-Mass Spectrometric Interfaces. //J.Chromatogr.Sci.,1969, 7, 284-289.

111. V.T.Kogan, O.S.Viktorova. Organic Impurity Preconcentration by a Multimembrane Inlet System of a Mass Spectrometer. //Technical Physics Letters., 2001,27(12), 984-986.

112. G.J. Tsai, G.D. Austin, M.J. Syu, G.T. Tsao, M.J. Hayward, T. Kotiaho, R.G. Cooks, Theoretical Analysis of Probe Dynamics in Flow Injection/Membrane Introduction Mass Spectrometry. //Anal. Chem.,1991, 63, 2460-2465.

113. F.L. Overney, C.G. Enke, A Mathematical Study of Sample Modulation at a Membrane Inlet Mass Spectrometer Potential Application in Analysis of Mixtures. //J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1996, 7, 93-100.

114. F. Lennemann, Membrane inlet mass spectrometry for bioreactors. Modelling and application for gases and liquids, Ph.D. Thesis, Hamburg-Harburg Technical University, Hamburg, 1999.

115. A.A. Sysoev, A Mathematical Model for Kinetic Study of Analyte Permeation from Both Liquid and Gas Phases through Hollow Fiber Membranes into Vacuum. //Anal.Chem,2000, 72, 4221-4229.

116. Дж.Чемпен.Практическая органическая масс-спектрометрия. M.: Мир,1988. 217с.

117. B.S.Yakovlev, V.L.Talrose. Membrane Ion Source for Mass Spectrometry //Anal.Chem. 1994,Vol.66.p. 1704-1707.

118. M.Soni, S.Bauer, J.W.Amy, P.Wong, R.G.Cooks. Direct determination of organic compounds in water at part-per-quadrillion levels by membrane introduction mass spectrometry.//Anal.Chem. 1995.Vol.67.p.l409-1412.

119. А.А.Полякова, Р.А.Хмельницкий. Масс-спектрометрия в органической химии. JL: Химия, 1972. 368 с.

120. Г.А.Семенов и др. Применение масс-спектрометрии в неорганической химии. JL: Химия, 1976.152 с.

121. В.А.Рабинович, З.Я.Хавин. Краткий химический справочник. JL: Химия, 1977. 376 с.

122. Ю.И.Ермолаев, Г.Н.Застенкер, В.Т.Коган, Г.Е.Кочаров, Б.В.Кошевенко, А.В.Лейбов, З.Немечек, А.К.Павлов, А.О.Федоров, А.А.Харченко,

123. Ю.В.Чичагов, Я.Шафранкова. Эксперимент по определению состава солнечного ветра с помощью масс-энергоанализаторов комплекса "БИФРАМ". //Космические исследования. 1986. Т. 24. С.192-199.

124. S.Kuns, P.Bochsler, J.Geiss, K.W.Ogilvie, M.A.Coplan. Determination of solar wind elemental abundances from M/Q observations during three periods in 1980. // Solar Phys., 1983,v.88, 359-376.

125. C.Jordan. The ionization equilibrium of elements between carbon and nickel.// Mon.Not.R. Astr. Soc., 1969. v. 142. p.501-521.

126. J.Geiss. Processes affecting abundances in solar wind.// Space Sci.Rev., 1982. v.33. p.201-217.

127. Ю.И.Ермолаев, Г.Н.Застенкер, В.И.Журавлев, В.Т.Коган, Б.В.Кошевенко, А.К.Павлов, Е.В.Соболева, Ю.В.Чичагов. Наблюдения однократно ионизованного гелия в солнечном ветре. // Космические исследования. 1989. Т. 27. Вып.5.С.717-725.

128. G.E.Kocharov, V.T.Kogan, A.N.Konstantinov and A.K.Pavlov. The possibilities of cosmogenic isotope investigation by means of mass-spectrometer methods.// Nucl. Instr. and Meth.V.B52. 1990. P.384-386.

129. A.K.Pavlov, V.T.Kogan, G.Yu.Gladkov. A Tandem Mass-Spectrometric Method of Cosmogenic Isotope Analysis. // Radiocarbon. 1992. V.34. '2, c. 271-276.

130. O.S.Viktorova, V.T.Kogan, S.A.Manninen. Portable Double-Focus Mass Spectrograph with Multimembrane Inlet. In Proceedings of the 3rd Conference "Harsh-Environment Mass Spectrometry" (March 25-28, 2002), Pasadena, California, USA, JPL, p.67.

131. O.S.Viktorova, V.T.Kogan. Membrane Inlet Systems for Portable Mass Spectrometers, In Proceedings of the 4rd Conference "Harsh-Environment Mass Spectrometry " (October 8-11, 2003), Florida, USF, USA, p.27.