Направленный синтез и изучение зависимостей структура - антипролиферативная активность для соединений двойного действия на динамику микротрубочек тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.16 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

_ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА_

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

Шишов Дмитрий Вениаминович

Направленный синтез и изучение зависимостей структура -антипролиферативпая активность для соединений двойного действия на динамику микротрубочек

02.00.16 — Медицинская химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

6МАР 2013

Москва 2013

005050247

Работа выполнена на кафедре органической химии в лабораториях биологически активных органических соединений и органического синтеза Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: Ольга Николаевна Зефирова

доктор химических наук, доцент.

Официальные оппоненты: Михаил Александрович Грин

Доктор химических наук, профессор, зам. зав. кафедрой химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского (Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова)

Марина Александровна Мягкова

Доктор биологических наук, кандидат химических наук, профессор, зав. лабораторией иммунохимии (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологически активных веществ РАН)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Защита диссертации состоится 27 марта 2013 года в 1300 на заседании диссертационного совета Д 501.001.69 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 3, МГУ, Химический факультет, аудитория 446.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разосланХ -'"февраля 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 501.001.69 при МГУ имени М.В. Ломоносова доктор химических наук, профессор

Т.В. Магдесиева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Онкологические заболевания занимают одно из первых мест по уровню смертности, и являются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Поэтому поиск новых эффективных и малотоксичных соединений с противоопухолевой активностью является важным направлением современной медицинской химии.

Одной из молекулярных мишеней для создания противоопухолевых веществ является клеточный белок тубулин и построенные из него микротрубочки. Такие соединения, как таксол, винбластин и колхицин, а также их многочисленные аналоги, ингибируют митоз путем связывания с различными областями тубулина и запуска либо ингибирования процесса сборки микротрубочек (колхицин, алкалоиды барвинка), либо неконтролируемой полимеризации тубулина (таксаны: таксол, таксотер). Благодаря высокой эффективности таксаны широко используют при наиболее распространенных типах рака, несмотря на сложности их получения полусинтетическим путем и высокую стоимость. Более доступный колхицин и его аналоги, обладающие существенно более простой структурой, оказываются слишком токсичными для клинического использования. Данные обстоятельства стимулируют как изучение возможности создания упрощенных миметиков таксола, так и попытки самых разнообразных структурных вариаций колхицина и его аналогов, направленных на получение более активных и менее токсичных соединений.

Вариантом подобных модификаций является создание гибридных конъюгатов, объединяющих в одной молекуле фрагменты, способные к взаимодействию с различными областями тубулина. Это направление интенсивно развивается в последнее десятилетие. В русле подобных исследований находится настоящая работа, посвященная изучению новых гибридных конъюгатов двойного действия на динамику микротрубочек.

Цель работы.

Основной задачей настоящего исследования являлось изучение возможностей создания новых классов лигандов тубулина двойного действия на динамику микротрубочек. Выполнение этой работы включало в себя:

1) направленный синтез комбинированных молекул, содержащих структуру упрощенного миметика таксола на основе адамантана, а также фрагменты колхицина, комбретастатина, подофиллотоксина и др.;

2) обстоятельное исследование зависимостей структура - антипролифера-тивная активность в рядах синтезированных структур (вариации длины и типа линкера, изучение влияния заместителей в отдельных фрагментах молекул и др.) с целью оптимизации соединения-лидера;

3) интерпретацию результатов биотестирования полученных соединений с помощью данных компьютерного молекулярного моделирования.

Научная новизна и практическая значимость.

Разработаны структуры аналогов соединения-лидера - 5-{[(2/?,3S)-N-(отре/и-бутоксикарбонил)фенилизосеринил]-окси}-2-адамантил7-оксо-7-(дез-ацетилколхиции-7-Л-ил)гептаноата - и осуществлен их направленный синтез. Показано влияние длины линкера и адамантанового фрагмента на цитоток-сичность и способность веществ к образованию тубулиновых кластеров. Продемонстрирована возможность удаления аминокислотной группировки в исследуемой структуре без потери активности, что привело к созданию нового соединения-лидера - А?-(7-адамант-2-илокси-7-оксогептаноил)-Л'-дезацетилкол-хицина, для которого проведено обстоятельное изучение соотношений структура — активность.

Изучена возможность замены колхицинового фрагмента в молекуле N-(1-адамант-2-илокси-7-оксогептаноил)-7^-дезацетилколхицина. Исследование полученных серий соединений, в том числе методом компьютерного молекулярного моделирования, позволило выявить три коньюгата подофил-лотоксина и комбретастатина с адамантаном с цитотоксичностью менее 1 мкМ.

В работе получено девять веществ с высоким значением цитотоксичности (ЕС50 < 50 нМ) по отношению к клеткам карциномы легких человека А549. Для ряда синтезированных соединений показан необычный эффект кластеризации тубулина, выявлена его корреляция с увеличением цитотоксичности.

Апробация работы.

Результаты работы представлены на XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), Международной конференции «Advanced Science in Organic Chemistry» (Крым, Украина, 2010), VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и Медицина» (Уфа, 2010), Международной конференции «Основные тенденции развития химии в начале XXI-го века» (Санкт-Петербург, 2009), Международной конференции «Органическая химия для медицины» (Черноголовка, 2008). Работы была удостоена президентской премии по результатам всероссийского конкурса научно-исследовательских работ учащихся и студенческой молодежи "Научный потенциал-XXI". Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 09-03-00879, 12-03-00720-а, 11-03-12088_офи_м), грантов Президента РФ для поддержки ведущих научных школ № НШ- 65546.2010.3.

Публикации. Содержание диссертации изложено в 12 публикациях, включая 5 статей в российских и международных журналах (все статьи - в журналах, рекомендованных ВАК) и 7 тезисах докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы, который включает в себя 165 ссылок. Работа содержит 27 схем, 17 рисунков и 8 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В литературном обзоре описаны основные соотношения структура - активность для классических лигандов колхицинового сайта белка тубулина. Проанализированы необычные эффекты на тубулин и микротрубочки, вызванные действием некоторых соединений. Систематизирована информация по созданию «двойных» (гибридных) лигандов тубулина с колхициновым фрагментом.

На основе данных об активности этих соединений для дальнейшего изучения выбрано соединение лидер -гибридная молекула 1, объединяющая колхициновый фрагмент и «упрощенный» миметик таксола на основе адамантана, с (2К,35!)-М-(трет-бутоксикарбонил)-Р-фенилизосериновым заместителем.

Наличие специфического свойства молекулы 1 — способности стимулировать разборку микротрубочек и вызывать образование агрегатов тубулина, а также высокая цитотоксичность сделали её интересным и перспективным соединением-лидером для дальнейшего изучения и создания на её основе новых типов веществ с потенциальной противоопухолевой активностью.

1. Молекулярный дизайн, синтез и изучение соотношения структура — активность для производных «упрощенного аналога колхитакселя»

Первым шагом в изучении закономерности структура — активность для соединения 1 стала вариация каркасной группировки и длины перемычки.

1.1.Синтез и биотестирование аналога соединения-лидера (1) без

адаманового фрагмента

Для проверки важности наличия адамантанового фрагмента в соединении-лидере 1, разработана структура его аналога, не содержащая каркасной группировки (4).

Схема 1. Условия и реагенты: а) ЕЕОСЗ, №дезацетилколхицин, СН2О2, 1К0М„., 17 ч; Ь) БРС, (45,5Л)-3-Вос-2-(4-метоксифенил)-4-фенил-оксазолиден-5-карбоновая кислота, ОМАР, СН2С12,1ком„, 12 ч; с) ТбОН, МеОН, 1К0ЬШ., 2,5 ч.

С целью сохранения расстояния между колхицином и аминокислотой использовали линкер, содержащий 11 метиленовых групп, что дает требуемое увеличение длины перемычки.

