Методология анализа объектов различного происхождения методами газовой хроматографии-масс-спектрометрии и элементного анализа на содержание следов среднелетучих органических веществ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

005011304

п *

Ревельскнй Александр Игоревич

МЕТОДОЛОГИЯ АНАЛИЗА ОБЪЕКТОВ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДАМИ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ II ЭЛЕМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА СОДЕРЖАНИЕ СЛЕДОВ СРЕДНЕЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

1 МАР Ш

Москва - 2012

005011304

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Рыбальченко Игорь Владимирович

доктор химических наук, профессор Буряк Алексей Константинович

доктор химических наук Бродский Ефим Соломонович

Ведущая организация: научно-технический центр «Хроматография»

Защита состоится « 14 » марта 2012 г. в 15 час. 00 мин. в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова С авторефератом можно ознакомиться на сайте ВАК России: ЬИр//уак.ed.gov.ru

Автореферат разослан « » февраля 2012 г. Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

Общая характеристика работы Актуальность темы

В настоящее время актуальной задачей является обнаружение следов среднелетучих органических соединений (СЛОС) в различных средах. К СЛОС относятся стойкие органические загрязнители (СОЗ), контролю содержания которых в объектах окружающей среды, продуктах питания и биосредах уделяется особое внимание (хлорорганические пестициды (ХОП), полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), полихлорированные бифенилы (ПХБ), полихлорированные дибензодиоксины (ПХДД), производные фенолов, фталаты и др.).

ПДК этих соединений составляют 10"12 - 10"7 % - в зависимости от класса соединений. Большую группу СЛОС составляют опасные соединения, в состав молекул которых входят такие элементы, как И, С1, Вг, Б и Р. ПДК для них находятся в том же диапазоне, что и для большинства СОЗ.

Существует необходимость обнаружения следовых содержаний среднелетучих производных (дериватов) нелетучих физиологически активных соединений таких, как аминокислоты, жирные, дикарбоновые кислоты, сахара, стероиды, фармацевтические субстанции и др. в биосредах и водных растворах. Важным объектом анализа являются фармацевтические препараты и присутствующие в них примеси.

Увеличение достоверности диагностики ряда заболеваний требует обнаружения как числа неизвестных СЛОС, так и их идентификации на следовом уровне в биосредах.

Для решения рассмотренных задач в большинстве случаев - требуется предварительное выделение аналитов из матрицы и их концентрирование. -

Наибольшее распространение, как при анализе вод, так и продуктов питания, почв, донных отложений, биосред на содержание СЛОС получил метод их выделения и концентрирования, основанный на жидкостной экстракции. Этот метод, в отличие от других известных методов, применим к широкому кругу матриц и лишён ряда ограничений при определении ультрамалых концентраций аналитов, в частности СОЗ. При извлечении СЛОС отбирают большие пробы образца (в случае воды 0.5 -10 л) и используют большие объёмы органического растворителя (десятки и сотни мл). Полученный экстракт упаривают. Упаренный объём экстракта обычно составляет около 1 мл, а объём анализируемой пробы - 1 мкл (в большинстве случаев). Из-за анализа столь малой части экстракта на стадии перехода от пробоподготовки к анализу имеет место увеличение пределов обнаружения от 1000

Для увеличения объёма пробы, анализируемой методом КГХ, используется два основных способа концентрирования примесей из больших проб органических растворов (экстрактов). Первый из них - это ввод больших проб в капиллярную колонку, свободную от НФ (Large volume cold on column injection), второй - это ввод больших проб на сорбент, помещённый в кварцевый лайнер инжектора, нагреваемого по определённой температурной программе (PTV инжектор - Programmed Temperature Vaporizing Injector). Объём пробы, обычно, не более 0.1 мл. При вводе пробы раствора в PTV инжектор с контролируемой скоростью объём пробы может быть увеличен.

до 500 раз.

Выделение примесей из раствора проводится внутри газового хроматографа (внутри аналитической системы) при вводе всего объёма пробы в капиллярную колонку, свободную от неподвижной фазы, или лайнер инжектора с сорбентом. После завершения концентрирования (удаления основной массы паров растворителя) концентрат аналитов переносится в разделительную колонку (при нагревании капилляра или инжектора). Большинство этих работ выполнено для растворов, в которых содержание аналитов в пробе составляло 10"9 - 10"8 г, с использованием капиллярной газовой хроматографии. Извлечение примесей из больших проб (до 0.5 мл) органических и водных растворов с нанесением всей пробы в пустую колонку, либо колонку, заполненную инертным носителем, проводилось методом дискретной термической и изотермической хромадистилляции (предложен и развит Жуховицким A.A. и Яновским С.М. с сотрудниками).

Имеется ряд ограничений при концентрировании ультрамалых количеств аналитов различной полярности и летучести этими методами и их определении методом ГХ/МС. Среди этих ограничений: попадание части паров растворителя в разделительную колонку и масс-спектрометр, загрязнение хроматографической системы нелетучими компонентами пробы, изменение аналитического сигнала (форма хроматографических пиков, воспроизводимость масс-спектров), потери следов определяемых веществ или искажение состава пробы. В связи с этим, эти способы нашли ограниченное применение в сочетании с ГХ-МС (обычно концентрирование из проб объёмом до 20 мкл).

Во всех работах, посвященных рассматриваемым способам, не изучали степень извлечения широкого круга среднелетучих органических соединений различной полярности и летучести из больших проб органических растворов, и особенно важно, их следовых количеств (10"13 - 10"9 г), внутри аналитической системы, в частности ГХ/МС. Не было известно работ по выделению следов СЛОС из больших проб органических растворов (экстрактов) вне термостата колонок или инжектора хроматографа (вне аналитической системы), переводу сконцентрированных определяемых веществ в аналитический прибор посредством термодесорбции и анализу всего концентрата как методом ГХ/МС, так и другими методами. Такое концентрирование позволило бы устранить недостатки известных способов.

В связи с этим актуальным является исследование концентрирования органических растворов (экстрактов) ультрамалых количеств (10"13 - Ю"10 г) СЛОС и анализа всего концентрата методом ГХ/МС с целью снижения пределов обнаружения, особенно при анализе экстрактов из малых проб образцов различных матриц, из которых извлечение аналитов производится жидкостной экстракцией. Актуальным является также снижение пределов обнаружения производных нелетучих физиологически активных органических соединений (аминокислот, жирных кислот, нуклеозидов, стероидов, Сахаров и др.) с целью обнаружения следов таких веществ в различных матрицах. Большой практический интерес представляет разработка подходов к определению состава компонентов смесей заданных и неизвестных соединений на уровне следов для решения различных задач в экологии, медицине, антидопинговом контроле, контроле качества фармацевтических веществ и препаратов.

Актуальной является также разработка подхода к эколого-анапитическому контролю, основанного на быстром скрининге проб органических экстрактов на

суммарное содержание следов На1-, Р- и 8- органических соединений в пересчёте на элемент (обобщённый показатель). Цели работы

Развитие направления обнаружения СЛОС различной летучести и полярности на уровне следов в сложных по составу матрицах, основанного на извлечении обнаруживаемых веществ из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов и анализе всего концентрата аналитов методами ГХ/МС и элементного анализа.

Разработка подходов к обнаружению следов заданных и неизвестных СЛОС в образцах различного происхождения, позволяющих по новому решить задачи экологического контроля, диагностики заболеваний, антидопингового контроля, контроля качества высокочистых веществ (фармсубстанций). Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод анализа следов СЛОС различной полярности и летучести, основанный на извлечении этих веществ из органических растворов в процессе непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) и анализе всего концентрата методами ГХ-МС, ГХ-АЭД и элементного анализа.

2. Выбрать условия хромато-масс-спектрометрического обнаружения ультрамалых количеств широкого круга органических соединений различной полярности и летучести и производных нелетучих органических соединений (в том числе дикарбоновые, гидрокси, окси-, жирные и аминокислоты спирты, сахара, стеролы, нуклеозиды, моносахариды, стероиды, ряда фармацевтических веществ).

3. Расширить возможности метода ГХ/МС для обнаружения следов малолетучих и нелетучих органических соединений в виде их производных, основанного на их выделении из образца, дериватизации, замене реагента на легколетучий инертный растворитель, концентрировании полученных растворов в процессе НМХД и анализе всего концентрата производных методом ГХ/МС.

4. Для метода ГХ/АЭД изучить зависимость сигналов атомно-эмиссионного детектора (АЭД) по углероду и водороду от структуры молекул органических соединений, содержащих такие элементы как С, Н, N. О, Р, Б, Р, С1 и Вг и разработать условия, минимизирующие такую зависимость. Изучить возможность определения количественного состава компонентов смесей без градуировки по каждому компоненту.

5. Разработать способ быстрого скрининга органических и водных растворов на суммарное содержание следов среднелетучих Р-, С1-, Вг-, 8- и Р- органических соединений в пересчёте на элемент (обобщённый показатель).

6. Разработать способ определения состава неизвестных СЛОС в конденсате выдыхаемого воздуха человека, основанный на жидкостной экстракции, концентрировании аналитов с удалением растворителя в процессе НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата. На основании полученных данных рассмотреть возможность увеличения достоверности диагностики таких лёгочных заболеваний, как бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ).

7. Предложить подход к селективному обнаружению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях на уровне следов,

основанный на жидкостной экстракции органическим растворителем, мало-растворяющим основной компонент, концентрировании аналитов с удалением растворителя из этого экстракта вне аналитической системы и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов. Научная новизна

На примере следовых количеств ПХДЦ, ПХБ и ХОП показана принципиальная возможность обнаружения следов CJIOC в органических растворах на уровне 10"12 -Ю"10 % и в модельных водных растворах (после микрожидкостной экстракции) на уровне 10"13 - 10'11 %. Такая возможность показана благодаря сочетанию концентрирования органических растворов (экстрактов) следов СЛОС (основанного на изотермической хромадистилляции при непрерывном вводе пробы в предколонку без неподвижной фазы) и анализа всего концентрата обнаруживаемых веществ методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов.

Предложена методология анализа образцов различного происхождения на содержание следов СЛОС, основанная на их извлечении органическим растворителем, концентрировании полученных растворов в условиях непрерывной микрохромадистилляции и анализе всего концентрата методом ГХ/МС и элементного анализа.

Разработан метод концентрирования органических растворов следов (10"12 - 10"9 г) СЛОС в условиях НМХД и анализа всего концентрата свободного от растворителя методами ГХ/МС, ГХ/АЭД и элементного анализа, включающего окислительную конверсию аналитов с последующей регистрацией продуктов конверсии, соответствующих определяемым элементам, методом ионной хроматографии. Этот метод позволяет на 2-3 порядка снизить пределы обнаружения. Он явился основой при разработке подходов и способов обнаружения СЛОС в различных средах на уровне следов, которые позволили решить различные задачи в экологии, медицине, антидопинговом контроле, идентификации, контроле качества лекарственных средств на новом уровне.

Предложено описание процесса концентрирования органических растворов следов СЛОС при непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) (при наличии или отсутствии сорбента). Описание основано на теории хромадистилляции предложенной A.A. Жуховицким.

Выбраны условия дериватизации для следовых количеств (10'" - 10"9 г) широкого круга нелетучих или малолетучих биологически активных соединений (аминокислоты, жирные, дикарбоновые, гидрокси, оксикислоты, нуклеозиды, сахара, стероиды и др.) при использовании реакции силилирования и этерификации/ацилирования (для амино и жирных кислот).

Предложена новая методология обнаружения следов изученных кислот, спиртов, Сахаров и стеролов при их совместном присутствии в водном растворе. Она основана на высушивании одной части образца и последующем триметилсилилировании смесью БСТФА с пиридином, и дериватизации другой части смесью изобутилхлорформиата (ИБХФ) с гептафторбутанолом в водно-органическом растворе с последующей жидкостной экстракцией и ГХ/МС анализом соответствующих производных в выбранных в результате исследований условиях эксперимента.

При использовании для дериватизации реакции этерификации/ацилировшшя впервые изучен состав жирных, дикарбоновых и аминокислот в лиофилизатах клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов с использованием ГХ/МС анализа производных определяемых соединений и впервые показана возможность увеличения достоверности установления отличия этих клеток друг от друга на основании различия в составе аминокислот.

Разработан метод обнаружения нелетучих физиологически активных веществ, основанный на их дериватизации, замене реагента после дериватизации на легколетучий инертный растворитель, концентрировании полученных растворов в условиях НМХД и анализе всего концентрата свободного и от реагента и от растворителя методом ГХ/МС. Метод позволил снизить пределы обнаружения производных таких соединений более чем на 2 порядка.

Предложен подход к обнаружению С-, Н-, Ы-, О-, Р-, С1-, Вг-, Р- и Б- содержащих органических соединений методом ГХ/АЭД, позволивший минимизировать зависимость сигналов этого детектора по С и Н от структуры и элементного состава аналитов при использовании гелиевой плазмы, обогащенной кислородом. Это ПОЗВОЛИЛО осуществить определение отношений Пс/Пн для различных веществ с минимальной погрешностью. Позволило предложить способ определения процентного содержания углерода в молекулах компонентов смесей углеводородов с высокой точностью и определения их количественного содержания без градуировки АЭД по каждому компоненту. Способ не требует образцов сравнения для каждого компонента смеси. Практическая значимость

Предложенный подход к обнаружению ПХДД, ПХБ и ХОП в органических и водных растворах при их совместном присутствии в смеси на уровне 10"12 - 10"'° % показывает принципиальные возможности сочетания предложенного подхода к концентрированию органических растворов и анализа всего концентрата методом ГХ/МС. В случае отсутствия (или снижения) влияния мешающих компонентов матрицы способ позволяет проводить быстрый скрининг проб экстрактов на наличие хлорсодержащих токсикантов.

Модификации разработанного метода концентрирования органических растворов следов СЛОС в условиях НМХД (размеры камеры концентрирования, вид сорбента, его количество либо отсутствие, условия перевода в разделительную капиллярную колонку, условия хромато-масс-спектрометрического анализа) позволили разработать ряд способов и подходов к обнаружению компонентов различных сложных смесей при их содержании на ультрамикроуровне, и решить ряд важных задач в эколого-аналитическом контроле, медицинской диагностике, антидопинговом контроле и идентификации компонентов сложных смесей.

Разработанный способ определения аминокислот в водных растворах, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных в воде, их жидкостной экстракции, концентрировании растворов аналитов в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов, позволяет снизить пределы обнаружения аминокислот более, чем на 2 порядка, благодаря чему существенно расширены возможности решения различных задач, связанных с определением состава аминокислот. Показанная возможность увеличения достоверности установления отличия клеток

аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов между собой на основании различия в составе аминокислот может увеличить достоверность гистологической диагностики онкозаболеваний.

Разработанные способы определения следовых содержаний производных ряда нуклеозидов, 2-деокси-2-фтор-<1-глюкозы, ряда Сахаров, позволяют снизить пределы обнаружения более чем на 2 порядка, и решить соответствующие задачи на новом уровне, недостижимом при общепринятом подходе.

Существенно расширены возможности антидопингового контроля благодаря разработанному способу анализа стероидов в водных растворах и моче. Способ позволяет зарегистрировать в моче больше соединений со стероидной структурой и снизить предел обнаружения более чем в 100 раз по сравнению с общепринятым подходом.

Разработанный подход, позволяющий минимизировать зависимость сигналов по С и Н атомно-эмиссионного детектора (АЭД) от структуры аналитов, и определять отношения пс/пн с низкой погрешностью расширяет возможности ГХ/АЭД с точки зрения определения как качественного, так и количественного состава компонентов смесей, особенно компонентов смесей углеводородов. Показана возможность определения элементного состава компонентов и их содержания для различных смесей без проведения градуировки АЭД по каждому компоненту, что очень важно при анализе многокомпонентных смесей. Предложенные подходы к обнаружению следов аналитов в органических растворах, основанные на концентрировании этих растворов в условиях НМХД и последующем анализе всего концентрата методами ГХ/АЭД и ГХ/МС, позволившие снизить пределы обнаружения методов ГХ/АЭД и ГХ/МС более чем на 2 порядка, существенно расширили возможности как обнаружения заданных соединений, так и идентификации компонентов смесей на уровне следов при совместном использовании данных, полученных этими методами.

Предложен способ дифференциации здоровых людей и больных астмой и ХОБЛ, при использовании разработанного подхода к определению состава неизвестных СЛОС на уровне следов (10"8 - 10"7 %) в водном конденсате выдыхаемого воздуха, вносящий вклад в развитие методов диагностики лёгочных заболеваний.

Новые возможности в эколого-аналитическом контроле открываются при использовании предложенных способов определения суммарного содержания На1-, Р-и Б- содержащих органических соединений на уровне (Ю'10 - 10"8 %) в водных и органических растворах. Эти способы позволяют создать новую методологию действенного эколого-аналитического контроля за всеми наиболее опасными нормируемыми и ненормируемыми токсикантами, основанную на быстром скрининге проб на суммарное содержание соответствующих соединений (элементов).

Предложенный новый подход к определению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях, основанный на жидкостной экстракции и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата открывает новые возможности для сопоставления качества оригинальных (патентованных) субстанций (и препаратов на их основе) и дженериков (копий). Такое сопоставление основано на сравнении многомерных профилей примесей (времён удерживания, масс-спектров электронной и химической ионизации и интенсивностей соответствующих сигналов для зарегистрированных соединений) для соответствующих препаратов.

Положения, выносимые на защиту

1. Подход к обнаружению ПХДЦ, ПХБ и ХОП в органических растворах на уровне 10'12 - Ю"10 % и в водных растворах (после микрожидкостной экстракции) на уровне 10"'э - 10'" %. Подход основан на концентрировании органических растворов (экстрактов) следов этих веществ в условиях непрерывной изотермической хромадистилляции в предколонке без неподвижной фазы и анализе всего концентрата методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов.

2. Метод концентрирования органических растворов (экстрактов) следовых количеств среднелетучих органических соединений в условиях НМХД, переводе концентрата термодесорбцией в аналитический прибор и анализе всего концентрата методами ГХ/МС и элементного анализа.

3. Способ определения аминокислот в водном растворе на уровне следов основанный на получении их ИБОК-ГФБ производных, жидкостной экстракции, концентрировании экстрактов в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов, позволяющий снизить предел обнаружения более чем на 2 прядка.

4. Способ дифференциации клеток аденокарциномы и фибробластов, основанный на определении состава аминокислот (их ИБОК-ГФБ производных) методом реакционной ГХ/МС в этих клетках.

5. Метод обнаружения нелетучих органических соединений (или соединений, аналитический сигнал производных которых более информативен), основанный на дериватизации, замене реагента после проведения дериватизации на летучий растворитель, концентрировании полученных растворов производных в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов.

6. Способ обнаружения стероидов в водных растворах и моче, основанный на разработанном методе, позволивший снизить более чем на 2 порядка пределы обнаружения и регистрировать в моче большее число соединений со стероидной структурой.

7. Подход к минимизации зависимости сигналов АЭД по С и Н от структуры молекул аналитов, и определения отношения пс/пн с высокой точностью, основанный на использовании гелиевой плазмы, обогащенной кислородом. Способ определения элементного состава компонентов смесей углеводородов с высокой точностью и их количественного содержания без градуировки АЭД по каждому компоненту с использованием разработанных условий определения.

8. Подходы к обнаружению органических соединений на уровне следов в органических растворах (экстрактах) методами ГХ/АЭД и ГХ/МС, позволяющие снизить пределы обнаружения этими методами более, чем на 2 порядка и увеличить.

9. Способ одновременного определения общего содержания На1-, Р- и Б-содержащих органических соединений в водных растворах, основанный на высаливании, жидкостной экстракции, концентрировании экстракта в условиях НМХД, переводе всего концентрата аналитов в реактор термодесорбцией и анализе всего абсорбата продуктов высокотемпературной окислительной конверсии методом ионной хроматографии (предел обнаружения по элементу на уровне Ю"10 %).

10. Способ определения состава неизвестных CJ10C на уровне 10"8 - 10'7 % в водном конденсате выдыхаемого воздуха, основанный на жидкостной экстракции с высаливанием, выделении аналитов из полученного органического экстракта в режиме НМХД и анализе всего концентрата методом ГХ/МС. Подход к дифференциации здоровых людей и больных ХОБЛ и бронхиальной астмой с высокой достоверностью на основании данных, полученных в результате анализа соответствующих конденсатов. И.Новый подход к определению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях и фармпрепаратах на их основе. Подход основан на жидкостной экстракции растворителем, не растворяющим основной компонент, концентрировании полученных экстрактов в режиме НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата аналитов. По сравнению с существующими подходами, данный позволяет зарегистрировать большее число примесей. Апробация работы и публикации Результаты исследований докладывались на следующих научных конференциях: 16-th International Symposium on Capillary Chromatography (Riva-del-Garda, Italy, 1994); Международный Симпозиум «Хроматография и масс-спектрометрия в анализе объектов окружающей среды» (Ст.-Петербург, Россия, 1994); Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-94» (Краснодар, Россия, 1994); InCom'95 International Symposium on Instrumentalized Analytical Chemistry and Computer Technology (Dusserldorf, Germany, 1995); PIITCON (McCormick Place, Chicago, Illinois, 1996); InCom'96 International Symposium on Instrumentalized Analytical Chemistry and Computer Technology (Dusserldorf, Germany, 1996); VII Всероссийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии (Москва, Россия, 1996); 18-th International Symposium on Capillary Chromatography (Riva-del-Garda, Italy, 1996); ISCSE'96, Chromatography and spectroscopy in environmental analysis and toxicology (St.-Petersburg, Russia,1996); IFPAC'97, Eleventh international forum process analytical chemistry (Seattle (Blaine), WA, USA, 1997); InCom'97 International Symposium on Instrumentalized Analytical Chemistry and Computer Technology (Dusserldorf, Germany, 1997); PITTCON (Atlanta, Georgia, USA,1997); Nineteenth international symposium on capillary chromatography and electrophoresis (Wintergreen, Virginia, USA, 1997); International congress on Analytical chemistry (Moscow, Russia, 1997); Balaton symposium'97 on high-performance separation methods (Siofok, Hungary, 1997); InCom'98 International Symposium on Instrumentalized Analytical Chemistry and Computer Technology (Dusserldorf, Germany, 1998); PITTCON (New Orleans, Louisiana, USA, 1998); 20th International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 1998); Balaton symposium'99 on highperformance separation methods (Siofok, Hungary, 1999); PITTCON (New Orleans, Louisiana, USA, 2000); 23ld International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 2000); 10-th Russian-Japan Joint Symposium on Analytical Chemistry (Moscow and Saint Petersburg, Russia, 2000); VIII Всероссийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, Россия, 2001); Seventh International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers (Brugge, Belgium, 2002); Всероссийский симпозиум « Современные проблемы хрматографии» (Москва,

Россия, 2002); 25л International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 2002); 3rd International Symposium on Separations in Biosciences (100 Years of Chromatography) (Moscow, Russia, 2003); 8th International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography (Brugge, Belgium, 2002); Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, Россия, 2004); 27th International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 2004); European Conference on Analytical Chemistry (Salamanca, Spain,2004); Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение' в нефтехимии» (Самара, Россия, 2005); Второй съезд ВМСО, Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2005); II Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, Россия, 2005); 1st ВВВВ Conference on Pharmaceutical science (Siofok, Budapest, Hungary, 2005); International Conference Instrumental Methods of Analysis «1МА'05» (Iraklion, Grete, Greece, 2005); 28th International Symposium on Capillary Chromatography and Electrophoresis (Las Vegas, USA, 2005); 40th IUPAC Congress «Innovation in Chemistry» (Beijing, China, 2005); Ninth International symposium on hyphenated techniques in chromatography and hyphenated chromatographic analyzers (York, 2006); 29th International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 2006); International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Moscow, Russia, 2006); Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (Москва - Клязьма, Россия, 2007); Третий съезд ВМСО II Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2007); II Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2007); Всероссийский симпозиум «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва, Клязьма, Россия, 2008); Всероссийская конференция «Химический анализ» (32-я годичная сессия научного совета РАН по аналитической химии) (Москва, Клязьма, Россия, 2008); The 32th International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 2008); II Международный форум «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, Россия, 2008); The 68th FIP World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences (Basel, Switzerland, 2008); Четвертый съезд ВМСО III Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2009); VII Всероссийская конференция по анализу окружающей среды «Экоаналитика-2009» (Йошкар-Ола, Россия, 2009); Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (Самара, Россия, 2009); V Международная научно-практическая конференция «Сверхкритические флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации» (Суздаль, Россия, 2009); III Всероссийская конференция с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2009); III Российская конференция «Актуальные проблемы нефтехимии» (Звенигород, Россия, 2009); I Всероссийская конференция «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, Россия, 2009); Съезд аналитиков России 2010 «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, Россия 2010); 34th International

Symposium on Capillary Chromatography and 7th GCxGC Symposium (Riva del Garda, Italy 2010); Четвертая Всероссийская конференция-школа «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Звенигород, Россия 2010); Четвертая Международная конференция «Экстракция органических соединений» (Воронеж, Россия. 2010); Пятый съезд ВМСО, 4 Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2011); Третий Всероссийский симпозиум с международным участием «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, Россия, 2011).

Вклад автора

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включённые в диссертацию, состоит в общей постановке задач, непосредственном участии в экспериментальных исследованиях, творческом участии на всех этапах исследований, обсуждении и оформлении полученных результатов и обобщении результатов исследований.

Публикации результатов

Материалы диссертации опубликованы в 30 статьях, в патенте и в более чем ВО тезисах докладов.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6-ти глав с обсуждением полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 245 страницах текста, содержит 61 таблицу и 36 рисунков.

Основное содержание работы

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы её цели и задачи, решение которых необходимо для достижения поставленных целей.

Обоснована необходимость развития направления работ по выделению следовых количеств СЛОС из больших проб органических растворов с удалением растворителя и анализом всего концентрата. Развитие этих работ актуально как для снижения пределов обнаружения заданных соединений методами ГХ-МС и элементного анализа, так и установления числа неизвестных соединений и их идентификации на следовом уровне в объектах различного происхождения.

Первая глава посвящена краткому обзору основных способов выделения следовых количеств СЛОС из органических растворов (экстрактов), полученных в результате пробоподготовки (в основном, жидкостной экстракции) и последующего анализа концентратов методами КГХ, ГХ-МС, ГХ-АЭД, определения суммарного содержания элемент-органических соединений. Рассмотрены возможности и ограничения известных методов.

В этой же главе приведен обзор литературных данных по анализу методом газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии производных таких малолетучих либо нелетучих физиологически активных соединений, как жирные, дикарбоновые, гидрокси-, окси- и аминокислоты, сахара, спирты, стеролы, нуклеозиды, стероиды. Особое внимание уделено возможности определения следов большей части из них при их совместном присутствии в водных растворах и биосредах.

Проведен также обзор литературы по возможности применения газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором (ГХ/АЭД) для определения качественного и количественного состава компонентов смесей.

Рассмотрена литература по определению суммарного содержания галоид-, фосфор-и сераорганических соединений в органических и водных растворах и зависимости сигналов АЭД по элементам от структуры аналитов. Приведен обзор литературы по определению следов органических соединений в выдыхаемом воздухе. Особое внимание уделено среднелетучим соединениям.

Во второй главе обсуждаются результаты исследования масс-спектров химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов для ПХДД, ПХБ и ХОП, условий селективного их определения в растворе на уровне следов методом ГХ-МС. Обсуждаются разработанные подходы к обнаружению этих соединений в органических и водных растворах на уровне (Ю'12-1(Г10) % и (10"13-10"и) %, соответственно. Подходы основаны на выделении 10",3-10"'2 г аналитов из больших проб органических растворов (или экстрактов из водных растворов) в предколонке без неподвижной фазы, соединённой с разделительной колонкой и линией сброса паров растворителя, с последующим разделением выделенных веществ и масс-спектральным детектированием в режиме химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов.

В этой же главе обсуждается новый метод анализа органических растворов, содержащих следы СЛОС различной полярности и летучести (хлорфенолы, ПАУ, ПХБ, ХОП), основанный на концентрировании этих растворов (метод непрерывной микрохромадистилляции (НМХД)), и анализе всего концентрата. Метод основан на выделении следовых количеств аналитов из больших проб органических растворов в процессе непрерывного ввода пробы раствора (с одновременным удалением растворителя) и потока инертного газа в камеру концентрирования (кварцевый капилляр или кварцевая трубка малого диаметра) и переносе всего концентрата в аналитическую систему термодесорбцией в потоке газа-носителя. Процесс концентрирования осуществляется вне прибора, с помощью которого после термодесорбции проводится регистрация выделенных веществ.

