Определение аминокислот и их оптических изомеров методом двумерной ВЭЖХ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

005008088

На правах рукописи

Натыкан Алексей Андреевич

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ И ИХ ОПТИЧЕСКИХ ИЗОМЕРОВ МЕТОДОМ ДВУМЕРНОЙ ВЭЖХ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2011

005008088

Работа выполнена в лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

НаучныП руководитель: член-корреспондент РАН, профессор Шпигун

Олег Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Курганов Александр Александрович, Институт нефтехимического синтеза имени. А.В.Топчиева РАН

кандидат химических наук, Кузнецов Михаил Александрович, ЗАО «БиоХимМак СТ»

Ведущая организация:

Воронежский государственный университет

Защита состоится 7 декабря 2011 года в 15 ч. 00 мин. в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы д.1, стр.3, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 2 ноября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Определение аминокислот в пищевых продуктах и фармацевтических препаратах, безусловно, является актуальной задачей аналитической химии, благодаря их огромной важности в жизни человека.

Особенное значение имеет определение 1>изомеров аминокислот как в пищевых продуктах и медицинских препаратах, так и в живой материи. Функции Р-амииокислот в физиологических процессах, их влияние на здоровье человека изучено мало, но исследования последних десятилетий убедительно показывают значимую роль этих соединений в качестве тонких регуляторов обмена веществ.

Аминокислоты обычно определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Существует прямой метод определения аминокислот и их оптических изомеров на хиральных неподвижных фазах и метод определения дериватизированных аминокислот, используемый для анализа сложных объектов. В качестве модифицирующего реагента часто используется о-фталевый альдегид (ОФА) совместно с различными нуклеофильными реагентами. Дериватизация с этим реагентом происходит за 3-5 минут, образующиеся производные легко определяются методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектором.

Хроматографическое поведение ОФА производных хорошо изучено в обращенно-фазовом режиме ВЭЖХ, но нет данных по разделению дериватизированных энантиомеров аминокислот на антибиотиковых хиральных колонках. Это вызвано падением селективности колонки из-за взаимодействий ОФА с функциональными группами сорбента. Перспективным решением этой задачи является использование двумерной ВЭЖХ.

Этот подход обладает такими достоинствами, как высокая селективность, чувствительность, экспрессность, возможность одновременного определения нескольких компонентов.

Для создания двумерной системы ВЭЖХ необходимо изучить хроматографическое поведение ОФА производных на обращенно-фазовых сорбентах и исследовать свойства хиральной антибиотиковой колонки. Актуальным является выбор оптимального нуклеофила для дериватизации, предсказание порядка элюирования производных аминокислот с помощью теоретических расчетов и оптимизация пробоподготовки реальных объектов.

Выбор хиральной колонки определяется в основном ее ценой и доступностью. В связи с этим привлекательной является новая отечественная колонка «ЫаиШиБ-Е», заполненная сорбентом на основе эремомицина.

Цель работы заключалась в изучении разделения энантиомеров аминокислот в виде о-фталевых производных на сорбенте отечественного производства «Nautilus-E» методом двумерной ВЭЖХ и оценка применимости двумерной ВЭЖХ для определения энантиомеров аминокислот в биологических объектах. Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:

• изучить влияние состава подвижной фазы, природы нуклеофилыгаго реагента на разделение аминокислот в виде о-фталевых производных на коммерческих сорбентах;

• изучить зависимость удерживания ОФА производных аминокислот от гидрофобности на обращенно-фазовом сорбенте в рамках модели «удерживание-свойство»;

• исследовать хроматографическое поведение нативных аминокислот и их гидрофобных производных на новом хиральном сорбенте марки «Nautilus-Е»;

• оценить применимость метода двумерной ВЭЖХ для определения аминокислот в нативной форме и в виде производных с о-фталевым альдегидом.

Научная новизна. Исследовано разделение сложных смесей аминокислот в виде о-фталевых производных с различными модификаторами на сорбентах «Hypersil BDS-C18», «Zorbax Eclipse ААА». Для последнего сорбента построены модели зависимостей «удерживание-свойство» для различных нуклеофильных агентов. Показано, что зависимости логарифмов фактора удерживания от коэффициента распределения производных аминокислот являются линейными. Это позволяет предсказывать порядок элюирования аминокислот, модифицированных ОФА реагентом.

Проведено систематическое исследование удерживания энантиомеров аминокислот в нативной форме и в виде КБЗ-производных на хиральной колонке «Nautilus-E». Установленные закономерности использовали для разработки методики одновременного определения смеси энантиомеров аминокислот.

Впервые подробно изучены условия разделения энантиомеров аминокислот в виде о-фталевых производных на сорбенте «Nautilus-E» методом двумерной ВЭЖХ. Показана возможность применения двумерной ВЭЖХ для определения энантиомеров аспарагиновой кислоты в биологических объектах.

Практическая значимость работы. Выбраны условия разделения о-фталевых производных аминокислот, содержащихся в пищевой продукции и являющихся активными компонентами лекарственных препаратов. После предколоночной

дериватизации с ОФА/ИБЛЦ реагентом определен аминокислотный состав нескольких образцов мясного фарша и лекарственных препаратов «Церебролизин концентрат» и «Церебролизин гидролизат».

Разработана методика определения энантиомеров аминокислот, содержащихся в препарате «Элтацин», методом ВЭЖХ с УФ детектированием.

Разработана методика определения цефепима и энантиомеров аргинина в лекарственном препарате «Цефепим» методом двумерной ВЭЖХ.

Показана применимость меркаптоэтанола и каптамина, как реагентов для высокоселективного определения энантиомеров серина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и треонина методом двумерной ВЭЖХ. Методом двумерной ВЭЖХ определено содержание энантиомеров аспарагиновой кислоты в моче.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты исследования влияния нуклеофилыюго реагента на разделение аминокислот в виде о-фталевых производных на сорбенте «Zorbax Eclipse AAA».

2. Модели «удерживание-свойство» для ОФА-производных аминокислот.

3. Результаты изучения влияния состава подвижной фазы на разделение энантиомеров аминокислот на сорбенте с привитым эремомицином.

4. Данные о влиянии состава подвижной фазы на разделение энантиомеров КБЗ-производых аминокислот на сорбенте с привитым эремомицином.

5. Результаты исследования влияния природы нуклеофильного реагента и состава подвижной фазы на разделение методом двумерной ВЭЖХ энантиомеров аминокислот в виде о-фталевых производных.

6. Методика определения аминокислотного состава образцов мясного фарша и некоторых лекарственных препаратов.

Апробация работы. Основное содержание работы изложено в 8 публикациях.

Результаты исследования доложены на научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва, 2010), на всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), на научной конференции «Аналитика как инструмент клинической химии» (Санкт-Петербург. 2011), на международной конференции Euroanalysis-2011 (Белград, 2011), в 111 Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011) на XIII международной научной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов - ИОНИТЫ -2011» (Воронеж, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 6 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 143 страницах машинописного текста, содержит 58 рисунков и 39 таблиц, в списке цитируемой литературы 106 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

Систематизированы сведения о методах чувствительного определения энантиомеров аминокислот методами газовой хроматографии, ВЭЖХ и капиллярного электрофореза.

Для метода ВЭЖХ рассмотрены хирапьные дериватизирующие реагенты, хиральные неподвижные фазы, хиральные модификаторы подвижной фазы.

Обсужден механизм распознавания оптических изомеров аминокислот на хиральных неподвижных фазах.

Рассмотрено несколько вариантов систем для двумерной ВЭЖХ энантиомеров аминокислот.

Экспериментальная часть

Для приготовления исходных растворов аминокислот использовали D и L-изомеры аминокислот из стандартного набора аминокислот (Сигма, США). Сокращенные названия приведены в табл.1.

В качестве дериватизирующего реагента использовали о-фталевый альдегид «для хроматографии» (Aldrich, США). В качестве нуклеофильных модификаторов использовали Цдиметиламино>этантиола гидрохлорид (каптамин), меркаптоэтанол, 3-меркаптопропионовую кислоту (3-МПК) (Aldrich, США).

В работе использовали рацемические смеси бензилкарбаматных производных триптофана, фенилаланина, аланина, лейцина, норлейцина, валина, метионина, аспарагина и аспарагиновой кислоты (Sigma, США).