Синтез целевой структуры 4 осуществили в три стадии по схеме 1. Сначала ацилированием А-дезацетилколхицина (синтезирован в три стадии по известной методике) 12-гидроксидодекановой кислотой получили амид 2, этерификация которого с (45',5Л)-3-Вос-2-(4-метоксифенил)-4-фенил-оксазоли-ден-5-карбоновой кислотой (полученной в восемь стадий из 5'-(а)-фенил-этиламина) привела к образованию сложного эфира 3. Удаление защитной группы позволило получить целевое соединение 4.

Цитотоксичность вещества 4 изучили1 в стандартном МТТ-тесте на клетках карциномы легких человека А549. Эта величина оказалась сравнима с цитотоксичностью соединения-лидера 1. Однако, по результатам тестов со свободным очищенным тубулином найдено, что способность вызывать образование агрегатов тубулина существенно снижается. Поэтому в ходе дальнейших исследований структура — активность в аналогах соединения 1 был сохранен адамантановый фрагмент.

1.2. Изучение влияния длины линкера в структуре 1

Для изучения роли перемычки в структуре соединения-лидера 1 синтезировали его аналоги с уменьшенным и увеличенным линкером — соединения 10а и 10Ь.

РН О РИ О р| |

А^-У^ОРГ Л Р1орГ ^еор,

5 (27%) 6(46%) Л, 7 (95%) °Н £ "-(б**.

9а п = 3 (93%) «а п=3(48%)

9Ь п = 6 (42%) 10Ь п = 6 (70%)

Схема 2. Условия и реагенты: а) 1. HN03/H2S04> tKOM„. 72ч 2. 30% водн. NaOH; b) DDC, DMAP, (45,5Л)-3-Вос-2-(4-метоксифенил)-4-фенил-оксазолиден-5-карбоновая кислота, tK0„H., 24 ч; c)NaBH4, Et20, 0°C, 10ч; d) DMAP, ангидрид глутаровой (а) или субериновой (b) кислоты, CH2CI2, tKOMH., 24-30ч; е) EEDQ, АЧдезацетилколхицин, CH2Cl2,tKOM„.; £) TsOH, МеОН ^комн., 2,5ч.

' Автор благодарит С.А. Кузнецова (Institut für Zellbiologie und Biosystemtechnik Fachbereich Biowissenschaften, Германия) за проведение биологических испытаний

Оба соединения получены однотипным методом (схема 2) из адамантанола, который сначала окислили до кемантана 5, а затем ввели в реакцию этерификации с (45,5Л)-3-/?греот-бутоксикарбонил-2-(4-метоксифенил)-4-фенил-оксазолиден-5-карбоновой кислотой. Дальнейшее восстановление кетогруппы в соединении 6 боргидридом натрия привело к спирту 7 (в виде смеси цис- и ш/эд//с-изомеров в соотношении 1:2), из которого реакцией с полиангидридами глутаровой и субериновой кислот синтезировали моноэфиры 8а и 8Ь. Амидирование карбоксильной группы в соединениях 8а,b проводили с помощью Л'-дезацетил колхицина в присутствии Л'-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина (EEDQ). Дальнейшее расщепление оксазолидинового фрагмента в соединениях 9а,b привело к целевым структурам с соотношением цис- и транс- изомеров 1:1 (10а) и 3:7 (10Ь).

Результаты тестирования полученных соединений 10а (ЕС™9 = 220 нМ) и 10Ь (ЕС*"* = 2 нМ) показывают, что уменьшение длины линкера критическим образом сказывается на активности. В то же время увеличение длины линкера на одну метиленовую группу существенно усиливает цитотоксичность: соединение 10Ь оказывается на порядок активнее колхицина, и по активности сравнимо с таксолом (ЕС*"9 =4.6 нМ).

Также как и соединение-лидер 1, полученный конъюгат 10Ь проявляет двойственный эффект на сеть микротрубочек: с одной стороны, стимулирует их деполимеризацию (как в случае колхицина), а с другой - вызывает образование длинных кластеров, которые концентрируются около клеточных ядер. Важно, что подобный эффект не обнаруживается при одновременном действии таксола и колхицина на клетки и, следовательно, является специфическим свойством гибридной молекулы.

Таким образом, в ходе первичного изучения соотношения структура -активность для соединения-лидера 1 получена гибридная молекула 10Ь, обладающая очень высокой цитотоксичностью и способностью вызывать усиленную (по сравнению с соединением 1) кластеризацию (агрегацию) тубулина. Продемонстрирована важная роль адамантанового фрагмента для проявления выраженной способности образовать такие кластеры.

2. Синтез колхадама и изучение соотношения структура — активность для его аналогов

Для изучения роли фрагмента «упрощенного» миметика таксола в структуре 1 и, главным образом, аминокислотной цепи, играющей принципиально важную роль во взаимодействии с таксольным сайтом тубулина, синтезировали аналог соединения-лидера 1, не содержащий (2R,3S)-A'-w/ютг-бутоксикарбонил-Р-фенилизосериновой группировки (структура 12).

Двухстадийный синтез соединения 12 включал в себя взаимодействие адамантан-2-ола с полиангидридом пимелиновой кислоты и этерификацию эфира 11 с Л'-дезацет и л ко л х и ц и н о м, которая привела к целевому амиду 12.

jQi

ДА

ОН О X 5 он

11(72%) 12(27%)

Схема 3. Условия и реагенты: a)4-DMAP, CH2CI2, tKO„„., 24 ч; b) EEDQ, N-дезацетилколхицин, CH2CI2, tK0„„., 18 ч.

Результаты биотестирования соединения 12 показали, что его цитоток-сичность очень высока и находится в наномолярном интервале концентраций (£C5f49=6 нМ). При этом агрегирующий эффект превышает таковой для соединения лидера 1 и оказывается аналогичным по силе для соединения 10Ь.

Полученный результат представляет значительный интерес, поскольку означает, что способность промотировать образование тубулиновых агрегатов не зависит от наличия в структуре конъюгатов аминокислотной цепи таксола. Результаты дополнительных испытаний соединения 12 в тестах in vitro показывают, что оно оказывает подобный эффект и на другие опухолевые клетки, например, на клетки HeLa.

Очень высокая цитотоксичнось соединения 12, его необычная способность к образованию тубулиновых кластеров в сочетании с относительно простой структурой по сравнению с соединением 1, явились решающими факторами в.выборе ето.в.качестве.нотого (названного нами

колхадамом) для последующего широкого исследования структура -активность.

2.1. Изучение зависимости цитотоксичности и агрегирующего эффекта

аналогов колхадама от длины линкера

Изначально для колхадама изучили зависимость активности и агрегирующего эффекта от длины перемычки. Для этого была получена серия аналогов структуры-лидера 12 с разным количеством метиленовых групп в линкере (п = 3, 4, 6 и 7).

13а п = 3(40%) 14а п = 3(64%)

13Ь п = 4 (41%) 14Ь п = 4 (92%)

13с п = 6 (41%) 14с п = 6 (32%)

13с) п = 7 (25%) 14с1 п = 7(67%)

Схема 4. Условия и реагенты: а) 4-ОМАР, СН2С12; им„ , 24 - 36 ч; Ь) ББС>0, Ы-дезацетилколхицин, СНгСЬ; 1комн.,12 - 24 ч.

Соединения 14а-с1 получали из адамантан-2-ола из соответствующих ангидридов дикарбоновых кислот в ходе двухстадийного синтеза (схема 4). Во всех случаях промежуточные моноэфиры 13а-Ь получались с невысокими

выходами, что объясняется образованием некоторого количества адамантилового диэфира в качестве побочного продукта.

Данные биотестирования полученных соединений представлены в таблице 1, из которой видно, что максимум цитотоксичности наблюдается для лигандов с линкерами, содержащими пять (12) и шесть (14с) метиленовых групп. Для этих же соединений обнаружена максимальная способность агрегировать клеточный тубулин. Дальнейшее удлинение или уменьшение длины перемычки приводит к значительному снижению и цитотоксичности и агрегирующего эффекта.

Таблица 1. Результаты биотестирования колхадама и его аналогов.