Третья глава посвящена разработке подходов к обнаружению следовых количеств различных нелетучих и малолетучих биологически активных органических соединений в органических, водных растворах и биосредах методом ГХ/МС после извлечения веществ из образцов и получения их термостабильных и летучих производных. Рассмотрена возможность обнаружения следов дериватов таких соединений, как органические кислоты и аминокислоты, сахара, стероиды, с использованием метода ГХ-МС (ЭИ, ХИ). Приведены результаты определения состава жирных, дикарбоновых и аминокислот в культурах клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов и показана возможность увеличения достоверности дифференциации этих клеток на основании полученных данных по составу аминокислот. В этой же главе рассмотрен способ обнаружения следовых концентраций аминокислот в водных растворах, позволяющий снизить пределы обнаружения более чем на 2 порядка. Кроме того, изучена возможность дериватизации ряда фармацевтических субстанций, с использованием различных способов дериватизации и показано, что наибольшее число из изученных соединений может быть продериватизировано с использованием реакции силилирования.

Рассмотрен новый подход к развитию высокочувствительного обнаружения следов производных нелетучих органических соединений методом хромато-масс-

спектрометрии. Этот подход основан на удалении избытка дериватизирующего реагента из реакционной смеси после проведения реакции дериватизации, его замене на легколетучий инертный растворитель, концентрировании дериватов из всего объёма пробы полученного раствора с помощью разработанного метода, основанного на НМХД и ГХ-МС анализе всего концентрата. Подход существенно расширяет возможности метода ГХ/МС благодаря снижению пределов обнаружения производных и увеличению стабильности характеристик метода во времени. С использованием этого подхода выбраны условия обнаружения следов биологически активных соединений (нуклеозиды, сахара, стероиды) рассмотренные в этой главе.

В четвёртой главе рассмотрены результаты исследования зависимости сигналов атомно-эмиссионного детектора (АЭД) для С и Н от структуры аналита и присутствия в его молекуле таких элементов, как К, О, Б, С1, Вг, I, Р и 8. Предложен подход, сочетающий преимущества разработанного метода концентрирования основанного на НМХД и метода ГХ/АЭД для обнаружения следовых количеств среднелетучих соединений. Подход позволил снизить пределы обнаружения метода ГХ/АЭД более чем на 2 порядка. В этой же главе приведены результаты исследования по определению элементного состава компонентов смесей углеводоров и их количественного состава без градуировки по каждому компоненту при использовании усовершенствованного метода ГХ-АЭД, позволяющего минимизировать зависимость сигнала АЭД по каналам С и Н от структуры и элементного состава молекул. Рассмотрен новый подход к идентификации компонентов смесей на следовом уровне, основанный на выделении компонентов из органического раствора (экстракта) в процессе НМХД, анализе всего концентрата методами ГХ/МС (ХИ, ЭИ) и ГХ/АЭД и совместном использовании полученных данных о молекулярной массе компонента, присутствующих в молекуле элементах и масс-спектре электронной ионизации.

Пятая глава посвящена разработке способа быстрого скрининга проб органических и водных растворов на суммарное содержание галоген-, фосфор- и сера-органических соединений на уровне следов и новых подходов к эколого-аналитическому контролю и обнаружению опасных органических соединений в различных матрицах.

В шестой главе приведены результаты исследования состава неизвестных среднелетучих органических соединений на уровне следов в конденсате выдыхаемого воздуха человека, полученные при использовании разработанного метода концентрирования в процессе НМХД и анализа всего концентрата методом, ГХ-МС (ЭИ, ХИ). Проведено сопоставление результатов анализа образцов конденсата выдыхаемого воздуха по обнаруженным соединениям, собранных у групп здоровых людей и больных бронхиальной астмой и ХОБЛ. Показано, что такое сопоставление помогает увеличить достоверность дифференциации здоровых и больных этими заболеваниями при диагностике. В этой главе представлен новый подход к определению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях и фармпрепаратах на их основе. Подход основан на жидкостной экстракции растворителем, не растворяющим основной компонент, концентрировании полученного экстракта в процессе НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата аналитов. Подход позволяет зарегистрировать большее

число примесей, по сравнению с существующими решениями задачи обнаружения термостабильных и летучих примесей в фармпрепаратах.

1. Новые подходы к концентрнрованию органических растворов ультрамалых количеств среднелетучих органических соединений и ГХ-МС аналнзу всего концентрата аналнтов

1.1. Подход к обнаружению ПХДД, ПХБ н ХОП в органических растворах на уровне 10"п - 10"'° %, и в модельных водных растворах на уровне 10'13 - 10'11 %, демонстрирующий принципиальную возможность обнаружения СЛОС на столь низком уровне при сочетании концентрирования органических растворов аналнтов и анализа всего концентрата методом ГХ/МС

Определение СЛОС на уровне ниже в воде, и органических растворах

(экстрактах) требует предварительного выделения и концентрирования. В большинстве случаев для извлечения таких соединений из вод и других сред используется жидкостная экстракция с последующим упариванием. Объектом исследования является органический раствор (экстракт) объём которого составляет до 1 мл; при этом анализу подлежит лишь 0.001-0.01 часть конечного объёма экстракта. Актуальной задачей является разработка способов концентрирования больших проб органических растворов следов СЛОС и ГХ-МС анализа всего концентрата аналитов.

В этой главе с использованием большого числа модельных соединений (больше 130) таких, как ПХДД, ПХБ и ХОП на основании изучения масс-спектров их химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов и выбора условий газо-хроматографического разделения разработан подход к их обнаружению при совместном присутствии в растворе на уровне 10"п- 10"12 г в пробе методом ГХ-МС с химической ионизацией и регистрацией отрицательных ионов (СГ, М").

Показано, что общепринятый вариант концентрирования в газовом хроматографе не применим как при дискретной так и (особенно) при непрерывной подаче пробы раствора в ГХ с масс-спектральным детектором в связи с попаданием большой доли паров растворителя в разделительную колонку и масс-спектрометр.

Разработан подход к концентрированию больших проб органических растворов (экстрактов), содержащих следовые количества

(10'13 - Ю-12 г) органических соединений. Подход основан на удалении основной массы паров растворителя при непрерывной подаче пробы раствора в зону концентрирования (предколонку без неподвижной фазы, соединённую с разделительной колонкой и линией сброса паров растворителя) до разделительной колонки и анализе сконцентрированных веществ при увеличении температуры термостата по оптимизированной температурной программе. С целью минимизации потока паров растворителя в разделительную колонку и масс-спектрометр на выходе из предколонки включён форвакуумный насос (подключён к линии сброса паров растворителя).

При использовании предложенного подхода к концентрированию больших проб органических растворов следов ПХДД, ПХБ и ХОП внутри термостата хромато-масс-спектрометра и предложенного подхода к обнаружению этих веществ при совместном присутствии на уровне 10"13 - 10"'2 г, была показана принципиальная возможность быстрого скрининга органических растворов на содержание ПХДД, ПХБ и ХОП на уровне 10"12 - Ю"10 %, при условии отсутствия (или устранения) мешающих компонентов матрицы.

Соответствующие данные по пределам обнаружения, полученные для различных ПХДД, приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Пределы обнаружения различных ПХДД при концентрировании проб гексанового раствора объёмом 10 и 400 мкл внутри термостата хроматографа и ГХ/МС (ХИ) анализе всего концентрата с регистрацией ионов 3}СГ_

№ Название Предел обнаружения, хЮ'15, г Предел обнаружения, хЮ"10, %

Объём пробы, мкл Объём пробы, мкл

10 400 10 400

1 Тетра ХДД 50 40 7.1 0.14

2 ПентаХДД 20 10 2.9 0.04

3 ГексаХДД 20 10 2.9 0.04

4 Гепта ХДД 30 20 4.3 0.07

5 Окта ХДД 600 500 86.0 1.80

Подход к обнаружению ультраследовых содержаний ПХДД, ПХБ и ХОП при их совместном присутствии в органических растворах позволил приступить к исследованию по обнаружению этих соединений на ультраследовом уровне и в водных растворах. Была изучена степень извлечения рассматриваемых соединений при использовании микрожидкостной экстракции (соотношение водный раствор/гексан, равное 100:1). Объём водного раствора был равен 40 мл. Вода предварительно была тщательно очищена от фонового содержания хлорорганики с использованием очищенного активированного угля.

В результате проведенных исследований был предложен быстрый скрининг проб водных растворов (свободных от мешающих компонентов матрицы) на содержание ПХДД, ПХБ и ХОП, основанный на микрожидкостной экстракции, концентрировании экстрактов и ГХ/МС анализе в режиме химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов всего концентрата аналитов. Пределы обнаружения, полученные для ряда ХОП, приведены в Таблице 2.

Пределы обнаружения для ПХДД и ПХБ составили 2.5*10"13 - 1.3x10""%, и 10"13 -10"п%, соответственно. Время одного определения не превышало 30 мин.

Концентрирование больших проб органических растворов следов СЛОС внутри термостата газового хромато-масс-спектрометра и анализ всего концентрата методом ГХ/МС позволили предложить подходы к быстрому скринингу органических и водных растворов на содержание наиболее опасных ксенобиотиков на уровне ПДК и ниже, при совместном присутствии в смеси (при условии отсутствия влияния мешающих компонентов матрицы). На примере хлорированных токсикантов была показана принципиальная возможность достижения столь низких пределов обнаружения органических соединений в водных и органических растворах при применении разработанного подхода.

Разработка обеспечила возможность снижения пределов обнаружения других СЛОС на 2-3 порядка, по сравнению со стандартными методами. Однако этому подходу присущи определённые ограничения:

• он применим только для анализа очищенных экстрактов с малым содержанием малолетучих и нелетучих неопределяемых примесей;

• объединение стадии концентрирования и стадии анализа снижает производительность последних; концентрирование проводится только в данном

приборе, концентрат не может быть проанализирован другим методом или на другом ГХ/МС приборе; • попадание части (хотя и небольшой) паров растворителя в масс-спектрометр.

Таблица 2. Пределы обнаружения нормированных в воде ХОП по концентрации, полученные при анализе предложенным способом__

№ Название соединения Концентрация в воде, х10"13% Предел обнаружения, *10"13% (8/М=10:1)

1 1,2,3,4-тетрахлорбензол 240 21

2 а-хлорциклогексан 210 15

3 гексахлорбензол 240 45

4 Р-гексахлорциклогексан 250 6

5 у-гексахлорциклогексан 200 6

6 гептахлор 210 3

7 альдрин 240 3

8 гептахлорэпоксид 320 3

9 кельтан 350 3

10 ддд 230 6

11 ддт 170 3

1.2. Разработка метода аналнза органических растворов следовых количеств СЛОС, основанного на концентрировании растворов в процессе непрерывной микрохромаднстнлляцни и анализе всего концентрата аналнтов методом ГХ-МС после перевода концентрата в прибор термодесорбцней

В связи с этим было проведено следующее исследование возможности концентрирования больших проб органических растворов следов СЛОС и анализа всего концентрата. Следовые количества аналитов из органических растворов выделяли в процессе непрерывной подачи с постоянной скоростью пробы раствора (с одновременным удалением паров растворителя) и потока инертного газа в камеру концентрирования (кварцевый капилляр или кварцевая трубка малого диаметра). После завершения концентрирования пробы раствора (объём пробы до 500 мкл) весь концентрат, свободный от растворителя, переносили из камеры концентрирования в инжектор хроматографа или непосредственно в капиллярную колонку термодесорбцией в потоке газа-носителя и анализировали методом ГХ/МС. Процесс концентрирования осуществляли вне прибора, с помощью которого после термодесорбции проводили обнаружение выделенных веществ. Внутри камеры концентрирования осуществлялось распыление органического раствора с образованием капель на стенках камеры и паров в газовой фазе. В случае выделения из раствора в камере концентрирования более летучих СЛОС, на выходе из неё, помещали небольшое количество сорбента (миллиграммы).

Исследование проводили при использовании гексановых растворов таких соединений, как ПАУ, ПХБ, ПХДД, ХОП, алкил-фенолы, хлорфенолы, нитрофенол, хлоранилин, содержание которых в пробе составляло Ю"10 - 10"8 г.

Необходимым условием концентрирования, как показал эксперимент, было наличие жидкой фазы раствора внутри камеры концентрирования (на её стенках) и отсутствие таковой на выходе из неё.

Камеру испарения и концентрирования помещали в металлический контейнер (картридж) цилиндрической формы. Картридж обеспечивал возможность подачи потоков инертного газа и органического раствора в камеру при концентрировании определяемых веществ. Он же соединялся с инжектором газового хроматографа через иглу, либо непосредственно с разделительной капиллярной колонкой для проведения термодесорбции концентрата аналитов в потоке газа-носителя (гелия).

Исследование концентрирования органических растворов определяемых веществ включало следующие этапы:

• выбор сорбента (и его количества), который бы обладал минимальной остаточной сорбцией аналитов, и, в то же время, способствовал выделению их следовых количеств из потока парогазовой смеси;

• изучение степени термодесорбции с сорбента следовых количеств всех соединений, выбранных в качестве модельных;

• изучение зависимости степени переноса аналитов из пробы органического раствора в ГХ/МС, от объёма пробы раствора, подаваемого в камеру концентрирования, от скорости его подачи, от скорости потока инертного газа; выбор оптимальных скоростей раствора и инертного газа;

• уменьшение размеров камеры концентрирования с оптимизацией всех вышеперечисленных параметров.

Изучены такие сорбенты, как кварцевые шарики с 1% НФ, Хромосорб в с 3% НФ, сверхтонкое кварцевое волокно (СКВ), обработанное диметилдихлорсиланом. В роли камеры концентрирования выступали кварцевые трубки различного внутреннего диаметра (от 5 до 1 мм), длиной от 30 до 100 мм. Слой сорбента составлял до 'Л длины трубки.

В результате проведенных исследований в качестве сорбента было выбрано СКВ. Изучение условий термодесорбции ПАУ, ПХБ, ПХДЦ, ХОП и СЛОС различной полярности (для 10'8 - 10"9 г) показало, что степень термодесорбции для всех изученных СЛОС (36 соединений) составила в большинстве случаев около 100%. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3. Степень термодесорбции ряда ПАУ, ПХБ, ХОП, ПХДЦ с СКВ (Р=0.95, п=3)_

Название соединения Степень термодесорбции, %

Количество вещества

пх10"уг пх10"8г

бифенил 94±5 95±6

Бенз(а)пирен 96±7 98±7

2-хлорбифенил 97±6 99±6

2,2',3,3',4,5',6,6'-октахлорбифенил 97±6 96±7

1,2,3,4-тетрахлорбензол 96±6 98±6

ДДТ 97±6 96±7

1,3,7,8-тетраХДЦ 98±5 97±6

Окта-ХДЦ 98±7 97±6

В качестве модельных веществ отбирали аналиты, температуры кипения которых охватывали весь диапазон для СЛОС.

Таблица 4. Степень термодесорбции модельной смеси среднелетучих нормируемых

Название соединения Степень термодесорбции, %

Количество вещества

пх10-9г пх10 г

фенол 78±5 80±6

2-метилфенол 76±5 84±5

3-метилфенол 85±5 89±6

4-метилфенол 85±6 89±5

Бензойная кислота 95±5 97±5

4-хлорфенол 97±6 96±6

4-хлранилин 96±6 98±5

4-нитрофенол 99±7 101±6

пентахлрфенол 98±7 100±6

Ди-н-бутилфталат 99±6 99±7

Степень извлечения изученных аналитов из пробы органического раствора объёмом 100 мкл (с учётом степени термодесорбции), как показал эксперимент, практически не зависела от скорости потока инертного газа (100 - 480 см3/мин) и для большинства изученных СЛОС составила около 100 %. Результаты представлены в таблице 5. Таблица 5. Зависимость степени переноса ПХБ в ГХ/МС при концентрировании

Название соединения Степень переноса, %

Скорость потока инертного газа, см3/мин

480 340 200 100

2-хлорбифенил 22±5 38±5 60±5 96±5

2,3-дихлорбифенил 65±7 87±б 95±5 102±4

2,4,5-трихлорбифенил 93±6 95±6 96±5 95±5

2,2',3,4,6-тетрахлорбифенил 96±4 97±5 98±4 93±6

2,2',4,4'-пентахлорбифенил 91 ±5 98±5 99±6 99±7

2,2',4,4',5,6'-гексахлорбифенил 98±5 100±6 100±5 101±5

2,2',3,3',4,4',6-гептахлорбифенил 97±5 99±6 98±6 102±6

2,2',3,3',4,5',6,6'-октахлорбифенил 98±5 98±6 101±5 103±6

Оптимальной скоростью подачи инертного газа была выбрана скорость, равная 100 см3/мин, а оптимальной скоростью потока органического раствора -100 мкл/мин.

При оптимальных скоростях потоков органического раствора и инертного газа, подаваемых в камеру концентрирования, была изучена зависимость степени переноса из пробы органического раствора в ГХ/МС от объёма концентрируемой пробы ряда ПАУ, ПХБ, ХОП и ПХДД. Полученные данные (количество каждого из веществ -около 10'9 г) приведены в Таблице 6.

В результате проведенных исследований с использованием большого числа модельных СЛОС, отличающихся по летучести и полярности, разработан метод анализа больших проб органических растворов, содержащих следы таких соединений.

Таблица 6. Зависимость степени переноса ряда ПАУ, ПХБ, ХОП и ПХДД из пробы

Название соединения Степень переноса, %

Объём анализируемой пробы, мкл

100 200 300

Бифенил 93±7 91±7 93±6

Бенз(а)пирен 101±6 102±6 98±7

2-хлорбифенил 98±7 96±6 95±6

2,2',3,3',4,5',6,6'-октахлорбифенил 101±6 103±6 102±7

1,2,3,4-тетрахлорбензол 96±6 95±6 96±6

ддт 96±6 99±6 97±6

1,3,7,8-тетраХДД 98±6 99±6 97±6

октаХДД 98±6 97±7 95±6

Метод основан на выделении всего количества искомых соединений из органических растворов, на переводе свободных от растворителя аналитов термодесорбцией из камеры концентрирования в газовый хроматограф и на их анализе методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Извлечение следов веществ из растворов проводили вне приборов.

С нашей точки зрения процесс отделения следовых количеств (пг - нг) СЛОС от органического растворителя в разработанном методе может быть описан в виде непрерывной микрохромадистилляции (НМХД). Дискретный вариант изотермической хромадистилляции был описан A.A. Жуковицким (ДИХД). В отличие от ДИХД, в рассматриваемом случае проба раствора подается непрерывно в камеру концентрирования вместе с потоком инертного газа, в которой происходит распыление раствора с образованием парогазовой смеси в присутствии жидкой фазы раствора, попавшей на стенки камеры, и небольшого количества инертного сорбента на выходе из камеры. Выбираются такие потоки органического раствора и инертного газа, чтобы на выход из камеры концентрирования поступала только парогазовая смесь, а примеси определяемых веществ концентрировались внутри камеры. Кроме того, размеры камеры концентрирования и, соответственно, площадь на которой распределяется жидкая фаза раствора в случае НМХД как минимум на два порядка меньше (по этой причине в названии появилось слово микро).

Выделение примесей из раствора происходит при комнатной температуре и ниже как благодаря процессу изотермической хромадистилляции (тяжёлые примеси выделяются в основном в начале камеры испарения на инертной поверхности кварца), так и процессу ограничительной хромадистилляции и неэффективной хроматографии на инертном сорбенте (помещённом на выходе из камеры). Этот сорбент должен обеспечивать возможность селективного отделения от растворителя следовых количеств (пг - нг) СЛОС различной полярности и летучести во время удаления из камеры концентрирования остатков растворителя и должен обеспечивать возможность извлечения из него этих веществ во время их перевода в аналитическую систему термодесорбцией.

При дискретной изотермической хромадистилляции, проба раствора наносится дискретно на инерный носитель (либо капиллярную колонку большой длины (порядка десяти метров), свободную от неподвижной фазы). Далее колонка

продувается инертным газом до удаления большей части растворителя из нанесённой пробы раствора. В этом случае, согласно А. А. Жуховицкому, может быть записано уравнение баланса для растворителя (концентрация которого в растворе » концентрации примесей): QP = CipxVxt (1)

Где Qp - количество органического раствора (растворителя), г, нанесённого на инертный носитель; С, - концентрация паров растворителя в газовом потоке, г/см3 V - объёмная скорость инертного газа, см3/мин, подаваемого в колонку; t - время, в течение которого производится испарение растворителя. Полное удаление растворителя в процессе концентрирования этим методом не производится.

При выделении следовых количеств CJ10C (температура кипения которых много больше температуры кипения растворителя) и концентрация которых в растворе на многие порядки меньше концентрации растворителя, количество испаряемого растворителя примерно соответствует количеству раствора.

В предлагаемом методе НМХД удаление растворителя осуществляется в большой степени в результате процесса непрерывной изотермической микрохромадистилляции (НИТМХД) в коротком инертном кварцевом капилляре, при непрерывной подаче в него потоков пробы раствора (экстракта) и инертного газа. Этот процесс может быть описан следующим неравенством: Qp/tonT<CipxVonT (2)

где Qp/tonT - количество органического раствора (растворителя), поступающего в камеру концентрирования, г/мин;

Vom - скорость газа-носителя, при которой при выбранной скорости подачи раствора, на выход из камеры концентрирования поступает только парогазовая смесь;

tonr - выбранное оптимальное время концентрирования (подачи пробы раствора и удаления растворителя).

При заданном количестве раствора, выбираются оптимальные значения tom. и VonT, при которых отсутствует проскок жидкой фазы на выходе из камеры концентрирования, т.е. на выходе - только парогазовая смесь. Необходимые условия осуществления этого процесса в режиме НИТМХД:

• отсутствие жидкости на выходе из камеры концентрирования (только паро-газовая смесь);

• наличие небольшого количества жидкости в этой камере в процессе концентрирования (для обеспечения процесса НИТМХД), которая испаряется потоком инертного газа при окончании подачи органического раствора в камеру;

• отсутствие потерь выделяемых примесей в процессе концентрирования;

• инертность поверхности кварца по отношению к следовым количествам аналитов. Эти условия реализуются на практике при выборе соответствующего растворителя

(экстрагента) и потоков органического раствора и инертного газа в камеру концентрирования в случае большого различия в упругости пара растворителя и примесей, инертности поверхности кварца по отношению к аналитам и отсутствии влияния растворителя на процесс отделения примесей от растворителя методом НИТМХД.

В последнем случае имеется в виду отсутствие размывания зоны растворителя в процессе испарения и отделения примесей от него (и разделения их между собой благодаря процессу газовой хроматографии с подвижной/неподвижной фазой, роль которой играет растворитель, и вызванного этим процессом дополнительного размывания зон примесей). Этот процесс, в нашем случае, минимизирован благодаря большой скорости потока инертного газа, подаваемого в камеру концентрирования.

В качестве растворителя-экстрагента выбирается один из общепринятых растворителей, применяемых при жидкостной экстракции - наиболее летучий и наиболее чистый. Этим требованиям при решении различных задач отвечали спектроскопически чистые гексан, хлороформ, пентан, дихлорметан, метилтретбутиловый эфир.

При выбранных параметрах образования парогазовой смеси, обеспечивающих удаление растворителя из раствора в режиме НИТМХД за оптимальное время, выбранные скорости потоков инертного газа и органического раствора соответствуют Vom И Qp/toirr-

Допустим, что количество примеси в пробе органического раствора, поступающего на концентрирование, равно q;.

Скорость переноса испаряемого количества примеси ЯшрЛопт парогазовой смесью при выбранных для растворителя скорости потоков инертного газа V0OT. и органического раствора Qp/torrr и давлении насыщенного пара примеси Cinp будет описываться таким же уравнением баланса, как и в случае растворителя:

ЯшрАопт ~~ Я1пр(пар/^опт ~ Cinp* VorrT (3)

где qinp - количество примеси, г, переносимое в парогазовой смеси в процессе удаления растворителя в режиме НИТМХД;

torn - выбранное оптимальное время подачи раствора с удалением растворителя в виде парогазовой смеси, мин.

Cinp - концентрация паров примеси в газовой фазе, соответствующая давлению насыщенного пара примеси;

Vom. - выбранная оптимальная скорость потока инертного газа, см3/мин в парогазовой смеси, сформированной в основном растворителем.

Так как tonT и VonT в случае растворителя и примеси одни и те же, то

qi„p/Qp = Cinp/Cip=PVp°xp (4)

или

q,np = PVpVQp (5)

где Р°хр и Р°хпр - давления насыщенного пара растворителя и примеси, соответственно.

Т.е. количество примеси, уносимое с парами растворителя в парогазовой смеси тем меньше, чем меньше Р°хпр (при P°xp=const).

При qjnp<qi почти вся примесь переводится в паровую фазу и уносится парогазовой смесью (в режиме НИТМХД).

При qi»qjnp примесь сконцентрируется в начальной части камеры концентрирования за счёт процесса (НИТМХД).

Время концентрирования в режиме НИТМХД определяется объёмом органического раствора (экстракта), временем его подачи и удаления растворителя потоком инертного газа. Последнее несколько превышает время подачи раствора и испарения

растворителя, рассчитанное из уравнения (2) в связи с тем, что для полного удаления растворителя необходимо небольшое время после испарения основной его массы. Это время определялось исходя из необходимости минимизации потерь наиболее летучего CJIOC, присутствующего в смеси, и компонентов, концентрация которых в смеси наименьшая.

Предел обнаружения по массе при прямом определении CJIOC методом ГХ/МС в органических растворах составляет в общем случае при регистрации суммарного ионного тока около Ю"10 г (при объёме пробы - 1 мкл). Для достижения более низких пределов обнаружения по концентрации необходимо концентрирование растворов определяемых веществ. При пробе объёмом 0.1 - 1мл и анализе всего концентрата предел обнаружения должен составлять Ю-7 - 10"8 %, соответственно, при количественном выделении определяемых веществ. При этом количество аналита в объёме анализируемой пробы составляет те же Ю'10 г. При регистрации в режиме селективного ионного детектирования предел обнаружения может достигать 10'" -10" 12 г/мкл и ниже для заданных соединений.

Необходимым условием концентрирования следов примесей из органического раствора в соответствии с методом НИТМХД является не только большое различие в упругостях пара растворителя и примеси, но и присутствие примеси в пробе раствора в количествах qM не испаряемых за время удаления растворителя в процессе концентрирования.

При количественном извлечении примесей методом НИТХД достаточно, чтобы 4inpS0.01q; Для qi = 10"'° г испаряемое количество примеси qinp должно быть <10'12 г. Для Qp = 0.1 г и q,np = Ю-12 г; Р°хпр/ Р% < 10"11.

Такому значению, соответствует случай, как показывают расчёты, когда растворителем является гексан, а примесью - н-алкан С2з с Ткип = 382°С, проба раствора - 0.1 г и расходы органического раствора и инертного газа равны при этом 0.02 г/мин и 100 см3/мин, соответственно.

Рассмотрим на примере ряда н-алканов, для которых известны либо могут быть рассчитаны давления насыщенного пара при разных температурах, зависимость количества примеси, уносимого парогазовой смесью за время удаления растворителя, в процессе НИТХД вместе с растворителем (гексан), от Ткип примеси и её упругости пара (Р°хпр). Примем величину пробы раствора, подаваемого на концентрирование, равной 0.1 г (около 100 мкл), VonT = 100 см3/мин; время подачи пробы раствора -около 5 мин; количество примеси в растворе q, = 10"9-10'12 г. Соответствующие данные приведены в таблице 7.

Изучение зависимости количества примеси, уносимого парогазовой смесью за время удаления растворителя (гексан) в процессе ННТМХД вместе с растворителем от Ткип примеси и её упругости пара (Р°хпр), проведенное нами для н-алканов, для которых известны либо могут быть рассчитаны Р°х, при разных температурах показало, что количественное выделение следов CJIOC из органического раствора при использовании только метода НИТМХД в случае q¡= 10"9 г возможно для веществ с Ткип>345°С, а в случае q,=10"u - 10"12 г - для веществ с Ткип>405°С (проба раствора - 100 мг, Уопт=100 см3/мин, и время подачи раствора - около 5 мин).

Таблица 7. Отношение испаряемого количества примеси к его количеству в растворе, д.пр/ д, для ряда н-алканов, растворённых в гексане_

г

а «

о ч Ч о

Ы О, Я V

г о

)Е О В

о н

и С5 .

в В 1 Ч

я — а Ь

щ и % О,

ч Э г

® _ 5

я Й = 1

в За.

№ "Ч.