В работе использовали оптически чистые Ы-ацетил-Ь-цистеин (НАЦ), N-изобутирил-Ь-цистеин (ИБЛЦ) (Aldrich, США). Хиральный селектор Ы-(Ю-манделил-(5)-цистеин (НМЦ) был синтезирован Д.Т. Гуранда и В.К. Швядасом, Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Таблица 1. Исследованные аминокислоты

Название Обозначение Название Обозначение

Аргинин Apr Алании Ала

Валин Вал Аспарагин Асн

Гистидин Гис Аспарагиновая кислота Асп

Изолейцин Иле Глицин Гли

Лейцин Лей Глутаминовая кислота Глу

Лизин Лиз Глутамин Глн

Метионин Мет Пролин Про

Треонин Тре Серии Сер

Триптофан Трп Тирозин Тир

Фенилаланин Фен Цистин Цис-Цис

Цистеин Цис Норлейцин Нор

Работу выполняли на хроматографе Agilent 1200 Series фирмы «Agilent

Technologies» с автоматическим инжектором, диодно-матричным и флуориметрическим детекторами, хроматографе Agilent 1100 Series фирмы «Agilent Technologies» с автоматическим инжектором, диодно-матричным и флуориметрическим детекторами, дополнительным насосом и шестиканальным двухходовым клапаном. На основе хроматографа Agilent 1100 Series была собрана установка для проведения двумерной ВЭЖХ (рис.1).

Рис. 1. Схема хроматографической системы с переключением потоков. ПК - двухходовой 6-канальный клапан

— положение 1

— положение 2

Детектор 1 - Диодно-матричный Детектор 2 -

Спектрофотометрический, флуоресцентный.

Получение производных аминокислот с о-фталевым альдегидом

В качестве реагента для получения производных аминокислот использовали о-фталевый альдегид совместно с различными серосодержащими компонентами.

Реагент для определения аминокислот получали, растворяя 3 мг ОФА и 4.5 мг хирального SH-реагента (НАЦ, НМЦ, ИБЛЦ) в 0.5 мл метанола, или, растворяя 3 мг ОФА в 0.5 мл метанола и добавляя 10 мкл 3-МПК или меркаптоэтанола, использовали свежеприготовленный раствор. Минимальное мольное соотношение ОФА и суммы

аминокислот поддерживали равным 3,5:1. Дериватизация аминокислот проходила автоматически в автосэмплере в среде боратного буферного раствора (0,1М, рН 9,6).

Для разделения производных аминокислот использовали стальную колонку (150x2,1 мм), заполненную сорбентом «Hypersil BDS-C18» (3 мкм) фирмы «Agilent Technologies» (США), стальную предколонку (12,5x3,6 мм), заполненную сорбентом «Hypersil BDS-CI8»; стальную колонку (150x4,6 мм), заполненную сорбентом «Zorbax Eclipse ААА» (5 мкм) фирмы «Agilent Technologies» (США), стальную предколонку (12,5x4,6 мм), заполненную сорбентом «Zorbax Eclipse ААА»; стальную колонку (150x4,6 мм), заполненную сорбентом «Zorbax Eclipse XDB-C8» (5 мкм) фирмы «Agilent Technologies» (США), стальную предколонку (12,5x4,6 мм), заполненную сорбентом «Zorbax Eclipse XDB-C8»; стальную колонку (4,6x150 мм, 5 мкм), заполненную сорбентом «Acclaim PolarAdvantage» фирмы «Dionex» (США); стальную предколонку (12,5x4,6 мм), заполненную сорбентом«АссЫт PolarAdvantage» фирмы «Dionex» (США); стальную колонку (4,6x250 мм), заполненную сорбентом «Chirobiotic-T» (5мкм) фирмы Astec (США); стальную колонку (4,6x250 мм), заполненную сорбентом «Nautilus-E» ЗАО «БиоХимМак СТ» (Россия); стальную колонку (4x250 мм), заполненную сорбентом Диасфер-110-С16 (5мкм) фирмы «БиоХимМак СТ» (Россия).

В качестве подвижных фаз использовали смеси ацетонитрила, метанола с различными буферными растворами.

рН водных растворов контролировали на рН-метре МР 220 (Mettler Toledo, Швейцария).

Для осаждения белка использовали центрифугу CENTRIFUGE СМ-50 (ELMI, Латвия).

Для проведения гидролиза белка применяли микроволновые печи «ETHOS touch control» фирмы «Milestone» (Италия) и «SPEEDWAVE» фирмы «BERGHOFF» (Германия) при фиксированной частоте 2450 МГц при температуре 160°С. Также применяли аналитический модуль автоклавной пробоподготовки с резистивным нагревом МКП-04 (Россия).

Разделение ОФА производных аминокислот в обращеино-фазовой ВЭЖХ

Первая стадия разделения для двумерной ВЭЖХ очень важна, чем чище будет зона с рацемической смесью, тем надежнее идентификация энантиомеров на следующем этапе и тем дольше прослужит колонка с хиральной неподвижной фазой.

В работе было изучено хроматографическое поведение о-фталевых производных аминокислот на нескольких сорбентах для обращенно-фазовой хроматографии. В том числе были исследованы сорбенты, позиционирующиеся производителем, как предназначенные непосредственно для аминокислотного анализа.

Разделение о-фталевых производных аминокислот на неподвижной фазе «Нуpersil BDS С18»

В работе изучено разделение ОФА/З-МПК производных аминокислот на сорбенте «Hypersil BDS С18». Достоинством данной колонки является малый расход подвижной фазы, и как следствие, малый объем пробы вводимой на вторую колонку, что уменьшает размывание хроматографических пиков. Скорость подвижной фазы состаапяла 0,12 мл/мин. Нами исследовалось влияние градиента элюента, природы и рН подвижной фазы на селективность разделения производных аминокислот.

Варьирование состава и рН подвижной фазы на колонке «Hypersil BDS С18» не позволило разделить все аминокислоты, содержащиеся в белках. Пики производных гидрофобных аминокислот накладываются на пик реагента. Не удалось разделить пары ОФА/З-МПК производных Гли/L-Tpe, Ь-Гис/Ь-Тре, и L-Apr/L-Ала, для которых максимальное значение разрешения составило 0,65, 0,63 и 0,71 соответственно (табл. 2 и 3).

Таблица 2. Влияние рН подвижной фазы на разрешение критических пар

аминокислот

Критические пары Разрешение (Rs)

рН=6,0 рН=7,0 рН=7,7

Ь-глицин/Ь-гистидин 0,40 0,78 0,09

Ь-глицин/Ь-треонии 0,30 0,41 0,52

Ь-гистидин/Ь-треонин 0,63 0,37 0,61

Ь-аргинин/Ь-апанин 0,71 0,09 0,15

Таблица 3. Влияние природы буфера подвижной фазы на разрешение производных аминокислот__

Подвижная фаза Разрешение (Rs)

L-Apr/L-Ала Гли/Ь-Гис Гли/L-Tpe L-Гис/Ь-Тре

Фосфатный буфер 0,71 0,40 0,30 0,63

Ацетатный буфер 0,34 1,23 0,65 0,53

Из полученных результатов видно, что разделение ОФА производных аминокислот на сорбенте «Hypersil BDS С18» оставляет желать лучшего, и включать эту колонку в двумерную ВЭЖХ систему не стоит.

Оптимизация разделения о-фталевых производных аминокислот на неподвижной фазе «Zorbax Eclipse AAA».

В работе изучено влияние состава подвижной фазы и дериватизирующсго реагента на селективность и эффективность разделения о-фталевых производных аминокислот на специализированной колонке «Zorbax Eclipse AAA». Предложен подход, позволяющий существенно продлить срок службы колонки.

Ресурс колонки весьма ограничен. После анализа 50-60 реальных образцов, модифицированных ОФА/З-МПК, значительно ухудшается селективность разделения. Это явление наблюдалось для трех колонок данной марки. Со временем элюируются одним пиком пары L-Гис/Гли, L-Арг/Ь-Ала и ухудшается разделение L-валина и L-метионина.

В работе было исследовано влияние следующих нуклеофилов: N-ancnui-L-цистеин, Ы-изобутирил-Ь-цистеин и Ы-(Я>манделил-(5>цистеин (табл.4).

