Методы просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения для анализа наноструктуры биоматериалов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

На правах рукописи УДК 537.533.35 + 538.911 + 532.78

СУВОРОВА ЕЛЕНА ИГОРЕВНА

МЕТОДЫ ПРОСВЕЧИВАЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА НАНОСТРУКТУРЫ БНОМАТЕРИАЛОВ

01.04.18 — кристаллография, физика кристаллов

Автореферат диссертации па соискание ученой степени доктора физико-математических наук

щ

Москва - 2006 г. /

Работа выполнена в Институте кристаллографии имени A.B. Шубникова Российской академии наук

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Имамов Рафик Мамед оглы

доктор физико-математических наук, член-корр. РАН Аристов Виталий Васильевич

доктор физ.-мат. ( наук Суханова Татьяна Евгеньевна

Ведущая организация: кафедра полимеров и кристаллов физического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Защита состоится « 2006 года в 11.00 на заседании диссертационного совета

Д 002.114.01 Института кристаллографии имени A.B. Шубникова Российской академии наук по адресу: 119333, Москва, Ленинский пр., 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии имени A.B. Шубникова РАН

2006 г.

■Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.1 ] 4.01 кандидат физико-математических наук

Каневский В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Направления н актуальность исследований

Для решения современных задач диагностики наноструктур требуется адаптация к этим задачам традиционных методов и оборудования, а также развитие новых подходов для анализа свойств и процессов, присущих объектам нанометровой геометрии и системам пониженной размерности (до масштабов 1А). Диссертация посвящена исследованию структуры и морфологии наноразмерных кристаллов и композитов, созданных на их основе, методами количественной электронной микроскопии, которые включали обработку и моделирование электронно-микроскопических изображений высокого разрешения, картин электронной, а также картин рентгеновской дифракции.

Электронная микроскопия высокого разрешения (ВРЭМ) исторически явилась первым методом, реально обеспечившим визуализацию структуры объектов с атомным разрешением, а во многих случаях является единственным источником получения информации о внутренней структуре и структуре границ раздела нанообъектов.

Неоспоримым преимуществом электронной микроскопии является возможность получения количественной информации как в обратном (электронная дифракция), так и в прямом пространстве (электронно-микроскопические изображения с высоким разрешением) и исследования локальной структуры в нанообластях вплоть до атомного уровня.

Среди научных публикаций широко представлены работы по теоретическому обеспечению применения преобразования Фурье для получения кристаллографической информации из экспериментальных изображений [1-3]. Методики, основанные на локализации максимального контраста и связанного с ним положения атомных колонок, применялись для установления изменений в параметрах решёток в многослоевых системах, полупроводниках, выявление искажений структуры и дефектов, и др. Преобразование Фурье ВРЭМ-изображений (дифрактограммы) достаточно точно отражает геометрию структуры. В современных просвечивающих электронных микроскопах низкое значение коэффициента сферической аберрации объективных линз обеспечивает однородную передаточную функцию вблизи брегговского пучка, что позволяет проводить измерения с большой точностью и надежностью. С этих позиций применение дифрактограмм для фазовой идентификации нанокристаллов является очень перспективным.

Особое внимание в настоящей работе уделялось установлению пределов неопределенности при идентификации нанофаз, имеющих большие низкосимметричные элементарные ячейки, для которых характерно большое количество отражений. Для уточнения фазового состава, ориентировки кристаллов проводилось моделирование картин

электронной дифракции и дифрактограмм при разных углах наклона к точной оси зоны, с рефлексами от нескольких Лауэ-зон. В сложных случаях образования многофазных систем привлекались данные рентгеновского энерго-дисперсионного (ЭДС) микроанализа и, как правило, исследование начиналось с проведения качественного и количественного (в тех образцах, где существовала возможность надёжных измерений) микроанализа.

Электронно-микроскопические изображения представляют собой картины интерференции электронных волн и прямая интерпретация подобных изображений как проекций структуры возможна только для тонких образцов (приближение слабого фазового объекта) при шерцеровской дефокусировке [4-6]. Поскольку в общем (реальном) случае картина искажается динамическим рассеянием и оптическими аберрациями микроскопа, то для правильной интерпретации получаемых изображений необходимо проводить компьютерное моделирование, используя известные электронно-оптические параметры и кристаллографические данные образцов с последующим сравнением рассчитанных и экспериментальных изображений.

Моделирование ВРЭМ-изображений при . заданных условиях (кристаллическая структура, толщина и ориентация образца, условия получения изображения в микроскопе, включая значение дефокуса, ускоряющего напряжения, коэффициентов аберраций и угла расходимости) и сравнение с экспериментальными изображениями однозначно подтверждает (или опровергает) структуру исследуемого материала в наномасштабе. Варьирование параметров, связанных со структурой и морфологией образца, последовательно изменяя дефокус или угол наклона образца к точной оси зоны, в свою очередь, дает возможность провести количественный анализ, установить свойства материалов: выполнить оценку размеров, особенно толщины, естественных тонких кристаллов, установить разориентировку зерен и выявить локальное разупорядочение в кристаллах. Все эти параметры необходимы при определении механизма образования или разрушения структуры материалов, композитов на основе нанокристаллов.

Одной из наиболее часто цитируемой и используемой в различных исследованиях программой моделирования ВРЭМ изображений является многофункциональная программа JEMS - Java Electron Microscopy Software (ранняя версия программы EMS, разработанная П.Стадельманном [7]. Особенностью программы является возможность встраивания других программ (модулей) для выполнения разнообразных расчетов и проведения моделирования. Гибкость программы обеспечила уникальную возможность внесения в неё других необходимых функций для решения научных проблем, что сделало JEMS незаменимым средством исследования паноразмерных систем. Новыми функциями JEMS, разработанными и протестированными для различных материалов, стали программа для моделирования

размерного эффекта и определение его влияния на картины электронной дифракции от нанокристаллов, установление влияния отклонения ориентировки образца от точной оси зоны на распределение контраста на ВРЭМ изображениях.

Основными объектами, исследуемыми в данной работе, были биоматериалы: (1) синтетические фосфаты кальция - гидроксиапатит (НАР) и октакальций фосфат (ОСР), осаждаемые из растворов в разных условиях, а также пористые и твердые керамики, созданные на основе гидроксиапатита, (3) покрытия из гидроксиапатита, получаемые в низкотемпературной газовой плазме на различных подложках, (4) керамики на основе трикальций фосфатов, синтезируемые при высокой температуре, (5) биообъекты - костная ткань и минерализованные сердечные клапаны, (б) композиты, представляющие собой стабилизирующую полимерную матрицу с внедренными наночастицами селена и серебра.

Указанные материалы уже сейчас находят широкое применение в биологической и медицинской областях [8-14]. Основными требованиями, предъявляемые к ним являются чистота, эффективность, безопасность. Поэтому разработка оптимальных условий синтеза и характеризация конечных продуктов должны были отвечать данным требованиям, а это, в свою очередь потребовало адекватных методов исследования.

Несмотря на то, что изучению, например, фосфатов кальция как синтетических, так и природных посвящено огромное количество публикаций, интерес к структурным исследованиям не угасает в связи с их жизненной важностью. Один из фосфатов кальция, гидроксиапатит, является минеральной компонентой костной ткани и является основной фазой, которая осаждается на сердечных клапанах, препятствуя нормальной работе сердца. Механизм образования фосфатов кальция в растворах, несмотря на существующие модели, не ясен и остается предметом исследования во многих лабораториях мира. Нанокристаллический НАР, осаждаемый из водных растворах, долгое время считался аморфной фазой из-за уширенных дифракционных максимумов на рентгеновских дифрактограммах. На основе уширенных максимумов и данных химанализа предполагалось, что кристаллизация гидроксиапатита проходила в несколько этапов с помощью превращения осаждающейся аморфной фазы через несколько кальций фосфатных модификаций в НАР.

Обычно исследование наноразмерных объектов, которое включает установление морфологии, размеров, химического и фазового состава проводится с помощью комбинации методов 1) получение изображений с высоким разрешением, 2) микро- и нанодифракции, 3) рентгеновского энергодисперсионного анализа с использованием тонкого папозонда, 4) спектроскопии энергетических потерь электронов. Две первых методики дают информацию о структуре и локальном фазовом составе, с помощью двух других методик определяется химический состав, электронное состояние образца.

В любом электронно-микроскопическом исследовании приходится учитывать радиационную устойчивость образцов к электронному пучку, а для образцов всех указанных биоматериалов, это влияние оказывается критическим. В работе показано, что такие локальные методы, как рентгеновский энерго-дисперсионный анализ с использованием электронного нанозонда, нанодифракции или электронной дифракции в сходящемся пучке не являются информативным, поскольку образцы разрушаются раньше, чем могут быть получены экспериментальные данные. В этом случае наиболее полная информация о наноструктуре была получена с помощью дифрактограмм от ВРЭМ изображений, а также путем моделирования ВРЭМ изображений и дифракции для известных кристаллографических и электронно-оптических параметров.

Стоит особо отметить, что отработка методов приготовления образцов занимали практически половину времени всего электронно-микроскопического эксперимента. В случае исследования мелкодисперсных (порошкообразных) материалов с прозрачными для электронов пластинчатыми кристаллами их не только прямо переносили на поддерживающую медную сетку с углеродной плёнкой. Для изучения других проекций кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата (например, [001]) образцы готовили специальным образом, при котором кристаллы заливались эпоксидной смолой с плотностью, близкой к плотности кристаллов, и затем делались тонкие срезы в ультамикротоме. Образцы костной ткани, которая является чрезвычайно пористой, также находились в затвердевшей эпоксидной смоле, которая не давала образцу рассыпаться при получении тонких срезов с помощью ультрамикротомии. Все образцы, особенно включающие органическую матрицу, исследовались с наименьшей интенсивностью электронного пучка, чтобы не допустить его разрушения до получения необходимых данных, но в то же время достигнуть удовлетворительного отношения сигнала к шуму для последующего количественного анализа ВРЭМ-изображения.

Таким образом мотивировать проведение данных исследований по идентификации панофаз можно как с позиций фундаментальной науки, так и с точки зрения их практического использования. Фундаментальными составляющими в областях физики и химии кристаллов здесь являются особенности структуры напокристаллов и механизмов ее образования. Перспективы практического использования полученных результатов заложены в методологическом подходе: (I) выявлены возможности и пределы применимости количественных электронно-микроскопических методов фазового анализа на наноуровне с помощью преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ изображений и картин электронной дифракции, (2) отработана техника приготовления тонких образцов биоматериалов для электронной микроскопии высокого разрешения.

Проведенные наноструктурные исследования и полученные результаты являются основанием для развития новых представлений о механизме кристаллизации гидроксиапатита в растворе и пересмотра существующей теории фазовых превращений из аморфного состояния, механизма биоминерализации, оптимизации условий синтеза безопасных и эффективных биоматериалов.

Цель работы

Целью работы являлось развитие и определение потенциальных возможностей количественных методов электронной микроскопии высокого разрешения для характеризации нанофаз в биоматериалах, включая моделирование размерного эффекта и его влияния на картины электронной дифракции, установления влияния наклона образца на распределение контраста на ВРЭМ-изображениях, установления структурных особенностей кристаллов, определяющих появление запрещенных рефлексов.

Проводимое исследование наноструктуры было также направлено на решение фундаментальной задачи механизма образования кристаллов и композитов на их основе. Измерения методами ВРЭМ дополнялись исследованием с помощью рентгеновской энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС), а также рентгеновской дифракции и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для получения информации о фазовом составе в целом от мелкодисперсного образца и для сравнения морфологии различных кристаллов в макромасштабе.

Научная новизна

Разработаны подходы к исследованию влияния уменьшения размеров кристаллов (изотропных и анизотропных) с разной структурой на появление диффузного рассеяния на картинах электронной дифракции. Соответствующая программа моделирования размерного эффекта является составной частью программы JEMS. Проведенное исследование позволило выявить причины сильного диффузного рассеяния на элсктронограммах и сравнить с уширенисм максимумов на картинах рентгеновской дифракции.

Усовершенствована программа моделирования ВРЭМ изображений, в которой учтены отклонения от точной оси зоны на любой угол, случайные вибрации и дрейф образца (из-за зарядки под электронным пучком непроводящих частиц) для выявления более точного соответствия расчётных и экспериментальных изображений. Результатом проведённой модификации стала возможность надёжной идентификации нанофаз (размер кристаллитов до 5 нм), измерения толщины естественных кристаллов гидроксиапатита и относительной

разориентация нанозерен в кристаллах с помощью моделирования ВРЭМ изображений, установления причин появления запрещенных рефлексов с ростом толщины.

Создана программа построения сверхячейки анизотропного кристалла и образования структурной модели изотропной сферической частицы.

Проведено усовершенствование графического интерфейса для оптимизации времени вычислений и моделирования, а также использования оперативной памяти компьютера при работе с кристаллами, имеющими большие многоатомные (до 300 атомов) элементарные ячейки с низкой симметрией.

Впервые проведены исследования микро- и наноструктуры кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата, выращенных в условиях микрогравитации и выявлены различия в морфологии, размерах и структуре кристаллов, полученных в разных режимах смешивания исходных растворов. Впервые получены и исследованы чистые и большие (несколько миллиметров длиной) кристаллы октакальций фосфата.

Исследована структура смешанных кристаллов гидроксиапатит/октакальций фосфат, впервые установлены ориентационные кристаллографические соотношения между двумя фазами, вычислены напряжения в кристаллах.

Определена наноструктура слоев гидроксиапатита, полученных плазменным осаждением на подложки.

Определена устойчивость кальций фосфатных биоматериалов, полученных при высоких температурах. Впервые выявлено образование оксида кальция во время спекания и приготовления пористого костного биозаместителя на основе а-СазР04 при температуре 1430°С, которая ниже температуры, определённой фазовой диаграммой в системе СаО-РгОз и равной 1720°С.

Исследована структура нормальной и патологически измененной костной ткани и получены изображения отдельных нанокристаллов гидроксиапатита на коллагеновых волокнах, оценены их размеры в трех направлениях.

Исследован фазовый состав минерального осадка на сердечных клапанах и предложена модель его образования.

Проведена характеризация образующихся нанофаз под влиянием внешних условий и определена устойчивость нанокомпозитов, представляющих собой внедренные в органическую стабилизирующую матрицу наночастицы селена и серебра.

Впервые обнаружен и описан эффект кристаллизации внутри рыхлых бесструктурных наночастиц селена, синтезированных в водных растворах с помощью окислительно-восстановительной реакций и стабилизированных в разных органических средах.

Практическая значимость работы

Главным практическим результатом, полученным в работе, является обоснование применения комбинации методов по идентификации фазового состава в наномасштабе на основе количественной обработки ВРЭМ изображений с помощью преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ изображений от радиационпо-чувствительных объектов, оценка толщины естественных (не утонченных) кристаллов.

Установлены закономерности изменений наноструктуры и морфологии кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата в зависимости от скорости смешивания исходных растворов, температурь! кристаллизации.

Определены условия для получения нанокристаллических гидроксиапатитных покрытий из плазмы газового разряда на различных подложках.

Результаты исследования структуры как осаждающихся из растворов кристаллов гидроксиапатита, так и плазменных покрытий на подложках, актуальны с точки зрения производства эффективных и безопасных биоимплантатов и выяснения механизмов патологических отклонений в живых организмах.

Предложен механизм биоактивности бактерицидных средств, включающих наночастицы серебра, в основе которого химическое взаимодействие серебра с серосодержащими агентами в окружающей среде и в организмах, установлены причины недостаточной эффективности медицинских препаратов с наночастицами селена в органических средах.

Всё это способствовало прояснению различий и сближению позиций между химическими, биологическими, медицинскими подходами с одной стороны и физическими подходами в получении и интерпретации результатов, с другой стороны.

Защищаемые положения

1. Комбинированный метод по идентификации нанокристаллов и нанофаз в разных биокомпозитах с помощью преобразования Фурье и моделирования электронной дифракции и электронно-микроскопических изображений с высоким разрешением, среди которых недавно разработанные программы для моделирования ВРЭМ изображений с учетом отклонения от точной оси зоны, атомных вибраций, дрейфа образца; создания сверхячейки анизотропного кристалла; образования структурной модели изотропной сферической частицы; исследования зависимости уширения дифракционных максимумов с уменьшением размера частиц.

2. Результаты экспериментальных исследований наноструктуры, морфологии и размером кристаллов гидроксиапатита, синтезируемых в водных растворах в условиях конвективного смешивания реагентов, в диффузионном режиме смешивания в невесомости и в случае принудительного смешивания с разными скоростями при низких (25- 40°С) и высоких (95°С) температурах.

3. Установление зависимости и определение толщины малорастворимых в воде кристаллов от температуры растворов. Обнаружение запрещенных гексагональной симметрией отражений в кристаллах гидроксиапатита благодаря локальному разупорядочепию в их структуре.

4. Обнаружение размерного эффекта на рентгеподифракционных картинах и электронограммах и его моделирование на примере нанокристаллов гидроксиапатита.

5. Результаты экспериментального исследования наноструктуры смешанных кристаллов гидроксиапатита / октакальций фосфата: определение кристаллографических ориентационных соотношений и напряжений.

6. Результаты экспериментального исследования наноструктуры плазменных покрытий гидроксиапатита на различных подложках: определение фазового состава, размеров и относительной ориентации нанокристаллов в покрытиях.

7. Результаты экспериментального исследования наноструктуры высокотемпературных биоматериалов на основе гидроксиапатита и трикальций фосфатов.

8. Результаты сравнительной характеризации здоровой костной ткани и образцов с патологическими изменениями. Модельное представление механизма снижения минеральной плотности кости и развития деструктивных процессов.

9. Результаты экспериментального исследования - определение фазового состава минеральной фазы, осаждающейся на сердечных клапанах, структуры, морфологии, размеров кристаллов в осадке. Модельное представление механизма патологической минерализации мягких тканей в живых организмах.

10. Обнаружение эффекта кристаллизации наиочастиц селена под действием органических веществ. Анализ экспериментальных данных с помощью структурного моделирования напочасти селена.

И. Обнаружение продуктов химического взаимодействия наночастиц серебра с реагентами из окружающей среды. Модельное представление механизма бактерицидной активности наночастиц Ag.

Личный вклад автора

Все оригинальные результаты электронно-микроскопического исследования,

обработки данных и моделирования, вошедшие в диссертацию, были получены самим

автором или при непосредственном его участии в модернизации программы моделирования, а также в разработке ростовых экспериментов.

Апробация результатов работы п публикации

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных и российских национальных конференциях, конгрессах и семинарах:

1. 9th European Symposium Gravity-Dependent Phenomena in Physical Science. Berlin, Germany,

2-5 May 1995;

2. 16 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 29 ноября-2 декабря 1996;

3. 26'h International School on Electron Crystallography, Erice, Italy, May 22-June 2, 1997;

4. 17 Российская конференция но электронной микроскопии. Черноголовка, 15-18 июня 1998;

5. 12а> International Conference on Crystal Growth, Jerusalem, Israel 26-31 July, 1998;

6. 18"' International Congress of the International Union of Crystallography, Glasgow, Scotland 4Ih-

13th August, 1999;

7. 18 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 5 июня - 8 июля,

2000;

8. 9 национальная конференция по росту кристаллов НКРК-2000, Москва, 16-20 октября 2000;

9. First International Symposium on Microgravity Research and Applications in Physical Sciences

and Biotechnology. Sorrento, Italy, 10-15 September 2000;

10. 11th Interdisciplinary Research Conference on Biomaterials (GRIBOI). Calais, France, 8-9 March 2001;

11. 4th International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 24-28 September 2001;

12. Fifth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar "Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and biotechnology" St Petersburg, Russia, May 27-29,2002;

13. 10 национальная конференция по росту кристаллов НКРК-2002, Москва, 24-29 ноября 2002;

14. Gordon Research Conference on BIOMINERALIZATION. New London, USA, August 2002;

15. 9th General meeting of the Swiss Society for Biomaterials. Ncuchatel, Switzerland, May 14-15, 2003;

16. 5"1 International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 22-26 September 2003;

17. 16th International Conference on Bioceramics, Porto, Portugal, November, 7-10, 2003;

18. 4-ая Национальная конференции по применению рентгеновского, синхротронпого излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов - РСНЭ-2003, Москва, 17-22 ноября 2003;

19. XX Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 31 мая-4 июня, 2004;

20. 13 European Congress on Electron Microscopy. Antwerp, Belgium, 23-28 August, 2004;

21. 14"' International Conference on Crystal Growth. 9-13 August 2004, Grenoble, France;

22. 2nd Joint Meeting of the European Calcified Tissue Society (ECTS) and the International Bone and Mineral Society (IBMS), Geneva, Switzerland, 24-29 June 2005;

23. XX International Congress of the International Union of Crystallography, Florence, Italy, 23-31 August, Book of Abstracts, p.l 16, 2005.

24. 16"' International Congress on Electron Microscopy, IMC16, 3-8 Sept.2006, Sapporo, Japan.

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в реферируемых отечественных и зарубежных научных журналах и сборниках, список публикаций приведён в конце автореферата.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, семи глав, каждая из которых заканчивается кратким обзором результатов, заключения и списка литературы, изложенных на 230 страницах печатного текста, включающих 140 рисунков, 11 таблиц и список литературы из 215 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во Ввсдепин обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы основные цели и направления исследования, научная новизна и практическая значимость полученных данных, а также перечислены защищаемые положения.