с-

II

О

I •

г и

В и

в. О о. в о, н 5? В

Отношение испаряемого количества примеси к его количеству в растворе, ^„р/

ЧгЮ"иг

68.7

121

Сп

235

2.1x10

1.75x10

1.75x10

1.75x10*

2.85х10"7

С16

287

3.45x10

2.85x10""

285

1.94Х10'3

1.6х10"7

Си

317

1.6x10"

16

3.47x10"" 6.53x10"'"

331

4.02x10"' 7.9x10"'

3.47x10"

3.47

6.53x10"'

34.7

6.53хЮ2

С20

345

6.53x10

6.53

65.3

С23

382

3.49x10

2.88x10"

2.88x10"'

2.88x10"'

2.88x10

2.88x10"'

7ГГ

4.46x10-"

4.46хЮ"И 4.0Х10"16

С25

405

5.4x10'

4.46x10

4.46x10

^ПГ

4.46x10' 4.0x10"5

4.46x10 4-ОхЮ*4

С27

427

4.84x10'

4.0x10"'

4.0x10'

4.0x10

При концентрировании высококипящих соединений, (которые могут быть проанализированы методом ГХ) содержащих в молекуле полярные -ОН, ->Ш2, -СООН, -БН и другие фукциональные группы с подвижными атомами водорода, для обеспечения количественной термодесорбции следовых количеств таких веществ внутренняя поверхность кварцевого капилляра дезактивируется (силанизируется). Кроме того, в случае следов как малолетучих, так и особенно нелетучих соединений, содержащих в молекуле такие функциональные группы, проводится их превращение (дериватизация) в менее полярные и более летучие и термостабильные соединения с использованием соответствующих реагентов и условий проведения реакций.

Существенное достоинство способа концентрирования, основанного только на НИТМХД - возможность выделения и переноса в аналитическую систему следовых (пг - нг) количеств заданных высококипящих СЛОС без использования сорбента.

В то же время, наряду с достоинством, этому способу присуще существенное ограничение при концентрировании следов СЛОС, кипящих в широком диапазоне температур, особенно когда состав примесей неизвестен.

В связи с этим предлагаемый метод включает концентрирование, основанное, как на НИТМХД, так и на ограничительной хромадистилляции и неэффективной хроматографии (НХ) в присутствии сорбента. Стадия ограничительной хромадистилляции появляется в случае присутствия сорбента, когда образующаяся на сорбенте в результате динамической конденсации насыщенных паров органического растворителя его жидкая фаза играет роль ограничителя и способствует дополнительному отделению аналитов от растворителя..

Для большинства изученных нами СЛОС различной летучести в качестве сорбента использовали СКВ (сверхтонкое кварцевое волокно). В этом случае, как было

показано экспериментально, количественное извлечение и перенос термодесорбцией был возможен для веществ с Ткип>250°С. В ряде случаев, когда необходимо было выделение следов более летучих СЛОС, в качестве сорбента использовали полимерный сорбент Тепах (в сочетании с СКВ). Сочетание НИТМХД, ОХД и НХ позволяет расширить диапазон концентрируемых СЛОС в сторону более легколетучих.

При осуществлении концентрирования в соответствии с предложенным методом, основанным на сочетании НИТМХД, ОХД и НХ, уравнение баланса для растворителя аналогично уравнению (2). Это связано с тем, что на выходе из слоя сорбента так же парогазовая смесь, сформированная в процессе НИТМХД из паров растворителя и инертного газа, но в этой смеси отсутствуют пары примесей, выделившиеся из неё благодаря ОХД и НХ.

В этом случае количество примеси, переведённое в пар ^|Пр), равно этому же количеству, выделенному на сорбенте (я,пр с); т.е. Яшр — Чшр.с (б)

Потери СЛОС, связанные с процессом испарения и уносом парогазовой смесью при НИТМХД, в этом случае отсутствуют. Сорбент позволяет, что особенно важно, расширить диапазон не только Ткип, но и следовых количеств СЛОС, выделяемых из органических растворов, в сторону пикограммовых количеств (что для многих СЛОС невозможно при их выделении только методом НИТМХД). В этом случае испаряемые количества следов аналитов выделяются на сорбенте в широком диапазоне количеств и не уносятся парогазовой смесью.

Важным этапом предложенного метода концентрирования следовых количеств СЛОС из органических растворов является их перевод термодесорбцией в аналитическую систему в потоке газа-носителя;

• в случае хромато-масс-спектрометра и хроматографа с атомно-эмиссионным детектором - в инжектор хроматографа либо непосредственно в разделительную капиллярную колонку при оптимальной скорости газа-носителя через неё;

• в случае элементного анализатора - потоком гелия, поступающим в поток кислорода (в этом случае скорость Не значительно больше чем в случае десорбции в хроматограф);

Температура термодесорбции должна обеспечивать быстрый перевод аналитов, выделенных из органического раствора, в аналитическую систему при оптимальной скорости газа-носителя.

Главный критерий выбора условий выделения следов СЛОС предлагаемым методом из органического раствора - степень извлечения аналита из органического раствора и его переноса в аналитическую систему термодесорбцией в потоке газа-носителя. Ъ=8оЯп*100 (7)

Где 11;- степень выделения ¡-того аналита из органического раствора и его переноса в аналитическую систему. Бп и 812, - площади пиков, зарегистрированные при прямом вводе пробы органического раствора объёмом 1 мкл в инжектор хроматографа и при анализе большой пробы этого раствора, содержащей то же количество аналита, что и 1 мкл, соответственно. При количественном выделении аналита из органического раствора и его переносе в аналитическую систему Я, должна быть около 100%.

В данном исследовании применяли широкий круг модельных СЛОС различной полярности и летучести. В связи с этим было выдвинуто предположение о том, что разработанный метод анализа применим как для изученных, так и других СЛОС, которые могут быть обнаружены методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии. '

При извлечении заданных компонентов из органического раствора конкретные условия концентрирования (наличие либо отсутствие сорбента, его тип, его количество, объём пробы, скорости потоков раствора и инертного газа, условия перевода концентрата в аналитическую систему) выбираются исходя:

• из Ткип растворителя и заданных аналитов (их упругостей пара при комнатной температуре);

• предполагаемых концентраций аналитов в пробе и пределов их детектирования;

• из обеспечения условий, исключающих появление жидкости на выходе из камеры концентрирования;

• из условий, обеспечивающих удаление растворителя в процессе концентрирования и количественный перенос следов аналитов из пробы в аналитическую систему.

В случае смесей неизвестного качественного и количественного состава, о которых имеется лишь какая-либо предположительная информация, процесс концентрирования оптимизируется с использованием смесей модельных соединений, отличающихся по полярности и летучести, предполагаемых в пробе, содержание которых в пробе составляет 10"12-10"9 г/мкл.

При отсутствии какой-либо предварительной информации о составе выделяемых аналитов, концентрирование проводится и при НИТМХД, и при сочетании НИТМХД, ОХД и НХ (далее режим непрерывной микрохромодистилляции (НМХД) в отсутствие или при наличии сорбента).

При выделении примесей СЛОС из воды использовали жидкостную экстракцию (с высаливанием). Предпочтение отдавали, когда это возможно, микрожидкостной экстракции в связи с возможностью анализа всего объёма микроэкстракта с применением предлагаемого метода анализа без предварительного упаривания, которое может приводить к искажению состава пробы.

При выделении следов аналитов из твёрдой матрицы, в частности из фармпрепаратов, использовали, когда это было возможно, растворитель, минимально растворяющий основной компонент (с дальнейшим концентрированием экстракта в режиме НМХД) - с целью увеличения селективности выделения примесей аналитов, увеличения числа регистрируемых примесей и снижения их пределов обнаружения.

Достоинства разработанного метода концентрирования больших проб органических растворов следов СЛОС в режиме НМХД:

• метод позволяет проводить концентрирование органических растворов среднелетучих органических соединений, кипящих в широком диапазоне температур и отличающихся по полярности и летучести и анализировать весь концентрат;

• в результате концентрирования выделяется смесь аналитов, практически свободная от растворителя, благодаря чему обеспечиваются условия анализа, позволяющие достичь минимальных пределов обнаружения;

• минимизируется загрязнение разделительной колонки и инжектора малолетучими или нелетучими примесями благодаря их удерживанию в камере концентрирования;

• метод может быть использован для анализа всего концентрата аналитов не только методом ГХ/МС, но и другими методами;

• метод позволяет зарегистрировать большее число известных и неизвестных примесей в объектах исследования, снизить предел обнаружения на 2-3 порядка, по сравнению с существующими способами;

• метод позволяет снизить пределы обнаружения при использовании масс-спектрометров с ионной ловушкой за счёт ионизации только аналитов (в отсутствие паров растворителя) и уменьшить искажение масс-спектров, свойственное этому анализатору (по сравнению с квадрупольным анализатором);

• метод может быть использован для быстрого скрининга проб вод (но не сточных) на содержание заданных соединений при проведении микрожидкостной экстракции и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов.

Для реализации разработанного метода концентрирования органических растворов различных СЛОС были разработаны и использованы следующие способы выделения аналитов из органических растворов и перевода всего концентрата в аналитическую систему и соответствующие устройства:

• концентрирование органического раствора аналитов в кварцевой трубке (лайнере) с сорбентом с последующим её переносом в инжектор хроматографа;

• концентрирование аналитов в кварцевой трубке с сорбентом, помещённой в специальный металлический картридж (либо в окварцованном изнутри металлическом картридже с сорбентом), с последующим переносом концентрата аналитов термодесорбцией в потоке газа-носителя в анализирующий прибор.

С использованием разработанного метода концентрирования органических растворов следов СЛОС разработан ряд новых способов концентрирования следов малолетучих и нелетучих органических соединений и их анализа, позволивших решить ряд актуальных задач по обнаружению следов заданных и неизвестных соединений в различных матрицах, рассмотренных ниже.

Эти способы отличались условиями выделения аналитов, применяемым сорбентом, его количеством (либо сорбцией на внутренней поверхности кварцевой трубки), условиями перевода в аналитическую систему термодесорбцией в потоке газа-носителя и условиями соответствующего метода анализа.

2. Расширение возможностей метода ГХ/МС для обнаружения следов малолетучих п нелетучих органических соединений в органических, водных растворах и биосредах методом ГХ/МС

2.1. Обнаружение следовых концентраций различных органических кислот, Сахаров и спиртов в водных растворах методом ГХ/МС

При исследовании состава смесей соединений, образующихся в процессе роста бактерий требуется установление состава таких соединений, как жирные, дикарбоновые, окси- и аминокислоты, сахара, стеролы на следовом уровне. Установление состава смесей ряда из рассмотренных соединений на уровне следов (в частности, аминокислот) требуется и при изучении жизнедеятельности клеток.

К началу настоящего исследования работы по установлению состава смесей рассмотренных соединений при их совместном присутствии на уровне 10"12 - 10"9 г в анализируемой пробе не были известны.

Изучены условия получения силильных производных для следовых количеств около 60-ти малолетучих и нелетучих различных жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стиролов в органических растворах при использовании различных силлилирующих реагентов (БСТФА, МТБСТФА) и растворителей. Выбраны оптимальные условия дериватизации рассмотренных соединений при их совместном присутствии в смеси, выявлены возможности и ограничения.

Показано, что только при использовании МТБСТФА возможно получение стабильных во времени летучих производных всех изученных (17) аминокислот.

Изучены условия дериватизации следов жирных, дикарбоновых и аминокислот в водно-органических растворах с использованием изобутил-хлорформиата (ИБХФ) в смеси с изобутанолом либо гептафторбутанолом (ГФБ) и выбраны оптимальные условия дериватизации и жидкостной экстракции полученных производных.

Изучены масс-спектры электронной и химической ионизации для следовых количеств всех полученных производных определяемых соединений; определены пределы детектирования в режиме регистрации суммарного ионного тока и селективного ионного детектирования, которые составили 10"12 -10"' г (в зависимости от соединения, способа ионизации и регистрации ионов).

Предложен новый подход к определению следовых содержаний жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стиролов при их одновременном присутствии в водном растворе. Он основан на получении для одной части исследуемого образца ТМС-производных после взаимодействия со смесью БСТФА с пиридином (после высушивания водной пробы), а для другой - ИБОК-ГФБ-эфиров всех аминокислот (кроме аргинина), и ГФБ-эфиров и диГФБ-эфиров для всех жирных и дикарбоновых кислот в водно-органическом растворе после дериватизации смесью ИБХФ и ГФБ. Растворы полученных производных анализировали методом ГХ/МС.

С использованием разработанных условий дериватизации изучен состав жирных, дикарбоновых и аминокислот в культурах клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов. Показано, что содержание большинства аминокислот в клетках фибробластов превышало более чем в 10 раз их содержание в онкоклетках.

Данные определения состава аминокислот в клетках аденокарциномы и фибробластов приведены в Таблице 8.

Таблица 8. Результаты анализа лиофилизатов клеток аденокарциномы и фиброблаетов (s, < 0.20) на содержание аминокислот_____

Аминокислота Оценка содержания, % К

Клетки аденокарциномы Клетки фиброблаетов

Алании, ИБОК-ГФБ 3.2x10° 1.6x10"2 5.0

Глицин, ИБОК-ГФБ 7.6х10'3 4.8x10"3 0.7

Валин, ИБОК-ГФБ 7.2x10"4 1.2x10"2 16.9

Лейцин, ИБОК-ГФБ 1.2х10° 2.7x10"2 23.2

Изолейцин, ИБОК-ГФБ 4.6х10"4 1.5х10"2 31.9

Пролин, ИБОК-ГФБ 5.2х10"3 1.7x10'2 3.3

Аспарагин, ИБОК-ГФБ 3.2x10"4 4.0x10'3 12.7

Метионин, ИБОК-ГФБ 3.4x10'4 I.lxlO"2 31.8

Треонин, 2ИБОК-ГФБ І.ЗхІО"3 І.ЗхІО"2 10.3

Фенилаланин, ИБОК-ГФБ 7.5х10"4 2.1x10'2 27.9

Серии, 2ИБОК-ГФБ 1.8х10"3 І.ЗхІО"2 7.5

Лизин, 2ИБОК-ГФБ І.ЗхІО"3 1.5х10"2 11.8

Гистидин, 2ИБОК-ГФБ І.бхІО"4 4.2х10"3 25.4

Триптофан, ИБОК-ГФБ 1.7x10'4 6.5х10"3 38.1

Тирозин, 2ИБОК-ГФБ 8.2х10"4 2.1х10"2 25.7

Цистин, 2ИБОК-2ГФБ 9.7xl0"s 1.2х10"3 12.8

* В таблице приведены данные для ИБОК-ГФБ производных соответствующих аминокислот.

Предложен способ обнаружения следовых концентраций аминокислот в водных растворах, основанный на их дериватизации изобутилхлорформиатом в смеси с гептафторбутанолом, жидкостной экстракции производных, концентрировании полученных растворов в процессе НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов. Способ позволяет снизить предел обнаружения не менее чем на 2 порядка.

Степени переноса аналитов из органического раствора в систему ГХ/МС составляли для проб растворов объёмом 1 и 100 мкл от 80 до 105 %, в зависимости от соединения. Концентрации вещества в пробе составляли пхЮ"10 г/мкл и n*10"u г/мкл, соответственно.

2.1.2. Исследование возможности обнаружения ряда фармацевтических субстанций в виде их производных методом ГХ/МС

Целевое и побочное действие фармацевтических субстанций на организм человека ограничивается не только действующим веществом, но и примесями, содержащимися в субстанциях.

Общепринятый подход к определению примесей в фармацевтических препаратах основан на растворении навески образца в растворителе (или экстракции из навески) и анализе полученного раствора (экстракта) методом ВЭЖХ (УФ) либо ВЭЖХ/МС (МС). Этот подход имеет широкое применение как в методиках, внесённых в фармакопеи разных стран, так и в исследовательских работах, т.к. большинство фармацевтических субстанций часто является нелетучими соединениями. Метод ГХ/МС с электронной и химической ионизацией обычно применяется для определения остатков органических растворителей в образцах фармпрепаратов.

Проведенное исследование возможности определения ряда фармацевтических субстанций и соответствующих экстрактов из фармпрепаратов показало, что целый ряд фармацевтических субстанций, обычно анализируемых методом ВЭЖХ, может быть напрямую проанализирован методом ГХ/МС. Этот метод превосходит метод ВЭЖХ по эффективности разделения, информативности (благодаря сочетанию с масс-спекгрометрией электронной ионизации) и чувствительности. Представляло интерес также изучение возможности анализа ряда нелетучих фармацевтических субстанций, содержащих в молекулах различные функциональные группы, методом ГХ/МС.

Изучение условий дериватизации низкомолекулярных фармацевтических веществ и примесей в них для использования преимуществ метода ГХ/МС (высокая эффективность разделения, самый воспроизводимый на сегодняшний день масс-спектр (электронной ионизации), определение молекулярной массы, низкий предел обнаружения) представляет несомненный научный и практический интерес.

Исследовали возможность получения производных ряда фармацевтических субстанций, отличающихся по структуре и содержащих различные функциональные группы (гидроксо-, карбоксильная, кето- и амино- группы). В качестве модельных соединений исследовали метоклопрамид, сотолол, каптоприл, гидрохлортиазол, налидиксовую кислоту и ставудин. Дериватизацию изучали с использованием пяти известных дериватизирующих агентов (БСТФА, МТБСТФА, ВгТМАН, ИБХФ, ПФББ) с целью изучения реакций силлирования, ацилирования и алкилирования. Продукты реакции анализировали методом ГХ/МС. Изучены соответствующие масс-спектры и выбраны характеристичные ионы, отражающие особенности структуры производных и используемые при регистрации масс-хроматограмм следовых количеств этих веществ.

Показана возможность высокоселективной дериватизации малолетучих и нелетучих веществ, молекулы которых содержат карбоксильную группу, при использовании в качестве реагента изобутилхлорформиата (ИБХФ) и проведении реакции в водной среде (с последующей экстракцией и анализом экстракта методом ГХ/МС). Наиболее эффективными оказались БСТФА и МТБСТФА - при использовании каждого из них производные были получены для четырёх из шести изученных фармацевтических субстанций.

На основании результатов проведенного исследования предложен новый подход к сравнению качества фармацевтических препаратов (субстанций), основанный на сопоставлении многомерных профилей неизвестных примесей, зарегистрированных при прямом ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе соответствующих экстрактов и при анализе реакционной смеси (регистрация производных примесей).

Этот подход был использован при сопоставлении качества ряда оригинальных фармпрепаратов и соответствующих дженериков.

В таблице 9 в качестве примера приведены результаты, полученные при сопоставлении оригинального фармпрепарата и двух дженериков. Наибольшее число примесей при прямом анализе было зарегистрировано в случае использования МТБЭ как экстрагента.

Таблица 9. Число примесей, зарегистрированных в образцах оригинального фармпрепарата и двух его дженериков при анализе экстракта из этих препаратов и реакционной смеси методом ГХ/МС. Объём пробы - 1 мкл_

Образец Число зарегистрированных среднелетучих примесей

Анализ МТБЭ экстракта Анализ реакционной смеси

Оригинал ф.п. 11 28

Дженерик 1 16 35

Дженерик 2 11 15

Проведение такого сопоставления важно не только для сравнения качества фармсубстанций и фармпрепаратов, но и для выявления факта заимствования технологии получения субстанций.

2.2. Разработка метода обнаружения следов ряда физиологически активных соединений в водных растворах и биосредах, основанного на их выделении из образца, дериватизацин, замене реагента на легколетучнн инертный растворитель, концентрировании полученных растворов в процессе НМХД и анализе всего концентрата производных, свободного от реагента и растворителя методом ГХ/МС

2.2.1. Обнаружение следовых концентраций ряда нуклеозидов и Сахаров в виде их производных в органических растворах

Определение указанных веществ в водных матрицах методом ГХ/МС предполагает селективное их выделение с помощью аффинной хроматографии, ВЭЖХ очистки и фракционирования, твердофазной экстракции на обращённой фазе, высушивание (лиофилизирование) выбранной очищенной фракции, её дериватизация (в случае ГХ/МС) и анализ аликвоты реакционной смеси. В данном исследовании акцент делали на стадиях дериватизации и анализа полученных производных.

Обнаружение Сахаров на низком уровне (10"9 г в пробе и ниже) необходимо для определения из содержания в клеточных структурах. Особый интерес представляет определение 2-деокси-2-фтор-(1-глюкозы как потенциального маркера онкологических заболеваний. Актуальным является определение на следовом уровне и ряда модифицированных нуклеозидов, которые, так же как и сахара, могут отражать особенности биологических процессов (в том числе и патологических) в живых организмах. Стандартный подход (в том случае, когда применяется метод ГХ/МС) основан на получении летучих производных этих соединений и ГХ/МС анализе полученной реакционной смеси. В этом случае объём анализируемой пробы реакционной смеси составляет около 1 мкл, в связи с чем, предел обнаружения составляет не ниже 10"5%. Прямой анализ реакционной смеси приводит к ухудшению разделительной способности капиллярной колонки, искажению состава масс-спектра электронной ионизации полученных производных и снижению чувствительности масс-спектрометра. Метод ГХ/МС применяют по причине его высокой селективности и чувствительности, а так же уникальной, на сегодняшний день, воспроизводимости масс-спектров электронной ионизации.

В результате проведенных исследований предложен новый подход к обнаружению следовых количеств ТМС производных ряда нелетучих органических соединений в органических растворах. Моносахариды (Б-фруктозы, О-галактозы, 1-октил-Р-В-глкжопиранозида) дериватизировали с помощью БСТФА в присутствии пиридина в

ультразвуковом поле. После завершения реакции дериватизации удаляли реагент из реакционной смеси потоком инертного газа с последующей заменой на летучий инертный растворитель (МТБЭ). Полученные растворы анализировали методом ГХ/МС. Показано, что в выбранных условиях органические растворы ТМС-производных моносахаридов (в метилтретбутиловом эфире) с содержанием (п><10'10 г/мкл - пхЮ"8 г/мкл) стабильны при хранении. Изучены условия дериватизации ряда нуклеозидов (уридин, 5-метилуридин (тимиди), 2-деоксиуридин) и 2-деокси-2-фтор-с1-глюкозы при использовании БСТФА и пиридином и последующей замены избытка реагента на инертный растворитель (МТБЭ). Показано, что производные аналитов стабильны в полученном растворе в течении как минимум одной недели при содержании (пх Ю"10 г/мкл - пх 10"8 г/мкл).

Концентрируя полученные растворы в процессе НМХД с последующим анализом всего концентрата, свободного от растворителя снижали предел обнаружения более чем в 100 раз. Существенным достоинством предложенного подхода наряду со снижением пределов обнаружения силильных производных нелетучих веществ является стабильность характеристик разделительной колонки и чувствительности масс-спектрометра во времени благодаря исключению возможности попадания реагента в колонку. Подход к анализу нелетучих органических веществ методом ГХ/МС, основанный на дериватизации, замене реагента на легколетучий и инертный растворитель и анализе всей пробы (до 500 мкл) полученного раствора ранее, по нашим данным, в литературе не встречался.

2.2.2. Разработка способа определения следовых концентраций ряда стероидов в водных растворах и моче, расширяющего возможности антидопингового контроля

Существующий подход - выделение стероидов из мочи, их триметилсилирование с помощью МСТФА, ГХ/МС анализ 1/500 части объёма реакционной смеси в режиме селективной регистрации трёх ионов (СИД). Помимо повышения предела обнаружения в связи с анализом малой части смеси наблюдается загрязнение разделительной колонки и источника ионов реагентом и изменение их характеристик во времени.

Актуальным являлось: снижение пределов обнаружения стероидов, минимизация возможности загрязнения прибора и ухудшения его характеристик во времени, увеличение достоверности обнаружения стероидов на уровне следов благодаря увеличению объёма анализируемой пробы и обеспечению возможности регистрации полных масс-спектров. Кроме того, актуальным являлось увеличение числа регистрируемых стероидов и подобных им по структуре соединений (для более достоверного установления паспорта спортсмена, для увеличения достоверности обнаружения новых дизайнерских стероидов, не входящих в обязательный перечень определяемых веществ).

В результате проведенных исследований предложенный подход к обнаружению следовых количеств ТМС производных нелетучих органических соединений был применён и для обнаружения стероидов и выбраны условия обнаружения их следов в водных растворах и моче. Стероиды дериватизировали с использованием БСТФА в смеси с пиридином, заменяли реагент на легколетучий инертный растворитель (МТБЭ), концентрировали полученные растворы в режиме НМХД и анализировали

весь свободный от растворителя концентрат методом ГХ/МС в режиме полного ионного тока. Объём пробы органического раствора в случае анализа водного раствора составлял 100 мкл, а в случае мочи - 10 мкл. Было показано, что ТМС-производные ряда изученных стероидов были стабильны в растворе МТБЭ не менее двух недель.

Пределы обнаружения при пробе раствора, равной 100 мкл, составили от 5*10'13 г/мкл до 2x10"12 г/мкл, в зависимости от соединения, т.е. были более чем на 2 порядка ниже, чем при пробе, равной 1 мкл.

В результате проведенного исследования разработан способ высокочувствительного определения стероидов в водных растворах, основанный на получении растворов триметилсильных производных стероидов, переводе их в лёгколетучий инертный растворитель, на концентрировании этих растворов и анализе всего концентрата методом капиллярной газовой хроматографии-времяпролётной масс-спектрометрии (ВПМС).

Применение ГХ/МС с времяпролётным масс-анализатором с большой скоростью сканирования масс-спектров обеспечило возможность регистрации полного масс-спектра для следовых количеств каждого компонента смеси.

Применение предложенного способа к анализу мочи (объём пробы органического раствора в МТБЭ - 10 мкл) позволил зарегистрировать в 2 раза больше соединений стероидной структуры, чем при пробе того же раствора, равной 1 мкл (40 соединений вместо 20).

Этот способ может быть использован для проведения рутинных анализов (пробоподготовка осуществляется вне прибора) и обнаружения новых ранее неизвестных допинговых соединений стероидной структуры (так называемых дизайнерских стероидов) в связи с регистрацией полных масс-спектров (а не 3-х характеристичных ионов). Предложенный способ может быть использован для более достоверного подтверждения результатов допингового контроля, полученных на предварительной стадии (скрининга) с использованием стандартного метода, благодаря возможности регистрации полных масс-спектров для следовых количеств аналитов в пробе и обнаружению их на более низком уровне, чем требует ВАДА (Всемирное антидопинговое агентство). Он существенно расширяет возможности антидопингового контроля.

Таким образом, в результате проведенных исследований развито направление высокочувствительной газовой хромато-масс-спектрометрии при обнаружении следов нелетучих (и соединений, летучие производные которых имеют более информативный аналитический сигнал) физиологически активных соединений в водных растворах и биосредах.

3. Минимизация зависимости сигналов атомно-эмиссионного детектора (АЭД) по углероду и водороду от структуры молекул аналитов, снижение пределов обнаружения при использовании газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором

3.1. Исследование зависимости сигналов АЭД по элементам от структуры молекул компонентов

Актуальной задачей является идентификация компонентов смесей на уровне следов. Вероятность достоверной идентификации может быть существенно увеличена при

совместном использовании данных АЭД по составу элементов в молекулах компонентов и данных об их молекулярных массах, которые могут быть получены при использовании ГХ/МС. Большую роль здесь играет определение величины отношений чисел атомов углерода и водорода пс/пн (где Пс и пн - числа атомов углерода и водорода в молекуле) в молекулах компонентов.

В результате проведенных нами исследований для большого числа С-, Н-, К-, 0-, Р-, С1-, Вг-, Р-, Б- содержащих органических соединений показано, что в общепринятых условиях соответствующие сигналы АЭД по С и Н зависят от структуры и элементного состава аналитов, что объясняет противоречивые литературные данные о возможности определения состава элементов и количественного состава компонентов смесей.

Разработаны условия, позволяющие минимизировать эту зависимость, и предложен способ определения пс/пн с погрешностью, составляющей в среднем около 4% отн. (при использовании гелиевой плазмы, обогащённой кислородом). Такая возможность была показана для углеводородов и соединений, содержащих в молекуле такие элементы, как фтор, хлор, бром, фосфор, серу, азот и кислород.

Изучение зависимости отношений чисел атомов углерода к числу атомов таких элементов, как С1, Вг, Б, Р, N в молекулах компонентов смесей от их структуры и элементного состава показало, что точное определение величин таких отношений при использовании ГХ/АЭД в общем случае невозможно ни в стандартных условиях, ни в выбранных в результате исследования.

Предложен способ определения элементного состава компонентов смесей углеводородов и их количественного содержания без градуировки по каждому компоненту смеси с использованием выбранных условий АЭ детектирования с гелиевой плазмой, обогащённой кислородом.