Соединение ЕС50 (нМ) Длина линкера Эффект на клеточный тубулин 1 мкМ

14а 200 ± 62 -(СН2)3- Только деполимеризация

14Ь 830±140 -(СН2)4- Деполимеризация и агрегирующий эффект ++

12 6± 1.4 -(СН2)5- Деполимеризация и агрегирующий эффект +++

14с 5± 1.8 -(СН2)6- Деполимеризация и агрегирующий эффект +++

14(1 3800±630 -(СН2)7- Деполимеризация и агрегирующий эффект +

Интересно отметить, что модификация заместителей по положению С7 колхицина в литературе обычно рассматривается как не оказывающая значительного влияния на активность получающихся аналогов. Однако в серии соединений 14а-й наблюдается четко выраженная зависимость влияния длины этого заместителя как на цитотоксичность, так и на агрегирующий эффект (см. таблицу 1).

2.2. Изучение роли адамантанового фрагмента в структуре колхадама

Для получения целостного представления о вкладе фрагментов молекулы 12 во взаимодействие с тубулином провели изучение роли адамантана в ее структуре. Первым шагом в этом исследовании стало изучение возможности замены адамантана другими группами: циклогексильной, изопропильной, метальной и фенильной (16а-с1).

. о о

и и

А4'

15а (47%) 15Ь (43%) 15с (34%) 15с) (21%)

ОН

16а (51%) 16Ь (39%) 16с (41%) 16(1 (73%) /

сг*х.

V

V

а"

V

Схема 5. Условия и реагенты: а) 4-РМАР, СНгСЬ; 1ко, дезацетилколхицин, СН2С12; 1ком„., 12 - 24 ч.

с (1

24 - 36 ч; Ь)ЕЕО0, ¿V-

Каждый аналог колхадама 16a-d получали согласно схеме 5 в две стадии из соответствующих спиртов, полиангдрида пимелиновой кислоты и Л-дезаце-тилколхицина по методике, разработанной для синтеза соединений 12 и 14a-d.

Результаты биотестирования выявили высокое значение цитотоксичности соединения с циклогексановым (16а, ЕС^49 =4.8нМ) заместителем, а его способность вызывать агрегацию тубулина оказалась близкой (несколько меньшей) таковой для соединения-лидера 12. Цитотоксичность соединений с метальной (16с, ЕС;"4'' =32 нМ) и изопропильной (16Ь, ЕС^"9 =30 нМ) группой практически равна таковой для колхицина, а агрегирующий эффект в небольшой степени сохраняется только для изопропильного аналога. В целом, величина цитотоксичности и агрегирующего эффекта в ряду 12-16а-16с хорошо коррелирует с объемом группировок. Неожиданно низкая цитотоксичность (£С/О549=5700 нМ) наблюдалась для конъюгата 16d с фенильным заместителем, причем это соединение утратило и способность образовывать кластеры тубулина. Таким образом, изучение соотношения длина перемычки — активность свидетельствует о том, что для проявления высокой цитотоксичности и агрегирующего эффекта требуется наличие достаточно объемного и неплоского заместителя в конъюгатах исследуемого типа.

Суммируя результаты биологических испытаний соединения 1, колхадама 12 и их аналогов можно проследить следующую закономерность. Все синтезированные вещества с высокой цитотоксичностью (1, 10Ь, 12, 14с, 16с) обладают при этом сильной способностью образовывать кластеры тубулина. И напротив, соединения, обладающие только деполимеризующим эффектом (14а, 16с), имеют сравнимое с колхицином или меньшее значение цитотоксичности. Это позволяет предположить, что обнаруженная способность (или связанные с ней аспекты взаимодействия с белком-мишенью) являются важным фактором в обеспечении наблюдаемого инкремента митостатической активности и делает интересным выяснение механизма указанного эффекта.

С этой целью в работе был проведен докинг2 в колхициновый сайт связывания, который расположен в р-субъединице тубулинового димера на границе с а-субъединицей. Как видно из рис. 1, если колхициновый фрагмент молекулы 12 находится в колхициновом сайте связывания (отмечен точками) Р-субъединицы, то адамантановый фрагмент располагается в пространстве между двумя субъединицами за счет гидрофобного взаимодействия с остатками Туг224 и Val 177 в а-субъединице, кроме того, атом кислорода перемычки может образовывать водородную связь с гидроксилом Туг224.

Аналогичное молекулярное моделирование было проведено для соединений 16с,d, которые не обладают способностью образовывать кластеры со свободным тубулином. Их расположение в белке отличается от такового для соединения 12 (рис. 1, на примере соединения 16d). Перемычка и фенильная группа экспонированы во внутреннее пространство р-субъединицы белка. Так как соединения 16с,d не вызывают образования кластеров тубулина, то логично предположить, что это свойство может быть связано со способностью

2 Автор выражает благодарность д.х.н. И. И. Баскину за проведение компьютерного докинга.

обеспечивать своего рода «сшивку» а- и (3-субъединиц тубулинового димера за счет взаимодействия адамантанового фрагмента соединения 12 с гидрофобной областью а-субъединицы белка и образование водородной связи с аТуг224 (последнее взаимодействие может быть причиной обнаруженной нами зависимости от длины линкера в ряду 1-10а,Ь и 12-14а,Ь).

Рисунок 1. Расположение соединения 12 (слева) и 16(1 (справа) в димере тубулина.

Таким образом, полученные данные позволяют объяснить найденные нами закономерности структура - активность для соединения 12 и его аналогов, а именно: оптимальную длину перемычки (равную 5-6 метиленовым группам) и необходимость объемной адамантановой группировки в структуре молекулы.

2.3. Изучение влияния позиции присоединения адамантанового

фрагмента в структуре колхадама на цитотоксичность

Для изучения влияния на активность позиции присоединения линкера к адамантану синтезировали соединения 18а,Ь с узловым (по атому С1) присоединением адамантана.

Оба целевых соединения 18а,Ь получали из адамантан-1 -ола и соответствующих ангидридов дикарбоновых кислот согласно схеме 6. В этом случае потребовалось модификация реализованной ранее (схемы 3-4) методики, поскольку в случае адамантан-1-ола скорость протекания реакции этерификации оказалась неудовлетворительной. С целью ускорения протекания реакции её проводили при 80°С без растворителя в расплаве ангидридов. В этом случае процесс протекает селективно, образуются преимущественно моноэфиры 17а,Ь. Целевые амиды 18а,Ь получали по стандартной методике из соответствующих кислот 17а,Ь и тУ-дезацетилколхицина.

Результаты биотестирования полученных амидов 18а,Ь показывают, что конъюгат 18а обладает высокой цитотоксичностью (£С5'0549 = 1 1 нМ) и агрегирующим эффектом, сравнимым с колхадамом, то есть позиция

присоединения линкера к адамантану практически не оказывает влияния на активность.

\

Схема 6. Условия и реагенты: а) 4-ОМАР, 80°С 24 - 36 ч; Ь) ЕЕБСЗ, И-дезацетилколхицин, СНчСЬ; 1комн., 12 - 24 ч;

Интересный результат получен для соединения 18Ь с удлиненной перемычкой, которое оказалось также весьма цитотоксичным (ЕС^49 = 29 нМ). Сравнение этого результата с таковым для аналога с 2-замещенным адамантаном 14с1 при такой же длине линкера показывает, что зависимость от длины цепи в двух сериях различается более чем на два порядка.

С целью выяснения возможной причины такого различия было проведено

Рисунок 2. Расположение структур в колхициновом сайте тубулина. А) 18а В) 12, С) 18Ь, В) Ш.

Докинг структур 18а, 12, 18Ъ и 14<3 в колхициновый сайт тубулина показал, что для молекул с 1-адамантанолом (18а и 18(1) независимо от длины линкера расположение в белке соответствует расположению структуры 12 (рис. 2А-С). С другой стороны, расположение соединения 14(1 в колхициновом сайте отличается (рис. 12Б) от такового для указанных выше соединений 18а-Ь и 12: в этом случае колхициновый фрагмент молекулы находится в области, существенно отдаленной от колхицинового сайта связывания.

Таким образом, результаты биотестирования, также как и результаты компьютерного моделирования, показывают равнозначность положения присоединения перемычки к каркасному фрагменту в случае оптимальной длины линкера (пять метиленовых групп) и существенное отличие в случае более длинного линкера.