В Главе 1 обобщены литературные данные и выделены особенности исследования наноматериалов с помощью просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (ВРЭМ), посвященные основным принципам обработки и моделирования изображений. Отмечается, что для образцов, чувствительных к электронному облучению фазовый анализ на наноуровне наиболее эффективно может быть проведен с помощью преобразования Фурье ВРЭМ изображений (дифрактограмм), когда само изображение становится образцом.

В ходе обработки изображений преследуются несколько целей: 1) улучшение визуального восприятия изображений и 2) выполнение измерений расстояний и углов в регулярных структурах на изображениях. В электронной микроскопии улучшение качества изображений обычно связано с уменьшением фона, а измерение расстояний между полосами и углов, обеспечивает определение структуры материалов. Такие измерения, проводимые прямо на ВРЭМ изображениях могут приводить к большим ошибкам.

Известно, что преобразование Фурье является представлением изображения как суммы комплексных экспонент переменных, частот и фаз, и играет важную роль для анализа, фильтрации и реконструкции изображений. Изображение может быть преобразовано из области времён в область часто'г, а полученное изображение опять может быть преобразовано из области частот в область времен путем выполнения обратного двумерного быстрого преобразования Фурье (БПФ). Если никаких изменений в комплексном изображении в области частот не было сделано, то конечное изображение будет таким же, как и начальное. Но поскольку могут быть выполнены некоторые операции в области частот, называемые свёртками, то конечное изображение может измениться. Операция свёртки в области частот практически является наложением маски на преобразуемое изображение, в результате чего может быть достигнуто изменение уровня шума или реконструкция изображения.

Исследование дифрактограммы от ВРЭМ-изображения даёт возможность 1) выявить, измерить и скорректировать астигматизм микроскопа; 2) обнаружить движение образца в процессе экспозиции; 3) измерить дефокусировку на полученном изображении; 4) измерить коэффициент сферической аберрации микроскопа; 5) измерить постоянные функции затухания; 6) использовать для получения информации о структуре образца. Первые пять функций использовались in situ при работе на электронном микроскопе в данном исследовании, т.е. немедленно выявлялся и корректировался астигматизм, аберрации, определялось направление движения (если таковое имело место) образца, устанавливалась дефокусировка и т.д. Эти процедуры были необходимыми для получения хорошего интерпретируемого изображения, которое впоследствии и анализировалось.

Фаза электронной волны на выходной поверхности образца отражает периодичность кристаллической структуры. В свою очередь, ВРЭМ изображение в приближении слабого фазового объекта является в основном интерференционной картиной, которая отражает периодические модуляции фазы электронной волны. Поэтому структура и фазовый состав образцов может быть определён благодаря сохранению дифрактограммой такой периодичности, т.е. её способности отражать фазу рассеяния электронной волны.

Получение кристаллографической информации в прямом пространстве из ВРЭМ изображений, образованных с помощью очень тонкого пучка, и последующий доступ к обратному пространству методом преобразованием Фурье нанообластей на ВРЭМ изображениях представляет собой очень красивый и полезный метод, альтернативный нанодифракции. Однако дифрактограммы не являются картинами электронной дифракции, а только в той или иной степени имитируют геометрию истинной дифракционной картины. Первое отличие состоит в том, что информация о фазе дифрагированных пучков внедрена в интерференционной картине, которой является ВРЭМ изображение, но отсутствует в реальной дифракционной картине, которая является картой амплитуд пучков. Второе отличие проистекает из-за влияния самого микроскопа, а именно: передаточная функция добавляет изменение фазы и срезает пространственные частоты. Это приводит к тому, что объект не является уже трёхмерным распределением атомов, а только двумерной решёткой, контраст от которой уже не имеет простой связи с первоначальным.

Одной из основных целей электронной микроскопии высокого разрешения является установление соответствия между положениями в объекте атомов или их групп и распределением темного и светлого контраста па полученных изображениях. Обычно такого прямого соответствия нет, и в общем случае изображение образца нельзя описать простым аналитическим выражением. Интерпретация экспериментальных данных проводится на основе расчета ожидаемого контраста, т.е. моделирования изображения для известной структуры, толщины и ориентации образца. В таких расчетах учитываются все необходимые электроно-оптические параметры, а именно: ускоряющее напряжение, дефокусировка изображения, расходимость пучка, сферическая и хроматическая аберрации, флуктуации значений дефокусировки. Интерпретация полученных рассчитанных изображений требует сравнения с теоретическими изображениями. Распространение волнового фронта в образце описывается в рамках упругого рассеяния, при этом используется алгоритм Бете (или метод блоховских волн, Bloch wave approach). Другой способ расчета изображений базируется на так называемом многослоевом методе (The multislice method), в котором предполагается разбиение кристалла на множество слоёв. В предлагаемой работе использованы оба метода расчёта ВРЭМ-изображений.

В Главе 2 представлены литературные данные о материалах, которые служили образцами для исследования методом ВРЭМ. Здесь дан краткий обзор свойств и структурных особенностей как естественных (образующихся в природе) малоразмерных, так и синтезированных наноматериалов, применение которых имеет значительные перспективы в качестве биоматериалов.

В разделе 2.1 рассмотрены особенности синтеза, приведены структурные данные, представлен разброс мнений о механизме образования фосфатов кальция: гидроксиапатита, трикальций фосфатов, кислых фосфатов (октакальций фосфат, брушит, монетит).

Особенности нанокомпозитов па основе наночастиц металлов (Ag) и неметаллов (Se), диспергированные в различные органические матрицы описаны в разделе 2.2. Считается, что такие композиты обладают практически неограниченными кумулятивными свойствами, берущими начало в природе, как неорганических компонент, так и полимеров. Результаты исследования подобных композитов находят применение в одной из важнейших областей - биомедицине. Селену и серебру принадлежит своя исключительная роль в создании и производстве профилактических и лечебных средств. Селен и его соединения известны в качестве антиоксидантов, удаляющих свободные радикалы, имуностимулирующих и антимутагенных средств, что определяет практическое использование как лекарственных препаратов при лечении онкологических, сердечнососудистых заболеваний. Оправдан вновь проявляющийся повышенный интерес к коллоидному серебру, стабилизированному более эффективными и менее токсичными (вызывающими аллергические реакции) органическими матрицами, как к бактерицидному средству на фоне общего снижения эффективности различных антибиотиков.

В Главе 3 диссертации представлены основные принципы, заложенные в программы моделирования размерного эффекта и ВРЭМ изображений для образцов, отклоненных от точной оси зоны, испытывающих случайные вибрации и дрейф. Дано подробное описание условий проводимых экспериментов, оборудования, компьютерного программного обеспечения электронно-микроскопического эксперимента (Раздел 3.1).

В параграфе 3.1.1 представлены основные характеристики используемого электронного микроскопа высокого разрешения FEI CM300UT FEG с автоэлектропным источником при ускоряющем напряжении 300 кВ и коэффициенте сферической аберрации 0.65 мм с разрешением 0.17 нм. Изображения получали с помощью CCD Gatan797 камеры (1024 pixels х 1024 pixels х 14 bits).

Количественная обработка ВРЭМ изображений и дифракционных картин, фильтрация шума проводилась с помощью компьютерной программы DigitalMicrograph 3.6.1. Эта программа применяется как "on line", так и "off line" , т.е. создана как для управления

микроскопом, так и обработки полученных изображений, имеет свой собственный формат сохранения изображений, называемый DM3, и поддерживает общепринятые форматы TIFF, GIF, PICT, BMP.

Параграф 3.1.2 представляет используемое в работе компьютерное обеспечение для количественной обработки и калибровки изображений. Обработка ВРЭМ-изображений включала измерения углов и расстояний, фильтрацию шума путём наложения маски на «рефлексы» с помощью преобразования Фурье, получаемые от регулярной структуры картины, использование математических операций для сравнения изображений.

Основные принципы создания программ моделирования изложены в параграфе 3.1.3. Количественная обработка ВРЭМ изображений с помощью преобразования Фурье или дифрактограмм было необходимым условием в исследовании, но не являлось достаточным, поскольку часто получали многозначные решения, которые отвечали нескольким ориентировкам кристаллов или даже нескольким фазам, например двум или трём фосфатам кальция или различным модификациям селена. Для всех этих кристаллов характерны большие низкосимметричные элементарные ячейки, что приводит к образованию большого количества отражений на дифракционных картинах. Как правило, эти электронограммы имеют оси зон с высокими индексами. Соответственно несколько решений могут быть удовлетворительными в пределах точности измерений 1-2%. Таким образом, моделирование ВРЭМ изображений являлось своего рода операцией по восстановлению фазы дифрагированных пучков, в комбинации с известными амплитудами из дифрактограмм, что устраняло эту неоднозначность в определении структуры.

Интерпретация ВРЭМ изображений - определение фазового состава в нанообластях и оценка толщины образовавшихся кристаллов - проводились с использованием JEMS, многофункциональной компьютерной программы для расчета: а) ВРЭМ изображений (с помощью блоховских волн и по многослоевому методу), б) электронодифракционных картин (моно- и поликристаллических, дифракции в сходящемся пучке) в рамках кинематической и динамической теории, в) передаточной функции для всех типов микроскопов и г) построения кристаллографических моделей различных веществ (в прямом и обратном пространстве, стереографические проекции и трехмерные изображения). Данная версия, написанная на языке Java, отличается эффективным пользовательским графическим интерфейсом и возможностью изменения любого параметра образца или изображения в любой момент времени. Задавая необходимые параметры, фактически можно наблюдать, например, изменения ВРЭМ изображений в реальном времени. Важным преимуществом JEMS является высокая скорость вычислений, а также новые возможности в интерпретации результатов, связанные с эффектами дрейфа, колебаний, наклона образцов, астигматизма и

смещения изображения. В случае исследования состава в многофазных системах JEMS позволяет провести анализ электронограмм и идентификацию фаз сразу для значительного количества соединений.

Наноструктурное исследование биоматериалов потребовало значительной модификации программы моделирования JEMS, которая заключалась в разработке и введении новых программ (опций), открывших более широкие возможности в интерпретации экспериментальных данных. Большое внимание было уделено объяснению диффузного рассеяния на картинах электронной дифракции от нанокристаллов гидроксиапатита, для чего JEMS получила программу, с помощью которой возможно наблюдение изменения ширины дифракционных пиков и их разрешения в зависимости от размера частицы (Параграф 3.1.3.1).

Были выбраны два пути моделирования размерного эффекта. Первый подход базируется на известной формуле для кристалла конечного размера в форме параллелепипеда, где интенсивность рассеяния пропорциональна квадрату модуля структурной амплитуды, объему кристалла и фактору повторяемости. Форма получаемого профиля для интенсивности уширенных колец в поликристаллических электронограммах аппроксимировалась с помощью аналитических выражений для интенсивности Гаусса и Лоренца. Получено хорошее согласование профилей максимумов на экспериментальных электронограммах с сильным диффузным рассеянием и моделированных картинах электронной дифракции для изотропных частиц диаметром до 20 нм, что также подтверждено электронно-микроскопическими изображениями. Второй путь учитывает анизотропию кристаллов и основан на расчетах интенсивности из первых принциов с помощью атомных амплитуд всех атомов, входящих в элементарную ячейку. В этом случае сначала строилась модель тонкого вытянутого кристалла, задавая вдоль х (ось а), у (ось Ь) и z (ось с) необходимое (произвольное) число ячеек, после чего для данной модели моделировалась дифракционная картина и ее профиль, которые сравнивались с экспериментальной картиной. Такое моделирование позволяло заметить момент образования анизотропных кристаллов, начинающих свой рост вдоль преимущественного направления [0001] с соответствующим появлением пика 0002.

Для однозначной интерпретации ВРЭМ изображений для установления фазового состава, определения ориентировки кристаллов и оценки их толщины в моделировании ВРЭМ изображений было учтено возможное отклонение кристалла от точной оси зоны (Параграф 3.1.3.2). Таким образом, появилась возможность задавать любые координаты центра Лауэ круга (а не только целочисленные hkl, как это было в предыдущих версиях JEMS, а также в других программах моделирования) и исследовать изменение распределение

контраста на ВРЭМ изображениях. Умет влияния случайных вибраций образца и смещений в разных направлениях при моделировании позволил достигать наилучшее соответствие между экспериментальными и рассчитанными изображениями (Параграф 3.1.3.3).

Проводилась значительная работа для создания дружественного графического интерфейса программы, главным образом связанного с оптимизацией использования оперативной памяти компьютера и разумного времени расчета.

Соответствие (Параграф 3.1.3.4) между экспериментальными и рассчитанными ВРЭМ изображениями определялось с помощью нескольких критериев согласия и корреляционного коэффициента, значения которого находились в интервале от 0.990 до 0.997. Численная корреляция между экспериментальными и моделированными изображениями определялась для ВРЭМ изображения, полученных от нанокристаллов гидроксиапатита для определения их толщины. Данная операция не проводилась при идентификации нанофаз в смесях и в кристаллах с включениями, поскольку распределение контраста на моделированных ВРЭМ изображениях от неподходящих фаз или ориентировок было очевидным для выбора.

В Параграфах 3.1.4. и 3.1.5. представлено описание исследований, часть которых была выполнена с помощью сканирующей электронной микроскопии па двух приборах FEI XL30 F и высокоразрешающем микроскопе FEI XL30 S. Для химического (элементного) количественного и качественного анализа исследуемых материалов использовалась рентгеновская энерго-дисперсионная спектроскопия, как в просвечивающих, так и в сканирующих электронных микроскопах, оснащенных рентгеновским спектрометром и компьютерным обеспечением системы INCA, Oxford.

В Разделе 3.2 приведены основные сведения об особенностях проводимых синтезов исследуемых материалов, условий роста нанокристаллов и приготовлении образцов для электронной микроскопии.

В параграфе 3.2.1 описаны фосфаты кальция (гидроксиапатит и октакальций фосфат), которые синтезировались разными способами осаждением из водных растворов при различных режимов перемешивания исходных растворов (СаСЬ и КН2РО4 + К2НРО4 нескольких концентраций), включая конвекционное, диффузионное на космической платформе и принудительное перемешивание с разными скоростями. Температуры растворов во время химической реакции и осаждении кристаллов были 25°С - 40°С или 95°С, pH раствора до начала осаждения составлял порядка 7.4. Известно, что скорость смешения реагентов в растворах оказывает решающее значение на морфологию и размеры образующихся кристаллов и на фазовый состав осадков благодаря изменению значений локального пересыщения и ра;пределения пересыщения в кристаллизационном объёме.

В космических и земных контрольных экспериментах кристаллизатор представлял собой резервуар с тремя отделениями. В двух крайних камерах находились начальные растворы, содержащие ионы кальция и фосфат ионы, а в средней камере был залит 0.16М буферный раствор KCl. На космической платформе открывались клапаны и в среднюю камеру с буферным раствором начинали поступать растворы СаСЬ и КН2РО4+К2НРО4, процесс осуществлялся в течение 5 месяцев, пока продолжался космический полёт, В это время на земле в таком же кристаллизаторе и в тех же растворах тоже проходила кристаллизация. Был проведен ростовой эксперимент, имитирующий условия очень медленного перемешивания реагентов в растворе, находящимся в невесомости, и, наоборот, в условиях максимально быстрого перемешивания.

Параграф 3.2.2 посвящен описанию методики приготовления высокотемпературных керамик и пористых материалов (костных заместителей) на основе гидрокисапатита, синтезируемого из водных растворов при температурах не выше 40°С.

Для исследования наноструктуры кальций фосфатных покрытий (параграф 3.2.3) гидроксиапатит осаждали на разные подложки из низкотемпературной газовой плазмы. Для электронной микроскопии готовились образцы как «в плане» так и поперечные сечения покрытия вместе с подложкой.

Механизм биоминерализации (параграф 3.2.4) изучался на примере кальцификации сердечных клапанов и сравнительной характеризации структуры нормальной костной ткани и патологически модифицированной. Кристаллы и их агломераты с осадков на сердечных клапанах переносились на медную сетку с углеродной пленкой; не проводилось дополнительного утонения или напыления защитных пленок сверху образцов. Образцы костной ткани в эпоксидной смоле готовили с помощью ультрамикротомии.

Синтез наночастиц селена и серебра (параграф 3.2.5) осуществлялся с помощью окислительно-восстановительного процесса в присутствии стабилизирующих полимеров различной природы: поливинилпирролидон, натриевые соли полисульфоновых кислот, некоторые полиэлектролитные комплексы. Для электронно-микроскопического исследования, сильно разбавленные коллоидные растворы наносились на медные электронно-микроскопические сетки с тонкой углеродной плёнкой. 100-кратное разбавление проводилось для предотвращения образования трёхмерной структуры и агломерации наночастиц при высыхании растворителя, а также уменьшения сильного фона от органического вещества.

В Главе 4 представлены результаты исследования особенностей морфологии и структуры гидроксиапатита и октакальций фосфата, осаждаемых из водных низко- и высокотемпературных растворов в разных условиях.

Раздел 4.1. посвящен данным о морфологии структуре кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата, осаждающихся при проведении низкотемпературной кристаллизации. Приведены результаты исследования морфологии и структуры кристаллов, образующихся при разных режимах смешивания начальных растворов. Медленное диффузионное смешивание реагентов в невесомости приводит к образованию больших (на 1-2 порядка больше по сравнению с контрольными образцами на Земле) кристаллов, в то время как максимально возможное быстрое смешивание (несколько секунд) и малые времена кристаллизации (от нескольких секунд до нескольких десятков секунд) приводят к образованию нанокристаллов. В последнем случае в сильно неравновесных условиях кристаллы октакальций фосфата, обладающие большей растворимостью, растворяются, а кристаллы гидроксиапатита — фаза с наименьшей растворимостью - зарождаются и растут до микроразмеров.

Известно, что численное значение растворимости для октакальций фосфата не является постоянными и в разных литературных источниках оно может различаться. Тому могут быть две причины. Первая - дефектная структура кристаллов, вторая - неточность в проведении фазового анализа и измерения растворимости на образцах с разным составом. Эксперименты по измерению растворимости были начаты почти 40-50 лет назад с предварительным рентгенофазовым анализом полученного материала. Неточность фазового анализа могла заключаться в том, что исследовалось не чистое вещество, а смесь двух фаз, гидроксиапатита и октакальций фосфата. Действительно, для кристаллов октакальций фосфата установлена характерная особенность - практически все кристаллы являются смешанными и включают менее растворимую в воде фазу гидроксиапатита. В Разделе 4.2 представлены результаты исследования смешанных ОСР/НАР кристаллов, получаемых как в условиях нормальной, так и микрогравитации. Соотношение фаз ОСР/НАР не является постоянным и при медленном росте в диффузионном режиме (в космосе) образуются практически чистые ОСР кристаллы с малыми (напо)включениями НАР. Вклад конвективного перемешивания исходных растворов приводит к неравномерному распределению пересыщения в разных точках кристаллизационного объёма и вблизи растущей поверхности. Размер включений НАР в кристаллах ОСР может быть значительным.

Установить присутствие включений ПАР в матричных кристаллах ОСР весьма затруднительно по электронограммам благодаря близости межплоскостных расстояний для обеих фаз. Кроме того, из-за сильной анизотропии кристаллов и малости толщины трудно было получить проекцию, где разница в расстояниях была бы чётко определяемой. Как правило, основными проекциями электронограмм были [110] или [100]. На картинах

селективной электронной дифракции проявлялись дуги и небольшие растепления рефлексов, которые можно было интерпретировать как результат включений. Дифрактограммы (преобразование Фурье) от ВРЭМ изображений, позволяющие анализировать значительно меньшие области структуры образца, ясно показывали наличие всех рефлексов от двух фаз ОСР и НАР, для которых установлены ориентационныс соотношения (0001)Нар Н (001)оср и [21 I 0]нар // [1Ю]оср- Показано, что такие кристаллы весьма напряженные. При наличии включений НАР деформация в кристалле ОСР вдоль направления [001] на границе раздела может составить около 0.73%, а вдоль направления [010] ОСР величина деформации достигает 9.9 %.

Проявление размерного эффекта на картинах электронной дифракции и определение толщины тонких кристаллов гидроксиапатита описано в Разделе 4.3. Моделирование размерного эффекта для частиц гидроксиапатита диаметром 50, 4.1, 1.6 и 0.9 им по программе JEMS показало изменение электронной дифракционной картины с уменьшением размера частиц. Появление диффузного рассеяния на картинах селективной электронной дифракции объясняется как малыми размерами кристаллов, так и структурными особенностями гидроксиапатита. С уменьшением размеров значительное число отражений, характерных для кристаллов с большой гексагональной ячейкой, перекрывается благодаря близости межплоскостных расстояний. Моделирование размерного эффекта в приближении изотропных кристаллов и аппроксимация с помощью функций Гаусса или Лоренца показало, что диффузные широкие кольца сохраняются для нанокристаллов со средним размером 20 нм. Расчет интенсивностей отражений с помощью атомных амплитуд всех атомов, входящих в ячейку позволил исследовать влияние размеров на картины электронной дифракции для анизотропных нанокристаллов и выявить начальную стадию преимущественного роста кристалла вдоль направления [0001]. Экспериментальные ВРЭМ изображения с соответствующими дифрактограммами подтвердили кристаллическую структуру наночастиц НАР, а с помощью рассчитанных ВРЭМ изображений удалось оценить толщину нанокристаллов (1-2 параметра решетки вдоль направления [21 10]).

Известно, что кристаллические дефекты и напряжения также приводят к уширению дифракционных максимумов. В данном случае эти факторы не являются определяющими, поскольку исследуемые объекты двумерные с малой толщиной от 0.8 нм до 50 нм. Дефектность гораздо сильнее проявляется в случае более толстых кристаллов, однако, диффузное рассеяние па их дифракционных картинах не проявляется.