Таблица 10. Результаты определения процентного содержания углерода (\¥С,%) в молекулах компонентов смеси «неизвестных» углеводородов и их содержания без градуировки по каждому компоненту при использовании экспериментальных значений пс/пн и \Ур,% (п=3)_■__

Соединение Концентрация углеводорода, г/мкл

истинное значение расчетное значение Бг Д,% истинное значение расчетное значение їг Д,%

С11Н24 84.61 84.67 0.0005 0.1 3.32х10"8 3.23x10"' 0.002 3

СцНгб 84.72 стандарт 2.75x10"'' стандарт

с,3н28 84.77 85.14 0.0007 0.4 1.03x10"' 9.89ХІ0"8 0.005 4

СмНзо 84.86 85.27 0.0003 0.5 1.57x10"7 1.46x10'7 0.002 7

С,6Нз4 84.97 85.17 0.0007 0.2 9.40x10"8 9.04х10"8 0.005 4

Расчёт процентного содержания углерода в молекуле, У/с, % проводили по формуле:

\Ус, % = 12/ 12+( пс/пн)"1 х 100%,

где пс/пн - отношение чисел атомов углерода и водорода в молекуле углеводорода, рассчитанное на основании экспериментальных данных, полученных для этих элементов с АЭД.

12 - атомная масса углерода.

Из формулы видно, что погрешность определения Wc, %, практически мало зависит от погрешности определения пс/пн;

Расчёт отношений Пс/% проводили по формуле: nc/nH = Scx/ShxxShcl/ScCTxnCci/nHcT,

где пСст/пнст _ отношение чисел атомов углерода и водорода в молекуле вещества стандарта,

Scx/Shx, Sh„/Sccr - отношение площадей пиков, зарегистрированных по каналам углерода и водорода для анализа и вещества-стандарта, соответственно.

Содержание углеводорода в смеси без градуировки (Сх) может быть рассчитано, как было нами показано, по формуле:

Сх = (Scx / ScCT)*Wcx,%/ WcCT,%xCCT,

где Сх и Сет - концентрации определяемого количества (х) и вещества-стандарта (ст), соответственно;

Wcx,%/ WcCT,% - процентное содержание углерода в молекуле аналита и вещества -стандарта, соответственно;

Scx и ScCT - площади пиков анапитов и вещества-стандарта, соответственно, зарегистрированные по каналу углерода.

Погрешность определения процентного содержания углерода в молекулах компонентов смеси углеводородов составила около 0.3 % абс., т.е. соответствовала погрешности определения этого элемента в молекулах индивидуальных органических соединений, специфицируемой для элементных анализаторов.

В случае определения количественного состава компонентов смеси углеводородов без градуировки (соответственно, без стандартных образцов аналитов), погрешность составляла около 4 % отн., т.е. была не выше погрешности определения при проведении анализа с градуировкой. Применение предложенного способа особенно перспективно при анализе многокомпонентных смесей углеводородов, состав которых полностью неизвестен, когда градуировка практически неосуществима в связи, как со сложностью смеси, и отсутствием большого числа стандартных образцов, так и неизвестностью качественного состава. Способ может быть использован и для анализа смесей без градуировки других соединений известного качественного состава, когда отсутствуют стандартные образцы аналитов.

Пределы детектирования по углероду и водороду в разработанных условиях АЭ детектирования составляют около Ю"10ги 10"11 г, соответственно.

3.2. Снижение пределов обнаружения метода ГХ/АЭД

Актуальным являлось снижение пределов обнаружения ГХ/АЭД по концентрации как для самостоятельного использования ГХ/АЭД, так и при идентификации компонентов смесей на уровне следов. Эта идентификация основана на совместном использовании данных, полученных с ГХ/АЭД по составу элементов и ГХ/МС (молекулярная масса, масс-спектр электронной ионизации), предел детектирования которого в режиме регистрации суммарного ионного тока при электронной ионизации несколько ниже, чем в случае АЭД по углероду, а в случае химической ионизации - примерно такой же.

В качестве модельных соединений были выбраны триэтилфосфат, дибутилбутилфосфонат и трибутилфосфат, которые являлись имитаторами таких

ФОБ, как зарин, зоман и Ух, обнаружение и идентификация которых в различных средах является актуальной задачей.

Была исследована возможность концентрирования, органических растворов этих соединений (сорбент - сверхтонкое кварцевое волокно, объём пробы - 500 мкл) с использованием метода концентрирования органических растворов в процессе НМХД и анализа всего концентрата после его перевода термодесорбцией в ГХ/АЭД.

Аналогичное исследование для смеси таких же модельных соединений было проведено для снижения концентрационного предела обнаружения методом ГХ/МС.

Данные по степени переноса модельных среднелетучих соединений (имитаторов ФОБ (Ткип от 215 до 289°С)) в ГХ/АЭД, полученные в результате концентрирования из проб органических растворов объёмом 1 мкл и 500 мкл (концентрации пхЮ'8 г/мкл - пхЮ'10 г/мкл, соответственно) приведены в Таблице 11.

Таблица 11. Степени переноса п*10"8 г ряда среднелетучих органических соединений из разных по объему проб органических растворов

Соединение Степень переноса, %

1 мкл 500 мкл

триэтилфосфат 70 40

дибутилбутилфосфона т 95 100

трибутилфосфат 105 110

Таким образом, нами был предложен способ определения среднелетучих органических соединений (имитаторов ФОБ), основанный на концентрировании раствора в режиме НМХД и анализе всего концентрата методом ГХ/АЭД. Способ позволяет снизить пределы обнаружения ГХ/АЭД более, чем на 2 порядка. Он позволяет существенно расширить возможности ГХ/АЭД при идентификации и определении следов компонентов СЛОС.

Возможность снижения предела обнаружения методов ГХ/МС и ГХ/АЭД показана также при анализе растворов ряда малолетучих фармацевтических субстанций. Данное исследование проводилось с целью расширения возможностей применения этих методов для регистрации и идентификации следов термостабильных примесей в фармацевтических препаратах. Использование преимуществ данных методов для определения термостабильных и малолетучих веществ вместе с чаще используемыми методами (ВЭЖХ/УФ и, реже, ВЭЖХ/МС) необходимо для более полного сравнения качества фампрепаратов, содержащих одно и то же активное вещество, выявления фальсификатов, фактов заимствования технологий получения субстанций, обнаружения примесей, которые даже в следовых количествах отвечают за побочное действие лекарств.

В качестве модельных соединений использовали термостабильные и малолетучие фармсубстанции ряда фармпрепаратов, содержащие гетероэлементы. Анализировали растворы метронидазола, каптоприла, ифосфамида, пентоксифилина, метаклопромида, феназепама, рофекоксиба и холоксана.

Разработанный метод концентрирования органических растворов СЛОС в процессе НМХД позволил и для этих полярных малолетучих веществ понизить предел

обнаружения более чем на 2 порядка (при объёме пробы - 500 мкл). При этом количественный перенос концентрата аналитов удалось обеспечить только при присоединении термодесорбера, (в котором находилась камера концентрирования -кварцевая трубка) непосредственно к аналитической колонке, минуя инжектор.

При вводе пробы раствора смеси модельных фармацевтических препаратов посредством термодесорбера непосредственно в колонку, наблюдались минимальные потери определяемых веществ. По-видимому, в инжекторе хроматографа происходила сорбция следов определяемых веществ и дискриминация состава пробы.

В результате исследования был предложен подход к обнаружению следов термостабильных фармацевтических веществ различной полярности и летучести, основанный на концентрировании содержащих их органических растворов в процессе НМХД и анализе всего концентрата методами ГХ/МС и ГХ/АЭД. Подход к регистрации следов модельных веществ этими двумя методами был распространён на сравнение оригинальных препаратов и дженериков по составу термостабильных примесей. Он вошёл в состав методологии контроля качества фармпрепаратов, являющейся основой соглашения о сотрудничестве химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и Росздравнадзора.

3.3. Новый подход к идентификации компонентов смесей сред нелетучих органических соединений на уровне следов, основанный на концентрнрованин больших проб органических растворов (экстрактов) в процессе НМХД и анализе всего концентрата методами ГХ-АЭД и ГХ/МС (ХИ, ЭИ)

В настоящее время идентификация компонентов смесей проводится в подавляющем большинстве случаев по экспериментальным масс-спектрам ЭИ с использованием электронной базы данных масс-спектров МБТ; проба составляет 0.001-0.01 части органического экстракта.

Примерно для 26% изученных соединений, приведенных в базе данных N181 (2008) масс-спектры не содержат пика молекулярного иона - самого важного иона масс-спектра, либо его интенсивность очень мала (<1%). Для 39% соединений, приведённых в базе данных, интенсивность пика в масс-спектрах <5%. Достоверность идентификации на основании масс-спектров ЭИ уменьшается для следовых количеств аналитов. Состав масс-спектров, и следовательно, степень совпадения с библиотечным масс-спектром, зависит от масс-анализатора, температуры источника ионов, количества аналита, его концентрации в газе носителе, фона прибора. Процесс идентификации усложняется, если экспериментальный масс-спектр аналита отсутствует в базе масс-спектров МБТ.

Достоверность идентификации возрастает, если известна молекулярная масса аналита и элементы, входящие в состав молекулы аналита.

Разработанный метод выделения СЛОС из органических растворов в процессе НМХД и разработанный способ определения пс/пн методом ГХ/АЭД при использовании гелиевой плазмы, обогащённой кислородом, позволили предложить новый подход к идентификации компонентов сложных смесей СЛОС (или летучих производных нелетучих органических веществ) на уровне следов, который включает:

• анализ всего концентрата методом ГХ/МС (ХИ) и определение молекулярных масс компонентов;

• анализ всего концентрата методом ГХ/МС (ЭИ);

• анализ всего концентрата методом ГХ/АЭД и регистрацию всех элементов (С, Н, N. О, Р, С1, Вг, 1, Р, Б), которые могут входить в состав определяемых веществ;

• анализ всего концентрата методом ГХ/АЭД при использовании гелиевой плазмы обогащенной кислородом, и определение соотношения Пс/пн для интересующих компонентов анализируемых смесей органических веществ.

Отличие предлагаемого подхода - возможность снижения пределов обнаружения более чем на 2 порядка по сравнению с известными подходами при определении молекулярной массы компонентов, регистрации воспроизводимого масс-спектра электронной ионизации и регистрации элементов, присутствующих в их молекулах.

Регистрация масс-хроматограмм, отвечающих молекулярным либо квазимолекулярным ионам, позволяет получить достоверную информацию о молекулярных массах компонентов, их числе в смеси, решить задачу обнаружения коэлюируемых пиков на хроматограмме, увеличить достоверность идентификации при использовании масс-спектров электронной ионизации. Обнаружение коэлюируемых пиков позволяет оптимизировать условия разделения компонентов смеси, увеличить достоверность установления состава сложных смесей, определения отношения Пс/Пн для интересующих компонентов анализируемых смесей.

Определение молекулярной массы позволяет провести первичную выборку брутто-формул при содержании аналитов на уровне следов.

Регистрация всех элементов, входящих в состав молекул этих аналитов, позволяет на том же уровне содержаний, что и при определении молекулярных масс, провести существенное сокращение первой выборки вероятных брутго-формул.

Определение отношений Пс/пн и значения По позволяет дополнительно минимизировать число вероятных брутто-формул (однако, для количеств, больших на порядок, чем при регистрации элементов).

Регистрация масс-спектров ЭИ компонентов позволяет на том же уровне содержаний аналитов, что и при определении молекулярных масс, регистрации элементов, входящих в молекулу, и определении величин пс/пн, уточнить строение выбранных соединений. Информация о молекулярной массе и составе элементов в молекуле обеспечивает увеличение достоверности идентификации компонентов смесей на уровне следов и при библиотечном поиске, если масс-спектр аналита есть в библиотеке. При его отсутствии в библиотеке полученная во всей совокупности информация позволит в ряде случаев провести идентификацию компонентов на следовом уровне при наличии баз данных только по брутто-формулам и молекулярным массам. Использование значений молекулярных масс (молекулярных, протонированных или депротонированных ионов) для идентификации компонентов в таких случаях может быть иногда более продуктивным чем масс-спектров ЭИ, в которых пик молекулярного иона отсутствует либо малоинтенсивен, т.к. предел обнаружения определяется фактически одним (молекулярным, протонированным или депротонированным ионом), но самым информативным ионом масс-спектра.

4. Разработка способа быстрого скрининга проб органических и водных растворов на суммарное содержание галоид-, фосфор-, сераорганических соединений на уровне следов в пересчёте на элемент (обобщённый показатель)

В соответствии со стандартными методами эколого-аналитического контроля только небольшая часть соединений, для которых были установлены ПДК, подлежит

определению. В случае анализа вод эта часть составляет около 10% даже при использовании методов ЕРА. Общепринятая методология эколого-аналитического контроля (для CJIOC) в большинстве случаев основана на требующей больших затрат времени пробоподготовке с использованием жидкостной экстракции и покомпонентном ГХ/МС анализе малой (0.001-0.01) части конечного объёма экстракта. Такой подход не обеспечивает контроля за всеми опасными токсикантами, малопроизводителен и экономически малоэффективен. Большинство опасных органических соединений - известных и неизвестных - к которым относятся Hal-, Р-, S-органические соединения, не подлежит контролю. Поэтому эколого-аналитический контроль сегодня позволяет решать только малую часть проблем, которые должны решаться для защиты окружающей среды, но не могут быть решены при использовании существующего подхода к такому контролю.

Новые возможности в эколого-аналитическом контроле открываются, если проводить определение суммарного содержания Hal-, Р-, S-органических соединений на уровне следов в водных и органических растворах. В этом случае возможно получение информации о большинстве (заданных и незаданных) опасных СЛОС.

В результате проведенного исследования разработан способ одновременного определения суммарного содержания Hal-, Р-, S-содержащих СЛОС в пересчёте на элемент в органических растворах на уровне 5><10"9 - 2.5><10"8 % по элементу (объём пробы раствора 500 мкл).

Способ основан на предложенном методе концентрирования органических растворов СЛОС в процессе НМХД, переводе всего концентрата аналитов в реактор термодесорбцией в потоке гелия, их высокотемпературной окислительной конверсии, абсорбции продуктов конверсии из потока кислорода и анализа всего абсорбата методом ионной хроматографии на содержание фторида, хлорида, бромида, фосфата и сульфата, которые соответствуют определяемым элементам. Метод определения суммарного содержания Hal-, Р-, S-органических соединений в органических растворах на уровне 1х10"6 - 5x10"5 % (в пересчёте на элемент) разработан в нашей лаборатории ранее.

Разработан также способ определения суммарного содержания F-, С1-, Br-, Р-, S-содержащих СЛОС в воде, основанный на высаливании, жидкостной экстракции, концентрировании экстрактов и определении аналитов в концентрате с использованием предложенного метода определения суммарного содержания таких соединений в органических растворах. При объёме пробы воды, равном 10 мл, предел обнаружения способа составляет 1x10"10 - 5хЮ'10 % по элементу (в зависимости от элемента). При использовании разработанного способа было проведено определение суммарного содержания рассматриваемых соединений в образцах различных вод. Полученные данные приведены в Таблице 12.

Время одного определения вместе с концентрированием в случае вод не превышает 30 мин.

Изучение распределения органических соединений, нормируемых по ПДК в воде показало, что для около 96% этих соединений ПДК составляли от Ю"4 до 10"6%, для около 3% - от 10"6 до 10"8% и для менее чем 1% - менее 10"9%.

Для надёжного и экономически высокоэффективного эколого-аналитического контроля вод предлагается новая методология.

Она основана на случайном выборе проб из большой выборки отобранных образцов, быстром скрининге этих проб на суммарное содержание Hal-, Р- и S-содержащих органических соединений.

Таблица 12. Результаты определения суммарного содержания Р-, С1-, Вг-, Р-, Б-содержащих СЛОС в образцах различных вод.__

Наименование образца Суммарное содержание определяемого элемента, %

F С1 Вг Р S

Деионизованная вода <1.1x10-'° 0.8х10"6 <4.9x10"'° <5.1хЮ"10 І.ЗхІО-6

Водопроводная вода (Хим. фак. МГУ) 6.9х10-8 2.4хЮ"6 6.1x10" <5.1хЮ"10 4.9*10"6

Водопроводная вода (г. Подольск) 9.2хЮ"8 1.8*10"6 2.5x10'8 <5.1x10"lu 4.1 х 10"6

Питьевая вода «Вопаяиа» 6.7x10"8 1.2x10"6 з.іхіо-8 <5.1x10""' 2.2ХІ0-6

Питьевая вода «Святой источник» 5.ІХІ0-8 І.бхЮ"6 0.5x10"8 <5.1х10'|и 2.7х10"6

Скрининг осуществляется на уровне Ю'10 - 10'9 % для бром-, фтор- и фосфорсодержащих органических веществ и на уровне выше - 10"6 % для хлор и серу содержащих органических веществ (в воде, т.к. в этой матрице уровень фонового сигнала по этим элементам находится на уровне 10"6 %). Если фоновый уровень по хлору и сере позволяет (особо чистая вода, экстракты из матриц, в которых фоновый уровень по хлору и сере низкий) то скрининг по этим элементам может быть осуществлён на уровне Ю-10 - Ю-9 %.

5. Применение разработанного метода концентрирования органических растворов, основанного на НМХД, для обнаружения в объектах анализа следов неизвестных среднелетучих органических соединений 5.1. Определение состава следов СЛОС в образцах конденсата выдыхаемого воздуха человека

Увеличение достоверности диагностики таких лёгочных заболеваний, как хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ) и астма является очень актуальным, особенно с учётом того, что число людей, ежегодно заболевающих этими болезнями, очень велико.

Подавляющее число работ по анализу выдыхаемого воздуха посвящено определению газообразных и легколетучих соединений, которые неадекватно отражают состав смеси выдыхаемых эндогенных соединений. Состав СЛОС в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) был практически неизвестен, и их содержание оценивалось на уровне ниже 10"7%.

Целью работы являлось изучение состава неизвестных СЛОС на уровне следов в КВВ здоровых и больных ХОБЛ и астмой людей и изучение возможности увеличения достоверности диагностики этих заболеваний на основании полученных результатов исследования. Исследование проводили при использовании смесей модельных соединений (более 20) таких, как спирты, жирные кислоты, н-алканы, ароматические углеводороды, кетоны и альдегиды, отличающиеся по полярности и летучести, которые, согласно литературным данным, могли присутствовать в выдыхаемом воздухе. Были изучены масс-спектры ЭИ и ХИ модельных соединений,

оптимизированы условия газо-хроматографического разделения и определения методом масс-спектрометрии.

В результате проведенного исследования концентрирования органических растворов ультраследовых количеств модельных СЛОС выбраны условия обнаружения таких соединений. Были выбраны условия концентрирования растворов в режиме НМХД и анализа всего концентрата аналигов методом ГХ/МС (ЭИ, ХИ). При концентрировании в качестве сорбента использовали Тепах и СКВ. Пределы обнаружения составили Ю-8 -10'% в зависимости от соединения.

Выбраны условия обнаружения СЛОС различной полярности в водных растворах на следовом уровне. Условия включали высаливание, жидкостную экстракцию, концентрирование экстрактов в условиях НМХД и анализ всего концентрата аналитов методом ГХ/МС (ЭИ). Варьируя выбранные условия для обнаружения СЛОС в воде, оптимизировали условия их обнаружения в образцах конденсата выдыхаемого воздуха. При объёме пробы органического экстракта из КВВ, равной 100 мкл, пределы обнаружения составили в зависимости от аналита.

С использованием оптимизированных условий анализа образцов КВВ изучен состав среднелетучих органических соединений в 70 таких образцах здоровых людей и больных ХОБЛ и астмой (образцы КВВ были предоставлены д.м.н., профессором Э.Х. Анаевым, исследование проводилось под руководством академика РАМН А.Г. Чучалина, Институт Пульмонологии РАМН). Зарегистрировано более 100 соединений на уровне 10"8 - Ю-7 % и ниже, из которых 33 были идентифицированы с использованием библиотеки масс-спектров МБТ (часть из них совпали с модельными веществами, которые были взяты для выбора условий анализа). Для 11 отсутствующих в библиотеке веществ (которые также были взяты для сравненения образцов здоровых и больных людей) были зарегистрированы масс-спектры ЭИ и времена удерживания. Молекулярные массы большинства из зарегистрированных соединений подтверждены с помощью метода ГХ/МС(ХИ). Ранее, согласно литературным данным, в образцах КВВ СЛОС не обнаруживали, объясняя это их низким содержанием.

Математическая обработка полученных нами данных проведена с использованием теории распознавания образов сотрудниками кафедры математической теории интеллектуальных систем механико-математического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова под руководством академика Кудрявцева В.Б. В результате математической обработки полученных данных, показана возможность различить с высокой надёжностью (достоверность более 80%) здоровых людей и больных ХОБЛ, здоровых и больных бронхиальной астмой, больных ХОБЛ и бронхиальной астмой между собой.

Выявлена группа веществ, которые могут рассматриваться как потенциальные биомаркеры астмы и ХОБЛ.

5.2. Регистрация следов нензвестных среднелетучих примесей в образцах фармацевтических препаратов после растворения последних в растворителях мало их растворяющих

Для увеличения селективности выделения примесей из фармацевтических веществ нами предложен подход к обнаружению неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях, основанный на их выделении из образца

органическим растворителем, концентрировании полученных растворов, в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата. Выделение примесей осуществляется с помощью жидкостной экстракции растворителем, мало растворяющим действующее вещество, либо не растворяющим его совсем. Мы предположили, что примеси, концентрации которых много меньше концентрации основного компонента (на порядки), должны растворяться в таком растворителе. .

При использовании предложенного подхода был изучен состав неизвестных примесей в образцах двух фармсубстанций - метронидазола и дротаверина. Исследование показало, что метронидазол не растворим в пентане, а дротаверин - в МТБЭ. В то же время МТБЭ хорошо растворял первый, а метанол - второй препарат. Объём экстрагента - 1мл. Проба анализируемого раствора в растворителе, хорошо растворяющем основной компонент субстанции, составляла 1 мкл (концентрация основного компонента - 10"6 г/мкл), плохо растворяющем - 500 мкл. В случае метронидазола в экстракте пентаном были зарегистрированы 4 примеси и соответствующие им масс-спектры ЭИ. В МТБЭ растворе не было зарегистрировано ни одной примеси. В случае МТБЭ экстракта из дротаверина было обнаружено 13 примесей, а экстракта метанолом - 3 примеси.

Таким образом, использование растворителя, не растворяющего основной компонент субстанции, и применение разработанного метода концентрирования органических растворов в условиях НМХД позволяет селективно выделять примеси из образца субстанции и селективно их обнаруживать методом ГХ/МС, что расширяет возможности контроля качества лекарственных средств.

Заключение

В результате проведенных исследований развито новое направление в обнаружении известных и неизвестных CJIOC на уровне следов в различных матрицах - водах, биосредах, фармпрепаратах. Направление основано на использовании предложенного нового метода анализа объектов различного происхождения. Метод основан на выделении CJIOC из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов в условиях НМХД, переводе всего концентрата в аналитический прибор термодесорбцией и анализе методами ГХ/МС и элементного анализа, включающего ГХ/АЭД и определение суммарного содержания CJIOC содержащих в молекуле F, CI, Br, Р и S.

Концентрирование органических растворов следов CJIOC внутри термостата газового хромато-масс-спектрометра и анализ всего концентрата методом ГХ/МС с химической ионизацией и регистрацией отрицательных ионов позволили на примере хлорированных токсикантов (ПХДД, ПХБ и ХОП) показать принципиальную возможность достижения ультранизких пределов обнаружения (10"13 - 10"12 %) органических соединений в водных и органических растворах.

Разработка и развитие метода концентрирования органических растворов в процессе НМХД и анализа всего концентрата аналитов применительно к решению конкретных задач установления состава смесей различных соединений позволило снизить пределы обнаружения таких методов, как ГХ/МС (ЭИ, ХИ), ГХ/АЭД и метод определения суммарного содержания Hal-, Р-, S-органических соединений, более чем на 2 порядка по сравнению с существующими способами.

Показана возможность обнаружения методом ГХ/МС следов малолетучих и нелетучих органических соединений, таких как гидрокси, окси, дикарбоновые, жирные и аминокислоты при их совместном присутствии в водных растворах и биосредах. Выбраны соответствующие условия дериватизации, экстракции, анализа

Благодаря полученным результатам проведено исследование состава аминокислот в лиофилизатах раковых клеток прямой кишки и фибробластов и выявлено значимое различие состава таких кислот, что позволило увеличить достоверность дифференциации раковых клеток и фибробластов.

Развито направление высокочувствительной ГХ/МС следов малолетучих и нелетучих физиологически активных органических соединений. Оно базируется на разработанном методе анализа, включающем дериватизацию обнаруживаемых соединений с использованием БСТФА в смеси с пиридином, замену, после дериватизации, избытка реагента на летучий инертный растворитель, концентрирование полученных растворов в условиях НМХД и анализе всего концентрата методом ГХ/МС. Такой подход позволяет не только снизить пределы обнаружения более чем на 2 порядка, но и существенно улучшить стабильность свойств колонки и чувствительности масс-спектрометра во времени. Он существенно расширил возможности антидопингового контроля как с точки зрения пределов обнаружения заданных стероидов (что очень актуально), так и увеличения числа регистрируемых соединений стероидной структуры, что важно для решения задач паспортизации спортсменов и обнаружения дизайнерских (новых, неизвестных) стероидов.

Наряду с разработкой способов обнаружения следовых содержаний заданных СЛОС и малолетучих и нелетучих органических соединений в водных и органических растворах (экстрактах) и биосредах в работе развито направление по обнаружению в этих средах числа и природы неизвестных среднелетучих и нелетучих органических соединений.

Разработан способ обнаружения состава неизвестных среднелетучих примесей различной полярности и летучести в конденсате выдыхаемого воздуха человека. Он основан на жидкостной экстракции, концентрировании экстрактов в условиях НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата аналитов.

Сопоставление состава примесей, обнаруженных в конденсате выдыхаемого воздуха здоровых людей и больных ХОБЛ и бронхиальной астмой позволило с достоверностью более 80% дифференцировать эти группы людей. Что очень важно для развития методов диагностики лёгочных заболеваний.

Сочетание предложенного метода концентрирования органических растворов СЛОС в условиях НМХД с методом определения суммарного содержания На1-, Р- и Б-органических соединений позволило разработать способ быстрого скрининга проб на суммарное содержание таких соединений на уровне следов. Предложена новая методология эколого-аналитического контроля, основанная на случайном выборе проб на анализ из большой выборки отобранных образцов и быстром скрининге анализируемых проб на суммарное содержание наиболее опасных На1-, Р- и Б-содержащих токсикантов в пересчёте на элемент. Методология открывает новые возможности в осуществлении надёжного высокоселективного, экономически эффективного и действенного эколого-аналитического контроля.

В отличие от общепринятого подхода к определению известных и неизвестных примесей в фармсубстанциях и фармпрепаратах, основанного на анализе малой части экстракта методом ВЭЖХ (УФ) и реже - ВЭЖХ (МС), изучена возможность анализа растворов целого ряда малолетучих фармсубстанций, отличающихся по структуре и составу функциональных групп, методом ГХ/МС. Показано, что метод ГХ/МС имеет целый ряд преимуществ при обнаружении таких веществ по сравнению с другими методами (селективность, чувствительность, воспроизводимость масс-спектров). Анализ всего экстракта не только позволил снизить пределы обнаружения, но и (при термодесорбции аналитов непосредственно в колонку, минуя инжектор) значительно уменьшить часто описываемую в литературе дискриминацию состава пробы таких веществ при вводе пробы растворов.

Кроме того, предложен новый способ селективного обнаружения среднелетучих и малолетучих примесей в лекарственных средствах, основанный на экстракции примесей растворителем, не растворяющим основной компонент, концентрировании полученных растворов в режиме НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата.

Показано, что при использовании этого способа регистрируется больше (в несколько раз) примесей, чем при анализе раствора в растворителе, растворяющем основной компонент.

Новые возможности идентификации компонентов смесей на уровне следов открываются при использовании предложенной методологии, основанной на выделении веществ из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов в условиях НМХД и анализе всего концентрата методами ГХ/МС (ХИ) и ГХ/АЭД. Совместное использование данных для следов СЛОС о составе масс-спектра электронной ионизации, молекулярной массе аналитов и присутствующих в молекуле элементов позволяет сузить круг веществ-претендентов.

Таким образом, результаты, полученные в настоящем исследовании, открывают новые возможности в обнаружении состава смесей известных и неизвестных среднелетучих, малолетучих и нелетучих соединений в образцах различного происхождения на уровне следов. Эти результаты способствуют решению различных задач, имеющих важное практическое значение в медицине, биотехнологии, эколого-аналитическом контроле, антидопинговом контроле, определении состава примесей в высокочистых органических веществах, в частности фармацевтических.

Перспективным является развитие сочетания предложенного метода концентрирования в условиях НМХД и ВЭЖХ, КЭФ и ТСХ. Выводы

1. В результате проведенных исследований развито новое направление в обнаружении известных и неизвестных СЛОС и производных нелетучих органических соединений на уровне следов в различных матрицах - водах, органических растворах (экстрактах), биосредах, фармацевтических субстанциях. Оно основано на извлечении обнаруживаемых веществ в органический растворитель, концентрировании полученных растворов в процессе непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) и анализе всего концентрата методами ГХ/МС и элементного анализа.