Таблица 4. Нуклеофильные реагенты для дериватизации аминокислот

Название Структурная формула

N-aneTiw-L-uncTCHH (НАЦ) снн°^0 o^mAs SH

Ы-(К>манделил-(8>цистеин (НМЦ)

Ы-изобутирил-Ь-цистеин (ИБЛЦ) ?н3 но H3C-J Y=° O^NH^V. SH

Использование ОФА/НАЦ позволяет улучшить разделение Ь-аргишша и Ь-аланина, однако, остаются неразделенными пики Ь-треонина и глицина, реагента и Ь-метионина (табл.5). Применение ОФА/НМЦ позволяет удовлетворительно разрешить пики Ь-треонина и глицина, Ь-аргинина и Ь-аланина, однако не полностью разрешены глицин и Ь-гистидин №0,41), также невозможно разделить Ь-валин и Ь-метионин, реагент и Ь-лейцин (табл.5). Использование Ы-изобутирил-Ь-цистеина в качестве

нуклеофильного агента позволило добиться наилучших результатов. После оптимизации градиентной программы были полностью разделены производные всех исследуемых аминокислот (рис.2, табл.5). Лучшая селективность ИБЛЦ связана, по-видимому, с более удачным соотношением гидрофобности и размера образующихся соединений.

Рис. 2. Хроматограмма смеси ОФА/ИБЛЦ производных аминокислот. Колонка «Zorbax Eclipse ААА» (4,6x150 мм) с предколонкой. Градиентное элюирование. Скорость потока 1 мл/мин. Т = 30°С. Детектор - флуориметрнческий (^»oi6.=340 HM, /-регистр =450 нм). ]=L-Acn, 2= L-Глу, 3= L-Cep, 4= L-Tpe, 5= L-Гис, 6= Гли, 7= L-Apr, 8= L-Ала, 9= L" Тир, 10= L-Вал, 11= L-Мет, 12= L-Tpn, Д_ 13= L-Иле, 14= L-Фен, 15=реагент, 16= L-Лей, 17= L-Лиз.

Таблица 5. Значения хроматографических параметров разделения ОФА производных

НАЦ НМЦ ПБЛЦ

k' Rs k' Rs k' Rs

L-Acn 0,33 - L-Acn 3,99 - L-Acn 2,65 -

L-Глу 0,94 3,87 L-Глу 7,24 10,38 L-Глу 5,98 9,80

L-Cep 2,20 7,54 L-Cep 10,59 13,94 L-Cep 8,89 9,55

L-Гис 4,37 9,78 L-Tpe 13,12 12,11 L-Tpe 11,35 9,91

L-Tpe +Гли 5,19 2,91 Гли 13,38 0,87 L-Гис 11,53 0,87

L-Apr 7,22 7,87 L-Гис 13,55 0,41 Гли 11,88 0,95

L-Ала 8,93 7,87 L-Apr 14,70 4,65 L-Apr 13,38 6,41

L-Тир 12,13 15,60 L-Ала 15,12 1,79 L-Ала 13,85 2,02

L-Вал 14,62 12,75 L-Тир 18,32 12,77 L-Тир 16,99 11,19

Ь-Мет+ реагент 15,84 3,88 L-Вал+ L-Мет 21,60 15,30 L-Вал 20,63 12,53

L-ILie 18,66 7,40 L-Tpn 22,57 5,85 L-Мет 21,48 3,43

L-Tpn 19,20 1,85 L-Фен 23,12 3,50 L-Tpn 23,40 8,34

L-Фен 20,19 4,68 L-Ilie 23,40 1,74 L-Нле 23,60 0,87

L-Лиз 20,82 3,66 L- Лей + реагент 23,97 2,51 L-Фен 24,25 2,71

L-Лей 21,16 2,00 L-Лиз 25,00 3,82 L-Лей 25,57 4,99

Ь-Лиз 29,49 9,57

Построение модели «удерживание-свойство» для о-фталевых производных аминокислот.

В работе была решена поставленная задача, однако следует признать, что оптимизация условий экспериментальным путем требует много времени и расхода дорогостоящих реактивов. В связи с этим была сделана попытка использовать теоретические расчеты для предсказания порядка выхода производных аминокислот.

Полученные нами данные позволили построить эмпирическую модель «удерживание-свойство». В настоящей работе была изучена зависимость удерживания ОФА производных аминокислот от их гидрофобное™ Для оценки гидрофобности использовали значения коэффициентов распределения изучаемых молекул между водой и октанолом, рассчитанные для рН 6,0 с помощью программы АСОЬАЬэ. Для производных НАЦ, НМЦ и ИБЛЦ были получены линейные (к2 = 0,92-0,95) зависимости логарифма удерживания от логарифма коэффициента распределения. Для проверки полученных уравнений хроматографировали дериватизированный норлейцин. Как видно из таблицы 6, наиболее точным оказался прогноз в случае предсказания удерживания и порядка элюирования ОФА-НМЦ и ОФА-ИБЛЦ производных. Таким образом, показано, что использование компьютерной программы АСЭЬАЬв позволяет предсказывать порядок элюирования модифицированных аминокислот и сокращать время эксперимента.

Таблица 6. Теоретические и экспериментальные полученные значения удерживания

производных с норлейцином (п=3, РЮ.95)

Нуклеофильный агент к' теор. к' эксп.

НАЦ 1,4±0,1 1,3(Ш),01

НМЦ 1,39*0,02 1,37±0,01

ИБЛЦ 1,40±0,02 1,41±0,01

Определение аминокислот в продуктах питания н лекарственных препаратах методом реакционной ВЭЖХ

С использованием ОФА/ИБЛЦ реагента определено содержание аминокислот в лекарственных препаратах, в образце детского питания, в тканях свиных органов и в соединительной и мышечной тканях говядины. Дериватизацию аминокислот и разделение производных выполняли в условиях, разработанных для этого реагента. Определение содержания Ь-аминокислот в лекарственных препаратах проводили методом внешнего стандарта.

ЛвтоклавньШ гидролиз детского питания. Для продуктов питания самым длительным этапом анализа является разложение белков. Гидролиз является наименее контролируемой частью анализа и вносит основной вклад в погрешность определения аминокислот. В работе сделана попытка ускорить этот процесс за счет разложения в автоклавах с микроволновым и резистивным нагревом. Гидролизу подвергали стандартный образец детского питания. Установлено, что мощность микроволнового излучения в значительной мере влияет на степень гидролиза. Из табл. 7 видно, что использование излучения мощностью 300 Вт, достаточного для поддержания необходимой температуры, не приводит к полному разложению образца. Содержание серина, треонина, гистидина, тирозина, изолейцина, фенилаланина более чем в два раза меньше по сравнению со стандартной схемой гидролиза в соляной кислоте. За счет увеличения мощности достигается полное разложение белка. Таким образом, время гидролиза сокращается по сравнению с классической схемой с 24 часов до 25 минут.

Таблица 7. Содержание аминокислот (мг/г белка) в образце детского питания после гидролиза (п=3, Р=0,95)___

Аминокислот а Аттестованые значения Стандарт -ный гидролиз Микроволновой нагрев Резистивный нафев

«Milestone» «BERGHOFF» 160°С 3,5 часа

110°С 24 часа 160°С 25 мин 300Вт 160°С 25 мин 600Вт 160°С 25 мин

L-Asp 35 36±5 24±4 39±9 34±5 3,2±0,3

L-Глу 84 85±9 66±10 90±20 87±10 2,1 ±0,3

L-Cep 25 24±2 8±1 29±6 25±3 6,7±0,2

L-Tpe 20 22±2 5±1 24±5 18±2 1,0±0,1

L-Гис 16 17±2 6±1 14±2 19±3 1,4±0,2

Гли 14 11±2 13±2 16±3 15±3 2,1±0,2

L-Арг 20 19±2 15±2 22±3 19±3 0,7±0,1

L-Ала 20 19±2 19±3 24±3 25±4 2,0±0,2

L-Тир 18 21±2 4±1 20±3 24±5 1,3±0,2

L-Вал 30 30±3 17±3 29±4 26±3 2,5±0,2

L-Мет 24 21±2 21±3 24±5 19±3 1,9±0,1

L-Иле 22 24±3 13±2 21±4 21±4 3,3±0,3

L-Фен 23 20±2 10±1 23±5 22±4 4,3±0,6

Ь-Лей 50 48±4 38±6 60±10 56±5 1,0±0,2

Ы1из 53 55±8 41±6 60±10 57±9 11±1

Изучение хроматорафических свойств колонки «№иШи$-Е» Разделение аминокислот в нативной форме. Для создания системы двумерной ВЭЖХ необходимо исследовать возможности новой хирапьной колонки «ЫаШПив-Е».

В работе было изучено влияние рН элюента на разделение энантиомеров метионина, цистина, апанина, фенилапанина, серина, аспарагиновой и глутаминовой кислот. В качестве подвижной фазы была выбрана смесь метанол/0,04 М КагНРС^ (20/80), рН элюента варьировали в диапазоне 3,0 - 7,0. Полученные экспериментальные данные (рис. 3 и 4), позволяют выбрать условия определения энантиомеров аминокислот при одновременном присутствии, например смесь изомеров аспарагиновой и глутаминовой кислот в присутствии энантиомеров аминокислоты одной из ряда: апанин, фенилаланин, метионин, цистин и глицин.