2.4. Изучение влияния природы заместителей в адамантане на цитотоксичность

Следующей стадией исследования являлось изучение влияния разнообразных заместителей в адамантане, в том числе, с целью вариаций общей липофильности молекул. Сначала для синтетической реализации была предложена структура 21а, содержащая аминогруппу в адамантановом ядре (протонирование атома азота этой группы должно уменьшать общую липофильность конъюгата и увеличивать его водорастворимость). Выбор аналога с узловым присоединением перемычки к адамантану объясняется в данном случае стремлением избежать образования стереоцентров. Такой выбор обоснован тем, что, как было показано ранее, положение присоединения линкера не оказывает влияния на активность.

Синтез соединения 21а осуществили по схеме 7. Окисление гидрохлорида 1-аминоадамантана привело к 1-амино-адамантан-З-олу.

Схема 7. Условия и реагенты: a) H2S04, 60%-HN03, 10°С; b) Вос20, NEt3, СН2С12, tKOMH., 15 ч; с) 4-DMAP, СН2С12, tKOU„., 30 ч; d) EEDQ, ЛГ-дезацетилколхицин, СН2С12, tKOUH, 48ч; е) 1. TFA, СН2С12, t«„„„., 24ч 2. водн. NaHC03.

Далее, учитывая необходимость проведения последующей реакции амидирования, аминогруппа была защищена. Это позволило этерификацией с полиангидридом пимелиновой кислоты получить кислоту 20, реакцией которой с jV-дезацетилколхицином получили конъюгат 21Ь. Гидролиз трет-бутоксикарбонильной защитной группы в соединении 21Ь привел к целевой структуре 21а. Отметим, что обратный порядок «сборки» молекулы 21а оказался неудачным из-за трудностей присоединения адамантанового фрагмента к А'-(гидроксикарбонилгексаноил)-А?-дезацетилколхицину.

Результаты биотестирования соединения 21а (ЕС*™ =400 нМ) показали многократное уменьшение активности по сравнению с колхадамом. Интересно, что аналог вещества 21а - соединение 21Ь с объемной /гузет-бутильной группировкой - обладает практически равной колхицину цитотоксичностью (£С540549 =29 нМ). Это позволяет предположить, что низкая активность вещества 21а, по-видимому, связана с большей (по сравнению с расчетными данными) степенью его ионизации и, соответственно, с низкой способностью проникать через клеточные мембраны.

Далее была синтезирована серия аналогов колхадама 22с-е, содержащих в адамантановом фрагменте заместители разного объема.

н

21b R = Вое (86%)

21а R = H (90%)

Соединения 22с-е получали из соответствующих спиртов (2-метиладама-нтан-2-ола, А-(3-гидрокси-5,7-диметиладамант-1 -ил)ацетамида и 2-бутилада-мантан-2-ола) и ангидрида пимелиновой кислоты по разработанной ранее для соединений 17а,Ь методике (получение моноэфиров также проводили в расплаве пимелинового ангидрида при 80°С).

22d

о о

Кроме того, было синтезировано соединение 22{ с бицикло[3.3.1]нонановым фрагментом по четырехстадийной схеме 8 из 2-оксагомоадамантан-3-она.

о /

COOH l^^J СООМе | 23(92%) 24(90%) )\У1^СООМе СООМе

25 (63%)

хн о

22f (87%)

Схема 8. Условия и реагенты: а) 1. Na0H/H20 2. водн. HCl; b) BF3xEt20/Me0H, кипячение; с) пимелиновый полиангидрид, 4-DMAP, СН2С12, tK0„„., 48 ч; d) EEDQ, N-дезацетилколхицин, СН2С12, tKOMH., 12 - 24 ч.

Раскрытие лактонного цикла привело к образованию эндо-7-гидрокси-бицикло[3.3.1]нонан-эюо-3-карбоновой кислоты (23), этерификация которой позволила получить эфир 24. Реакцией этого эфира с полиангидридом пимелиновой кислоты получили кислоту 25. Дальнейшее амидирование N-дезацетилколхицином привело к целевой структуре 22f (схема 8).

Значение ЕС50 для соединения 22е равно 10 нМ. Вещества 22с,d,f в настоящее время проходят биологические испытания.

Полученные результаты, в совокупности с данными для высокоактивного аналога 10b с А'-бензоил-Д-фенилизосериновым заместителем в адамантане, показывают допустимость введения очень объемных группировок в различные положения адамантанового ядра рассматриваемых конъюгатов. Это свидетельствует о том, что адамантановая группировка находится в достаточно свободной области белка и косвенно подтверждает выдвинутое предположение о её расположении на границе двух субъединиц тубулина.

3. Изучение возможности замены колхицинового фрагмента в структуре колхадама другими группировками

Завершающий этап настоящей работы был посвящен исследованию возможности замены колхицинового фрагмента другими группами. Такая замена преследовала двоякую цель: с одной стороны, подтвердить предложенный механизм связывания колхадама 12 с белком, а с другой стороны - подобрать фрагмент с меньшей токсичностью, чем колхицин.

3.1. Замена колхицина объемными липофильными группами

Колхициновый фрагмент в молекуле колхадама 12, по всей вероятности, играет ключевую роль в обеспечении его цитотоксических свойств. Для подтверждения этого предположения синтезировали аналоги колхадама, в которых колхициновый фрагмент заменен более простыми объемными группировками. Учитывая возможное влияние на активность длины и природы линкера, были получены соединения с линкером разной длины (вещества 26а,Ь) и с разным типом связи: сложноэфирной и амидной (соединение 27).

н

26а п = 5 27

26Ь п=6

Для получения этих соединений в реакции этерификации полиангидридов дикарбоновых кислот с адамантан-2-олом помимо моноэфиров 11 и 13с специально выделили в индивидуальном виде соединения 26а,Ь. Кроме того, реакция кислоты 11 с циклогексиламином позволила получить целевое соединение 27.

Отсутствие цитотоксических свойств для соединений 26а,Ь и 27 подтвердило определяющую роль колхицина в связывании колхадама с тубулином.

В дальнейшем мы предприняли попытки замены колхицина в структуре соединения-лидера 12 другими лигандами данного сайта связывания. При их выборе учитывались, во-первых, доступность этих соединений, а, во-вторых, наличие удобной в синтетическом плане группы для присоединения перемычки с каркасной группировкой.

3.2. Попытка замены колхицинового фрагмента нокодазолом

Одним из эффективных лигандов колхицинового сайта тубулина является нокодазол. Сравнение расположения молекул колхицина и нокодазола в области связывания с тубулином, показывает, что наиболее удобной позицией присоединения линкера является атом азота имидазольного цикла нокодазола. На основании этих данных, для синтетической реализации нами были предложены коньюгаты 28а,Ь (рис. 3).

Для синтеза целевых соединений 28а,Ь исходные моноэфиры 11 и 13с ввели в реакцию с дифенилазидофосфатом (схема 8), что позволило получить соответствующие изоцианаты 29а,Ь.

28а п = 5 28 Ь п = 6

Рисунок 3. Расположение молекул колхицина и нокодазола в области связывания колхицина с тубулином (слева; атомы азота показаны темным цветом); структуры предложенных конъюгатов (справа).

Далее мы показали, что реакция изоцианата 29а с модельным соединением — бензимидазолом — протекает при комнатной температуре с высоким выходом.

1 ] п Ч>

28а

11

13с " ' "

29а п = 5 (97%) 28Ь

29Ь п = 6 (95%)

Схема 9. Условия и реагенты: а) (РЮ)2Р(0)^, ШзМ, толуол; Ь) бензимидазол, 29а, СН2С12 ? ^КОМН. ; с) нокодазол, СН2С12, ^омн.

Попытки проведения аналогичной реакции с нокодазолом, однако, не увенчались успехом: независимо от вариаций температуры и растворителя (СН2С12, ДМСО и др.) из реакционной смеси выделили только исходный нокодазол. Отметим, что к такому же результату привели и попытки /V-ацилирования нокодазола с помощью хлорангидрида кислоты 11, а также с помощью самой кислоты 11 в присутствии различных амидирующих реагентов. При этом реакция с бензимидазолом протекает гладко и приводит к соединению 31с выходом 97%.