2. На примере следовых количеств ПХДД, ПХБ и ХОП показана принципиальная возможность обнаружения следов СЛОС в органических растворах на уровне 10"12 -

Ю"10 % и в модельных водных растворах (после микрожидкостной экстракции) на уровне

10-п _ ш-и % благодаря

сочетанию предложенного подхода к концентрированию органических растворов и анализа всего концентрата определяемых веществ методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов. В случае устранения или отсутствия мешающих компонентов матрицы, предложенных подход позволяет осуществлять быстрый скрининг проб растворов на наличие хлорсодержащих токсикантов на уровне 10"12 - Ю'10 %.

3. Разработан новый метод анализа органических растворов, содержащих следы СЛОС различной полярности и летучести, основанный на концентрировании этих растворов благодаря процессу непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) в присутствии сорбента, и вводе всего концентрата аналитов в ГХ/МС термодесорбцией.

4. Предложены подходы к обнаружению следовых количеств различных жирных кислот, аминокислот, дикарбоновых, гидрокси и оксокислот, Сахаров и спиртов в водных растворах и биосредах, при их совместном присутствии в смеси, основанные на дериватизации и ГХ/МС анализе соответствующих производных. Снижены пределы обнаружения аминокислот в водных растворах более чем на 2 порядка, при использовании концентрирования органического экстракта и ГХ/МС анализа всего концентрата в соответствии с предложенным методом.

5. Показана возможность увеличения достоверности дифференциации онкоклеток и фибробластов, основанная на установлении различия в составе аминокислот разработанным способом их определения.

6. Расширены возможности метода ГХ/МС для обнаружения следов малолетучих и нелетучих органических соединений и предложено направление, основанное на их выделении из образца, дериватизации соответствующим реагентом, замене реагента на инертный легколетучий растворитель, концентрировании полученных растворов с удалением растворителя в режиме НМХД и анализе всего концентрата производных методом ГХ/МС. Пределы обнаружения снижены более чем на 2 порядка.

7. В соответствии с этим направлением предложен подход к обнаружению следов стероидов в водных растворах и моче, существенно расширяющий возможности антидопингового контроля благодаря снижению пределов обнаружения стероидов более чем на 2 порядка, и регистрации большего числа соединений стероидной структуры, по сравнению с общепринятым подходом.

8. Предложен подход к минимизации зависимости сигналов АЭД по углероду и водороду от структуры молекул аналитов, основанный на использовании гелиевой плазмы, обогащенной кислородом. Способ позволяет определять отношения чисел атомов углерода и водорода (пс/пн) с высокой точностью.

9. Предложен новый способ определения элементного состава компонентов углеводородных смесей с высокой точностью, основанный на использовании отношений пс/пн и определения количественного содержания без градуировки по каждому компоненту смеси.

10. Предложен новый подход к идентификации компонентов смесей СЛОС на уровне следов, основанный на их концентрировании из органических растворов в режиме НМХД, анализе всего концентрата аналитов методами ГХ/МС(ХИ) и

ГХ/АЭД и совместном использовании данных о молекулярной массе и присутствующих в молекулах элементов.

11. Предложен подход к определению суммарного содержания среднелетучих На1-, Р-, 8- органических соединений в водных и органических растворах на уровне Ю'10 - 10"9 % и 10"9 - 10"8 % (по элементу) соответственно, позволяющий осуществлять быстрый скрининг проб таких растворов, и проведён анализ образцов различных вод. Способ основан на разработанном методе концентрирования органических растворов в режиме НМХД и переводе всего концентрата в окислительный реактор в потоке гелия с последующей регистрацией продуктов конверсии, соответствующих определяемым элементам, методом ионной хроматографии.

12. Предложена новая методология экологоаналитического контроля вод, основанная на случайном выборе проб на анализ из большой выборки отобранных проб, быстром скрининге этих проб на суммарное содержание На1-, Р- и Б-содержащих органических соединений (в том числе токсикантов). Скрининг осуществляется на уровне 10"'° - 10"9 % для бром-, фтор- и фосфор- содержащих органических веществ и на уровне выше - 10'6 % для хлор и серу содержащих органических веществ (в воде, т.к. в этой матрице уровень фонового сигнала по этим элементам находится на уровне 10"6 %). Если фоновый уровень по хлору и сере позволяет (особо чистая вода, экстракты из матриц, в которых фоновый уровень по хлору и сере низкий) то скрининг по этим элементам может быть осуществлён на уровне 10'10 - 10'9 %.

13. Разработан подход к определению среднелетучих соединений различной полярности и летучести (спирты, жирные кислоты, н-алканы, ароматические углеводороды, альдегиды и кетоны) в органических и водных растворах на уровне 10"8 - 10"6 % и 10"®- 10"7 %, соответственно. Он основан на предложенном методе концентрирования органических растворов (экстрактов) в условиях НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата. С использованием данного подхода изучен состав конденсата выдыхаемого воздуха здоровых людей и больных бронхиальной астмой и ХОБЛ. Зарегистрировано более 100 органических соединений на уровне 10'8 - 10'7 %. В результате математической обработки данных (масс-спектров, времён удерживания и интенсивностей хроматографических пиков зарегистрированных веществ) показана возможность увеличения достоверности диагностики больных бронхиальной астмой и ХОБЛ (до 80%), по сравнению с существующими методами.

14. Предложен новый подход к обнаружению неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях, основанный на их выделении экстракцией растворителем, не растворяющим активное вещество, концентрировании аналитов из всего объёма экстракта предложенным нами методом вне аналитической системы и анализе всего концентрата методом ГХ/МС. Показана возможность увеличения числа обнаруживаемых неизвестных примесей по сравнению с общепринятым подходом и снижению их пределов обнаружения.

Публикации по теме работы

1. Revelsky I.A., Golovko I.V., Yashin Yu.S., Efimov I.P., Zirko B.I., Glazkov I.N., Revelsky A.I., Vulikh P.P., Zolotov Yu.A. On the methodology of trace organic determination in water // Analytical Methods and Instrumentation. 1995. V.2. №4. P. 163-169.

2. Ревельский А.И., Яшин Ю.С., Ларионов О.Г., Ревельский И.А., Ефимов И.П. Быстрый метод скрининга хлорсодержащих пестицидов в воде на уровне следовых концентраций (Ю'10 - 10'"%) // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1996. Т.37. №4. С. 376-380.

3. Ревельский А.И., Яшин Ю.С., Митрошков А.В., Ларионов О.Г., Ревельский И.А., Лазутин М.Г. Быстрый скрининг проб водных и органических растворов на наличие полихлордибензодиоксинов в присутствии хлорорганических пестицидов и полихлорбифенилов на уровне следов // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 1997. Т. 63. №12. С. 3-7.

4. Ревельский А.И., Мочалов Т.Г., Ревельский И.А., Яшин Ю.С., Зирко Б.И., Пасекова Н.А. Изучение возможности газохроматографического анализа больших по объему проб органических растворов // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1998. Т.39. №3. С. 181-183.

5. Ревельский А.И., Ларионов О.Г., Глазков И.Н., Ревельский И.А. Способ ввода в хромато-масс-спектрометр больших по объему проб органических растворов с удалением растворителя вне аналитической системы // Заводская Лаборатория. Диагностика материалов. 2002. Т. 68. № 10. С.11-15.

6. Sobolevsky T.G., Revelsky A.I., Revelsky I.A., Miller В., Oriedo V. Electron ionization mass spectra of N(0,S)-isobutoxycarbonyl isobutyl esters of amino acids // European J. of Mass Spectrometry. 2002. V. 8. P. 447-449.

7. Sobolevsky T.G., Chernetsova E.S., Revelsky A.I., Revelsky I.A., Starostin A.B., Miller В., Oriedo V. Electron ionization mass spectra and their reproducibility for trialkylsilylated derivatives of organic acids, sugars and alcohols // European J. of Mass Spectrometry. 2003. V.9. P. 487-495.

8. Revelsky I.A., Yashin Y.S., Sobolevsky T.G., Revelsky A.I., Miller В., Oriedo V. Electron ionization and atmospheric pressure photochemical ionization in gas chromatography-mass spectrometry analysis of amino acids // European J. of Mass Spectrometry. 2003. V.9. P. 497-507.

9. Ревельский И.А., Караваева В.Г., Яшин Ю.С., Аавик Х.Э., Белов Б.Н., Иоонсон В.А., Милли В.Э., Жуховицкий А.А., Мулярский Я.В., Бородулина Р.И., Зирко Б.И., Капинус Е.Н., Вирюс Э.Д., Глазков И.Н., Полухин Д.Ю., Вулых П.П., Напалкова О.В., Ревельский А.И. Идентификация компонентов сложных смесей, количественный анализ без градуировки, новые подходы к контролю качества химической продукции и эколого-аналитическому контролю. 100 лет хроматографии/отв. ред. Б.А. Руденко. М.: Наука. 2003. (529-545) 739 с.

10. Sobolevsky T.G., Revelsky A.I., Miller В., Oriedo V., Chernetsova E.S., Revelsky I.A. Comparison of silylation and esterification/acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids //J. of Separation Science. 2003. V.26. №17. P. 1474-1478.

11. Sobolevsky T.G., Revelsky A.I., Revelsky I.A., Miller В., Oriedo V. Simultaneous determination of fatty, dicarboxylic and amino acids based on derivatization with isobutyl chloroformate followed by gas chromatography-positive ion chemical ionization mass spectrometry//J. of Chromatogr. B. 2004. V. 800. № 1-2. P. 101-107.

12. Чернецова Е.С., Ревельский А.И., Дёрст Д., Ревельский И.А. Определение элементного состава компонентов смесей углеводородов при использовании газового хроматографа с атомно-эмиссионным детектором: увеличение точности // Журн. аналит. химии. 2005. Т. 60. № 9. С. 963-968.

13. Чернецова Е.С., Ревельский А.И., Дёрст Д., Ревельский И.А. Определение отношений пС/пН в молекулах летучих Cl- и Br-содержащих углеводородов при использовании газового хроматографа с атомно-эмиссионным детектором Н Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2005. Т. 71. № 8. С. 12-14.

14. E.S. Chernetsova, A.I. Revelsky, D. Durst, T.G. Sobolevsky, I.A. Revelsky. Increasing the accuracy of determination of nc/nH ratios by GC-AED // J. of Chromatogr. A. 2005. V. 1071. P. 55-58.

15. Chernetsova E.S., Revelsky A.I., Sobolevsky T.G., Revelsky I.A., Durst D. Improving the Accuracy of Carbon-to-Hydrogen Ratio Determination for P, N, S, O, CI and Br-containing Organic Compounds Using Atomic Emission Detector // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2005. V. 382. P. 448 - 451.

16. Чернецова E.C., Ревельский А.И., Дёрст Д., Ревельский И.А Изучение возможности определения отношений чисел элементов при использовании газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. Т.72. № 2. 2006. С. 8-13.

17. Ревельский А.И., Ревельский И.А. Применение метода хромато-масс-спектрометрии и способа ввода больших по объему проб для определения среднелетучих органических соединений в различных средах. // Хроматография на благо России. Издательская группа «Граница». 2007. Москва. С. 249-272.

18. Родионов А.А., Долгорукова А.В., Ревельский А.И. Прямое определение кетонов и альдегидов методом хромато-масс-спектрометрии с химической ионизацией и регистрацией положительных ионов // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т.7. №.5. С. 726-732.

19. Родионов А.А., Ревельский А.И., Ревельский И.А., Анохина Т.Н., Анаев Э.Х. Хроматомасс-спектрометрическое определение среднелетучих органических веществ в конденсате выдыхаемого воздуха // Масс-спектрометрия. 2007. Т.4. № 2. С. 143-148.

20. Revelsky I.A., Chernetsova E.S., Revelsky A.I. Gas chromatography with atomic emission detection: a method for the determination of hydrocarbon mixture components // Mendeleev Communications. 2009. V.19. №4. P. 233-234.

21. Ревельский А.И., Андриянов A.B., Ревельский И.А. Снижение пределов обнаружения стероидов благодаря сочетанию способа ввода больших проб органических растворов (экстрактов) и метода ГХ/МС. // Масс-спектрометрия. 2009. Т.6. №1. С. 77 - 78.

22. Гуляев И.В., Ревельский А.И. Анализ фармацевтических субстанций методом реакционной газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией // Масс-спектрометрия. 2009. Т.6. №3. С. 199-204.

23. Ревельский А.И., Леднева А.В., Андриянов А.В., Ревельский И.А. Определение моносахаридов методом реакционной газовой хроматографии/масс-спектрометрии с удалением реагента из реакционной смеси // Масс-спектрометрия. 2009. Т.6. №3. С. 221-225.

24. Ревельский И.А., Капинус Е.Н., Федосеева М.В., Ревельский А.И. Одновременное определение общего содержания галоген-, фосфор- и серосодержащих среднелетучих органических соединений в органических

растворах (экстрактах) на ультрамикроуровне // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. Т.76. №4. С. 15-18.

25. Ревельский И.А., Капинус E.H., Федосеева М.В., Ревельский А.И. Определение общего содержания галоген-, фосфор- и серосодержащих среднелетучих органических соединений в воде на уровне 10"'° - 10"'% // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. Т.76. №5. С. 10-15.

26. Chernetsova E.S., Revelsky A.I., Revelsky I.A., Zolotov Yu.A. Gas chromatography of organic mixtures using an atomic emission detector. // J. of Analytical Chemistry. 2010. V.65. №8. P. 788-802.

27. Ревельский А.И., Чернецова E.C., Ревельский И.А. Газовая хроматография с атомно-эмиссионным детектированием, предварительным концентрированием и переводом всего концентрата в хроматограф. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. Т.76. №6. С. 19-21.

28. Ревельский И.А., Ревельский А.И., Капинус E.H. Способ одновременного определения суммарного содержания F-, С1-, Br-, J-, S- и Р-органических соединений в воде и водных растворах. Патент на изобретение № 2395804. Приоритет изобретения от 17. 10. 2008 г. Зарег. в Гос. реестре изобретений РФ 27.07.2010. Бюл. №21.

29. Revelsky A.I., Samokhin A. S., Virus Е. D., Rodchenkov G. М. and Revelsky I. A. High sensitive analysis of steroids in doping control using gas chromatography/time-of-flight mass-spectrometry // Drug Testing and Analysis. 2011. V.3. №4. P. 263-267.

30. Анохина Т.Н., Анаев Э.Х., Ревельский А.И., Родионов A.A., Алексеев Д.В., Ревельский И.А., Кудрявцев В.Б. Диагностическая значимость среднелетучих органических соединений в конденсате выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни лёгких // Пульмонология. 2011. № 4. С.71-75.

31. Ревельский А.И., Глазков И.Н., Яшин Ю.С., Чепелянский Д.А., Самохин A.C., Бурмыкин Д.А., Ревельский И.А. Новый подход к сопоставлению оригинальных фармпрепаратов и дженериков, основанный на сравнении многомерных профилей примесей с использованием СФЭ, ЖЭ и хромато-масс-спектрометрии // Сверхкритические флюиды. Теория и практика. 2011. Т.6. №4. С.51 - 59.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своим учителям профессору, д.х.н. И.А. Ревельскому, профессору, д.х.н. О.Г. Ларионову, к.х.н. Ю.С. Яшину и Б.И. Зирко. Автор благодарен сотрудникам кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ за помощь в обсуждении результатов и поддержку. Автор признателен к.х.н. Вирюсу Э.Д., к.х.н. Глазкову И.Н., Чепелянскому Д.А., бывшим аспирантам, а ныне к.х.н. Соболевскому Т.Г., Капинус E.H., Чернецовой Е.С., Родионову A.A., Богданову A.B., бывшим и нынешним аспирантам и дипломникам Шнайдеру A.A., Брайцеву Р.Н., Михасенко И.А., Федосеевой М.Н., Дротиковой Т.М., Дёмину А.О., Чамян K.P., Ледневой A.B., Гуляеву И.В., Вахрушеву М.К., Самохину A.C., Бочкову П.О., Бурмыкину Д.А. Бучинской А,А„ Разважной О.В. за творческое сотрудничество и помощь в работе.

Подписано в печать: 10.02.2012 Объем: 3 усл.п.л. Тираж: 150 экз. Заказ № 43 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, д. 6, стр. 1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru

02.00.02 — Аналитическая химия)

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва —

Список сокращений

ХД - хромадистилляция

НМХД - непрерывная микрохромадистилляция

НИТХД - непрерывная изотермическая хромадистилляция

ДИТХД - дискретная изотермическая хромадистилляция

ИТХД - изотермическая хромадистилляция

ОХД - ограничительная хромадистилляция

НХ - неэффективная хроматография

ГХ/МС - газовая хромато-масс-спектрометрия

ГХ/АЭД - газовая хроматография с атомно-эмиссионным детектированием

ПИД - пламенно-ионизационный детектор

БСТФА - НО-бис(триметилсилил)трифторацетамид

МТБСТФА - И-метил-М-третбутилдиметилсилилтрифторацетамид

ИБХФ - Изобутилхлорформиат

ИБ - Изобутанол

ГФБ - Гептафторбутанол

ЭИ- электронная ионизация

ХИ- химическая ионизация

Содержание

Введение

Глава 1. Литературный обзор

Глава 2. Новые подходы к концентрированию органических растворов ультрамалых количеств среднелетучих органических соединений и ГХ-МС анализу всего концентрата аналитов

2.1. Подход к обнаружению ПХДД, ПХБ и ХОП в органических растворах на уровне 10"12 - 10"10 %, и в модельных водных растворах на уровне 10'13 - 10"11 %, демонстрирующий принципиальную возможность обнаружения СЛОС на столь низком уровне при сочетании концентрирования органических растворов аналитов и анализа всего концентрата методом ГХ/МС

2.2. Разработка метода концентрирования органических растворов, содержащих следовые количества СЛОС различной полярности и летучести, основанного на НМХД, и анализа всего концентрата аналитов методом ГХ-МС после его перевода в прибор термодесорбцией

Глава 3. Расширение возможностей метода ГХ/МС для обнаружения следов малолетучих и нелетучих органических соединений в органических, водных растворах и биосредах методом ГХ/МС

3.1. Обнаружение следовых концентраций различных органических кислот, Сахаров и спиртов в водных растворах методом ГХ/МС

3.1.1. Дериватизация модельных соединений

3.1.2. Хромато-масс-спектрометрическая идентификация продуктов дериватизации изучаемых соединений

3.1.3. Определение состава жирных, дикарбоновых и аминокислот в клетках аденокарциномы и фибробластов человека

3.1.4. Определение следовых содержаний аминокислот в водных растворах

3.1.5. Исследование возможности обнаружения ряда фармацевтических субстанций в виде их производных методом ГХ/МС

3.2. Разработка метода обнаружения следов ряда физиологически активных соединений в водных растворах и биосредах, основанного на их выделении из образца, дериватизации, замене реагента на легколетучий инертный растворитель, концентрировании полученных растворов в процессе НМХД и анализе всего концентрата производных, свободного от реагента и растворителя методом ГХ/МС

3.2.1. Выбор условий дериватизации ряда нуклеозидов и Сахаров и анализа следов их производных методом ГХ/МС

3.2.2. Разработка способа определения следовых концентраций ряда стероидов в водных растворах и моче, расширяющего возможности антидопингового контроля

Глава 4. Минимизация зависимости сигналов атомно-эмиссионного детектора (АЭД) по углероду и водороду от структуры молекул аналитов, снижение пределов обнаружения при использовании газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором

4.1. Исследование зависимости сигналов АЭД по элементам от структуры молекул компонентов

4.2. Изучение возможности определения содержания компонентов смесей без градуировки по каждому компоненту

4.2.1. Определение содержания компонентов «модельной» смеси н-алканов без градуировки

4.2.2. Изучение возможности определения активного компонента фармацевтических препаратов методом ГХ-АЭД

4.3. Снижение пределов обнаружения метода ГХ/АЭД

4.4. Новый подход к идентификации компонентов смесей среднелетучих органических соединений на уровне следов, основанный на концентрировании больших проб органических растворов (экстрактов) в условиях НМХД и анализе всего концентрата методами ГХ-АЭД и ГХ/МС (ХИ, ЭИ)

Глава 5. Разработка способа быстрого скрининга проб органических и водных растворов на суммарное содержание галоид-, фосфор-, сераорганических соединений на уровне следов в пересчёте на элемент (обобщённый показатель)

Глава 6. Применение разработанного метода концентрирования органических растворов, основанного на НМХД, для обнаружения в объектах анализа следов неизвестных среднелетучих органических соединений

6.1. Определение состава следов СЛОС в образцах конденсата выдыхаемого воздуха человека

6.2. Регистрация следов неизвестных среднелетучих примесей в образцах фармацевтических препаратов после растворения последних в растворителях мало их растворяющих

В настоящее время актуальной задачей является обнаружение следов среднелетучих органических соединений (СЛОС) в различных средах. К СЛОС относятся стойкие органические загрязнители (СОЗ), контролю содержания которых в объектах окружающей среды, продуктах питания и биосредах уделяется особое внимание (хлорорганические пестициды (ХОП), полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), полихлорированные бифенилы (ПХБ), полихлорированные дибензодиоксины (ПХДД), производные фенолов, фталаты и ДР-)

ПДК этих соединений составляют 10'12 - 10"7 % - в зависимости от класса соединений. Большую группу СЛОС составляют опасные соединения, в состав молекул которых входят такие элементы, как Б, С1, Вг, 8 и Р. ПДК для них находятся в том же диапазоне, что и для большинства СОЗ.

Существует необходимость обнаружения следовых содержаний среднелетучих производных (дериватов) нелетучих физиологически активных соединений таких, как аминокислоты, жирные, дикарбоновые кислоты, сахара, стероиды, фармацевтические субстанции и др. в биосредах и водных растворах. Важным объектом анализа являются фармацевтические препараты, и присутствующие в них примеси.

Увеличение достоверности диагностики ряда заболеваний требует обнаружения как числа неизвестных СЛОС, так и их идентификации на следовом уровне в биосредах.

Для решения рассмотренных задач в большинстве случаев требуется предварительное выделение аналитов из матрицы и их концентрирование.

Наибольшее распространение, как при анализе вод, так и продуктов питания, почв, донных отложений, биосред на содержание СЛОС получил метод их выделения и концентрирования, основанный на жидкостной экстракции. Этот метод, в отличие от других известных методов, применим к широкому кругу матриц и лишён ряда ограничений при определении ультрамалых концентраций аналитов, в частности СОЗ. При извлечении СЛОС отбирают большие пробы образца (в случае воды 0.5 - 10 л) и используют большие объёмы органического растворителя (десятки и сотни мл). Полученный экстракт упаривают. Упаренный объём экстракта обычно составляет около 1 мл, а объём анализируемой пробы - 1 мкл (в большинстве случаев). Из-за анализа столь малой части экстракта на стадии перехода от пробоподготовки к анализу имеет место увеличение пределов обнаружения от 1000 до 500 раз.

Для увеличения объёма пробы, анализируемой методом КГХ, используется два основных способа концентрирования примесей из больших проб органических растворов (экстрактов). Первый из них - это ввод больших проб в капиллярную колонку, свободную от НФ (Large volume cold on column injection), второй - это ввод больших проб на сорбент, помещённый в кварцевый лайнер инжектора, нагреваемого по определённой температурной программе (PTV инжектор -Programmed Temperature Vaporizing Injector). Объём пробы, обычно, не более 0.1 мл. При вводе пробы раствора в PTV инжектор с контролируемой скоростью объём пробы может быть увеличен.

Выделение примесей из раствора проводится внутри газового хроматографа (внутри аналитической системы) при вводе всего объёма пробы в капиллярную колонку, свободную от неподвижной фазы, или лайнер инжектора с сорбентом. После завершения концентрирования (удаления основной массы паров растворителя) концентрат аналитов переносится в разделительную колонку (при нагревании капилляра или инжектора). Большинство этих работ выполнено для о о растворов, в которых содержание аналитов в пробе составляло 10" - 10" г, с использованием капиллярной газовой хроматографии. Извлечение примесей из больших проб (до 0.5 мл) органических и водных растворов с нанесением всей пробы в пустую колонку, либо колонку, заполненную инертным носителем, проводилось методом дискретной термической и изотермической хромадистилляции (предложен и развит Жуховицким A.A. и Яновским С.М. с сотрудниками).

Имеется ряд ограничений при концентрировании ультрамалых количеств аналитов различной полярности и летучести этими методами и их определении методом ГХ/МС. Среди этих ограничений: попадание части паров растворителя в разделительную колонку и масс-спектрометр, загрязнение хроматографической системы нелетучими компонентами пробы, изменение аналитического сигнала (форма хроматографических пиков, воспроизводимость масс-спектров), потери следов определяемых веществ или искажение состава пробы. В связи с этим, эти способы нашли ограниченное применение в сочетании с ГХ-МС (обычно концентрирование из проб объёмом до 20 мкл).

Во всех работах, посвященных рассматриваемым способам, не изучали степень извлечения широкого круга среднелетучих органических соединений различной полярности и летучести из больших проб органических растворов, и

10 Л особенно важно, их следовых количеств (10" - 10" г), внутри аналитической системы, в частности ГХ/МС. Не было известно работ по выделению следов СЛОС из больших проб органических растворов (экстрактов) вне термостата колонок или инжектора хроматографа (вне аналитической системы), переводу сконцентрированных определяемых веществ в аналитический прибор посредством термодесорбции и анализу всего концентрата как методом ГХ/МС, так и другими методами. Такое концентрирование позволило бы устранить недостатки известных способов.

В связи с этим актуальным является исследование концентрирования органических растворов (экстрактов) ультрамалых количеств (10*13 - Ю"10 г) СЛОС и анализа всего концентрата методом ГХ/МС с целью снижения пределов обнаружения, особенно при анализе экстрактов из малых проб образцов различных матриц, из которых извлечение аналитов производится жидкостной экстракцией. Актуальным является также снижение пределов обнаружения производных нелетучих физиологически активных органических соединений (аминокислот, жирных кислот, нуклеозидов, стероидов, Сахаров и др.) с целью обнаружения следов таких веществ в различных матрицах. Большой практический интерес представляет разработка подходов к определению состава компонентов смесей заданных и неизвестных соединений на уровне следов для решения различных задач в экологии, медицине, антидопинговом контроле, контроле качества фармацевтических веществ и препаратов.

Актуальной является также разработка подхода к эколого-аналитическому контролю, основанного на быстром скрининге проб органических экстрактов на суммарное содержание следов На1-, Р- и 8- органических соединений в пересчёте на элемент (обобщённый показатель).

Цель работы

Развитие направления обнаружения СЛОС различной летучести и полярности на уровне следов в сложных по составу матрицах, основанного на извлечении обнаруживаемых веществ из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов и анализе всего концентрата аналитов методами ГХ/МС и элементного анализа.

Разработка подходов к обнаружению следов заданных и неизвестных СЛОС в образцах различного происхождения, позволяющих по новому решить задачи экологического контроля, диагностики заболеваний, антидопингового контроля, контроля качества высокочистых веществ (фармсубстанций).

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод анализа следов СЛОС различной полярности и летучести, основанный на извлечении этих веществ из органических растворов в процессе непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) и анализе всего концентрата методами ГХ-МС, ГХ-АЭД и элементного анализа.

2. Выбрать условия хромато-масс-спектрометрического обнаружения ультрамалых количеств широкого круга органических соединений различной полярности и летучести и производных нелетучих органических соединений (в том числе дикарбоновые, гидрокси, окси-, жирные и аминокислоты спирты, сахара, стиролы, нуклеозиды, моносахариды, стероиды, ряда фармацевтических веществ).

3. Расширить возможности метода ГХ/МС для обнаружения следов малолетучих и нелетучих органических соединений в виде их производных, основанного на их выделении из образца, дериватизации, замене реагента на легколетучий инертный растворитель, концентрировании полученных растворов в процессе НМХД и анализе всего концентрата производных методом ГХ/МС.

4. Для метода ГХ/АЭД изучить зависимость сигналов атомно-эмиссионного детектора (АЭД) по углероду и водороду от структуры молекул органических соединений, содержащих такие элементы как С, Н, О, Р, 8, Б, С1 и Вг и разработать условия, минимизирующие такую зависимость. Изучить возможность определения количественного состава компонентов смесей без градуировки по каждому компоненту.

5. Разработать способ быстрого скрининга органических и водных растворов на суммарное содержание следов среднелетучих Б-, С1-, Вг-, 8- и Р-органических соединений в пересчёте на элемент (обобщённый показатель).