В Разделе 4.4 представлены возможности JEMS моделирования в определении толщины кристаллов, установлении наклона и кристалла по отношению к электронному пучку или его изгиба под действием пучка. Моделирование проводилось как по методу

блоховских волн, так и по многослоевому методу для нескольких ориентации кристаллов. Для установления наилучшего соответствия между моделированными и экспериментальными ВРЭМ изображениями учитывалось влияние вибраций образца вдоль осей X и Y с учетом азимутального направления, дрейфа образца на распределение контраста на изображениях. Как уже указывалось в Главе 2, JEMS предлагает учитывать астигматизм (2D и 3D). В данной работе астигматизм объективной линзы устранялся в процессе электронно-микроскопического исследования.

Раздел 4.5 посвящен исследованию особенностей структуры «толстых» кристаллов гидроксиапатита и причинам появления запрещенных отражений на электронограммах как результата как проявления локального разупорядочения в пределах малых углов 0.5 - 0.8°, возникающего в процессе роста. Относительно толстые (несколько десятков нм) кристаллы гидроксиапатита обычно образуются в высокотемпературных водных растворах (до 95°С) и их толщина значительно превосходит толщину кристаллов, осажденных в низкотемпературных растворах. Построение серии изображений в координатах дефокус -толщина при изменении толщины от 1 до 100 нм и изменении дефокуса от 0 до 60 нм для кристалла гидроксиапатита в точных ориентировках [1100] и [21 10] и с учетом отклонения от точной оси зоны показало существование слабо разориентированных (в пределах 0.8°) относительно друг друга областей в таких кристаллах при сохранении монокристаллической селективной электронной дифракции. Дифрактограмма, полученная от топкого края кристалла, полностью соответствует гексагональной группе Рбз/m, в которой рефлекс 0001 является запрещенным. Моделированное изображение имело наилучшее соответствие с экспериментальным для толщины кристалла в 0.8 нм или 1.0 нм, т.е. 1 параметр решетки вдоль [2110] или [1100], соответственно. Запрещенный сигнал становился все более заметным с увеличением толщины кристалла (при движении к центру). Все электронограммы от толстых кристаллов содержат отражение 0001. Появление такого рефлекса объяснили неидеапьной упаковкой атомных плоскостей (нестехиометрия или неполные элементарные ячейки) на основе моделирования динамической электронной дифракции в зависимости от толщины образца. Динамические явления наступают в кристаллах, значительно более толстых по сравнению с условиями возникновения запрещённых рефлексов (уже при толщине 2 элементарных ячейки).

В Разделе 4.6 с помощью моделирования рентгенодифракционных картин от смесей гидроксиапатита и октакальций фосфата в разных соотношениях показана ограниченность данного метода исследования по сравнению с локальным электронно-микроскопическим исследованием. Целью моделирования с помощью программы CaRIne Crystallography 3.1 (1989-1998 С. Boudias, D. Monceau) был мониторинг изменения высоты пиков в зависимости

22

от соотношения двух фаз и определение порога чувствительности метода рентгенофаэового анализа. Показано, что проблематичным становится детектирование ОСР уже в смеси, где содержание этой фазы около 8 вес.%, а также весьма затруднительно идентифицировать гидроксиапатит в смеси с 15 % НАР и 85% ОСР, или в смеси 95 % НАР и 5% ОСР. Таким образом, фазы, находящиеся в меньшем количестве в данных смесях, могут быть потеряны, а проведение анализа смесей НАР/ОСР только на основе рентгенодифракциопных данных может привести к ошибочному заключению о фазовом составе. Преимуществом электронной микроскопии является возможность выявления одного кристалла, по крайней мере, из тысячи по характерной морфологии или структуре, что в случае исследования смесей фосфатов кальция делает применение данного метода эффективным и необходимым.

В Разделе 4.7 представлены результаты исследования влияния электронного облучения на структуру кристаллов гидроксиапатита и остакальций фосфата. Такое исследование было проведено (I) из-за многочисленных дискуссий о возможности перехода одной кальций фосфатной модификации в другую под действием электронного пучка и (2) из-за попыток проведения фазового анализа с помощью рентгеновского микроанализа без электронной дифракции или ВРЭМ исследования. Показано, что образцы подвергаются сильным радиационным повреждениям в результате действия пучка вплоть до полного испарения кристалла. На начальном этапе радиационные повреждения проявляются в образовании шероховатого края и поверхности, затем следует образование многочисленных границ с появлением дырок, после чего тонкий кристалл испаряется, толстый кристалл превращается в бесформенную массу и постепенно испаряется. Для агломератов напокристаллов характерно спекание кристаллов с последующим их разрушением. Кристаллы ОСР, содержащие в решетке молекулы воды разрушаются значительно быстрее. Среднее время исследования тонкого кристалла НАР и ОСР около 30 секунд, толстого кристалла НАР около 1-2 мин. Поскольку НАР и ОСР начинают разрушаться сразу, то объем образца, с которого детектируется рентгеновское излучения, все время меняется. При проведении микроанализа соотношения Са/Р постоянно увеличивается, что означает рост концентрации кальция и падение концентрации фосфора. Соотношение Са/Р, полученное данным методом в первые секунды измерения может только приблизительно указать на начальный состав исследуемого фосфата кальция.

Глава 5 посвящена исследованию наноструктуры пористых и твердых биоматериалов на основе гидроксиапатита покрытий гидроксиапатита и керамики трикальций фосфата, прошедших через высокотемпературную обработку.

В разделе 5.1. продемонстрирована высокая эффективность ВРЭМ в исследовании наноструктуры и термической устойчивости высокотемпературных пористых и твердых

биоматериалов на основе гидроксиапатита, синтезированного в низкотемпературных растворах (не выше 40°С). Выявлены различия в морфологии и размерах нанокристаллов НАР, составляющих пористые гранулы (полученные в кипящих водных растворах) и в твердых плотных керамиках, синтезированных при 870 и 1200°С. Показано, что НАР сохраняет свою кристаллическую структуру при высоких температурах вплоть до 1200°С. Не установлено присутствия других кальций фосфатных модификаций в биокерамиках, соответственно, не выявлено признаков разложения гидроксиапатита.

В разделе 5.2 дифрактограммы и моделирование ВРЭМ изображений применены к установлению особенностей структуры плазменных покрытий гидроксиапатита на металлических подложках, поверхностях монокристаллов хлорида натрия и фторида бария. ВРЭМ-изображения поперечного сечения покрытия на подложках указывают, что покрытие состоит из нанокристаллов НАР размером от 3 до 20 нм. Эти нанокристаллы ориентированы случайным образом относительно друг друга и относительно подложки. Индицировапие дифрактограмм нанообластей показало присутствие только иапокристаллов НАР, никакой другой фазы lie было выявлено. Следует отметить, что непосредственно вблизи подложки наблюдались участки с неупорядоченной структурой, появление которых можно объяснить образованием случайно ориентированных нанокристаллов НАР, размеры которых сравнимы с размерами элементарной ячейки. Анализ данных, полученных с покрытий, осажденных электрохимическим способом в растворах с последующим отжигом, показал зависимость фазового состава покрытий от величины электрического тока. Большие токи приводят к разложению фосфатов кальция и появлению в покрытиях нанообластей со случайными соотношениями Са/Р в интервале от 0.12 до 5.9. Смесь фаз образует в данных нанообластях разупорядоченную структуру.

В разделе 5.3 проведена характеризация нанофаз, образующихся в процессе высокотемпературного спекания Р-Саз(Р04)г с образованием фазы а-Саэ(Р04)2 при температуре фазового перехода 1125°С в конечном продукте, используемом в качестве костного нмплантата. Большая часть экспериментальных электронограмм а-Саз(РС>4)2 включала рефлексы нескольких Лауэ зон (часто наблюдалось присутствие 5 лауэ-зон). Их индицировапие проводилось путем моделирования картин электронной дифракции методом блоховских волн с помощью JEMS. Моделирование показало появление запрещенных симметрией кристаллографической ячейки рефлексов с ростом толщины кристалла, что уже было установлено для кристаллов гидроксиапатита. Для анализа и интерпретации экспериментальных электронограмм и дифрактограмм ВРЭМ-изображений использовались кристаллографические данные ряда соединений кальция, которые имели возможность образоваться в процессе высокотемпературного спекания. Было показано, что в пределах

точности электронно-микроскопического анализа фазовый переход из р-Саз(Р04);> в а-Саз(Р04)2 прошёл полностью. Однако синтез привёл к образованию нанокристаллического оксида кальция, что подтверждается электронограммами и дифрактограммами от ВРЭМ-изображсний. Количество оксида кальция, которое не поддаётся детектированию с помощью рентгеновской дифракции, может достигать 11-15 вес.%, причем оксид кальция может формировать микрочастицы диаметром до 1-2 мкм. Таким образом, впервые показано, трикальций фосфат разлагается под действием температуры (1430°С) до СаО задолго до температуры, определённой фазовой диаграммой в системе СаО-РгО.^ и равной 1720°С.

Глава 6 посвящена исследованию структуры костной ткани и состава минерального осадка на сердечных клапанах. Электронно-микроскопические методы характеризации нанофаз, протестированные для синтезированных кристаллов фосфатов кальция, применены для анализа биообъектов.

В разделе 6.1. представлены результаты сравнительной характеризации разных образцов костной ткани, касающиеся структуры, морфологии и текстуры нанокристаплов гидроксиапатита, расположенных на коллагеновых волокнах. Кристаллическая текстура проявлялась в виде арок, как на элсктронограммах, так и на дифрактограммах, полученных от изображений. Угол разориентировки находился в интервале ±30°. Нанокристаллы НАР на коллагеновых волокнах были вытянуты вдоль направления [0001]. Длина нанокристаплов не превышала 15-20 нм, ширина была несколько меньше, толщина кристаллов, по оценкам, сделанным с помощью моделирования ВРЭМ-изображений, составляла 0.8 нм или 1 параметр элементарной ячейки вдоль направления [21 10]. Только кристаллы НАР были выявлены в минеральной составляющей костной ткани. В рамках исследования различных патологических изменений в кости проведенный сравнительный анализ образцов нормальной и патологической костной ткани показал отсутствие каких-либо изменений минеральной фазы костной ткани, т.е. не произошло фазовых превращений, не изменились размеры или распределение нанокристаплов НАР. Методом сканирующей электронной микроскопии и ЭДС было выявлено разрастание органических волокон. На основе полученных экспериментальных изображений было объяснено наблюдающееся при остеопорозе изменение плотности костной ткани. Повышенная пористость может образоваться благодаря проникновению органических волокон внутрь кости, которая в результате дилатации увеличивается в объёме, что и может быть причиной уменьшения .' плотности кости. С другой стороны наблюдалось зарастание естественных каналов в кости для кровеносных сосудов, нервных окончаний, что могло впоследствие приводит не только к затруднению и прекращению кровообращения в костной ткани, но и нарушениям кальциевого и фосфорного баланса, к прекращению доставки питательных веществ. Таким

образом, нарушение целостности кости, а также динамического равновесия между ионами кальция и фосфат ионами, приводит к ухудшению механических свойств кости - их прочности.

В разделе 6.2 на основе электронной микроскопии минеральных осадков на сердечных клапанах предложена модель патологической минерализации клапанов. Было установлено, что на сердечном клапане могут образоваться как кристаллы гидроксиапатита, так и кристаллы октакальций фосфата, в отличие от костной ткани, что говорит разных величинах пересыщения в разных точках вблизи клапанов и образующейся минеральной фазы. В результате сравнения структуры, размеров, относительной ориентации кристаллов и фазового состава осадка в целом был сделан вывод о подобии механизмов кристаллизации в лабораторных условиях при обычном перемешивании начальных растворов и образованием минеральных осадков на клапанах в организме.

В Главе 7 представлены данные о структуре наночастиц серебра и селена, стабилизированных различными органическими матрицами. Прежде всего, было установлено влияние концентраций исходных растворов на морфологию и размер образующихся наночастиц - повышенные концентрации приводили к образованию дендритов и агломерации.

Анализ фазовых превращений, происходящих в тонких пленках композитов поливинилпирролидон/серебро, позволил предложить модель механизма бактерицидной активности наночастиц серебра и ее изменения в результате их взаимодействия с серосодержащими соединениями в окружающей среде и живых организмах. Чтобы определить фазовый состав новой частицы был проведён анализ дифрактограмм от ВРЭМ-изображений, который показал образование моноклинных фаз сульфида и сульфита серебра. Таким образом, взаимодействие между наночастицами серебра и серой из соответствующих соединений представляет собой окислительно-восстановительный процесс, в котором Ag легко окисляется до Ag+. Роль этой химической реакции может быть интерпретирована двояко. С одной стороны, время хранения растворов и тонких плёнок, содержащих наночастицы серебра, весьма ограничено, так как образующиеся сульфиды и сульфиты серебра не представляют собой биологически активные вещества. С другой стороны, именно лёгкость образования малорастворимых соединений лежит в основе бактерицидного свойства серебра. Наночастицы серебра, активно взаимодействуя с серосодержащими протеинами бактерий, разрушают их и способствуют подавлению размножения и роста бактерий.

Структура наночастиц селена исследовалась в тонких плёнках, полученных из водных растворов с разными органическими стабилизаторами:

1) поли-М-винилпирродидона - ПВП,

2) поли-М,1Ч,М,К-триметилметакрилоилоксиэтиламмония метилсульфата,

3) полиэлектролитного комплекса - сополимера ПВП с 1Ч,М,Ы,М — триэтилметакрилол-оксиэтил аммонием иодидом и додецилсульфатом натрия при разных молярных соотношениях анионов и катионов в коллоидном растворе.

4) а также из растворов, содержащих гель-плёнку бактериальной целлюлозы. Электронная микроскопия композитов с наночастицами селена показала зависимость

их структуры от природы органической матрицы, с которой частицы соприкасаются. Образующиеся во время окислительно-восстановительного процесса при указанных условиях частицы селена, не имеют регулярной кристаллической структуры, дифракционная картина состоит из размытых слабых колец, на ВРЭМ-изображениях регулярная структура также не проявляется. Добавление гель-пленки бактериальной целлюлозы (АсеюЬас1ег хуИпит), являющейся по своей природе полисахаридом, приводит к кристаллизации уже существующих в водном растворе с органической матрицей бесструктурных наночастиц селена. Индицирование нанодифракционных картин и дифрактограмм от ВРЭМ-изображений показало, что образующиеся наночастицы имеют моноклинную кристаллическую решетку а-селена. В большинстве случаев анализ дифрактограмм от ВРЭМ-изображений проводился с большей точностью, чем интерпретация нанодифракционных картин, поскольку последние были образованы не точечными рефлексами, а пятнами большого диаметра. Кроме того, ввиду близости различных осей зон для большой моноклинной ячейки происходило наложение нескольких дифракционных картин, отчего края пятен размывались. Это вносило определенную погрешность в определении центра отражения и в измерения расстояний. «Рефлексы» на дифрактограммах, получаемых от нанообластей ВРЭМ-изображений получались более четкими, и погрешность в измерениях не превышала 1%.

Первоначально образующиеся рыхлые частицы содержат внутри себя органические молекулы, т.е. частица является конгломератом кластеров селена с молекулами органической матрицы. Можно предположить, что под влиянием химических факторов, создаваемых бактериальной целлюлозой в такой рыхлой частице создаются центры кристаллизации. Такой механизм кристаллизация из нескольких центров приводит к образованию границ внутри частицы, что и наблюдается на практически всех частицах.

Было установлено, что кристаллизация частиц в растворе в присутствии бактериальной целлюлозы зависит от соотношения катион/анион в растворе. Условия, создаваемые в растворе с БЦ и полиэлектролитный комплексом при соотношении катион/анион, равным 0.5, способствуют кристаллизации. В то время как в растворе с

соотношением катион/анион, равным 4.0, кристаллических частиц не выявлено даже при длительном временном периоде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные результаты проведенных исследований можно сформулировать

следующим образом:

1. Продемонстрирована возможность полной характеризации наноструктуры биоматериалов

с помощью комбинированного метода методами преобразования Фурье и моделирования электронно-микроскопических изображений с высоким разрешением и электронной дифракции. Разработаны соответствующие программы для более точной интерпретации электронно-микроскопических данных.

2. На примерах разных кристаллов, как с моноатомными, так и многоатомными кристаллическими решетками предложен путь оценки толщины нанокристаллов и определения зеренной структуры, относительной разориентировки между ними с помощью моделирования ВРЭМ-изображений с отклонением от точной оси зоны.

3. Впервые исследована структура больших чистых кристаллов октакальций фосфата, полученных из водного раствора в условиях невесомости, а также смешанных кристаллов гидроксиапатит/октакальций фосфат, выращенных в условиях конвективного смешивания реагентов. Установлены ориентационньге кристаллографические соотношения между двумя фазами, вычислены напряжения в кристаллах.

4. Выявлены причины диффузного рассеяния и низкой интенсивности отражений на картинах рентгеновской и электронной дифракции от агломерированных нанокристаллов гидроксиапатита, которые заключаются, прежде всего, в том, что кристаллы, осажденные из низкотемпературных растворов, являются очень тонкими и имеют толщину порядка 13 параметров решетки, т.е. 0.8 - 2.4 нм. Несмотря на то, что структурные факторы соответствующих отражений сильны, ослабление интенсивности происходит за счет малой толщины, равной высоте элементарной ячейки. В то время как в других направлениях для больших кристаллических размеров проявляются отражения с малыми структурными факторами. Проведенное моделирование размерного эффекта с учетом особенностей кристаллической структуры гидроксиапатита полностью совпало с экспериментальными данными.

5. Показано, что распределение «рефлексов» на картинах преобразования Фурье -дифрактограммах, полученных с разных участков ВРЭМ-изображения является хорошим индикатором изменения толщины кристаллов по присутствию запрещенных рефлексов. На самых тонких участках по толщине, равных высоте одной элементарной ячейки,

полностью соблюдаются правила погасания. С ростом толщины происходят нарушения в упаковке слоев и возникновение локального беспорядка (нестехиометрия или рост кристалла через образование неполных элементарных ячеек), что . обеспечивает появление запрещённых для кристаллов НАР рефлексов {0001} до наступления явлений динамического характера.

6. Впервые представлено изображение поперечных сечений плазменных покрытий гидроксиапатита на подожках, показано наноструктура слоя, определены размеры, относительная ориентировка между нанокристаллами в слое и. по отношению к подложке.

7. Детально исследована структура моноклинного а-трикальций фосфата, образующаяся в

результате высокотемпературного фазового перехода из тригональной ^-модификации. Показано, что при данных условиях обработки фазовый переход проходит практически полностью с остатком порядка 3-4 вес % исходного соединения, однако при этом происходит разложение фазы трикальций фосфата с образованием нанокристаллического кубического оксида кальция задолго до температуры 1720°С, определённой фазовой диаграммой в системе СаО-РгО.?.

8. На основе ВРЭМ исследования и сравнительной характеризации разных образцов костной

ткани предложен механизм деструктивных процессов, происходящих в кости. Показано, что причиной разрушения кости в результате снижения минеральной плотности и развития остепороза может быть сильное разрастание органической ткани в виде пленок и волокон. В то время как изменений в структуре и организации минеральной фазы не происходит: присутствуют только нанокристаллы гидроксиапатита длиной до 15-20 нм, шириной до 15 нм и толщиной порядка 0.8-1.6 нм с характерной текстурой до ±30°.

9. Экспериментально показано подобие образования и осаждения фосфатов кальция в низкотемпературных растворах и образования минеральных осадков на сердечных клапанах. Детально исследованы фазовый состав (гидроксиапатит и октакальций фосфат), размеры кристаллов НАР на уровне долей микрометра с толщиной около одного-пяти параметров решетки вдоль направления [2110] и микронные размеры кристаллов октакальций фосфата и морфология кристаллов.

10. Определена устойчивость нанокомпозитов на основе органических матриц с наночастицами селена и серебра к агломерации и действию химических реагентов из окружающей среды. Предложен механизм бактерицидной активности и ее изменения для наночастиц серебра в растворах и топких пленках.

11. Впервые описан и исследован эффект кристаллизации внутри рыхлых бесструктурных наночастиц селена, синтезированных в растворе с помощью окислительно-

восстановительной реакции и стабилизированных в разных органических средах. Присутствие бактериальной целлюлозы способствуют кристаллизации уже сформированных в водных растворах стабилизированных наночастиц селена с образованием дефектов и границ внутри моноклинного кристалла а-селена.

Таким образом, подводя итоги исследования, можно заключить, что электронная микроскопия высокого разрешения, количественная обработка ВРЭМ-изображения с помощью метода преобразования Фурье и интерпретация с помощью моделирования изображений является надежным инструментом в исследование структуры нанокристаллов, нанофаз в композитах и характеризации их морфологии, размеров и относительной ориентации. Полученные данные о структуре нанофаз позволяют сделать выводы о механизмах кристаллизации для разных условий, включая механизмы биоминерализации, определить оптимальные методы синтеза биоматериалов, эффективном и безопасном использовании лекарственных средств. Цитированная литература

1. Crozier Р.А. et al.. Factors affecting the accuracy of lattice spacing determination by HREM in

nanometre-sized Pt particles. J. Electron Microscopy 48 (1999) 1015-1024;

2. Malm J.O., O'Keefe M.A. Deceptive "lattice spacings" in high resolution micrographs of metal

nanoparticles, Ultramicroscopy 68 (1997) 13-23.