Рис.3. Зависимость фактора удержиания рнс.4. Зависимость фактора удержиания

от рН элюента для [.-изомеров от рн элюента для О-изомеров

аминокислот. 1. - Асп, 2 - Глу, 3 - Фен, 4 аминокислот. 1. - Фен, 2 - Асп, 3 - Глу,

- Цис-Цис, 5 - Мет, 6 - Ала, 7 - Сер. 4 _ цис-Цис, 5 - Мет, 6 - Ала, 7 - Сер.

Зависимость удерживания от рН для аспарагиновой и глутаминовой аминокислот сильно отличается от остальных (рис.3 и рис.4.) и имеет ярко выраженный максимум при рН 4,0, где преобладает форма аминокислоты с двумя депротонированными карбоксильными группами. В то же время при рН 4,0 эремомицин (р1 7,4) заряжен положительно. Повышение рН в диапазоне 4,0 - 7,0 приводит к уменьшению положительного заряда молекулы антибиотика и уменьшению удерживания отрицательно заряженных рассматриваемых аминокислот. Это указывает на значительный вклад ионных взаимодействий в механизм распознавания. Предполагаемая начальная стадия стереораспознавания представлена на рис. 5.

Рис. 5. Предполагаемая схема первичного взаимодействия эремомицина и аспарагиновон кислоты.

Следует отметить, что для серина, аланина, фенилаланина, цистина и метионина. изменение рН элюента в большей степени влияет на удерживание й-изомера. Удерживание [.-изомеров серина, аланина. фенилаланина. метионина и цистина практически не меняется.

Ь-изомеры аланина и серина удерживаются одинаково в изученном диапазоне рН. в то время как удерживание для Э-апанина существенно больше, чем для И-серина.

Для Э-изомеров аланина. фенилаланина, метионина и серина наблюдалось уменьшение удерживания О-изомера с ростом рН, что приводит к уменьшению разрешения оптических изомеров. Наибольшее значение наблюдалось для фенилаланина, что обусловлено тг-тг-взаимодействиями ароматических колец агликонной части эремомицина и фенилаланина.

На основании полученных данных была разработана методика определения аминокислот, входящих в препарат «Элтацин» (рис.6). Предложенная методика более экпрессная и дешевле методики, предлагаемой фармстатьей. кроме того возможно определение О-изомеров аминокислот.

| ;

Рис. 6. Хроматограмма смеси аминокислот. Колонка «ЫаиШиз-Е» (4,6 х 250 мм). Подвижная фаза: метанол/ №2НР040,04 М (рН 4,0), 20/80. скорость потока 0,5 мл/мин, Т=25°С. Детектор - диодно-матричный (^=210 нм). 1 - Гли, 2 -1- Цис-Цис, 3 - О-Цис-Цис, 4 -Ь-Глу, 5 - Э-Глу.

Таблица 8. Результаты анализа препарата «Элтацин» (п—3, Р=0.95)

Аминокислота Содержание по НТД, % Найдено, % Б,

Ь-Глу 29,4-34,2 29,5±0,1 0,006

Глицин 29,4-34,2 30,7±0,2 0,006

Ь-цистин 29,4-34,2 30,6±0,1 0,002

Содержание всех аминокислот находится в пределах, установленных фармакопейной статьей на «Элтацин». И-изомеры цистина и глутаминовой кислоты в лекарственном препарате не обнаружены, что свидетельствует о хорошем качестве препарата. Также в работе предложена методика контроля энатиомерной чистоты препарата «Аспаркам», представляющего смесь аспарагинатов калия и магния. Результаты определения аминокислот в препаратах представлены в табл. 8 и 9.

Таблица 9. Результаты анализа препарата «Аспаркам» (п=3, Р=0.95)

Компонент Содержание по НТД, мг/таб Найдено, Мг/таб

Аспарагиновая кислота 251-275 266+2 0,01

Ь-изомер Не нормировано 152,9±0,4 0,002

[>изомер Не нормировано 112,3+0,9 0,008

Стоит отметить, что в препарате «Аспаркам» содержание Ь-изомера превышает содержание 1>изомера, но их соотношение относительно близко к рацемической смеси. Вероятно, это связано с методом производства препарата, и в другой партии можно обнаружить таблетки с преобладающим О-изомером.

Разделение аминокислот на колонке «№иб1т-Е» в виде производных.

Для изучения энантиоселективности колонки «ЫаиШи5-Е» по отношению к модифицированным аминокислотам были выбраны бензилкарбаматные производные. Исследовано влияние состава органического компонента подвижной фазы на разделение энантиомеров триптофана, фенилапанина, лейцина (рис.7), валина, аспарагина, норлейцина, аланина, метионина и аспарагиновой кислоты в виде бензилкарбаматных производных. Для всех соединений достигнуто полное разделение энантиомеров. В работе варьировали соотношение метанола и ацетонитрила, оставляя общую концентрацию органического модификатора 95%. Увеличение доли метанола приводит к небольшому увеличению удерживания, что указывает на вклад гидрофобных взаимодействий. На второй пик влияние заметно сильнее.

Рис.7. Зависимость хроматографических параметров КБЗ-производного лейцина от концентрации метанола в элюенте.

» 30 Э 5 40 45 50 55 00 85 70 75 N№>4.4

Применение двумерной ВЭЖХ для стереоселективного определения аминокислот.

На основании проведенных исследований была сконструирована двумерная система ВЭЖХ. Возможности системы были продемонстрированы на примере препарата «Цефепим». В работе был предложен способ определения энантиомерной чистоты аргинина методом двумерной ВЭЖХ в препарате, содержащий антибиотик цефепим. Данный способ позволяет за один ввод определять содержание цефепима, общего аргинина и соотношение О/Ь-изомеров аргинина (рис.8).

Рис.8. Хроматограмма стандартного раствора цефепима и ОЬ-аргинина. Первая колонка: Диасфер-110-С16 (4x250 мм, 5мкм), изократическое элюирование, 25°С. Детектор диодно-матричный 1=205 нм. Вторая колонка: СЫгоЬюИс-Т (4,6*250), изократическое элюирование: Детектор спектрофотометрический Х=205 нм. Вырезалась фракция 1,70- 1,95 мин, дозирующая петля 250мкл. 1 - Аргинин, 2 - Цефепим, 3 - Ь-Аргинин, 4 - О-Аргинин.

Данным методом проанализировали несколько образцов препарата «Цефепим» разных производителей. Показано, что содержание цефепима и Ь-аргинина соответствует нормативной документации, О-аргинин не обнаружен.

Разделение ОФА-производных аминокислот на колонке «№иШи5-Е»

Прямое хроматографическое разделение аминокислот в виде ОФА-производных на сорбентах с макроциклическими антибиотиками затруднено из-за взаимодействия избытка реагента с функциональными группами сорбента. Метод двумерной жидкостной хроматографии позволяет изучить хроматографическое поведение ОФА производных на

сорбенте с привитыми антибиотиками. В данной работе было изучено три нуклеофильных реагента (табл. 10).

Соединение Формула

3-меркаптопропионовая кислота (МПК) °=уон

Меркаптоэтанол (МЭТ) но

КЫ-диметиламиноэтантиол (каптамин, КПТ) сн3 Н3С—N эн

Изучение разделения производных аминокислот с ОФЛ/МПК.

В работе было изучено разделение энантиомеров серина и аспарагиновой кислоты. Выделение рацемической смеси аминокислот на первой стадии проводили на колонке «гогЬах ХОВ С-8». В обращенно-фазовом режиме хроматографирования на хиральной колонке наблюдали сильное удерживание обоих энантиомеров серина (рис.9). Переход к полярно-органическому режиму выигрыша не дал, так как О-изомер выходил с мертвым временем и накладывался на системный пик. В работе изучено влияне концентрации и состава органического модификатора элюента на разделение энантиомеров серина и аспарагиновой кислоты. Показано, что уменьшение элюирующей силы растворителя увеличивает разрешение, но ухудшает эффективность. Разрешение энантиомеров серина в изученных условиях достигнуто на уровне 1,5-2 при эффективности разделения 100 -200 тт/м. Энантиомеры аспарагиновой кислот разрешить не удалось (1*5=0,39, эффективность 190 тт/м). Полученные данные убедительно показали бесперспективность меркаптопропионовой кислоты как нуклеофильного модификатора для разделения энантиомеров на сорбенте с привитым эремомицином.