6. Разработать способ определения состава неизвестных СЛОС в конденсате выдыхаемого воздуха человека, основанный на жидкостной экстракции, концентрировании аналитов с удалением растворителя в процессе НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата. На основании полученных данных рассмотреть возможность увеличения достоверности диагностики таких лёгочных заболеваний, как бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ).

7. Предложить подход к селективному обнаружению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях на уровне следов, основанный на жидкостной экстракции органическим растворителем, мало-растворяющим основной компонент, концентрировании аналитов с удалением растворителя из этого экстракта вне аналитической системы и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов.

Научная новизна

На примере следовых количеств ПХДД, ПХБ и ХОП показана принципиальная возможность обнаружения следов СЛОС в органических растворах на уровне 10"12 - Ю"10 % и в модельных водных растворах (после микрожидкостной экстракции) на уровне Ю"13 Ю"11 %. Такая возможность показана благодаря сочетанию концентрирования органических растворов (экстрактов) следов СЛОС (основанного на изотермической хромадистилляции при непрерывном вводе пробы в предколонку без неподвижной фазы) и анализа всего концентрата обнаруживаемых веществ методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов.

Предложена методология анализа образцов различного происхождения на содержание следов СЛОС, основанная на их извлечении органическим растворителем, концентрировании полученных растворов в условиях непрерывной микрохромадистилляции и анализе всего концентрата методом ГХ/МС и элементного анализа.

Разработан метод концентрирования органических растворов следов (10"12 -10"9 г) С ДОС в условиях НМХД и анализа всего концентрата свободного от растворителя методами ГХ/МС, ГХ/АЭД и элементного анализа, включающего окислительную конверсию аналитов с последующей регистрацией продуктов конверсии, соответствующих определяемым элементам, методом ионной хроматографии. Этот метод позволяет на 2-3 порядка снизить пределы обнаружения. Он явился основой при разработке подходов и способов обнаружения CJIOC в различных средах на уровне следов, которые позволили решить различные задачи в экологии, медицине, антидопинговом контроле, идентификации, контроле качества лекарственных средств на новом уровне.

Предложено описание процесса концентрирования органических растворов следов CJIOC при непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) (при наличии или отсутствии сорбента). Описание основано на теории хромадистилляции предложенной A.A. Жуховицким.

Выбраны условия дериватизации для следовых количеств (10"п - 10"9 г) широкого круга нелетучих или малолетучих биологически активных соединений (аминокислоты, жирные, дикарбоновые, гидрокси, оксикислоты, нуклеозиды, сахара, стероиды и др.) при использовании реакции силилирования и этерификации/ацилирования (для амино и жирных кислот).

Предложена новая методология обнаружения следов изученных кислот, спиртов, Сахаров и стиролов при их совместном присутствии в водном растворе. Она основана на высушивании одной части образца и последующем триметилсилилировании смесью БСТФА с пиридином, и дериватизации другой части смесью изобутилхлорформиата (ИБХФ) с гептафторбутанолом в водно-органическом растворе с последующей жидкостной экстракцией и ГХ/МС анализом соответствующих производных в выбранных в результате исследований условиях эксперимента.

При использовании для дериватизации реакции этерификации/ацилирования впервые изучен состав жирных, дикарбоновых и аминокислот в лиофилизатах клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов с использованием ГХ/МС анализа производных определяемых соединений и впервые показана возможность увеличения достоверности установления отличия этих клеток друг от друга на основании различия в составе аминокислот.

Разработан метод обнаружения нелетучих физиологически активных веществ, основанный на их дериватизации, замене реагента после дериватизации на легколетучий инертный растворитель, концентрировании полученных растворов в условиях НМХД и анализе всего концентрата свободного и от реагента и от растворителя методом ГХ/МС. Метод позволил снизить пределы обнаружения производных таких соединений более чем на 2 порядка.

Предложен подход к обнаружению С-, Н-, 1М-, О-, Б-, С1-, Вг-, Р- и 8-содержащих органических соединений методом ГХ/АЭД, позволивший минимизировать зависимость сигналов этого детектора по С и Н от структуры и элементного состава аналитов при использовании гелиевой плазмы, обогащенной кислородом. Это позволило осуществить определение отношений пс/пн для различных веществ с минимальной погрешностью. Позволило предложить способ определения процентного содержания углерода в молекулах компонентов смесей углеводородов с высокой точностью и определения их количественного содержания без градуировки АЭД по каждому компоненту. Способ не требует образцов сравнения для каждого компонента смеси.

Практическая значимость

Предложенный подход к обнаружению ПХДД, ПХБ и ХОП в органических и водных растворах при их совместном присутствии в смеси на уровне 10"12 - 10"10 % показывает принципиальные возможности сочетания предложенного подхода к концентрированию органических растворов и анализа всего концентрата методом ГХ/МС. В случае отсутствия (или снижения) влияния мешающих компонентов матрицы способ позволяет проводить быстрый скрининг проб экстрактов на наличие хлорсодержащих токсикантов.

Модификации разработанного метода концентрирования органических растворов следов СЛОС в условиях НМХД (размеры камеры концентрирования, вид сорбента, его количество либо отсутствие, условия перевода в разделительную капиллярную колонку, условия хромато-масс-спектрометрического анализа) позволили разработать ряд способов и подходов к обнаружению компонентов различных сложных смесей при их содержании на ультрамикроуровне, и решить ряд важных задач в эколого-аналитическом контроле, медицинской диагностике, антидопинговом контроле и идентификации компонентов сложных смесей.

Разработанный способ определения аминокислот в водных растворах, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных в воде, их жидкостной экстракции, концентрировании растворов аналитов в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов, позволяет снизить пределы обнаружения аминокислот более, чем на 2 порядка, благодаря чему существенно расширены возможности решения различных задач, связанных с определением состава аминокислот. Показанная возможность увеличения достоверности установления отличия клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов между собой на основании различия в составе аминокислот может увеличить достоверность гистологической диагностики онкозаболеваний.

Разработанные способы определения следовых содержаний производных ряда нуклеозидов, 2-деокси-2-фтор-с1-глюкозы, ряда Сахаров, позволяют снизить пределы обнаружения более чем на 2 порядка, и решить соответствующие задачи на новом уровне, недостижимом при общепринятом подходе.

Существенно расширены возможности антидопингового контроля благодаря разработанному способу анализа стероидов в водных растворах и моче. Способ позволяет зарегистрировать в моче больше соединений со стероидной структурой и снизить предел обнаружения более чем в 100 раз по сравнению с общепринятым подходом.

Разработанный подход, позволяющий минимизировать зависимость сигналов по С и Н атомно-эмиссионного детектора (АЭД) от структуры аналитов, и определять отношения пс/пн с низкой погрешностью расширяет возможности ГХ/АЭД с точки зрения определения как качественного, так и количественного состава компонентов смесей, особенно компонентов смесей углеводородов. Показана возможность определения элементного состава компонентов и их содержания для различных смесей без проведения градуировки АЭД по каждому компоненту, что очень важно при анализе многокомпонентных смесей. Предложенные подходы к обнаружению следов аналитов в органических растворах, основанные на концентрировании этих растворов в условиях НМХД и последующем анализе всего концентрата методами ГХ/АЭД и ГХ/МС, позволившие снизить пределы обнаружения методов ГХ/АЭД и ГХ/МС более чем на 2 порядка, существенно расширили возможности как обнаружения заданных соединений, так и идентификации компонентов смесей на уровне следов при совместном использовании данных, полученных этими методами.

Предложен способ дифференциации здоровых людей и больных астмой и

ХОБЛ, при использовании разработанного подхода к определению состава

8 1 неизвестных СЛОС на уровне следов (10" - 10" %) в водном конденсате выдыхаемого воздуха, вносящий вклад в развитие методов диагностики лёгочных заболеваний.

Новые возможности в эколого-аналитическом контроле открываются при использовании предложенных способов определения суммарного содержания На1-, Р- и 8- содержащих органических соединений на уровне (Ю"10 - 10"8 %) в водных и органических растворах. Эти способы позволяют создать новую методологию действенного эколого-аналитического контроля за всеми наиболее опасными нормируемыми и ненормируемыми токсикантами, основанную на быстром скрининге проб на суммарное содержание соответствующих соединений (элементов).

Предложенный новый подход к определению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях, основанный на жидкостной экстракции и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата открывает новые возможности для сопоставления качества оригинальных (патентованных) субстанций (и препаратов на их основе) и дженериков (копий). Такое сопоставление основано на сравнении многомерных профилей примесей (времён удерживания, масс-спектров электронной и химической ионизации и интенсивностей соответствующих сигналов для зарегистрированных соединений) для соответствующих препаратов.

Положения, выносимые на защиту 1. Подход к обнаружению ПХДД, ПХБ и ХОП в органических растворах на уровне 10"12 - Ю"10 % и в водных растворах (после микрожидкостной экстракции) на уровне

10-13 10-п 0/о подход основан на концентрировании органических растворов (экстрактов) следов этих веществ в условиях непрерывной изотермической хромадистилляции в предколонке без неподвижной фазы и анализе всего концентрата методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов.

2. Метод концентрирования органических растворов (экстрактов) следовых количеств среднелетучих органических соединений в условиях НМХД, переводе концентрата термодесорбцией в аналитический прибор и анализе всего концентрата методами ГХ/МС и элементного анализа.

3. Способ определения аминокислот в водном растворе на уровне следов основанный на получении их ИБОК-ГФБ производных, жидкостной экстракции, концентрировании экстрактов в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов, позволяющий снизить предел обнаружения более чем на 2 прядка.

4. Способ дифференциации клеток аденокарциномы и фибробластов, основанный на определении состава аминокислот (их ИБОК-ГФБ производных) методом реакционной ГХ/МС в этих клетках.

5. Метод обнаружения нелетучих органических соединений (или соединений, аналитический сигнал производных которых более информативен), основанный на дериватизации, замене реагента после проведения дериватизации на летучий растворитель, концентрировании полученных растворов производных в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов.

6. Способ обнаружения стероидов в водных растворах и моче, основанный на разработанном методе, позволивший снизить более чем на 2 порядка пределы обнаружения и регистрировать в моче большее число соединений со стероидной структурой.

7. Подход к минимизации зависимости сигналов АЭД по С и Н от структуры молекул аналитов, и определения отношения пс/пн с высокой точностью, основанный на использовании гелиевой плазмы, обогащенной кислородом. Способ определения элементного состава компонентов смесей углеводородов с высокой точностью и их количественного содержания без градуировки АЭД по каждому компоненту с использованием разработанных условий определения.

8. Подходы к обнаружению органических соединений на уровне следов в органических растворах (экстрактах) методами ГХ/АЭД и ГХ/МС, позволяющие снизить пределы обнаружения этими методами более чем на 2 порядка и увеличить.

9. Способ одновременного определения общего содержания На1-, Р- и 8-содержащих органических соединений в водных растворах, основанный на высаливании, жидкостной экстракции, концентрировании экстракта в условиях НМХД, переводе всего концентрата аналитов в реактор термодесорбцией и анализе всего абсорбата продуктов высокотемпературной окислительной конверсии методом ионной хроматографии (предел обнаружения по элементу на уровне 1(Г10%).

10. Способ определения состава неизвестных СЛОС на уровне 10'8- ю-7% в водном конденсате выдыхаемого воздуха, основанный на жидкостной экстракции с высаливанием, выделении аналитов из полученного органического экстракта в режиме НМХД и анализе всего концентрата методом ГХ/МС. Подход к дифференциации здоровых людей и больных ХОБЛ и бронхиальной астмой с высокой достоверностью на основании данных, полученных в результате анализа соответствующих конденсатов.

11. Новый подход к определению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях и фармпрепаратах на их основе. Подход основан на жидкостной экстракции растворителем, не растворяющим основной компонент, концентрировании полученных экстрактов в режиме НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата аналитов. По сравнению с существующими подходами, данный позволяет зарегистрировать большее число примесей.

Литературный обзор

При определении следов органических соединений в матрицах различного происхождения методом газовой хроматографии с разными детекторами широко применяются способы пробоподготовки, основанные на жидкость-жидкостной и твердофазной экстракции. Результатом данных способов пробоподготовки обычно является экстракт, объём которого равен 1 мл. При этом объём пробы, анализируемый методом ГХ, обычно составляет 1-2 мкл. Таким образом, на стадии перехода от пробоподготовки к анализу концентрационный предел обнаружения повышается на 1-3 порядка.

Для устранения указанного недостатка в современном анализе следов органических соединений применяется способ «Ввода больших проб» (Large volume injection). Этим способом осуществляется концентрирование определяемых веществ с последующим их переносом в аналитическую колонку в потоке газа-носителя, посредством нагревания области концентрирования. Благодаря использованию разных вариантов этого способа удаётся увеличить объём вводимой в газовый хроматограф пробы от 1 до 100 мкл и более. Весь органический экстракт, полученный в результате пробоподготовки (а не 1/1000 его часть) может быть проанализирован методом ГХ благодаря использованию этого способа.

Наиболее распространенными способами ВБП являются способы, использующие обогреваемый инжектор с возможностью программирования значения температуры и необогреваемый инжектор с возможностью ввода жидкой пробы (органического раствора) непосредственно в колонку (а точнее, в кварцевый капилляр без фазы, соединённый с аналитической колонкой) [1]. Обогреваемый инжектор с возможностью программирования температуры представлен на рисунке 1.

Линия обдува септы колонка

Рис. 1. Обогреваемый инжектор с возможностью программирования температуры ввода

В инжекторе расположен кварцевый лайнер, в который помещают сорбент для удерживания большого (100 мкл) объёма раствора и концентрирования определяемых веществ.

Техника ввода пробы таким способом заключается в следующем. Температура инжектора устанавливается на 10-40°С ниже температуры кипения растворителя. Весь объём пробы либо быстро, либо с контролируемой скоростью вводится в лайнер. При этом открыта линия деления потока газа-носителя, обеспечивая большую (100-200 мл/мин) скорость потока газа-носителя из инжектора через линию делителя. Растворитель испаряется. Его пары в потоке газа-носителя удаляются из инжектора через линию делителя потока, при этом определяемые вещества концентрируются на сорбенте в лайнере. В случае ввода пробы с контролируемой скоростью, значение последней выбирается таким, чтобы количество растворителя, поступающее в единицу времени в инжектор, было равным количеству его паров удаляемых с потоком газа-носителя. После испарения растворителя линия деления потока инжектора закрывается, инжектор быстро нагревается и сконцентрированные на сорбенте определяемые вещества в

17 потоке газа-носителя переводятся в аналитическую колонку. Температура колонки в это время значительно (на 100°С и более) ниже температуры кипения определяемых веществ. Далее термостат колонок нагревается по заданной программе и происходит разделение сконцентрированных веществ [2, 3]. Недостатками указанного способа ВБП являются:

• разложение неустойчивых веществ (сорбент может выступать и в роли катализатора этого процесса) в процессе термодесорбции;

• возможная необратимая сорбция некоторых определяемых веществ. Необогреваемый инжектор с возможностью ввода через него жидкой пробы непосредственно в колонку (а точнее, в кварцевый капилляр без фазы, соединённый с аналитической колонкой) представлен на рисунке 2.

Рис. 2. Схема ввода пробы через необогреваемый инжектор

Необогреваемый инжектор подсоединён к длинной (до нескольких метров) пустой предколонке (кварцевый капилляр без фазы). Между пустой предколонкой и аналитической колонкой находится короткая (до 1 м) удерживающая предколонка, покрытая той же фазой, что и аналитическая колонка.

Техника ввода пробы осуществляется следующим способом. С помощью шприца проба (обычно 100 мкл) вводится через необогреваемый инжектор в предколонку с оптимальной для данного растворителя скоростью и при оптимальной температуре термостата колонок (на 10-40°С ниже температуры кипения растворителя). В процессе ввода пробы растворитель, двигаясь по предколонке в потоке газа-носителя, распределяется по её стенкам и постепенно испаряется. Образовавшиеся пары удаляются через линию сброса паров растворителя. Определяемые вещества концентрируются в предколонке и коротком капилляре с фазой. После испарения основной массы растворителя (незначительная часть оставляется, т.к. на её заднем фронте концентрируются менее летучие определяемые вещества) линию сброса паров закрывают и нагревают термостат колонок по заданной программе. Осуществляется разделение сконцентрированных веществ [4, 5]. Недостатками данного способа ВБП являются:

• постепенное загрязнение предколонки нелетучими компонентами пробы, что приводит к искажению аналитического сигнала определяемых веществ (размывание хроматографических пиков и снижение пределов обнаружения);

• необходимость очень точного подбора скорости ввода пробы раствора в предколонку (количество поступающего растворителя должно быть равным количеству удаляющегося в виде пара); в противном случае наблюдается проскок раствора в виде жидкости в разделительную колонку.

Также в литературе представлены способы ВБП, применяющие петлевой дозатор для ввода пробы в колонку и технику ввода пробы, основанную на концентрировании определяемых веществ из раствора при испарении растворителя в лайнере инжектора (лайнер заполнен сорбентом) при температуре выше температуры кипения растворителя и без подачи газа носителя (vapour-overflow). На рисунке 3 представлено устройство ВБП с петлевым дозатором.

Стандартный шести-ходовой кран для ввода пробы в жидкостный хроматограф, с петлёй-дозатором (металлическая или полимерная трубка) известного объёма, установлен на верхней панели ГХ. К крану подсоединён пустой капилляр (проходящий через термоизолированную стенку хроматографа), соединённый с предколонкой (пустой кварцевый капилляр). Эта предколонка соединяется с аналитической колонкой и линией сброса паров растворителя. Температуру термостата колонок устанавливают незначительно выше температуры кипения растворителя при рабочем давлении газа-носителя. Вдоль капилляра устанавливается положительный градиент температуры. вэжх

Сброс растворителя

Линия сброса

Термостат ; колонок ' растворителя - чг Термостат £ А колонок

Пары 1 растворителя и летучие 1 компоненты ! < < 4 1 ■ > г Пустой кварцевый ( капилляр ' (удерживающая 1 предколонка) 1 Аналитическая колонка

Рис. 3. Устройство ввода пробы с петлевым дозатором

Объём пробы, забранный в петлю, в потоке газа носителя поступает по соединительному капилляру в сторону аналитической колонки. По мере движения по капилляру пробка раствора достигает точки градиента температуры, в которой растворитель с переднего фронта, нагреваясь, начинает испаряться. Под давлением образовавшихся паров растворителя жидкая пробка раствора выталкивается вверх, в более холодную зону, откуда её снова продвигает вниз поток газа-носителя. Устанавливается равновесие, давление образующихся паров растворителя уравновешивается давлением газа-носителя. Пробка раствора продолжает уменьшаться до полного испарения растворителя, пары растворителя удаляются через линию сброса, определяемые вещества концентрируются на поверхности предколонки. После окончания ввода пробы термостат колонок нагревают по заданной программе и осуществляют разделение сконцентрированных веществ [6, 7]. Недостатками данного способа ВБП также являются:

• постепенное загрязнение предколонки нелетучими компонентами пробы, что приводит к искажению аналитического сигнала определяемых веществ (размывание хроматографических пиков и снижение пределов обнаружения);

• необходимость очень точного подбора скорости ввода пробы раствора в предколонку; в противном случае наблюдается проскок раствора в виде жидкости в аналитическую колонку.

• после каждого ввода пробы на стенках капилляра, соединяющего петлевой дозатор и предколонку, остаётся тонкая плёнка раствора; таким образом, перед каждой следующей пробой в капилляре присутствует остаток предыдущей пробы.

На рисунке 4 [8] представлена схема техники ВБП, основанная на концентрировании определяемых веществ из раствора при испарении растворителя в лайнере инжектора (лайнер заполнен сорбентом) при температуре выше температуры кипения растворителя и без подачи газа носителя (vapour-overflow).

Анализируемый раствор

Газ-носитель

Сорбент

Пары растворителя

Анализируемый раствор

Линия

7\ делителя

Аналитическая потока колонка

Рис. 4. Устройство ввода пробы Vapour-overflow

Сам инжектор похож на инжектор с программированием температуры. Внутри инжектора также расположен кварцевый лайнер, наполненный сорбентом. Но температура инжектора устанавливается несколько выше температуры кипения растворителя. В инжекторе не создаётся избыточное давление посредством подачи газа-носителя. Газ-носитель во время концентрирования не подаётся в инжектор и линия деления потока закрыта. Открыта линия обдува герметизирующей инжектор прокладки (септы). Жидкая проба единовременно вводится в лайнер и удерживается на сорбенте. Растворитель испаряется. Его пары, создавая некоторое избыточное давление, удаляются из инжектора через линию обдува септы. Постепенно весь растворитель испаряется. Определяемые соединения концентрируются на сорбенте. Далее линия обдува закрывается, подаётся поток газа-носителя, инжектор быстро нагревается и, сконцентрированные вещества переносятся в аналитическую колонку [9, 10].

Авторами статьи [10] представлена конструкция инжектора (at-column), сочетающая в себе возможности инжектора с программированием температуры, инжектора с петлевым дозатором и инжектора, в котором растворитель испаряется в условиях, когда температура инжектора выше температуры кипения растворителя и газ-носитель не подаётся. Авторы обращают внимание на устранение (или минимизацию влияния) недостатков трёх перечисленных способов в представленной ими конструкции. Схема данного способа ВБП представлена на рисунке 5.

Газ-носитель

Уплотнитель

Т> Т,

Давление паров

Давление паров

Определяемые компоненты

Стеклянный шарик

Область концентрирования

Рис. 5. Устройство ввода пробы АТ-со1ишп [10].

В этой схеме используется пустой (без сорбента) лайнер, температура которого ниже температуры кипения растворителя. Этот лайнер соединен с капиллярной кварцевой предколонкой, температура которой устанавливается выше температуры кипения растворителя. Таким образом, по аналогии с устройством ВБП с петлевым дозатором, создается положительный градиент температур. С другой стороны предколонка соединена с капиллярной ГХ колонкой. Между предколонкой и ГХ колонкой отсутствует линия сброса паров растворителя.

Техника ввода пробы следующая. Раствор пробы (120 мкл) вводят в холодный лайнер. В потоке газа-носителя раствор пробы движется в сторону предколонки. В некоторой точке первых сантиметров капилляра (предколонки) раствор достигает

22 температуры кипения, и растворитель начинает испаряться. Образовавшийся пар толкает пробку жидкости вверх, в более холодную зону. Оттуда следующую порцию раствора продвигает вниз поток газа-носителя. Процесс повторяется до тех пор, пока не испарится последняя капля в капилляре. Пары растворителя удаляются через отверстие в кварцевом лайнере. В результате все компоненты образца концентрируются вверху кварцевого капилляра. Затем линию сброса паров растворителя закрывают, повышают температуру лайнера, и определяемые компоненты в потоке газа-носителя переносятся в аналитическую колонку. Далее проводят ГХ разделение.

Ещё одна конструктивная особенность в предлагаемом способе ВБП - это использование маленького стеклянного шарика (примерно 1 мм в диаметре), который расположен в нижней части лайнера. Этот шарик предотвращает «заброс» раствора в кварцевый капилляр в начале ввода пробы, когда еще давление потока газа-носителя не уравновешено давлением образовавшихся паров.

Другим достоинством такой техники ввода является то, что испарение растворителя происходит в холодной зоне лайнера, который не заполнен сорбентом (поверхность испарения меньше), благодаря процессу диффузии (очень медленно). Удаление паров происходит через очень маленькое отверстие (2 мм в диаметре) в верхней части лайнера, поэтому только небольшая часть пара выводится из системы, а остальная снова конденсируется в холодной части лайнера. Все это понижает возможность потери легколетучих компонентов. Так же благодаря отсутствию сорбента, уменьшается вероятность необратимой сорбции следов определяемых веществ.

Основными недостатками всех представленных способов ввода остаются:

• загрязнение нелетучими компонентами устройства ввода и аналитической колонки (или предколонки); во время вывода на режим указанных деталей хроматограф бездействует; колонка может быть загрязнена необратимо;

• во время концентрирования определяемых веществ (удаления растворителя) прибор (газовый хроматограф) простаивает;

• анализ пробы определяемых веществ возможен только на том приборе, в котором проводится концентрирование.

В связи с выше сказанным, представляется интересным рассмотреть вариант концентрирования определяемых веществ из раствора (с последующим их переводом в аналитическую колонку газового хроматографа в потоке газа-носителя при нагревании), расположенный вне газового хроматографа. Для каждого хроматографа таких устройств концентрирования может быть несколько. Это позволит не только легко заменять загрязнившееся устройство новым и быстро приводить в рабочий режим загрязнившееся (не влияя на время и качество работы хроматографа), но и иметь в наличии набор различных устройств (например, с различными сорбентами) для различных аналитических задач.

В области разработки методов введения в хроматограф больших по объёму проб большой вклад внесли учёные нашей страны. A.A. Жуховицким с соавторами был разработан и развит новый вариант разделения термостабильных и летучих соединений - хромадистилляция [11-17].

При хромадистилляции в колонке в потоке газа-носителя происходят многократные процессы конденсации и испарения компонентов анализируемой смеси. При этом колонка либо заполнена твёрдым инертным носителем, либо (в случае капиллярного варианта) пустая (поверхность капилляра свободна от какой-либо неподвижной фазы). Разделение смеси достигается либо благодаря температурному полю вдоль колонки с отрицательным градиентом (термическая ХД), либо благодаря вводу в колонку до анализируемой пробы дозы вещества, обладающего большей летучестью, чем любой из компонентов смеси (ограничительная ХД), либо при изотермическом элюировании (изотермическая ХД).

Хромадистилляционные процессы использовались для различных задач. Из органических растворов хромадистилляция позволяет концентрировать вещества с меньшими и большими по сравнению с макрокомпонентом (например, растворителем) температурами кипения. Данную возможность используют для концентрирования органических веществ из органических растворов [18].

Соавтор работ A.A. Жуховицкого С.М. Яновский рассматривает процессы концентрирования примесей из растворителя с применением так называемого «эффекта растворителя», представленные в работах Гроба и других авторов [1923], как частный случай хромадистилляции [24].

Наличие компонентов на колонке в жидком виде (особенно растворителя как главного компонента смеси) создаёт условия для формирования узких фронтов на границе между зонами разделяемых компонентов, и соответственно, для концентрирования примесных компонентов на этих границах. Гроб и соавторы рассматривают процессы, происходящие в начале колонки (или предколонки свободной от неподвижной фазы) где растворитель находится в виде жидкой фазы, только как хроматографические. Яновский же считает, что эти процессы принадлежат в большой степени и дистилляционным и охватываются хромадистилляцией. Он рассматривает работы по «эффекту растворителя», как важное применение хромадистилляции для определения примесей в растворителях [24]. К ним же относятся работы [4,5] по концентрированию аналитов из раствора в предколонке свободной от неподвижной фазы.

Все рассмотренные варианты концентрирования органических растворов различных веществ наряду с достоинствами обладают одним серьёзным недостатком (из которого следуют остальные вышеперечисленные) концентрирование и анализ объединены в одном приборе. Научный и практический интерес представляет концентрирование с удалением органического растворителя вне аналитического оборудования с возможностью последующего анализа всего концентрата различными методами.

В настоящее время для определения таких классов соединений, как жирные кислоты, дикарбоновые кислоты, аминокислоты, оксикислоты, сахара, спирты и стиролы используется капиллярная газовая, высокоэффективная жидкостная, ионообменная хроматография (РГХ, ВЭЖХ и ИОХ, соответственно), а также капиллярный электрофорез (в случае аминокислот). Подобные анализы востребованы в контроле качества пищевых продуктов, продуктов фармацевтической промышленности, в медицинской диагностике, в биотехнологии и микробиологических исследованиях. В литературе представлено большое количество вариантов определения отдельных групп таких соединений. Сложность представляет определение этих классов соединений на уровне следов и при совместном присутствии в смеси.

Совокупность уникальных преимуществ метода газовой хроматографии-масс-спектрометрии (высокая селективность разделения и чувствительность определения, воспроизводимые масс-спектры электронной ионизации, позволяющие использовать коммерческие базы данных, масс-спектры химической ионизации с регистрацией положительных и отрицательных ионов) может быть использована для анализа смесей, содержащих данные классы соединений, но после предварительного получения их летучих производных (дериватизации).

Для получения летучих и термостабильных производных существует достаточно большое число методов, основанных на различных химических реакциях [24], главным образом этерификации, ацилирования и алкилирования.

Для аминокислот достаточно распространенным является получение силилиловых эфиров аминокислот [25-29], при этом ТБДМС производные, хотя и имеют большие времена удерживания, обладают целым набором преимуществ по сравнению с ТМС эфирами (на четыре порядка более устойчивы к гидролизу, дериватизация при меньших температурах) [30-32].

Однако методики получения таких производных противоречивы: разные авторы рекомендуют использовать различные соотношения реагента и растворителя (и разные растворители), а также различные температурно-временные условия проведения реакции [33-34].