3. Buffat P.A. Identification of nano-phases: relative merit of local analysis techniques (HRTEM,

nanodiffraction, EDS/EELS). Yearbook of Electron Microscopy Society, 78-91, Antwerpen, 2004.

4. Spense J.C.H. Experimental high resolution electron microscopy. Oxford: Clarendon Press, 1981.

Русский перевод: Спенс Дж. Экспериментальная электронная микроскопия высокого разрешения. Пер. С англ./Под ред. В.Н.Рожанского. - Москва: Наука. 1986.

5. Cowley J.M. Diffraction physics. Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1990 (Second revised

edition, forth printing).

6. Horiuchi S. Fundamentals of high resolution transmission electron microscopy. Amsterdam:

Elsevier Science B.V. 1994.

7. P.A. Stadelmann. EMS - A software package for electron difitraction analysis and HREM image

simulation in materials science. Ultramicroscopy 21 (1987) 131-146

8. Suchanck W., Yoshimura M., Processing and Properties of HA-Based Biomaterials for Use as

Hard Tissue Replacement Implants, J. Mater. Res. Soc., 1998, vol. 13, no. 1, pp. 94-103.

9. Hech, L.L., Bioceramics. J. Am. Ceram. Soc., 1998. vol. 82, no. 7, pp. 1705-1733.

10. Северин А. В., Комаров В. Ф,. Божевольнов В. Е, Мелихов И. В. Морфологический отбор в суспензии нанокристаллического гидроксиапатита, приводящий к сфероидным агрегатам. Ж. неорг. химии. 2005. V. 50, Р. 76.

11. Мелихов И.В., Комаров В.Ф., Божевольнов В.Е., Северин A.B. ДАН. 2000. Т. 373. С. 355.

12. Копейкии В.В., Панарин И.Ф. Водно-растворимые нанокомпозиты нуль-валентного серебра с высокой антимикробной активностью. Докл. Акад. Наук. 380 (2001) №4, 497500.

13. Копейкин В.В., Валуева C.B., Киппер А.И., Боровикова Л.П., Филлипов А.П. Синтез наночастиц селена в водных растворах поливинил-пирролидопа и морфологические характеристики образующихся нано-композитов. Высокомолекулярные соединения, сер. А, 45 (2003) №4, 615-622.

14. Хамчуков Ю.Д., Кпубович В.В., Потапенко И.П., Батраков Н.Ф., Бобровский В.В., Шашков С.Н. Нанесение покрытий на титан методом распыления таблетированного карбонат-гидроксилапатита в плазме ВЧ разряда. Физика и химия обработки материалов. 1998. № 1. 55 - 59.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в реферируемых журналах.

1. Lundager Madsen Н.Е., Christensson F., Polyak L.E., Suvorova E.I., Kliya M.O., Chernov A.A. Calcium phosphate crystallization under terrestrial and microgravity conditions. J.Crystal Growth 152(1995) 191-202.

2. Lundager Madsen H.E., Christensson F., Chernov A.A., Polyak L.E., Suvorova E.I. Crystallization of calcium phosphate in microgravity. Adv. Space Res. 16 (1995) 65-68.

3. Suvorova E.I., Christensson F., Lundager Madsen H.E., Chernov A.A. Terrestrial and space-grown HAP and OCP crystals: effcct of growth conditions on perfections and morphology. J. Crystal Growth 186 (1998) 262-274.

4. Suvorova E.I., Lundager Madsen H.E. Observation by HRTEM the hydroxyapatite - octacalcium phosphate interface in crystals grown from aqueous solutions. J. Crystal Growth 198/199, Part 1 (1999) 677-681.

5. Suvorova E.I., Buffat P.A. Electron diffraction from micro- and nanoparticles of hydroxyapatite. J.Microscopy 196 (1999) Part.l, 46-58.

6. Suvorova E.I., Buffat P.A. Electron diffraction and high-resolution transmission electron microscopy in characterization of calcium phosphate precipitation from aqueous solutions under biomincralization conditions. European Cells and Materials, 1 (2001) 27-42.

7. Суворова Е.И., Поляк JI.E., Комаров В.Ф., Мелихов И.В. Исследование синтетического гидроксиапатита методом высокоразрешающей просвечивающей электронной микроскопии: морфология и направление роста. Кристаллография, 45 (2000), №5, 930-934.

8. Суворова Е.И., Буффа Ф.А. Проявление размерного эффекта на картинах рентгеновской и электронной дифракции от частиц гидроксиапатита. Кристаллография 46 (2001) №5, 796804.

9. Суворова Е.И. Высокоразрешающая просвечивающая электронная микроскопия и электронная дифракция в исследовании минерального осадка на сердечном клапане. Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2001, № 8, с.74-78.

10. Суворова Е.И. Фазовый анализ микро- и наночастиц фосфатов кальция, осаждаемых из водных растворов. С. 246-255. В сб.: Физика кристаллизации. К столетию Леммлейна. Ред. М.В.Ковальчук, С.И.Желудева, С.А.Пикин, В.М.Каневский, В.В.Удалова. Москва, Физматлит. 2002.

11. Suvorova Е.1., Buffat P.A. Model of the mechanism of Ca-loss by bones under microgravity and earth conditions. J. Biomed. Mater. Res. (Appl. Biomater), 63 (2002) 424-432.

12. Bulushev D.A., Kiwi-Minsker L„ Yuranov I., Suvorova E. I., Buffat P. A., Renken A. Structured Au/FeOx/C catalysts for low-temperature CO oxidation. Journal of Catalysis, 210 (2002) 149-159.

13. Kiwi J., Denisov N, Gak Y., OvanesyanN., Buffat P. A., Suvorova E., Gostev F., Titov A., Sarkisov O., Albers P., Nadtochenko V. Catalytic Fe 3+ clusters and complexes in nafion active in photo-tenton processes. High-resolution electron microscopy and femtosecond studies. Langmuir, 18 (2002) 9054-9066.

14. Yuranov I., Moeckli P., Suvorova E., Buffat P.A., Kiwi-Minsker L., Renken A. Pd/Si02 catalysts: synthesis of Pd nanoparticles with the controlled size in mesoporous silicas. Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 192 (2003) 239-251.

15. Суворова Е.И., Клечковская В.В., Бобровский В.В., Хамчуков Ю.Д., Клубович В.В. Наноструктура покрытия, полученного плазменным распылением гидроксиапатита. Кристаллография, 48 (2003) №5, 928-934.

16. Клечковская В.В., Баклагина Ю.Г., Степина Н.Д., Хрипунов Л.К., Буффа Ф., Суворова Е.И., Занавескина И.С., Ткаченко А.А., Гладчепко С.В. К структуре целлюлозы Acetobacter xylinum. Кристаллография, 48 (2003) №5, 825-832.

17. Suvorova E.I., Bobrovsky V.V., Khamchukov Yu.D., Buffat P.A. Nanostructure of hydroxyapatile coatings sprayed in argon plasma. Key Engineering Materials, 254-256 (2004) 891-894.

18. Суворова Е.И., Стадельманн П.А., Буффа Ф.А. Применение ВРЭМ-моделирования для измерения толщины кристаллов гидроксиапатита и определения разориеитации зерен. Кристаллография, 49 (2004) №3,407-417.

19. Suvorova E.I., Klechkovskaya V.V., Kopeikin V.V., Buffat P.A. Stability of Ag nanoparticles dispersed in amphiphilic organic matrix. J. Crystal Growth, 275 (2005) 2351-2356.

20. Suvorova Е.1., Buffat P.A. Pathological Mineralization of Cardiac Valves: Causes and Mechanism. Journal of Long-Term Effects of Medical Implants, 15 (2005) №4, 361 - 374.

21. Хамчуков Ю.Д., Клубович В.В., Бобровский В.В., Сычев И.Ю., Суворова Е.И., Клечковская В.В. Тонкие покрытия из карбонат-гидроксилапатита на поверхности металлов и монокристаллических диэлектриков. Физика и химия обработки материалов, 2006, №2, с.38-43.

22. Суворова Е.И., Клечковская В.В., Комаров В.Ф., Северин А.В., Мелихов И.В., Буффа Ф.А. Электронная микроскопия биоматериалов на основе гидроксиапатита. Кристаллография, 2006, т. 51, № 5, с.218-225.

Тезисы и труды конференции

1. E.I.Suvorova, A.A.Timofeev, Electron microscopy of calcium phosphates grown on earth and in space. 9,h European Symposium Gravity-Dependent Phenomena in Physical Science. Berlin, Germany, 2-5 May 1995. P. 231-232.

2. Е.И.Суворова. Граница раздела между гидроксиапатитом и октакальций фосфатом: обнаружение и исследование методом ВРЭМ. 17 Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка, 15-18 июня 1998г. Тезисы, с.25.

3. E.I.Suvorova, H.E.Lundager Madsen. Hydroxyapatite-octacalcium phosphate interface in mixed crystals grown from aqueous solutions. 12th International Conference on Crystal Growth, Jerusalem, Israel 26-31 July,1998. Abstracts, p.356.

4. E.I. Suvorova, P.-A Buffat. Diffraction from micro- and nanoparticles. 1811' International Congress on Crystallography, Glasgow, Scotland 4ll,-13"1 August 1999. Abstracts, pl45.

5. Е.И. Суворова. ВРЭМ и нанодифракция в исследовании минерального осадка на сердечном клапане. 18 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка,5 июня- 8 июля 2000 г. Тезисы докладов, стр.186.

6. Е.И. Суворова. Высокоразрешающая электронная микроскопия и нанодифракция в исследовании фазового состава и структуры микро- и нанокристаллов осаждаемых фосфатов кальция. 9 национальная конференция НКРК-2000, Москва, 16-20 октября 2000 г. Тезисы докладов, с. 120.

7. E.I. Suvorova. Calcium phosphate precipitation under biomineralization conditions: Effect of Microgravity. First International Symposium on Microgravity Research and Applications in Physical Sciences and Biotechnology. Sorrento, Italy, 10-15 September 2000. Proceedings. P.33I-336.

8 . E.I. Suvorova, P.A-Buffat. Model of the Ca-loss mechanism in bones under microgravity and earth conditions. 111'1 Interdisciplinary Research Conference on Biomaterials. (GRIBOI). Calais, France. 8"'-9m March 2001.

9. E. I. Suvorova. Processes of mineralization in living organisms. 4th International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 24-28 September 2001. Proceedings, 268-276.

10. E.I. Suvorova, P.A. Buffat. HRTEM in determining the state of matter and particles size: the cases of thin synthetic and biological calcium phosphates platelets. 5th ISTC Scientific Advisory Committee Seminar "Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and biotechnology" St Petersburg, Russia, May 27-29, 2002. Abstracts. P.86-87. Proceedings, p.288-294, 2002.

11. Е.И. Суворова. Костная ткань как композит: нанокристаллы гидроксиапатита/ коллаген. 10 национальная конференция НКРК-2002, Москва, 24-29 ноября 2002 г. Тезисы докладов, с.463.

12. Е.И. Суворова, А.И. Федюшкин. Численное моделирование массообмена при кристаллизации фосфата кальция. 10 национальная конференция НКРК-2002, Москва, 2429 ноября 2002 г. Тезисы докладов, с.428.

13. E.I. Suvorova, V.V. Bobrovsky, Yu.D. Khamchukov. Hydroxyapatite plasma coatings. 5th International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 22-26 September 2003. Proceedings, p.336-344.

14. Suvorova E.I. Application limits of mass crystallization model for bone tissue formation. 5th International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 22-26 September 2003. Proceedings, p. 200-208.

15. P.A. Buffat, R.J. Danaani, J. Kiwi, E.I. Suvorova. Nanophase characterization and identification by electron microscopy methods: an application to high velocity oxy-fuel WC-Co coatings and iron fluoride dispersed in a polymer matrix. 5'1' International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 22-26 September 2001. Proceedings, p. 465471.

16. Е.И. Суворова, D.B. Клечковская, B.B. Бобровский, Ю.Д. Хамчуков. Электронная микроскопия высокого разрешения для исследования наноструктуры покрытий из гидроксиапатита. Тезисы докладов 4-ой Национальной конференции РСНЭ-2003, Москва, 17-22 ноября 2003. стр.281.

17. Е.И. Суворова, В.В. Клечковская, В.В.Копейкин, Ф.А. Буффа. Устойчивость наночастиц серебра, диспергированных в органических матрицах. 20 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 1шоня -4 июня 2004 г. Тезисы докладов. C.I5.

18. Е. I. Suvorova, V.V. Kopeikin, P.A. Buffat. Stability of Ag nanoparticles dispersed in amphiphilic organic matrix. Abstracts of the 141'1 International Conference on Crystal Growth. 9-13 August 2004, Grenoble, France. P.221.

19. E.I. Suvorova, P.P. Petrenko, A.T. Titov and P.A. Buffat. Nano- and microstructure of normal and osteoporotic human vertebra bones. Proceedings of the 13 European Congress on Electron Microscopy. V. III. Life Sciences. P. 253-254. EMC 2004, Antwerp.

20. E.I. Suvorova, P.P. Petrenko, P.A. Buffat. Electron microscopy for investigation of order/disorder in bone structure. 2nd Joint Congress of European Calcified Tissue Society and International Bone and Mineral Society. Geneva, 25-28 June 2005.

21. E.I. Suvorova, V.V. Klechkovskaya, P.A. Buffat. Characterization of nanophases in HRTEM: Fourier transform and simulation. XX Congress of the International Union of Crystallographers. Book of Abstracts, P. CI 16. Florence, 23-31 Aug. 2005.

22. E.I. Suvorova, V.F. Komarov, I.V. Melikhov, M. Kitamura, C. Ohtsuki, P.A. Buffat. Thermal stability and decomposing of tricalcium phosphates and hydroxyapatite for bone substitution. The 16,h International Microscopy Congress, IMC16. Proceedings. Sapporo, 03-08 September, 2006.

Типография ордена "Знак Почета" издательства МГУ 119992, Москва, Ленинские горы Заказ № 393 Тираж 100 экз.

Введение

Глава 1. Электронная микроскопия высокого разрешения в исследовании наноматериалов: преобразование Фурье и моделирование изображений.

Глава 2. Особенности низкоразмерных систем.

2.1. Фосфаты кальция как нанодисперсные биоматериалы: структура и образование.

2.2 Нанокомпозиты на основе частиц металлов неметаллов), стабилизированных полимерами.

Глава 3. Методы и материалы.

3.1. Методы электронной микроскопии.

3.1.1. Оборудование, используемое в исследовании 65 методом просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения.

3.1.2. Компьютерное обеспечение для 66 количественной обработки.

3.1.3. Интерпретация электронно-микроскопических 68 данных с помощью моделирования.

3.1.3.1 Моделирование размерного эффекта.

3.1.3.2. Учёт отклонения от точной ориентировки 75 (наклон кристалла).

3.1.3.3. Учет атомных колебаний, вибраций и 78 смещения образца.

3.1.3.4. Нахождение корреляции между 79 экспериментальными и моделированными ВРЭМ изображениями.

3.1.4. Сканирующая электронная микроскопия.

3.1.5. Рентгеновская энергодисперсионная спектроскопия для химического анализа в электронной микроскопии. 3.2. Материалы и приготовление образцов.

3.2.1. Фосфаты кальция, синтезируемые из водных растворов при низких температурах.

3.2.2. Высокотемпературные керамики и пористые материалы на основе гидрокисапатита, синтезируемого из водных растворов.

3.2.3. Сухой синтез: осаждение гидроксиапатита из газовой плазмы на подложки и получение высокотемпературных трикальцийфосфатов.

3.2.4. Биологический гидроксиапатит: костная ткань и минеральная фаза на сердечных клапанах.

3.2.5. Наночастицы селена и серебра в различных органических матрицах-стабилизаторах.

Глава 4. Особенности морфологии и структуры кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата, осаждаемых нз водных растворов в разных условиях.

4.1. Низкотемпературная кристаллизация гидроксиапатита и октакальций фосфата.

4.2. Образование смешанных кристаллов гидроксиапатит / октакальций фосфат, ориентационные соотношения между фазами, морфология и атомная структура.

4.3. Проявление размерного эффекта на картинах рентгеновской и электронной дифракции.

4.4. Моделирование ВРЭМ изображений для определения толщины кристаллов.

4.5. Особенности структуры «толстых» кристаллов 117 гидроксиапатита: появление запрещенных отражений на электронограммах.

4.6. Сравнение с данными рентгенофазового 124 порошкового анализа смесей, содержащих гидроксиапатит и октакальций фосфат.

4.7. Влияние электронного облучения на состояние 128 кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата.

Пределы энергодисперсионного рентгеновского анализа.

Краткое обобщение результатов Главы 4.

Глава 5. Высокотемпературные модификации фосфатов кальция.

5.1. Высокотемпературные пористые и твердые 134 биоматериалы на основе гидроксиапатита, синтезированного в низкотемпературных растворах.

5.2. Особенности структуры плазменных покрытий 139 гидроксиапатита на металлических подложках, на поверхностях монокристаллов хлорида натрия и фторида бария.

5.3. Образование фаз при высокотемпературном 150 спекании трикальций фосфатов.

Краткое обобщение результатов Главы 5.

Глава 6. Биоминерализация: характеризация минеральной фазы в костной ткани и в осадках на сердечных клапанах.

6.1. Строение костной ткани: структура, морфология 164 и текстура нанокристаллов гидроксиапатита.

6.2. Электронная микроскопия минеральных осадков 170 на сердечных клапанах: морфология частиц и фазовая идентификация. Модель патологической минерализации клапанов.

Краткое обобщение результатов Главы 6.

Глава 7. Влияние различных органических матриц на 182 структуру наночастиц селена и серебра.

7.1. Электронная микроскопия наночастиц серебра.

7.2. Электронная микроскопия наночастиц селена. 188 Краткое обобщение результатов Главы 7.

Просвечивающая электронная микроскопия является в настоящее время наиболее эффективным и универсальным методом исследования материалов. Электронная микроскопия высокого разрешения (ВРЭМ) исторически явилась первым методом, реально обеспечивающим визуализацию структуры объектов с атомным разрешением, во многих случаях являясь единственным источником получения информации о внутренней структуре и структуре границ раздела многих нанообъектов. Успех в использовании электронного зонда в просвечивающей электронной микроскопии определяется рядом факторов. Электронный пучок легко фокусируется с помощью линз, что позволяет исследовать локальную структуру в нанообластях. Преимуществом электронной микроскопии является также возможность получения количественной информации как в обратном (электронная дифракция), так и в прямом пространстве (электронно-микроскопические изображения с высоким разрешением). Кроме того, современный просвечивающий электронный микроскоп оборудован различными детекторами, что открыло новые возможности для локального количественного химического анализа. Устранение механических, тепловых и электрических нестабильностей в приборах, использование автоэлектронных источников с размером кроссовера (виртуального источника электронов) порядка 10 нм и яркостью примерно в тысячу раз выше, чем обычный У-образный вольфрамовый катод позволило достичь теоретического предела разрешающей способности микроскопа. При высоком разрешении микроскоп становится электронным интерферометром, а полученные экспериментальные изображения с высоким разрешением - электронной интерференционной картиной. Поскольку для подавляющего большинства образцов не существует простой аналитической связи между изображением с высоким разрешением и кристаллической структурой образца, то для интерпретации полученных данных требуется проведение компьютерного моделирования. В настоящее время созданы и постоянно совершенствуются мощные компьютерные программы для моделирования и количественного анализа изображений с регулярной (нерегулярной) структурой, включая фурье-преобразование и фильтрацию. Моделирование проводится для заданных электроно-оптических параметров (ускоряющее напряжение, величина сферической и хроматической аберраций, угол расходимости пучка) и предполагаемых или точно известных кристаллической структуры образца и его оси зоны при изменяемых значениях толщины и дефокусировки. После чего рассчитанные и экспериментальные изображения сравниваются, и кристаллическая структура подтверждается или опровергается, оценивается толщина исследуемого образца, определяются его дефекты. Развитие математического метода - быстрого преобразования Фурье электронно-микроскопических изображений с высоким разрешением -предоставило возможность количественной характеризации нанофаз, когда образцом становится само изображение.

Наноматерилы, как природные, так и искусственные, составляют в настоящее время огромное поле для исследования их структуры с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Особенностью нанообъектов является наличие размерных эффектов, т.е. зависимость их свойств от размера и появление новых свойств. Известны такие явления, как изменение теплоемкости, давления паров, температуры плавления, оптических, магнитных и электронных свойств. Например, последнее свойство наряду с высоким отношением поверхности к объему частицы и увеличенным числом краев и граней приводит к повышенной активности и селективности во время каталитических реакций.

Динамично развиваются в настоящее время технологии по получению нанокомпозитов на основе металлических (неметаллических) наночастиц, диспергированных и стабилизированных в органических матрицах в/на структурированных или мезопористых подложках. Важным направлением в данной области является создание отвечающих современным требованиям биоматериалов. Например, нанокомпозит А^полимер нашел свое применение в качестве нового эффективного бактерицидного средства, большие перспективы в фармакологии у композитов на основе наночастиц элементарного селена. Функциональность и устойчивость таких средств определяется структурой компонент, и любое изменение биологической активности связано с изменением состояния наночастиц, химических реакций и фазовых переходов, контроль за которыми может быть осуществлен методами ВРЭМ.

Природным нанокомпозитом является костная ткань, в состав которой входят коллагеновые волокна с нанокристаллами фосфата кальция - гидроксиапатита. Организация костной ткани, структура, размеры и морфология нанокристаллов - компетенция ВРЭМ.