Рис. 9. Хроматограмма И,[.-серина. Дериватизация с ОФА/МПК. Колонка

ЫаиШш-Е (4,6*250), изократическое элюирование:

ацетонитр ил/метанол/буферный раствор Р=0,5 мл/мин, ФЛД 340/450 нм. 1 =0-Сер,2 = Ь-Сер.

Изучение разделения производных аминокислот с ОФА/МЭТ.

Выделение рацемической смеси аминокислот на первой стадии проводили на колонке (йогЬах ХЭВ С-8». Было изучено разделение энантиомеров аспарагиновой и глутаминовой кислот, серина, треонина и гистидина.

Используя этот модификатор, за приемлемое время удалось разрешить энантиомеры аспарагиновой кислоты и серина (рис.10). Частично разрешены энантиомеры треонина и глутаминовой кислоты. Энантиомеры гистидина разделить не удалось. Параметры разделения представлены в таблице 11. Стоит отметить, что в случае глутаминовой кислоты первым выходит Ь-изомер.

, Рис. 10. Хроматограмма ЭХ-серина.

I , 1 Дериватизация с ОФА/МЭТ. Колонка

ЫашПив-Е (4,6*250), изократическое I 2 элюирование:

ацетонитрил/метанол/буферный раствор

—---------------—•- —' ^ — И =0,5 мл/мин, ФЛД 340/450 нм. 250мкп,

1 = Э-Сер, 2 = Ь-Сер.

Табл. П. Хроматографические параметры для производных аминокислот ОФА/МЭТ

Соединение ¡г О, мин 1гЬ, мин N а тг/м N Ь, тт/м

ОФА/МЭТ-Асп 9,49 13,49 830 870 1,27

ОФА/МЭТ-Сер 8,38 11,61 1110 1090 1,34

ОФА/МЭТ-Тре 8,64 9,89 1800 890 0.58

ОФА/МЭТ-Глу 10,24 8,64 1350 1000 0,72

ОФ А/МЭТ-Гис 27,3 28.9 780 400 0.16

Систематическое изучение влияния состава подвижной фазы показало незначительное преимущество в использовании менее концентрированного раствора фосфата калия (рис. 11). Увеличение концентрации ацетонитрила в подвижной фазе приводит к уменьшению удерживания и селективности. Однако повышает эффективность разделения (табл. 12)

Рис. 11. Влияние ионной силы буферного раствора на разрешение энантиомеров сТ] производных серина и ^ аспарагиновой кислоты.

Содержание ацетонитрила в подвижной фазе, % tr,D tr, L N L, тг/м N D, тг/м Rs

23 3,42 5,62 1300 610 1,86

28 3,50 4,53 1150 1170 1,09

33 3,19 3,84 2450 2230 1,12

Изучение разделения производных аминокислот с ОФА/КПТ

В работе было изучено разделение энантиомеров аспарагиновой и глутаминовой кислот, серина, треонина, гистидина, аланина, метионина, лейцина, лизина, валина, фенилаланина, изолейцина, тирозина и аргинина. Разделение аспарагиновой и глутаминовой кислот на первой стадии проводили на колонке «Zorbax Eclipse XDB-C8», для остальных использовали «Acclaim Polaradvantage».

Условия полного разделения найдены для производных энантиомеров аспарагиновой кислоты (рис. 12). Производные L- и D-глутаминовой кислоты удалось разрешить частично. Как и в случае применения меркаптоэтанола производное L-глутаминовой кислоты элюируется перед D-изомером (рис. 13). Производные стереоизомеров остальных рассмотренных аминокислот элюируются одним пиком, подобрать условия разделения не удалось.

Рис. 12. Хроматограмма 0,Ь-аспарагиновой кислоты. Дериватизация с ОФА/КПТ.

Вторая колонка: ЫаиП1ш-Е (4,6*250), изократическое элюирование: ацетонитрил/буферный раствор (№2НР04 0,2 г/л, рН 7,0) 25/75). Р=1 мл/мин, ФЛД 340/450 нм. Вырезалась фракция 10,34- 10,54 мин, 250мкл. 1 = ОАсп, 2 = Ь-Асп.

Рис. 13. Хроматограмма 0,Ь-глутаминовой кислоты. Дериватизация с ОФА/КПТ.

Вторая колонка: ЫаиШш-Е (4,6><250), изократическое элюирование: ацетонитрил/буферный раствор (Ыа2НР04 0,2 г/л, рН 6,0) 28/72). Р=1 мл/мин, ФЛД 340/450 нм. Вырезалась фракция 12,18- 12,38 мин, 250мкл. 1 =Ылу,2 = 0-Глу.

В работе было изучено влияние состава подвижной фазы на разделение энантиомеров аспарагиновой и глутаминовой аминокислот. Варьировали концентрацию органического модификатора и рН буферного раствора. Показано, что увеличение

содержания ацетонитрида уменьшает удерживание, увеличивает эффективность разделения, но негативно сказывается на разрешении компонентов.

Уменьшение рН буферного раствора улучшает разрешение энантиомеров как для аспарагиновой, так и для глутаминовой кислот. Однако при этом сильно увеличивается удерживание обоих изомеров и увеличивается размывание пиков.

Сравнение меркаптопропионовой кислоты, меркаптоэтанола и каптамина позволило сделать ряд выводов по механизму распознавания о-фталевых производных энантиомеров аминокислот на неподвижной фазе с привитым эремомицпном. Во-первых, взаимодействие идет по смешанному механизму. Удерживание производных увеличивается при прочих равных в ряду МГЖ >» МЭТ > КПТ. Введение в замещённые изоиндолы дополнительной карбоксильной группы с МПК настолько увеличивает удерживание, что применять этот реагент для аналитических целей невозможно, по крайней мере, в обрашенно-фазовом режиме хроматографирования. Каптамин с замешенной аминогруппой, напротив, образует наименее удерживаемые производные.

В зависимости от аналитической задачи следует использовать меркаптоэтанол (для определения серина и аспарагиновой кислоты) или каптамин (для определения аспарагиновой или глутаминовой кислот).

В условиях компромисса между временем удерживания, эффективностью и разрешением было проведено определение энантиомеров аспарагиновой кислоты методом двумерной ВЭЖХ в образце мочи. На уровне до 1 мг/мл О-аспарагиновая кислота не обнаружена. Правильность определения проверялась методом «введено-найдено» (табл. 15). Следует отметить достоверность определения небольших количеств Э-аминокислот в биологических объектах методом двумерной ВЭЖХ.

Таблица. 15. Результаты определения энантиомеров аспарагиновой кислоты в моче (п=3, Р=0,95)_._,_,

Образец мочи

Аминокислота Добавлено, мг/л Найдено, мг/л Эг

1>аспарагиновая кислота 0 0 0

10 10+0,6 0,05

Ь-аспарагиновая кислота 0 0 0

10 9.2±0,9 0,09

Выводы

1. Изучено разделение аминокислот в виде о-фталевых производных с различными N-замещенными цистеинами на сорбенте «Zorbax Eclipse AAA». Показано, что использование №изобутирил-Ь-цистеина позволяет улучшить селективность разделения аналитов и продлить эксплуатационные сроки колонок с данным сорбентом.

2. Для о-фталевых производных аминокислот с тремя нуклеофилами (НАЦ, ИБЛЦ, НМЦ) предложена модель «удерживание-свойство», позволяющая предсказывать порядок элюирования дериватизированных аминокислот.

3. С помощью разработанного подхода, методом реакционной обращенно-фазовой ВЭЖХ проведено определение аминокислот и их оптических изомеров в лекарственных препаратах, образцах детского питания и мяса.

4. Изучено разделение энантиомеров ряда аминокислот в нативной форме и в виде бензилкарбаматных производных, на сорбенте марки «Nautilus-E» с привитым эремомицииом. Установлено, что в основе механизма стереораспознования аминокислот лежат ионные взаимодействия, для модифицированных аминокислот большее значение имеют гидрофобные взаимодействия. В выбранных оптимальных условиях определено содержание компонентов и энантиомерной чистоты аминокислотных лекарственных препаратов «Элтацин» и «Аспаркам».

5. Предложен способ одновременного определения компонентов и энантиомерной чистоты лекарственного препарата «Цефепим» методом двумерной ВЭЖХ.