Наиболее часто в настоящее время используется способ дериватизации, который основан на получении различных //-алкоксикарбонил алкиловых эфиров в водно-органической среде. Он является наиболее простым, экспрессным и универсальным, позволяя получать летучие производные не только аминокислот, но и других органических кислот [35-48]. Однако выход этой реакции для разных аминокислот достаточно сильно отличается. Условия дериватизации, используемые разными авторами, также отличаются.

При получении летучих производных жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксикислот и Сахаров большинство авторов использует силилирование. При этом условия реакций в разных работах ощутимо отличаются: предлагаются различные реагенты (ГМДС, БСТФА, МТБСТФА, ТБДМСИ), температурно-временные режимы дериватизации и растворители [49-54]. При этом в качестве детектора часто применяют ПИД, который не может обеспечить необходимого уровня чувствительности, селективности и достоверности идентификации. Противоречива либо отсутствует и информация о пределах обнаружения. Имеется лишь небольшое число публикаций по применению ГХ-МС для анализа летучих производных аминокислот, жирных, дикарбоновых кислот и Сахаров. Только в ряде работ проводят одновременное определение соединений различных классов, однако зачастую ограничиваются при этом лишь немногими представителями, и сама пробоподготовка требует больших затрат времени [55-63]. Не рассматривается возможность определения органических кислот и Сахаров при их совместном присутствии в водных либо культуральных средах на ультраследовам уровне.

В связи с этим актуальным является поиск условий определения аминокислот, органических кислот и Сахаров при их совместном присутствии в водном растворе, которые обеспечивали бы получение летучих производных наибольшего числа соединений при минимальном времени пробоподготовки и дериватизации, а также возможность увеличения селективности и снижения пределов обнаружения.

Поэтому актуальной является разработка способа определения аминокислот, жирных, дикарбоновых, гидрокси- и оксикислот, а также Сахаров, спиртов и стиролов в водных и органических растворах (экстрактах) при их совместном присутствии на ультранизком уровне методом хромато-масс-спектрометрии. Важно рассмотреть возможность концентрирования органических растворов полученных производных и анализа всего экстракта для снижения предела обнаружения.

Применение метода газовой хроматографии для определения нуклеозидов стало актуальным практически сразу же после того, как было выдвинуто предположение о том, что они могут служить биомаркерами раковых заболеваний. Это связано с тем, что газовая хроматография обладает большей чувствительностью и эффективностью по сравнению с другими методами, применявшимися для этого (ионообменная хроматография, тонкослойная хроматография, электрофорез) [65].

Чтобы определять нуклеозиды, необходимо было перевести их в летучую термостабильную форму. Первыми были опробованы ацильные и метальные производные [66]. С помощью них не смогли добиться воспроизводимых результатов при определении цитидина и гуанозина, в связи, с чем стали использовать новый способ дериватизации - силилирование [65]. В работе [65] были начаты исследования по получению триметилсилильных производных девяти нуклеозидов (уридин, деоксиуридин, тимидин, аденозин, деоксиаденозин, инозин, гуанозин, цитидин, ксантозин) с помощью смеси гексаметилдисилазан -триметилхлорсилан (2:1). Были проведены ИК- и ПМР- исследования структур полученных производных. Было установлено, что производные неустойчивы к гидролизу в отсутствии избытка реагента.

Эффективность использования бис(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА) сравнивали с другими силилирующими реагентами, такими как бис(триметилсилил)ацетамид, триметилсилилимидазол. Было показано, что БСТФА является лучшим, т.к. обладает наибольшей реакционной способностью [67]. Были проведены исследования по отработке условий проведения дериватизации нуклеозидов с помощью БСТФА, изучали влияние изменения температуры, продолжительности реакции, влияние соотношения реагентов и используемого растворителя на выход реакции. Оптимальными были выбраны следующие условия дериватизации: нагревание реакционной смеси в течение 15 минут при 150°С при 225-кратном молярном избытке БСТФА, а в качестве растворителя лучшими оказались пиридин и ацетонитрил [68, 69].

Работы по получению производных нуклеозидов, результаты которых отражены в статьях [67-69], стали основой для всех последующих исследований в этой области. На сегодняшний день анализ проб нуклеозидов в основном выполняют с помощью метода ВЭЖХ/МС, но для регистрации следов соединений данного класса в образце с последующей их идентификацией применение реакционной ГХ/МС, на наш взгляд, остаётся актуальным. Особый интерес представляет анализ больших проб растворов следов производных нуклеозидов, но для этой цели необходимо изучить возможность замены реакционной смеси после дериватизации на легколетучий инертный растворитель.

В настоящее время для скрининга анаболических стероидов при проведении допингового контроля используют метод газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) в режиме селективного ионного детектирования и метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) [70]. Однако эти подходы не позволяют провести однозначную идентификацию [71]. Если в результате анализа возникает подозрение на содержание в пробе запрещенных веществ, проводят подтверждение их присутствия, а иногда и количественное определение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС2) [72] или с масс-спектрометрией высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР) с орбитальной ловушкой [73-75]. Применяется также метод газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (ГХ-МСВР) [76 - 78].

В подавляющем большинстве работ стероиды определяют в виде силильных или ацильных производных, что объясняется повышением термической и химической устойчивости, снижением необратимой сорбции на активных центрах, увеличением летучести, образованием фрагментарных ионов с большей молекулярной массой, менее подверженных влиянию фона, и снижением пределов обнаружения [79-82].

Для дериватизации гидроксильных групп стероидов наиболее часто используют триметилсилилирование [79]. Обычно анализируют саму реакционную смесь, вводя пробу с делением потока. В результате и повышается предел обнаружения, и защитить прибор от негативного влияния реагента полностью не удаётся. Актуальным является изучение возможности замены избытка реагента после проведения дериватизации на легколетучий инертный растворитель, концентрирования полученных растворов производных стероидов и анализа всего концентрата методом ГХ/МС.

Согласно литературным данным фармацевтические вещества и примеси в них определяют в основном методом ВЭЖХ (УФ) либо ВЭЖХ/МС (МС) т.к. большинство из них часто является нелетучими соединениями [93-105].

Метод газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием для определения фармацевтических препаратов и их метаболитов и примесей в фармацевтических препаратах применяется значительно реже [106-113]. Применение этого метода, как для определения самих фармацевтических веществ, так и их производных после дериватизации представляет научный и практический интерес.

Принцип атомно-эмиссионного детектирования органических соединений основан на атомизации молекул этих соединений в высокотемпературной плазме, сопровождающейся переходом атомов в возбужденное состояние, и регистрации характеристичного для каждого элемента излучения, испускаемого этим элементом при переходе в нормальное состояние [114]. Сочетание такого детектора с газовой хроматографией расширяет область исследований и анализа многокомпонентных смесей.

При условии полной атомизации вещества в плазме детектора значение интенсивности излучения на длине волны, соответствующей регистрируемому элементу, должно быть пропорционально концентрации этого элемента в плазме, а коэффициент пропорциональности - одинаков для всех соединений. При соблюдении этого условия появляются две уникальных области применения атомно-эмиссионного детектора в сочетании с газовой хроматографией [115 - 119]:

- определение отношений чисел атомов в молекулах компонентов смесей;

- количественный анализ без градуировки по каждому компоненту (т.е. в отсутствие стандартов всех определяемых соединений и используя лишь одного стандартное вещество).

При этом на результат определения будет влиять дискриминация пробы в системе ввода и воспроизводимость ввода пробы.

Вопросам возможности регистрации сигнала АЭД на длине волны регистрируемого элемента независимого от структуры, концентрации и элементного состава определяемых соединений посвящено большое количество работ [120-139]. Несмотря на многочисленность этих публикаций и многообразие представленных в них (часто противоречивых) данных изучение возможности регистрации сигналов атомно-эмиссионного детектора, независимых от структуры, элементного состава и количества определяемого соединения остаётся актуальным.

Актуальна разработка подхода к определению отношений чисел атомов углерода и водорода в молекулах компонентов смесей органических соединений и их количественного определения без проведения градуировки по каждому компоненту при использовании метода газовой хроматографии с атомно-эмиссион-ным детектором. Сочетание метода ГХ/АЭД со способом ввода больших по объему проб органических растворов может позволить понизить концентрационный предел обнаружения определяемых веществ как минимум на два порядка.

Повысить достоверность идентификации веществ может помочь сочетание возможностей методов ГХ-АЭД и ГХ-МС [140-145]. Снижение предела обнаружения обоих этих методов благодаря анализу больших проб органических растворов позволит повысить достоверность обнаружения и идентификации компонентов смесей следов термостабильных органических соединений.

Помимо покомпонентного анализа на сегодняшний день очень актуальными являются методы, позволяющие описать состояние анализируемого объекта с помощью каких либо обобщённых показателей. Одним из них является метод одновременного высокоселективного, высокочувствительного определения общего содержания фтор-, хлор-, бром-, серо- и фосфорсодержащих органических соединений в водных и органических растворах. Метод основан на извлечении определяемых соединений из растворов, их высокотемпературной окислительной конверсии, поглощении продуктов конверсии и анализе всего абсорбата методом ионной хроматографии на содержание образовавшихся анионов (фторида, хлорида, бромида, фосфата и сульфата), соответствующих определяемым элементам. Метод обладает преимуществами перед другими методами как по количеству одновременно определяемых элементов, так и по пределам обнаружения.

В этом методе пробу органического или водного раствора (объёмом 1 мкл) шприцом вводят в нагретый до 800-1000°С кварцевый реактор в непрерывный поток кислорода. В течение нескольких минут проба разлагается, и продукты разложения в потоке кислорода попадают в абсорбер (шприц с водой). Для снижения пределов обнаружения анализировали весь абсорбат или большую его часть, концентрируя соответствующие анионы на короткой концентрирующей колонке (12.5x4.0 мм), заполненной анионообменником. Колонку подсоединяли к крану-дозатору, удаляли из неё элюентом воду и далее элюентом переводили сконцентрированные анионы в разделительную колонку ионного хроматографа. Объем пробы составлял от 1 до 10 мл.

Для понижения пределов обнаружения ещё на 2 порядка представляет интерес выбрать условия выделения определяемых веществ из органических экстрактов или растворов и анализа всего экстракта данным методом, вводя пробу в реактор термодесорбцией в потоке инертного газа [153-154].

Основой неннвазивной диагностики является исследование естественных выделений человеческого организма. Одним из таких объектов исследования является выдыхаемый человеком воздух. Особый интерес, как с точки зрения пробоотбора, так и с точки зрения изучения состава смесей компонентов пробы является конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ) (водный конденсат, получаемый при охлаждении выдыхаемого воздуха) [156]. Интерес к изучению данного объекта впервые появился в начале 80-х годов 20-го века [157] и с тех пор объём исследований КВВ с каждым годом только увеличивается [158,159].

Конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ) — биологическая жидкость, содержащая частицы и вещества с поверхности бронхов и альвеол. Собирают КВВ путём охлаждения потока выдыхаемого пациентом через рот воздуха и отделением конденсирующейся влаги, препятствуя попаданию слюны в образец. Сбор конденсата у взрослого человека осуществляют 10-15 мин, объём пробы при этом обычно составляет 1-3 мл. Количество конденсата, которое можно собрать в единицу времени зависит от влажности воздуха окружающей среды, скорости потока воздуха через лёгкие, поверхностного натяжения жидкости, из которой формируется аэрозоль, состояния дыхательных путей (здоровья пациента) [160163].

Общепринятого подхода к определению органических веществ в КВВ не существует. Наиболее эффективным методом для определения нелетучих органических веществ в КВВ является жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометричесим детектированием [164]. В изученных литературных данных почти не содержится информации об определении в КВВ среднелетучих органических веществ. Исключение составляют работы по определению ряда альдегидов [165-169]. Такое отсутствие интереса, прежде всего, объясняется трудностями в определении веществ, находящихся в столь низких концентрациях, а также тем, что среди летучих и среднелетучих веществ гораздо больше соединений, которые попадают в лёгкие из окружающей атмосферы, чем веществ образующихся в организме человека. Экстракция таких соединений из проб КВВ органическим растворителем и концентрирование полученного раствора с последующим анализов всего концентрата методом ГХ/МС позволило бы значительно понизить предел обнаружения этих соединений.

Анализ литературных данных показал, что, несмотря на повышенное внимание, уделяемое анализу СЛОС в различных матрицах и широкому использованию различных способов анализа больших по объёму проб органических растворов методом капиллярной газовой хроматографии, остаётся актуальным развитие методов извлечения следов органических соединений из органических растворов и анализа всего экстракта. В связи с чем, в цели данной работы входили:

Развитие направления обнаружения СЛОС различной летучести и полярности на уровне следов в различных матрицах, основанного на жидкостной экстракции, выделении аналитов из полученного экстракта концентрированием и анализе всего концентрата аналитов методами ГХ/МС и определения элементного состава.

Разработка подходов к обнаружению различных СЛОС на следовом уровне в водных растворах, биосредах и органических растворах (экстрактах), позволяющих снизить пределы обнаружения заданных и неизвестных соединений, что поможет решить задачи по обнаружению и идентификации различных соединений в экологическом контроле, антидопинговом контроле, контроле качества высокочистых веществ (фармсубстанций) для диагностики заболеваний.

Развитие направления высокочувствительного и высокоселективного обнаружения производных следов нелетучих органических веществ методом ГХ/МС, основанного на выделении этих веществ из матрицы, их дериватизации и анализе полученных дериватов методом ГХ/МС в отсутствии избытка реагента.

Разработка методологии эколого-аналитического контроля, основанной на быстром скрининге проб вод и органических растворов на суммарное содержание Г-,С1-, Вг-, Б- и Р- содержащих СЛОС на ультраследовом уровне.

Глава 2. Новые подходы к концентрированию органических растворов ультрамалых количеств среднелетучих органических соединений и ГХ-МС анализу всего концентрата аналитов

Выводы

1. В результате проведенных исследований развито новое направление в обнаружении известных и неизвестных СЛОС и производных нелетучих органических соединений на уровне следов в различных матрицах - водах, органических растворах (экстрактах), биосредах, фармацевтических субстанциях. Оно основано на извлечении обнаруживаемых веществ в органический растворитель, концентрировании полученных растворов в процессе непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) и анализе всего концентрата методами ГХ/МС и элементного анализа.

2. На примере следовых количеств ПХДД, ПХБ и ХОП показана принципиальная возможность обнаружения следов СЛОС в органических растворах на уровне Ю-12 - Ю'10 % и в модельных водных растворах (после

13 11 микрожидкостной экстракции) на уровне 10" - 10" % благодаря сочетанию предложенного подхода к концентрированию органических растворов и анализа всего концентрата определяемых веществ методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов. В случае устранения или отсутствия мешающих компонентов матрицы, предложенных подход позволяет осуществлять быстрый скрининг проб растворов на наличие хлорсодержащих токсикантов на уровне 10"12 - Ю"10 %.

3. Разработан новый метод анализа органических растворов, содержащих следы СЛОС различной полярности и летучести, основанный на концентрировании этих растворов благодаря процессу непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) в присутствии сорбента, и вводе всего концентрата аналитов в ГХ/МС термодесорбцией.

4. Предложены подходы к обнаружению следовых количеств различных жирных кислот, аминокислот, дикарбоновых, гидрокси и оксикислот, Сахаров и спиртов в водных растворах и биосредах, при их совместном присутствии в смеси, основанные на дериватизации и ГХ/МС анализе соответствующих производных. Снижены пределы обнаружения аминокислот в водных растворах более чем на 2 порядка, при использовании концентрирования органического экстракта и ГХ/МС анализа всего концентрата в соответствии с предложенным методом.

5. Показана возможность увеличения достоверности дифференциации онкоклеток и фибробластов, основанная на установлении различия в составе аминокислот разработанным способом их определения.

6. Расширены возможности метода ГХ/МС для обнаружения следов малолетучих и нелетучих органических соединений и предложено направление, основанное на их выделении из образца, дериватизации соответствующим реагентом, замене реагента на инертный легколетучий растворитель, концентрировании полученных растворов с удалением растворителя в режиме НМХД и анализе всего концентрата производных методом ГХ/МС. Пределы обнаружения снижены более чем на 2 порядка.

7. В соответствии с этим направлением предложен подход к обнаружению следов стероидов в водных растворах и моче, существенно расширяющий возможности антидопингового контроля благодаря снижению пределов обнаружения стероидов более чем на 2 порядка, и регистрации большего числа соединений стероидной структуры, по сравнению с общепринятым подходом.

8. Предложен подход к минимизации зависимости сигналов АЭД по углероду и водороду от структуры молекул аналитов, основанный на использовании гелиевой плазмы, обогащенной кислородом. Способ позволяет определять отношения чисел атомов углерода и водорода (п<Упн) с высокой точностью.

9. Предложен новый способ определения элементного состава компонентов углеводородных смесей с высокой точностью, основанный на использовании отношений пс/пн и определения количественного содержания без градуировки по каждому компоненту смеси.

10. Предложен новый подход к идентификации компонентов смесей СЛОС на уровне следов, основанный на их концентрировании из органических растворов в режиме НМХД, анализе всего концентрата аналитов методами ГХ/МС(ХИ) и ГХ/АЭД и совместном использовании данных о молекулярной массе и присутствующих в молекулах элементов.

11. Предложен подход к определению суммарного содержания среднелетучих На1-, Р-, органических соединений в водных и органических растворах на уровне Ю"10 - 10"9 % и 10"9 - 10~8 % (по элементу) соответственно, позволяющий осуществлять быстрый скрининг проб таких растворов, и проведён анализ образцов различных вод. Способ основан на разработанном методе концентрирования органических растворов в режиме НМХД и переводе всего концентрата в окислительный реактор в потоке гелия с последующей регистрацией продуктов конверсии, соответствующих определяемым элементам, методом ионной хроматографии.

12. Предложена новая методология экологоаналитического контроля, основанная на случайном выборе проб на анализ из большой выборки отобранных проб, быстром скрининге этих проб на суммарное содержание На1-, Р- и 8-содержащих органических соединений (в том числе токсикантов). Скрининг осуществляется на уровне 10"10 - 10"9 % для бром-, фтор- и фосфор- содержащих органических веществ и на уровне выше - 10"6 % для хлор и серу содержащих органических веществ (в воде, т.к. в этой матрице уровень фонового сигнала по этим элементам находится на уровне 10'6 %). Если фоновый уровень по хлору и сере позволяет (особо чистая вода, экстракты из матриц, в которых фоновый уровень по хлору и сере низкий) то скрининг по этим элементам может быть осуществлён на уровне Ю"10 - 10"9 %.

13. Разработан подход к определению среднелетучих соединений различной полярности и летучести (спирты, жирные кислоты, н-алканы, ароматические углеводороды, альдегиды" и кетоны) в органических и водных о /г Q 7 растворах на уровне 10" - 10" % и 10" - 10" %, соответственно. Он основан на предложенном методе концентрирования органических растворов (экстрактов) в условиях НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата. С использованием данного подхода изучен состав конденсата выдыхаемого воздуха здоровых людей и больных бронхиальной астмой и ХОБЛ. Зарегистрировано более 100 органических соединений на уровне 10"8 - 10"7 %. В результате математической обработки данных (масс-спектров, времён удерживания и интенсивностей хроматографических пиков зарегистрированных веществ) показана возможность увеличения достоверности диагностики больных бронхиальной астмой и ХОБЛ (до 80%), по сравнению с существующими методами.

14. Предложен новый подход к обнаружению неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях, основанный на их выделении экстракцией растворителем, не растворяющим активное вещество, концентрировании аналитов из всего объёма экстракта предложенным нами методом вне аналитической системы и анализе всего концентрата методом ГХ/МС. Показана возможность увеличения числа обнаруживаемых неизвестных примесей по сравнению с общепринятым подходом и снижению их пределов обнаружения.

Заключение

В результате проведенных исследований развито новое направление в обнаружении известных и неизвестных СЛОС на уровне следов в различных матрицах - водах, биосредах, фармпрепаратах. Направление основано на использовании предложенного нового метода анализа объектов различного происхождения. Метод основан на выделении СЛОС из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов в условиях НМХД, переводе всего концентрата в аналитический прибор термодесорбцией и анализе методами ГХ/МС и элементного анализа, включающего ГХ/АЭД и определение суммарного содержания СЛОС содержащих в молекуле Б, С1, В г, Р и Б.

Концентрирование органических растворов следов СЛОС внутри термостата газового хромато-масс-спектрометра и анализ всего концентрата методом ГХ/МС с химической ионизацией и регистрацией отрицательных ионов позволили на примере хлорированных токсикантов (ПХДД, ПХБ и ХОП) показать принципиальную возможность достижения ультранизких пределов обнаружения

13 12

10" - 10" %) органических соединений в водных и органических растворах.

Разработка и развитие метода концентрирования органических растворов в процессе НМХД и анализа всего концентрата аналитов применительно к решению конкретных задач установления состава смесей различных соединений позволило снизить пределы обнаружения таких методов, как ГХ/МС (ЭИ, ХИ), ГХ/АЭД и метод определения суммарного содержания На1-, Р-, 8-органических соединений, более чем на 2 порядка по сравнению с существующими способами.

Показана возможность обнаружения методом ГХ/МС следов малолетучих и нелетучих органических соединений, таких как гидрокси, окси, дикарбоновые, жирные и амино-кислоты при их совместном присутствии в водных растворах и биосредах. Выбраны соответствующие условия дериватизации, экстракции, анализа.

Благодаря полученным результатам проведено исследование состава аминокислот в лиофилизатах раковых клеток прямой кишки и фибробластов и выявлено значимое различие состава таких кислот, что позволило увеличить достоверность дифференциации раковых клеток и фибробластов.

Развито направление высокочувствительной ГХ/МС следов малолетучих и нелетучих физиологически активных органических соединений. Оно базируется на разработанном методе анализа, включающем дериватизацию обнаруживаемых соединений с использованием БСТФА в смеси с пиридином, замену, после дериватизации, избытка реагента на летучий инертный растворитель, концентрирование полученных растворов в условиях НМХД и анализе всего концентрата методом ГХ/МС. Такой подход позволяет не только снизить пределы обнаружения более чем на 2 порядка, но и существенно улучшить стабильность свойств колонки и чувствительности масс-спектрометра во времени. Он существенно расширил возможности антидопингового контроля как с точки зрения пределов обнаружения заданных стероидов (что очень актуально), так и увеличения числа регистрируемых соединений стероидной структуры, что важно для решения задач паспортизации спортсменов и обнаружения дизайнерских (новых, неизвестных) стероидов.

Наряду с разработкой способов обнаружения следовых содержаний заданных СЛОС и малолетучих и нелетучих органических соединений в водных и органических растворах (экстрактах) и биосредах в работе развито направление по обнаружению в этих средах числа и природы неизвестных среднелетучих и нелетучих органических соединений.

Разработан способ обнаружения состава неизвестных среднелетучих примесей различной полярности и летучести в конденсате выдыхаемого воздуха человека. Он основан на жидкостной экстракции, концентрировании экстрактов в условиях НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата аналитов.

Сопоставление состава примесей, обнаруженных в конденсате выдыхаемого воздуха здоровых людей и больных ХОБЛ и бронхиальной астмой позволило с достоверностью более 80% дифференцировать эти группы людей. Что очень важно для развития методов диагностики лёгочных заболеваний.

Сочетание предложенного метода концентрирования органических растворов СЛОС в условиях НМХД с методом определения суммарного содержания На1-, Р-и 8-органических соединений позволило разработать способ быстрого скрининга проб на суммарное содержание таких соединений на уровне следов. Предложена новая методология эколого-аналитического контроля, основанная на случайном выборе проб на анализ из большой выборки отобранных образцов и быстром скрининге анализируемых проб на суммарное содержание наиболее опасных На1-, Р- и Б-содержащих токсикантов в пересчёте на элемент. Методология открывает новые возможности в осуществлении надёжного высокоселективного, экономически эффективного и действенного эколого-аналитического контроля.

В отличие от общепринятого подхода к определению известных и неизвестных примесей в фармсубстанциях и фармпрепаратах, основанного на анализе малой части экстракта методом ВЭЖХ (УФ) и реже - ВЭЖХ (МС), изучена возможность анализа растворов целого ряда малолетучих фармсубстанций, отличающихся по структуре и составу функциональных групп, методом ГХ/МС. Показано, что метод ГХ/МС имеет целый ряд преимуществ при обнаружении таких веществ по сравнению с другими методами (селективность, чувствительность, воспроизводимость масс-спектров). Анализ всего экстракта не только позволил снизить пределы обнаружения, но и (при термодесорбции аналитов непосредственно в колонку, минуя инжектор) значительно уменьшить часто описываемую в литературе дискриминацию состава пробы таких веществ при вводе пробы растворов.

Кроме того, предложен новый способ селективного обнаружения среднелетучих и малолетучих примесей в лекарственных средствах, основанный на экстракции примесей растворителем, не растворяющим основной компонент, концентрировании полученных растворов в режиме НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата.

Показано, что при использовании этого способа регистрируется больше (в несколько раз) примесей, чем при анализе раствора в растворителе, растворяющем основной компонент.

Новые возможности идентификации компонентов смесей на уровне следов открываются при использовании предложенной методологии, основанной на выделении веществ из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов в условиях НМХД и анализе всего концентрата методами ГХ/МС (ХИ) и ГХ/АЭД. Совместное использование данных для следов СЛОС о составе масс-спектра электронной ионизации, молекулярной массе аналитов и присутствующих в молекуле элементов позволяет сузить круг веществ-претендентов.

Таким образом, результаты, полученные в настоящем исследовании, открывают новые возможности в обнаружении состава смесей известных и неизвестных среднелетучих, малолетучих и нелетучих соединений в образцах различного происхождения на уровне следов. Эти результаты способствуют решению различных задач, имеющих важное практическое значение в медицине, биотехнологии, эколого-аналитическом контроле, антидопинговом контроле, определении состава примесей в высокочистых органических веществах, в частности фармацевтических.

Перспективным является развитие сочетания предложенного метода концентрирования в условиях НМХД и ВЭЖХ, КЭФ и ТСХ.

1. Grob К., Biedermann М. Vaporizing systems for large volume injection or on-line transfer into gas chromatography: classification, critical remarks and suggestions. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 750. P. 11-23.

2. Mol H.G.J., Janssen H.-G., Cramers C.A., Brinkman U.A.Th. Large-volume injection in gas chromatographic trace analysis using temperature-programmable (PTV) injectors. // Trends Anal. Chem. 1996. V. 15. P. 206-214.

3. Hankemeier Т., Кок S.J., Vreuls R.J.J., Brinkman U.A.Th. Optimization of large-volume on-column injection conditions in gas chromatography by monitoring the actual carrier gas flow. // J. Cromatogr. A. 1999. V. 841. P. 75-94.

4. Dugo P., Dugo G., Mondello L. On-line Coupled LC-GC: Theory and Applications. // Recent applications in multidimensional chromatography. 2003. V. 12. P. 2-10.

5. Grob K. Development of the transfer techniques for on-line high-performance liquid chromatography capillary gas chromatography. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 703. P. 265-276.

6. Koning S., Kurano M., Janssen H.-G., Brinkman U.A.Th. AT-column, a novel concentrating technique for large-volume injection in gas chromatography. // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1023. P. 165-174.

7. Жуховицкий А.А., Яновский C.M., Шварцман В.П., Ревельский И.А. Милли В. Э. В., Иоонсон В. А., Ахерма X. Авт. свид. СССР 536429. 1974. Бюл. Изобр., 1976. №43. с. 117.

8. Жуховицкий А.А., Яновский С.М., Шварцман В.П., Синельников А. В., Охотников Б.П., Ревельский И.А. Авт. свид. СССР 600441. 1976. Бюл. Изобр., 1978. № 12. с. 168.

9. Жуховицкий А.А., Яновский С.М., Шварцман В.П., Ревельский И.А. Хромадистилляция // Журнал физической химии. 1975. Т.49, №11. С. 2954-2955.

10. Жуховицкий А.А., Яновский С.М., Алкснис О.Н., Соколов А.В. Капиллярная хромадистилляция // Заводская лаборатория. 1977. Т.43, №9. С. 1053-1057.

11. Жуховицкий А.А., Охотников Б.П., Яновский С.М., Логинова Л.Г. Хромадистилляционное обогащение и анализ жидкостей // Журнал аналитической химии. 1979. Т.49, №3. С. 545-549.

12. Яновский С.М., Жуховицкий А. А., Бурова М.О., Алкснис О.Н. Хромадистилляционное определение примесей в воде // Журнал Аналитической Химии. 1980. Т.35, №10. С. 1965-1970.

13. Ревельский И.А., Яшин Ю.С., Жуховицкий А.А., Курочкин В.К., Костяновский Р.Г. Сочетание хромадистилляции и хромато-хромадистилляции с масс-спектрометрией // Заводская лаборатория. 1990. Т. 56, №7. С. 24-27.