В качестве искусственных костных заместителей создаются все более эффективные биоматериалы на основе разных фосфатов кальция. В этом ряду - гидроксиапатит, а- и |3-трикальций фосфаты, дикальций фосфат, а также керамики, включающие комбинации фосфатов кальция в разных соотношениях для достижения требуемых параметров (растворимости, механических свойств). Осуществление контроля над фазовым составом таких материалов требуется не только во время и после изготовления кальций фосфатного биокомпозита, но и после его взаимодействия с водой или биологическими жидкостями, для исключения образования побочных продуктов из-за наличия малых концентраций примеси. По данным рентгеноструктурного анализа к настоящему времени известно порядка 20 кальций фосфатных модификаций (без включения в это число соединений с различными катионными или анионными заместителями). Эти соединения подвергаются физическо-химическим превращениям в биологических жидкостях, что приводит в разной степени к изменениям рН, концентраций ионов кальция и фосфат ионов, уровня пересыщения и, соответственно, образования и осаждения кристаллов. На практике идентификация фаз осложняется чрезвычайной близостью параметров кристаллических структур разных фосфатов кальция, малыми размерами и морфологическими особенностями.

В электронной микроскопии существует несколько путей исследования нано-объектов, выбор которых диктуется природой материала. Нанодифракция или электронная дифракция в сходящемся пучке есть прямой метод определения структуры и фазового состава наночастицы. Однако, для исследования перечисленных объектов, а именно: всех фосфатов кальция и наночастиц в органических матрицах данный метод не является подходящим из-за радиационной нестойкости образцов. Под действием сфокусированного пучка в пробу диаметром 2-3 нм нанокристалл или органическая матрица разрушается раньше, чем может быть получена картина нанодифракции. К параллельному пучку электронов в режиме ВРЭМ такие материалы толерантны в течение времени, необходимого для записи изображений, хотя и требуют очень низкой интенсивности. Поэтому для таких особо чувствительных к электронному облучению материалов методы количественной обработки с помощью преобразования Фурье ВРЭМ изображений, а также их моделирование являются наиболее эффективными при интерпретации экспериментальных данных и получения информации о структуре, фазовом составе и морфологии нанокристаллов.

Необходимость структурно-морфологического исследования мелкодисперсных систем потребовала разработки новых подходов в моделировании ВРЭМ изображений и картин электронной дифракции. Проведенное в настоящей работе исследование наноструктуры биоматериалов стимулировало ряд выполненных в 1996-2004 г. изменений и введение дополнительных функций в созданную ранее программу JEMS, существенно расширяющих возможности и области её применения.

С другой стороны, анализ наноструктур помог установить механизмы протекания химических и биологических процессов, и выявить корреляцию между структурой веществ и условиями их формирования, определить оптимальные параметры приготовления требуемых материалов и корректного их использования.

Целью диссертационной работы являлось развитие и определение потенциальных возможностей количественных методов электронной микроскопии высокого разрешения (ВРЭМ) для характеризации нанофаз в биоматериалах, включая моделирование размерного эффекта на картинах электронной дифракции, установления влияния наклона образца на распределение контраста на ВРЭМ изображениях, установления влияния структурных особенностей кристаллов на появление запрещенных рефлексов.

Методы моделирования как ВРЭМ изображений, так и картин электронной дифракции, полученных от материалов с большой низкосимметричной элементарной ячейкой и значительным числом разных атомов (до 400) потребовали изменений в пользовательском интерфейсе, чтобы оптимизировать время расчетов и рациональное использование оперативной памяти.

Необходимость структурно-морфологического исследования продуктов синтеза гидроксиапатита в процессе осаждения потребовала разработки новых подходов в анализе результатов ВРЭМ при характеризации мелкодисперсных систем. Эффективность и работоспособность подходов были протестированы на ряде других материалов: трикальций фосфатах, октакальций фосфате, селене и его соединениях, серебре и его соединениях. Ряд выполненных в 1996-2004 г. изменений в программе моделирования и создание дополнительных функций, существенно расширяющих возможности и области применения, был стимулирован настоящим исследованием наноструктуры биоматериалов.

На основе экспериментальных данных определялась корреляция между структурой нанообъектов, относящихся к классу биоматериалов, механизмов их образования и биоактивности. Измерения методами ВРЭМ дополнялись исследованием с помощью рентгеновской энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС), а также рентгеновской дифракции и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для получения информации о фазовом составе в целом от мелкодисперсного образца и для сравнения морфологии различных кристаллов в макромасштабе.

При этом большинство экспериментов в диссертационной работе было выполнено впервые. Основное внимание уделялось практически неисследованным областям, например, изучению образцов, полученных при кристаллизации из пересыщенных кальций фосфатных в условиях невесомости. Также впервые были получены и исследованы чистые кристаллы октакальций фосфата, выяснены причины появления сильного диффузного рассеяния на картинах рентгеновской и электронной дифракции от нанокристаллов гидроксиапатита и проведено моделирование размерного эффекта.

Впервые выявлено влияние некоторых органических субстанций на кристаллизацию уже сформировавшихся и стабилизированных в растворах наночастиц селена.

Актуальность темы.

Задачи, рассматриваемые в диссертации, представляют фундаментальный интерес в исследовании структуры материалов на наноуровне и механизма роста кристаллов, что тесно связано с актуальной проблемой исследования и создания наноструктур, развития нанотехнологий. Многолетние исследования показали, что эффективность, доступность и безопасность создаваемых новых материалов в области химии катализа, биомедицины и фармакологии напрямую зависят от уровня методов характеризации исходных веществ и применения компьютерного мониторинга. Именно таким живым проблемам посвящено большое число международных симпозиумов и конференций как, например, 14-ая международная конференция по росту кристаллов в Гренобле (2004 г.), 13-й европейский симпозиум по электронной микроскопии в Антверпене (2004 г.) 16 международный симпозиум по биоматериалам в Порто (Bioceramicslö 2003г.), 2-ой Объединенный конгресс европейского общества по кальцифицированным тканям и Международного общества исследования костной ткани в Женеве (ECTS -IBMS, 2005), 16 Международный конгресс по микроскопии в Саппоро (IMC16, 2006) и т.д.

Научная новизна.

Разработаны подходы к исследованию влияния размеров кристаллов на появление диффузного рассеяния на картинах электронной дифракции. Соответствующая программа моделирования размерного эффекта внесена в версию программы JEMS. Это позволило выявить причины сильного диффузного рассеяния на электронограммах и сравнить с уширением максимумов на рентгеновских дифрактограммах.

Усовершенствована программа моделирования ВРЭМ изображений, в которой учтены отклонения от точной оси зоны на любой угол, случайные вибрации и дрейф образца для поиска более точного соответствия расчётных и экспериментальных изображений. Результатом проведённой модификации стала возможность надёжной идентификации нанофаз (размер кристаллитов или областей порядка 5 нм). Определены толщины естественных кристаллов гидроксиапатита и относительная разориентация нанозерен в кристаллах, установлены причины появления запрещенных рефлексов с ростом толщины.

Создана программа построения сверхячейки анизотропного кристалла и образования структурной модели изотропной сферической частицы.

Впервые проведены исследования микро- и наноструктуры кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата, выращенных в условиях микрогравитации и выявлены различия в морфологии, размерах и структуре кристаллов, полученных в разных режимах смешивания исходных растворов. Впервые получены и исследованы чистые и большие (несколько миллиметров длиной) кристаллы октакальций фосфата.

Исследована структура смешанных кристаллов гидроксиапатит / октакальций фосфат, впервые установлены ориентационные кристаллографические соотношения между двумя фазами, вычислены напряжения в кристаллах.

Определена наноструктура слоев гидроксиапатита, полученных плазменным осаждением на подложки.

Определена устойчивость кальций фосфатных биоматериалов, полученных при высоких температурах. Впервые выявлено образование оксида кальция СаО во время спекания и приготовления пористого костного биозаместителя на основе а-Са3Р04 при температуре 1430°С, которая значительно ниже температуры, определённой фазовой диаграммой в системе Са0-Р205 и равной 1720°С.

Исследована структура нормальной и патологически измененной костной ткани и получены изображения отдельных нанокристаллов гидроксиапатита на коллагеновых волокнах, оценены их размеры в трех направлениях.

Исследован фазовый состав минерального осадка на сердечных клапанах и предложена модель его образования.

Проведена характеризация образующихся нанофаз под влиянием внешних условий и определена устойчивость нанокомпозитов на основе органической стабилизирующей матрицы с внедрёнными частицами селена и серебра.

Впервые обнаружен и описан эффект кристаллизации внутри рыхлых бесструктурных наночастиц селена, синтезированных в водных растворах с помощью окислительно-восстановительной реакций и стабилизированных в разных органических средах.

Практическая значимость работы.

Главным практическим результатом, полученным в работе, является обоснование применения комбинации методов по идентификации фазового состава в наномасштабе на основе количественной обработки ВРЭМ изображений с помощью преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ изображений от радиационно-чувствительных объектов, оценка толщины естественных (не утонченных) нанокристаллов.

Установлены закономерности изменений наноструктуры и морфологии кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата в зависимости от скорости смешивания исходных растворов, температуры кристаллизации.

Определены условия для получения нанокристаллических гидроксиапатитных покрытий из плазмы газового разряда на различных подложках. Результаты исследования структуры как осаждающихся из растворов кристаллов гидроксиапатита, так и плазменных покрытий на подложках, актуальны с точки зрения производства эффективных и безопасных биоимплантатов, так и выяснения механизмов патологических отклонений в живых организмах.

Предложен механизм биоактивности бактерицидных средств, включающих наночастицы серебра, в основе которого химическое взаимодействие серебра с серосодержащими агентами в окружающей среде и в организмах, установлены причины недостаточной эффективности медицинских препаратов с наночастицами селена в органических средах.

Всё это способствовало прояснению различий и сближению позиций между химическими, биологическими, медицинскими подходами с одной стороны и физическими подходами в получении и интерпретации результатов, с другой стороны.

Основные результаты и научные положения, выносимые на защиту: 1. Комбинированный метод по идентификации нанокристаллов и нанофаз в разных биокомпозитах с помощью преобразования Фурье и моделирования электронной дифракции и электронно-микроскопических изображений с высоким разрешением - программы для моделирования ВРЭМ изображений с учетом отклонения от точной оси зоны, атомных вибраций, дрейфа образца; создания сверхячейки анизотропного кристалла; образования структурной модели изотропной сферической частицы; исследования зависимости уширения дифракционных максимумов с уменьшением размера частиц.

2. Результаты экспериментальных исследований наноструктуры, морфологии и размеров кристаллов гидроксиапатита, синтезируемых в водных растворах в условиях конвективного смешивания реагентов, в диффузионном режиме смешивания в невесомости и в случае принудительного смешивания с разными скоростями при низких (25-40°С) и высоких (95°С) температурах.

3. Установление зависимости и определение толщины малорастворимых в воде кристаллов от температуры растворов. Обнаружение запрещенных гексагональной симметрией отражений в кристаллах гидроксиапатита благодаря локальному разупорядочению в их структуре.

4. Обнаружение размерного эффекта на электронограммах и его моделирование на примере нанокристаллов гидроксиапатита; сравнение электронографических и рентгенодифракционных данных.

5. Результаты экспериментального исследования наноструктуры смешанных кристаллов гидроксиапатита / октакальций фосфата: определение кристаллографических ориентационных соотношений и напряжений.

6. Результаты экспериментального исследования наноструктуры плазменных покрытий гидроксиапатита на различных подложках: определение фазового состава, размеров и относительной ориентации нанокристаллов в покрытиях.

7. Результаты экспериментального исследования наноструктуры и устойчивости кальций фосфатных биоматериалов, полученных при высоких температурах. Впервые выявлено образование оксида кальция во время спекания и приготовления пористого костного биозаместителя на основе а-СазР04 при температуре 1430°С.

8. Результаты сравнительной характеризации здоровой костной ткани и образцов с патологическими изменениями; модельное представление механизма снижения минеральной плотности кости и развития деструктивных процессов.

9. Результаты экспериментального исследования - определение фазового состава минеральной фазы, осаждающейся на сердечных клапанах, структуры, морфологии, размеров кристаллов в осадке. Модельное представление механизма патологической минерализации мягких тканей в живых организмах.

10. Обнаружение эффекта кристаллизации наночастиц селена под действием органических веществ. Анализ экспериментальных данных с помощью структурного моделирования наночастиц селена.

11. Обнаружение продуктов химического взаимодействия наночастиц серебра с реагентами из окружающей среды. Модельное представление механизма бактерицидной активности наночастиц Ag.

Апробация работы:

Результаты работы были представлены на следующих конференциях:

1. 9th European Symposium Gravity-Dependent Phenomena in Physical Science. Berlin, Germany, 2-5 May 1995;

2.16 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 29 ноября-2 декабря 1996;

3. 26th International School on Electron Crystallography, Erice, Italy, May 22-June 2,1997;

4.17 Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка, 15-18 июня 1998;

5.12th International Conference on Crystal Growth, Jerusalem, Israel 26-31 July, 1998;

6. 18th International Congress of the International Union of Crystallography, Glasgow, Scotland 4th- 13th August, 1999;

7. 18 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 5 июня - 8 июля, 2000;

8. 9 национальная конференция по росту кристаллов НКРК-2000, Москва,

16-20 октября 2000;

9. First International Symposium on Microgravity Research and Applications in Physical Sciences and Biotechnology. Sorrento, Italy, 10-15 Sept. 2000;

10.11th Interdisciplinary Research Conference on Biomaterials (GRIBOI). Calais, France, 8 - 9 March 2001;

11. 4th International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 24-28 September 2001;

12. Fifth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar "Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and biotechnology" St Petersburg, Russia, May 27-29, 2002;

13.10 национальная конференция по росту кристаллов НКРК-2002, Москва, 24-29 ноября 2002;

14. Gordon Research Conference on BIOMINERALIZATION. New London, USA, August 2002;

15. 9th General meeting of the Swiss Society for Biomaterials. Neuchatel, Switzerland, May 14-15, 2003;

16. 5th International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 22-26 September 2003;

17.16th International Conference on Bioceramics, Porto, Portugal, November, 7-10,2003;

18.4-ая Национальная конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов-РСНЭ-2003, Москва, 17-22 ноября 2003;

19. XX Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 31 мая-4 июня, 2004;

20.13 European Congress on Electron Microscopy. Antwerp, Belgium, 23-28 August, 2004;

21. 14th International Conference on Crystal Growth. 9-13 August 2004, Grenoble, France;

22.2nd Joint Meeting of the European Calcified Tissue Society (ECTS) and the International Bone and Mineral Society (IBMS), Geneva, Switzerland, 24-29 June 2005;

23. XX International Congress of the International Union of Crystallography, Florence, Italy, 23-31 August, 2005.

24. 16th International Microscopy Congress (IMC 16), Sapporo, Japan, 5-9 Sept. 2006.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 46 печатных работ, включая 22 статьи в реферируемых журналах и сборниках научных трудов, 24 тезиса конференций, перечисленных в общем списке литературы.

Результаты исследования радиационных повреждений и процесс разрушения кристаллов ОСР представлены на Рис. 4.36. Величина отношения Са/Р уже в начале электронной бомбардировки не соответствует атомному соотношению в ОСР, равному 1.33. Очевидно, что механизм разрушения включает образование оксидов фосфора, которые покидают кристалл поэтому отношение Са/Р возрастает.

Продолжение воздействия электронов приводило к полному разрушению материала. Скорость разрушения НАР и ОСР зависит от интенсивности электронного пучка. Процесс съёмки электронограмм с использованием падающего параллельного пучка, когда электроны фокусируются на наибольшем расстоянии от образца, можно проводить в течение 3 часов без ущерба для образцов. Однако, получение ВРЭМ изображений требует увеличения интенсивности для создания достаточного числа фотонов достигающих CCD камеры.

ОСР

--1-т-р--- 1-1-т--1-1-1-1---

1 23466789 10 К время облучения, мин

Рис. 4.36. Радиационные повреждения в кристалле ОСР: кристалл вначале исследования (а), поврежденная область кристалла после проведения микроанализа (б), изменение отношения Са/Р во время исследования(с); стрелки указывают характерные величина отношений Са/Р (НАР) =1.67, Са/Р (ТСР)=1.5 и Са/Р (ОСР)= 1.33.

Краткое обобщение результатов Главы 4.

На основе ВРЭМ с количественной обработкой изображений и моделированием как ВРЭМ-изображений, так картин электронной и рентгеновской дифракции установлена структура кристаллов ОСР с включениями НАР, и определены ориентационные отношениямежду фазами. Выявлен и описан размерный эффект от нанокристаллов НАР. Данный эффект проявляется резким уширением дифракционных максимумов и образованием диффузных колец на электронограммах. Значительную роль здесь играют структурные особенности НАР: большая элементарная ячейка с множеством легких атомов и близость дифракционных пиков, способствующая их перекрыванию. Обнаружена закономерность образования тонких (до 3-ех параметров ячейки в направлении [2ПО]) кристаллов в низкотемпературных растворах и значительно более толстых кристаллов в высокотемпературных растворах. Обнаружено, что для кристаллов толщиной в один параметр ячейки сохраняются правила погасания пр.гр. Р63/ш, в то время как с ростом толщины это правило нарушается, и на электронограммах и дифрактограммах появляются запрещенные рефлексы {0001}. Данный факт может быть объяснен с позиций динамической дифракции и нарушения гексагональной упаковки слоев в кристаллах толщиной, превосходящих высоту одной элементарной ячейки. Описаны эффекты радиационного повреждения кристаллов НАР и ОСР при электронно-микроскопическом исследовании. Результатом электронного облучения является образование многочисленных границ в толстых кристаллах с последующим разрушением и испарением кристаллов. Среднее время исследования тонких кристаллов с помощью пучка низкой интенсивности не превышает 20 секунд. Фазовый анализ различных кальций фосфатных модификаций по соотношению Са/Р методом ЭДС не представляется возможным из-за неопределенности состава и объема исследуемой области, подвергающейся радиационному облучению. При этом соотношение Са/Р имеет тенденцию к росту. Фазовых превращений между фосфатами кальция под действием электронного пучка не зафиксировано. Показана возможность оценки толщины кристаллов НАР, а также установления относительной разориентации нанозерен внутри кристалла с помощью моделирования ВРЭМ изображений. Используемая программа моделирования ВРЭМ изображений позволила учитывать в построении традиционных серий толщина/дефокус влияние отклонения от точной оси зоны (наклон кристалла), вибрации и дрейф образца с различными амплитудами.

Глава 5. Высокотемпературные модификации фосфатов кальция.

Рассмотрены особенности структуры биоматериалов на основе гидроксиапатита, осажденного из плазмы на различные подложки [179,180,192], а также керамик, полученных при высокотемпературном спекании синтезированного в растворе НАР [177], пористых гранул [177], образованных в кипящей суспензии и высокопористых материалов, полученных из а- и (3-трикальций фосфатов при повышенных температурах. Исходные материалы подвергались высокотемпературной обработке, в результате которой происходили или могли происходить фазовые переходы. Проведенное исследование методами рентгеновской дифракции и ВРЭМ включало фазовую идентификацию фосфатов кальция в полученных материалах, установление размеров частиц, обнаружение микро- и нанопримесей.

5.1. Высокотемпературные пористые и твердые биоматериалы на основе гидроксиапатита, синтезированного в низкотемпературных растворах.

Исходный синтезированный НАР для последующего приготовления твердых керамик представлял собой порошок с агломерированными наночастицами, размер которых увеличивался со временем нахождения осадка в маточном растворе (Рис.4.10 - 4.12). Установлено, что исходный размер нанокристаллов существенного влияния на их структуру не оказал.

Гранулированный материал, полученный из кипящей суспензии, представлен на Рис. 5.1. Максимальный диаметр отдельных гранул достигает 1 мм, средний диаметр - 300-500 мкм. Измерения показали, что плотность одной гранулы составляет 1/3 от плотности гидроксиапатита 3.07 г/см3 [72].

Каждая гранула является агломератом в основном анизотропных наночастиц НАР, вытянутых вдоль направления [0001]. Таким образом, в значительной степени форма и размеры нанокристаллов в гранулах

134 подобны кристаллам в исходных порошках с периодом кристаллизации от 60 сек. Различие состоит в том, что в гранулах примерно на порядок больше выявляется кристаллов НАР в виде гексагональных пластинок.

Рис. 5.2. Нанокристаллы НАР, образующие гранулы (а), поликристаллическая электронограмма (б), ВРЭМ изображение (в) и дифрактограмма (г), полученные вдоль оси зоны [4 510] для значения дефокуса 0 нм, толщины кристалла 3 нм и амплитуды вибрации по оси X с азимутальным углом -47.5°.

Электронно-микроскопические изображения нанокристаллов, полученных при разламывании гранулы, представлены на Рис. 5.2а с соответствующей поликристаллической электронограммой (Рис. 5.26). ВРЭМ изображения и дифрактограмма подтверждают кристаллическую фазу НАР (Рис. 5.2 в, г). Моделирование ВРЭМ изображения (Рис. 5.2 г, вставка М) проводилось для гексагонального НАР с пр. гр. Р63/т вдоль оси зоны [4 510] для значения дефокуса 0 нм, толщины кристалла 3 нм и амплитуды вибрации по оси X под азимутальным углом -47.5°. Получено отличное согласование между экспериментальным и рассчитанным изображениями.

Рис. 5.3. Внешний вид (а) и структура разлома (б) керамики НАР, полученной спеканием при 870°С.

Рис. 5.4. Внешний вид (а) и структура разлома (б) керамики НАР, полученной спеканием при 1200°С.