31(97%) N5=/

Схема 10. Условия и реагенты: а) бензимидазол, ЕЕБ<3, СН2С12

Конъюгаты 30 и 31 были протестированы на противоопухолевую активность, которое показало резкое падение цитотоксичности этих веществ (ЕС5о>10 цМ) по сравнению с колхадамом.

3.3. Замена колхицинового фрагмента комбретастатином и его аналогами

Поскольку комбретастатин является относительно простым аналогом колхицина, и, что особенно интересно, обладает меньшей токсичностью, мы предприняли попытку синтеза аналогов колхадама, в котором колхицин заменен комбретастатиновым фрагментом.

Рисунок 4. Наложение структур колхицина и комбретастатина А4.

Из наложения структур колхицина и комбретастатина А4 (рис. 4) видно, что амидная группа колхицина находится на примерно равном расстоянии от двойной связи комбретастатина (2.75 А до С8 и 3.45 А до С7). Поэтому были предложены несколько вариантов комбретастатиновых конъюгатов, строение которых схематично представлено на рисунке 4.

Известно, что введение кето-, и амидной группы в положение при атоме С7 не уменьшает высокую активность производных комбретастатина. Учитывая это обстоятельство, а также тот факт, что перемычка с амидной связью позволит сохранить амидную группировку в положении, соответствующем таковому в колхадаме, нами были получены аналоги колхадама 32а,Ь. При этом соединение 32Ь являлось целевым, а 32а использовалось в качестве модельного для отработки методов синтеза.

Исходные кислоты получали по реакции Перкина из З-гидрокси-4-метоксибензальдегида и 3,4-диметоксифенилуксусной кислоты в случае 33а или 3,4,5-триметоксифенилуксусной кислоты в случае ЗЗЬ. Важно отметить, что данная методика позволяет получить почти исключительно А'-изомер.

Далее синтез целевых соединений 32а-Ь проводили согласно схеме 11. На первой стадии синтезировали монозащищенный Л'-Вос-этилендиамин 34. Далее из амина 34 и полиангидрида пимелиновой кислоты получили амид 35.

H.N

NH,

Boc^^NH,

н

Вое

36 (21%)

34(85%)

и и

(— N" NH, Н

U и

он

35 (53%)

е . 32а R = Н (52%) 32Ь R=OMe (16%)

37 (95%)

Схема 11. Условия и реагенты: а) Вос20, СН2С12;Ь) пимелиновый полиангидрид, СН2С12, tKO„„.; с) адамантан-2-ол, DCC, 4-DMAP, СН2С12, tKOMH.; d) TFA, СН2С12, tKOMH.; е) EEDQ, ЗЗа/ЗЗЬ, СН2С12, tKOMH,

Затем соединение 35 ввели в реакцию этерификации с адамантан-2-олом с образованием сложного эфира 36. Из свободного амина 37 (полученного гидролизом защитной группы) и кислоты 33а согласно схеме 11 получили амид 32а. Соединение 32Ь было синтезировано аналогично 32а, но на последней стадии вместо кислоты 33а использовали кислоту ЗЗЬ.

Испытания in vitro, проведенные для соединения 32а, показали, что оно не проявляет цитотоксических свойств (что, скорее всего, является следствием отсутствия важного фармакофорного элемента структуры - 5-метоксигруппы). Аналог 32Ь, содержащий метоксигруппу в положении при С5, проявляет большую цитотоксичность {ЕС£49 =4.8 мкМ).

он

38а п = 5 38Ь п = 6 38с п = 7

ОН

Предположив, что уменьшение активности комбретастатиновых конъюгатов по сравнению с соединением-лидером 12 является следствием недостаточной гибкости перемычки в соединениях 32а,Ь из-за наличия в ней двух амидных и одной сложноэфирной связи, мы предложили для последующего синтеза структуры 38а-1" с более гибким линкером различной длины.

Все соединения 38а-1" получали по однотипным схемам (см. схемы 12 и 13). Имея в виду последующее восстановление карбонильной группы в ЗЗЬ,с синтезировали метиловые эфиры акриловых кислот 39а,Ь. С целью последующего направленного введения линкера фенольный гидроксил в соединениях 56а,Ь защитили с помощью ТВ1)М8-группы.

,41а 1*1 = СН2ОН 1*2 = ОТВОМЭ (74%)

Схема 12. Условия и реагенты: а) Гл3Ы, (СН3С0)20, кипячение; Ь) МеОН, Н2Я04; с) ТВОМ8С1, ДМФА, имидазол, 1кои„ с!) 1ЛА1Н4, ТГФ; е) 11 или 13с или Ш, ОСС, ОМАР, и»к. 1) ППи, CHзCN-H20,1комн.

Восстановление карбоксильной группы соединений 40а,Ь проводили по стандартной методике с 1лА1Н4 в ТГФ. Полученные вещества, по данным спектров ЯМР *Н и 13С, являются ¿'-изомерами.

38с1 (75%) 38е (84%) 38Г(86%)

I— 39Ь 1*1 = СООМе Н2 = ОН (92%) ¿=>" 40Ь Я1 = СООМе Я2 = ОТВОМв (98%)

1-1« 41Ь = СН2ОН 1*2 = ОТВОМЭ (81%)

Схема 13. Условия и реагенты: а) МеОН, Н2804; Ь) ТШ)М8С1, ДМФА, имидазол, 1комн. с) 1лА1Н4, ТГФ; с1) 11 или 13с или 13(1, ОСС, ОМАР, ц„,„, е) ОВи, СН3СМ-Н20, иМ11.

Сборку гибридных молекул осуществляли по реакции этерификации между защищенными спиртами 41а,Ь и ранее полученными сложными моноэфирами 11, 13с-с1. Последующее удаление защитной группы привело к целевым конъюгатам 38а-Г

Таблица 2. Результаты биотестирования соединений 38а-£

Соединение Линкер ЕС5о (мкМ) Соединение Линкер ЕС50 (мкМ)

38а -(СН2)5- 1.3 ±0.3 38Ь -(СН2)6- 1.4 ±0.3 38с -(СН2)7- 1.6 ±0.3 38с1 -(СН2)5- 0.829 ±0.021 38е -(СН2)6- >10 38Г -(СН2)7- 1.4 ±0.23

Результаты биотестирования полученных производных комбретастатина представлены в таблице 2. Все соединения (за исключением 38е) с более гибкой

перемычкой оказались в несколько раз активней, чем их аналоги 32а,Ь, что говорит о правильности выбранного нами направления модификации.

Анализ соотношений структура — активность в полученных рядах конъюгатов позволяют заключить следующее. Для конъюгатов с присоединением перемычки через атом С8 комбретастатина (соединения 38а-с), практически не наблюдается зависимости активности от длины линкера. Для структур с присоединением через атом С7 (соединения 38(1-1) существует некоторая зависимость цитотоксических свойств от длины линкера: лучшее значение цитотоксичности наблюдается для конъюгата 38(1 с перемычкой, содержащей пять метиленовых групп. При этом абсолютные значения цитотоксичности рассматриваемых соединений невелики. Также важно отметить, что ни один из полученных комбретастатиновых конъюгатов, даже самый активный (38(1), не обладает обнаруженной для соединения-лидера 12 способностью вызывать агрегацию клеточного тубулина.

3.4. Попытки замены колхицинового фрагмента упрощенными

аналогами метоксиэстрадиола

Другим возможным кандидатом для замены колхицинового фрагмента колхадама является 2-метоксиэстрадиол 43. Это соединение выделяется среди лигандов колхицинового сайта тубулина сочетанием ряда важнейших свойств: низкой токсичностью и действием на широкий спектр опухолей. Учитывая эти факты, мы провели пробные эксперименты по синтезу конъюгатов адамантана с 2-метокси-эстрадиолом с присоединением по положению при С6 стероидного фрагмента, однако при этом выявили существенные синтетические сложности. В связи с этим, учитывая привлекательные биологические свойства 2-метоксиэстрадиола, нами стала разрабатываться идея о возможности замены его структуры более простыми и устойчивыми аналогами.