6. Впервые методом двумерной ВЭЖХ изучено разделение энантиомеров ряда аминокислот в виде о-фталевых производных с меркаптопропионовой кислотой, меркаптоэтанолом и каптамином, установлен существенный вклад ионных взаимодействий в стереораспознавание. Показано, что меркаптоэтанол и каптамин более перспективные реагенты для двумерной ВЭЖХ

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Натыкан А.А, Сычева К.Ю., Чернобровкин М.Г., Шаповалова E.H., Шпигун O.A. Хроматографическое определение аминокислот и их оптических изомеров с применением колонки Nautilus-E //Заводская лаборатория. 2011. Т. 77. №3. С. 1822.

2. Натыкан A.A., Чернобровкин М.Г., Шпигун O.A. Изучение влияния природы нуклеофильного модификатора на хроматографические свойства производных аминокислот с о-фталевым альдегидом // Сорбционные и хроматографические процессы. 20 i 1. Т. 11. В. 6. С. 895 - 903.

3. Сычева К.Ю., Натыкан А.А, Чернобровкин М.Г., Шпигун O.A. Определение аминокислот в пищевых продуктах и лекарственных препаратах методом реакционной ВЭЖХ / Материалы научной конференции «Ломоносовские чтения». Москва, Россия, 12 — 15 апреля 2010. Доступно он-лайн на http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2010/28-l.rar/59_946_18176.

4. Натыкан А.А, Сычева К.Ю., Чернобровкин М.Г., Шпигун O.A. Определение аминокислот и их оптических изомеров в препарате «Элтацин» / Материалы всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар, 26 сентября -1 октября 2010. С. 161.

5. Натыкан A.A., Чернобровкин М.Г. Контроль энантиомерной чистоты фармпрепаратов / Материалы научной конференции «Аналитика как инструмент клинической химии», Санкт-Петербург, 26-27 апреля 2011. С. 21

6. Natykan A.A., Chemobrovkin M.G., Shpigun O.A. "Separation of derivatizated amino acid enantiomers using column-switching chromatography technique" / Materials of 16th European Conference on Analitical Chemistry "Euroanalysis", Belgrade, Serbia. September 11-15,2011.CH22

7. Натыкан A.A., Чернобровкин М.Г., Шпигун O.A. Разделение энантиомеров аминокислот в виде о-фталевых производных на силикагеле с привитым эремомицином методом двухмерной ВЭЖХ. / Материалы всероссийского симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии», Краснодар, 2-7 октября 2011. С. 123.

8. Натыкан A.A., Чернобровкин М.Г., Шпигун O.A. Определение энантиомеров аргинина в препарате «Цефепим» методом двумерной ВЭЖХ / Материалы ХШ Международной научной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов- ИОНИТЫ -2011», Воронеж, 17-21 октября 2011. С. 428430.

Отпечатано в ПЦ «Фан» Подписано в печать 01.11.11г. Москва, ул. Шухова, 18 Тел.: (495) 956-19-07 ООО «Техноком» 101000. Москва, ул. Покровка, 12. стр. 3 Заказ № 58. Тираж 100 шт.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МЕТОДЫ ЭНАНТИОМЕРННОГО АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТ.

ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Хиральные реагенты в ГХ.

Использование хиральных неподвижных фаз (ХНФ).

МЕТОДЫ ВЭЖХ.

Хиральные реагенты для ВЭЖХ.,.

Хиральные неподвижные фазы.

ФазыПиркла.

Циклодекстрины.

ХНФ с краун-эфирами.

Лигандообменные ХНФ.

Хиральные неподвижные фазы с привитыми полисахаридами.

Хиральные неподвижные фазы с иммобилизованными белками.

Хиральные неподвижные фазы иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками.

Хиральные модификаторы подвижной фазы.

Системы с переключением колонок.

КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ.

СПОСОБЫ АМИНОКИСЛОТНОГО ГИДРОЛИЗА.

Классические способы гидролиза белков.

Кислотный гидролиз соляной кислотой.

Кислотный гидролиз с помощью сулъфоновых кислот и других агентов.

Щелочной гидролиз.

Ферментативный гидролиз.

Использование аналитических автоклавов для гидролиза белков.

Гидролиз под действием микроволнового излучения.

Рацемизация аминокислот при гидролизе.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА, АППАРАТУРА, МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.

Исходные реактитвы и растворы.

Получение производных аминокислот с о-фталевым альдегидом.

Аппаратура, сорбенты и подвижные фазы.

Методика хроматографического эксперимента.

Методика автоклавного разложения.

Методика пробоподготовки мясных продуктов.

Методика пробоподготовки биологических жидкостей.

ОПТИМИЗАЦИЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ОФА ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЭЖХ.

Разделение о-фталевых производных аминокислот на неподвижной фазе

Hypersil BDS С18».

Разделение о-фталевых производных аминокислот на неподвижной фазе

Zorbax Eclipse ААА».

Оптимизация разделения о-фталевых производных аминокислот на неподвижной фазе «Zorbax Eclipse ААА».

Построение модели «удерживание-свойство» для о-фталевых производных аминокислот.

Определение аминокислот в лекарственных препаратах методом реакционной ВЭЖХ.

Определение качества мясной продукции.

АВТОКЛАВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ДЕТСКОГО ПИТАНИЯ.

ИЗУЧЕНИЕ ХРОМАТОРАФИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОЛОНКИ «NAUTILUS-Е».

Разделение аминокислот в нативной форме.

Определение качества лекарственных препаратов «Элтацин» и «Аспаркам»

Разделение аминокислот на колонке «Nautilus-Е» в виде производных.

ПРИМЕНЕНИЕ ДВУМЕРНОЙ ВЭЖХ ДЛЯ СТЕРЕСЕЛЕКТИВНОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ.

Определение энантиомеров аргинина в субстанции цефепим.

Разделение ОФА-производных аминокислот на колонке «Nautilus-Е».

Изучение производных аминокислот с ОФА/МПК.

Изучение производных аминокислот с ОФА/МЭТ.

Изучение производных аминокислот с ОФА/КПТ.

4. ВЫВОДЫ.

выводы

1. Изучено разделение аминокислот в виде о-фталевых производных с различными N-замещёнными цистеинами на сорбенте «Zorbax Eclipse ААА». Показано, что использование М-изобутирил-Ь-цистеина позволяет улучшить селективность разделения аналитов и продлить эксплуатационные сроки колонок с данным сорбентом.

2. Для о-фталевых производных аминокислот с тремя нуклеофилами (НАЦ, ИБЛЦ, НМЦ) предложена модель «удерживание-свойство», позволяющая предсказывать порядок элюирования дериватизированных аминокислот.

3. С помощью разработанного подхода, методом реакционной обращенно-фазовой ВЭЖХ проведено определение аминокислот и их оптических изомеров в лекарственных препаратах, образцах детского питания и мяса.

4. Изучено разделение энантиомеров ряда аминокислот в нативной форме и в виде бензилкарбаматных производных, на сорбенте марки «Nautilus-E» с привитым эремомицином. Установлено, что в основе механизма стереораспознования аминокислот лежат ионные взаимодействия, для модифицированных аминокислот большее значение имеют гидрофобные взаимодействия. В выбранных оптимальных условиях определено содержание компонентов и энантиомерной чистоты аминокислотных лекарственных препаратов «Элтацин» и «Аспаркам».

5. Предложен способ одновременного определения компонентов и энантиомерной чистоты лекарственного препарата «Цефепим» методом двумерной ВЭЖХ.

6. Впервые методом двумерной ВЭЖХ изучено разделение энантиомеров ряда аминокислот в виде о-фталевых производных с меркаптопропионовой кислотой, меркаптоэтанолом и каптамином, установлен существенный вклад ионных взаимодействий в стереораспознавание. Показано, что меркаптоэтанол и каптамин более перспективные реагенты для двумерной ВЭЖХ.

1. G.E. Pollock, C.N. Cheng, S.E. Cronin. Determination of the D and L isomers of some protein amino acids present in soils // Anal. Chem. 1977. V. 49. P. 27.

2. H. Hasegawa, T. Matsukawa, Y. Shinohara, T. Hashimoto. Simultaneous determination of the enantiomers of leucine and 2H7. leucine in plasma by capillary gas chromatography-mass spectrometry.// J. Chromatogr. B. 1999. V. 735. P. 141-149.

3. A. Hashimoto, T. Nishikawa, T. Hayashi, N. Fujii, K. Harada, T. Oka, K. Takahashi. The presence of free D-serine in rat brain. // FEBS Lett. 1992. V. 296. P. 33-36.