Внешний вид образцов - твердых керамик, спекаемых при температурах 870°С и 1200°С, а также внутренняя структура на разломе показаны на Рис. 5.3 и Рис. 5.4. Изображения, полученные в сканирующем электронном микроскопе, демонстрируют значительные отличия: в структуре керамики, полученной при 870°С ясно различимы нанокристаллы. Для высокотемпературной керамики характерна достаточно гладкая поверхность разлома, на которой выделяются несколько монокристаллических блоков размером до 2 мкм. Плотность керамики, отожженной при 870°С, составляет приблизительно 2/3 от плотности гидроксиапатита, в то время как, плотность ВРЭМ изображение высокотемпературной керамики приближается к плотности НАР и составляет около 98%.

Рентгенофазовый анализ не выявил присутствия посторонних фаз в обеих керамиках, в которых можно было ожидать появление а- или р-формы трикальций фосфата кальция, особенно при повышенных температурах.

Моделирование рентгенодифракционных картин показало, что предел чувствительности находится на уровне 2 вес.% Р-Саз(Р04)2 (Рис. 5.5). На присутствие примеси Р-Са3(Р04)г могут указать только малоинтенсивные отражения 214 с углом 20=27.78° и 0 2 10 в области 26=31.03°.

Рис. 5.5. Моделированная рентгенодифракционная картина от смеси 98 вес.% НАР - 2 вес.% ß-Ca3(P04)2. Стрелками показаны два наиболее интенсивных пика 214 (20=27.78°) и 0 2 10 (20=31.03°), принадлежащие примесной фазе ß-Ca3(P04)2. Отражения, относящиеся к НАР, указаны обычным шрифтом, отражения, относящиеся к ß-Ca3(P04)2, указаны итальянским шрифтом.

Морфология нанокристаллов (Рис. 5.6), составляющих 870-градусную керамику, значительно отличается от морфологии кристаллов в исходном порошке и в гранулах: их форма становится более изотропной. ВРЭМ изображение и дифрактограмма получены от гексагональной частицы вдоль оси зоны [0001] с характерными только для НАР межплоскостными расстояниями 0.815 нм (Рис 5.6 в,г).

Рис. 5.6. ПЭМ изображение частиц НАР из керамики, полученной при 870°С (а) и поликристаллическая электронограмма с указанием характеристических для НАР рефлексов 1010 и 2131 (б), ВРЭМ изображение (в) и дифрактограмма (г) от гексагональной частицы НАР с Рис. 10а (показана стрелкой).

Рис. 5.7. ПЭМ изображение частицы НАР из высокотемпературной керамики (а) и электронограмма (б), фильтрованное ВРЭМ изображение (в), дифрактограмма (г) и моделированное изображение М, полученное для значения дефокуса 35 нм и толщины образца 3.5 нм, который наклонен к оси зоны [1100] под углом 0.66° вдоль направления [0001], амплитуда вибраций составляла 0.148 нм.

В случае высокотемпературной керамики спекание при 1200 °С приводит к образованию поликристаллического стержня, при этом размеры составляющих его блоков достигают 2 мкм. Одна из частиц со своей электронограммой вдоль направления [1100] представлена на Рис. 5.7. ВРЭМ изображение (Рис. 5.7 в), дифрактограмма (Рис. 5.7 г) и моделированное изображение М, полученное для значения дефокуса 35 нм и толщины образца 3.5 нм, который наклонен к оси зоны [1100] под углом 0.66° вдоль направления [0001], подтверждают фазу гидроксиапатита.

Для каждого из исследованных образцов было обработано не менее 100 картин электронной дифракции и 100 ВРЭМ изображений от различных кристаллов, или частиц, или их агломератов в исходных материалах и конечных керамиках. Не установлено присутствия других кальций фосфатных модификаций в биокерамиках, соответственно, не выявлено признаков разложения гидроксиапатита при температуре спекания 1200°С.

Для температуры 1200°С в [67] было установлено максимальное значение прочности на изгиб порядка 100 МПа и рассчитаны размеры кристаллических блоков в чистой керамике НАР, равных 1-1.5 мкм. В нашей работе была получена та же величина прочности на изгиб и из электронно-микроскопических изображений измерены размеры блоков в высокотемпературной поликристаллической керамике. Хорошее согласование данных свидетельствует о воспроизводимости условий экспериментов и результатов.

5.2. Особенности структуры плазменных покрытий гидроксиапатита на металлических подложках, поверхностях монокристаллов хлорида натрия и фторида бария.

При исследовании кальций фосфатных покрытий [178-180] сначала проводился предварительный анализ исходного порошка. Гранулометрический анализ показал, что распределение по размерам частиц в порошке гидроксиапатита после отжига имеет два максимума при 2.5 мкм и 11.4 мкм.

Просвечивающая электронная микроскопия демонстрирует, что подобные частицы являются агломератами кристаллов (Рис.5.8), и, соответственно, величина таких агломератов может изменяться вплоть до размера одного кристалла (до 200 нм).

Фаза гидроксиапатита была определена из картин электронной дифракции, полученных от отдельных нанокристаллов (Рис.5.9) и подтверждена в результате сравнения экспериментальных и моделированных ВРЭМ изображений (Рис. 5.10).

Из дифрактограммы (FFT) от ВРЭМ изображения (Рис. 5.10) определена ориентировка [45 10] в нанообласти. Моделирование проводилось для набора толщин кристаллов и ряда значений дефокусировки, интервала углов наклона кристалла к точной оси зоны.

Рис. 5.8. Исходный порошок ПАР, используемый для получения покрытия. Кругом отмечен агломерат, показанный в увеличенном масштабе на Рис. 5.2.

Рис. 5.9. ПЭМ изображение агломерата кристаллов с Рис. 5.1. Электронограмма получена с отмеченного стрелкой кристалла НАР вдоль оси зоны [45 10].

Рис. 5.10. ВРЭМ изображение кристалла НАР с Рис. 5.2. ПФ (FFT НАР) получено вдоль оси зоны [4510], на вставках S1 и S2 - смоделированные ВРЭМ изображения, рассчитанные для направления [4510] НАР для дефокуса 21 нм и 23 нм, соответственно, и толщине кристалла 3.2 нм вдоль указанного направления.

Наилучшее соответствие между моделированием (на вставках 81 и Б2) и экспериментом получено для кристалла гидроксиапатита толщиной 3.2 нм с осью зоны [45 10] и значении дефокуса 21 и 23 нм. Таким образом, кристаллы гидроксиапатита в исходном отожженном порошке, используемом для запрессовывания в таблетки, весьма тонкие.

Рис. 5.11. Поверхность (а) и поперечное сечение (б) слоев НАР на подложках.

Изображения (Рис. 5.11 а), полученные в сканирующем электронном микроскопе, демонстрируют морфологию слоев (вид сверху), осажденных на металлические подложки и монокристалл ВаР2. В указанном масштабе покрытия выглядят плотными, однородными и имеют малую поверхностную шероховатость. Изображение поперечного сечения покрытия представлено на Рис. 5.11 б. Для получения этого изображения, поверхность подложки ВаР2 со слоем была установлена практически параллельно падающему электронному пучку в микроскопе, что и позволило определить толщину покрытия, а также оценить его шероховатость и скорость образования. Толщина слоя достигает 400 нм и, соответственно, средняя скорость его образования порядка 1нм/мин, шероховатость до 10 нанометров.

Рисунок 5.12 демонстрирует ПЭМ изображение тонкого среза покрытия (Рис. 5.12 а), ЭДС спектр (Рис. 5.5 б) и поликристаллическую электронограмму (Рис. 5.12 в). Химический анализ различных образцов

142 покрытий свидетельствует, что основными элементами являются кальций, фосфор и кислород (Рис. 5.12 б), пик от меди появляется из-за использования медной сетки. Поскольку материал покрытий является чувствительным к воздействию электронного облучения, то при выполнении спектроскопических измерений электронный пучок не фокусировался полностью на исследуемом участке. Например, при времени регистрации спектра 40 сек оптимальный диаметр электронного зонда для получения хорошей статистики измеряемого сигнала составлял не менее 50 нм.

Рис. 5.12. ПЭМ изображение (вид сверху) тонкого среза покрытия НАР (а), поликристаллическая электронограмма (б), ЭДС спектр (в) с основными химическими элементами Са, Р, О. Пик от Си появляется из-за медной поддерживающей сетки, пик С возникает благодаря углеродной плёнке-подложке.

Однако, используя только данные ЭДС о величине отношения Са/Р, определить структуру вещества, его фазовый состав невозможно, поскольку со временем облучения относительное количество кальция и фосфора изменяется в сторону уменьшения содержания фосфора. Например, полу количественный ЭДС анализ (Рис. 5.13), проведенный в первые 40 сек регистрации, дал отношения Са/Р = 1.8, что выше характерного для гидроксиапатита значения 1.67.

4.00 3.50

3.00 2 50

О 2.00 1 .50 1.00 0 .50 0.00

Рис. 5.13. Изменяющееся соотношение Са/Р в процессе регистрации ЭДС спектров для НАР покрытия.

Следует отметить, что электронограмма (Рис. 5.12 б) имеет первое яркое широкое кольцо, второе кольцо, составленное точечными рефлексами, достаточно тонкое, все следующие кольца довольно слабые и уширенные. Такая электронограмма не может быть использована для точного фазового анализа.

В данном случае структура покрытия была определена с помощью фурье-преобразования (дифрактограммы), полученного от ВРЭМ-изображения (Рис. 5.14). Для подтверждения фазового состава образца, проведено моделирование в области, отмеченной квадратом на Рис. 5.14. Поскольку образец является достаточно толстым, то сравнение экспериментального и рассчитанного изображений выполнялось с помощью фильтрованного изображения (IFFT), которое получали наложением маски на максимумы отражений на дифрактограмме. На

144 вставках Б1, 82 и БЗ представлены рассчитанные изображения при значениях дефокуса 40 - 43 нм, с предполагаемыми толщинами 60 - 72 нм и с углом разориентации к оси зоны [1100] порядка 1.2°. Таким путем показано, что покрытие состоит из нано- и субнанокристаллов гидроксиапатита со средним размером около 5 нм, разориентированых относительно друг друга.

Рис. 5.14. ВРЭМ изображение тонкого среза НАР-покрытия. ПФ (FFT НАР) получено вдоль оси зоны [1100]. На изображении обратного ПФ (IFFT НАР) промоделированы три нанообласти Sl, S2 и S3 для НАР вдоль [1100], значений дефокуса 40-43 нм, толщиной кристалла порядка 60-72 нм и разориентировкой нанозерен около 1.2° относительно [1100].

Чтобы выявить внутреннюю структуру покрытий были получены ВРЭМ-изображения с их поперечных сечений. Рисунок 5.15 (а) представляет ПЭМ изображение поперечного сечения на подложке монокристалла ВаР2. Электронограмма (Рис. 5.15 б) указывает на нанокристаллический характер материала.

Толщина плазменных покрытий при данных условиях получения составляла порядка 400 нм, покрытия были достаточно однородными, гладкими с малой шероховатостью, не превышающей 10 нм.

Рис. 5.15. Поперечное сечение покрытия на подложке BaF2 (а) и соответствующая электронограмма (б), в которой уширенные кольца принадлежат фазе НАР, а сетка точечных рефлексов принадлежит подложке монокристаллу [101] BaF2.

Электронограмма (Рис. 5.15 б) включает 3-4 видимых уширенных кольца - ряд отражений с наибольшими структурными факторами для атомных плоскостей {0002}, {2131} - {0330}, {224 2} - {32 13}, and {2460} - {0552}. Индицирование проводилось в рамках гексагональной структуры НАР, однако, нельзя полностью исключить присутствие другой кальций фосфатной модификации. Таким образом, электронная дифракция с выделенного участка из-за размерного эффекта кристаллитов в покрытии [142] не может дать полной гарантии точного фазового анализа. И как уже отмечалось выше, из-за высокой чувствительности к радиационным повреждениями микродифракция с нанообластей также не является подходящим методом.

ВРЭМ-изображение (Рис. 5.16) поперечного сечения демонстрирует, что покрытие состоит из нанокристаллов НАР размером от 3 до 20 нм. Эти нанокристаллы ориентированы случайным образом относительно друг друга и относительно подложки. Индицирование дифрактограмм от трёх нанообластей (Рис. 5.16 FFT a,b,c) показала присутствие только нанокристаллов НАР. На других ВРЭМ изображениях также никакой другой фазы не было установлено. Следует отметить, что непосредственно вблизи подложки наблюдались неупорядоченные области, появление которых можно объяснить образованием случайно ориентированных нанокристаллов НАР, размеры которых сравнимы с размерами элементарной ячейки.

Для сравнения структур разных кальций фосфатных покрытий, было проведено исследование нескольких образцов, полученных при других условиях. Образование областей с полностью нерегулярной структурой на атомном уровне было выявлено после изменения условий осаждения покрытий. На Рис. 5.17а представлено электронно-микроскопическое изображение образца кальций фосфатного покрытия, полученного на подложке титана анодным окислением с помощью разряда в водном растворе электролита СаЩгРО^г [89] при постоянном электрическом токе порядка 150 мА. В этом случае оказались важными результаты ЭДС анализа, поскольку электронограмма на Рис. 5.17 б с размытыми рефлексами аналогична электронограмме на Рис. 5.12 б, и при этом не было обнаружено регулярной структуры на ВРЭМ изображениях.

Однако количественный спектроскопический анализ (Рис. 5.18 а, б) показал резкое превышение содержания фосфора над кальцием (при аналогичных условиях измерений) в одной части образца и резкое превышение кальция над фосфором в другой части образца. Кругами на микрофотографии (диаметр электронного зонда) отмечены области, в которых проводился количественный рентгеновский ЭДС анализ и показавший разные значения отношения Са/Р, равные 0.12 и 5.9, в близко расположенных участках

Рис. 5.16. ВРЭМ изображение поперечного сечения покрытия НАР на подложке BaF2. Отдельные нанокристаллы выделены белыми квадратами а, Ь, с. Соответствующие дифрактограммы a, b, and с подтверждают фазовый состав нанокристаллов и указывают ориентировку относительно электронного пучка. Дифрактограмма d получена от подложки монокристаллического BaF2 (белый квадрат d) вдоль оси зоны [101].

FeNi ■.„Си FeCo CoBNI | i ' , 9 10

Рис. 5.17. Область покрытия на подложке титана после анодного окисления в результате разряда в водном растворе электролита Са(Н2Р04)2. Отмечены участки с различными значениями Са/Р (а), электронограмма с уширенными кольцами(б).

Рис. 5.18. ЭДС спектры от изображения на Рис. 5.10 с соотношениями Са/Р, равными 0.12 (а) и 5.9 (б).

Таким образом, данные ЭДС показали, что покрытие содержало несколько фаз, включая оксиды фосфора и кальция, смесь которых на атомном уровне образует разупорядоченную структуру.

5.3. Образование фаз при высокотемпературном спекании трикальций фосфатов.

В рамках исследований, направленных на развитие биотехнологий и методов приготовления новых материалов, трикальций фосфаты рассматриваются как биоактивные заместители в случае регенерации костной ткани. Известны несколько модификаций с химической формулой Са3(Р04)2, имеющих различную кристаллическую структуру [45, 46, 193, 194]. Здесь представлены результаты исследования, полученные при синтезе моноклинной фазы а-Саз(Р04)2 [46]. Данная модификация получена с помощью высокотемпературного фазового перехода из тригонального (3-Саз(Р04)2 [45]. Температура фазового перехода составляет 1125°С. Фаза а-Саз(Р04)г обладает более высокой растворимостью по сравнению с Р-Са3(Р04)2 и является термодинамически устойчивой до 1430°С, после чего образуется другая (супер) а-Сй^РО^ вплоть до точки плавления 1765°С [193].

Конечный продукт высокотемпературного спекания, названный СР50 и предполагающий в своём составе а-Саз(Р04)2, исследовался методами рентгеновской дифракции, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии для выявления возможных примесей других соединений кальция, включая микро- и наноуровень.

Изображения, полученные в сканирующем электронном микроскопе, пористого материала представлены на Рис. 5.19 (а, б, в) с возрастанием увеличения на микрофотографиях.

Моделирование с помощью компьютерной программы СаШпе С1у81а11о£гар11у 3.1 показало, что присутствие малых количеств других соединений кальция, которые могли бы образоваться в процессе высокотемпературного синтеза, не могут быть выявлены только с помощью порошковой рентгеновской дифракции.

Рис. 5.19. Пористый конечный материал а-Са3(Р04)2, полученный в процессе высокотемпературного спекания начального порошка (3-Са3(Р04)2. Показан последовательный рост увеличений на микрофотографиях (а - в).

Расчет рентгенограмм показал зависимость интенсивности пиков от количественного соотношения между фазами а- и (3- Са3(Р04)2 в смеси. Если количество (3-фазы в смеси не превышало 10 %, то по одной только порошковой дифрактограмме было сложно определить, является ли материал одно- или двухфазным. материала СР50 (а-ТСР) и начального порошка Р-ТСР (а), часть рентгенограммы, записанной с малой скоростью для разрешения пика 200 от оксида кальция (б).

Анализ экспериментальных рентгенограмм (Рис. 5.20а), полученных от конечного продукта и исходного материала (3-ТСР, показал присутствие дифракционных пиков от исходного порошка Р-ТСР (1 0 10)р.тср и (314)р. тер- С помощью моделирования рентгенограмм от смесей, включающих обе фазы в разных соотношениях, было установлено, что количество исходного материала равно приблизительно 3-3.4 вес.% (Рис. 5.21).

Рис. 5.21. Рассчитанная рентгенограмма для смеси, содержащей 86.0 % а-ТСР {конечного продукта), 3.0 % [З-ТСР (остаточного исходного материала) и 11.0 % СаО (примесь, образовавшаяся в результате разложения трикальций фосфатов).

Разумно было также предположить, что часть трикальций фосфата может разложиться в результате термического воздействия. Поэтому в интервале углов 26 от 37° до 38° рентгенограмма записывалась с шагом 0.01° для того, чтобы разрешить пик 200 от оксида кальция. На Рис. 5.206 показано положение этого пика на экспериментальной рентгенограмме. Однако его величина слишком мала для количественной оценки, а моделирование показало, что количество кубического оксида кальция, надёжно детектируемого с помощью рентгеновской дифракции, должно быть не менее 11-16 вес.%. Оценка количества СаО с помощью моделирования дало величину в 11.0 - 15.0%.

Поэтому применение электронной микроскопии было естественным для исследования возможного присутствия микро- и нанофаз в конечном материале. Одно из ПЭМ-изображений с электронограммой от частицы из образца конечного материала а-Са3{РО^)2 показано на Рис. 5,22. а-Саз(Р04)2 [043] / / / / / /. ф . • • • а

Шо . ■• ••

434 \ \ * ^ Ч I / /

10 нм а)1 а-Саз(РОф [043] б)

Рис. 5.23. Экспериментальная электронограмма (а) и наложенные друг на друга экспериментальная и моделированная электронограммы (б). На электронограмме (а) обозначены Лауэ зоны высоких порядков: I, Л и III.

Рис. 5.24. Экспериментальное и моделированные (SI, S2, S3 и S4) ВРЭМ-изображения с дифрактограммой вдоль оси зоны [043].

Картина с наложенными друг на друга экспериментальной и моделированной электронограммами (Рис. 5.23 б) даёт возможность проиндицировать все видимые рефлексы и установить наличие отражений из нулевой, первой, второй и третьей лауэ-зон. Расчёт 120 электронограмм показал образование только одной кальций фосфатной модификации а

Са3(Р04)2.

ВРЭМ-изображения (экспериментальное и четыре моделированных для разных толщин кристалла) с дифрактограммой показаны на Рис. 5.24. Моделирование ВРЭМ изображений SI, S2, S3 и S4 проводилось вдоль оси зоны [043], при значениях дефокуса 45 нм, 45 нм, 30 нм and 30 нм с предполагаемыми толщинами 11.8 нм, 47.3 нм ,59.1 нм и 71.0 нм при углах наклона 0°, 0.1°, 0.23° и 0.23° к оси зоны [043] вдоль направления [001], соответственно. Экспериментальное и рассчитанные изображения хорошо соответствуют друг другу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Электронная микроскопия высокого разрешения в современном исполнении способна решать сложные задачи из многих областей: физики, химии, материаловедения, биологии, медицины. Характеризация нанофаз -это не только определение структуры материалов, но и установление механизма их образования, отработка методов синтеза и выявление оптимальных условий.

В настоящей работе проведено исследование возможности и эффективности метода преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ-изображений для характеризации нанофаз в биоматериалах: определения структуры и морфологии. Такой подход диктовался особенностями строения исследуемых материалов, а именно радиационной чувствительностью образцов и малыми размерами исследуемых областей. С помощью преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ-изображений с хорошей точностью удалось определить структуру нанокристаллов гидроксиапатита в костной ткани и в осадках на сердечных клапанах, выявить включения гидроксиапатита в кристаллах октакальций фосфата, оценить толщины осаждаемых кристаллов, установить разориентировку зёрен внутри кристалла. Показана высокая эффективность и надёжность используемых компьютерных программ Digital Micrograph и JEMS, большим преимуществом которых является их многофункциональность и работоспособный графический пользовательский интерфейс. Это тот путь, который можно предложить для развития компьютерного обеспечения научных разработок: хорошая научная база и отличное графическое представление результатов.