С помощью метода компьютерного молекулярного моделирования для соединений общей формулы 44, полученных последовательным упрощением структуры 2-метоксиэстрадиола в сайте связывания колхицина, была предсказана способность весьма эффективно взаимодействовать с этой областью тубулина. Хорошее связывание с белком (близкое к таковому для исходного стероида) предсказано для структуры 44а. Поскольку базовый скелет структуры 44а, по нашим предварительным предположениям, мог быть легко сформирован с помощью реакции Дильса - Альдера, мы попытались реализовать соответствующую схему превращений.

он

43

СООЕ1

о — СООЕ1

чр{ 44а 1*1 = 1*2 = Н

44Ь 1*1,1*2= =0

Схема 14. Схема построения мостиковых структур 44 с помощью реакции Дильса-Альдера

Требуемый диенофил 45 синтезировали из эн<)о-гидроксикислоты 23 (схема 15)3. Реакцию Дильса-Альдера для соединения 45 провели с 2,3-бис(триметилсилилокси)-бутадиеном-1,3 в стандартных условиях: длительным нагреванием в запаянной ампуле в толуоле при 150°С или в бензоле в присутствии кислоты Льюиса (БпСЦ). Однако в результате был выделен только исходный диенофил и продукт полимеризации диена.

Далее с помощью молекулярного моделирования была показана возможность введения карбонила в положение при С6 (модельная структура 44Ь) с сохранением активности. Это дало основание для проведения активации диенофила 45.

Введение карбонильной группы провели в две стадии: окислением оксидом селена до соответствующего гидроксиэфира 46, а затем - окислением соединения 46 до кетоэфира 47 действием оксида марганца в хлористом метилене (схема 15).

СООЕ1 СООЕ1

ОН "о

23 45(67%) 46(61%) 47(86%)

Схема 15. Условия и реагенты: а) ВР3хЕ120/ЕЮН, бензол; Ь) Яе02/диоксан-вода; с) Мп02, СН2С12.

Активированный диенофил 47 ввели в реакцию Дильса-Альдера как с 2,3-бис(триметилсилилокси)-бутадиеном-1,3, так и с 2,3-(диметокси)-бутадиеном-1,3 в следующих условиях: а) в бензоле при нагревании; б) в запаянной ампуле без растворителя при нагревании до 200 °С; в) при нагревании в толуоле со БпСЦ; г) в насыщенном растворе перхлората лития в диэтиловом эфире. Однако ни в одном случае в реакционной смеси не было обнаружено продукта присоединения.

Аналогичную реакцию провели для эндо-изомера 51, который, в отличие от диенофила 47, принимает более выгодную для реакции диенового синтеза конформацию кресло-ванна (получен из адмантан-2-она по схеме 16).

Однако в реакции соединения 51 с 2,3-бис(триметилсилилокси)-бутадиеном-1,3 или с 2,3-(диметокси)-бутадиеном-1,3 в указанных выше

3 В структурах на схемах показано взаимное расположение заместителей в мостиковом фрагменте, а

не их абсолютная конфигурация, все соединения выделены в виде смесей энантиомеров.

условиях искомого продукта циклизации выделить не удалось. Только в реакции 51 с циклопентадиеном, проведенной с целью изучения принципиальной возможности диенового синтеза для рассматриваемых диенофилов, был выделен продукт циклоприсоединения (52).

СООН СООЕ1 СООЕ1 СООЕ1 СООЕ1

48(63%) 49(70%) 50(78%) 51(37%) 52(39%)

Схема 16. Условия и реагенты: a) l.NaN3,CH3S03H, 0°С 2. NaOH, Н20 3. НС1 (конц); b) 1. CDI, СН2С12 2. ЕЮН; с) SeCh/диоксан-вода; d) Мп02, СН2С12, 0°С; е) циклопентадиен, А1С1з, бензол, кипячение.

В целом, результаты данного исследования демонстрируют сложности синтеза структур 44а,b с помощью реакции Дильса-Альдера и требуют дополнительного моделирования других аналогов 2-метоксиэстрадиола, более доступных для синтетической реализации.

3.5. Замена колхицинового фрагмента подофиллотоксином и его

аналогами

Ещё одной предпринятой нами попыткой модификации колхициновой группировки в структуре колхадама стала замена её подофиллотоксином. Это природное соединение так же, как и колхицин, относится к лигандам колхицинового сайта тубулина. Удобным положением в подофиллотоксине для присоединения каркасного фрагмента, соединенного с линкером, является гидроксильная группа. Компьютерное наложение показывает, что ее расположение близко к амидной группировке колхицина.

Схема 17. Условия и реагенты: а) ОСС, 4-БМАР, СН2С12,1комн.

Для синтеза были выбраны соединения 53а-с с перемычкой, содержащей как пять метиленовых групп (аналогично колхадаму), так и удлинённой и укороченной на одну метиленовую группу (аналогично соединениям 14с и 14Ь).

Синтез конечных структур проводили из полученных ранее моноэфиров 11, 13Ь и 13с, которые ввели в реакцию этерификации по кислотной группе с подофиллотоксином в присутствии ОСС и 4-БМАР (схема 17).

Результаты биотестирования конъюгатов 53а-с показали значительное отличие их активностей: цитотоксичность соединений 53Ь,с лежит в наномолярном диапазоне концентраций (ЕС^Ю =505 и 498 нМ соответственно), тогда как соединение 53а оказалось не цитотоксичным (ЕС^49 > 10 мкМ).

Рисунок 5. Докинг структуры 53а в колхициновый сайт тубулина.

Последний результат оказался неожиданным, и мы провели докинг этого соединения в колхициновую область связывания тубулина. Как видно из рисунка 6, перемычка и адамантановый фрагмент структуры не попадают в область между а- и (3-субъединицами тубулина (как предполагается для колхадама 12), а оказываются экспонированными в р-субъединицу белка. Вероятно, такое расположение является результатом неоптимальной длины линкера (как в случае соединения 14(1), что подтверждает заметная цитотоксичность соединений 53Ь,с.

Обнадеживающим фактом является то обстоятельство, что цитотоксичность соединений 53Ь,с является самой высокой среди всех соединений, изученных в ходе работ по замене колхицина в молекуле колхадама. Более того, эти два конъюгата проявили слабый агрегирующий эффект (характерный для колхадама) на микротубулярную сеть.

Итак, только на примере конъюгатов с подофиллотоксином нам удалось частично воспроизвести наблюдаемый для колхадама необычный эффект на микротрубочки. Важно, что, как и в случае с аналогами соединения-лидера 12, появление агрегирующего (кластеризующего) эффекта коррелирует с увеличением цитотоксичности. Действительно, конъюгаты подофиллотоксина с адамантаном оказались наиболее цитотоксичными в ряду всех изученных нами соединений в рамках работ по замене колхицина в структуре колхадама. Полученные данные позволяют сделать достаточно обоснованный вывод об универсальности кластеризующего эффекта, который, по-видимому, является свойством определенным образом модифицированных лигандов колхицинового сайта белка тубулина.

В целом, в данной работе проведено обстоятельное изучение структура — активность для двух серий соединений, одна из которых представляет собой гибридные молекулы, объединяющие фрагмент колхицина и упрощенный миметик таксола, а другая - конъюгаты типа «колхицин-перемычка-адамантан». Несколько полученных соединений (10Ь, 12, 14с, 16а, 18а, 22е) являются на порядок более активными, чем колхицин и сравнимы по силе цитотоксического эффекта с таксолом. При этом указанные соединения обладают выраженной способностью не только вызывать деполимеризацию микротрубочек, но и стимулируют образование необычных кластеров тубулина. На многочисленных примерах показано, что сила агрегирующего (кластеризующего) эффекта коррелирует с цитотоксичностью полученных соединений. Этот результат открывает широкие перспективы для модификации лигандов колхицинового сайта тубулина с целью увеличения их цитотоксичности.