4. H. Bruckner, A. Schieber. Determination of amino acid enantiomers in human urine and blood serum by gas chromatography-mass spectrometry. // Biomed. Chromatogr. 2001. V. 15. P. 166-172.

5. H. Bruckner, A. Schieber. Determination of Free D-Amino Acids in Mammalia by Chiral Gas Chromatography-Mass Spectrometry. // J. High Resolut. Chromatogr. 2000. V. 23. P. 576-582.

6. P. Marfey. Determination of o-amino acids. Use of a Afunctional reagent, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene. // Carlsberg Res. Commun. 1984. V. 49. P 591596.

7. Y. Nagata, K. Yamamoto, T. Shimojo. Determination of D- and L-amino acids in mouse kidney by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. 1992. V. 575. P. 147-152.

8. Y. Nagata, R. Masui, T. Akino. The presence of free D-serine, D-alanine and D-proline in human plasma. // Experientia. 1992.V. 48. P. 986-988.

9. W.C. Chan, R. Micklewright, D.A. Barrett. Porous graphitic carbon for the chromatographic separation of 0-tetraacetyl-(3-d-glucopyranosyl isothiocyanate-derivatised amino acid enantiomers. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 697. P. 213-217.

10. L.A. Sternson, J.F. Stobaugh, A J. Repta. Rational design and evaluation of improved ophthalaldehyde-like fluorogenic reagents. // Anal. Biochem. 1985. V. 144. №1. P. 233-246.

11. R. Barnett, W.P. Jencks. Diffusion-controlled and concerted base catalysis in the decomposition of hemithioacetals. // J. Am. Chem. Soc. 1969. V. 91. №24. P. 6758-6765.

12. R. Barnett, W.P. Jencks. Base-catalyzed hemithioacetal decomposition at a diffusion-controlled rate. // J. Am. Chem. Soc. 1967. V. 89. №23. P. 59635964.

13. D.W. Aswad. Determination of D- and L-aspartate in amino acid mixtures by high-performance liquid chromatography after derivatization with a chiral adduct of o-phthaldialdehyde. // Anal. Biochem. 1984. V. 137. P. 405-409.

14. Y. Kera, H. Aoyama, H. Matsumura, A. Hasegawa, H. Nagasaki, R. Yamada. Presence of free D-glutamate and D-aspartate in rat tissues. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1243. P. 282-286.

15. A. Morikawa, K. Hamase, T. Inoue, R. Konno, A. Niwa, K. Zaitsu. Determination of free D-aspartic acid, D-serine and D-alanine in the brain of mutant mice lacking d-amino-acid oxidase activity. // J. Chromatogr. B. 2001. V. 757. P 119-125.

16. A. Jegorov, J. Triska, T. Trnka. 1-Thio-p-D-galactose as a chiral derivatization agent for the resolution of D,L-amino acid enantiomers. // J. Chromatogr. A. 1994. V. 673. P. 286-290.

17. M.G. Chernobrovkin, E.N. Shapovalova, D.T. Guranda, P.A. Kudryavtsev,v

18. Шаповалова E.H., Смоленков А.Д., Попик M.B., Шпигун O.A. Прикладной химический анализ. Практическое руководство по хроматографическим методам анализа. М.: Типография МГУ, 2008. 206 с

19. Кузнецов М.А. Энантиоселективные сорбенты с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками // Дис. Канд. Хим. Наук. М. 2008. 131 с.

20. Т. Fukushima, М. Kato, Т. Santa, К. Imai. Enantiomeric separation and sensitive determination of D, L-amino acids derivatized with fluorogenic benzofurazan reagents on pirkle type stationary phases. // Biomed. Chromatogr. 1995. V. 9. P 10-17.

21. K. Hamase, H. Homma, Y. Takigawa, T. Fukushima, T. Santa, K. Imai. Regional distribution and postnatal changes of D-amino acids in rat brain. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1334. P. 214-222.

22. T. Inoue, K. Hamase, A. Morikawa, K. Zaitsu. Determination of minute amounts of D-leucine in various brain regions of rat and mouse using column-switching high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 744. P. 213-219.

23. К. Hamase, Т. Inoue, A. Morikawa, R. Konno, К. Zaitsu. Determination of Free D-Proline and D-Leucine in the Brains of Mutant Mice Lacking D-Amino Acid Oxidase Activity. //Anal. Biochem. 2001. V. 298. P. 253-258.

24. D.W. Armstrong, X. Yang, S.M. Han, R.A. Menges. Direct liquid chromatographic separation of racemates with an .alpha.-cyclodextrin bonded phase. //Anal. Chem. 1987. V. 59. P. 2594-2596.

25. D.W. Armstrong, M.P. Gasper, S.H. Lee, N. Ercal, J. Zukowski. Factors controlling the level and determination of D-amino acids in the urine and plasma of laboratory rodents. // Amino Acids. 1993. V. 5. P. 299-315.

26. Matsunaga H., Santa Т., Iida Т., Fukushima Т., Homma H., Imai K. Proton: a major factor for the racemization and the dehydration at the cyclization/cleavage stage in the Edman sequencing method. // Anal. Chem.1996. V.68.P. 2850-2856

27. Iida Т., Matsunaga H., Fukushima Т., Santa Т., Homma H. Complete Enantiomeric Separation of Phenylthiocarbamoylated Amino Acids on a Tandem Column of Reversed and Chiral Stationary Phases // Anal. Chem.1997. V.68.P. 2850-2856

28. B.A. даванков. Лигандообменная хроматография прорыв в области энантиоселективных технологий. // 100 лет хроматографии. 2003. Москва. С. 212-233.

29. S. Lam, H. Azyumaya, A. Karmen. High-performance liquid chromatography of amino acids in urine and cerebrospinal fluid // J. Chromatogr. A. 1984. V. 302. P. 21-29.

30. Allenmark S., Andersson S. Chiral amino acid microanalysis by direct optical resolution of fluorescent derivatives on BSA-based (resolvosil) columns // Chromatographic 1991. V.31 P. 429-433.

31. D. W. Armstrong, Y. Tang, S. Chen, Y. Zhou, C. Bagwill, J.R. Chen. Macrocyclic antibiotics as a new class of chiral selectors for liquid chromatography. // Anal. Chem. 1994. V. 66. P. 1473 1484.

32. Armstrong D.W., Liu Y., Ekborg-Ott K.H. A covalently bonded teicoplanin chiral stationary phase for HPLC enantioseparations // Chirality. 1995. V. 7. №. 6. P.474 497.

33. Ekborg-Ott K.H., Liu Y., Armstrong D.W. Highly enantioselective HPLC separations using the covalently bonded macrocyclic antibiotic, ristocetin A, chiral stationary phase // Chirality. 1998. V. 10. P. 434 483.

34. Ekborg-Ott K.H., Kullman J.P., Wang X., Gahm K., He L., Armstrong D.W. Evaluation of macrocyclic antibiotic avoparcin as a new chiral selectors for HPLC // Chirality. 1998. V. 10. P. 627 660.

35. G.F. Gause, M.G. Brazhnikova, N.N. Lomakina, T.F. Berdnikova, G.B. Fedorova, N.L. Tokareva, V.N. Borisova, G.Y. Batta. Eremomycin newglycopeptide antibiotic: chemical properties and structure. // J. Antibiotics. 1989. V. 42. P. 1790-1799.

36. Berthod A., Liu Y., Bagwill С., Armstrong D.W. Facile liquid chromatographic enantioresolution of native amino acids and peptides using a teicoplanin chiral stationary phase // J. Chromatogr. A. 1996. V. 731. P. 123137.

37. Péter A., Tôrôk G., Armstrong D.W. High-performance liquid chromatographic separation of enantiomers of unusual amino acids on a teicoplanin chiral stationary phase. //J. Chromatogr. A. 1998. V. 793. P. 283296.

38. Péter A., Tôrôk G., Armstrong D.W., Tôth G., Tourwé D. Effect of temperature on retention of enantiomers of P-methyl amino acids on a teicoplanin chiral stationary phase. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 828. P. 177190.

39. Péter A., Olajos E., Casimir R., Tourwé D., Broxterman Q.B., Kaptein В., Armstrong D.W. High-performance liquid chromatographic separation of the enantiomers of unusual a-amino acid analogues. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 871. P. 105-113.

40. Tôrôk G., Péter A., Vékes E., Sâpi J., Laronze M., Armstrong D.W. Enantiomeric high-performance liquid chromatographic separation of p-substituted tryptophan analogues. // Chromatographia. 2000. V51(suppl.). P. 165-174.