В заключение можно сформулировать следующим образом основные результаты проведенных исследований:

1. Продемонстрированы возможности комбинированного подхода по идентификации нанокристаллов и нанофаз в разных биокомпозитах с помощью преобразования Фурье и моделирования электронномикроскопических изображений с высоким разрешением и электронной дифракции.

2. Для повышения точности интерпретации электронно-микроскопических данных разработаны специальные программы для моделирования ВРЭМ изображений с учетом отклонения от точной оси зоны, атомных вибраций, дрейфа образца, создания сверхячейки анизотропного кристалла и структурной модели изотропной сферической частицы, исследования зависимости уширения дифракционных максимумов с уменьшением размера частиц.

3. Определены толщины образующихся в водных растворах тонких кристаллов и установлена зависимость толщины от температуры растворов.

4. Обнаружены запрещенные гексагональной симметрией дифракционные отражения в кристаллах гидроксиапатита и предложено объяснение данного эффекта, возникающего благодаря локальному разупорядочению в структуре.

5. Выявлены причины диффузного рассеяния на дифракционных картинах, которое образуется благодаря размерному эффекту. Проведено моделирование размерного эффекта на примере нанокристаллов гидроксиапатита и оксида кальция, показан вклад перекрытия соседних дифракционных максимумов в уширение колец на электронограммах.

6. Впервые исследована структура больших чистых кристаллов октакальций фосфата, полученных из водного раствора в условиях невесомости, а также смешанных кристаллов гидроксиапатит /октакальций фосфат, выращенных в условиях конвективного (земного) смешивания реагентов. Установлены ориентационные соотношения между двумя фазами, вычислены напряжения в кристаллах.

7. Впервые получены результаты о наноструктуре на поперечных сечениях плазменных покрытий гидроксиапатита на подложках; определены размеры, относительная ориентировка между нанокристаллами в слое и по отношению к подложке.

8. Определена устойчивость кальций фосфатных биоматериалов, полученных при высоких температурах. Впервые выявлено образование оксида кальция во время спекания и приготовления пористого костного биозаместителя на основе а-СазР04 при температуре 1430°С, которая значительно ниже температуры, определённой фазовой диаграммой в системе Са0-Рг05 и равной 1720°С.

9. На основе ВРЭМ исследования и сравнительной характеризации разных образцов костной ткани предложен механизм деструктивных процессов, происходящих в кости, на фоне снижения минеральной плотности. Показано, что изменений в составе минеральной фазы не происходит. Образцы, как здоровой, так и патологически измененной костной ткани, включают нанокристаллы гидроксиапатита длиной до 15-20 нм, шириной до 15 нм и толщиной порядка 0.8-1.6 нм с характерной текстурой до ±30°. Причиной снижения минеральной плотности кости, а также развития остепороза может быть сильное разрастание органической ткани в виде пленок и волокон, которое является причиной искусственной пористости и хрупкости кости.

10. Экспериментально показано подобие образования и осаждения фосфатов кальция в низкотемпературных растворах и образования минеральных осадков на сердечных клапанах. Детально исследованы фазовый состав (гидроксиапатит и октакальций фосфат), размеры кристаллов НАР (длина и ширина - доли микрометра, толщина до одного-пяти параметров решетки вдоль направления [2110]) и микронные размеры кристаллов октакальций фосфата и морфология кристаллов. Развито новое представление механизма патологической минерализации мягких тканей в живых организмах.

11. Определена устойчивость нанокомпозитов на основе органических матриц с диспергированными наночастицами селена и серебра к агломерации и действию химических реагентов в окружающей среде. Предложен механизм бактерицидной активности и ее изменения для наночастиц серебра в растворах и тонких пленках.

12. Впервые обнаружено и исследовано влияние органических материалов на кристаллизацию уже образовавшихся и существующих в водных растворах рыхлых бесструктурных наночастиц селена. Присутствие бактериальной целлюлозы способствуют кристаллизации наночастиц с образованием дефектов и границ внутри моноклинного кристалла а-селена.

Таким образом, исследование структуры и морфологии нанофаз привело к заключению о необходимости пересмотра результатов, полученных много лет назад, и привести в соответствие модельные представления прошлого с современными методологическими возможностями. Исследование механизмов, протекающих на наноуровне, структура наноматериалов потребовали особого подхода, как в постановке эксперимента, так и в корректной интерпретации экспериментальных данных.

Данная работа была бы невозможна без поддержки значительного числа людей, вовлечённых в научный процесс.

Автор считает своим долгом поблагодарить технических сотрудников, помогавших в приготовлении образцов. Хороший образец в электронной микроскопии высокого разрешения - это половина успеха в исследовании. Даниэла Лауб и Фабьен Бобард, работающие в Центре электронной микроскопии (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) сделали всё возможное для получения хороших тонких образцов.

Работа по изучению фосфатов кальция, включая кристаллы из космоса, была начата в лаборатории А.А. Чернова и под его руководством. А.А. Чернов при поддержке швейцарских и датских коллег способствовал проведению исследований. Автор горячо благодарит финансовую поддержку X. Шнайтера из швейцарской компании Контравес Спейс (Contraves Space) и научное сотрудничество с проф. Э. Лундагером Мадсеном из Дании. Электронную микроскопию высокого разрешения, компьютерные премудрости, обработку ВРЭМ изображений и их моделирование автор изучал под руководством проф. Ф.А. Буффа и проф. П.А. Стадельманна, работающих в Центре электронной микроскопии (Centre Interdisciplinaire de Microscopie Electronique - Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Швейцария). Автор сердечно благодарит за предоставленную возможность работать на современных электронных микроскопах, пользоваться компьютерами и программами, а также за научную, финансовую и моральную поддержку профессора Ф.А. Буффа, директора Центра. Все расчётные ВРЭМ-изображения и картины электронной дифракции получены с помощью программы JEMS. Её автором является П.А. Стадельманн, сотрудничество с которым привело к значительной модернизации программы, как в научной части, так и в чисто пользовательском подходе.

Образцы для исследования гидроксиапатит и биоматериалы на основе гидроксиапатита были получены в МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет, в лаборатории под руководством член-корреспондента РАН Мелихова И.В. Автор благодарит Игоря Витальевича Мелихова и его сотрудников за помощь в работе и обсуждение результатов. Покрытия гидроксиапатита в результате плазменного осаждения на различных подложках были приготовлены в Институте технической акустики НАНБ, Витебск, Беларусь в лаборатории под руководством Юрия Дмитриевича Хамчукова. Композиты, представляющие собой наночастицы, внедрённые в органические матрицы, получали в Институте высокомолекулярных соединений РАН в Санкт-Петербурге. Автор благодарит за сотрудничество Виктора Васильевича Копейкина, Альберта Константиновича Хрипунова, Юлию Георгиевну Баклагину.

Моим со-руководителем в кандидатской диссертации, посвящённой выявлению и изучению примесной фазы в кристаллах дигидрофосфата калия, и консультантом настоящей работы была Вера Всеволодовна Клечковская. Основам электронографии автор учился у неё. Также автор научился у В.В. Клечковской «закрывать» некоторые сенсационные научные открытия, включая свои собственные, т.е. очень критически подходить к полученным результатам и отличать настоящий результат от артефакта из-за некорректного использования прибора или неправильной интерпретации. Автор с огромной благодарностью принимал все её замечания, рекомендации и, главное, всемерную поддержку своей научной работы.

Исследования были поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований (Проекты № 01-02-16176а , № 02-02-81009/Бела, 05-03-32842а).

1. Characterization of nanophase materials. Ed. Zhong Lin Wang, Weinheim: Wiley VCH Verlag, 2000,406 p.

2. Нанотехнологии в полупроводниковой электронике. Отв. ред. ч.-корр. РАН А.Л. Асеев, Новосибирск, Издательство СО РАН, 2004 г.

3. Алферов Ж.И., Копьев П.С., Сурис Р.А., Асеев A.JL, Гапонов С.В., Панов В.И., Полторацкий Э.А., Сибельдин Н.Н. Наноматериалы и нанотехнологии. Микросистемная техника. 2003. №8. С. 3-13.

4. Аристов В.В. Исследования в области физики и технологии наноэлектроники в ИГГГМ РАН. Успехи соврем, радиоэлектроники. -2004.-N5-6.-С. 129-132.

5. Гусев А.И., Ремпель А.А. Нанокристаллические материалы. М.: Физматлит, 2000. 222 с.

6. М.В. Ковальчук Органические наноматериалы, наноструктуры и нанодиагностика. Вестник российской академии наук, 73 (2003) No 5, 405-412.

7. Штанский Д. В. Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения в нанотехнологических исследованиях. Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева), 2002, т. XLVI, № 5, 81 89.

8. Musatov A.L., Kiselev N.A., Kukovitskii E.F., Zakharov D.N., Zhbanov A.I., Izraelyants K.R., Chirkova E.G. Field electron emission from natotube carbon layers grown by CVD process. Applied Surface Science, 1-2 (2001) 111-119.

9. Dinelli F., Assender HE., Kirov K., Kolosov O.V. Surface morphology and crystallinity of biaxially stretched PET films on the nanoscale. POLYMER 41 (2000) No 11,4285-4289.

10. Choi, J., G. Sauer, К. Nielsch, R. B. Wehrspohn, and U. Gosele. Hexagonally arranged monodisperse silver nanowires with adjustable diameter and high aspect ratio, Chemistry of Materials 15 (2003), 776-779.

11. Wang, Z. К., M. H. Kuok, S. C. Ng, D. J. Lockwood, M. G. Cottam, K. Nielsch, R. B. Wehrspohn, and U. Gosele. Spin wave quantization in ferromagnetic nickel nanowires, Physical Review Letters 89 (2002). 027201/1-3

12. Cantor B. Nanocrystalline materials manufactured by advanced solidification processing methods. Advances in nanocrystallization 307 (1999) 143-151.

13. Электронные свойства дислокаций в полупроводниках. Осипьян Ю.А. (ред) Москва: УРСС, 2000, 320 с.

14. Spense J.C.H. Experimental high resolution electron microscopy. Oxford: Clarendon Press, 1981. Русский перевод: Спенс Дж. Экспериментальная электронная микроскопия высокого разрешения. Пер. С англ./Под ред. В.Н.Рожанского. Москва: Наука. 1986.

15. Tomas G., Goringe M.J. Transmission electron microscopy of materials. NY: John Wiley and Sons, 1979. Томас Г., Гориндж М.Дж. Просвечивающая электронная микроскопия материалов. Пер. с англ./ Под ред. Вайнштейна Б.К. Москва: Наука, 1983.

16. Cowley J.M. Diffraction physics. Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1990 (Second revised edition, forth printing).

17. Horiuchi S. Fundamentals of high resolution transmission electron microscopy. Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1994.

18. Williams D.B., Carter C.B. Transmission electron microscopy: a textbook for materials science. NY: Plenum Press, 1986.

19. Pratt W. K. Digital Image Processing (2nd edition), Wiley: New York, 1991.

20. Jain A.K. Fundamentals of Digital Image Processing. Prentice Hall: London, 1989.

21. Russ J.C. The image processing. Handbook, (2nd edition). CRC Press: Boca Raton, 1994.

22. Cooley J.W., Tukey J.W. An algorithm for the machine calculation of complex Fourier series. Mathematics Computation, 19 (1965) 297-301.

23. Hawkes P. Electron optics and electron microscopy. London; Naylor and Francis, 1972.

24. Metherell A.J.F. "Diffraction of electrons by perfect crystals" in Electron Microscopy in Materials. Science, Third course of Intern.school of Electron Microscopy, Ettore Majorana, 1973.

25. Cowley J.M., Moodie A.F. The scattering of Electrons by Atoms and Crystals. Acta Cryst. 10 (1957) 609-619, Acta Cryst. 12 (1959) 353-357.

26. Ishizuka K., Uyeda N. A new theoretical and practical approach to the multislice method. Acta Cryst. A33 (1977) 740-749.

27. Ishizuka K. Contrast Transfer of crystal images in TEM. Ultramicroscopy 5 (1980)55-65.

28. Hytch M.J., Snoeck E., Kilaas R. Quantitative measurement of displacement and strain fields from HREM micrographs. Ultramicroscopy 74 (1998) 131146.

29. Zhang F., Jin Q., Chan S-W. Ceria nanoparticles: size, size distribution, and shape. J. Appl Physics 95 (2004) 4319-4326.

30. Buffat P.A. et al., Crystallographic structure of small gold particles studied by high resolution electron microscopy, Faraday Discuss. 92 (1991) 173187.

31. Crozier P.A. et al., Factors affecting the accuracy of lattice spacing determination by HREM in nanometre-sized Pt particles. J. Electron Microscopy 48 (1999) 1015-1024;

32. Solliard C., Flueli M. Surface stress and size effect on the lattice parameter in small particles of gold and platinum, Surf. Sci. 156 (1985) pp.487-494;

33. Malm J.O., O'Keefe M.A. Deceptive "lattice spacings" in high resolution micrographs of metal nanoparticles, Ultramicroscopy 68 (1997) 13-23.

34. Buffat P.A. Identification of nano-phases: relative merit of local analysis techniques (HRTEM, nanodiffraction, EDS/EELS). Yearbook of Electron Microscopy Society, 78-91, Antwerpen, 2004.

35. G.MacLennan, C.A.Beevers, The crystal structure of dicalcium phosphate, CaHP04. Acta Cryst. 8 (1955) 579-583.

36. Beevers C.A. The crystal structure of dicalcium phosphate dihydrate, CaHP04 -2H20. Acta Cryst. 11(1958) 273-277.

37. Kay MI, Young RA, Posner AS Crystal structure of hydroxyapatite. Nature 204(1964) 1050-1052.

38. Elliot J.C., Mackie P.E, Young R.A. Monoclinic hydroxyapatite. Science 180(1973)1055-1057.

39. Morgan H., Wilson R.M., Eliot J.C., Dowker S.E.P., Anderson P. Preparation and characterization of monoclinic hydroxyapatite and its precipitated carbonate apatite intermediate. Biomaterials, 21(2000), 617627.

40. Brown W., Smith J., Lehr J., Frazier A.W. Octacalcium phosphate and hydroxyapatite. Nature 196 (1962) 1048-1055.

41. Brown W., Smith J., Lehr J., Frazier A.W. J. Crystallographic and Spectroscopic Research, 18 (1988) 235-250.

42. Dickens В, Schroeder LW, Brown WE Crystallographic studies of the role of Mg as a stabilizing impurity in beta-Ca3(P04)2. J. Solid State Chem. 10 (1974)232-248.

43. Mathew M, Schroeder LW, Dickens B, Brown WE The crystal structure of a-Ca3(P04)2. ActaCryst. 33(1977) 1325-1333.

44. Calvo С The crystal structure of alfa-Ca2P207. Inorganic Chemistry 7 (1968) 1345-1351.

45. Boudin S., Grandin A., Borel M.M., Leclaire A., Ravean B. Redermination of the beta-Ca2P207 structure. Acta Cryst. С 49 (1993) 2062-2064.

46. Eanes E.D., Gillessen I.H., Posner A.S. Intermediate states in the precipitation of hydroxyapatite. Nature 208 (1965) 365-367.

47. Posner A.S., Betts F. Synthetic amorphous calcium phosphate and its relation to bone mineral structure. Acc.Chem.Res. 8 (1975) 273

48. Onuma K., Ito A., Tateishi Т., Kameyama T. Growth kinetics of hydroxyapatite crystal revealed by atomic force microscopy. J. Crystal Growth 154 (1995) 118.

49. Onuma K., Ito A. Cluster Growth Model for Hydroxyapatite. Chem.Mater. 10(1998) 3346-3351.

50. Treboux G., Kanzaki N., Onuma K., Ito A. Energy-Preeminent Isomer of the Ca3(P04)2 Cluster. J.Phys.Chem. A. 103 (1999) 8118-8120.

51. Oyane A., Onuma K., Kokubo Т., Ito A. Clustering of Calcium Phosphate in the System CaCl2-H3P04-KCl-H20. J. Phys. Chem. В 103 (1999) 82308235.

52. Пинскер З.Г. Дифракция электронов. 1949. М.: Изд-во АН СССР.

53. Вайнштейн Б.К. Структурная электронография. 1956. Москва: Изд-во АН СССР.

54. Хейденрайх Р. Основы просвечивающей электронной микроскопии. Москва: Мир. 1966.

55. Nancollas G.H., Tomazic, J. Growth of calcium phosphate on hydroxyapatite crystals. Effect of supersaturation and ionic medium. Phys.Chem. 78 (1974) 2218-2225.

56. Boskey A.L., Posner A.S. Formation of hydroxyapatite at low supersaturation. J. Phys.Chem. 80 (1976) 40-45.

57. Graham S., Brown P.W. Reactions of octacalcium phosphate to form hydroxyapatite. J. Crystal Growth. 165 (1996) 106-115.

58. Christoffersen M. R., Christoffersen J. Possible mechanisms for the growth of the biomaterial, calcium hydroxyapatite microcrystals. J.Crystal Growth 121 (1992)617-630.

59. Elliot J.C. Structure and chemistry of the apatite and other calcium othophosphates. Amsterdam: Elsevier. 1994.

60. Moreno EC, Gregory TM, Brown WE. Preparation and solubility of hydroxyapatite. J Res Nat Bur Stand A. Physics and Chemistry 72(1968) 773-782.

61. Suchanek W., Yoshimura M., Processing and properties of HA-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants, J. Mater. Res. Soc., 1998, vol. 13, no. 1, pp. 94-103.

62. Suchanek W., Yashima M., Kakihana M. Yoshimura M. Hydroxyapatite ceramics with selected sintering additives. Biomaterials 18 (1997) 923-933.

63. Royer A., Viguie J. C., Heughebaert M., Heughebaert J. C. Stoichiometry of hydroxyapatite: influence on the flexural strength. Journal of Materials science: Materials in Medicine 4 (1993) 76-82.

64. Hech, L.L., Bioceramics. J. Am. Ceram. Soc., 1998, vol. 82, no. 7, pp. 1705-1733.

65. Paul W., Sharma C.P., Development of Porous Spherical Hydroxyapatite Granules: Application towards Protein Delivery, J. Mater. Sci.: Mater. Med., 1999, vol. 10, no. 7, pp. 383-388.

66. Krajewski A., Ravaglioli A., Roncan E., et al., Porous Ceramic Bodies for Drug, J. Mater. Sci.: Mater. Med., 2000, vol. 11, no. 12, pp. 763-772.

67. Vaz L., Lopes A.B., Almeida M., Porosity Control of Hydroxyapatite Implants, J. Mater. Sci.: Mater. Med., 1999, vol. 10, no. 10/11, pp. 239-242.

68. Северин А. В.,. Комаров В. Ф,. Божевольнов В. Е, Мелихов И. В. Морфологический отбор в суспензии нанокристаллического гидроксиапатита, приводящий к сфероидным агрегатам. Ж. неорг. химии. 2005. V. 50, Р. 76.

69. Мелихов И.В., Комаров В.Ф., Божевольнов В.Е., Северин А.В. ДАН. 2000. Т. 373. С. 355.

70. Орловский В.П., Ежова Ж.А., Родичева Г.В., и др. Структурные превращения гидроксиапатита в интервале температур 100-1600°С. Журнал неорг. химии. 1990. V. 34. Р. 1337.

71. Cihlár J., Buchal A., Trunec М. Kinetics of thermal decomposition of hydroxyapatite bioceramics. J. Materials Science 34 (1999) 6121-6131.

72. Sz-Chian Liou, San-Yuan Chen. Transformation mechanism of different chemically precipitated apatitic precursors into b-tricalcium phosphate upon calcinations. Biomaterials 23 (2002) 4541^547.

73. Kreidler E.R., Hummel F.A. Inorg.Chem. 1967. V. 6. P. 884.

74. Driessens F. С. M., Boltong M. G., Bermúdez O., Planell J. A., Ginebra M. P., Fernández E. Effective formulations for the preparation of calcium phosphate bone cements. J. Materials Science: Materials in Medicine 5 (1994) 164-170

75. Riman R.E., Suchanek W. L., Byrappa K., Chun-Wei Chen, Shuk P., Oakes C.S. Solution synthesis of hydroxyapatite designer particulates. Solid State Ionics 151 (2002) 393-402.

76. Hench L. L. Bioceramics, from concept to clinic. J. Am. CeramSoc. 74 (1991) 1482-1510.

77. Sampathkumaran U., De Guire M. R., Wang R. Hydroxyapatite coatings on Titanium. Advanced Engineering Materials. 3 (2001) No 6,401-405.

78. Dhert W. J. A. Retrieval studies on calcium phosphate-coated implants. Med. Prog. Technol., 20 (1994) 143-154.

79. Manley M. T. Calcium phosphate biomaterials: A review of the literature,' in Hydroxylapatite Coatings in Orthopaedic Surgery, R. G. T. Geesink and M. T. Manley (eds.), Raven Press, New York, 1993, P. 1-23.

80. Wen H. B., de Wijn J. R., Cui F. Z., de Groot K. Preparation of calcium phosphate coatings on titanium implant materials by simple chemistry. J Biomed Mater Res, 41 (1998) 227-236.

81. Peltola T., Patsi M., Rahiala H., Kangasniemi I., Yli-Urpo A. Calcium phosphate induction by sol-gel-derived titania coatings on titanium substrates in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (1998) 504-510.

82. Mao C., Li H., Cui F., Ma C., Feng Q. Oriented growth of phosphates on polycrystalline titanium in a process mimicking biomineralization. J.Crystal Growth 206 (1999) 308-321.

83. Schreckenbach J.P., Marx G., Schlottig F., Textor M., Spencer N.D. Characterization of anodic spark-converted titanium surfaces for biomedical applications. J.Materials Science: Materials in Medicine 10 (1999) No 8, 453-457.