ВЫВОДЫ:

1. Осуществлен направленный синтез серии гибридных соединений, объединяющих структуру противоопухолевого вещества колхицина и адаман-тил (2Я,35)-Аг-(яг^еш-бутоксикарбонил)-Р-фенилизосериата. В ходе изучения зависимостей структура — активность для этой серии показано влияние длины линкера и присутствия адамантанового фрагмента на цитотоксичность. Обнаружен важный факт — возможность удаления аминокислотной группировки без потери активности.

2. Для выявленного нового соединения-лидера - А'-(7-адамант-2-илокси-7-оксогептаноил)-Л^-дезацетилколхицина (колхадама) - проведено обстоятельное изучение соотношений структура — активность, в ходе которого:

а) найдена оптимальная длина линкера (5-6 метиленовых групп);

б) обнаружено уменьшение цитотоксичности при замене адамантана небольшими алкильными и фенильньным заместителями и сохранение её при замене циклогексильным фрагментом;

в) доказана равнозначность позиции присоединения линкера к адамантану;

г) показана допустимость введения объемных заместителей в адамантан.

3. Изучена возможность замены колхицинового фрагмента в молекуле колхадама, в ходе которой:

а) продемонстрирована полная потеря активности при замене адамантано-вой, циклогексановой и бензимидазольной группировками;

б) выявлены синтетические сложности замены 2-метоксиэстрадиолом и его миметиком с трицикло[7.3.1.02'7]тридек-4-еновым скелетом, предложенным с помощью метода компьютерного молекулярного моделирования;

в) синтезированы серии веществ с комбретастатиновым и подофиллотокси-новым фрагментами, исследованы зависимости их активности от длины и типа линкеров и выявлены три соединения с цитотоксичностью менее 1 мкМ.

4. В результате направленного синтеза (63 новых соединения; протестировано 32) получено девять веществ с высоким значением цитотоксичности (ЕС5о <50 нМ) по отношению к клеткам карциномы легких человека А549. Для нескольких синтезированных соединений показан

необычный механизм действия, а именно, способность вызывать деполимеризацию микротрубочек с последующим образованием кластеров из свободного тубулина. Выявлена корреляция кластеризующего эффекта с увеличением цитотоксичности и сделано предположение о его универсальности. На основе компьютерного молекулярного моделирования предложен возможный механизм возникновения этого эффекта.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Е.В.Нуриева, А.А. Белоглазкина, Д.В. Шишов, В.В. Гоголь, Я.С. Глазкова, Б. Вобит, Н.С. Зефиров, С.А. Кузнецов, О.Н. Зефирова. Синтез и биотестирование конъюгатов бензимидазола с адамантаном. Вести. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. 2013, 54 (1), 45^48.

2. O.N. Zefirova, E.V. Nurieva, D.V. Shishov, I.I. Baskin, F. Fuchs, H. Lemcke, F. Schroder, D.G. Weiss, N.S. Zefirov, S.A. Kuznetsov. Synthesis and SAR requirements of adamantane - colchicine conjugates with both microtubule depolymerizing and tubulin clustering activities. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 2011, 19, 5529-5538.

3. E.B. Нуриева, И.С. Семенова, B.H. Нуриев, Д.В. Шишов, И.И. Баскин, О.Н. Зефирова, and Н.С. Зефиров. Реакция Дильса-Альдера как подход к синтезу бицикло[3.3.1]нонановых аналогов колхицина. Журнал органической химии, 46(12): 1877-1880, 2010.

4. O.N. Zefirova, E.V. Nurieva, Н. Lemcke, А.А. Ivanov, D.V. Shishov, D.G. Weiss, S.A. Kuznetsov, N. S. Zefirov. Design, synthesis and bioactivity of putative tubulin ligands with adamantane core. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 2008, 18, 5091-5094.

5. M.B. Кирюхин, E.B. Нуриева, Д.В. Шишов, О.Н. Зефирова, B.H. Нуриев, Н.В. Зык, Н.С. Зефиров. Синтез производных адамантана и бицикло[3.3.1]нонана с оксетановым фрагментом. Вестн. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. 2007, 62 (5), 342-346.

6. О.Н. Зефирова, Е.В. Нуриева, Д.В. Шишов, Ф. Фуч, X. Лемке, Ф. Шредер, Н.В. Зык, И.И. Баскин, Н. С. Зефиров, С.А. Кузнецов. Гибридные структуры с необычной активностью по отношению к микротрубочкам и белку тубулину. Тезисы докладов XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Волгоград, ВолГТУ, 2011. С. 513.

7. Д.В. Шишов, Е.В. Нуриева, И.С. Семенова, И.И. Баскин, О.Н. Зефирова Синтетические подходы к бицикло[3.3.1]нонановым аналогам колхицина «Advanced Science in Organic Chemistry» (ASOC-Crimea 2010), Miskhor -Ukraine, 2010, C-249

8. О.Н. Зефирова, E.B. Нуриева, Д.В. Шишов, X. Лемке, Н.В. Зык, И.И. Баскин, В.А. Палюлин, Н. С. Зефиров, С.А. Кузнецов. Дизайн противоопухолевых веществ на основе каркасных фрагментов. Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и Медицина». Уфа, «Гилем», Апрель 6-8, 2010. С. 171-172.

9. О.Н. Зефирова, E.B. Нуриева, Д.В. Шишов, Т.Ю. Баранова, И.С. Семенова, И.С. Рагузин, Н.В. Зык, Н.С. Зефиров. Возможности использования би- и трициклических каркасов при создании физиологически активных веществ. Тезисы докладов Международной конференции «Основные тенденции развития химии в начале ХХ1-го века», Санкт-Петербург, Апрель 24-29, 2009. С. 363-364. Ю.О.Н.Зефирова, Е.В. Нуриева, Д.В. Шишов, Ю.М.Румянцева, Н.С.Зефиров. Создание веществ с противоопухолевой активностью на основе каркасных структур. «Химия и общество. Грани взаимодействия». Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 80-летию Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, Ноябрь 25-27, 2009. С. 73.

11.О.Н. Зефирова, Е.В. Нуриева, Д.В. Шишов, Т.Ю. Баранова, Н.В. Аверина, Н.В. Зык, Н.С. Зефиров. Различные аспекты использования каркасных фрагментов в структурном дизайне физиологически активных веществ. Тезисы докладов Международной конференции «Органическая химия для медицины». Черноголовка, Сентябрь 7-11, 2008. С 97. 12.О.Н. Зефирова, Е.В. Нуриева, Д.В. Шишов, Н.В. Зык, Н.С.Зефиров. Синтез и биологическое тестирование «упрощенного» аналога колхитакселя. Тезисы докладов V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ». Уфа, Июнь 8-12, 2008. С. 128.

Подписано в печать. 24.02.2013 Формат А4 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 130экз. Заказ № 0166 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39

1 Введение.

2 Обзор литературы.

2.1 Тубулин как мишень действия противоопухолевых препаратов.

2.2 Колхициновый сайт связывания тубулина и его лиганды.

2.2.1 Фармакофорная модель колхицинового сайта.

2.2.2 Обзор лигандов колхицинового сайта.

2.2.2.1 Колхицин и его производные.

2.2.2.2 Производные колхицин по атому азота при С1.

2.2.2.3 Комбретастатин и его аналоги.

2.2.2.4 Подофиллотоксин и его аналоги.

2.2.2.5 2-Метоксиэстрадиол и его аналоги.

2.2.2.6 Нокодазол и его аналоги.

2.3 Двойные лиганды тубулина на основе колхицина: структурные особенности и методы синтеза.

2.4 Соединения со смешанным механизмом действия на белок тубулин.

3 Обсуждение результатов.

3.1 Синтез и изучение соотношения структура — активность для производных «упрощенного аналога колхитакселя».

3.1.1 Синтез и биотестирование аналога соединения-лидера (1) без адаманового фрагмента.

3.1.2 Изучение влияния длины линкера в структуре 1.

3.2 Синтез колхадама и изучение соотношения структура - активность для его аналогов.