41. Péter A., Vékes E., Géra L., Stewart J.M., Armstrong D.W. A comparison of the direct and indirect LC methods for separating enantiomers of unusualglycine and alanine amino acid analogues. // Chromatographia. 2002. V. 56(suppl.). P. 79-89.

42. Chen S. HPLC enantiomeric resolution of phenyl isothiocyanated amino acids on teicoplanin-bonded phase using an acetonitrile-based mobile phase: a structural consideration. // J. Liq. Chromatogr. Related Technol. 2003. V.26. P. 3475-3495.

43. Chen S., Ward T. Comparison of the chiral separation of amino-acid derivatives by a teicoplanin and RN-P-CD CSPs using waterless mobile phases: Factors that enhance resolution // Chirality. 2004. V.16. P.318-330.

44. A.M. Rizzi, P. Briza, M. Breitenbach. Determination of D-alanine and D-glutamic acid in biological samples by coupled-column chromatography using p-cyclodextrin as mobile phase additive. // J. Chromatogr. 1992. V. 582. P. 35-40.

45. D.S. Dunlop, A. Neidle, D. McHale, D.M. Dunlop, A. Lajtha. The presence of free D-aspartic acid in rodents and man. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. V. 141. P. 27-32.

46. H. Zhao, K. Hamase, A. Morikawa, Z. Qiu, K. Zaitsu. Determination of D-and L-enantiomers of threonine and allo-threonine in mammals using two-step high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 2004. V. 810. P. 245-250

47. K. Hamase. Sensitive Two-Dimensional Determination of Small Amounts of D-Amino Acids in Mammals and the Study on Their Functions // Chem. Pharm. Bull. 2007. V. 55. P 503—510.

48. P. Khan, P.R. Fielden. Quantification of the D-(+)-enantiomer of phenylalanine in physiological fluids using high-performance liquid chromatography with column switching. // Anal. Commun. 1998. V. 35. P. 37-40.

49. N.C. van de Merbel, M. Stenberg, R. Oste, G. Marko-Varga, L. Gorton, H. Lingeman, U.A.T. Brinkman. Determination of D- and L-amino acids in biological samples by two-dimensional column liquid chromatography. // Chromatographic 1995. V. 41. P. 6-14.

50. C. Prata, P. Bonnafous, N. Fraysse, M. Treilhou, V. Poinsot, F. Couderc. Recent advances in amino acid analysis by capillary electrophoresis. // Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 4129-4138.

51. H. Wan, L.G. Blomberg. Chiral separation of amino acids and peptides by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 43-88.

52. K. Otsuka, S. Terabe. Enantiomer separation of drugs by micellar electrokinetic chromatography using chiral surfactants. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 163-178.

53. M. Tsunoda, M. Kato, T. Fukushima, T. Santa, H. Homma, H. Yanai, T. Soga, K. Imai. Determination of aspartic acid enantiomers in bio-samples by capillary electrophoresis. // Biomed. Chromatogr. 1999. V. 13. P. 335-339.

54. S.L. Zhao, Y.Z. Feng, M.H. LeBlanc, Y.M. Liu. Determination of free aspartic acid enantiomers in rat brain by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. // J. Chroma togr. B. 2001. V. 762. P. 97-101.

55. S.L. Zhao, Y.M. Liu. Electrophoretic separation of tryptophan enantiomers in biological samples. //Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 2769-2774.

56. S.L. Zhao, Y.M. Liu. Quantification of amino acid enantiomers in single cells by capillary electrophoresis. // Cell. Mol. Biol. 2001. V. 47. P. 1217.

57. M. Friedman. Chemistry, nutrition, and microbiology of D-amino acids. // J. Agric. Food Chem. 1999. V. 47. P. 3457-3479.

58. M. Fountoulakis, H.-W. Lahm. Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins. //J. Chromatogr. A. 1998. V. 826. P. 109-134.

59. B.A. Bidlingmeyer, S.A. Cohen, T.L. Tarvin. Rapid analysis of amino acids using pre-column derivatization. // J. Chromatogr. 1984. V. 336. P. 93-104

60. M. Weiss, M. Manneberg, J.-F. Juranville, H.-W. Lahm, M. Fountoulakis. Effect of hydro on the determination of the amino acid composition of proteins. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 795. P. 263-275.

61. L. Joergensen, H. N. Thestrup. Determination of amino acids in biomass and protein samples by microwave hydrolysis and ion-exchange chromatography. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 706. P. 421-428.

62. R. Hayashi, F. Suzuki. Determination of methionine sulfoxide in protein and food by hydrolysis with p-toluenesulfonic acid. // Anal. Biochem. 1985. V. 149. P. 521-528.

63. M.F. Maimer, L.A. Schroeder. Amino acid analysis by high-performance liquid chromatography with methanesulfonic acid hydrolysis and 9-fluorenylmethylchloroformate derivatization. // J. Chromatogr. 1990. V. 514. P. 227-239.

64. J.-C. Huet, J. C. Pernollet. Chromatographic separation and determination of tryptophan in foodstuffs after barytic hydrolysis using Fractogel TSK HW 40 S. //J. Chromatogr. 1986. V. 355. P. 451-455.

65. H. Jansen, U. A. Brinkman, R. W. Frei. Stereoselective determination of Lamino acids using column liquid chromatography with an enzymatic solidphase reactor and chemiluminescence detection. // J. Chromatogr. 1988. V. 440. P. 217-223.

66. B.A. Орлова, B.A. Шерстнякова, Ю.А. Карпов. Современные возможности автоклавной химической пробоподготовки. // Заводская лаборатория. 1993. № 9. С. 1-7.

67. Ю.А. Карпов, В.А. Орлова. Аналитические автоклавы. // Высокочистые вещества. 1990. № 3. С. 189-197.

68. Н.-М. Yu, S.-T. Chen, S.-H. Chiou, K.-T. Wang. Determination of amino acids on Merrifield resin by microwave hydrolysis. // J. Chromatogr. 1988. V. 456. P. 357-362.

69. E. Marconi, G. Panfili, L. Bruschi, V. Vivanti, L. Pizzoferrato. Comparative study on microwave and cjnventional method for protein hydrolysis in food. // Amino Acids. 1995. V. 8. P. 201-208.

70. Agilent Zorbax column selection guide for analytical HPLC. Agilent Technologies Inc. USA, 2001. 30 p.

71. Сакодынский К.И., Бражников B.B., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шатц В.Д. Аналитическая хроматография. Москва.: Химия, 1993. С. 312.

72. Стыскин E.JL, Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. 242 с.

73. Чернобровкин М.Г., Шунина М.В., Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А. Определение аминокислот в лекарственных препаратах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с амперометрическим детектированием. // Заводская лаборатория. 2007. Т.73. № 4. С. 23-28.

74. Agilent Zorbax Eclipse AAA instruction for use. Pub. 5980-3088 EN. Agilent Technologies, 2000

75. Шатц В.Д., Сахартова O.B. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига. Зинатне. 1988. 391 с.

76. Фармакопейная статья предприятия, ФСП 42-0090173101. Раствор для инфузий «Полиамин». 2001.

77. Кузнецов М.А., Нестеренко П.Н., Васияров Г.Г., Староверов С.М. Высокоэффективная жидкостная хроматография энантиомеров а-аминокислот на силикагеле с иммобилизованным эремомицином / Журнал аналитической химии. 2008. Т. 63. № 1. С. 64-72

78. А.Е. Prokhorova, E.N. Shapovalova, A.V. Shpak, S.M. Staroverov, O.A. Shpigun. Enantiorecognition of profens by capillary electrophoresis using a novel chiral selector eremomycin / J. Chromatogr. A. V. 1216. 24 April 2009. P. 3674-3677.

79. Фармакопейная статья предприятия, ФСП 42-0025520204. «Элтацин». 2009.

80. М.Г. Чернобровкин, Н.В. Кольцова, Б.Н. Шепелев. Определение аминокислот в препарате «Элтацин» / Фармация. 2004. Т. 53. № 5. С. 1820.

81. Фармакопейная статья предприятия, ФСП 42 - 0015538908. «Аспаркам».

82. The United States Pharmacopeia. The national formulary. USP34-NF29. 2011 // Cefepime for Injection. P. 2219.

83. Фармакопейная статья предприятия, ФСП 42- 14991-07. «Цефепим». 2007

84. Фармакопейная статья предприятия, ФСП 42 - 9378-08. «Цефепим». 2009

85. Aboul-Enein H.Y.; Hefnawy M.M.; Hoenen H., LC Determination of the Enantiomeric Purity of L-Arginine Using a Teicoplanin Chiral Stationary