84. Cotell C.M., Chrisey D.B., Grabowski K. S., Spregue J. A. J. Appl. Biomater 3 (1992) 87.

85. Wolke J. G. C., de Groot K., Jansen J. A. In vivo dissolution behavior of various RF magnetron sputtered Ca-P coatings. J Biomed. Mater. Res. 391998)524-530.

86. Park E., Condrate R.A., Lee D., Kociba K., Gallagher P.K. Characterization of hydroxyapatite before and after plasma spraying. J.Materials Science: Materials in medicine 13 (2002) 211-218.

87. Gross K. A., Berndt С. C., Herman H. Amorphous phase formation in plasma-sprayed hydroxyapatite coatings. J Biomed. Mater. Res. 39 (1998) 407-414.

88. Willmann G. Coating of Implants with Hydroxyapatite Material Connections between Bone and Metal. Advanced Engineering Materials. 11999) No 2,95-105.

89. ASTM F 1609-95, Standard Specification for Calcium Phosphate Coatings for Implanteable materials 1995.

90. ASTM F 1185-88, Standard Specification for Composition of ceramic hydroxyapatite for Surgical Implants 1988.

91. Ogiso M., Yamashita Y., Matsumoto T. Microstructural changes in bone of HA-coated implants. J.Biomed.Mater.Res. 39 (1998) 23-31.

92. Cowin S.C., van Buskirk W.C., Ashman R.B. in Handbook of Bioengineering. Eds.: Skalak R., Chien S. New York: McGrow-Hill, p.2.1, 1987.

93. Шубникова E.A. Функциональная морфология тканей. M.: Издательство Московского университета, 1981.

94. Landis W.J., Glimcher M.J. Electron diffraction and electron probe microanalysis of the mineral phase of bone tissue prepared by anhydrous technique. J. Ultrastructural Research 63 (1978) 188-223.

95. Harrigan T.P., Reuben J.D. Mechanical model for critical strain in mineralizing biological tissues: application to bobe formation in biomaterials. Biomaterials 18 (1997) 877 883.

96. Boskey A.L., Posner A.S. Conversion of amorphous calcium phosphate to microcrystalline hydroxyapatite, a pH-dependent, solution-mediated, solidsolid conversion. J. Phys. Chem. 77 (1973) 2313-2317.

97. De Grauw C.J., de Bruijn J.D., Otto C., Greve J. Investigation of bone an dcalcium phosphate coatings and crystallinity determination using Raman microspectroscopy. Cells and materials. 6 N1-3 (1996) 57-62.

98. Bacon G.E. The study of bones by neutron diffraction. J. Appl. Cryst. 10 (1977) 124-126.

99. Walsh W.R., Christiansen D.L. Demineralized bone matrix as a template for mineral organic composites. Biomaterials 16 (1995) 1363- 1371.

100. Su X., Sun K., Cui F.Z., Landis W.J. Organization of apatite crystals in human woven bone. Bone 32 (2003) 150 162.

101. Heaney R.P., Abrams S., Dawson-Hughes B., Looker A., Marcus R., Matkovic V., Weaver C. Peak Bone Mass. Osteoporos Int (2000) 11: 9851009.

102. Kanis J. A., Oden A., Johnell O., Caulin F., Bone H., Alexandre J.-M., Abadie E., Lekkerkerker F. Uncertain Future of Trials in Osteoporosis. Osteoporos Int 13 (2002) 443^49.

103. Ganong WF. Review of medical physiology. 21 ed. New York: McGraw-Hill, 2003; 385-390.

104. Russell R. G. G., Rogers M. J. Bisphosphonates: From the Laboratory to the Clinic and Back Again. Bone 25 (1999) 97-106.

105. Zieba A., Sethuraman G., Perez F., Nancollas G. H., Cameron D. Influence of Organic Phosphonates on Hydroxyapatite Crystal Growth Kinetics. Langmuir 1996, 12,2853-2858.

106. Fleisch, H. Bisphosphonates in Bone Disease. From the Laboratory to the Patient, Third Edition. New York: The Parthenon Publishing Group; 1997.

107. Glatt M., Pataki A., Evans G. P., Hornby S.B., Green J. R. Loss of vertebral bone and mechanical strength in estrogen-deficient rats is prevented by long-term administration of zoledronic acid. Osteoporos Int (2004) 15: 707-715

108. Li C.Y., Majeska R. J., Laudier D. M., Mann R., Schaffler M. B. High-dose risedronate treatment partially preserves cancellous bone mass and microarchitecture during long-term disuse. Bone 37 (2005) 287 295.

109. Schoen F, Levy R. Tissue heart valves: Current challenges and future research perspectives. J Biomed Mater Res. 1999; 47(4): 439-65.

110. Wallin R, Wajih N, Greenwood GT, Sane DC. Arterial calcification: A review of mechanisms, animal models, and the prospects for therapy. Med Res Rev. 21 (2001) No 4,274-301.

111. Wexler L, Brundage B, Crouse J, Detrano R, Fuster V, Maddahi J, Rumberger J, Stanford W, White R, Taubert K. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, epidemiology, imaging methods, and clinical implications. Circulation 1996; 94(5): 1175-1192.

112. Kapolos J, Mavrilas D, Missirlis Y, Koutsoukos PG. Model Experimental system for investigation of heart valve calcification in vitro. J Biomed Mater Res. 1997; 38(3): 183-90.

113. Shanahan CM, Proudfoot D, Tyson KL, Cary NRB, Edmonds M, Weissberg PL. Expression of mineralization-regulating proteins in association with human vascular calcification. Z Kardiol. 2000; 89 Suppl 2: 63-8.

114. Moreno ES, Zahradnic RT, Glazman A, Hwu R. Precipitation of hydroxyapatite from dilute solutions upon seeding Calcif Tiss Int. 24 (1977) 47-57.

115. Moreno E.S., Varughese K. Crystal growth of calcium apatites from dilute solutions. J Cryst Growth 53 (1981) 20-30.

116. Begun P.I, Schukeilo Y.A. Biomechanics. S-Petersburg: Politehnika, 2000; 5-211.

117. Yoganathan A.P. Fluid mechanics of aortic stenosis. Eur Heart J 9 (1988) SupplE: 13-17.

118. Salusky .IB, Goodman W.G. Cardiovascular calcification in end-stage renal disease. Nephrol Dial Transplant. 17 (2002) No 2, 336-339.

119. Raggi P., Boulay A., Chasan-Taber S., Amin N., Dillon M., Burke S.K., Chertow G.M. Cardiac calcification in adult hemodialysis patients. A link between end-stage renal disease and cardiovascular disease? J Am Coll Cardiol. 39 (2002) No 4,695-701.

120. Ventura J.E., Tavella N., Romero C., Petraglia A., Báez A., Mufioz L. Aortic valve calcification is an independent factor of left ventricular hypertrophy in patients on maintenance hemodialysis. Nephrol Dial Transplant. 17 (2002) No 10,1795-1801.

121. Guérin A.P, London G.M, Marchais S.J, Metivier F. Arterial stiffening and vascular calcifications in end-stage renal disease. Nephrol Dial Transplant. 15 (2000) No7, 1014-1021.

122. Chertow G.M, Slowing the progression of vascular calcification in hemodialysis. J Am Soc Nephrol. 14 (2003) No9, Suppl 4, S310-S314.

123. Shen M, Marie P, Farge D, Carpentier S, Pollak C, Hott M, Chen L, Martinet B, Carpentier A. Osteopontin is associated with bioprosthetic heart valve calcification in humans. C R Acad Sci III. 1997; 320(1): 49-57.

124. Piuz F., Borel J.P., Phys. Status Solidi A 14 (1972) 129.

125. Buffat P. A., Borel J. P. Size effect on the melting temperature of gold particles. Phys.Rev. A13 (1976) 2287.

126. Ajayan P.M., Marks L.D. Quasimelting and phases of small particles. Phys. Rev. Lett. 60 (1988) 585-587.

127. Ino S. Epitaxial growth of metals on rocksalt faces cleaved in vacuum. II. Orientation and structure of gold particles formed in ultrahigh vacuum. J. Phys. Soc. Jpn 21 (1966) 346.

128. Solliard C., Buffat P. A., Faes, F. Equilibrium structure of small gold crystals. J. Cryst. Growth 32 (1976) 123.

129. Ajayan P. M., Marks, L. D. Experimental evidence for quasimelting in small particles. Phys. Rev. Lett. 63 (1989) 279.

130. Marks L. D. Experimental studies of small particle structure. Rep. Prog. Phys. 57(1994) 603.

131. Narayanaswamy D., Marks L. D. Transformations in quasimelting. Z. Phys. D26 (1993) S70.

132. Ajayan P. M., Marks L. D. Phase instabilities in small particles. Phase Transitions 24-26 (1990) 229.

133. Buffat P. A. Dynamical behaviour of nanocrystals in transmission electron microscopy: size, temperature or irradiation effects. Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 361 (2003) 291-295.

134. Bulushev D.A., Kiwi-Minsker L., Yuranov I., Suvorova E. I., Buffat P.A., Renken A. Structured Au/FeOx/C Catalysts for Low-Temperature CO Oxidation. Journal of Catalysis 210 (2002) 149-159.

135. Kiwi J., DenisovN., GakY., OvanesyanN., Buffat P. A., Suvorova E., Gostev F., Titov A., Sarkisov O., Albers P., Nadtochenko V. Catalytic Fe3+ Clusters and Complexes in Nafion Active in Photo-Fenton Processes. High

136. Resolution Electron Microscopy and Femtosecond Studies. Langmuir 182002) 9054-9066.

137. Yuranov I., Moeckli P., Suvorova E., Buffat P., Kiwi-Minsker L., Renken A. Pd/Si02 catalysts: synthesis of Pd nanoparticles with the controlled size in mesoporous silicas. Journal of Molecular Catalysis A: Chemical 1922003) 239-251.

138. Herron N., Thorn D. Nanoparticles: Uses and Relationships to Molecular Cluster Compounds. Adv. Mater. 10 (1998) №15,1173-1184.

139. Bradly J.S. In Clusters and Colloids. From Theory to Applications, Schmidt D. (ed). VCH: Weinheim, 1994.

140. Selenium in biology and human health. Ed. R.F. Burk. New York: Springer-Verlag, 1994,221 p.

141. Gao X., Zhang J., Zhang L. Hollow Sphere Selenium Nanoparticles: Their In-Vitro Anti Hydroxyl Radical Effect. Adv. Mater. 14 (2002) 290-293.

142. Копейкин B.B., Панарин И.Ф. Водно-растворимые нанокомпозиты нуль-валентного серебра с высокой антимикробной активностью. Докл. Акад. Наук. 380 (2001) №4,497-500.

143. Mayer A.B.R. Colloidal metal nanoparticles Dispersed in Amphiphilic Polymers. Polymers for Advanced Technologies. 12 (2001) 93-106.

144. Ершов Б.Г. Ионы металлов в необычных и неустойчивых состояниях окисления в водных растворах: получение и свойства. Успехи химии, 66 (1997) №2,103-116.

145. Ершов Б.Г. Изв. АН. Сер. хим., 1999, № 1, с. 1.15.

146. Janata Е., Henglein A., Ershov B.G. J. Phys. Chem., 98 (1994) № 42, 10888-10891.

147. Ершов Б. Г. Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические и каталитические свойства. Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2001, т. XLV, № 3,20-30.

148. Gao X., Zhang J., Zhang L. Hollow Sphere Selenium Nanoparticles: Their In-Vitro Anti Hydroxyl Radical Effect. Adv. Mater. 14 (2002) 290-293.

149. Digital Micrograph, Gatan, Pleasonton, CA. http://gatan.com.

150. Stadelmann P.A. EMS a software package for electron diffraction analysisand HREM image simulation in materials science. Ultramicroscopy 21 (1987)131.146.

151. Stadelmann P. JEMS. http://cimewww.epfl.ch/people/Stadelmann/iemsWebSite/iems.html

152. Суворова Е.И., Буффа Ф.А. Проявление размерного эффекта на картинах рентгеновской и электронной дифракции от частиц гидроксиапатита. Кристаллография 46 (2001) №5, 796-804.

153. Суворова Е.И., Стадельманн П.А., Буффа Ф.А. Применение ВРЭМ-моделирования для измерения толщины кристаллов гидроксиапатита и определения разориентации зерен. Кристаллография 49 (2004) №3, 407-417.

154. Lundager Madsen Н.Е., Christensson F., Chernov A.A., Polyak L.E., SuvorovaE.I. Crystallization of Calcium Phosphate in Microgravity. Adv.Space Res. 16 (1995) 65-68.

155. Lundager Madsen H.E., Christensson F., Polyak L.E., Suvorova E.I., Kliya M.O., Chernov A.A. Calcium phosphate crystallization under terrestrial and microgravity conditions. J. Crystal Growth 152 (1995) 191 202.

156. Suvorova E.I., Christensson F., Lundager Madsen H.E. & Chernov A.A. Terrestrial and space-grown HAP and OCP crystals: effect of growth conditions on perfection and morphology. J. Crystal Growth 186 (1998) 262 274.

157. Суворова Е.И., Поляк JI.E., Комаров В.Ф., Мелихов И.В. Исследование синтетического гидроксиапатита методом высокоразрешающей просвечивающей электронной микроскопии: морфология и направление роста. Кристаллография 45 (2000) 930-934.

158. Baldyga J, Bourne Ж. Turbulent mixing and chemical reactions. Chichester: John Wiley &Sons Ltd, 1999; 810-840.

159. Мелихов И.В., Комаров В.Ф., Божевольнов B.E., Северин А.В. ДАН. 373 (2000) С. 355.

160. Суворова Е.И., Клечковская В.В., Комаров В.Ф., Северин А.В., Мелихов И.В., Буффа Ф.А. Электронная микроскопия биоматериалов на основе гидроксиапатита. Кристаллография 2006, т. 51, № 5, с.218-225.

161. Суворова Е.И., Клечковская В.В., Бобровский В.В., Хамчуков Ю.Д., Клубович В.В. Наноструктура покрытия, полученного плазменным распылением гидроксиапатита. Кристаллография 48 (2003), №5,928-934.

162. Хамчуков Ю.Д., Клубович В.В., Бобровский В.В., Сычев И.Ю., Суворова Е.И., Клечковская В.В. Тонкие покрытия из карбонат-гидроксилапатита на поверхности металлов и монокристаллических диэлектриков. Физика и химия обработки материалов 2006, №2,с.38-43.

163. Kitamura М, Ohtsuki С, Ogata S, Kamitakahara М, Tanihara М Fabrication of a-Tricalcium Phosphate Porous Body Having a Uniform Pore Size Distribution. Key Engineering Materials 254-256 (2004) 965-968.

164. Суворова Е.И. Высокоразрешающая просвечивающая электронная микроскопия и электронная дифракция в исследовании минерального осадка на сердечном клапане. Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2001, № 8,74-78.

165. Suvorova E.I., Buffat P.A. Model of the Mechanism of Ca-loss by Bones under Microgravity and Earth Conditions. J. Biomed. Mater. Res. (Appl. Biomater) 63 (2002) 424-432.

166. Suvorova E.I., Buffat PA. Pathological Mineralization of Cardiac Valves: Causes and Mechanism. Journal of Long-Term Effects of Medical Implants. 15 (2005) №4,361-374.

167. Копейкин В.В., Валуева C.B., Киппер А.И., Филлипов А.П., Хлебосолова Е.Н., Боровикова JI.H., Лаврентьев В.К. Исследование формирования наночастиц Se0 в водном растворе катионного полиэлектролита. Журнал прикладной химии, 76 (2003) №5,847-850.

168. Suvorova Е. I., Klechkovskaya V.V., Kopeikin V.V., Buffat P.A. Stability of Ag nanoparticles dispersed in amphiphilic organic matrix. J. Crystal Growth 275 (2005) 2351 -2356.

169. Suvorova E.I., Lundager Madsen H.E. Observation by HRTEM the Hydroxyapatite Octacalcium Phosphate Interface in Crystals Grown from Aqueous Solutions. J.Crystal Growth 198/199 (1999) Part 1,677-681.

170. Suvorova E.I., Buffat P.A. Electron Diffraction from Micro- and Nanoparticles of Hydroxyapatite. J.Microscopy 196 (1999) Parti, 46-58.

171. Iijima M., Moradian-Oldak J. Control of octacalcium phosphate and apatite crystal growth by amelogenin matrices. J. Mater . Chem. 14 (2004), 2189 — 2199.

172. Iijima M., Moriwaki Y., Wen H.B., Fincham A.G., Moradian-Oldak J. Elongated Growth of Octacalcium Phosphate Crystals in Recombinant Amelogenin Gels under Controlled Ionic Flow. J.Dent.Res. 81 (2002) № 1, 69-73.

173. E.I. Suvorova, V.V. Bobrovsky, Yu.D. Khamchukov, P.A.Buffat. Nanostructure of Hydroxyapatite Coatings Sprayed In Argon Plasma. Key Engineering Materials, 254-256 (2004) 891-894.

174. Knowles JC, Gibson IR, Abrahams I High temperature phase transition in Ca3(P04)2 measured by neutron diffraction. Bioceramics 1999, 341-344.

175. Roux P, Loner D, Bonel G Su rune novel form crystalline du phosphate tricalcique. Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances del'Academie des Sciences, Serie C, Sciences Chimiques. 286 (1978) 549-551.

176. Jay AH, Andrews KW Note on oxide systems pertaining to steel making furnace slags: FeO-MnO, FeO-MgO, CaO-MnO, MgO-MnO. J.Iron and Steel Institute (London) 152 (1946) 15-18.

177. Rubin MA, Jasiuk I, Taylor J, Rubin J, Ganey T, Apkarianb RP. TEM analysis of the nanostructure of normal and osteoporotic human trabecular bone. Bone 2003; 33: 270-282.

178. Rubin MA, Rubin J, Jasiuk I. SEM and TEM study of the hierarchical structure of C57BL/6J and C3H/HeJ mice trabecular bone. Bone 2004; 35: 11-20.

179. Hassenkama T, Jgirgensen HL, Pedersenc MB, Kourakisc AH, Simonsend L, Lauritzen JB. Atomic force microscopy on human trabecular bone from an old woman with osteoporotic fractures. Micron 2005; 36: 681-687.

180. Moreno ES, Zahradnic RT, Glazman A, Hwu R. Precipitation of hydroxyapatite from dilute solutions upon seeding Calcif Tiss Int. 24 (1977) 47-57.

181. Moreno E.S., Varughese K. Crystal growth of calcium apatites from dilute solutions. J Cryst Growth 53 (1981) 20-30.

182. Chernov A.A. Modern Crystallography III. Crystal growth. Berlin: Springer-Verlag, 1984; 279-297.

183. Titov A.T, Larionov P.M, Shchukin V.S, Zaikovskii V.I. Possible formation of hydroxyapatite in blood. Doklady Biochemistry. 373 (2000) 132-134.

184. Moreno E.C, Brown W.E, Osborn G. Stability of dicalcium phosphate dehydrate in aqueous solutions and solubility product of octacalcium phosphate. Soil Sci Soc AmProc. 24 (1960) 99-102.

185. Owen E.A., Yates E.L. Precision measurements of crystal parameters. J. Chemical Physics 3 (1935) 605-616.

186. Cava R.J., Reidinger F., Wuensch B.J. Single-crystal neutron diffraction study of the fast-ion conductor beta-Ag2S between 186 and 325 C. J.Solid State Chemistry 31 (1980) 69-80.

187. Sadanaga R., Sueno S. X-Ray study on the alpha beta transition of Ag20. Mineralogical Journal (Japan) 5 (1967) 124-148.

188. Larsson, L.O. The crystal structure of silver sulphite. Acta Chemica Scandinavica 23 (1969) 2261-2269.

189. Mehrotra B.N., Hahn, T., Eysel W., Roepke H., Illguth A. Crystal chemistry of compounds with thenardite (Na2S04V) structure. Neues Jahrbuch fuer Mineralogie. Monatshefte (1978), 1978, 408-421. Phase Transition 38 (1992) 127-220.

190. Cherin P., Unger P. Refinement of the crystal structure of alpha-monoclinic Se. Acta Crystallographica B, 28 (1972) 313-317.

191. Cherin, P., Unger P. The crystal structure of trigonal selenium. Inorganic Chemistry (1967), 6,1589-1591. Acta Crystallographica 21 (1966) 46-46.

192. Burbank R.D. The crystal structure of beta-monoclinic selenium. Acta Crystallographica 5 (1952) 236-246.

193. Foss O., Janickis V. Crystal structure of gamma-monoclinic Selenium. J.Chemical Society. Dalton Transactions, Inorganic Chemistiy 1980 (1980) 624-627.

194. McCullough J.D. The Crystal Structure of Selenium Dioxide. Journal of the American Chemical Society 59 (1937) 789-794.314201. Mijlhoff F.C. The crystal structure of tetragonal selenium trioxide. Acta Crystallographica 18 (1965) 795-798.

195. Zak Z. Crystal structure of diselenium pentoxide Se205. Zeitschrift fuer Anorganische und Allgemeine Chemie 460 (1980) 81-85.

196. Larsen F.K., Lehmann, M.S.; Sotofte, I. A Neutron Diffraction Study of Selenious Acid, H2Se03. Acta Chemica Scandinavica 25 (1971) 1233-1240.

197. Erfany-Far H., Fuess H., Gregson, D. Single-crystal neutron diffraction study of hydrogen bonding in selenic acid. Acta Crystallographica C 43 (1987)395-397.