14. Яновский С.М., Алкснис О.Н., Жуховицкий А.А. Ввод больших проб в капиллярную колонку. Журн. аналит. химии, 1983, 38, № 10, с. 1764-1768.

15. K.Grob, Jr. Peak broadening or splitting caused by solvent flooding after splitless or cold on-column injection in capillary gas chromatography. // J Chromatogr A. 1981. V. 213. P. 3-13.

16. K.Grob, Jr. "Band broadening in space" and the "Retention gap" in capillary gas chromatography. // J Chromatogr A. 1982. V. 237. P. 15-23.

17. K.Grob, Jr, G.Karrer, M.-L.Riekkola. On-column injection of large sample volumes using the retention gap technique in capillary gas-chromatography. // J Chromatogr A. 1985. V. 334. P. 129-155

18. K. Grob., E. Muller. Sample reconcentration by column-external solvent evaporation or injection of large volumes into gas chromatographic capillary columns? J. Chromatogr. 1987. V. 404. P. 297-305.

19. Grob K. On-line Coupled LC-GC. Huthig. 1991. 462 p.

20. K. Blau, G. King. Handbook of Derivatives for Chromatography / Heyden: London, 1978.

21. C.W. Gehrke, H. Nakamoto, R.W. Zumwalt. Gas-Liquid Chromatography of Protein Amino Acid Trimethylsilyl Derivatives // J. Chromatogr. 1969. 45. P. 24-51.

22. C.W. Gehrke, K. Leimer. Trimethylsilylation of Amino Acids. Derivatization and Chromatography//J. Chromatogr. 1971. 57. P. 219-238.

23. C.W. Gehrke, K. Leimer. Trimethylsilylation of Amino Acids. Effect of Solvents on Derivatization Using Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide // J. Chromatogr. 1970. 53. P. 201-208.

24. Matsumoto, T. Kuhara. A New Chemical Diagnostic Method for Inborn Errors of Metabolism by Mass Spectrometry Rapid, Practical, and Simultaneous Urinary Metabolites Analysis // Mass. Spectrom. Rev. 1996. 15. P. 43-57.

25. S.L. MacKenzie, D. Tenaschuk, G. Fortier. Analysis of Amino Acids by Gas-Liquid Chromatography as tert. -Butyldimethylsilyl Derivatives. Preparation of Derivatives in a Single Reaction // J. Chromatogr. 1987. 387. P. 241-253.

26. Starke, E. Kleinpeter, B. Kamm. Separation, Identification, and Quantification of Amino Acids in L-Lysine Fermentation Potato Juices by Gas Chromatography Mass Spectrometry // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. 371. P. 380-384.

27. P. Husek. Simultaneous Profile Analysis of Plasma Amino and Organic Acids by Capillary Gas Chromatography // J. Chromatogr. B. 1995. 669. P. 352-357.

28. P. Husek. Chloroformâtes in Gas Chromatography as General Purpose Derivatizing Agents // J. Chromatogr. B. 1998. 717. P. 57-91.

29. P. Husek, P. Matucha, A. Vránková, P. Simek. Simple Plasma Work-up for a Fast Chromatographic Analysis of Homocysteine, Cysteine, Methionine and Aromatic Amino Acids // J. Chromatogr. B. 2003. 789. P. 311-322.

30. P. Husek. Rapid Derivatization and Gas Chromatographic Determination of Amino Acids //J. Chromatogr. 1991. 552. P. 289-299.

31. S. Matsumura, H. Kataoka, M. Makita. Determination of Amino Acids in Human Serum by Capillary Gas Chromatography // J. Chromatogr. B. 1996. 681. P. 375-380.

32. H. Kataoka, S. Matsumura, H. Koizumi, M. Makita. Rapid and Simultaneous Analysis of Protein and Non-Protein Amino Acids as N(0,S)-Isobutoxycarbonyl Methyl Ester Derivatives by Capillary Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. 758. P. 167-173.

33. A.P. Vonderheide, M. Montes-Bayon, J.A. Caruso. Solid-Phase Microextraction as a Sample Preparation Strategy for the Analysis of Seleno Amino Acids by Gas Chromatography Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry // Analyst. 2002. 127. P. 49-53.

34. S. Casal, M.B. Oliveira, M.A. Ferreira. Gas Chromatographic Quantification of Amino Acid Enantiomers in Food Matrices by their iVfO,5^-Ethoxycarbonyl Heptafluorobutyl Ester Derivatives // J. Chromatogr. A. 2000. 866. P. 221-230.

35. P. Cao, M. Moini. Quantitative Analysis of Fluorinated Ethylchloroformate Derivatives of Non-Protein Amino Acids Using Positive and Negative Chemical1.nization Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. A. 1995. 710. P. 303-308.

36. A. Namera, M. Yashiki, M. Nishida, T. Kojima. Direct Extract Derivatization for Determination of Amino Acids in Human Urine by Gas Chromatography and Mass Spectrometry // J. Chromatogr. B. 2002. 776. P. 49-55.

37. J. Giacometti, C. Milin, N. Wolf. Monitoring the Esterification of Sorbitol and Fatty Acids by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1995. 704. P. 535-539.

38. T.P. McGinnis. Quantitative Determination of Fatty and Resin Acids in Kraft Black Liquors as their Trimethylsilyl Derivatives by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1998. 829. P. 235-249.

39. Y. Ghoos, B. Geypens, M. Hiele, P. Rutgeerts, G. Vantrappen. Analysis for Short-Chain Carboxylic Acids in Feces by Gas Chromatography with an Ion-Trap Detector //Anal. Chim. Acta. 1991. 247. P. 223-227.

40. Y.J. Yang, M.H. Choi, M.-J. Paik, H.-R. Yoon, B.C. Chung. Gas Chromatographic -Mass Spectrometric Determination of Plasma Saturated Fatty Acids Using Pentafluorophenyldimethylsilyl Derivatization // J. Chromatogr. B. 2000. 742. P. 3776.

41. K.S. Docherty, P.J. Ziemann. On-Line, Inlet-Based Trimethylsilyl Derivatization for Gas Chromatography of Mono- and Dicarboxylic Acids // J. Chromatogr. A. 2001. 921. P. 265-275.

42. M. Morvai, I. Molnár-Perl. Simultaneous Determination of Organic Acids and Sugars in Apples by Gas-Liquid Chromatography // J. Chromatogr. 1990. 520. P. 201-207.

43. M. Morvai, I. Molnár-Perl, D. Knausz. Simultaneous Gas-Liquid Chromatographic Determination of Sugars and Organic Acids as Trimethylsilyl Derivatives in Vegetables and Strawberries // J. Chromatogr. 1991. 552. P. 337-344.

44. M. Morvai, I. Molnár-Perl. Simultaneous Gas Chromatographic Quantitation of Sugars and Acids in Citrus Fruits, Pears, Bananas, Grapes, Apples and Tomatoes // Chromatographia. 1992. 34. 9/10. P. 502-504.

45. Boldizsár, К. Horváth, Gy. Szedlay, I. Molnár-Perl. Simultaneous GS-MS Quantitation of Acids and Sugars in the Hydrolyzates of Immunostimulant, Water-Soluble Polysaccharides of Basidiomycetes // Chromatographia. 1998. 47. 7/8. P. 413-419.

46. Molnár-Perl. Role of Chromatography in the Analysis of Sugars, Carboxylic Acids and Amino Acids in Food // J. Chromatogr. A. 2000. 891. P. 1-32.

47. F. Bartolozzi, G. Bertazza, D. Bassi, G. Cristoferi. Simultaneous Determination of Soluble Sugars and Organic Acids as their Trimethylsilyl Derivatives in Apricot Fruits by Gas-Liquid Chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. 758. P. 99-107.

48. M.A. Adams, Z.-L. Chen, P. Landman, T.D. Colmer. Simultaneous Determination by Capillary Gas Chromatography of Organic Acids, Sugars and Sugar Alcohols in Plant Tissue Extracts as their Trimethylsilyl Derivatives // Anal. Biochem. 1999. 266. P. 77-84.

49. Кульневич В. Г. Моносахариды современные данные о структуре и стереохимии их молекул. // Соросовский образовательный журнал. 1996. №8. С. 41-49.

50. Sasaki Y., Hashizume T. Gas chromatoraphy of thrimethylsylilated bases and nucleosides. // Anal. Biochem. 1966. V. 16. P. 1-19.

51. Miles H.T., Fales H.M. Application of gas. Chromatography to analysis of nucleosides. // Anal. Chem. 1962. V. 34. P. 860.

52. Gehrke C.W., Patel A.B. Gas-liquid chromatography of nucleosides. Effect of silylating reagents and solvents. // J. Chromatogr. 1977. V. 130. P. 103-114.

53. Gehrke C.W., Patel A.B. Gas-liquid chromatography of nucleosides. Derivatization and chromatography. // J. Chromatogr. 1976. V. 123. P. 335-345.

54. Patel A.B., Gehrke C.W. Derivatization and Chromatography of Nucleosides and Nucleotides. //J. Chromatogr. 1977. V. 130. P. 115-128.

55. Crips S., Sheehan Т., Hughes J. The science of doping control. Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.laboratorvequipment.com/article-science-of-doping-control.aspx

56. Antignac J.P., Monteau F., Negriolli J., Andre F., Bizec B. Application of hyphenated mass spectrometric techniques to the determination of corticosteroid residues in biological matrices. // Chromatographia Supplement. 2004. V. 59. P. 13-22.

57. Scippo M.L., Willemsen P., Danyi S., Helbo V., Muller M., Martial J., Maghuin-Rogister G. Receptor-Based Screening Assays: New Perspectives in Anti-Doping Control. // Chromatographia Supplement. 2004. V. 59. P. 23-27.

58. Virus E.D., Sobolevsky T.G., Rodchenkov G.M. Introduction of HPLC/orbitrap mass spectrometry asscreening method for doping control. // Journal of Mass Spectrometry. 2008. V. 43. P. 949-957.

59. Cho Y.D., Choi M.H. Alternative Sample Preparation Techniques in Gas Chromatographic-Mass Spectrometric Analysis of Urinary Androgenic Steroids. // Bulletin of the Korean Chemical Society. 2006. V. 27. N. 9. P. 1315-1322.

60. Halket J.M., Zaikin V.G. Derivatization in mass spectrometry 1. Silylation. // Journal of Mass Spectrometry. 2003. V. 9. P. 1-21.

61. Blau K., Halket J.M. Handbook of derivatives for chromatography. Chichester: Wiley, 1993. 369 p.

62. Ревельский А.И., Андриянов A.B., Ревельский И.А. Снижение пределов обнаружения стероидов благодаря сочетанию способа ввода больших проб органических растворов (экстрактов) и метода ГХ/МС. // Масс-спектрометрия. 2009. Т. 6.№1.С. 77-78.

63. Aman С.S., Pastor A., Cighetti G., Guardia M. Development of a multianalyte method for the determination of anabolic hormones in bovine urine by isotope-dilution GC-MS/MS. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2006. V. 386. P. 1869-1879.

64. Hooijerink D., Schilt R., Hoogenboom R., Huveneers-Oorsprong M. Identification of metabolites of the anabolic steroid methandienone formed by bovine hepatocytes in vitro. // Analyst. 1998. V. 123. P. 2637-2641.

65. The world anti-doping code. The 2009 prohibited list. Lausanne: WAD A, 2005. 82 p

66. Hajkova K., Pulkrabova J., Schurek J., Hajslova J., Poustka J., Napravnikova M., Kocourek V. Novel approaches to the analysis of steroid estrogens in river sediments. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2007. V. 387. P. 1351-1363.

67. Hu R., Zhang L., Yang Z. Picogram determination of estrogens in water using large volume injection gas chromatography-mass spectrometry. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2008. V. 390. P. 349-359.

68. Гёрёг Ш. Количественный анализ стероидов. (Пер. с англ. Е.Н. Дороховой и Г.В. Прохоровой: Под ред. И.В. Торгова и В.Г. Березкина). М.: Мир, 1985. 504 с.

69. Budzinski Н., Devier М.Н., Labadie P., Togola A. Analysis of hormonal steroids in fish plasma and bile by coupling solid-phase extraction to GC/MS. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2006. V. 386. P. 1429-1439.

70. Wu J., Hu R., Yue J., Yang Z., Zhang L. Determination of fecal sterols by gas chromatography-mass spectrometry with solid-phase extraction and injection-port derivatization. // Journal of Chromatography A. 2009. V. 1216. P. 1053-1058.

71. Gorog S. New safe medicines faster: the role of analytical chemistry // Trends in Analytical Chemistry. 2003. V. 22. P. 407-414.

72. Karbiwnyk C.M., Carr L.E., Turnipseed S.B. Determination of quinolone residues in shrimp using liquid chromatography with fluorescence detection and residue confirmation by mass spectrometry // Analytica Chimica Acta. 2007. V. 596. P. 257263.

73. Kennedy D. G., McCracken R. J., Cannavan A. Use of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of residues of antibiotics in meat and milk // Journal of Chromatography A. 1998. V. 812. P. 77-98.

74. Niessen W. M. A. Analysis of antibiotics by liquid chromatography-mass spectrometry // Journal of Chromatography A. 1998. V. 812. P. 53-75.

75. Kotretsou S.I. Determination of Aminoglycosides and Quinolones in Food Using Tandem Mass Spectrometry: A Review // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2004. V. 44. P. 173-184.

76. Balizs G., Hewitt A. Determination of veterinary drug residues by liquid chromatography and tandem mass spectrometry // Analytica Chimica Acta. 2003. V. 492. P. 105-131.

77. Goebel C., Trout G.J., Kazlauskas R. Rapid screening method for diuretics in doping control using automated solid phase extraction and liquid chromatographyelectrospray tandem mass spectrometry // Analytica Chimica Acta. 2004. V. 502. P. 65-74.

78. Mistri H.N., Jangid A.G., Pudage A. High throughput LC-MS/MS method for simultaneous quantification of lamivudine, stavudine and nevirapine in human plasma //Journal of Chromatography B. 2007. V. 853. P. 320-332.

79. Gorog S., Babjak M., Balogh G. Drug impurity profiling strategies // Talanta. 1997. V. 44. P.1517-1526.

80. Taomin Huang, Zhong He, Bei Yang. Simultaneous determination of captopril and hydrochlorothiazide in human plasma by reverse-phase HPLC from linear gradient elution // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2006. V. 41. P. 644648.

81. Wiesner J.L., Sutherland F.C.W., Smit M.J. Sensitive and rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination ofstavudine in human plasma // Journal of Chromatography B. 2002. V. 773. P. 129— 134.

82. Rodriguez I., Quintana J.B., Carpinteiro J. Determination of acidic drugs in sewage water by gas chromatography-mass spectrometry as tert.-butyldimethylsilyl derivatives // Journal of Chromatography A. 2003. V. 985. P. 265-274.

83. Gôrôg S. The changing face of chemical derivatization in pharmaceutical and biomedical analysis // Fresenius J. Anal. Chem. 1998. V.362. P. 4-8

84. Halket J.M., Zaikin V.G. Derivatization in mass-spectrometry. Silylation // Eur. J. of Mass Spectrom. 2003. V. 9. P. 1-21.

85. Amendola L., Colamonici C., Mazzarino M. Rapid determination of diuretics in human urine by gas chromatography-mass spectrometry following microwave assisted derivatization // Analytica Chimica Acta. 2003. V. 475. P. 125-136.

86. Dunge A., Sharda N., Singh B. Establishment of inherent stability of stavudine and development of a validated stability-indicating HPLC assay method // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005. V. 37. P. 1115-1119.

87. Andreu V., Blasco C. Analytical strategies to determine quinolone residues in food and the environment // Trends in Analytical Chemistry. 2007. V. 26. P. 534-556.

88. Баффингтон P. Применение атомно-эмиссионной спектроскопии в высокочастотном разряде для газовой хроматографии. М.: Мир, 1994. 79 с.

89. Janak K., Colmsjo A., Ostman C. Quantitative Analysis Using Gas Chromatography with Atomic Emission Detection // J. Chromatogr. Sci. 1995. V. 33. P. 611621.

90. Kovacic N., Ramus T.L. Application of a Microwave-Induced Plasma Atomic Emission Detector for Quantification of Halogenated Compounds by Gas Chromatography // J. Anal. Atom. Spectrom. 1992. V. 7. P. 999-1005.

91. Schwarz F.P. Characterization of the Emission from Atomic Hydrogen in a Microwave Induced Plasma//Anal. Chem. 1979. V. 51. P. 1508-1512.

92. Jin Q., Yang G., Guo Zh., Yu A., Liu J. Some Observations on the Development of a Gas Chromatographic Microwave Plasma Ionization Detector // Microchem. J. 1987. V. 35. P. 281-287.

93. Dagnall R.M., West T.S., Whitehead P. Use of the Microwave-Excited Emissive Detector for Gas Chromatography for Quantitative Measurement of Interelement Ratios // Anal. Chem. 1972. V. 44. P. 2074-2078.

94. Bonnekessel J., Klier M. Data Acquisition and Processing of a Microwave Plasma Detector in Gas Chromatography // Anal. Chim. Acta. 1978. V. 103. P. 29-42.

95. Dingjan H.A., de Jong H.J. Determination of Ratio Formulae for Organic Compounds Using a Microwave Induced Plasma // Spectrochim. Acta B. 1983. V. 38. P. 777-781.

96. Haas D.L., Caruso J.A. Moderate-Power Helium Plasma as an Element-Selective Detector for Gas Chromatography of Dioxins and Other Halogenated Compounds // Anal. Chem. 1985. V. 57. P. 846-851.

97. Szelewski M.J. Empirical Formula Determinations and Compound-Independent Calibration Using a GC-AED System // Hewlett-Packard Application Note 228-382.

98. Sullivan J.J., Quimby B.D. Detection of С, H, N and О in Capillary Gas Chromatography by Atomic Emission // J. High Resol. Chromatogr. 1989. V. 12. P. 282-286.

99. Пономарёв А.С. Применение капиллярной газовой хроматографии в сочетании с атомно-эмиссионным детектором для определения органических соединений. Дис. канд. хим. наук. Саратов: Саратовский Государственный Университет, 2000. 136 с.

100. Wylie P.L., Oguchi R. Pesticide Analysis by Gas Chromatography with a Novel Atomic Emission Detector // J. Chromatogr. 1990. V. 517. P. 131-142.

101. Pedersen-Bjergaard S., Asp T.N., Greibrokk T. Factors Affecting C:H and C:N Ratios Determined by Gas Chromatography Coupled with Atomic Emission Detector // J. High Resol. Chromatogr. 1992. V. 15. P. 89-93.

102. JanakK., Colmsjo A., Ostman C. Quantitative Analysis Using Gas Chromatography with Atomic Emission Detection // J. Chromatogr. Sci. 1995. V. 33. P. 611-621

103. Ting K.-C., Kho P. GC/MIP/AED Method for Pesticide Residue Determination in Fruits and Vegetables // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1991. V. 74. P. 991-998.

104. Jelink J.Th., Venema A. Investigations into the Use of Capillary GC with Atomic Emission Detection. Influence of the Molecular Structure on the Element Response // J. High Resol. Chromatogr. 1990. V. 13. P. 447-450.

105. Webster C., Cooke K. Use of an Atomic Emission Detector to Study the Variation in Elemental Response for Chlorine, Carbon, and Oxygen in Phenols // J. High Resol. Chromatogr. 1995. V. 18. P. 319-322.

106. Stuff J.R., Creasy W.R., Rodriguez A.A., Dupont Durst H. Gas Chromatography with Atomic Emission Detection as an Aid in the Identification of Chemical Warfare Related Material//J. Microcol. Sep. 1999. V. 11. P. 644-651.

107. Hardas N.R., Uden Р.С. Empirical Formulae Studies of Chlorofluorocarbons Using Gas Chromatography Coupled to Atomic Emission Detection // J. Chromatogr. A. 1999. V. 844. P. 271-281.

108. Freeman J.E., Hieftje G.M. Analytical Characteristics of Near-Infrared Nonmetal Atomic Emission from a Helium Microwave-Induced Plasma // Spectrochim. Acta B. 1985. V. 40. P. 475-492.

109. Deruaz D., Soussan-Marchal F.F., Joseph I., Desage M., Bannier A., Brazier J.L. Analytical Strategy by Coupling Headspace Gas Chromatography, Atomic Emission Spectrometric Detection and Mass Spectrometry // J. Chromatogr. A. 1994. V. 677. P. 345-354.

110. Pedersen-Bjergaard S., Semb S.I., Vedde J., Brevik E.M., Greinbrokk T. Environmental Screening by Capillary Gas Chromatography Combined with Mass Spectrometry and Atomic Emission Spectroscopy // Chemosphere. 1996. V. 32. P.1103-1115.

111. Quimby B.D., Sullivan J.J. Evaluation of a Microwave Cavity, Discharge Tube, and Gas Flow System for Combined Gas Chromatography Atomic Emission Detection // Anal. Chem. 1990. V. 62. P. 1027-1034

112. The United States Pharmacopoeia. United States Pharmacopeial convention, Inc. 1995.

113. Vatsova M., Tzvetanov S., Drenska A., Goranscheva J., Tyutyulkova N. Improved Gas Chromatographic Mass Spectrometric Method for the Quantitative Determination of Vinpocetine in Human Plasma / J. Chromatogr. B. 1997. V. 702. P. 221-226.

114. Martens J. Determination of Loratadine and Pheniramine from Human Serum by Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. B. 1995. V. 673. P. 183-188.

115. Sachs H., Kintz P. Testing for Drugs in Hair. Critical Review of Chromatographic Procedures Since 1992 // J. Chromatogr. B. 1998. V. 713. P. 147-161.

116. Ternes Th.A. Analytical Methods for the Determination of Pharmaceuticals in Aqueous Environmental Samples // Trends Anal. Chem. 2001. V. 20. P. 419-434.

117. E.H. Капинус, И.А. Ревельский, B.O. Улогов, Ю.А. Леликов. Ионохроматографическое определение анионов F-, N02-, Br-, N03-, HP042"-,9 Q О

118. S04 в водных растворах на уровне 10-10"°% // Вестник МГУ, Сер. 2, Химия. 2004. Т. 45. С. 246.

119. Вирюс Э.Д., Капинус Е.Н., Ревельский И.А., Борзенко А.Г. Определение общего содержания хлорорганических соединений в воде, основанное на микрожидкостной экстракции и микрокулонометрическом анализе экстракта // Зав. Лаб. 2003. Т. 69. С. 3-7.

120. J.B. de Lema, М. González, L. Vigil, P. Casan, «Exhaled Breath Condensate: Standardized Collection of Samples From Healthy Volunteers», Arch. Bronconeumol. 41, 584-586 (2005).

121. Г.И. Сидоренко, Э.И. Зборовский, Д.И. Левина, «Поверхностно-активные свойства конденсата выдыхаемого воздуха (новый метод для изучения легочной функции)», Терапевтический Архив 52, 65-68 (1980).

122. J. Hunt, «Exhaled breath condensate: an evolving tool for noninvasive evaluation of lung disease», J. Allergy Clin. Immunol. 110, 28-34 (2002).

123. G.M. Mutlu, K.W. Garey, R.A. Robbins, L.H. Danziger, I. Rubinstein, «Collection and analysis of exhaled breath condensate in humans», Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164, 731-737(2001).

124. Анаев Э. X., Чучалин А. Г. Исследование конденсата выдыхаемого воздуха в пульмонологии (обзор зарубежной литературы). // Пульмонология : Научно-практический журнал. 2002. № 2 . С. 57-66.

125. Effros R. М., Dunning М. В., Biller J., Shaker R. The promise and perils of exhaled breath condensates. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2004. V. 287. P. 10731080.

126. Mutlu G.M., Garey K.W., Robins R.A., Danziger L.H., Rubinstein I. Collection and Analysis of Exhaled Breath Condensate in Humans. // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2001. V. 164. P 731-737.

127. Moeller A., Kielbasa B. Exhaled Breath Condensate and Other Markers in Exhaled Air. // Paediatric Pulmonary Function Testing. Prog. Respir. Res. 2005. V. 33. P. 190-202.

128. Montuschi P., Martello S., Felli M., Mondino C., Barnes P.J., Chiarotti M. Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of exhaled leukotriene B4 in asthmatic children. // Respiratory Research. 2005. V. 6. P. 119.

129. Larstada M., Ljungkvista G., Olina A., Toren K. Determination of malondialdehyde in breath condensate by highperformance liquid chromatography with fluorescence detection. // Journal of Chromatography В. V. 766. 2001. P. 107114.

130. Corradi M., Rubinstein I., Andreoli R., Manini P., Caglieri A., Poli D., Alinovi R., Mutti A. Aldehydes in Exhaled Breath Condensate of Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2003. V. 167. P. 1380-1386.

131. Corradi M., Pignatti P., Manini P., Andreoli R., Goldoni M., Poppa M., Moscato G., Balbiz В., Mutti A. Comparison between exhaled and sputum oxidative stress biomarkers in chronic airway inflammation. // Eur. Respir. J. 2004. V. 24. P. 1011— 1017.

132. Samsonov D.P., Kiruhin V.P., Zhiruhina N.P. Determination of polychlorinated debenzo-p-dioxins and dibenzofurans in biological materials using gas chromatography-mass spectrometry in the negative ionization // J. Anal. Chem. 1994. V.49.P. 868-873.

133. Mitroshkov A.V., Revelsky I.A., Sarkisyan A.I., Kostyanovskii R.G. Highly sensitive and selective determination of chlorodibenzodioxins using low-resolution mass spectrometry and chemical ionization // J. Anal. Chem. 1995. V.50. P. 165-170.

134. Ревельский А.И., Яшин Ю.С., Ларионов О.Г., Ревельский И.А., Ефимов И.П. Быстрый метод скрининга хлорсодержащих пестицидов в воде на уровне следовых концентраций (Ю-10 10"13%) // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1996. Т.37.№4. С. 376-380.

135. Ревельский А.И., Мочалов Т.Г., Ревельский И.А., Яшин Ю.С., Зирко Б.И., Пасекова Н.А. Изучение возможности газохроматографического анализа больших по объему проб органических растворов // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1998. Т.39. №3. С. 181-183.

136. Sobolevsky T.G., Revelsky A.I., Revelsky I.A., Miller В., Oriedo V. Electron ionization mass spectra of N(0,S)-isobutoxycarbonyl isobutyl esters of amino acids // European J. of Mass Spectrometry. 2002. V. 8. P. 447-449.

137. Sobolevsky T.G., Revelsky A.I., Miller В., Oriedo V., Chernetsova E.S., Revelsky I.A. Comparison of silylation and esterification/acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids // J. of Separation Science. 2003. V.26. №17. P. 1474-1478.

138. Гуляев И.В., Ревельский А.И. Анализ фармацевтических субстанций методом реакционной газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией // Масс-спектрометрия. 2009. Т.6. №3. С. 199-204.

139. Ревельский А.И., Леднева А.В., Андриянов А.В., Ревельский И.А. Определение моносахаридов методом реакционной газовой хроматографии/масс-спектрометрии с удалением реагента из реакционной смеси // Масс-спектрометрия. 2009. Т.6. №3. С. 221-225.

140. Revelsky A.I., Samokhin A. S., Virus Е. D., Rodchenkov G. М. and Revelsky I. A. High sensitive analysis of steroids in doping control using gas chromatography/time-of-flight mass-spectrometry // Drug Testing and Analysis. 2011. V.3. №4. P. 263267.

141. E.S. Chernetsova, A.I. Revelsky, D. Durst, T.G. Sobolevsky, I.A. Revelsky. Increasing the accuracy of determination of nc/nH ratios by GC-AED // J. of Chromatogr. A. 2005. V. 1071. P. 55-58.

142. Revelsky I.A., Chernetsova E.S., Revelsky A.I. Gas chromatography with atomic emission detection: a method for the determination of hydrocarbon mixture components // Mendeleev Communications. 2009. V.19. №4. P. 233 234.

143. Chernetsova E.S., Revelsky A.I., Revelsky I.A., Zolotov Yu.A. Gas chromatography of organic mixtures using an atomic emission detector. // J. of Analytical Chemistry. 2010. V.65. №8. P. 788-802.

144. Ревельский И.А., Ревельский А.И., Капинус Е.Н. Способ одновременного определения суммарного содержания F-, С1-, Br-, J-, S- и Р-органических соединений в воде и водных растворах. Патент на изобретение № 2395804.

145. Приоритет изобретения от 17. 10. 2008 г. Зарег. в Гос. реестре изобретений РФ 27.07.2010. Бюл. №21.

146. Родионов A.A., Ревельский А.И., Ревельский И.А., Анохина Т.Н., Анаев Э.Х. Хроматомасс-спектрометрическое определение среднелетучих органических веществ в конденсате выдыхаемого воздуха // Масс-спектрометрия. 2007. Т.4. № 2. С. 143-148.