3.2.1 Изучение зависимости цитотоксичности и агрегирующего эффекта аналогов колхадама от длины линкера.

3.2.2 Изучение роли адамантанового фрагмента в структуре колхадама.

3.2.3 Изучение влияния позиции присоединения адамантанового фрагмента в структуре колхадама на цитотоксичность.

3.2.4 Изучение влияния природы заместителей в адамантане на цитотоксичность

3.3 Изучение возможности замены колхицинового фрагмента в структуре колхадама другими группировками.

3.3.1 Замена колхицина объемными липофильными группами.

3.3.2 Попытка замены колхицинового фрагмента нокодазолом.

3.3.3 Замена колхицинового фрагмента комбретастатином и его аналогами.

3.3.4 Попытки замены колхицинового фрагмента упрощенными аналогами метоксиэстрадиола.

3.3.5 Замена колхицинового фрагмента подофиллотоксином и его аналогами.

4 Экспериметальная часть.

4.1 Принятые сокращение.

4.2 Общие сведения.

4.3 Описание эксперимента.

4.3.1 Общие методики и синтез реагентов.

4.3.2 Синтез реагентов.

4.3.3 Синтез ^,5Д)-5-даре/и-бутоксикарбонил-2-(4-метоксифенил)-4-фенил-оксазолиден-5-карбоновой кислоты.

4.3.4 Синтез ЛЧцезацетилколхицина.

4.3.5 Синтез ангидридов кислот.

4.3.6 Синтез соединения 2.

4.3.7 Синтез соединений 23а-Ь.

4.3.8 Синтез колхадама.

4.3.9 Синтез соединений 26а-<1.

4.3.10 Синтез соединений 28а-<1.

4.3.11 Синтез соединений 31а, Ь.

4.3.12 Синтез соединения 32а.

4.3.13 Синтеза соединений 32с-е.

4.3.14 Синтез соединения 32£.

4.3.15 Синтез соединений 41-43.

4.3.16 Синтез соединений 47-48.

4.3.17 Синтез произодных комбретостатина.

4.3.18 Попытки синтеза соединений 60а-Ь.

4.3.19 Синтез соединений 69а-с.

4.4 Молекулярное моделирование.

4.5 Биотестирование.

5 Литература.

Онкологические заболевания занимают одно из первых мест по уровню смертности, и являются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Поиск новых, эффективных и малотоксичных соединений, обладающих противоопухолевой активностью, является одним из важных направлений современной медицинской химии.

Процесс возникновения злокачественных опухолей включает в себя неконтролируемое деление клеток, поэтому большинство химиотерапевтических препаратов, известных к настоящему моменту, действуют на стадию митоза. Одной из молекулярных мишеней в человеческом организме является клеточный белок тубулин и построенные из него микротрубочки. Такие соединения, как таксол, винбластин и колхицин, а также их многочисленные аналоги, ингибируют митоз путем связывания с различными областями тубулина и запуска либо ингибирования процесса сборки микротрубочек (колхицин, алкалоиды барвинка), либо неконтролируемой полимеризации тубулина (таксаны: таксол, таксотер). Таксаны, благодаря высокой эффективности, широко используются при наиболее распространенных злокачественных новообразованиях, несмотря на сложности их получения полусинтетическим путем и высокую стоимость. Более доступный колхицин и его аналоги, обладающие существенно более простой структурой, оказываются слишком токсичными для клинического использования. Данные обстоятельства стимулируют как изучение возможности создания упрощенных миметиков таксола, так и попытки самых разнообразных структурных вариаций колхицина и его аналогов, направленных на получение более активных и менее токсичных соединений.

Вариантом подобных модификаций является создание гибридных конъюгатов, объединяющих в одной молекуле фрагменты, способные к взаимодействию с различными областями тубулина. Это направление интенсивно развивается в последнее десятилетие. Настоящая работа лежит в русле таких исследований, и её основной целью стал направленный синтез «двойных» соединений на основе колхицина и упрощенных миметиков таксола и обстоятельное изучение для них зависимостей структура -антипролиферативная активность.

2 Обзор литературы

В литературном обзоре описаны основные соотношения структура - активность для классических лигандов колхицинового сайта белка тубулина. Проанализированы необычные эффекты на тубулин и микротрубочки, вызванные действием некоторых соединений. Систематизирована информация по созданию «двойных» (гибридных) лигандов тубулина с колхициновым фрагментом.

1. Guenard, D., Gueritte-Voegelein, F., Potier, P.: Taxol and taxotere: discovery, chemistry, and structure-activity relationships. Acc. Chem. Res. 26, 160-167 (1993)

2. Kingston, D.G.I.: Taxol, a molecule for all seasons. Chemical Communications. 867-880 (2001)

3. Wall, M.E., Wani, M.C.: Camptothecin and taxol: from discovery to clinic. Journal of Ethnopharmacology. 51, 239-254 (1996)

4. Stanton, R.A., Geraert, K.M., Nettles, J.H., Aneja, R.: Drugs that target dynamic microtubules: a new molecular perspective. Medicinal Research Reviews. 31,443-81 (2011)

5. Ranaivoson, F.M., Gigant, B., Berritt, S., Joullié, M., Knossow, M.: Structural plasticity of tubulin assembly probed by vinca-domain ligands. Acta Crystallographica. Section D, Biological crystallography. 68, 927-34 (2012)

6. Schiff, P.B., Fant, J., Horwitz, S.B.: Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277, 665-667 (1979)

7. Islam, M.N., Iskander, M.N.: Microtubulin binding sites as target for developing anticancer agents. Mini-Rev. Med. Chem. 4, 1077-104 (2004)

8. Gigant, B., Wang, C., Ravelli, R.B.G., Roussi, F., Steinmetz, M.O., Curmi, P.A., Sobel, A., Knossow, M.: Structural basis for the regulation of tubulin by vinblastine. Nature. 435, 519-22 (2005)

9. Sackett, D.L., Sept, D.: Protein-protein interactions: making drug design second nature. Nature Chemistry. 1, 596-7 (2009)

10. Pellegrini, F., Budman, D.R., R Budman, D.: Review: Tubulin Function, Action of Antitubulin Drugs, and New Drug Development. Cancer investigation. 23, 264-73 (2005)

11. Ganem, B., Franke, R.R.: Paclitaxel from primary taxanes: a perspective on creative invention in organozirconium chemistry. J. Org. Chem. 72, 3981-7 (2007)

12. Breen, E.C., Walsh, J.J.: Tubulin-targeting agents in hybrid drugs. Curr. Med. Chem. 17, 609-39 (2010)

13. Ravelli, R.B.G., Gigant, В., Curmi, P.A., Jourdain, I., Lachkar, S., Sobel, A., Knossow, M.: Insight into tubulin regulation from a complex with colchicine and a stathmin-like domain. Nature. 428, 198-202 (2004)

14. Dorléans, A., Gigant, В., Ravelli, R.B.G., Mailliet, P., Mikol, V., Knossow, M.: Variations in the colchicine-binding domain provide insight into the structural switch of tubulin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13775-9 (2009)

15. Зефирова, O.H., Дийков, А.Г., Зык, H.B., Зефиров, Н.С.: Лиганды колхицинового сайта тубулина: фармакофорная модель и новые структурные классы. Известия РАН. Серия хим. 655-663 (2007)

16. Bhattacharyya, В., Panda, D., Gupta, S., Banerjee, M.: Anti-mitotic activity of colchicine and the structural basis for its interaction with tubulin. Medicinal Research Reviews. 28, 155-83 (2008)

17. Chen, J., Liu, Т., Dong, X., Hu, Y.: Recent development and SAR analysis of colchicine binding site inhibitors. Mini-Rev. Med. Chem. 9, 1174-90 (2009)

18. Li, Q., Sham, H.L.: Discovery and development of antimitotic agents that inhibit tubulin polymerisation for the treatment of cancer. Expert Opin. Ther. Pat. 12, 1663-1702 (2002)

19. Prinz, H.: Recent advances in the field of tubulin polymerization inhibitors. Expert review of anticancer therapy. 2, 695-708 (2002)27.